JP5992020B2 - 不快臭を生成しないチゴサッカロミケス属酵母 - Google Patents

Description

本発明は、ＢＡＴ１遺伝子および／またはＡＲＯ８遺伝子の機能が変異等により失われたことにより、不快な香気成分の生産が著しく抑制された、ジゴサッカロミケス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母に関するものである。

ジゴサッカロミケス属酵母は、ジゴサッカロミケス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、ジゴサッカロミケス・ビスポラス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、ジゴサッカロミケス・コンブチャエンシス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ）、ジゴサッカロミケス・レンタス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｅｎｔｕｓ）、ジゴサッカロミケス・メーリス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓ）、ジゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）の６種に分類されるが、中でもジゴサッカロミケス・ルキシーは食品産業でよく用いられる。

ジゴサッカロミケス・ルキシーは、醤油、味噌などの食品の生産等において欠くことのできない有用な微生物であり、アルコールをはじめとする各種の香気成分を生成することにより、当該食品に特徴的な香味を付与する役割を担っている。しかし、ジゴサッカロミケス・ルキシーは同時にイソ酪酸、２−メチルブタン酸、イソ吉草酸といった不快臭成分をも生成することが知られており（非特許文献１）、例えば醤油の製造工程においてこのような不快臭成分が蓄積することで、意図せず当該食品の品質が低下することがある。従って、このような不快臭成分を生成しないジゴサッカロミケス属酵母を使用することが出来れば、発酵食品の製造工程でのこれらの不快臭成分による汚染を低減させることが可能であると考えられるが、これらの不快臭成分の生成能が低減されたジゴサッカロミケス属酵母はこれまで提供されていなかった。

一方、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、イソ酪酸、２−メチルブタン酸、イソ吉草酸のような不快臭成分は、それぞれバリン、イソロイシン、ロイシンのような分岐鎖アミノ酸を基質として生産されることが知られている（非特許文献２）。

サッカロミケス・セレビシエにおける不快臭成分の生合成では、まず上記分岐鎖アミノ酸（バリン、イソロイシン、ロイシン）が対応するα−ケト酸へと代謝される。この反応はＢＡＴ１、ＢＡＴ２と称される遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼによって触媒されていることが知られている。

しかしながら、ジゴサッカロミケス属の酵母においては、これまで不快臭の低減を目的とした育種は実施されてこなかった。

富田実、日本醸造協会誌、９２、７８３−８５９（１９９７） Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ ＡＬ， ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，７４，２２５９−２２６６ （２００８）

本発明者らは、これらの不快臭の生産に関わる遺伝子の機能を変異等により失わせ、不快臭の生産が著しく低減した酵母の作出を試みた。

ジゴサッカロミケス・ルキシーの全ゲノム配列は公共データベースＧｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ．ｏｒｇ／）等から利用可能である。そこで、サッカロミケス・セレビシエのＢＡＴ１、ＢＡＴ２遺伝子をクエリに相同配列検索を行った結果、ＢＡＴ２と類似した配列は存在しなかったが、ＢＡＴ１と類似した配列がジゴサッカロミケス・ルキシーにおいても１つ見出された。

実施例で記載する通り、このＢＡＴ１遺伝子の破壊だけでも不快臭を顕著に低減することができた。また、解析を進めていく中で、ジゴサッカロミケス属酵母の不快臭成分の生成は、ＢＡＴ１遺伝子とは異なる、未知の遺伝子にも依存していることが示唆された。

すなわち本発明の課題は、ジゴサッカロミケス属酵母において不快臭の生成に関与する遺伝子群を探索し、これら遺伝子の機能を欠損させることで、発酵食品の製造工程において意図せずに発生する不快臭を低減する方法を確立することにある。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、全く予想外なことに、ジゴサッカロミケス属酵母では、従来サッカロミケス・セレビシエにおいて不快臭成分の生合成に寄与するとされてきた分岐鎖アミノ酸の代謝経路とは全く関係しないＡＲＯ８遺伝子が、不快臭の生成に関与することを発見した。

