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JP6016966B2 - インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼに基づく免疫療法 - Google Patents
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インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼに基づく免疫療法 Download PDF

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Description

本出願で引用されたすべての特許および非特許の参考文献はまた、その全体が本明細書中で参考として援用される。
発明の分野
本発明は、癌の予防および治療分野に関する。特に、タンパク質であるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）または抗癌免疫応答を誘発することができるそのペプチドフラグメントを提供する。具体的には、本発明は、癌処置のためのＩＤＯ、ＩＤＯ由来のペプチド、またはＩＤＯ特異的Ｔ細胞の使用に関する。したがって、本発明は、任意選択的に他の免疫療法と組み合わせて使用することができる抗癌ワクチンおよび癌治療としてのワクチン接種によって養子導入されるかｉｎ ｖｉｖｏで誘導されるＩＤＯ特異的Ｔ細胞に関する。本発明の一態様は、本明細書中に提供した医薬品を癌化学療法と組み合わせて使用することができることである。さらなる一態様は、上記と同一の手段による感染の防止および治療に関する。
癌および感染の治療、診断、および予後におけるＩＤＯおよびその免疫学的ペプチドフラグメントの使用も提供する。
発明の背景
免疫系は、新生物細胞を認識して破壊する能力を有する。しかし、腫瘍性形質転換が免疫原性抗原の発現に関連するという事実にもかかわらず、免疫系はしばしばこれらの抗原に対して有効に応答することができない。免疫系は、明らかにこれらの抗原に対して寛容性を示すようになる１（非特許文献１）。これが起こる場合、新生物細胞は制御不可能に増殖し、罹患個体の予後が不良な悪性癌を形成する。癌免疫療法を成功させるには、寛容状態の獲得を克服しなければならない。
インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、免疫系のホメオスタシスの維持における主要成分であるが、腫瘍誘導性寛容にも寄与する。ＩＤＯの発現および活性化により、必須アミノ酸であるトリプトファンの分解によるＴ細胞の直接抑制または局所Ｔｒｅｇ−（活性化調節性Ｔ細胞）媒介性免疫抑制の増強のいずれかによって腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節（ＬＮ）内の寛容原性環境が得られる。前者に関して、ＩＤＯの生物学的影響は、トリプトファンの局所枯渇によって媒介されるものもあれば、免疫調節性トリプトファン代謝産物によって媒介されるものもある３，４（非特許文献２、非特許文献３）。最近、Ｔ細胞におけるＩＤＯ応答性シグナル伝達系（ストレスキナーゼＧＣＮ２を含む）が同定されている５。Ｔ細胞からトリプトファンが枯渇された場合にＧＣＮ２は非荷電ｔＲＮＡの上昇に応答し、ＧＣＮ２を欠くＴ細胞にはＩＤＯ媒介性抑制およびアネルギー誘導が無効である６。
ＩＤＯを、腫瘍細胞および腫瘍間質細胞によって腫瘍内に発現することができ、ここでＩＤＯは免疫応答のエフェクター段階を阻害する。さらに、ＩＤＯ発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）は腫瘍流入領域リンパ節中に存在し、ここでＡＰＣは寛容原性微小環境を作製すると考えられる。実際、腫瘍流入領域リンパ節から単離されたＩＤＯ発現ＣＤ１９＋形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの強い免疫抑制およびＴ細胞アネルギー７，８（非特許文献４、非特許文献５）を媒介し、正常なリンパ節および脾臓由来の形質細胞様ＤＣはＩＤＯを発現しない。腸を除く正常なリンパ組織でＩＤＯを構成的に発現する細胞はほとんどない。これは、ＩＤＯを構成的に発現する腫瘍流入領域リンパ節中のＤＣが腫瘍の存在に関連する刺激を受けなければならないことを意味する。この刺激は、腫瘍から流入領域リンパ節への活性化調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の移動によると考えられる。Ｔｒｅｇは、ＣＴＬＡ−４の細胞表面発現を介してＩＤＯを誘導することが示されている９。ＩＤＯの誘導は、腫瘍流入領域リンパ節を免疫化から寛容環境に変換する。実際、ＩＤＯ＋ＤＣがｉｎ ｖｉｖｏで注射されると、これらは注射部位から流れ出てリンパ節中の抗原特異的Ｔ細胞の抑制およびアネルギーを引き起こす１０。免疫コンピテント細胞におけるその発現と無関係に、ＩＤＯは腫瘍微小環境にて腫瘍細胞自体または異なる間質細胞のいずれかに頻繁に発現する。この状況では、ＩＤＯは免疫応答のエフェクター段階を阻害すると考えられる１１，１２。クリニックでは、腫瘍細胞中のＩＤＯ発現が予後不良に関連することが繰り返し認められている１３，１４。
Ｍｏｒｒｉｓ Ｅ， Ｈａｒｔ Ｄ， Ｇａｏ Ｌら： Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ（２００６）２０：６１−６９ Ｐｌａｔｔｅｎ Ｍ， Ｈｏ ＰＰ， Ｙｏｕｓｓｅｆ Ｓら： Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）３１０：８５０−８５５ Ｂａｕｅｒ ＴＭ， Ｊｉｇａ ＬＰ， Ｃｈｕａｎｇ ＪＪら： Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ： ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｒａｔ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ（２００５）１８：９５−１００ Ｓｈａｒｍａ ＭＤ， Ｂａｂａｎ Ｂ， Ｃｈａｎｄｌｅｒ Ｐら： Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍａｔｕｒｅ Ｔｒｅｇｓ ｖｉａ ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００７）１１７：２５７０−２５８２ Ｍｕｎｎ ＤＨ， Ｓｈａｒｍａ ＭＤ， Ｈｏｕ Ｄら： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｂｙ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００４）１１４：２８０−２９０
したがって、ＩＤＯ発現およびそれに伴うＩＤＯ誘導性の癌免疫抑制が癌治療で問題を引き起こす。
発明の概要
癌免疫抑制の問題は、本発明者らによる癌患者におけるＩＤＯ発現細胞に対する自発的細胞傷害性免疫応答の驚くべき所見に基づく本発明によって解決される。これらの所見は、癌疾患の調節において一般的に適用可能な新規の治療および診断アプローチを可能にする。
本発明は、ＩＤＯ発現癌細胞の直接的死滅およびＩＤＯ発現性でアネルギー誘導性のＡＰＣ／ＤＣの死滅によって癌疾患を標的にする。Ｔ細胞がＩＤＯ発現細胞を認識できるようにすることによってこれを行う。同様に、臨床状態が感染である場合、Ｔ細胞は、ＩＤＯ発現ＡＰＣ／ＤＣを死滅させることができる。したがって、癌細胞およびＡＰＣ中での免疫抑制酵素ＩＤＯの発現は、これらのＩＤＯ発現細胞を標的にする本発明の方法の適用と併せて陽性である。このアプローチは、特にＡＰＣ／ＤＣの死滅を伴う場合、ＩＤＯが一般にＡＰＣ／ＤＣ周囲の寛容環境を除去するために下方制御／阻害を試みる一方でこれらの細胞を保存し、これが有効な免疫応答を開始させるために必要であると見なされる本分野での一般的意見に反する。
さらに、ＩＤＯ発現細胞が他の免疫療法アプローチの所望の効果を拮抗するので、ＩＤＯ発現細胞に対する自発的細胞傷害性免疫応答の所見は特に驚くべきことである。したがって、ＩＤＯターゲティング免疫療法と腫瘍ターゲティング免疫療法との組み合わせは相乗効果が高い。
本発明は、医薬品として使用するためのアジュバントと組み合わせた配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸を含むワクチン組成物に関する。
ワクチン組成物およびさらなる免疫刺激組成物を含む部分のキット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）に関する本発明の態様で上記開示のワクチンに基づいた免疫療法の組み合わせの相乗効果が得られる。
本発明のワクチンと他の癌処置（化学療法薬など）との組み合わせの態様も本明細書中に提供する。
本発明のワクチンと感染に対する他の処置（免疫療法および／または抗生物質など）との組み合わせの態様も本明細書中に提供する。
本発明の別の態様は、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、またはＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメントを含む、癌患者におけるＩＤＯに反応性を示すＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための組成物に関する。
さらなる態様は、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、またはＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメントを含む、癌患者におけるＩＤＯに反応性を示すＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための診断キットに関する。
ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含むペプチドフラグメントとクラスＩ ＨＬＡ分子またはクラスＩＩ ＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントとの複合体も本明細書中に提供する。
腫瘍組織または血液サンプルをＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含むペプチドフラグメントとクラスＩ ＨＬＡ分子またはクラスＩＩ ＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントとの複合体と接触させる工程、および組織または血球への複合体の結合を検出する工程を含む、癌患者におけるＩＤＯ反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法は、本発明のさらなる一態様である。
本発明のさらなる一態様は、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含むペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子に関する。
任意の上記手段による臨床状態（癌または感染など）の処置方法は本発明の範囲に含まれるということになる。この手段には、臨床状態に罹患した個体への有効量の上記開示のワクチン組成物の投与、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含むペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子、または別の免疫刺激組成物および／または化学療法薬と共に上記ワクチンまたは分子を含む部分のキットが含まれる。
したがって、本発明の目的はまた、癌疾患の処置または防止のための医薬品の製造においてＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメントまたは上記ワクチン組成物を使用することである。
本発明のさらなる目的は、個体から血液サンプルを提供する工程、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯ、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、またはＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸を提供する工程、血液サンプルがタンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうか決定する工程、およびそれによってタンパク質またはペプチドに対する免疫応答が個体中で惹起されたかどうかを決定する工程を含む、免疫化をモニタリングする方法である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
医薬として使用するためのワクチン組成物であって、
ａ）配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）または配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、前記ＩＤＯまたは前記その機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、または前記ＩＤＯまたは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸、ならびに
ｂ）アジュバント
を含む、ワクチン組成物。
（項目２）
前記インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）が配列番号１のＩＤＯである、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目３）
前記免疫原性活性ペプチドフラグメントが５〜５０個の範囲のアミノ酸の連続配列からなる、項目１または２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目４）
前記免疫原性活性ペプチドフラグメントが、前記配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯの
ａ）８〜１１個の範囲のアミノ酸の連続配列および／または
ｂ）１８〜３０個の範囲のアミノ酸の連続配列または最多で２個のアミノ酸が置換されたその機能的ホモログ
である、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目５）
前記ワクチン組成物が、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態に罹患した個体に投与した場合に、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯまたはその機能的ホモログを発現する癌および／または抗原提示細胞に対して免疫応答を誘発することができる、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目６）
前記ワクチン組成物が個体の細胞性免疫応答を誘発することができる、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目７）
前記臨床状態が癌である、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目８）
前記臨床状態が感染である、項目１から６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目９）
以下の特徴：
ａ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したところ、臨床状態に罹患した個体のＰＢＬ集団において１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができ、そして／または
ｂ）腫瘍組織中でエピトープペプチドに反応性を示すＣＴＬをｉｎ ｓｉｔｕで検出することができ、
ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＤＯ特異的Ｔ細胞の成長を誘導することができる
の少なくとも１つを有するＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１０）
ＭＨＣクラスＩ分子によって拘束されるペプチドフラグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１１）
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるペプチドフラグメントを含む、先行する項目
のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１２）
ペプチドフラグメントを含み、前記ペプチドフラグメントが配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯ由来の８〜１０個または１８〜２５個の連続するアミノ酸からなる、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１３）
臨床状態に罹患した個体のＰＢＬ集団において１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができるペプチドフラグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１４）
配列番号１のＩＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログが発現する場合に臨床状態に罹患した個体のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができるペプチドフラグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１５）
癌疾患が腫瘍形成癌疾患である、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１６）
前記ペプチドフラグメントが、最多で５０個のアミノ酸残基、例えば、最多で４５個のアミノ酸残基（最多で４０個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で３５個のアミノ酸残基（最多で３０個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で２５個のアミノ酸残基（２０〜２５個のアミノ酸残基など）からなる、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１７）
前記ペプチドフラグメントが、最多で２０個のアミノ酸残基、例えば、最多で１９個のアミノ酸残基（最多で１８個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１７個のアミノ酸残基（最多で１６個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１５個のアミノ酸残基（最多で１４個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１３個のアミノ酸残基（最多で１２個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１１個のアミノ酸残基（８〜１０個のアミノ酸残基など）からなる、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１８）
前記ペプチドが配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および／または１１の群から選択される、項目１から１５および／または１７のいずれか１項に記載のペプチド。
（項目１９）
前記ペプチドが配列番号３および／または６（ＩＤＯ２および／またはＩＤＯ５）である、項目１から１５および／または１７から１８のいずれか１項に記載のペプチド。
（項目２０）
前記ワクチンが、ワクチン接種個体中でＩＤＯ発現癌細胞および／またはＩＤＯ発現抗原提示細胞に対して細胞傷害効果を有する調節性Ｔ細胞の産生を誘発する、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目２１）
前記ワクチン組成物が、被験体における腫瘍間質中の抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することができる、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目２２）
前記ワクチン組成物が被験体における臨床反応を誘発することができ、前記臨床反応が安定な疾患、部分的応答、または完全な寛解によって特徴づけられる、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目２３）
ＩＤＯではないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目２４）
前記アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、およびイミダゾキニリンからなる群から選択される、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目２５）
前記アジュバントがモンタニドＩＳＡアジュバントである、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目２６）
前記アジュバントがモンタニドＩＳＡ５１またはモンタニドＩＳＡ７２０である、項目２５に記載のワクチン組成物。
（項目２７）
前記アジュバントがモンタニドＩＳＡ５１である、項目２６に記載のワクチン組成物。
（項目２８）
前記アジュバントがＧＭ−ＣＳＦである、項目１から２４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目２９）
前記ワクチン組成物が、前記免疫原性活性ペプチドフラグメントまたは前記免疫原性活性ペプチドフラグメントをコードする核酸を含む抗原提示細胞を含む、先行する項目のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目３０）
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、項目２９に記載のワクチン組成物。
（項目３１）
前記核酸が項目２から１４のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目３２）
前記核酸がベクター内に含まれる、項目１または３１のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目３３）
前記ベクターが、ウイルスベクターおよび細菌ベクターからなる群から選択される、項目３２に記載のワクチン組成物。
（項目３４）
前記ベクターがＴ細胞刺激性ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目３２または３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目３５）
項目１から３４のいずれか１項に記載のワクチン組成物および第２の有効成分を含む部分のキット。
（項目３６）
前記第２の有効成分が免疫刺激組成物である、項目３５に記載のワクチン組成物を含む部分のキット。
（項目３７）
さらなる免疫刺激組成物が１つまたは複数のインターロイキンを含む、項目３５または３６のいずれか１項に記載の部分のキット。
（項目３８）
前記インターロイキンがＩＬ−２および／またはＩＬ−２１から選択される、項目３５から３７のいずれか１項に記載の部分のキット。
（項目３９）
前記第２の有効成分が抗癌剤である、項目１から３４のいずれか１項に記載のワクチン組成物を含む部分のキット。
（項目４０）
前記抗癌剤が化学療法薬である、項目３９に記載の部分のキット。
（項目４１）
前記化学療法薬が、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イリノテカン、レナリドマイド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブリミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンから選択される、項目３９または４０のいずれか１項に記載の部分のキット。
（項目４２）
前記第２の有効成分が抗生物質である、項目１から３４のいずれか１項に記載のワクチン組成物を含む部分のキット。
（項目４３）
前記抗生物質が、アモキシシリン、ペニシリン、アシクロビル、および／またはビダラビンから選択される、項目１から３および２０から４５のいずれか１項に記載のワクチン組成物を含む部分のキット。
（項目４４）
提供された前記組成物を同時または逐次的に投与する、項目３５から４３のいずれか１項に記載の部分のキット。
（項目４５）
項目１から１９のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントを含む、臨床状態に罹患した個体におけるＩＤＯに反応性を示すＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための組成物。
（項目４６）
項目１から１９のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントを含む、臨床状態に罹患した個体におけるＩＤＯに反応性を示すＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための診断キット。
（項目４７）
項目１から１９のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントとクラスＩ ＨＬＡ分子またはクラスＩＩ ＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントとの複合体。
（項目４８）
単量体である、項目４７に記載の複合体。
（項目４９）
多量体である、項目４７に記載の複合体。
（項目５０）
腫瘍組織または血液サンプルを項目４７に記載の複合体と接触させる工程、および前記組織または血球への前記複合体の結合を検出する工程を含む、臨床状態に罹患した個体におけるＩＤＯ反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法。
（項目５１）
項目１から１９のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子。
（項目５２）
抗体またはそのフラグメントである、項目５１に記載の分子。
（項目５３）
前記分子がＴ細胞受容体である、項目５１または５２のいずれか１項に記載の分子。
（項目５４）
項目５１または５３の分子の結合を遮断することができる分子。
（項目５５）