また、高食塩含有発酵食品より分離されたジゴサッカロミケス・ルキシーは、それぞれ配列が異なるＢＡＴ１遺伝子を２つ、ＡＲＯ８遺伝子をゲノム上に２つ保有することを明らかにした。２つのＢＡＴ１遺伝子の破壊によって得られた変異株（ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ）は、親株と比較して不快臭成分であるイソ酪酸および２−メチルブタン酸の生成量が著しく減少し、さらに２つのＡＲＯ８遺伝子を破壊することで得られた変異株（ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ）では、不快臭成分であるイソ酪酸、２−メチルブタン酸、イソ吉草酸全ての生成量が顕著に減少することを発見した。

さらに、本発明者はこの変異株を、例えば醤油等の発酵食品の製造に適用させた場合、親株使用時と比較して著しく不快臭が低減されるばかりではなく、元の発酵食品と比較して官能特性を異にする発酵食品となることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、下記に示すようなものである。
（１）ＢＡＴ１をコードする遺伝子の機能が欠損している、ジゴサッカロミケス属酵母。
（２）ＢＡＴ１をコードする遺伝子およびＡＲＯ８をコードする遺伝子の機能が欠損している、ジゴサッカロミケス属酵母。
（３）ＢＡＴ１をコードする遺伝子および／またはＡＲＯ８をコードする遺伝子の機能が欠損することにより、イソ酪酸、２−メチルブタン酸およびイソ吉草酸の生成量が、欠損していない親株に比較していずれも５０％以下となっている、（１）または（２）に記載のジゴサッカロミケス属酵母。
（４）ジゴサッカロミケス属酵母がジゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）である（１）から（３）のいずれか１つに記載の酵母。
（５）製造工程において、（１）から（４）のいずれか１つに記載の酵母を添加することを特徴とする発酵食品。
（６）発酵食品が醤油または味噌である、（５）に記載の食品。

本発明の酵母は、イソ酪酸、２−メチルブタン酸、イソ吉草酸等の不快臭の原因となる成分の生成量が著しく低減されるため、不快臭が低減された発酵食品の製造が可能である。また、イソ吉草酸やイソ酪酸とは異なる香り成分が増加することにより、従来の製法で製造したものとは香気特性が異なる発酵食品を製造することが可能である。

図１は、ジゴサッカロミケス・ルキシー ＡＴＣＣ２６２３ ｂａｔ１Δ株の栄養要求性評価結果を示す。 図２は、ジゴサッカロミケス・ルキシー Ｚ３ ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株の栄養要求性評価を示す。 図３は、ジゴサッカロミケス・ルキシー ＡＴＣＣ２６２３ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ９Δ株の栄養要求性評価を示す。 図４は、ジゴサッカロミケス・ルキシー ＡＴＣＣ２６２３ ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ株の栄養要求性評価を示す。 図５は、ジゴサッカロミケス・ルキシー Ｚ３ 変異株の産膜形成の様子を示す。 図６は、ジゴサッカロミケス・ルキシー Ｚ３ ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δａｒｏ８Δ株の栄養要求性評価結果を示す。 図７は、ジゴサッカロミケス・ルキシー Ｚ３ 各変異株における不快臭成分の生成量を示す。 図８は、醤油にジゴサッカロミケス・ルキシー Ｚ３ 変異株を添加したときの産膜形成の様子を示す。 図９は、醤油にジゴサッカロミケス・ルキシー Ｚ３ 変異株を添加したときの不快臭成分の生成量を示す。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明で親株として用いる酵母は、ジゴサッカロミケス属に属する酵母である。中でも、食品産業でよく用いられるジゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）が好ましい。ジゴサッカロミケス・ルキシーとしては任意の株を用いることができ、ＡＴＣＣ２６２３株等の一般に入手可能な株や、醤油諸味・味噌等の発酵食品から採取した株を用いることが可能である。

本発明の酵母は、ＢＡＴ１をコードする遺伝子の機能が欠損している、ジゴサッカロミケス属酵母である。ＢＡＴ１は、をコードする遺伝子の配列は、ジゴサッカロミケス・ルキシーの全ゲノム配列の公共データベースＧｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ．ｏｒｇ／）においてＺＹＲＯ０Ｇ００３９６ｇとして示される配列、または配列表の配列番号１および配列番号３に示される。

また、本発明の酵母は、ＢＡＴ１をコードする遺伝子およびＡＲＯ８をコードする遺伝子の機能が欠損している、ジゴサッカロミケス属酵母である。ＡＲＯ８をコードする遺伝子の配列は、ジゴサッカロミケス・ルキシーの全ゲノム配列の公共データベースＧｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ．ｏｒｇ／）においてＺＹＲＯ０Ｃ０６０２８ｇとして示される配列、または配列表の配列番号２および配列番号４に示される。

本発明の酵母では、ＢＡＴ１をコードする遺伝子の機能を欠損させることにより、不快臭成分の生成を一定量抑えることができる。また、ＢＡＴ１をコードする遺伝子に加えてさらにＡＲＯ８をコードする遺伝子の機能を欠損させることにより、不快臭成分の生成をより著しく抑制することが可能である。

本発明の酵母は、たとえば通常の相同組換えによる遺伝子破壊法または変異導入法によって、ＢＡＴ１をコードする遺伝子および／またはＡＲＯ８をコードする遺伝子の機能を欠損させることで得ることができる。

相同組換えによって、配列表１−４に記載のオリゴヌクレオチドを欠損させる方法としては、一般的に実施されている遺伝子破壊方法を用いることができる。遺伝子破壊に用いるＤＮＡ断片の作成を行う場合は、まず、適当なマーカー遺伝子と配列表１−４に記載のオリゴヌクレオチドの両方に相補的に結合可能なオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、適当なマーカー遺伝子を含む配列を鋳型にＰＣＲを行うことで遺伝子破壊に用いるＤＮＡ断片を取得することが可能である。用いるマーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子としては、ジェネティシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ノーセオスリシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子などを、親株の栄養要求性を相補する遺伝子としては、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、及びＡＤＥ２遺伝子などをあげることができるが、これらの遺伝子に制限は無く、選抜の指標として使用できる遺伝子であればどのような遺伝子であってもかまわない。

また、酵母を作成した遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を用いて形質転換する方法としては、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、及び凍結融解法などをあげることができるが、これらの方法に特段の制限は無く、遺伝子破壊用のＤＮＡ断片を酵母に導入することができる方法であればどのような技術であってもかまわない。

相同組換え法によって所期の遺伝子が酵母に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法などが挙げられる。ただし、このような栄養要求性だけでは、目的とする遺伝子座が導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できない。従って、栄養要求性に合わせて適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。

また、変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、イオンビーム、紫外線を照射させる方法を挙げることができる。

ＢＡＴ１やＡＲＯ８の機能が確かに欠損しているかを確認するためには、対象の株がバリン、イソロイシン、ロイシン要求性となっているかを検証すればよい。ＢＡＴ１やＡＲＯ８による酵素反応は可逆反応であり、分岐鎖アミノ酸を分解するだけでなく、それぞれの分岐鎖アミノ酸の生合成経路の最終段階としても働いている。したがって、これらの遺伝子の機能欠損株は分岐鎖アミノ酸を合成することができず、分岐鎖アミノ酸要求性となるため、相同組換えや変異導入によって遺伝子の機能が欠損したか否かは、対象の株がバリン、イソロイシン、ロイシン要求性となっているかを検証することによって確認することが可能である。

対象とするジゴサッカロミケス・ルキシー株がバリン、イソロイシン、ロイシン要求性となっているかを検証する方法としては、たとえばイーストナイトロジェンベース・アミノ酸不含、グルコースのみから成る最少培地にイソロイシン、バリン、ロイシンをそれぞれ少なくとも１種添加し、各培地における対象株の生育の度合いを見ることによって確認できる。バリン、イソロイシンに対して要求性を示す株であればＢＡＴ１をコードする遺伝子が機能欠損していると判断でき、バリン、イソロイシン、ロイシンのいずれに対しても要求性を示す株であれば、ＢＡＴ１に加えてＡＲＯ８をコードする遺伝子が機能欠損していると判断できる。

さらに本発明のジゴサッカロミケス・ルキシー株は、イソ酪酸、２−メチルブタン酸、イソ吉草酸から成る不快臭成分の生成量が、いずれも親株の５０％未満、より好ましくは２０％未満となっていることを特徴とする。上記不快臭成分の生成量の測定方法としては、下記のような方法に拠ればよい。