臨床状態に罹患した個体に有効量の項目１から３４のいずれか１項に記載の組成物、項目５１に記載の分子、または項目３５から４４のいずれか１項に記載の部分のキットを投与する工程を含む、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態を処置する方法。
（項目５６）
処置すべき前記臨床状態が、ＩＤＯが発現される癌疾患である、項目５５に記載の方法。（項目５７）
さらなる癌処置と組み合わせた項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置からなる群から選択される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
処置すべき前記臨床状態がＡＰＣ中でＩＤＯを発現させる感染である、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
前記感染に対するさらなる処置と組み合わせた、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記さらなる処置が、化学療法、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
臨床状態の処置または防止のための医薬品の製造における項目１から１９のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントまたは項目１から３４のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使用。
（項目６３）
処置すべき前記疾患が、ＩＤＯが発現される癌疾患である、項目６２に記載の使用。
（項目６４）
さらなる癌処置と組み合わせた項目６２または６３のいずれか１項に記載の使用。
（項目６５）
前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置からなる群から選択される、項目６４に記載の使用。
（項目６６）
処置すべき前記臨床状態がＡＰＣ中でＩＤＯを発現させる感染である、項目６２に記載の使用。
（項目６７）
前記感染に対するさらなる処置と組み合わせた、項目６６に記載の使用。
（項目６８）
前記さらなる処置が、化学療法、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置からなる群から選択される、項目６７に記載の使用。
（項目６９）
免疫化をモニタリングする方法であって、
ａ）個体から血液サンプルを提供する工程、
ｂ）配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯ、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、前記ＩＤＯまたは前記その機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、または前記ＩＤＯまたは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を提供する工程、
ｃ）前記血液サンプルがタンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうか決定する工程、
ｄ）それによって前記タンパク質またはペプチドに対する免疫応答が前記個体中で惹起されたかどうかを決定する工程
を含む、方法。
（項目７０）
前記ＩＤＯが配列番号１のＩＤＯである、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記ペプチドフラグメントが項目１から１９のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントである、項目６９または７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
癌および／または感染などのＩＤＯ発現に関連する臨床状態の処置または防止で用いる、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯ、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、前記ＩＤＯまたは前記その機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、または前記ＩＤＯまたは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸。
（項目７３）
癌の処置または防止で使用する、項目１から１９のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントまたは項目１から３４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
ＩＤＯに対するＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔ細胞応答。 ＩＤＯに対するＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔ細胞応答。 図２ａは、ＨＬＡ−Ａ２拘束ポジティブコントロールペプチドの結合。図２ｂは、腎細胞癌患者由来のＰＢＬ中のＩＤＯ５特異的ＣＤ８Ｔ細胞。図２ｃは、ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞の四量体分析。 図２ｄ〜ｆは、ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞の四量体分析。 ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローンの特異性および機能的能力。 ヒストグラムは細胞内ＩＤＯ染色を示す。 ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローン（ＲＢＳ３５）のＩＦＮ−γ処置乳癌細胞株を死滅させる機能的能力。 ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローン（ＲＢＳ３５）のＩＦＮ−γ処置乳癌細胞株を死滅させる機能的能力。 ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローン（ＲＢＳ３５）のＤＣを死滅させる機能的能力。 ５１Ｃｒ放出アッセイによってアッセイされたＩＤＯ５特異的Ｔ細胞の特異性および機能的能力。 ＩＤＯ配列であるＩＤＯ、ＩＤＯＡ、ＩＤＯＢ、およびＩＤＯＣの多重アラインメント。 ＩＤＯおよびＩＤＯＬＩＫＥのペアワイズアラインメント。
発明の詳細な説明
本発明の主な目的は、癌の防止、リスクの軽減、または処置における医薬品として使用するためのインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）またはその免疫原性活性ポリペプチドフラグメントを含むワクチン組成物を提供することである。
定義
アジュバント：投与される免疫原性決定基／抗原／核酸構築物と混合した場合に決定基に対する免疫応答を増加させるかそうでなければ改変する任意の物質。
アミノ酸：任意の合成または天然に存在するアミノカルボン酸であって、ペプチドおよびポリペプチド中に生じる任意のアミノ酸が含まれる（ｉｎ ｖｉｖｏで合成された（したがって、アミノ酸修飾物が含まれる）タンパク質および酵素が含まれる）。用語アミノ酸を、本明細書中で、少なくとも１つの他の種（２つなど）（例えば、３つ（３つを超える他の種など））と反応した記載のアミノ酸を含むことを意味する用語「アミノ酸残基」の同意語として使用する。総称アミノ酸は、天然および非天然のアミノ酸の両方を含み、そのいずれかが「Ｄ」または「Ｌ」異性体であり得る。
抗体：免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の活性部分。抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリン分子または免疫原性活性を保持するそのフラグメントである。
抗原：クローン的に分布した免疫受容体（Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体）に結合することができる任意の物質。通常、ペプチド、ポリペプチド、または多量体ポリペプチドである。抗原は、好ましくは、免疫応答を誘発することができる。
ＡＰＣ：抗原提示細胞。ＡＰＣは、その表面上にＭＨＣと複合体化した外来抗原を提示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの複合体を認識することができる。ＡＰＣは以下の２つのカテゴリーに分類される：プロフェッショナル（以下の３つの型が存在する：樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞）または非プロフェッショナル（ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合性遺伝子複合体タンパク質を構成的に発現せず、これらは、ＩＦＮ−γなどの一定のサイトカインによって非プロフェッショナルＡＰＣの刺激の際のみに発現される）。
追加免疫：追加抗原の注射または投与によって追加免疫するとは、さらなる用量の免疫剤（ワクチンなど）を、免疫剤の前の投与によって誘発された免疫応答を維持するために最初の投与後のある時点で投与することである。
癌：本明細書中では、良性または悪性の任意の前新生物疾患または新生物疾患であり、「新生物」は、細胞の異常な増殖をいう。
キャリア：免疫応答の誘導を補助するために抗原にカップリングされる実体または化合物。
キメラタンパク質：２つ以上の完全または部分的な遺伝子または一連の（非）ランダム核酸の同時スプライシングによって作製されたヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子操作されたタンパク質。
臨床状態：医学的配慮を必要とする様態（本明細書中では、特に、ＩＤＯ発現に関連する様態）。かかる様態の例には、癌および感染が含まれる。
補体：その作用が抗体の働きを「補完する」複雑な一連の血液タンパク質。補体は細菌を破壊し、炎症を引き起こし、免疫応答を調節する。
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球。Ｔ細胞受容体と共にＣＤ８を発現し、従って、クラスＩ分子によって提示される抗原に応答することができるＴ細胞の亜群。
サイトカイン：成長または分化のモジュレーター。この用語は本明細書中で非限定的に使用され、本発明および特許請求の範囲を制限すると解釈すべきではない。サイトカインに加えて、接着分子、アクセサリー分子、またはその任意の組み合わせを単独またはサイトカインと組み合わせて使用することができる。
送達ビヒクル：ヌクレオチド配列、ポリペプチド、またはその両方を少なくとも一方の媒体から他方に輸送することができる実体。
ＤＣ：樹状細胞。（ＤＣ）は免疫細胞であり、哺乳動物免疫系の一部を形成する。その主な機能は、抗原物質をプロセシングし、免疫系の他の細胞に対してその表面上に抗原物質を提示することである。したがって、ＤＣは抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。
フラグメント：フラグメントを、核酸またはポリペプチドの非全長部分を示すために使用する。したがって、フラグメント自体がそれぞれ核酸またはポリペプチドでもある。
機能的ホモログ：機能的ホモログは、野生型バージョン／所与の遺伝子の配列／遺伝子産物／タンパク質／ポリペプチドと少なくともいくつかの配列同一性を示し、且つ元の配列機能性の少なくとも一態様を保持している任意の核酸／タンパク質／ポリペプチドであり得る。本明細書中では、ＩＤＯの機能的ホモログは、ＩＤＯ発現細胞に対して免疫応答を誘導する能力を有する。
ＩＤＯ：インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ。配列番号：（１、１３、１４、１５、および１６）で識別する。
個体：一般に、鳥類、哺乳動物、魚類、両生類、または爬虫類の任意の種または亜種、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくはヒト。
感染：本明細書中では、用語「感染」は、免疫応答を生じる任意の種類の臨床状態に関する。したがって、感染、慢性感染、自己免疫性容態、およびアレルギー性炎症が含まれる。
単離：本明細書中に開示の核酸、ポリペプチド、および抗体に関連して使用される、「単離」は、これらをその天然の、典型的には細胞の環境の成分から同定および分離し、そし／または回収することをいう。本発明の核酸、ポリペプチド、および抗体を好ましくは単離し、本発明のワクチンおよび他の組成物は、好ましくは、単離した核酸、ポリペプチド、または単離した抗体を含む。
ＭＨＣ：主要組織適合性遺伝子複合体であって、２つの主なＭＨＣサブクラスであるクラスＩおよびクラスＩＩが存在する。
核酸：遺伝情報を伝達するヌクレオチドの鎖または配列。本発明に関して、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
核酸構築物：遺伝子操作された核酸。典型的には、いくつかのエレメント（遺伝子または遺伝子のフラグメント、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡテール、リンカー、ポリリンカー、操作リンカー、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、マーカー、終止コドン、他の調節エレメント、または内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）など）を含む。
操作リンカー：核酸またはポリペプチドの生物学的プロセシングを確保する様式で核酸構築物または（キメラ）ポリペプチドの２つの部分と共に結合するヌクレオチド配列またはアミノ酸残基配列。
病原体：疾患の特異的原因因子、特に、その宿主に疾患を引き起こし得る生物学的因子（ウイルス、細菌、プリオン、または寄生虫など）。感染性因子ともいう。
ＰＢＬ：末梢血球は、循環血液内で見出されるが、リンパ系、脾臓、肝臓、または骨髄内で隔絶されない血液中の有形成分（赤血球、白血球、および血小板からなる）である。
ＰＢＭＣ：末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、円形の核を有する血球（リンパ球または単球など）である。これらの血球は、感染と戦い、侵入者に適応するための免疫系における重要成分である。リンパ球集団は、Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８陽性、約７５％）、Ｂ細胞およびＮＫ細胞（合わせて約２５％）からなる。
ペプチド：配列を定義し、アミド結合によって結合された複数の共有結合アミノ酸残基。この用語を、オリゴペプチドおよびポリペプチドと同様に使用する。天然および／または非天然のアミノ酸を、ペプチド結合または非ペプチド結合によって結合することができる。用語ペプチドはまた、当該分野で公知の化学反応または酵素触媒反応によって導入された翻訳後修飾を含む。本用語は、ポリペプチドのバリアントまたはフラグメントをいうことができる。
薬学的キャリア：賦形剤または安定剤ともいい、使用した投薬量および濃度で曝露された細胞または個体に無害である。しばしば、生理学的に許容可能なキャリアは水性ｐＨ緩衝液である。生理学的に許容可能なキャリアの例には、緩衝液（リン酸、クエン酸、および他の有機酸の緩衝液など）；抗酸化剤（アスコルビン酸が含まれる）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）など）が含まれる。
複数：少なくとも２つ。
プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼが結合して１つまたは複数の近隣の構造遺伝子によって伝令ＲＮＡの転写が開始されるＤＮＡ鎖中の結合部位。
シグナルペプチド：．細胞中のタンパク質の最終的な位置を決定するアミノ酸の短い配列。ソーティングペプチドともいう。
界面活性剤：溶解される液体の表面張力を軽減することができる表面活性剤。界面活性剤は、親水性を示す極性基および疎水性を示す非極性基を含み、しばしば、脂肪鎖から構成される化合物である。
Ｔｒｅｇ：調節性Ｔ細胞／Ｔリンパ球
ワクチン：動物において免疫応答を誘導することができる物質または組成物。本明細書中では免疫原性組成物ともいう。免疫応答は、一次反応よりもむしろ二次反応によって対処され、それによって宿主生物に及ぼす影響が軽減される生物（感染性因子を生じる）における免疫応答（体液性／抗体および／または細胞性）誘導性記憶である。本発明のワクチンを、予防および／または治療用医薬品として投与することができる。組成物は、以下のうちの１つまたは複数を含むことができる：抗原、Ｉｉに作動可能に連結された１つまたは複数の抗原を含む核酸構築物、キャリア、アジュバント、および薬学的キャリア。
バリアント：所与の基準となる核酸またはポリペプチドの「バリアント」は、基準となる核酸またはポリペプチドとある程度の配列相同性／同一性を示すが、基準となる核酸またはポリペプチドと同一でない核酸またはポリペプチドをいう。
インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ
インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、Ｌ−トリプトファンのＮ−ホルミルキヌレニンへの変換を触媒する酵素であり、したがって、キヌレニン経路によるトリプトファン異化の第１の律速酵素である。トリプトファンの異化によってトリプトファンが枯渇し、それにより、Ｔ細胞応答が抑制され、哺乳動物の妊娠、腫瘍抵抗性、慢性感染、自己免疫、およびアレルギー性炎症における免疫寛容を促進する。したがって、癌だけでなく一般的な感染（特に、慢性感染）、自己免疫、およびアレルギー性炎症も、特に、本発明に関連する全ての臨床状態である。
ＩＤＯは、ヒトにおいて以下の５つの形態で存在する：ＩＤＯ、ＩＤＯＡ、ＩＤＯＢ、ＩＤＯＣ、およびＩＤＯＬＩＫＥ（文献ではＩＤＯ２としても公知）。ＩＤＯは、配列番号１に開示の４０３アミノ酸残基長のポリペプチドであり、配列番号１６のＩＤＯＬＩＫＥと共に本明細書中で好ましいＩＤＯである。他のＩＤＯもまた本発明に関連するが、これらについてはほとんど知られておらず、本明細書中でＩＤＯＡ：配列番号１３、ＩＤＯＢ：配列番号１４、およびＩＤＯＣ：配列番号１５として識別する。ＩＤＯＬＩＫＥはＩＤＯほど広く発現しないが、関連物質と同様に、トリプトファン異化によって免疫寛容が駆動される抗原提示樹状細胞中でも発現する。ＩＤＯのように、ＩＤＯＬＩＫＥはトリプトファンを触媒し、翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を誘発し、ＬＩＰ（免疫調節転写因子ＮＦ−ＩＬ６の阻害イソ型）の翻訳を駆動する（Ｐｏｐｏｖ ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，２００８）。本明細書中の用語ＩＤＯは、一般に、上記ＩＤＯの全ておよびその対応する配列をいう。
ＩＤＯは主な免疫調節分子として同定されており、この分子は、免疫応答の調節下にあるいくつかの負のフィードバック機構の一部である。この様式では、ＩＤＯは癌において重要な免疫抑制機能も発揮する。本発明を基礎とする研究では、ＩＤＯ自体が免疫応答の標的として役立つことができ、免疫療法、特に癌治療に活用することができるかどうかを試験した。「逆免疫学的」アプローチにより、ＩＤＯタンパク質内にＨＬＡ−Ａ２ペプチドが同定され、これに対する自発的なＴ細胞反応性が非関連腫瘍型（すなわち、黒色腫、腎細胞癌、および乳癌）に罹患した患者で検出された。これらの天然に存在するＴ細胞応答は、容易に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後にＨＬＡ／ペプチド四量体を使用したフローサイトメトリーによって視覚化されるだけでなく、直接的なｅｘ ｖｉｖｏアッセイによっても視覚化された。さらに、ＩＤＯ反応性Ｔ細胞が実際にペプチド特異的細胞傷害性エフェクター細胞であることが明白に確認された。言い換えると、ＩＤＯ特異的Ｔ細胞は、異なる起源（黒色腫、結腸癌腫、乳癌など）のＩＤＯ＋癌細胞株および直接的にｅｘ ｖｉｖｏ富化したＡＭＬ芽球を有効に溶解する。非関連癌型に罹患した患者由来のＰＢＬ中のＩＤＯ由来ペプチドエピトープに対する自発的ＣＴＬ応答の存在およびＩＤＯ特異的Ｔ細胞による異なる起源の癌細胞の死滅は、ＩＤＯの免疫療法への潜在性を明確に示す。ＩＤＯ特異的ＣＴＬがＩＤＯ＋成熟ＤＣを認識して死滅させ、それにより、ＩＤＯ特異的Ｔ細胞が免疫コンピテントＤＣを死滅させることができるという所見がさらにより特徴的である。最近の報告では、ＩＤＯが成熟の際にヒトＤＣで上方制御されることが証明されている２３，２４。さらに、ＩＤＯ発現は癌患者におけるワクチン接種を意図するＤＣでも認められ、この発現はｓ．ｃ．（皮下）注射後にｉｎ ｓｉｔｕで維持される２５。ＤＣベースの治療ワクチン中のＩＤＯ発現は、ＦｏｘＰ３（＋）Ｔｒｅｇの誘引または誘導を介して重要な臨床的関連性を保持する。
ＩＤＯの二元的役割−免疫応答の初期段階およびエフェクター段階の両方の阻害−は相互排他的ではない。実際、共に所与の腫瘍で機能する可能性が高い。ＩＤＯが癌の免疫療法の結果に高度に関連し得るさらなる役割が存在する（炎症誘導性の拮抗機構としての役割）。拮抗応答は、免疫応答の強度および範囲を制限するのに役立つので、免疫系で重要である一方で、宿主に危険な損害を与え得る。しかし、抗癌免疫療法に関して、拮抗応答は腫瘍に対して強い免疫応答を生じる能力を拮抗する。拮抗は、拮抗が免疫活性化に応答した場合のみ誘発される二次事象であるという意味で寛容と異なる。ＩＤＯは、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンの両方によって誘導されることが公知であり、これらのインターフェロンは免疫活性化部位および炎症部位で見出される可能性が高い２６，２７。特に、ＩＤＯ反応性Ｔ細胞による死滅に対する腫瘍細胞の感受性がＩＦＮ−γとのプレインキュベーションによって増加することを本明細書中で証明する。同様に、共刺激分子４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の全身結紮によってＩＤＯが誘導されることが報告されている２８。定義によれば、ほとんどの抗癌免疫治療ストラテジーは、その分子標的と無関係に免疫学的な活性化および炎症の誘導を目的とする（例えば、ワクチン部位または腫瘍内）。実質的に、許容可能な毒性の範囲内でできるだけ高く免疫活性化することが目的である。したがって、拮抗は望ましくない。これに関して、ＣＴＬＡ−４遮断（すなわち、抗ＣＴＬＡ−４抗体）を用いた黒色腫および腎細胞癌患者の両方の処置において、小腸結腸炎と腫瘍退縮との間の関連が報告されている２９。したがって、自己免疫反応は、臨床的有効性と明確に相関する３０，３１。ＣＴＬＡ−４遮断は、自己抗原に対する末梢寛容の減少によるその自己腫瘍効果およびＩＲＡＥ誘導効果ならびにＴｒｅｇ機能の阻害によるＴ細胞活性化の増加を媒介すると考えられる。
ＩＤＯ発現細胞が他の免疫治療アプローチの所望の効果を拮抗するので、例えば、ワクチン接種、Ｔ細胞の養子移入、または免疫刺激剤によるＩＤＯ発現細胞のターゲティング（その全てが本発明の態様である）により、必然的にさらなる抗癌免疫療法との作用が相乗的に高くなる。本発明の開示では、ＣＴＬ規定ＩＤＯエピトープが治療的ワクチン接種で広く適用可能であり、したがって、実質的に免疫療法として有益であることを証明する。
したがって、本発明の一態様は、臨床状態処置のための医薬品として使用するためのインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）またはその免疫原性活性ポリペプチドフラグメントを含むワクチン組成物を提供することである。前述の臨床状態は癌であり得る。本発明のさらなる態様は、癌を防止するか、リスクを軽減するか、処置することである。別の態様は、他の医薬品（免疫治療用の医薬品および／または化学療法薬など）と組み合わせた本発明のワクチン組成物の使用に関する。さらなる態様は、ウイルスおよび／または微生物起源の疾患の処置のための本明細書中に開示のワクチン組成物の使用、さらに、他の医薬品（免疫治療用の医薬品および／または抗生物質および／または抗ウイルス薬など）と組み合わせたワクチンの使用に関する。
機能的ホモログ
配列
野生型ヒトＩＤＯ（すなわち、天然に存在するタンパク質の非変異バージョン）を配列番号１で識別する。本発明は、ＩＤＯ、ＩＤＯの免疫原性活性ペプチドフラグメント、最多で２個のアミノ酸が置換されたＩＤＯのペプチドフラグメント、および／または配列番号１と少なくとも７０％の配列が同一のＩＤＯの機能的ホモログを含むワクチン組成物を対象とする。用語ポリペプチドフラグメントを、本明細書中で、配列番号１で識別したＩＤＯに直接由来するか、同一であるように合成されたか、少なくとも７０％同一の配列を有するように合成されたアミノ酸残基の任意の非全長（配列番号１と比較した場合）ストリングを定義するために使用する。
機能的ホモログを、野生型ＩＤＯ（野生型ヒトＩＤＯなど）と配列が異なるが依然としてＩＤＯ発現細胞（癌細胞およびＤＣなど）に対する免疫応答を誘導することができるＩＤＯの全長またはフラグメントと定義することができる。これらの細胞中で発現したＩＤＯは、野生型であり得るか、内因性に変異されていてよい（先天性変異体または細胞分裂の間に誘導された変異など）。機能的ホモログは、野生型ＩＤＯの変異バージョンまたはオルタナティブスプライスバリアントであり得る。別の態様では、ＩＤＯの機能的ホモログを、本明細書中の下記のように定義する。機能的ホモログは、ｅｘ ｖｉｖｏで導入された１つまたは複数の変異および／または１つまたは複数の配列の欠失および／または付加を有する全長または断片化されたＩＤＯの組換えバージョンであり得るが、これらに限定されない。
ＩＤＯの機能的ホモログは、配列番号１と少なくともいくつかの配列が同一であり、且つＩＤＯ発現細胞に対する免疫応答を誘導する能力を有する任意のタンパク質／ポリペプチドであり得る。
したがって、特定の実施形態では、本発明の免疫原性活性ペプチドフラグメントは、５０個のアミノ酸残基、例えば、最多で４５個のアミノ酸残基（最多で４０個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で３５個のアミノ酸残基（最多で３０個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で２５個のアミノ酸残基（配列番号１で識別されるＩＤＯの１８〜２５個の連続アミノ酸またはその機能的ホモログなど）からなり、機能的ホモログは、最多で３個のアミノ酸（２個のアミノ酸（１個のアミノ酸など）など）が置換された機能的ホモログである。