まず、ＳＣＤ液体培地（イーストナイトロジェンベース アミノ酸・硫酸アンモニウム不含０．１７％、ドロップアウトミックス０．１４％、グルコース２％）にイソロイシン０．４％、バリン０．４％、ロイシン０．６％、寒天２．０％を添加した固体培地を作成する。この上に、培養した酵母を水に懸濁した溶液を重層し、プレートを逆さまにすることで余剰の懸濁液を除去し、プレート全面に均一に植菌する。このプレートを３０度で７日間培養し、スプレッダーで表面の酵母を除去した後、１ミリのメッシュで培地を細断する。細断した培地をチューブに回収し、滅菌水１５ｍｌを加えた後、４度で一晩静置する。デカントと遠心分離で液部を６ｍｌ回収し、３ｍｌのジエチルエーテルを加え香気成分を抽出する。ジエチルエーテル層を回収し、無水硫酸ナトリウムを適当量添加し、脱水する。１００ｍｇ／Ｌの２，３−ジメチルピラジン溶液と等量混合し、ＧＣＭＳ解析によりイソ酪酸、２−メチルブタン酸、イソ吉草酸を定量する。

ＧＣＭＳ測定では、サンプルをスプリットレスでアプライし、４０度で１０分ホールドした後、１分当たり１０度の割合で２５０度まで昇温し、２０分保持する。１秒に２．５回の割合で、ｍ／ｚが２０−４００のイオンをスキャンし、標準物質のリテンションタイムとマススペクトルとが一致することをもって、目的の物質を同定し、あらかじめ作成した検量線から目的の物質を定量することができる。

なお、ジゴサッカロミケス・ルキシーの中には、発酵食品の製造過程において産膜を生じ、これが不快臭生成の基となるとされる場合があるが、本願発明のジゴサッカロミケス・ルキシーは産膜の産生自体には影響を及ぼさず、不快臭成分の生成のみを低減させることを特徴とするものである。

本発明の酵母を食品の製造に用いる場合、当該食品としては、醤油、味噌などの酵母を用いて製造される発酵食品を使用することができる。また、発酵食品以外にも、酵母の混入によって不快臭が生じる可能性がある任意の食品を使用してもよい。さらに当該食品は、最終製品でなく、製造工程の途中段階である中間製品であっても構わない。

食品の製造工程に当該酵母を使用する場合、その添加時期に特段の制限は無く各工程で適切な時期に添加すればよいが、醤油醸造であれば、仕込後０−６ヶ月の間、より好ましくは１−２ヵ月の間に当該食品に混入することが望ましい。また、完成した醤油に当該酵母を使用することも可能である。

以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。

（実施例１）ジゴサッカロミケス・ルキシーにおける不快臭生成に関与する遺伝子の同定
（１−１）ジゴサッカロミケス・ルキシーにおけるＢＡＴ１遺伝子の探索
サッカロミケス・セレビシエにおいてＢＡＴ１及びＢＡＴ２遺伝子が不快臭成分の生合成経路に関わることが知られていたことから、ジゴサッカロミケス・ルキシーにおいても同様の遺伝子が存在するかを確認するため、サッカロミケス・セレビシエのＢＡＴ１遺伝子またはＢＡＴ２遺伝子の推定翻訳産物をクエリとし、ジゴサッカロミケス・ルキシーのゲノムデータベースに対する相同性検索を行った。その結果、ゲノムデータベース上ではジゴサッカロミケス・ルキシーは１つのＢＡＴ１遺伝子ＺＹＲＯ０Ｇ００３９６ｇを持つことが明らかとなった。

そこで、ジゴサッカロミケス・ルキシーのＢＡＴ１遺伝子を破壊するため、表１に示すプライマーを用い、ジェネティシン耐性遺伝子を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことで、ＢＡＴ１遺伝子破壊コンストラクトを作成した。

このコンストラクトを用いて、ゲノムシーケンスに用いられたＡＴＣＣ２６２３株のウラシル要求性株および食塩を高含有する醤油諸味より分離されたジゴサッカロミケス・ルキシーＺ３株（以下これらの株を「親株」と称することがある）を形質転換した。

ＢＡＴ１、ＢＡＴ２による反応は可逆反応であり、分岐鎖アミノ酸を分解するだけでなく、生合成経路の最終段階としても働いている。したがって、サッカロミケス・セレビシエのＢＡＴ１、ＢＡＴ２の二重遺伝子破壊株は分岐鎖アミノ酸を合成することができず、分岐鎖アミノ酸要求性となる（Ｋｉｓｐａｌ Ｇ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７１， ２４４５８−２４４６４ （１９９６））。