したがって、別の特定の実施形態では、本発明の免疫原性活性ペプチドフラグメントは、最多で２５個のアミノ酸残基（最多で２４個のアミノ酸残基など、最多で２３個のアミノ酸残基など、最多で２２個のアミノ酸残基など、最多で２１個のアミノ酸残基など、最多で２０個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１９個のアミノ酸残基（最多で１８個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１７個のアミノ酸残基（最多で１６個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１５個のアミノ酸残基（最多で１４個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１３個のアミノ酸残基（最多で１２個のアミノ酸残基など）、例えば、最多で１１個のアミノ酸残基（配列番号１のＩＤＯ由来の８〜１０個の連続アミノ酸またはその機能的ホモログなど）からなり、機能的ホモログは、最多で３個のアミノ酸（２個のアミノ酸（１個のアミノ酸など）など）が置換された機能的ホモログである。好ましくは、ペプチドは、ＩＤＯ由来の最多で１０個の連続アミノ酸残基（配列番号１で識別したＩＤＯ由来の最多で９個の連続アミノ酸残基など、８個の連続アミノ酸残基など、７個の連続アミノ酸残基など）またはその機能的ホモログを含み、機能的ホモログは、最多で３個のアミノ酸（２個のアミノ酸（１個のアミノ酸など）など）が置換された機能的ホモログである。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明のペプチドはノナペプチド（９個のアミノ酸残基を含むペプチド）およびいくつかのデカペプチド（１０残基を含む）であり、これらは以下の制限されない群から選択することができる（最初にペプチド名、次に配列、ＩＤＯ配列中の位置および配列番号）：ＩＤＯ１：ＱＬＲＥＲＶＥＫＬ（５４〜６２）（配列番号２）；ＩＤＯ２：ＦＬＶＳＬＬＶＥＩ（１６４〜１７２）（配列番号３）；ＩＤＯ３：ＴＬＬＫＡＬＬＥＩ（１９５〜２０３）（配列番号４）；ＩＤＯ４：ＦＩＡＫＨＬＰＤＬ（４１〜４９）（配列番号５）；ＩＤＯ５：ＡＬＬＥＩＡＳＣＬ（１９９〜２０７）（配列番号：６）；ＩＤＯ６：ＶＬＳＫＧＤＡＧＬ（３２０〜３２８）（配列番号：７）；ＩＤＯ７：ＤＬＭＮＦＬＫＴＶ（３８３〜３９１）（配列番号８）；ＩＤＯ８：ＶＬＬＧＩＱＱＴＡ（２７５〜２８３）（配列番号９）；ＩＤＯ９：ＫＶＬＰＲＮＩＡＶ（１０１〜１０９）（配列番号１０）；ＩＤＯ１０：ＫＬＮＭＬＳＩＤＨＬ（６１〜７０）（配列番号１１）；ＩＤＯ１１：ＳＬＲＳＹＨＬＱＩＶ（３４１〜３５０）（配列番号１２）。好ましくは、本発明のペプチドは、ＩＤＯ５：ＡＬＬＥＩＡＳＣＬ（１９９〜２０７）（配列番号６）；ＩＤＯ２：ＦＬＶＳＬＬＶＥＩ（１６４〜１７２）（配列番号３）；および／またはＩＤＯ６：ＶＬＳＫＧＤＡＧＬ（３２０〜３２８）（配列番号７）である。最も好ましくは、本発明のワクチン組成物は、ＩＤＯ５：ＡＬＬＥＩＡＳＣＬ（１９９〜２０７）（配列番号６）の少なくとも１つのペプチドを含む。
本発明の他のペプチドは、４個と１２０個との間、好ましくは８個と１００個との間、より好ましくは１０個と７５個との間、さらにより好ましくは１２個と６０個との間、さらにより好ましくは１５個と４０個との間（１８個と２５個との間など）の配列番号１のＩＤＯの連続アミノ酸または配列番号１と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログを含み（より好ましくは、からなり）、ここで、配列番号１のＩＤＯの最多で３個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されている（２個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているか、１個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているなど）。
本発明の１つの実施形態では、ＩＤＯペプチドはバリアントペプチドを含む。本明細書中で使用する場合、表現「バリアント」は、適切にはヒトＩＤＯである基本タンパク質に相同であるが、配列内の１つまたは複数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるという点でペプチドが由来する基本配列と異なるペプチドをいう。適切には、バリアントは、最多で６個のアミノ酸置換、例えば、最多で５個のアミノ酸置換（最多で４個のアミノ酸置換など）、例えば、最多で３個のアミノ酸置換（最多で２個のアミノ酸置換など）、例えば、最多で１個のアミノ酸置換を有するであろう。
適切には、バリアントは、配列番号１のＩＤＯに対して少なくとも７０％の配列同一性を共有するであろう。したがって、バリアントは、好ましくは、ヒトＩＤＯ配列と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、少なくとも８０％の配列同一性（少なくとも８５％の配列同一性など）、例えば、少なくとも９０％の配列同一性（少なくとも９１％の配列同一性など）、例えば、少なくとも９１％の配列同一性（少なくとも９２％の配列同一性など）、例えば、少なくとも９３％の配列同一性（少なくとも９４％の配列同一性など）、例えば、少なくとも９５％の配列同一性（少なくとも９６％の配列同一性など）、例えば、少なくとも９７％の配列同一性（少なくとも９８％の配列同一性など）、例えば、９９％の配列同一性を有する。
配列同一性を、多数の周知のアルゴリズムを使用し、多数の異なるギャップペナルティを適用して計算することができる。配列同一性を、全長配列番号１と比較して計算する。任意の配列アラインメントツール（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＬＡＬＩＧＮなどであるが、これらに限定されない）を、相同性検索および配列同一性の計算のために使用することができる。さらに、必要に応じて、任意の一般的に知られている置換行列（ＰＡＭ行列、ＢＬＯＳＳＵＭ行列、またはＰＳＳＭ行列などであるが、これらに限定されない）を検索アルゴリズムと共に適用することができる。例えば、ＰＳＳＭ（位置特異的スコアリング行列）を、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを介して適用することができる。さらに、配列アラインメントを、ギャップオープニングおよびギャップ伸長についてのペナルティ範囲を使用して行うことができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを、５〜１２の範囲のギャップオープニングペナルティおよび１〜２の範囲のギャップ伸長ペナルティと共に使用することができる。
機能的等価物は、ヒトタンパク質中に天然に存在しないアミノ酸（アミノ酸）（オルニチンなど）の化学修飾（ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種、種々の酵素などを使用）、ペグ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）、または挿入（または化学合成による置換）など）をさらに含むことができるが、機能的等価物は化学修飾を含まないことが好ましい。
配列番号１のＩＤＯのアミノ酸残基配列と比較したアミノ酸残基配列の任意の変化は、保存的置換であることが好ましい。当業者は、一方のアミノ酸を１つまたは複数の共通の化学的および／または物理的特徴を有する他方のアミノ酸と置換する「保存的」アミノ酸置換の作製および評価方法を理解しているであろう。保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性に影響を及ぼす可能性が低い。アミノ酸を、共通の特徴にしたがって分類することができる。保存的アミノ酸置換は、所定のアミノ酸群内の一方のアミノ酸の同一群内の別のアミノ酸との置換であり、ここで、所定の群内のアミノ酸が類似または実質的に類似の特徴を示す。
したがって、本発明の１つの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１のＩＤＯの８〜５０個の範囲のアミノ酸、好ましくは８〜１０個または２０〜２５個の範囲のアミノ酸の連続配列からなり、最多で３個のアミノ酸が置換され、置換が好ましくは保存的であるポリペプチドを含む。
ＭＨＣ
以下の２つのＭＨＣ分子型が存在する：ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子。ＭＨＣクラスＩ分子は、適応免疫応答の主なエフェクター細胞であるＣＤ８Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、主に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現し、樹状細胞であることが最も重要なようである。ＡＰＣは、ナイーブＴ細胞および免疫系中の他の細胞を刺激する。これらは、ＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞の両方を刺激する。
１つの実施形態では、いくつかの特徴のうちの少なくとも１つを有することによって特徴づけられる配列番号１のＩＤＯ由来の８〜１０個のアミノ酸または最多で２個の配列番号１のアミノ酸が置換されたその機能的ホモログからなる新規のＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドフラグメントを提供する。このいくつかの特徴のうちの１つは、本明細書中に記載のアセンブリ結合アッセイによって決定したところ、最多で５０μＭであるクラスＩ ＨＬＡ分子の最大半量の回収（Ｃ５０値）が可能なペプチド量によって測定される親和性で拘束されるクラスＩ ＨＬＡ分子に結合する能力である。このアセンブリアッセイは、ペプチド輸送体欠損細胞株Ｔ２へのペプチドの負荷後のＨＬＡ分子の安定化に基づく。その後に、正確に折り畳まれた安定なＨＬＡ重鎖を、構造依存抗体を使用して免疫沈降し、ペプチド結合を定量する。本実施形態のペプチドは、最多で２００、好ましくは最多で１００、より好ましくは最多で５０、さらにより好ましくは最多で２５、さらにより好ましくは最多で２０、なおさらにより好ましくは最多で１５（最多で１０個など）（例えば、配列番号１のＩＤＯの８〜１０個の連続アミノ酸の範囲）または最多で２個の配列番号１のアミノ酸が置換されたその機能的ホモログを含む（より好ましくは、からなる）。
本アッセイは、上記親和性で所与のＨＬＡ対立遺伝子分子に結合する能力についての候補ペプチドの簡潔なスクリーニング手段を提供する。好ましい実施形態では、本発明のペプチドフラグメントは、最大で３０μＭのＣ５０値（最大で２０μＭのＣ５０値（最大で１０μＭ、最大で５μＭ、および最大で２μＭのＣ５０値が含まれる）など）を有する。
別の好ましい実施形態では、本明細書中の下記のいくつかの特徴のうちの少なくとも１つを有することによって特徴づけられる、配列番号１のＩＤＯの新規のＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドフラグメントまたは最多で２個の配列番号１のアミノ酸が置換されたその機能的ホモログ（本明細書中で「ペプチド」ともいう）を提供する。本実施形態のペプチドは、４個と１２０個との間、好ましくは８個と１００個との間、より好ましくは１０個と７５個との間、さらにより好ましくは１２個と６０個との間、さらにより好ましくは１５個と４０個との間（１８個と２５個との間など）の配列番号１の配列番号１のＩＤＯの連続アミノ酸または最多で２個の配列番号１のアミノ酸が置換されたその機能的ホモログを含む（より好ましくは、からなる）。
したがって、本明細書中の下記のいくつかの特徴のうちの少なくとも１つを有することによって特徴づけられ、そのうちの１つが拘束されるクラスＩまたはクラスＩＩ ＨＬＡ分子に結合する能力である、配列番号１のＩＤＯの８〜１０個のアミノ酸の新規のＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドフラグメントまたは１８〜２５個のアミノ酸の新規のＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドフラグメントまたは最多で２個の配列番号１のアミノ酸が置換されたその機能的ホモログを提供する。
特定の実施形態では、以下の特徴：
（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したところ、癌患者のＰＢＬ集団において１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができること、および／または
（ｉｉ）腫瘍組織中でエピトープペプチドに反応性を示すＣＴＬをｉｎ ｓｉｔｕで検出することができること、
（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＤＯ特異的Ｔ細胞の成長を誘導することができることの少なくとも１つを有するＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドであるペプチドフラグメントを提供する。
より好ましい本発明のペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（例えば、下記の実施例１に記載のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）によって決定したところ特異的Ｔ細胞応答を惹起することができるペプチドである。いくつかのペプチドはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩと高親和性で結合しないが、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定したところＴ細胞応答を依然として生じ得る。ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩと高親和性で結合することができる他のペプチドはまた、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定したところＴ細胞応答を生じる。両方の種類のペプチドが、本発明の好ましいペプチドである。
それ故、本発明の好ましいペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した場合に１０８個の細胞あたり、より好ましくは１０７個の細胞あたり、さらにより好ましくは１０６個の細胞あたり、さらにより好ましくは１０５個の細胞あたり（１０４個の細胞あたりなど）５０個を超えるペプチド特異的スポットが測定される、特異的Ｔ細胞応答を惹起することができるペプチドである。
本発明の最も好ましいペプチドは、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態に罹患した個体において細胞性免疫応答を誘発することができるペプチドである。臨床状態は、好ましくは癌または感染であり、最も好ましくは癌である。
本明細書中に記載のように、ＨＬＡ系は、ヒト主要組織適合（ＭＨＣ）系を示す。一般に、ＭＨＣ系は、以下の範囲の特徴を調節する：移植抗原、胸腺依存性免疫応答、一定の補体因子、および一定の疾患の素因。より具体的には、ＭＨＣは、ＭＨＣのより一般的な特徴を決定する３つの異なる分子型（すなわち、クラスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ分子）をコードする。３つの分子のうち、クラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞および血小板の表面上に存在するいわゆるＨＬＡ−Ａ分子、ＨＬＡ−Ｂ分子、およびＨＬＡ−Ｃ分子である。
本発明のペプチドは、特定のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子に結合する（によって拘束される）能力によって特徴づけられる。したがって、１つの実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ分子（ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ１０、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａｗ１９、ＨＬＡ−Ａ２３（９）、ＨＬＡ−Ａ２４（９）、ＨＬＡ−Ａ２５（１０）、ＨＬＡ−Ａ２６（１０）、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３０（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３１（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３２（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３３（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３４（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ３６、ＨＬＡ−Ａｗ４３、ＨＬＡ−Ａｗ６６（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ６８（２８）、ＨＬＡ−Ａ６９（２８）が含まれる）によって拘束されるペプチドである。最初の数字表示のみを使用するより簡潔な表示も文献を通して使用されている（例えば、それぞれ、ＨＬＡ−Ａｗ１９およびＨＬＡ−Ａ２４（４９）の代わりにＨＬＡ−Ａ１９またはＨＬＡ−Ａ２４）。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ種に拘束される。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ種であるＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３に拘束される。
さらに有用な実施形態では、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ分子（以下のいずれかが含まれる：ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ１７、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ２１、ＨＬＡ−Ｂｗ２２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂｗ４１、ＨＬＡ−Ｂｗ４２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂｗ４６、およびＨＬＡ−Ｂｗ４７）によって拘束されるペプチドである。本発明の特定の実施形態では、本発明のペプチドが結合することができるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ種は、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７、およびＨＬＡ−Ｂ５１から選択される。
さらに有用な実施形態では、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｃ分子（以下のいずれかが含まれるがこれらに制限されない：ＨＬＡ−Ｃｗ１、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、およびＨＬＡ−Ｃｗ１）によって拘束されるペプチドである。
さらに有用な実施形態では、本発明のペプチドは、ＭＨＣ クラスＩＩ ＨＬＡ分子（以下のいずれかにが含まれるがこれらに制限されない：ＨＬＡ−ＤＰＡ−１、ＨＬＡ−ＤＰＢ−１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ、これらの群内の全ての対立遺伝子、およびＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ）によって拘束されるペプチドである。
特定のＨＬＡ分子に結合する能力を潜在的に有するペプチドを、所与の特定のＨＬＡ分子に結合する既知の配列のアラインメントによって選択することができ、それにより、ペプチド中の特定の位置でのいくつかの関連アミノ酸の優性が明らかとなる。かかる優性のアミノ酸残基は、本明細書中で、「アンカー残基」または「アンカー残基モチーフ」ともいう。アクセス可能なデータベース中で見出すことができる既知の配列データに基づいたかかる比較的簡潔な手順にしたがうことにより、ペプチドは、特異的ＨＬＡ分子に結合する可能性が高いＩＤＯに由来し得る。ＨＬＡ分子範囲についてのかかる分析の代表例を、以下の表に示す。

＊１つの実施形態では、この位置に特異的なアンカー残基は存在しないが、好ましい実施形態では、アンカー残基はＲまたはＡである。
したがって、一例として、ＨＬＡ−Ａ３に結合する能力を潜在的に有するノナペプチドは、以下の配列の１つを有するであろう：Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｋ、Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｙ、Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｆ、またはＸａａ−Ｖ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｋ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を示す）。類似の様式で、任意の他のＨＬＡ分子に結合する能力を潜在的に有する配列をデザインすることができる。当業者は所与のＨＬＡ分子についてのさらなる「アンカー残基モチーフ」を同定することができると認識されるであろう。
本発明のペプチドは、由来するＩＤＯの未変性配列である配列を有することができる。しかし、任意の所与のＨＬＡ分子に対してより高い親和性を有するペプチドは、例えば、上記手順に基づいた少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失、または付加による配列の修飾によってかかる未変性配列から誘導することができ、それにより所与のＨＬＡ分子に関するアンカー残基モチーフが同定される。
したがって、有用な実施形態では、本発明のポリペプチドには、その配列が表に列挙した各特異的ＨＬＡ対立遺伝子について表中に示す任意のアミノ酸残基を含むペプチドが含まれる。
したがって、本発明のペプチドは、好ましくは上記表中に示す所与のＨＬＡ−Ａ特異的ペプチドの１つまたは複数の、好ましくは全てのアンカー残基をペプチドが含む様式で１〜１０個の範囲、好ましくは１〜５個の範囲、より好ましくは１〜３個の範囲、さらにより好ましくは１〜２個の範囲、さらにより好ましくは１個のアミノ酸が別のアミノ酸と交換された、ＩＤＯ由来の連続配列を含む任意の上記ペプチドであり得る。
本発明の好ましいペプチドが拘束される好ましいＨＬＡ種の例には、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ種が含まれ、より好ましくはペプチドはＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ａ２によって拘束される。あるいは、好ましいＨＬＡ種には、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７、およびＨＬＡ−Ｂ５１からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ種が含まれる。
本発明のポリペプチドを同定するためのアプローチは、以下の工程：特定のＨＬＡ分子（例えば、所与の集団中に高比率で存在するもの）を選択する工程、上記アラインメント分析を行ってＩＤＯタンパク質中の「アンカー残基モチーフ」を同定する工程、１つまたは複数の同定したアンカー残基を含む適切なサイズのペプチドを単離または構築する工程、および実施例１に記載のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したところ、癌患者のＰＢＬ集団において１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発するペプチドの能力について得られたペプチドを試験する工程を含む。
本発明の一態様では、８〜１０個のアミノ酸残基より長いＩＤＯ由来ペプチドを提供する。８〜１０個のアミノ酸より長いポリペプチドを、ＨＬＡ分子に結合させるためにプロテアソームによってより短い長さにプロセシングする。したがって、８〜１０個のアミノ酸残基長を超えるポリペプチドを投与する場合、ＩＤＯの「長い」ポリペプチド／タンパク質／タンパク質フラグメント／バリアントを、プロテアソームによってサイトゾル中で一連のより小さなペプチドにプロセシングする。プロテアソームによって種々の異なるより短いペプチドにプロセシングすることができるより長いポリペプチドを使用することの利点は、１つのペプチドを使用して、特定のＨＬＡクラスに拘束される８〜１０個のアミノ酸のペプチドよりも多数のＨＬＡクラスをターゲティングすることができることである。
驚いたことに、本発明のいくつかのペプチドは、置換を不必要にするのに十分に高い親和性でＭＨＣ分子に結合し（図２を参照のこと）、ここでペプチドが提示される場合に抗原として使える状態にある。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、１つまたは複数の以下を含む：ＩＤＯタンパク質（配列番号１）、これに由来するポリペプチドフラグメント、同様にバリアント、全長および部分的な長さのＩＤＯの機能的ホモログ、ＩＤＯの連続ペプチド、およびこれらの機能的ホモログ。より好ましくは、ワクチン組成物は、本開示の配列表に列挙した任意の配列を含む。非常に好ましくは、ワクチン組成物は、ペプチドＩＤＯ５（配列番号６）、ＩＤＯ２（配列番号３）、および／またはＩＤＯ６（配列番号７）を含む。
本発明のペプチドの特筆すべき特徴は、癌および／または感染に罹患した個体のＡＰＣまたは腫瘍細胞／新生物細胞（標的細胞）上でＰＢＬ集団中の特定のペプチドを特異的に認識するＩＮＦ−γ産生反応Ｔ細胞（すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ））を認識または誘発する能力である。この活性は、個体由来のＰＢＬ、ＡＰＣ、または腫瘍細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供することによって容易に決定される。アッセイ前に、細胞を試験すべきペプチドと接触させることによってアッセイすべき細胞を刺激することが有利であり得る。好ましくは、ペプチドは、本明細書中で使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したところ、１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度でＩＮＦ−γ産生Ｔ細胞を誘発または認識することができる。より好ましくは、頻度は、１０４個のＰＢＬあたり少なくとも５個、最も好ましくは１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１０個（１０４個のＰＢＬあたり少なくとも５０個または１００個など）である。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＩＤＯペプチド特異的Ｔ細胞応答をモニタリングするための強力なツールである。本明細書中の所見は、本発明のペプチドが発現され、癌細胞および／またはＩＤＯ発現ＡＰＣ上のＨＬＡ分子と複合体を形成することを主に意味する。これにより、これらの癌細胞がＣＴＬによる破壊に感受性を示すようになり、癌および感染と戦うためのＩＤＯ免疫化の潜在的有用性が強調される。黒色腫患者由来のＰＢＬにおけるＨＬＡ拘束ＩＤＯ由来ペプチドエピトープに対する自発的ＣＴＬ応答の存在は、ＩＤＯ免疫原性ペプチドの免疫療法への潜在性を示す。