そこで、得られたジゴサッカロミケス・ルキシー形質転換株についても栄養要求性を確認するため、最少培地（イーストナイトロジェンベース・アミノ酸不含０．６７％、グルコース２％、寒天２％）に要求性を見たい分岐鎖アミノ酸（イソロイシン、バリン、ロイシン）以外のアミノ酸を各０．０５％添加した培地を調製し、ここに細胞懸濁液を滴下して３０度で５日間培養した。

その結果、図１に示すとおりＡＴＣＣ２６２３株のウラシル要求性株を親株とした形質転換株は、イソロイシン及びバリン要求性を示すことが確認された。しかし、食塩を高含有する醤油諸味より分離されたジゴサッカロミケス・ルキシーＺ３株において、このＢＡＴ１遺伝子を破壊しても、その栄養要求性になんら変化は認められず、不快臭成分の合成は抑制されていないと考えられた。醤油から分離される大部分の株は由来の異なる複数のゲノムが混在する異質倍数体であることが知られており（Ｔａｎａｋａ Ｙ，Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３１，１００−１０６ ２０１２）、したがって醤油諸味由来であるジゴサッカロミケス・ルキシーＺ３株においても配列が異なるＢＡＴ１遺伝子が他にも存在することが予想されたため、この遺伝子のクローニングを試みた。

（１−２）醤油由来ジゴサッカロミケス・ルキシーにおけるＢＡＴ１様遺伝子の探索
醤油諸味より分離されたジゴサッカロミケス・ルキシーＺ３のもう１つのＢＡＴ１様遺伝子を同定するため、ショットガンクローニングを行った。まず、ジゴサッカロミケス・ルキシーＺ３株のゲノミックＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで処理した。制限酵素処理産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、５〜８キロベースペアの断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を、事前にＢａｍＨ１処理しておいたＵＲＡ３遺伝子を有する多コピー型のプラスミドとライゲーションし、Ｚ３株のゲノミックＤＮＡライブラリーを構築した。構築したゲノミックライブラリーで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した後、大腸菌からプラスミドを回収し、ライブラリーの品質を確認した結果、平均インサート長６．８キロベース、インサート保持率８０％以上の約２０，０００の独立したクローンから構成されるライブラリーが構築できた。

当該ライブラリーからプラスミドＤＮＡを大量調整し、ＡＴＣＣ２６２３株のウラシル要求性株のＢＡＴ１破壊株を形質転換し、イソロイシン・バリン要求性が抑圧された（要求性を示さなくなった）株をスクリーニングした。その結果、イソロイシン・バリン要求性が抑圧された株が複数得られたので、これらの株が保持するプラスミドＤＮＡを回収し、一旦大腸菌で増幅した後、シーケンス解析に供した。シーケンスの結果、ジゴサッカロミケス・ルキシーゲノムデータベースのＢＡＴ１遺伝子と完全に一致する配列（配列表の配列番号３）と、それに類似した配列（配列表の配列番号１）とが得られた。後者が目的の遺伝子であると判断し、これを破壊するために、表２のプライマーを用いゼオシン耐性遺伝子を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことで２つ目のＢＡＴ１様遺伝子を破壊するための破壊コンストラクトを作成した。このコンストラクトで、前述のＺ３のＢＡＴ１遺伝子機能欠損株（以下「ｂａｔ１Δ」と表記）株を形質転換し、配列番号１および３に示した双方の遺伝子が欠損しているＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株を得た。Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株についても実施例１−１と同様の方法で分岐鎖アミノ酸要求性を確認したところ、図２に示すとおり、この株はＡＴＣＣ２６２３株のウラシル要求性株のＢＡＴ１破壊株と同様にイソロイシン・バリン要求性を示すことが確認された。

（１−３）ジゴサッカロミケス・ルキシーにおけるＡＲＯ８、ＡＲＯ９様遺伝子の探索
サッカロミケス・セレビシエにおいて分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするＢＡＴ１及びＢＡＴ２遺伝子を破壊した場合、イソロイシン・バリン・ロイシン要求性になることが知られている。しかし、ジゴサッカロミケス・ルキシーにおいては、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を破壊してもロイシン要求性にはならなかった。