本発明の１つの実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログが発現する臨床状態に罹患した個体のＰＢＬ集団中でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができる。臨床状態は、好ましくは癌または／および感染であり、最も好ましくは癌である。
供給源
本発明のペプチドは、上記のように、配列番号１、１３、１４、１５、および／または１６のＩＤＯまたはそのフラグメントに由来し、より好ましくは、ペプチドは、配列番号１および／または１６のＩＤＯに由来し、最も好ましくは、ペプチドは配列番号１のＩＤＯに由来する。ペプチドが由来し得るタンパク質は、タンパク質が発現される任意の動物種由来の任意のＩＤＯであり得る。好ましい実施形態では、出発タンパク質は、哺乳動物種（げっ歯類、ウサギ、および霊長類（ヒトなど）が含まれる）に由来する。選択されたタンパク質の配列に基づいて、本発明のペプチドは、上記の適切なサイズのペプチドが得られるタンパク質出発物質の任意の適切な化学的または酵素的処理によって誘導されるか、当業者が精通する任意の従来のペプチド合成手順によって合成することができる。より好ましくは、ＩＤＯタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、バリアント、および／またはこれらのいずれかの機能的ホモログは、タンパク質配列がヒトで発現されるＩＤＯに由来する。
個体
本発明のワクチン組成物で処置すべき個体は、臨床状態に罹患した個体である。個体は、好ましくは哺乳動物種個体であり、最も好ましくはヒト個体である。個体は任意の年齢（若年または高齢）の個体であり得、男性または女性のいずれでもよい。個体が罹患している臨床状態は、新生物疾患（癌など）または感染（微生物感染またはウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）など）であり得る。
本発明の実施形態は、癌の処置、リスクの軽減、安定化、または防止のためのワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、感染（微生物感染またはウイルス感染など）から生じる疾患の処置、リスクの軽減、安定化、または防止のためのワクチンを提供する。
さらなる実施形態は、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のＩＤＯ、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸、およびアジュバントを含む、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態の処置のためのワクチン組成物に関する。
癌
本発明のワクチン組成物を使用して、臨床状態を防止するか、リスクを軽減するか、処置することができる。好ましくは、臨床状態は、ＩＤＯ発現に関連するかこれによって特徴づけられる。ＩＤＯは、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のいずれかで識別されたＩＤＯであり得、野生型のこれらのいずれかと少なくとも７０％同一であるが、機能的である必要がないホモログであり得る。ＩＤＯの発現レベル（発現はｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、前駆体タンパク質、および完全にプロセシングされたタンパク質などの発現である）が臨床状態に罹患していない個体と同一またはより高いと本明細書中で理解される。本発明の好ましい実施形態では、臨床状態は癌である。癌（悪性新生物）は、細胞群が制御されない成長（正常限度を超える成長および分裂）、浸潤（隣接組織への侵入および破壊）、および時折転移（リンパまたは血液を介した体内の他の位置への拡大）の性質を示す疾患クラスである。これら３つの癌の悪性度は、自己制限され、浸潤や転移のない良性腫瘍と区別される。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、形成しないものもある（白血病など）。本明細書中で使用する場合、用語「癌」は、任意の癌、新生物疾患、および前新生物疾患を含むことを意味する。
本発明のワクチンの投与によって処置、管理、および／または防止することができる癌の一例として挙げられる制限されない癌の群には、以下が含まれる：結腸癌腫、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｅｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭腺癌腫、シスタンデオカルシノーマ、髄様癌腫、気管支癌腫、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌腫、絨毛癌腫、セミノーマ、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞性肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、膠芽細胞腫、ニューロノーマ、頭蓋咽頭種（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｉｎｇｉｏｍａｓ）、シュワン細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏａｍａ）、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病およびリンパ腫、急性リンパ球性白血病および急性骨髄性真性赤血球増加症、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、直腸癌、泌尿器癌、子宮癌、口腔癌、皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、肝臓癌、喉頭癌、食道癌、乳腺腫瘍、小児期ヌル急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胸腺ＡＬＬ、Ｂ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、急性巨核球性白血病、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、およびＴ細胞性白血病、小細胞および巨大な非小細胞の肺癌腫、急性顆粒球性白血病、胚細胞腫瘍、子宮内膜癌、胃癌、頭頸部癌、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病、および甲状腺癌。
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、被験体における臨床反応を誘発することができる。ここで、臨床反応を安定病態によって特徴づけることができるか、好ましい実施形態では、臨床反応を部分的応答によって特徴づけることができるか、好ましくは、臨床反応を癌の完全な寛解によって特徴づけることができる。好ましくは、癌は、黒色腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、血液学的癌（白血病など）、結腸および腎臓の細胞癌からなる群から選択される。
本発明の一態様では、ワクチン組成物は、個体における臨床反応を誘発することができる。１つの実施形態では、臨床反応を安定病態（さらに悪化も進行もしない）によって特徴づけることができるか、好ましい実施形態では、臨床反応を部分的応答によって特徴づけることができるか、好ましくは、臨床反応を癌または感染の完全な寛解によって特徴づけることができる。臨床反応を、下記のように決定することができる。
本発明の別の態様では、ワクチン組成物は、臨床反応が最も巨大な標的病変の最大直径の合計の増加によって特徴づけられる、被験体における臨床反応を誘発することができる。減少を、下記のように決定することができる。
器官あたり最大で５個までの病変および全部で１０個の病変の全ての測定可能な病変、全ての関連する器官の代表を、標的病変として同定し、ベースラインで記録および測定すべきである。
・標的病変を、そのサイズ（最長の直径を有する病変）および正確な反復測定のためのその適合性（画像化技術によるか臨床的に）に基づいて選択すべきである。
・全標的病変についての最長径（ＬＤ）の合計を計算し、ベースライン総和ＬＤとして報告する。ベースライン総和ＬＤを、目的の腫瘍を特徴づける基準として使用するであろう。
・全ての他の病変（または疾患部位）を、非標的病変として同定すべきであり、ベースラインでも記録すべきである。これらの病変の測定は必要でないが、それぞれの有無を追跡を通して留意すべきである。
標的病変の評価
・完全な応答（ＣＲ）：全ての標的病変の消滅。
・部分的応答（ＰＲ）：ベースライン総和ＬＤを基準として採用した標的病変のＬＤの総和の少なくとも３０％減少。
・進行性疾患（ＰＤ）：処置開始から記録された最小の総和ＬＤを基準として採用した標的病変のＬＤの総和の少なくとも２０％増加または１つまたは複数の新規の病変の出現。・安定病態（ＳＤ）：処置開始から最小の総和ＬＤを基準として採用した、ＲＰを定量するのに十分な縮みおよびＰＤを定量するのに十分な増加のいずれでもないこと。
非標的病変の評価
・完全な応答（ＣＲ）：全ての非標的病変の消滅および腫瘍マーカーレベルの正常化。
・不完全な応答／安定病態（ＳＤ）：１つまたは複数の非標的病変の持続および／または正常限度を超える腫瘍マーカーレベルの維持。
・進行性疾患（ＰＤ）：１つまたは複数の新規の病変の出現および／または既存の非標的病変の明白な進行。
本発明の１つの実施形態では、任意の本明細書中に記載のタンパク質および／またはポリペプチドを含むワクチン組成物は、臨床反応が最大の標的病変の最長の直径の総和の減少によって特徴づけられる、被験体における臨床反応を誘発することができる。
ＩＤＯを発現する癌に罹患した個体に投与した場合に本発明のワクチン組成物が配列番号１のＩＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログを発現する癌に対して免疫応答を誘発することができることが意図される。本発明のワクチン組成物は、ワクチン接種個体において癌細胞、ＩＤＯ発現ＡＰＣに対して細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘発し、そして／または被験体における腫瘍間質中の抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することができる。
ＰＢＬ集団において免疫応答を誘発する能力に加えて、本発明のペプチドがｉｎ ｓｉｔｕで（すなわち、固形腫瘍組織中で）細胞溶解性免疫応答を誘発することができることも意図される。これを、例えば、ＨＬＡ−ペプチド複合体（例えば、多量体化され、検出可能なレベルで提供される）の提供および本発明のエピトープペプチドと反応性を示す腫瘍組織ＣＴＬ中で検出するための免疫組織化学染色のためのかかる複合体の使用によって証明することができる。したがって、本発明のペプチドのさらに有意な特徴は、腫瘍組織中でエピトープペプチドに反応性を示すＣＴＬをｉｎ ｓｉｔｕで検出することができることである。
本発明のペプチドが、ＨＬＡ分子に結合して細胞表面上にＨＬＡとペプチドとの複合体を提示し、次いで複合体が細胞溶解性Ｔ細胞のエピトープまたは標的として作用するその能力に加えて、他の免疫応答型（複合体に対して抗体を産生するＢ細胞応答など）および／または遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を誘発することができることも意図される。本発明のペプチドの注射部位での後者の免疫応答型は、発赤および明確な硬化と定義される。
本発明の目的は、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）または配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸、およびアジュバントを含む、癌の防止、リスクの軽減、または処置のためのワクチン組成物を提供することである。
癌併用処置
いくつかの場合、本発明の処置方法をさらなる従来の癌処置（化学療法、放射線治療、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置など）と組み合わせることが適切であろう。
腫瘍細胞中のＩＤＯ発現の上昇によって免疫系が阻害されるので、本発明によって開示されたＩＤＯベースの免疫療法と細胞傷害性化学療法および／または別の抗癌免疫療法との組み合わせは、有効な癌治療アプローチである。これらの療法を、本明細書中で、「第２の有効成分」ともいう。
本発明のワクチン組成物との同時投与（連続的または同時）に関連する化学療法薬の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：オールトランスレチノイン酸、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イリノテカン、レナリドマイド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブリミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン。１つの実施形態では、本発明の薬剤の組み合わせで用いる化学療法薬自体が、異なる化学療法薬の組み合わせであり得る。適切な組み合わせには、ＦＯＬＦＯＸおよびＩＦＬが含まれる。ＦＯＬＦＯＸは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、およびオキサリプラチンを含む組み合わせである。ＩＦＬ処置には、イリノテカン、５−ＦＵ、およびロイコボリンが含まれる。
別の第２の有効成分は、腫瘍処置で個別、同時、または組み合わせて使用するためのキナーゼインヒビターであり得る。適切なキナーゼインヒビターには、抗腫瘍活性を保有することが示されているインヒビター（ゲフィチニブ（イレッサ）およびエルロチニブ（タルセバ）など）が含まれ、これらをペプチドと組み合わせて使用することができる。腎細胞癌処置で有効であることが示されている受容体チロシンキナーゼインヒビター（リンゴ酸スニチニブおよびソラフェニブなど）もまた、第２の有効成分として使用されるのに有用である。
第２の有効成分のさらなる例は、免疫刺激物質（例えば、サイトカインおよび抗体）である。サイトカインなどは、以下の群から選択することができるが、これらに制限されない：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ型ＩＦＮ、インターロイキン２１、インターロイキン２、インターロイキン１２、およびインターロイキン１５。抗体は、好ましくは、免疫刺激抗体（抗ＣＤ４０または抗ＣＴＬＡ−４抗体など）である。免疫刺激物質はまた、免疫阻害細胞（例えば、調節性Ｔ細胞）または因子を枯渇させることができる物質であり得、この物質は、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼであり得る。Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＨＥＣＴ、ＲＩＮＧ、およびＵ−ボックスタンパク質）は、免疫細胞機能の重要な分子調節物質として出現し、それぞれ、タンパク質分解性の破壊のための特異的阻害分子のターゲティングによって感染中の免疫応答の調節に関与し得る。いくつかのＨＥＣＴタンパク質およびＲＩＮＧ Ｅ３タンパク質はまた、現在のところ、免疫自己寛容の誘導および維持に関連している。ｃ−Ｃｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ、ＧＲＡＩＬ、Ｉｔｃｈ、およびＮｅｄｄ４はそれぞれ、Ｔ細胞成長因子の産生および増殖を下方制御する。
１つの実施形態では、ＩＤＯ由来のポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物を、第２の有効成分（免疫刺激物質など）と組み合わせて投与する。免疫刺激物質は、好ましくは、インターロイキン（ＩＬ−２１またはＩＬ−２など）または化学療法薬である。
感染
本明細書中で使用する場合、用語感染は、免疫応答を生じる任意の種類の臨床状態（炎症など）に関し、したがって、感染症、慢性感染、自己免疫容態、およびアレルギー性炎症が含まれる。したがって、感染（感染症、慢性感染、自己免疫容態、およびアレルギー性炎症など）は、本発明に関連する全ての臨床状態であり、以下で同様に扱われる。さらに、用語感染および炎症を、本明細書中で交換可能に使用する。
炎症は、有害刺激（病原体、損傷細胞、または刺激物など）に対する血管組織の複雑な生物学的応答である。炎症は、生物による傷害性の刺激を除去し、組織の治癒過程を開始させる防御的試みである。炎症を、急性または慢性のいずれかに分類することができる。急性炎症は、有害刺激に対する身体の最初の応答であり、血漿および白血球の血液から損傷組織への移動の増加によって達成される。生化学的事象のカスケードが炎症反応を伝播および成熟させ、これには、損傷組織内の局所血管系、免疫系、および種々の細胞が関与する。慢性炎症として公知の長期炎症により、炎症部位に存在する細胞型が進行性に変化し、炎症過程由来の組織の同時の破壊および治癒によって特徴づけられる。いずれかの場合、ＩＤＯは免疫系細胞（ＡＰＣなど）によって発現され、したがって、感染および炎症は、本発明のワクチン組成物の投与によって処置することができるか、防止することができるか、リスクを軽減することができる臨床状態である。ワクチン組成物は、好ましくは、ＩＤＯタンパク質、由来するタンパク質フラグメント、ポリペプチド、またはペプチド、またはこれらのいずれかの機能的ホモログを含む。
本発明に関する炎症に関連する傷害の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：アレルギー性炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、感染症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流障害、関節リウマチ、移植片拒絶、および脈管炎。
慢性感染および慢性炎症
慢性炎症は、特に本発明に関連する。慢性炎症は、同時活動性炎症、組織破壊、および修復の試みによって特徴づけられる病的状態である。慢性炎症組織は、単核免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、および形質細胞）の浸潤、組織破壊、および治癒の試み（血管形成および線維形成が含まれる）によって特徴づけられる。
急性炎症では、刺激の除去によって単球（適切な活性化下でマクロファージになる）の炎症組織への動員が停止され、既存のマクロファージがリンパ管を介して炎症組織から抜け出る。しかし、慢性炎症組織では、刺激は持続的であり、したがって、単球の動員が維持され、既存のマクロファージが所定の位置に係留され、マクロファージの増殖が刺激される（特に、アテローム斑中）。
本発明の目的は、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸、およびアジュバントを含む、慢性炎症の防止、リスクの軽減、または処置のためのワクチン組成物を提供することである。
感染症
本発明のワクチン組成物を使用して、臨床状態を防止するか、リスクを軽減するか、処置することができる。本発明の好ましい実施形態では、臨床状態は感染症である。感染症を、感染症に罹患した個体において増加されたＩＤＯ発現を誘導することができる任意の感染性因子（細菌、ウイルス、寄生虫、および／または真菌など）によって促進することができ、好ましくは、感染症は、慢性疾患であるか、慢性疾患リスクがある。発明の背景に記載のように、ＩＤＯ発現の増加は、トリプトファン除去によってＩＤＯ発現生物の近傍の微生物因子に直接影響を及ぼす。しかし、ＩＤＯ発現細胞がＡＰＣである場合に、ＩＤＯ発現の増加がＴｒｅｇ細胞の活性を誘導／阻害するので、このアプローチは逆効果である。したがって、本発明の態様は、感染性因子に起因する疾患の処置、改善（重症度の軽減）、安定化および／または防止のためのＩＤＯタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、および／またはこれらのいずれかのバリアントを含むワクチン組成物を提供することである。
感染症はウイルスに起因し得、処置で本発明のワクチン組成物を投与することができるウイルス疾患には以下のウイルス疾患が含まれるが、これらに限定されない：ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群、水疱（水痘）、感冒、サイトメガロウイルス感染、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、単純ヘルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、ムンプス、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｌｅｕｋｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘（痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル疾患、および黄熱病。好ましくは、ワクチン組成物を、ＨＩＶ／ＡＩＤＳおよび癌を生じ得るウイルス感染に罹患した個体に投与する。ヒト癌に関連する主なウイルスは、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、およびヒトＴリンパ球向性ウイルスである。したがって、本発明の目的は、これらのウイルス感染の処置または処置の一部として投与することである。
本発明に関連する細菌感染の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：炭疽病、細菌性髄膜炎、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター症、ネコ引っ掻き病、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、淋病、膿痂疹、レジオネラ症、癩病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、リウマチ熱、ＭＲＳＡ感染、ノカルジア症、百日咳（百日咳き）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、チフス熱、発疹チフス、および尿路感染。本発明の目的は、細菌感染の処置および／または防止および／またはリスクの軽減のためのワクチンを提供することである。
本発明のさらなる態様は、以下の処置および／または防止および／またはリスクの軽減のためのワクチン組成物を提供することである：寄生虫感染症（アフリカトリパソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、シャーガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症，裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活性アメーバ感染、ランブル鞭毛虫症、顎口虫症、模様条虫症、イソスポーラ症、カラアザール、リーシュマニア症、マラリア、メタゴニムス症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、蟯虫感染、疥癬、住血吸虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、トリコネローシス、旋毛虫症、鞭虫症、トリコモナス症、およびトリパソノーマ症などであるが、これらに限定されない）；真菌感染症（アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコックス症、ヒストプラスマ症、足白癬などであるが、これらに限定されない）；プリオン感染症（伝染性海綿状脳症、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー致死性家族性不眠症、およびアルパース症候群などであるが、これらに限定されない）。したがって、本発明の目的は、これらの寄生虫、真菌、またはプリオンに起因する感染の処置または処置の一部として投与することである。
感染症併用処置
さらに、本発明のワクチン組成物の投与による任意の感染症の処置をさらなる（第２の）有効成分と併せるか、さらなる処置（抗生物質処置、化学療法、免疫刺激物質を使用した処置、樹状細胞を使用した処置、抗ウイルス薬、および抗寄生虫薬など）と組み合わせて行うことができる。
本発明のワクチンと組み合わせて感染症処置で使用することができる第２の有効成分の例には、抗生物質が含まれるが、これに限定されない。本明細書中の用語抗生物質は、抗細菌、抗真菌、抗ウイルス、および／または抗寄生虫活性を有する物質をいう。本発明の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、クロラムフェニコール、フルオロキノロン、シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、糖ペプチド、バンコマイシン、リンコサミド、クリンダマイシン、マクロライド／ケトライド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリトロマイシン、エリスロマイシン、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファクロール、セファマンドール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフジニル、セフジトレン、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、モノバクタム、アズトレモナム、ニトロイミダゾール、メトロニダゾール、オキサゾリジノン、リネゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラナート、アンピシリン、スルバクタム、バカンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン、チカルシリン／クラブラナート、ストレプトグラミン、キヌプリスチン、ダルホプリスチン、スルホンアミド／スルファメトキサゾール、トリメトプリム、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、アゾール抗真菌剤クロトリマゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ボリコナゾール、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、エキノカンジン、カスポフンギン、ミカファンギン、シクロピロックス、フルシトシン、グリセオフルビン、およびテルビナフィン。抗ウイルス剤（ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、およびバルサイト（バルガンシクロビル）など）、ヌクレオシド−アナログ逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）：ＡＺＴ（ジドブジン）、ｄｄＩ（ジダノシン）、ｄｄＣ（ザルシタビン）、ｄ４Ｔ（スタブジン）、３ＴＣ（ラミブジン）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）：ネビラピン、デラビルジン、プロテアーゼインヒビター：サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネフィルナビル、リバビリン、アマンタジン／リマンタジン、リレンザおよびタミフル、プレコナリル、インターフェロンがさらに関連する。