このことは、ジゴサッカロミケス・ルキシーがＢＡＴ１などの分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ以外にも不快臭成分の生合成を担う酵素遺伝子を有していることを示唆している。そこで、本発明者らは芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするＡＲＯ８とＡＲＯ９について解析を行った。

サッカロミケス・セレビシエのＡＲＯ８，ＡＲＯ９遺伝子の推定翻訳産物をクエリとし、ジゴサッカロミケス・ルキシーのゲノムデータベースに対する相同性検索を行った。その結果、ジゴサッカロミケス・ルキシーはＡＲＯ８遺伝子ＺＹＲＯ０Ｃ０６０２８ｇ及びＡＲＯ９遺伝子ＺＹＲＯ０Ｇ０５３４６ｇを各１つ有することが明らかになった。

そこで、表３のプライマーを用い、ジェネティシン耐性遺伝子を有するプラスミドまたはゼオシン耐性遺伝子を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことでＡＲＯ８遺伝子破壊コンストラクトを、表４のプライマーを用いゼオシン耐性遺伝子を有するプラスミドまたはノーセオスリシン耐性遺伝子を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことでＡＲＯ９遺伝子破壊コンストラクトをそれぞれ作成した。

これらの破壊コンストラクトでＡＴＣＣ２６２３のウラシル要求性株を親株として用い形質転換し、ＡＲＯ８遺伝子機能欠損株（以下「ａｒｏ８Δ」と表記）、ＡＲＯ９遺伝子機能欠損株（以下「ａｒｏ９Δ株」と表記）、およびＡＲＯ８遺伝子、ＡＲＯ９遺伝子二重機能欠損株（以下「ａｒｏ８Δａｒｏ９Δ株」と表記）を作製した。その結果、図３に示すとおり、ホモロジー検索でジゴサッカロミケス・ルキシーから見出されたＡＲＯ８遺伝子ＺＹＲＯ０Ｃ０６０２８ｇ及びＡＲＯ９遺伝子ＺＹＲＯ０Ｇ０５３４６ｇの機能を同時に欠損させたａｒｏ８Δａｒｏ９Δ株は、サッカロミケス・セレビシエのそれと同様にチロシン、フェニルアラニン要求性を示した。

次に、ＡＲＯ８やＡＲＯ９がジゴサッカロミケス・ルキシーのロイシン代謝に関与しているのかどうかを確認するため、ＡＴＣＣ２６２３のウラシル要求性株のｂａｔ１Δ株を上記のＡＲＯ８遺伝子破壊コンストラクト、ＡＲＯ９遺伝子破壊コンストラクトで形質転換し、ＢＡＴ１遺伝子、ＡＲＯ８遺伝子二重機能欠損株（以下「ｂａｔ１Δａｒｏ８Δ株」と表記）、ＢＡＴ１遺伝子、ＡＲＯ９遺伝子二重機能欠損株（以下「ｂａｔ１Δａｒｏ９Δ株」と表記）、およびＢＡＴ１遺伝子、ＡＲＯ８遺伝子、ＡＲＯ９遺伝子三重機能欠損株（以下「ｂａｔ１Δａｒｏ８Δａｒｏ９Δ株」と表記）を作製した。これらの株の栄養要求性を確認した結果、ｂａｔ１Δａｒｏ８Δ株がイソロイシン、バリン、ロイシン要求性であることが確認された（図４）。この結果から、ＢＡＴ１遺伝子に加えてＡＲＯ８遺伝子もロイシン代謝に関与することが初めて示され、分岐鎖アミノ酸代謝が抑制されたこれらの機能欠損株において、不快臭が低減する可能性が示唆された。

（１−４）醤油由来ジゴサッカロミケス・ルキシーにおけるＡＲＯ８、ＡＲＯ９様遺伝子の探索
醤油由来のＺ３株において、ＢＡＴ１遺伝子とＡＲＯ８遺伝子の機能を同時に欠損させた場合に不快臭が低減するのかを実証するために、ＢＡＴ１遺伝子とＡＲＯ８遺伝子の二重破壊株を作製した。