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの抗生物質と組み合わせた、感染症処置のためのＩＤＯ由来タンパク質、ポリペプチド、および／またはこれらの機能的ホモログを含むワクチン組成物に関する。好ましくは、本発明のワクチン組成物を、慢性感染（例えば、ＨＩＶ）処置のために使用し、したがって、任意の上記列挙の抗生物質（抗ウイルス薬など）と組み合わせて使用する。
自己免疫疾患
生物がその構成要素（分子下レベルに至るまで）を自己として認識できず、その結果、生物自体の細胞および組織に対して免疫応答が生じる場合に、自己免疫疾患が生じる。かかる異常な免疫応答に起因する任意の疾患は自己免疫疾患と呼ばれ、本発明に関連する。その例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：セリアック病、真性糖尿病１型（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑、および関節リウマチ（ＲＡ）。
本発明の目的は、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸、およびアジュバントを含む、自己免疫疾患の防止、リスクの軽減、または処置のためのワクチン組成物を提供することである。
自己免疫疾患の併用処置
現在の自己免疫疾患処置は、通常、免疫抑制治療、抗炎症治療、または対症療法である。非免疫療法（橋本甲状腺炎におけるホルモン補充または真性糖尿病１型処置など）により、自己攻撃を引き起こしている。食事療法により、セリアック病の重症度が制限される。ステロイド処置またはＮＳＡＩＤ処置により、多数の疾患の炎症症状が制限される。免疫グロブリンの静脈内調製物（ＩＶＩＧ）は、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）およびギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）のために使用される。より特異的な免疫調節処置（ＴＮＦαアンタゴニストエタネルセプトなど）は、ＲＡ処置で有用であることが示されている。これらの免疫療法は、有害作用（感染に対する過敏症など）リスクの増加に関連し得る。
蠕虫療法はこれらの所見に基づいて開発され、個体への特定の腸内寄生線虫（蠕虫）の接種を含む。現在、２つの密接に関連する処置（（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ（一般に鉤虫として公知）またはＴｒｉｃｈｕｒｉｓ Ｓｕｉｓ Ｏｖａ（一般にブタ鞭虫卵として公知）のいずれかを接種する））が利用可能である。このアプローチが種々の自己免疫障害（クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー、多発性硬化症、および慢性炎症性障害が含まれる）の処置で非常に有効であることを証明する研究が利用可能である。
１つの実施形態では、本明細書中に開示のワクチンを、第２の有効成分（任意の上記薬物など）および自己免疫疾患処置と組み合わせて使用する。
アレルギー性炎症
アレルギーは、しばしばアトピーとも呼ばれる免疫系の障害である。アレルギー反応は、アレルゲンとして公知の環境物質に対して生じる。これらの反応は、後天性であり、予測可能であり、急速である。厳密には、アレルギーは、４つの過敏症形態のうちの１つであり、Ｉ型（または即時型）過敏症と呼ばれる。ＩｇＥとして公知の抗体型による肥満細胞および好塩基球と呼ばれる一定の白血球の過剰な活性化（極度の炎症反応を引き起こす）によって特徴づけられる。一般的なアレルギー反応には、湿疹、蕁麻疹、枯草熱、喘息、食物アレルギー、および刺咬昆虫（ススメバチおよびミツバチなど）の毒液に対する反応が含まれる。
アレルギー性炎症は、いくつかの疾病または病状（アレルギー喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、およびいくつかの眼アレルギー性疾患が含まれる）の重要な病態生理学的特徴である。
本発明の目的は、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、配列番号（１、１３、１４、１５、および／または１６）と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸、およびアジュバントを含む、アレルギー性炎症の防止、リスクの軽減、または処置のためのワクチン組成物を提供することである。
アレルギー性炎症の併用処置
アレルギー性炎症の処置、薬物療法、および免疫療法のために以下の２つの治療型が利用可能である：薬物療法および免疫療法。
薬物療法は、アレルギー性メディエーターの作用を遮断するか、細胞の活性化および脱顆粒過程を防止するための拮抗薬の使用である。これらには、抗ヒスタミン薬、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、エピネフリン（アドレナリン）、テオフィリン、クロモリンナトリウム、および抗ロイコトリエン（モンテルカスト（シングライル）またはザフィルルカスト（アコレート）など）が含まれる。抗コリン薬、鬱血除去薬、肥満細胞安定剤、および好酸球走化性を損なわせると考えられる他の化合物も一般に使用される。
免疫療法は、漸増用量の問題のアレルゲンで個体を段階的にワクチン接種する脱感作治療または減感作処置である。第２の免疫療法の形態は、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体の静脈内注射を含む。第３の形態である舌下免疫療法は、非病原体抗原（食品および常在細菌など）に対する経口免疫寛容を活用する経口投与療法である。
１つの実施形態では、本明細書中に開示のワクチンを、第２の有効成分（任意の上記薬物など）およびアレルギー性炎症処置と組み合わせて使用する。
薬学的組成物
本発明は、個体においてＩＤＯ発現に関連する臨床障害を処置し、リスクを軽減し、そして／または防止することができる薬学的組成物に関する。言い換えれば、用語ワクチンおよび薬学的組成物を本明細書中で交換可能に使用する。本発明のワクチン／薬学的組成物は、抗原（タンパク質、ポリペプチドおよび／または核酸分子など）を含む「伝統的な」ワクチン組成物であり得る。これらはまた、細胞（個体を起源とし、後に処理された改変細胞など）を含む組成物または複合体分子を含む組成物（抗体またはＴＣＲなど）の形態であり得る。
一般に、ワクチンは、個体において免疫応答を誘導することができる物質または組成物である。組成物は、１つまたは複数の以下を含むことができる：「活性成分」（抗原など）（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および核酸など）、他のエレメントのうちの１つまたは複数の抗原を含む核酸構築物、細胞、（例えば、養子移入のための負荷ＡＰＣ、Ｔ細胞）、複合体分子（抗体、ＴＣＲ、およびＭＨＣ複合体など）、キャリア、アジュバント、および薬学的キャリア。以下に本発明のワクチン組成物の種々の成分をより詳細に開示する。
本発明のワクチン組成物は、癌および／または感染（ＩＤＯ発現を引き起こす）に罹患した個体に投与した場合に、配列番号１のＩＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログを発現する癌、ＤＣ、またはＡＰＣに対する免疫応答を誘発することができる。好ましい実施形態では、臨床状態は癌である。本発明のワクチン組成物は、ワクチン接種した個体においてＩＤＯを発現する癌細胞、ＡＰＣ、およびＤＣに対する細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘発し、そして／または被験体における腫瘍間質中の抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することができる。
抗原および他の活性成分
タンパク質／ポリペプチドベースのワクチン組成物
本発明のペプチドは、驚くべき高い親和性で結合し（図２を参照のこと）、ここでペプチドが提示される場合に抗原として使える状態にある。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、１つまたは複数の以下を含む：ＩＤＯタンパク質（配列番号１）、これに由来するポリペプチドフラグメント、同様にバリアント、全長および部分的な長さのＩＤＯの機能的ホモログ、ＩＤＯの連続ペプチド、およびこれらの機能的ホモログ。より好ましくは、ワクチン組成物は、本開示の配列表に列挙した任意の配列を含む。非常に好ましくは、ワクチン組成物は、ペプチドＩＤＯ５（配列番号６）、ＩＤＯ２（配列番号３）、および／またはＩＤＯ６（配列番号７）を含む。
本発明のワクチン組成物中の抗原の選択は、当業者によって決定可能なパラメーターに依存するであろう。記載されているように、本発明のそれぞれの異なるペプチドは、特定のＨＬＡ分子によって細胞表面上に提示される。そのようなものとして、治療すべき被験体をＨＬＡ表現型に関して分類する場合、特定のＨＬＡ分子に結合することが公知のペプチドを選択する。あるいは、目的の抗原を、所与の集団中の種々のＨＬＡ表現型の頻度に基づいて選択する。一例として、ＨＬＡ−Ａ２は、白色人種で最も一般的な表現型である。したがって、ＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチドを含む組成物は、白色人種の大部分で活性であろう。さらに、本発明の抗原／ペプチドを、特定のＨＬＡ分子への結合を増強するために表２に記載のアンカー残基モチーフにしたがって修飾することができる。
本発明の組成物はまた、より高い比率の標的集団を対象とするために２つ以上のＩＤＯ由来のペプチド（それぞれ、異なるＨＬＡ分子と特異的に相互作用する）の組み合わせを含むことができる。したがって、例として、薬学的組成物は、ＨＬＡ−Ａ分子によって拘束されるペプチドとＨＬＡ−Ｂ分子によって拘束されるペプチドとの組み合わせ（例えば、標的集団中のＨＬＡ表現型の頻度に対応するＨＬＡ−Ａ分子およびＨＬＡ−Ｂ分子（例えば、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ３５など）が含まれる）を含むことができる。さらに、組成物は、ＨＬＡ−Ｃ分子によって拘束されるペプチドを含むことができる。
ペプチドベースのワクチンの場合、エピトープを、宿主抗原提示細胞による抗原取り込みおよびプロセシングと無関係な外因性負荷によって提示することができる「ＭＨＣ提供」形態で投与することができる。本発明のペプチドは、短い「ＭＨＣ提供」形態およびプロテアソームによるプロセシングを必要とし、それにより、複数の腫瘍抗原をターゲティングすることができるより複雑なワクチン組成物が得られるより長い形態の両方のペプチドを含む。より多数の異なるＨＬＡ群がワクチンによってターゲティングされるほど、ワクチンが多様な集団で機能する可能性が高くなる。
本発明は、好ましい実施形態では、医薬品として使用するためのアジュバントと組み合わせた配列番号１のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、配列番号１と少なくとも７０％同一であるその機能的ホモログ、ＩＤＯまたはその機能的ホモログの連続配列を含む免疫原性活性ペプチドフラグメント、またはＩＤＯまたはペプチドフラグメントをコードする核酸を含むワクチン組成物に関する。ワクチン組成物を、個体における臨床状態を処置、防止、または関連するリスクを軽減するために投与することができる。
多エピトープワクチン組成物
本発明はまた、高免疫原性多エピトープワクチンに関する。好ましくは、かかるワクチンを、下記の他の適切なペプチドおよび／またはアジュバントと任意選択的に組み合わせた最良に適合させたＩＤＯ由来ペプチドの同時送達が容易になるようにデザインすべきである。本発明は、下記のＩＤＯおよび／またはアジュバントに属さないかこれらに由来しないさらなるタンパク質またはペプチドフラグメントと任意選択的に組み合わせたＩＤＯ由来ペプチドを含むかかる多エピトープワクチンを含む。より複雑な組成物を有するワクチンの開発を駆動する重要な要因は、例えば、慎重に選択したＣＴＬおよびＴｈ細胞エピトープの集団を含むかコードするワクチンのデザインによって複数の腫瘍抗原をターゲティングするという要望である。したがって、本発明は、一態様では、クラスＩおよびクラスＩＩ拘束ＩＤＯエピトープの両方を含むワクチン組成物に関する。
したがって、本発明のペプチドは、短い「ＭＨＣ提供」形態（クラスＩ拘束）およびプロテアソームによるプロセシングを必要とするより長い形態（クラスＩＩ拘束）の両ペプチドを含む。したがって、本発明の組成物を、以下に定義のクラスＩ拘束エピトープおよび／またはクラスＩＩ拘束エピトープを含む多エピトープワクチンとして提供することができる。
核酸ベースのワクチン組成物
本発明のワクチン組成物は、ＩＤＯに属するタンパク質またはその免疫原性活性ペプチドフラグメントをコードする核酸を含むことができる。したがって、この核酸は、上記タンパク質およびペプチドフラグメントのいずれかをコードすることができる。核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＰＮＡであり得、好ましくは、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
本発明の核酸を、任意の適切なベクター（発現ベクターなど）内に含めることができる。多数のベクターが利用可能であり、当業者は特定の目的に有用なベクターを選択することができるであろう。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、または人工染色体の形態であり得る。適切な核酸配列を、種々の手順によってベクターに挿入することができる。例えば、ＤＮＡを、当該分野で周知の技術を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することができる。本発明の核酸配列は別として、ベクターは、１つまたは複数のシグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列をさらに含むことができる。ベクターはまた、さらなる配列（エンハンサー、ポリＡテール、リンカー、ポリリンカー、操作リンカー、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、終止コドン、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および組み込みのための宿主相同配列、または他の定義されたエレメントなど）を含むことができる。核酸構築物の操作方法は当該分野で周知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと）。ベクターは、好ましくは、適切な細胞中でのその発現を指示する調節核酸配列に作動可能に連結された核酸を含む発現ベクターである。本発明の範囲内で、調節核酸配列は、一般に、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくは抗原提示細胞中での発現を指示することができるはずである。
１つの好ましい実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ベクターはまた、細菌ベクター（弱毒化細菌ベクターなど）であり得る。弱毒化細菌ベクターを、感染および持続部位での持続的な粘膜免疫応答を誘導するために使用することができる。異なる組換え細菌をベクターとして使用することができる。例えば、細菌ベクターを、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群から選択することができる。一般に、マウスにおいて強いＣＴＬ誘導および腫瘍退縮と共に異種抗原ＨＰＶ１６ Ｌ１またはＥ７に対する免疫の誘導が認められる。ベクターは、Ｔ細胞刺激性ポリペプチドをコードする核酸をさらに含むことができる。
負荷ＡＰＣ
有用な実施形態では、癌疾患に対して指示される免疫原性応答を、個体由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に負荷すること、個体からＰＢＬを単離し、細胞をペプチドとインキュベートした後に注射によって個体に細胞を戻すこと、または個体から前駆体ＡＰＣを単離し、サイトカインおよび抗原を使用して細胞をプロフェッショナルＡＰＣに分化させた後に注射によって個体に細胞を戻すことのいずれかによって本発明のペプチドを投与することによって誘発する。
したがって、本発明の態様は、ＩＤＯもしくはその免疫原性活性ペプチドフラグメントまたはこのタンパク質をコードする核酸もしくは免疫原性活性ペプチドフラグメントを含む抗原提示細胞を含むワクチン組成物を提供することである。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に抗原を提示することができる任意の細胞であり得る。好ましい抗原提示細胞は樹状細胞である。樹状細胞（ＤＣ）を、任意の適切なプロトコール（例えば、下記のプロトコール）にしたがった治療手順で調製し、使用することができる。当業者は、プロトコールを異なるＨＬＡ型および異なる疾患を有する個体で使用されるように適合させることができると認識するであろう。
樹状細胞（ＤＣ）を、５０μｇ／ｍｌのＨＬＡ拘束ペプチド（ＧＭＰ ｑｕａｌｉｔｙで合成）と３７℃で１時間パルスすることができ、ペプチドおよび５×１０６細胞を１日目および１４日目、その後に４週間毎に皮下投与し、５回のワクチン接種後にさらに白血球搬出を行う。臨床での使用および品質管理のためのＤＣの生成を、本質的にＮｉｃｏｌｅｔｔｅら、（２００７）に記載のように行うことができる。
したがって、本発明の１つの実施形態では、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態（好ましくは、臨床状態は癌または感染である）に罹患した個体の処置方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで個体の抗原提示細胞（ＡＰＣ）にペプチドを提示し、その後に処置されたＡＰＣを注射によって個体に戻すことによってペプチドを投与する方法である。これを行うための方法は他に少なくとも２つある。一方の方法は、個体からＡＰＣを単離し、ＭＨＣクラスＩ分子をペプチドとインキュベート（負荷）することである。ＭＨＣクラスＩ分子の負荷は、ペプチドに特異的なＭＨＣクラスＩ分子を有するＡＰＣがペプチドと結合し、それによりペプチドをＴ細胞に提示することができるようにＡＰＣをペプチドとインキュベートすることを意味する。その後、ＡＰＣを個体に再注射する。別の方法は、樹状細胞の細胞生物学分野でなされた最近の発見に依存する。この場合、単球（樹状細胞前駆体である）を個体から単離し、サイトカインおよび抗原の使用によってｉｎ ｖｉｔｒｏでプロフェッショナルＡＰＣ（または樹状細胞）に分化する。その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されたＤＣをペプチドでパルスし、個体に注射する。
養子免疫療法／養子移入
本発明の重要な態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＤＯ特異的Ｔ細胞の培養および個体へのこれらの養子移入に関する。養子移入は、既に特異的免疫応答を生じることができる実際の免疫系成分を医師が個体に直接移入することを意味する。
本発明の１つの目的は、例えば、養子移入に有用であり得るＩＤＯ特異的Ｔ細胞を提供することである。ＩＤＯペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体またはＩＤＯペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体に特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含む単離Ｔ細胞を個体に養子移入することができる。このＴ細胞は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大したＴ細胞であり、ＩＤＯペプチドは上記の任意のＩＤＯペプチドであり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の拡大方法は当業者に周知である。本発明はまた、ＭＨＣ拘束ＩＤＯペプチド複合体に特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含むＴ細胞を個体（癌疾患に罹患したヒトなど）に投与する工程を含み、ＩＤＯ由来ペプチドが上記の任意のＩＤＯペプチドであり得る、処置方法に関する。本発明は、さらに、癌または感染の処置薬の調製のためのＩＤＯまたはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含むＴ細胞の使用に関する。本質的にＷａｌｔｅｒら、（１９９５）に記載のように自己Ｔ細胞移入を行うことができる。
ＴＣＲ移入
さらに別の実施形態では、かかるＴ細胞を養子移入前に照射して、個体中の増殖を調節することができる。ＴＣＲ遺伝子移入によってＴ細胞の特異性を遺伝子操作することが可能である（Ｅｎｇｅｌｓら、２００７）。これにより、ＩＤＯペプチド特異性を保有するＴ細胞を個体に移入することが可能である。一般に、腫瘍またはウイルスの存在しない環境下でのＴ細胞の拡大および注入前のＴ細胞機能の分析が可能であるので、養子免疫療法のためのＴ細胞の使用は魅力的である。養子移入におけるＴＣＲ遺伝子改変Ｔ細胞（異種ＴＣＲ発現を指示する発現構築物で形質転換されたＴ細胞など）の適用は、Ｔ細胞株の移入と比較して以下のいくつかの利点を有する：（ｉ）再指示されたＴ細胞の生成を一般に利用可能であること。（ｉｉ）高親和性または超高親和性ＴＣＲを選択または作製し、Ｔ細胞操作に使用することができること。（ｉｉｉ）コドン最適化またはマウス化ＴＣＲを使用して高アビディティＴ細胞を生成し、安定化ＴＣＲのより良好な表面発現が可能であること。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子移入によるＴ細胞特異性の遺伝子操作を、本質的にＭｏｒｇａｎら、（２００６）に記載のように行うことができる。
ＴＣＲトランスフェクション
既知の抗腫瘍反応性を有するＴＣＲを、初代ヒトＴリンパ球に遺伝的に導入することができる。腫瘍特異的ＣＴＬクローン由来のＴＣＲのα鎖およびβ鎖をコードする遺伝子を初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、この方法で腫瘍抗原に対する特異性を有するＴ細胞を再プログラミングすることができる。ＴＣＲ ＲＮＡをエレクトロポレーションによってＰＢＬにトランスフェクトする（Ｓｃｈａｆｔら、２００６）。あるいは、レトロウイルスベクターを使用したＴＣＲ遺伝子移入によって新規の特異性を有するＴ細胞を得ることができる（Ｍｏｒｇａｎら、２００６）。しかし、レトロウイルスベクター由来のプロウイルスをトランスフェクトした細胞のゲノム中に無作為に組み込み、その後に細胞成長を妨害することができる。ＲＮＡはトランスフェクトされた細胞中に一過性にしか存在せず、ゲノム中に組み込むことができないので、ＴＣＲコードＲＮＡを用いたＴ細胞のエレクトロポレーションによってこの不利益が克服される（Ｓｃｈａｆｔら、２００６）。さらに、細胞のトランスフェクションは、研究で日常的に使用されている。
アジュバントおよびキャリア
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、アジュバントおよび／またはキャリアを含む。有用なアジュバントおよびキャリアの例を以下に示す。したがって、ＩＤＯタンパク質、ポリペプチドフラグメント、これらに由来するバリアント、またはペプチドを、本発明の組成物中でアジュバントおよび／またはキャリアと組み合わせることができる。
アジュバントは、ワクチン組成物との混合によってＩＤＯまたはそのペプチドフラグメントに対する免疫応答が増加するか、そうでなければ改変される任意の物質である（以下をさらに参照のこと）。キャリアは、ＩＤＯまたはそのペプチドフラグメントが関連することができ、得に本発明のペプチドの提示を補助する足場構造（例えば、ポリペプチドまたはポリサッカリド）である。
多数の本発明のペプチドは比較的小さな分子である。したがって、ペプチドは、ペプチドをアジュバントおよび／またはキャリアなどの種々の物質と組み合わせてワクチン、免疫原性組成物などを産生するために本明細書中に記載の組成物中に必要とされ得る。広義のアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。アジュバントについての一般的考察は、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８６）の６１〜６３頁に記載されている。Ｇｏｄｉｎｇは、目的の抗原が低分子量であるか免疫原性が低い場合、免疫原性キャリアへのカップリングが推奨されると記述している。かかるキャリア分子の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、およびニワトリ免疫グロブリンが含まれる。種々のサポニン抽出物もまた、免疫原性組成物中のアジュバントとして有用であることが示唆されている。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（周知のサイトカイン）をアジュバントとして使用することが提案されている（ＷＯ９７／２８８１６号）。
キャリアは、アジュバントと無関係に存在することができる。キャリアの機能は、例えば、その活性または免疫原性を増加させるためか、安定性を付与するためか、生物学的活性を増加させるためか、血清半減期を増加させるために特定のペプチドフラグメントの分子量を増加させることであり得る。さらに、キャリアは、ＩＤＯタンパク質、ポリペプチド、そのバリアントまたはペプチドフラグメントのＴ細胞への提示を補助することができる。キャリアは、当業者に公知の任意の適切なキャリア（例えば、タンパク質または抗原提示細胞）であり得る。キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質（トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリン、またはオボアルブミンなど）、免疫グロブリン、またはホルモン（インスリンまたはパルミチン酸など）であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫化のために、キャリアは、ヒトに許容可能且つ安全な生理学的に許容可能なキャリアでなければならない。しかし、破傷風類毒素および／またはジフテリア類毒素は、本発明の１つの実施形態における適切なキャリアである。あるいは、キャリアは、デキストラン（例えば、セファロース）であり得る。
したがって、本発明の態様は、組成物中に存在するＩＤＯタンパク質、ポリペプチドフラグメント、これらに由来するバリアントまたはペプチドがキャリア（例えば、上記タンパク質など）または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ）など）に関連することである。
アジュバントは、例えば、以下からなる群から選択することができる：ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルヌラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミウル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれる）、ＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）乳濁液、リポ多糖およびその誘導体（脂質Ａが含まれる）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｌｏｓｉｓ由来のワックスＤ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＢｒｕｃｅｌｌａ属で見出された物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ Ａ、ＡＬＵＮのメンバー（米国特許第５８７６７号および同第５，５５４，３７２号を参照のこと）、脂質Ａ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリクスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタニドＩＳＡ−５１、およびＱＳ−２１。本発明と共に使用すべき好ましいアジュバントには、油／界面活性剤ベースのアジュバント（モンタニドアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｂｅｌｇｉｕｍから利用可能）、好ましくはモンタニドＩＳＡ−５１など）が含まれる。他の好ましいアジュバントは、細菌ＤＮＡベースのアジュバント（ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバントなど）である。さらなる他の好ましいアジュバントは、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント（ポリＩ：Ｃなど）である。イミダゾキニリンは、好ましいアジュバントのさらに別の例である。最も好ましいアジュバントは、ヒトへの使用に適切なアジュバントである。
モンタニドアジュバント（全てＳｅｐｐｉｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍから利用可能）を、モンタニドＩＳＡ−５１、モンタニドＩＳＡ−５０、モンタニドＩＳＡ−７０、モンタニドＩＳＡ−２０６、モンタニドＩＳＡ−２５、モンタニドＩＳＡ−７２０、モンタニドＩＳＡ−７０８、モンタニドＩＳＡ−７６３Ａ、モンタニドＩＳＡ−２０７、モンタニドＩＳＡ−２６４、モンタニドＩＳＡ−２７、モンタニドＩＳＡ−３５、モンタニドＩＳＡ５１Ｆ、モンタニドＩＳＡ０１６Ｄ、およびモンタニドＩＭＳからなる群から選択することができ、好ましくは、モンタニドＩＳＡ−５１、モンタニドＩＭＳ、およびモンタニドＩＳＡ−７２０からなる群から選択することができ、より好ましくはモンタニドＩＳＡ−５１からなる群から選択することができる。モンタニドＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．）は、異なる界面活性剤を非代謝性鉱物油、代謝性油、またはこれら２つの混合物と組み合わせた油／界面活性剤ベースのアジュバントである。これらを、ＩＤＯまたはそのペプチドフラグメントを含む水溶液を有する乳濁液として使用するために調製する。界面活性剤はオレイン酸マンニドである。ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）は、水溶液として取り扱われる高度に精製された水溶性サポニンである。ＱＳ−２１およびモンタニドＩＳＡ−５１アジュバントを、無菌の使い捨てバイアル中に提供することができる。
周知のサイトカインＧＭ−ＣＳＦは、本発明の別の好ましいアジュバントである。ＧＭ−ＣＳＦは、ここ１０年間にわたってアジュバントとして使用されており、好ましくはＷＯ９７／２８８１６号に記載のＧＭ−ＣＳＦであり得る。
本発明で使用することができるアジュバントの望ましい機能を、以下の表に列挙する。

本発明のワクチン組成物は、１つを超えるアジュバントを含むことができる。さらに、本発明は、任意のアジュバント物質および／またはキャリア（任意の上記またはその組み合わせが含まれる）をさらに含む治療組成物を含む。ＩＤＯタンパク質、そのバリアント、またはペプチドフラグメント、およびアジュバントを任意の適切な順序で個別に投与することができることも意図される。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、モンタニドアジュバント（モンタニドＩＳＡ５１またはモンタニドＩＳＡ７２０など）またはＧＭ−ＣＳＦアジュバントを含む。
したがって、本発明は、アジュバント物質（任意の上記またはその組み合わせが含まれる）をさらに含む治療組成物を含む。抗原（すなわち、本発明のペプチド）およびアジュバントを同時または任意の適切な順序で個別に投与することができることも意図される。
投与量および投与
薬学的組成物中の本発明の免疫原性ペプチドの量は、特定の適用に応じて変化し得る。しかし、ペプチド組成物の単回用量は、好ましくは、約１０μｇ〜約５０００μｇの範囲、より好ましくは約５０μｇ〜約２５００μｇ（約１００μｇ〜約１０００μｇなど）の範囲である。投与様式には、皮内投与、皮下投与、および静脈内投与、持続放出処方物の形態での埋め込みなどが含まれる。当業者に公知の任意および全ての投与形態が本明細書中に含まれる。注射用免疫原性ペプチド組成物の処方に適切であることが当該分野で公知の任意および全ての従来の投薬形態（必要に応じて従来の薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、防腐剤、アジュバント、緩衝液の成分などを含む凍結乾燥形態および溶液、懸濁液または乳濁液形態など）も含まれる。
薬学的組成物を、当業者に公知の任意の従来のプロトコールを使用して調製および投与することができる。実施例３〜５では、本発明のワクチン組成物の非限定的な調製例およびワクチンなどの非限定的な投与例を示す。当業者は、プロトコールを本明細書中に記載の任意のワクチン組成物に容易に適合することができることを認識するであろう。本発明のさらなる実施形態では、本発明の薬学的組成物は、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態（癌および感染など）に罹患した個体の処置に有用である。
本発明の組成物の免疫防御効果を、当業者に公知のいくつかのアプローチを使用して決定することができる。首尾の良い免疫応答を、免疫化後のＤＴＨ反応の発生および／またはワクチン組成物のペプチドを特異的に認識する抗体の検出によって決定することもできる。
本発明のワクチン組成物を、治療有効量で個体に投与することができる。有効量は、種々の要因（個体の容態、体重、性別、および年齢など）に応じて変化し得る。他の要因には、投与様式が含まれる。
薬学的組成物を、種々の経路（皮下、局所、経口、および筋肉内など）によって個体に投与することができる。薬学的組成物を、経口または非経口で投与する。非経口送達方法には、局所投与、動脈内（組織に直接）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、または鼻腔内投与が含まれる。本発明はまた、ワクチン組成物を用いた予防および処置で用いるのに適切な局所、経口、全身、および非経口用の薬学的処方物を提供することを目的とする。
例えば、ワクチン組成物を、錠剤、カプセル（それぞれ、持続放出処方物および徐放処方物が含まれる）、丸薬、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、溶液、懸濁液、シロップ、および乳濁液、または注射などの経口投薬形態で投与することができる。同様に、ワクチン組成物を、静脈内形態（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内形態、皮下形態、局所形態（閉塞ありまたはなし）、または筋肉内形態（全ての使用形態は、薬学分野の当業者に周知）で投与することもできる。本明細書中に記載の任意の化合物を含む有効であるが非毒性の量のワクチンを、予防薬または治療薬として使用することができる。注射用免疫原性ペプチド組成物の処方に適切であることが当該分野で公知の任意および全ての従来の投薬形態（必要に応じて従来の薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、防腐剤、アジュバント、緩衝液の成分などを含む凍結乾燥形態および溶液、懸濁液または乳濁液形態など）も含まれる。
本発明のワクチン組成物の好ましい投与様式には、全身投与（静脈内または皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、経口投与、直腸投与、膣投与、肺投与、および一般的に任意の粘膜投与形態など）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本明細書中に記載の任意の投与形態のための手段が本発明に含まれることが本発明の範囲内に含まれる。
本発明のワクチンを、１回または任意の回数（２回、３回、４回、または５回など）投与することができる。１回を超えるワクチン投与は、得られた免疫応答を追加免疫する効果がある。ワクチンを、前の投与と異なる形態または身体の部分にワクチンを投与することによってさらに追加免疫することができる。追加抗原注射は、同種または異種追加抗原注射のいずれかである。同種追加抗原注射は、第１およびその後のワクチン接種が同一構築物、より具体的には、同一送達ビヒクル、特に同一ウイルスベクターを含む場合である。異種追加抗原注射は、同一構築物が異なるウイルスベクター内に含まれる場合である。
第２の有効成分
本発明の態様は、得られた本明細書中のワクチン組成物を第２の有効成分と組み合わせて使用することである。ワクチン組成物および第２の有効成分の投与は、連続的または組み合わせであり得る。癌および感染のための第２の有効成分の例は上記である。さらなる態様は、ワクチン組成物を処置すべき所与の臨床状態のための関連する他の療法と組み合わせて使用することができることである。かかる療法には、手術、化学療法または遺伝子治療、免疫刺激物質、または抗体が含まれ得る。当業者は所与のシナリオに適切な併用療法を決定することができる。
いくつかの場合、本発明の処置方法をさらなる医学的処置（化学療法、放射線治療、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体および／または抗生物質を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置など）と組み合わせることが適切であろう。
診断および予後診断ツール
本発明のペプチドにより、癌疾患および感染に関する広く適用可能な診断手順および予後診断手順を開発するための根拠が得られる。したがって、他の有用な実施形態では、本発明の組成物は、個体におけるＩＤＯ発現細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための組成物である。診断手順は、ＰＢＬまたは腫瘍組織中のＩＤＯ反応性Ｔ細胞の検出に基づく。
したがって、個体中の１つまたは複数の本発明のペプチドを含むＰＢＬまたは腫瘍組織中のＩＤＯ反応性Ｔ細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための診断キット、個体中のかかる反応性Ｔ細胞の存在の検出方法、腫瘍組織または血液サンプルを本発明のペプチドとクラスＩまたはクラスＩＩ ＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントとの複合体と接触させる工程および組織または血球への複合体の結合を検出する工程を含む方法を提供する。一態様では、本発明は、診断試薬（本明細書中に記載の診断試薬など）として有用な本発明のペプチドとクラスＩまたはクラスＩＩ ＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントとの複合体を提供する。かかる複合体は、単量体または多量体であり得る。
別の有用な診断または予後診断アプローチは、異種動物種中の抗体（例えば、本発明のヒトＩＤＯ由来ペプチドに対して指向するマウス抗体）の生成に基づき、次いで、この抗体を使用して、例えば、ペプチドを提示する癌細胞の存在を診断することができる。かかる免疫化の目的のために、ペプチド量は、一連のｉｎ ｖｉｖｏ療法で使用した量より少量であり得る（上記の量など）。一般に、好ましい用量は、約１μｇ〜約７５０μｇのペプチドの範囲であり得る。本発明のペプチドでの免疫化に基づいてモノクローナル抗体を産生することも可能である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドに特異的に結合することができる分子（（特に、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（そのフラグメントが含まれる））およびかかる結合を遮断することができる分子（例えば、本発明のペプチドに対して指向するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に対して惹起する抗体）に関する。本発明は、さらに、本発明のペプチドまたはタンパク質およびこれらをコードする単離核酸に特異的に結合することができる単離Ｔ細胞受容体に関する。かかるＴ細胞受容体を、例えば、当業者に周知の標準的技術を使用してタンパク質またはペプチド特異的Ｔ細胞からクローン化することができる。
一態様では、本発明はまた、本明細書中に記載のＩＤＯおよび／またはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含む単離Ｔ細胞に関する。単離Ｔ細胞は、ＣＤ８Ｔ細胞またはＣＤ４Ｔ細胞であり得る。単離Ｔ細胞は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大されたＴ細胞である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の拡大方法は当業者に周知である。かかるＴ細胞は、特に、養子移入（ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）または自己細胞移入による癌処置で有用であり得る。したがって、本発明はまた、Ｔ細胞を含む薬学的組成物およびＩＤＯまたはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞受容体を含むＴ細胞を必要とする個体（癌および／または感染に罹患した個体など）に投与する工程を含む処置方法に関する。自己細胞移入を、本質的にＷａｌｔｅｒら（１９９５）に記載のように行うことができる。
本発明は、有効量の本明細書中に定義の組成物（例えば、本明細書中に記載の抗体またはＴ細胞受容体または部分のキットであり得るペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子）を疾患に罹患している個体に投与する工程を含む、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態（癌および感染（好ましくは癌）など）を処置、防止、緩和、または治癒する手段を提供する。したがって、本発明のさらなる態様は、配列番号１および／または配列番号１６のＩＤＯ発現に関連する臨床状態の処置方法を提供することである。
免疫化のモニタリング
好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物はワクチン組成物である。したがって、本発明の目的および態様は、本発明のワクチン組成物を投与する個体における免疫化をモニタリングすることである。したがって、薬学的組成物は、癌および／または感染に対して免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物またはワクチンであり得る。本明細書中で使用する場合、表現「免疫原性組成物またはワクチン」は、ＩＤＯ発現細胞（癌細胞、ＡＰＣ、またはＤＣなど）に対して指示される少なくとも１つの免疫応答型を誘発する組成物に関する。したがって、かかる免疫応答は、以下のうちのいずれかであり得る：細胞表面上に提示されるＨＬＡ／ペプチド複合体を認識し、細胞を溶解することができるＣＴＬを生成するＣＴＬ応答（すなわち、ワクチンは、ワクチン接種被験体中の癌細胞に対する細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘発する）；抗癌抗体を産生するＢ細胞応答；および／またはＤＴＨ型の免疫応答。本発明の目的は、個体への本発明の組成物の投与後の任意の上記反応のモニタリングによって個体の免疫化をモニタリングすることである。
一態様では、本発明は、
ｉ）個体から血液サンプルを提供する工程、
ｉｉ）ＩＤＯまたはそのペプチドフラグメントを提供する工程であって、タンパク質またはペプチドが本明細書中に記載の任意のタンパク質またはペプチドであり得る、提供する工程、
ｉｉｉ）血液サンプルがタンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうか決定する工程、
ｉｖ）それによってタンパク質またはペプチドに対する免疫応答が個体中で惹起されたかどうかを決定する工程を含む、免疫化をモニタリングする方法に関する。
個体は、好ましくは、ヒト（例えば、ＩＤＯまたはそのペプチドフラグメントまたはタンパク質またはペプチドをコードする核酸で免疫化されたヒト）である。
部分のキット
本発明はまた、
・本明細書中に記載の任意のワクチン組成物および／または
・ＩＤＯタンパク質またはそのバリアントおよび／または
・本明細書中に記載の任意のＩＤＯのポリペプチドフラグメント、そのバリアント、および／またはこれら由来のペプチド、および／または
・上記の２項のタンパク質をコードする任意の核酸、および
部分のキットを使用するための説明書
を含む部分のキットに関する。
本発明はまた、
・本明細書中に記載の任意のワクチン組成物および／または
・ＩＤＯタンパク質またはそのバリアントおよび／または
・本明細書中に記載の任意のＩＤＯのポリペプチドフラグメント、そのバリアント、および／またはこれら由来のペプチド、および／または
・上記の２項のタンパク質をコードする任意の核酸、および
第２の有効成分
を含む部分のキットに関する。
好ましくは、癌を処置する場合に例えば上記列挙の化学療法薬の中から第２の有効成分が選択されるように、処置すべき臨床状態に対応して第２の有効成分を選択する。同様に、微生物／ウイルス感染を処置する場合、第２の有効成分は、好ましくは抗生物質および／または抗ウイルス薬である。
部分のキットの成分は、好ましくは各組成物中に含まれる。しかし、部分のキットの成分が全て同一組成物内に含まれることは本発明の範囲内である。したがって、部分のキットの成分を、同時または任意の順序で連続的に投与することができる。
図面の詳細な説明
図１：ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによって測定したＩＤＯに対するＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔ細胞応答。１３人の健康な個体、４人の乳癌患者、６人の黒色腫患者、および１０人の腎細胞癌患者由来のＰＢＬを分析した。全個体はＨＬＡ−Ａ２陽性であった。ペプチドＩＤＯ２（ＦＬＶＳＬＬＶＥＩ）（ａ）、ＩＤＯ６（ＶＬＳＫＧＤＧＬ）（ｂ）、およびＩＤＯ５（ＡＬＬＥＩＡＳＣＬ）（ｃ）を試験した。Ｔリンパ球をペプチドで１回刺激後、関連ペプチドを用いるか用いないで４×１０５細胞／ウェルにて２連でプレートした。ペプチド特異的スポットの平均数（ペプチドを添加しないスポットを差し引いた後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓｅｒｉｅｓ２．０分析器（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ）を使用して各患者について計算した。（ｄ）細胞内ＩＤＯ染色によって測定されたＰＢＭＣ中のＩＤＯ発現に相関したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したＰＢＭＣ中のＩＤＯ５特異的細胞数。患者を以下の２つの群に分類した；ＩＤＯ−ＰＢＭＣまたはＩＤＯ＋ＰＢＭＣ。ＭＦＩＩＤＯおよびＭＦＩアイソタイプコントロールを比較する２回サンプリングした片側ｔ検定によって細胞内ＩＤＯ発現を得た。ここで、ＭＦＩは平均蛍光強度である。ｐ値＜０．０５（有意水準）について、ＰＢＭＣをＩＤＯ＋と定義した。白三角は、各群における４×１０５個のＰＢＭＣあたりのＩＤＯ５特異的スポットの平均数を示す。黒三角は、各群についての平均のＩＤＯ５特異的スポット数を示す。（ｅ）乳癌患者由来のＰＢＭＣ中のＩＤＯ５に対するＥＬＩＳＰＯＴ応答の例。
図２：ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞の四量体分析。（ａ）ＨＬＡ−Ａ２拘束ポジティブコントロールペプチドＨＩＶ−１ｐｏｌ４７６〜４８４（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）の結合を、アセンブリアッセイによってペプチドＩＤＯ５と比較した。（ｂ）四量体複合体ＨＬＡ−Ａ２／ＩＤＯ５−ＰＥおよびＣＤ８−アロフィコシアニンを使用したフローサイトメトリー染色によって視覚化した腎細胞癌患者由来のＰＢＬ中のＩＤＯ５特異的ＣＤ８Ｔ細胞の例。ネガティブコントロールとして、同一患者由来のＰＢＬを、四量体複合体ＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ ｐｏｌ４７６〜４８４−ＰＥおよびＣＤ８−アロフィコシアニンで染色した。（ｃ）健康なドナーまたは乳癌、黒色腫、もしくは腎細胞癌の患者由来のＰＢＬを、四量体複合体ＨＬＡ−Ａ２／ＩＤＯ５またはＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ ｐｏｌで染色し、ｅｘ ｖｉｖｏまたは１回のｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド刺激後のいずれかでフローサイトメトリーによって分析した。点線は、ＩＤＯ５四量体陽性細胞が同一患者においてｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で検出可能であることを示す。（ｄ）フローサイトメトリーによってｅｘ ｖｉｖｏで視覚化された腎細胞癌患者由来のＣＤ８Ｔ細胞富化ＰＢＭＣ由来のＩＤＯ５四量体／ＣＤ８ゲーティング細胞のＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ２８表現型分析の例。比較のために、細胞をアイソタイプ適合コントロールで染色した。（ｅ）四量体複合体ＨＬＡＡ２／ＩＤＯ５−ＰＥおよびＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７を使用してフローサイトメトリー染色によって視覚化した黒色腫患者由来のＩＬ−２拡大ＴＩＬ培養物の例。ネガティブコントロールとして、ＴＩＬを四量体複合体ＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ ｐｏｌ４７６〜４８４−ＰＥおよびＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７で染色した。（ｆ）ＩＤＯ５四量体のポジティブコントロールとして、ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローンをＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ−ＰＥおよびＨＬＡ−Ａ２／ＩＤＯ５−ＰＥ四量体で染色した。
図３：ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローンの特異性および機能的能力。（ＲＢＳ３５）を５１Ｃｒ放出アッセイによってアッセイした。（ａ）ペプチドを使用しないかＩＤＯ５ペプチドでパルスしたＴ２細胞の溶解。（ｂ）ＨＬＡ−クラスＩ特異的抗体Ｗ６／３２を添加しないか添加したＩＤＯ＋、ＨＬＡ−Ａ２＋結腸癌細胞株ＳＷ４８０の特異的溶解およびＩＤＯ−、ＨＬＡ−Ａ２＋結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６の溶解。（ｃ）ＩＤＯ５でパルスしたかパルスしていない非放射性Ｔ２細胞を無添加または添加したＩＤＯ＋、ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞株ＦＭ５５Ｍの溶解（インヒビター／標的比＝２０：１）。（ｄ）ＨＬＡ−Ａ２陽性ＡＭＬ患者から富化したＡＭＬ−芽球の溶解。ＡＭＬ−芽球、Ｂ細胞、およびＴ細胞を、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋マイクロビーズをそれぞれ使用してＡＭＬ患者の骨髄から枯渇させた。高度に富化したＡＭＬ−芽球を、ＨＬＡ−クラスＩ特異的抗体Ｗ６／３２を添加するか添加しないで標的細胞として使用した。全アッセイを、異なるＥ：Ｔ比で行った。（ｅ）癌細胞株中の細胞内ＩＤＯ発現を示すヒストグラム。データは、３試験の代表である。ＭＦＩＩＤＯ（暗色のヒストグラム）およびＭＦＩアイソタイプコントロール（淡色のヒストグラム）を比較する２回サンプリングした片側ｔ検定によって細胞内ＩＤＯ発現を得た。ここで、ＭＦＩは平均蛍光強度である。左：ＨＣＴ−１１６（ｐ＝０．３００）。右：ＳＷ４８０（ｐ＝０．００２）。
図４：ヒストグラムは細胞内ＩＤＯ染色を示す（暗色のヒストグラム）。ネガティブコントロールは、二次蛍光色素抱合抗体のみでの染色物であった（淡色のヒストグラム）。ＩＤＯ発現を、ＭＦＩ陽性−ＭＦＩバックグラウンド／２×ＳＤバックグラウンド（式中、ＭＦＩは平均蛍光強度である）と定義された染色指数を使用して決定した。細胞を、染色指数が１を超える場合にＩＤＯ陽性と定義した２１。（ａ）結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（０，０１）およびＳＷ４８０（１，３）、（ｂ）乳癌細胞株ＣＡＭＡ−１（１，３）およびＣＡＭＡ−１＋ＩＦＮ−γ（１，８）、および（ｃ）未成熟ＤＣ（０，２）および成熟ＤＣ（１，２）。