ただし、前述のとおり、Ｚ３株は異質倍数体であり配列の異なる２つのＡＲＯ８遺伝子を有することが考えられたため、まずはこの遺伝子のクローニングを試みた。実施例１−２にて作成したゲノムライブラリーでＡＴＣＣ２６２３ｕｒａ３Δｂａｔ１Δａｒｏ８Δ株を形質転換し、ロイシン要求性を抑圧するコロニーを選抜した。その結果、ロイシン要求性が抑圧された株が複数得られたので、これらの株が保持するプラスミドＤＮＡを回収し、一旦大腸菌で増幅した後、シーケンス解析に供した。その結果、ゲノムデータベースのＡＲＯ８遺伝子と完全に一致する配列（配列表の配列番号４）及びそれに類似した配列（配列表の配列番号２）が得られた。

そこで、これらの遺伝子を破壊するために、表３のプライマーを用いジェネティシン耐性遺伝子を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことでＡＲＯ８遺伝子破壊コンストラクトを、表５のプライマーを用いゼオシン耐性遺伝子を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行うことでもう一方のＡＲＯ８様遺伝子破壊コンストラクトを作成した。

これらのコンストラクトで前述のＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株を形質転換するためには、２つのＢＡＴ１遺伝子を破壊するために利用した２つのマーカーを事前に除去する必要がある。そこで、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株のマーカーリサイクルを目的として一旦Ｃｒｅリコンビナーゼを有するプラスミドで形質転換し、その作用によってゲノム内に挿入されたマーカー遺伝子が脱落した株を取得した。この株をＹＰＤ（イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地で培養し、導入したＣｒｅリコンビナーゼを有するプラスミドを脱落させた。この株を前述のＡＲＯ８遺伝子破壊コンストラクトおよびＡＲＯ８様遺伝子破壊コンストラクトで形質転換し、配列番号１、２、３および４に示した全ての遺伝子が欠損したＺ３のＢＡＴ１遺伝子、ＢＡＴ１様遺伝子、ＡＲＯ８遺伝子、ＡＲＯ８様遺伝子多重破壊株（以下「ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株」と表記）を作製した。

次に、作製したこれらの株が産膜を形成するかどうか確認するために、ＹＰＤ液体培地でフルグロースするまで酵母を前培養し、培養液の一部を１．８Ｍ ＮａＣｌを含むＹＰＤ液体培地に植え継ぎ、３０度で５日間静置培養した。その結果、図５に示すとおり、試験に供したＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株およびＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株は親株と同様に産膜を形成した。また、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株はＡＴＣＣ２６２３ｕｒａ３Δｂａｔ１Δａｒｏ８Δ株と同様に、イソロイシン・バリン要求性だけではなくロイシン要求性も示した（図６）。

（実施例２）遺伝子機能欠損株における不快臭成分の生成
次に、Ｚ３親株、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株およびＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株の不快臭成分の生成量を測定した。

ＳＣＤ液体培地（イーストナイトロジェンベース アミノ酸・硫酸アンモニウム不含０．１７％、ドロップアウトミックス０．１４％、グルコース２％）にイソロイシン０．４％、バリン０．４％、ロイシン０．６％、ウラシル０．１５％、寒天２．０％を添加した固体培地を作成した。この培地上に培養した酵母の水懸濁液を重層した後、プレートを逆さまにすることで余剰の懸濁液を除去し、酵母菌体をプレート全面に均一に植菌した。このプレートを３０度で７日間培養し、スプレッダーで表面の酵母を除去した後、１ミリのメッシュで培地を細断した。細断した培地をチューブに回収し、滅菌水１５ｍｌを加えた後、４度で一晩静置した。デカントと遠心分離で液部を６ｍｌ回収し、３ｍｌのジエチルエーテルを加え香気成分を抽出した。ジエチルエーテル層を回収し、無水硫酸ナトリウムを適当量添加し、脱水した。１００ｍｇ／Ｌの２，３−ジメチルピラジン溶液と等量混合し、ＧＣＭＳ解析により目的の成分を定量した。ＧＣＭＳはＶＡＲＩＡＮ １２００ ｐｌｕｓ ＣＰ−３８００を使用した。カラムはＣＰＷＡＸ−５２ＣＢを用いた。２２０度にあらかじめ加温した注入口に２マイクロリッターのサンプルをスプリットレスでアプライした。４０度で１０分ホールドした後、１分当たり１０度の割合で２５０度まで昇温し、２０分保持した。１秒に２．５回の割合で、ｍ／ｚが２０−４００のイオンをスキャンした。標準物質のリテンションタイムとマススペクトルとが一致することをもって、目的の物質を同定し、あらかじめ作成した検量線から目的の物質を定量した。

その結果、図７に示すとおり、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株では、不快臭成分であるイソ吉草酸の生成は親株と比較して半分程度に減少し（親株比で０．４５）、イソ酪酸や２−メチルブタン酸の生成はさらに顕著に減少した（それぞれ親株比で０．１１、０．０４）。また、さらに２つのＡＲＯ８遺伝子を破壊したＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株では、イソ酪酸、２−メチルブタン酸およびイソ吉草酸全てが顕著に減少した（それぞれ親株比で０．０６、０．０３、０．１４）。これらの結果から、ＢＡＴ１遺伝子の破壊だけでも不快臭の生成を抑制するのには効果的であるが、ＢＡＴ１遺伝子に加えさらにＡＲＯ８遺伝子を破壊することで、より効果的に不快臭成分の生成を抑制できることが示された。

（実施例３）本発明の酵母を利用した醸造食品の製造
次に、実際の醤油において同様の効果が得られるかどうか検証した。
市販の醤油を２倍希釈したサンプル１０ミリリットルをプラスチックシャーレに入れ、被検菌を植菌し、３０度で７日間培養した。その結果、図８に示すとおり、試験に供したＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株およびＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株は、親株と同様に醤油表面に産膜を形成した。次に、６ミリリットルの醤油を回収し、３ｍｌのジエチルエーテルを加え香気成分を抽出し、前述の方法と同様に不快臭成分の生成量を測定した。その結果、図９に示すとおり、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株では、不快臭成分であるイソ吉草酸の生成量は減少し（親株比で０．２７）、イソ酪酸や２−メチルブタン酸の生成も顕著に減少した（それぞれ親株比で０．１８、０．０７）。さらに、２つのＡＲＯ８遺伝子を追加で破壊したＺ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株では、イソ酪酸、２−メチルブタン酸およびイソ吉草酸全ての生成量が顕著に減少した（それぞれ親株比で０．１、０．０１、０．０２）。これらの結果から、ＢＡＴ１遺伝子の破壊だけでも不快臭の生成を抑制するのに効果的であるが、ＢＡＴ１遺伝子に加えさらにＡＲＯ８遺伝子を破壊することで、より効果的に不快臭成分の生成を抑制できることが醤油においても示された。

次に、官能評価により、当該醤油において不快臭が低減しているかどうかについての検討を実施した。その結果、表６に示すとおり、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ株を用いた試作品（表６中「ｂａｔ１Δ」）の不快臭は親株と比較して低減はしているが、やや不快臭を感じる状態であった。一方、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株を用いた試作品（表６中「ｂａｔ１Δａｒｏ８Δ」）は不快臭がほぼ感じられない状態となっていた。また、予想外なことに、Ｚ３ｂａｔ１Δ／ｂａｔ１Δ ａｒｏ８Δ／ａｒｏ８Δ株を使用した試作品は、特有の香気が醤油に付与されており、元の醤油とは官能的な性質を異にするものとなった。これらのことから、本特許で開発した酵母を用いることで、元の醤油とは差別化された官能特性を持つ醤油の開発が可能であると考えられた。

Claims (5)

1. ＢＡＴ１をコードする遺伝子およびＡＲＯ８をコードする遺伝子の機能が欠損している、ジゴサッカロミケス属酵母。
2. ＢＡＴ１をコードする遺伝子およびＡＲＯ８をコードする遺伝子の機能が欠損することにより、イソ酪酸、２−メチルブタン酸およびイソ吉草酸の生成量が、欠損していない親株に比較していずれも５０％以下となっている、請求項１に記載のジゴサッカロミケス属酵母。
3. ジゴサッカロミケス属酵母がジゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）である請求項１または２に記載の酵母。
4. 製造工程において、請求項１から３のいずれか１項に記載の酵母を添加することを特徴とする発酵食品の製造方法。
5. 発酵食品が醤油または味噌である、請求項４に記載の製造方法。

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