図５：５１Ｃｒ放出アッセイによってアッセイしたＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローン（ＲＢＳ３５）がＩＦＮ−γ処置乳癌細胞株を死滅させる機能的能力。ＩＦＮ−γ処置前および処置後のＨＬＡ−Ａ２陽性乳癌細胞株ＣＡＭＡ−１（ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｂ）の溶解。全アッセイを、異なるＥ：Ｔ比で行った。（ｃ）、左：ＩＦＮ−□処置前および処置後のＣＡＭＡ−１中の細胞内ＩＤＯ発現を示すヒストグラム。データは、３試験の代表である。ＭＦＩＩＤＯ（暗色のヒストグラム）およびＭＦＩアイソタイプコントロール（淡色のヒストグラム）を比較する２回サンプリングした片側ｔ検定によって細胞内ＩＤＯ発現を得た。ここで、ＭＦＩは平均蛍光強度である。上：ＣＡＭＡ−１（ｐ＝０．０２０およびＭＦＩＩＤＯ／ＭＦＩアイソタイプコントロール＝２．３）。下：ＣＡＭＡ−１＋ＩＦＮ−□処置２５（ｐ＝０．００４およびＭＦＩＩＤＯ／ＭＦＩアイソタイプコントロール＝３．５）。右：ＩＦＮ−□処置前および処置後のＣＡＭＡ−１中のＨＬＡ−Ａ２発現を示すヒストグラム。データは、３試験の代表である。ＭＦＩＨＬＡ−Ａ２（暗色のヒストグラム）およびＭＦＩアイソタイプコントロール（淡色のヒストグラム）を比較する２回サンプリングした片側ｔ検定によってＨＬＡ−Ａ２発現を得た。上：ＣＡＭＡ−１（ｐ＝０．００４およびＭＦＩＨＬＡ−Ａ２／ＭＦＩアイソタイプコントロール＝４３．７）。下：ＣＡＭＡ−１＋ＩＦＮ−□処置（ｐ＝０．００２およびＭＦＩＩＤＯ／ＭＦＩＨＬＡ−Ａ２＝１４１．２）。（ｄ）ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞のバルク培養によるＩＤＯタンパク質発現の下方制御のためのＩＤＯ ＳｈＲＮＡでトランスフェクトした結腸癌細胞株ＳＷ４８０の溶解。ポジティブコントロールとして、コントロールＳｈＲＮＡでトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞を標的細胞として使用した。全アッセイを、異なるＥ：Ｔ比で行った。（ｄ）コントロールＳｈＲＮＡ（ｐ＝０．００１およびＭＦＩＩＤＯ／ＭＦＩアイソタイプコントロール＝４．８）（上）およびＩＤＯ ＳｈＲＮＡ（ｐ＝０．０４０およびＭＦＩＩＤＯ／ＭＦＩアイソタイプコントロール＝２．１）（下）でトランスフェクトしたＳＷ４８０中の細胞内ＩＤＯ発現を示すヒストグラム。
図６：５１Ｃｒ放出アッセイによってアッセイしたＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローン（ＲＢＳ３５）がＤＣを死滅させる機能的能力。（ａ）自己未成熟および成熟ＤＣの溶解。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ２＋同種未成熟および成熟ＤＣの溶解。全アッセイを、異なるＥ：Ｔ比で行った。（ｃ）ＤＣにおける細胞内ＩＤＯ発現を示すヒストグラム。データは、３試験の代表である。ＭＦＩＩＤＯ（暗色のヒストグラム）およびＭＦＩアイソタイプコントロール（淡色のヒストグラム）を比較する２回サンプリングした片側ｔ検定によって細胞内ＩＤＯ発現を得た。ここで、ＭＦＩは平均蛍光強度である。左：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ未成熟ＤＣ（ｐ＝０．１００）。右：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟ＤＣ（ｐ＝０．００１）。（ｄ）ＩＤＯ＋ＰＢＭＣからｅｘ ｖｉｖｏで直接単離した自己ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の溶解。コントロールとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した自己ＩＤＯ未成熟ＤＣおよびＩＤＯ＋成熟ＤＣを使用した。（ｅ）乳癌患者由来のＰＢＭＣにおいてＥＬＩＳＰＯＴによって測定したＥＢＶ ＢＭＬＦ１２８０−２８８（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）に対するＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔ細胞応答の例。ＥＢＶ ＢＭＬＦ１（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）由来のＨＬＡ−Ａ２拘束エピトープに対する反応性についての試験前に２６のＩＤＯ特異的Ｔ細胞がなし（左）およびあり（ＰＢＭＣ：ＩＤＯ特異的Ｔ細胞比３０００：１）（右）にて、ＰＢＭＣ培養物をＩＦＮ−□で５日間処置した。以下の３つの異なるＰＭＢＣ濃度を試験した：１．５×１０５細胞、５×１０４細胞（上の２行）、および１０４細胞（下の２行）。
図７：５１Ｃｒ放出アッセイによってアッセイしたＩＤＯ５特異的Ｔ細胞の特異性および機能的能力。（ａ）ＩＤＯ５ペプチドまたは無関係のペプチド（ＨＩＶ−１ ｐｏｌ４７６−４８４）でパルスした非放射性Ｔ２細胞を無添加および添加したＨＬＡ−Ａ２＋／ＩＤＯ＋黒色腫細胞株ＦＭ５５ＭのＲＢＳ３５の溶解（インヒビター／標的比＝２０：１）および標的細胞としてナチュラルキラー細胞株Ｋ５６２を使用して試験したＲＢＳ３５のＮＫ細胞活性。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ２＋ＡＭＬ患者から富化したＡＭＬ−芽球のＲＢＳ３５による溶解。ＡＭＬ−芽球、Ｂ細胞、およびＴ細胞を、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋マイクロビーズをそれぞれ使用してＡＭＬ患者の骨髄から枯渇させた。高度に富化したＡＭＬ−芽球を、ＨＬＡ−クラスＩ特異的抗体Ｗ６／３２を添加するか添加しないで標的細胞として使用した。（ｃ）ＩＤＯ５ペプチドまたは無関係のペプチド（ＨＩＶ−１ ｐｏｌ４７６〜４８４）でパルスしたＴ２細胞の溶解およびＩＤＯ５特異的Ｔ細胞バルク培養によるＨＬＡＡ２＋／ＩＤＯ＋結腸癌細胞株ＳＷ４８０の溶解。（ｄ）５１Ｃｒ放出アッセイによってアッセイした以下の３つの異なるＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローンによるＨＬＡ−Ａ２＋／ＩＤＯ＋結腸癌細胞株ＳＷ４８０およびＨＬＡ−Ａ２＋／ＩＤＯ−結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６の溶解：（ＲＢＳ２６（白色の三角）、ＲＢＳ３１（黒色の三角）、ＲＢＳ４６（灰色の三角））。全アッセイを、異なるＥ：Ｔ比で行った。
図８：Ｃｌｕｓｔａｌ ＷによるＩＤＯ配列の多重アラインメント。
図９：Ｃｌｕｓｔａｌ ＷによるＩＤＯおよびＩＤＯＬＩＫＥのペアワイズアラインメント。
実施例１
患者／個体
ＰＢＬ／ＰＢＭＣを、癌患者（乳癌、黒色腫、および腎細胞癌）および健康なコントロールから採取した。血液サンプルを、任意の種類の抗癌療法の終了から最短で４週間後に採取した。大部分の腎細胞癌患者は以前にＩＬ２およびＩＦＮ−αで処置されており、ほとんどの黒色腫患者は高用量のＩＬ２およびＩＦＮ−αを投与されている一方で、全乳癌患者は数種類の化学療法（例えば、エピルビシン、ドセタキセル、カペシタビン（ｃａｂｅｃｉｔａｂｉｎｅ））、トラスツズマブ、および／または内分泌療法で予め処置されていた。ＰＢＬをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離を使用して単離し、ＨＬＡタイピングし（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結した。全部で２０人のＨＬＡ−Ａ２＋患者が含まれ、これらのうちで採血前に免疫療法を受けた者はいなかった。任意のこれらの測定前に患者から説明と同意を得た。
ペプチド
ＩＤＯ由来のエピトープを、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子の好ましいペプチド長、アンカー残基、および補助アンカーについての知識にしたがって予想した。ＩＤＯタンパク質のスキャニングを、ＭＨＣクラスＩアンカー残基のタンパク質配列の手作業の試験と組み合わせて「データベースＳＹＦＰＥＩＴＨＩＰ」３２を使用して行った。選択ペプチドをＧｅｎｓｃｒｉｐｔから購入した。以下の１１種の９量体および１０量体のペプチドを産生した：ＩＤＯ１の５４〜６２位（ＱＬＲＥＲＶＥＫＬ）、ＩＤＯ２の１６４〜１７２位（ＦＬＶＳＬＬＶＥＩ）、ＩＤＯ３の１９５〜２０３位（ＴＬＬＫＡＬＬＥＩ）、ＩＤＯ４の４１〜４９位（ＦＩＡＫＨＬＰＤＬ）、ＩＤＯ５の１９９〜２０７位（ＡＬＬＥＩＡＳＣＬ）、ＩＤＯ６の３２０〜３２８位（ＶＬＳＫＧＤＧＬ）、ＩＤＯ７の３８３〜３９１位（ＤＬＭＮＦＬＫＴＶ）、ＩＤＯ８の２７５〜２８３位（ＶＬＬＧＩＱＱＴＡ）、ＩＤＯ９の１０１〜１０９位（ＫＶＬＰＲＮＩＡＶ）、ＩＤＯ１０の６１〜７０位（ＫＬＮＭＬＳＩＤＨＬ）、およびＩＤＯ１１の３４１〜３５０位（ＳＬＲＳＹＨＬＱＩＶ）。ペプチドを、ＤＭＳＯ（最終濃度１０ｍＭ）または蒸留水に溶解した（最終濃度２ｍＭ）。ＨＬＡ−Ａ２高親和性結合エピトープＨＩＶ−１ ｐｏｌ４７６〜４８４（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）を、無関係のコントロールとして使用した。ＨＬＡ−Ａ２拘束エプスタイン・バーウイルスペプチドＥＢＶＢＭＬＦ１２８０〜２８８（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）をコントロールとして使用した。
ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合についてのアセンブリアッセイ
［３５Ｓ］−メチオニンで代謝的に標識されたＨＬＡ−Ａ２分子への合成ペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の結合親和性を、以前に記載のアセンブリアッセイで測定した３３。アッセイは、細胞溶解の際にＴＡＰ欠損細胞株Ｔ２から放出された空のＨＬＡ分子のペプチド媒介安定化に基づく。安定に折り畳まれたＨＬＡ分子を、ＨＬＡクラス−Ｉ特異的高次構造依存モノクローナル（ｍＡｂ）Ｗ６／３２の使用によって免疫沈降し、等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動によって分離した。主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）重鎖バンドを、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒプログラム（ＦＵＪＩ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ，Ｃａｒｒｏｌｔｏｎ，ＴＸ）を使用して定量した。バンド強度は、アッセイ中に回収されたペプチド結合クラスＩ ＭＨＣ複合体の量と直接比例した。ＨＬＡ−Ａ２の回収物を、１００、１０、１、および０．１μＭの関連ペプチドの存在下で測定した。最大半量安定化に十分なペプチド濃度として各ペプチドのＣＤ５０値を計算した。
ＰＢＬの抗原刺激
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイの感度を高くするために、分析前にＰＢＬをｉｎ ｖｉｔｒｏにてペプチドで１回刺激した３４。０日目に、ＰＢＬを解凍し、１０μＭペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の存在下で２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中の５％熱失活ヒト血清を含むＸ−ｖｉｖｏ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中に濃度２×１０６細胞にて２ｍｌ／ウェルでプレートした。１日後、４０ＩＵ／ｍｌ組換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を培養物に添加した。８日目に培養細胞をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した。
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
以前に記載のように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ペプチドエピトープ特異的ＩＮＦ−γ放出エフェクター細胞を定量した１７。いくつかの実験では、記載のように（３４）ＰＢＭＣを分析前にｉｎ ｖｉｔｒｏにてペプチドで１回刺激して、アッセイ感度を上げた。簡潔に述べれば、底がニトロセルロース９６ウェルプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＭＡＩＰ Ｎ４５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、抗ＩＦＮ−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ；Ｍａｂｔｅｃｈ）でコーティングした。ウェルを洗浄し、Ｘ−ｖｉｖｏ培地によってブロッキングし、１０μＭペプチドを使用するか使用しないでエフェクター細胞を異なる細胞濃度にて２連で添加した。プレートを一晩インキュベートした。翌日、培地を破棄し、ウェルを洗浄後、ビオチン化二次抗体（７−Ｂ６−１−ビオチン；Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加した。プレートを室温（ＲＴ）で２時間インキュベートし、洗浄し、アビジン−酵素抱合体（ＡＰ−Ａｖｉｄｉｎ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加した。プレートをＲＴで１時間インキュベートし、酵素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加し、ＲＴで５〜１０分間インキュベートした。暗紫色スポットの出現時に、水道水での洗浄によって反応を停止させた。スポットをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓｅｒｉｅｓ ２．０分析器（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ）を使用して計数し、ペプチド特異的ＣＴＬ頻度を、スポット形成細胞数から計算することができる。
フローサイトメトリー
四量体染色のために、癌患者および健康なドナー由来のＰＢＬならびに癌患者由来のＴＩＬを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてペプチドで１回刺激するか、ｅｘ ｖｉｖｏで直接分析した。７日目に、ＣＤ８細胞をＤｙｎａｌ ＣＤ８ネガティブ単離キット（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＰＢＬから単離した。得られたＴ細胞培養物をＰＥカップリング四量体で染色し、その後に以下の蛍光色素（ｆｌｏｕｒｏｃｈｒｏｍｅ）カップリングｍＡｂで抗体を染色した：ＣＤ８−アロフィコシアニン／ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ−Ｃｙ５、およびＣＤ２８−アロフィコシアニン（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。四量体染色をＰＢＳ＋２％ＦＣＳ中で暗所にて室温で１５分間行い、それに対して、抗体染色をＰＢＳ＋２％ＦＣＳ中にて４℃の暗所で行った。以下のＭＨＣ四量体複合体を使用した：ＨＬＡ−Ａ２／ＩＤＯ５（ＡＬＬＥＩＡＳＣＬ）およびＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ−１ ｐｏｌ４７６〜４８４（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）。サンプルを、ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＢＤ ＦＡＣＳ ａｒｉａで分析した。
癌細胞株およびＤＣを、フローサイトメトリーを使用してＩＤＯ発現について試験した。固定および透過処理後（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ，ＢＤ）、細胞をマウス抗ＩＤＯ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で染色し、その後にＦＩＴＣ標識抗マウス二次抗体（ＤＡＫＯ）で染色した。全実験について、誤って結合した二次抗体および自己蛍光由来のバックグラウンド蛍光を決定するために、ＦＩＴＣカップリング二次抗体のみで染色したネガティブコントロールを含めた。ＩＤＯ発現を、ＭＦＩ陽性−ＭＦＩバックグラウンド／２×ＳＤバックグラウンド（式中、ＭＦＩは平均蛍光強度である）として定義された染色指数を使用して決定した。細胞を、染色指数が１を超える場合にＩＤＯ陽性と定義した２１。
癌細胞を、フローサイトメトリーを使用してＨＬＡ−Ａ２発現について試験した。細胞を蛍光色素カップリングＨＬＡ−Ａ２ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。比較のために、細胞をアイソタイプ適合コントロールで染色した。サンプルを、ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢＤ ＦＡＣＳ ａｒｉａで分析した。正規性を仮定すると、ＭＦＩＨＬＡ−Ａ２およびＭＦＩアイソタイプコントロールを比較する２回サンプリングした片側ｔ検定によってＨＬＡ−Ａ２発現を得た。ここで、ＭＦＩは平均蛍光９の強度である。ｐ値＜０．０５（有意水準）について、細胞をＨＬＡ−Ａ２＋と定義した。発現倍数を、ＭＦＩＨＬＡ−Ａ２／ＭＦＩアイソタイプコントロールとして定義した。
樹状細胞（ＤＣ）
１０％ヒトＡＢ血清で富化したＲＰＭＩ−１６４０中での３７℃で６０分間の培養皿上の接着によってＰＢＭＣからＤＣを生成した。接着単球を、１０％ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０中にてＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）の存在下で６日間培養した。ＤＣを、ＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）の添加によって測定した。
抗原特異的Ｔ細胞培養物およびクローンの確立
癌患者由来のＰＢＬを、照射した（２５Ｇｙ）ＩＤＯ５負荷自己ＤＣ（ＰＢＬ：ＤＣ比＝３×１０６：３×１０５）、３μｇ／ｍｌのβ２ｍ、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、および４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で刺激した。培養物を、１０日毎に照射自己ＤＣ（２回）、その後に照射ＰＢＬ（２回）で刺激した。２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）をＤＣでの各刺激後に添加し、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）をＰＢＬでの各刺激後に添加した。１ヶ月間の成長後、培養物を標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＩＤＯ５に対する特異性について試験した。特異的培養物由来のＰＢＬを、１０６／ｍｌの照射（２５Ｇｙ）ＩＤＯ５負荷ＰＢＬおよび１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下にて限界希釈によってクローン化した。３〜４日毎に、５０μｌのＩＬ−２を含む新鮮な培地を、最終濃度１２０Ｕ／ｍｌまで添加した。成長中のクローンを、ＩＤＯ５負荷ＰＢＬ（５×１０４細胞／ウェル）および１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を使用して拡大した。拡大後、クローンを、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて特異性および細胞傷害可能性について試験した。
細胞傷害性アッセイ
ＣＴＬ媒介細胞傷害性についての従来の５１Ｃｒ放出アッセイを、他に記載のように行った３５。標的細胞は、Ｔ２細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した自己未成熟および成熟ＤＣ、同種ＨＬＡ−Ａ２陽性未成熟および成熟ＤＣ、自己ｅｘ ｖｉｖｏ単離単球、Ｔ細胞およびＢ細胞（ＣＤ１４＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ１９＋マイクロビーズ（ＭＡＣＳ）を使用して単離）、ナチュラルキラー標的細胞株Ｋ５６２、ｅｘ ｖｉｖｏ負荷ＨＬＡ−Ａ２陽性ＡＭＬ−芽球（ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋マイクロビーズ（ＭＡＣＳ）を使用してＡＭＬ患者の骨髄から単離）、ＨＬＡ−Ａ２陽性乳癌細胞株ＣＡＭＡ−１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６、およびＳＷ４８０（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から利用可能）、ならびにＨＬＡ−Ａ２陽性黒色腫細胞株ＦＭ５５Ｍ（ＩＰＤ−ＥＳＴＤＡＢデータベース由来、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｉｐｄ／ｅｓｔｄａｂ／３６で利用可能）であった。ＨＬＡ特異的ｍＡｂ Ｗ６／３２（２μｇ／１００μｌ）を使用して溶解をブロッキングした３７。いくつかのアッセイでは、癌細胞を１００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ−γで２日間処置した。
ＡＭＬ芽球の富化
ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋マイクロビーズ（ＭＡＣＳ）をそれぞれ使用して、ＡＭＬ患者の骨髄からＢ細胞およびＴ細胞を枯渇させた。高度に富化したＡＭＬ−芽球（ＣＤ３−、ＣＤ１９−）を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて標的細胞として使用した。
癌細胞におけるＩＤＯの下方制御
ヒトＳＷ４８０を、製造者の説明書にしたがってＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＳｕｐｅｒＡｒｒａｙから得た表示の低分子ヘアピンＲＮＡ（ＳｈＲＮＡ）プラスミドでトランスフェクトした。細胞を、ＬＳＢ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で直接溶解した。ＬＳＢ溶解物を５分間ボイルし、１０％プレキャストタンパク質ゲル（ＢｉｏＲａｄ）上にロードした。タンパク質を、セミドライトランスファー法によってＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に電気的に移行させ、製造者の説明書にしたがって表示の抗体で探索した。ブロットを、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手したＥＣＬシステムおよびＣＣＤカメラ（ＬＡＳ−１０００，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用して現像した。以下の抗体を使用した：抗Ｃｄｋ７（ＭＯ−１）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）および抗ＩＤＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
ＩＤＯ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔ細胞エピトープ
１１種のＩＤＯ由来ペプチドを、主なＨＬＡ−Ａ２特異的アンカー残基に基づいたアルゴリズムを使用して選択し、その後に合成した１６。ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮ−γ分泌アッセイを使用して、癌患者および健康な個体由来の末梢血Ｔ細胞をこれらのＩＤＯ由来ペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答の存在について試験した。このアプローチは、癌患者における腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の同定に非常に有効であることが以前に証明されている１７〜１９。したがって、ＨＬＡ−Ａ２陽性の後期癌患者（乳癌、黒色腫、および腎細胞癌）由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ＥＬＩＳＰＯＴによる試験前にｉｎ ｖｉｔｒｏにて異なるペプチドで１回刺激した。記載のように、ＥＬＩＳＰＯＴの感度を上げるためにこの手順を選択した１７，２０。ＩＤＯ２（ＩＤＯ１６４〜１７２；ＦＬＶＳＬＬＶＥＩ）、ＩＤＯ６（ＩＤＯ３２０〜３２８；ＶＬＳＫＧＤＧＬ）、特にＩＤＯ５（ＩＤＯ１９９〜２０７；ＡＬＬＥＩＡＳＣＬ）に対するＥＬＩＳＰＯＴ応答を検出した（図１）。コントロールとして、これら３つのＩＤＯ由来ペプチドに対する反応性について健康な個体由来のＰＢＬを試験した。任意の健康なコントロールにおける任意のＩＤＯ由来ペプチドに対する自発的応答は検出できなかった。「ＮＣＢＩデータベース」を使用したこれらのペプチドのアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索により、ＩＤＯタンパク質中でこれらのモチーフのみが一般的であることが示された。
実施例２
（材料と方法は実施例１に記載のとおりである）
癌患者におけるＩＤＯ反応性ＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔ細胞の検出
見かけ上最も免疫原性の高いＩＤＯ由来ペプチド（すなわち、ＩＤＯ５）を、アセンブリアッセイによるＨＬＡ−Ａ２高親和性ポジティブコントロールエピトープ（すなわち、ＨＩＶ−１ ｐｏｌ４７６−４８４（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ））との比較によってＨＬＡ−Ａ２に対する結合親和性について試験した（図２ａ）。特に、ＩＤＯ５は、高親和性コントロールエピトープよりも遥かに良好にＨＬＡ−Ａ２に結合した。ＨＬＡ−Ａ２へのＩＤＯ５の高い結合親和性により、安定なＨＬＡ−Ａ２／ＩＤＯ５四量体を作製することができ、これを使用して、フローサイトメトリーによってＩＤＯ反応性ＣＴＬを検出することができた。この分析により、ＨＬＡ−Ａ２陽性癌患者の血中のＩＤＯ５反応性ＣＤ８ Ｔ細胞の存在が明確に確認された（図２）。図２ｂは、コントロールとして使用したＨＩＶ四量体複合体での腎細胞癌患者におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後のＩＤＯ５特異的Ｔ細胞応答の例を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激によってＩＤＯ反応性Ｔ細胞の頻度が顕著に増加する一方で、選択した患者においてｅｘ ｖｉｖｏでＩＤＯ反応性Ｔ細胞が容易に検出可能であった（図２ｃ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に最も強い応答を示す３人の患者では、各反応性もｅｘ ｖｉｖｏで検出された。全体的に見て、７人のＨＬＡ−Ａ２陽性の健康な個体および１１人のＨＬＡ−Ａ２陽性患者由来のＰＢＬを分析し、健康なドナーにおける０．００１％と比較して、癌患者におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後の総ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＤＯ反応性細胞の平均頻度は０．０３％であることが明らかとなった（図２ｃ）。
いかなる健康なドナーにおいてもＩＤＯ反応性Ｔ細胞は検出できなかった（図２ｂ）。ＩＤＯ反応性Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ染色により、天然に存在するＩＤＯ５特異的Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２８＋中心／エフェクター記憶表現型を有することが示された（３４）。ＩＤＯ５四量体ゲーティング細胞のかかるｅｘ ｖｉｖｏ表現型染色の例を図２ｄに示す。比較として、サンプルをアイソタイプ適合コントロールで染色した。次に、四量体染色によってＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫および頭頸部癌患者由来のＩＬ−２処置ＴＩＬ培養物中のＩＤＯ５特異的Ｔ細胞の存在を試験した。図２ｅに示すように、ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞をＴＩＬ間で容易に検出することができる。全体的に見て、５人の分析した患者のうちの４人が検出可能なＩＤＯ５特異的Ｔ細胞を有していた。同様に、黒色腫患者および頭頸部癌患者由来のＴＩＬ培養物中のＩＤＯ５特異的Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴで検出することができた（データ示さず）。ＨＬＡ−Ａ２／ＩＤＯ５四量体の特異性を調節するために、ＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローンを染色した。ＨＬＡ−Ａ２／ＩＤＯ５四量体はＩＤＯ５特異的Ｔ細胞クローンを有効に染色したのに対して、Ｔ細胞クローンはコントロールＨＬＡＡ２／ＨＩＶ四量体によって染色されなかった（図２ｆ）。
実施例３
（材料と方法は実施例１に記載のとおりである）
ＩＤＯ特異的Ｔ細胞の機能的能力
ＩＤＯ５ペプチドに対する応答を保有する患者が同定された場合、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこのペプチドに対するＣＴＬバルク培養物を生成するためにかかる患者由来のＰＢＬを使用した。ＰＢＬを、自己ＩＤＯ５パルスＤＣによって刺激した。４ラウンドの刺激後、ペプチドの特異性を標準的な５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。これらのバルク培養物由来の細胞は、ＩＤＯ５ペプチドでパルスしたＴＡＰ欠損Ｔ２細胞を溶解した。ＩＤＯ特異的Ｔ細胞の溶解能力をより詳細に分析するために、限界希釈クローニングによってこれらのバルク培養物からＣＴＬクローンを確立した。短い拡大期間後、成長クローンの特異性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって分析した。ＩＤＯ特異的溶解能力を示す３３個のＴ細胞クローンのうち、より優れた成長速度によってさらに拡大させるための４個のクローンを選択した。代表的なＴ細胞クローンを図３ａに示す。Ｔ細胞クローンＲＢＳ３５はＩＤＯ５パルスＴ２細胞を有効に死滅させたのに対して、ペプチドを含まないＴ２細胞は溶解されなかった（図３ａ）。
実施例４
（材料と方法は実施例１に記載のとおりである）
ＩＤＯ特異的Ｔ細胞による腫瘍標的の死滅
多数の癌細胞株およびＤＣを、細胞内タンパク質染色およびその後のＦＡＣＳ分析によってＩＤＯ発現について試験した２１。この目的を達成するために、結腸癌細胞株ＳＷ４８０、黒色腫細胞株ＦＭ５５Ｍ、乳癌細胞株ＣＡＭＡ−１およびＭＤＡ−ＭＢ２３１、直接富化したＡＭＬ−芽球、および成熟ＤＣはＩＤＯ陽性であった。結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６および未成熟ＤＣのみがＩＤＯ陰性であった。さらに、癌細胞株のＩＦＮ−γ処置によってＩＤＯ発現が増加した。
ＩＤＯ染色の代表例を図４中のヒストグラムに示す。
重要なことに、Ｔ細胞クローンＲＢＳ３５は、ペプチドパルスＴ２細胞だけでなくＨＬＡ−Ａ２＋、ＩＤＯ＋結腸癌細胞株ＳＷ４８０（図３ｂ）も高効率で死滅させた。対照的に、ＲＢＳ３５はＨＬＡ−Ａ２＋／ＩＤＯ−結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６を溶解しなかった（図３ｂ）。ＲＢＳ３５のＨＬＡ拘束を、ＳＷ４８０標的細胞の溶解を完全に無効にしたＨＬＡ特異的ｍＡｂ Ｗ６／３２を使用したＨＬＡ−クラスＩのブロッキングによって確認した（図３ｂ）。同様に、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＩＤＯ＋黒色腫細胞株ＦＭ５５ＭはＲＢＳ３５によって死滅した（図３ｃ）。ＩＤＯ５（１０μＭ）ペプチドでパルスした非標識Ｔ２細胞を使用した非放射性ターゲティング阻害アッセイにより、死滅のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド特異性が確認された：非放射性（非標識）ＩＤＯ５パルスＴ２細胞の添加によってＦＭ５５Ｍ黒色腫細胞の死滅が完全に抑制された一方で、ペプチドを使用しない非放射性Ｔ２細胞の添加ではＦＭ５５Ｍの死滅効果はなかった（図３ｃ）。無関係のペプチド（ＨＩＶ−１ ｐｏｌ４７６−４８４）でパルスした非放射性Ｔ２細胞の添加もＦＭ５５Ｍの死滅効果がなかった（図７ａ）。ＮＫ細胞標的細胞株 Ｋ５６２に対する細胞傷害性は認められなかった（図７ａ）。
さらに、ＲＢＳ３５がＡＭＬ患者の骨髄由来のｅｘ ｖｉｖｏで直接富化したヒトＨＬＡ−Ａ２＋ＡＭＬ−芽球を溶解する能力を試験した。この目的のために、ＨＬＡ−Ａ２＋ＡＭＬ患者の骨髄からＴ細胞（ＣＤ３＋）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋）を枯渇させた。その後、高度に富化したＡＭＬ−芽球（ＣＤ３−、ＣＤ１９−）を、５１Ｃｒ放出アッセイにおける標的細胞として使用した。図３ｄに示すように、ＲＢＳ３５は、ＨＬＡ依存様式で白血病細胞を有効に溶解した。６人の患者（５人のＨＬＡ−Ａ２＋患者および１人のＨＬＡ−Ａ２−患者）由来のＡＭＬ芽球を富化し、これらは全てＩＤＯを発現した（データ示さず）。ＲＢＳ３５がＨＬＡ依存性様式でＨＬＡ−Ａ２＋白血病細胞を有効に溶解した一方で、ＨＬＡ−Ａ２−白血病細胞は溶解されなかった（図７ｂ）。
ＲＢＳ３５による腫瘍標的の代表的な死滅を示すために、ポリクローナルのＩＤＯ５特異的バルク培養物および３つの他のＴ細胞クローン（ＲＢＳ２６、ＲＢＳ３１、ＲＢＳ４６）によるＳＷ４８０の死滅を図７ｃおよび図７ｄに示す。ＲＢＳ３５と同様に、これらのクローン（ＲＢＳ２６、ＲＢＳ３１、ＲＢＳ４６）はＨＬＡ−Ａ２＋／ＩＤＯ−結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６を溶解しなかった（図７ｄ）。
最後に、ＨＬＡ−Ａ２＋乳癌細胞株ＣＡＭＡ−１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の死滅を試験した。ＣＡＭＡ−１細胞株はＲＢＳ３５によって死滅したのに対して（図５ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はＲＢＳ３５によって認識されなかった（図５ｂ）。ＩＮＦ−γ処置により、両細胞株中のＩＤＯ発現は増加した。これと一致して、ＩＮＦ−γ処置は、ＲＢＳ３５によるＣＡＭＡ−１の死滅を増加させ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の死滅を導入させた（図５）。
さらに、本発明者らは、ポリクローナルＩＤＯ５特異的バルク培養物およびＲＢＳ３５クローンによる死滅が実際にＩＤＯ特異的であることを示す。したがって、ＩＤＯ ｓｈＲＮＡを使用して、ヒトＳＷ４８０結腸癌細胞株中のＩＤＯタンパク質発現が下方制御され、それにより、これらの腫瘍細胞が死滅から救済された（図５ｃ）。この下方制御を、細胞内タンパク質染色によって視覚化した。これらの染色により、ＩＤＯ ＳｈＲＮＡの使用によって細胞中のＩＤＯタンパク質発現レベルが減少することが確認された（図５ｄ）。次いで、トランスフェクトした細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイにおける標的分子として使用した。ＩＤＯ ＳｈＲＮＡでトランスフェクトされた癌細胞は、ポリクローナルＩＤＯ特異的バルク培養によって認識されなかったのに対して、無関係のコントロールＳｈＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は図５ｃに示すように死滅した。
実施例５
（材料と方法は実施例１に記載のとおりである）
ＩＤＯ特異的Ｔ細胞による免疫コンピテント細胞の死滅
ＩＤＯ発現は腫瘍細胞および腫瘍間質細胞に拘束されないが、免疫細胞中でも誘導することができる。したがって、次のさらにより重要な工程として、ＩＤＯ発現ＤＣもＩＤＯ反応性ＣＴＬによる死滅に感受性を示すかどうかという問題に取り組んだ。この概念を試験するために、本発明者らは、ＣＴＬクローンが生成された同一ドナーから自己ＤＣを生成した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＰＧＥ２からなる標準的な成熟カクテルの添加によってＤＣを成熟させた２２。ＲＢＳ３５は、成熟ＤＣを有効に死滅させた。対照的に、自己未成熟ＩＤＯ−ＤＣはＲＢＳ３５によって死滅しなかった（図６ａ）。さらに、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナー由来のＩＤＯ＋成熟ＤＣおよびＩＤＯ−未成熟ＤＣのＲＢＳ３５による認識を試験した。同種成熟化ＤＣはＲＢＳ３５に死滅したのに対して、同一ドナー由来のＩＤＯ−未成熟ＤＣは死滅しなかった（図６ｂ）。
図６ｃでは、ｉＤＣと対照的にｍＤＣはＩＤＯを発現することを示す。次に、ＲＢＳ３５が自己の単球、Ｔ細胞、およびＢ細胞を溶解する能力を試験した。この目的のために、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで直接ＩＤＯ＋ＰＢＭＣから単離した。次いで、単離した細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイにおける標的細胞として使用した。自己ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ＲＢＳ３５によって溶解されなかった（図６ｄ）。
最後に、ＩＤＯ特異的Ｔ細胞がＩＤＯ−発現抑制細胞の枯渇によって免疫応答を増強するかどうかを試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを提供した。それ故、ＰＢＭＣの培養物をＩＦＮ−γで処置して、自己ＩＤＯ特異的Ｔ細胞を含むか含まない培養物中の免疫活性およびＩＤＯ発現を増加させた。５日後、培養物中のＥＢＶ ＢＭＬＦ１２８０−２８８（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）由来のＨＬＡ−Ａ２拘束免疫優性エピトープに対する免疫反応性を試験した。培養物中の全細胞数が同一であったにもかかわらず、ＥＢＶペプチドに対する反応性は、ＩＤＯ特異的Ｔ細胞を有する培養物中でより高かった（図６ｅ）。次ぎに、ＩＤＯ特異的Ｔ細胞の添加が通常の検出限界をはるかに下回る１０４個のＰＢＭＣしか使用しないＥＬＩＳＰＯＴにおいてＥＢＶ応答を検出可能な範囲まで免疫反応性を増加させるかどうかを精査した。実際、この低濃度のＰＢＭＣでさえも明確なＥＢＶ応答を検出することができた（図６ｅ）。予想通り、ＩＤＯ特異的Ｔ細胞を含まない培養物中では、この低い細胞濃度ではいかなるＥＢＶ応答は検出できなかった（図６ｅ）。
参考文献のリスト

Claims (51)

  1. 癌または感染の処置または予防に使用するためのワクチン組成物であって、以下：
    ａ）配列番号１のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、または配列番号６を含む配列番号１の連続配列からなる免疫原性活性ペプチドフラグメント、または前記ＩＤＯまたは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸、ならびに
    ｂ）アジュバント
    を含む、ワクチン組成物。
  2. 前記免疫原性活性ペプチドフラグメントが５〜５０個の範囲のアミノ酸の連続配列からなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
  3. 前記免疫原性活性ペプチドフラグメントが、前記配列番号１のＩＤＯの
    ａ）８〜１１個の範囲のアミノ酸の連続配列および／または
    ｂ）１８〜３０個の範囲のアミノ酸の連続配列
    である、請求項１から２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  4. 前記ワクチン組成物が、ＩＤＯ発現によって特徴づけられる臨床状態に罹患した個体に投与した場合に、配列番号１のＩＤＯを発現する癌および／または抗原提示細胞に対して免疫応答を誘発することができる、請求項１から３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  5. 前記ワクチン組成物が、前記個体の細胞性免疫応答を誘発することができる、請求項１から４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  6. 以下の特徴：
    ａ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定したところ、臨床状態に罹患した個体のＰＢＬ集団において１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができ、そして／または
    ｂ）腫瘍組織中でエピトープペプチドに反応性を示すＣＴＬをｉｎ ｓｉｔｕで検出することができ、
    ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＤＯ特異的Ｔ細胞の成長を誘導することができる
    の少なくとも１つを有するＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  7. ＭＨＣクラスＩ分子によって拘束されるペプチドフラグメントを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  8. ＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるペプチドフラグメントを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  9. ペプチドフラグメントを含み、前記ペプチドフラグメントが配列番号１のＩＤＯ由来の８〜１０個または１８〜２５個の連続するアミノ酸からなる、請求項１から８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  10. 臨床状態に罹患した個体のＰＢＬ集団において１０４個のＰＢＬあたり少なくとも１０個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができるペプチドフラグメントを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  11. 配列番号１のＩＤＯが発現する臨床状態に罹患した個体のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができるペプチドフラグメントを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  12. 前記癌が腫瘍形成癌疾患である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  13. 前記ペプチドフラグメントが、
    ａ）最多で５０個のアミノ酸残基、または
    ｂ）最多で４５個のアミノ酸残基、または
    ｃ）最多で４０個のアミノ酸残基、または
    ｄ）最多で３５個のアミノ酸残基、または
    ｅ）最多で３０個のアミノ酸残基、または
    ｆ）最多で２５個のアミノ酸残基、または
    ｇ）２０〜２５個のアミノ酸残基、または
    ｈ）最多で２０個のアミノ酸残基、または
    ｉ）最多で１９個のアミノ酸残基、または
    ｊ）最多で１８個のアミノ酸残基、または
    ｋ）最多で１７個のアミノ酸残基、または
    ｌ）最多で１６個のアミノ酸残基、または
    ｍ）最多で１５個のアミノ酸残基、または
    ｎ）最多で１４個のアミノ酸残基、または
    ｏ）最多で１３個のアミノ酸残基、または
    ｐ）最多で１２個のアミノ酸残基、または
    ｑ）最多で１１個のアミノ酸残基または
    ｒ）８〜１０個のアミノ酸残基からなる、請求項１から１２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  14. 前記ペプチドフラグメントが配列番号６(IDO5)である、請求項１から１３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  15. 前記ワクチンが、ワクチン接種個体中でＩＤＯ発現癌細胞および／またはＩＤＯ発現抗原提示細胞に対して細胞傷害効果を有する調節性Ｔ細胞の産生を誘発する、請求項１から１４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  16. 前記ワクチン組成物が、被験体における腫瘍間質中の抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することができる、請求項１から１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  17. 前記ワクチン組成物が被験体における臨床反応を誘発することができ、前記臨床反応が安定な疾患、部分的応答、または完全な寛解によって特徴づけられる、請求項１から１６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  18. ＩＤＯではないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  19. 前記アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、およびイミダゾキニリンからなる群より選択される、請求項１から１８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  20. 前記アジュバントがモンタニドＩＳＡアジュバントである、請求項１から１９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  21. 前記アジュバントがモンタニドＩＳＡ５１またはモンタニドＩＳＡ７２０である、請求項２０に記載のワクチン組成物。
  22. 前記アジュバントがモンタニドＩＳＡ５１である、請求項２１に記載のワクチン組成物。
  23. 前記アジュバントがＧＭ−ＣＳＦである、請求項１から１９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  24. 前記ワクチン組成物が、前記免疫原性活性ペプチドフラグメントをコードする核酸を含む、請求項１から２３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  25. 前記核酸が請求項１から１４のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、請求項１から２４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  26. 前記核酸がベクター内に含まれる、請求項１または２５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  27. 前記ベクターが、ウイルスベクターおよび細菌ベクターからなる群より選択される、請求項２６に記載のワクチン組成物。
  28. 前記ベクターがＴ細胞刺激性ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項２６または２７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  29. ＩＤＯに属さないかまたはＩＤＯに由来しない、タンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む、請求項１から２８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  30. 請求項１から２９のいずれか１項に記載のワクチン組成物および第２の有効成分を含む部分のキット。
  31. 前記第２の有効成分が免疫刺激組成物である、請求項３０に記載のワクチン組成物を含む部分のキット。
  32. さらなる免疫刺激組成物が１つまたは複数のインターロイキンを含む、請求項３１に記載の部分のキット。
  33. 前記インターロイキンがＩＬ−２および／またはＩＬ−２１から選択される、請求項３０から３２のいずれか１項に記載の部分のキット。
  34. 前記第２の有効成分が抗癌剤である、請求項３０に記載のワクチン組成物を含む部分のキット。
  35. 前記抗癌剤が化学療法薬である、請求項３４に記載の部分のキット。
  36. 前記化学療法薬が、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イリノテカン、レナリドマイド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブリミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンから選択される、請求項３４または３５のいずれか１項に記載の部分のキット。
  37. 前記第２の有効成分が抗生物質である、請求項３０に記載のワクチン組成物を含む部分のキット。
  38. 前記抗生物質が、アモキシシリン、ペニシリン、アシクロビル、および／またはビダラビンから選択される、請求項３７に記載の部分のキット。
  39. 提供された前記組成物は同時または逐次的に投与されるものである、請求項３０から３８のいずれか１項に記載の部分のキット。
  40. 請求項１から１４のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントを含む、臨床状態に罹患した個体におけるＩＤＯに反応性を示すＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための組成物。
  41. 請求項１から１４のいずれか１項に記載のペプチドフラグメントを含む、臨床状態に罹患した個体におけるＩＤＯに反応性を示すＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の存在のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ診断のための診断キット。
  42. 免疫化のモニタリングを補助する方法であって、
    ａ）個体由来の血液サンプルを提供する工程、
    ｂ）請求項１から３４のいずれか１項に記載の免疫原性活性ペプチドフラグメント、または前記ＩＤＯまたは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を提供する工程、および
    ｃ）前記血液サンプルが前記ペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうか決定する工程であって、前記血液サンプルにおいて前記ペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体を含むＴ細胞の存在は、前記ペプチドに対する免疫応答が前記個体中で惹起されたことを示す、工程
    を含む、方法。
  43. 癌または感染の処置または予防に使用するための薬学的組成物であって、以下：
    ａ）配列番号１のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、または請求項１から１４のいずれか１項に記載の免疫原性活性ペプチドフラグメント、または前記ＩＤＯまたは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸、ならびに
    ｂ）アジュバント
    を含む、薬学的組成物。
  44. 癌または感染の処置または予防に使用するための薬学的組成物であって、
    配列番号１のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、または請求項１から１４のいずれか１項に記載の免疫原性活性ペプチドフラグメント、または前記ＩＤＯまたは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を含む、薬学的組成物。
  45. 癌の処置または予防に使用するための、請求項４３または４４に記載の薬学的組成物。
  46. ＩＤＯが発現される癌疾患の処置または予防に使用するための、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  47. さらなる癌処置と組み合わせて使用される、請求項４３から４６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  48. 前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置からなる群より選択される、請求項４７に記載の薬学的組成物。
  49. 抗原提示細胞（ＡＰＣ）中でＩＤＯを発現させる感染の処置または予防に使用するための、請求項４３または４４に記載の薬学的組成物。
  50. 前記感染に対するさらなる処置と組み合わせて使用される、請求項４９に記載の薬学的組成物。
  51. 前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質を使用した処置、遺伝子治療、抗体を使用した処置、および樹状細胞を使用した処置からなる群より選択される、請求項５０に記載の薬学的組成物。
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