JP6028488B2 - Analytical carrier, method for producing and using the same - Google Patents
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Description
本発明は、生理活性物質を固定するための担体、該担体の製造方法、及び該担体上に生理活性物質を固定した分析用担体に関する。 The present invention relates to a carrier for immobilizing a physiologically active substance, a method for producing the carrier, and an analytical carrier having a physiologically active substance immobilized on the carrier.
一般的に生理活性物質固定化のための分析用担体は、粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートの形状で提供される場合が多い。
担体が粒子の場合は、カラムや容器に充填して、生理活性物質の反応、分離、精製等にしばしば用いられる。あるいは診断薬としても用いられる。また、担体が基板の場合は、前記同様に診断ツールに用いるなどして使用される。さらに繊維、フィルター、膜、シートの場合は大量の分離、精製ツール等に用いることができる。
In general, an analysis carrier for immobilizing a physiologically active substance is often provided in the form of particles, substrates, fibers, filters, membranes, and sheets.
When the carrier is a particle, it is often used for reaction, separation, purification, etc. of a physiologically active substance by filling a column or container. Or it is used also as a diagnostic agent. Further, when the carrier is a substrate, it is used for a diagnostic tool as described above. Further, in the case of fibers, filters, membranes, and sheets, they can be used for a large amount of separation and purification tools.
このような目的の場合、担体表面に確実に生理活性物質を固定化することが必須であり、そのため、以前は樹脂に対する物理化学吸着による生理活性物質の固定が主流であったが、現在では、担体表面に官能基を導入し、生理活性物質を化学結合により固定化する方法がよく採用されている。 For such a purpose, it is essential to reliably immobilize the physiologically active substance on the surface of the carrier. For that reason, the immobilization of the physiologically active substance by physicochemical adsorption to the resin was the mainstream before, but now, A method in which a functional group is introduced on the surface of a carrier and a physiologically active substance is immobilized by chemical bonding is often employed.
これにより、生理活性物質の剥離を防ぐとともに、分子量や構造によらず確実に生理活性物質を固定化することが可能となった。 As a result, peeling of the physiologically active substance can be prevented, and the physiologically active substance can be reliably fixed regardless of the molecular weight or structure.
特許文献１には、磁性体を内包する樹脂製マイクロビーズを乳化重合により作製し、ビーズ表面の官能基にエチレングリコールジグリシジルエーテルを反応させ、モノクローナル抗体を結合させる方法が記載されている。しかしながら、この方法では、マイクロビーズを重合により作製する工程が必要で、それは煩雑であるとともに、必要な粒径、粒度分布を制御することが困難である。 Patent Document 1 describes a method in which a resin-made microbead enclosing a magnetic material is prepared by emulsion polymerization, and a functional group on the surface of the bead is reacted with ethylene glycol diglycidyl ether to bind a monoclonal antibody. However, this method requires a step of producing microbeads by polymerization, which is complicated and difficult to control the required particle size and particle size distribution.
一方、特許文献２には、入手容易な汎用樹脂製マイクロビーズを基材として、その表面を加水分解し、表面に精製したカルボン酸に親水性のスペーサー分子を結合させ、さらにスペーサー分子の官能基に生理活性物質を結合し、親水性により非特異吸着を抑制する方法が述べられている。 On the other hand, in Patent Document 2, a general-purpose resin microbead, which is readily available, is used as a base, its surface is hydrolyzed, and a hydrophilic spacer molecule is bonded to the purified carboxylic acid on the surface. Describes a method of binding a physiologically active substance to the substance and suppressing non-specific adsorption due to hydrophilicity.
この方法により得られるマイクロビーズは、加水分解によりカルボン酸を生じる樹脂を基材として用いる必要がある。また、当該マイクロビーズを、そのスペーサー分子に固定した生理活性物質に親和性の高い物質を捕捉するために使用する場面において、生体由来の夾雑物を多く含む検体を接触させると非特異吸着を抑制しきれない可能性が高い。 The microbeads obtained by this method need to use, as a base material, a resin that generates carboxylic acid by hydrolysis. In addition, when the microbead is used to capture a substance having a high affinity for a physiologically active substance immobilized on the spacer molecule, nonspecific adsorption is suppressed by contacting a specimen containing a large amount of contaminants derived from a living body. There is a high possibility that it will not fit.
本発明は上記実情に鑑み成し遂げられたものであり、生理活性物質を固定化することができる担体、特に好ましくは、生理活性物質を固定化することができ且つ非特異吸着が抑制された担体を簡便に作製し、提供することを目的とする。 The present invention has been accomplished in view of the above circumstances, and a carrier capable of immobilizing a physiologically active substance, particularly preferably a carrier capable of immobilizing a physiologically active substance and suppressing nonspecific adsorption. It is intended to be easily produced and provided.
また、本発明の他の目的は、上記した生理活性物質固定化用粒子の上に生理活性物質を固定した担体を提供することにある。 Another object of the present invention is to provide a carrier having a physiologically active substance immobilized on the above-mentioned particles for immobilizing a physiologically active substance.
本発明は以下の通りである。
（１）生理活性物質を捕捉する機能を有する分析用担体であって、担体の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にアミノ基と反応する官能基を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする分析用担体。
（２）担体の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該担体と側鎖に親水性基を有する重合性モノマーと、生理活性物質を固定化するアミノ基と反応する官能基を有する重合性モノマーとを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、
該担体表面に高分子化合物を含む層を形成した（１）記載の分析用担体。
（３）前記アミノ基と反応する官能基がエポキシ基である（１）または（２）に記載の分析用担体。
（４）前記側鎖に親水性基を有する重合性モノマーが下記の一般式［１］で表されるモノマーを含む請求の（２）乃至（３）いずれか１項に記載の分析用担体。
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は親水性基を示す。Ｘはアルキレン
基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、異なっていてもよい。また、Ｘがエチレングリコール残基の場合、これ自体が親水性を示すのでＲ２は任意の官能基を選択できる。）
（５）前記親水性基が、ベタイン構造を有する官能基である（１）乃至（４）いずれか１項に記載の分析用担体。
（６）前記ベタイン構造を有する官能基がホスホリルコリン基である請求の（５）に記載の分析用担体。
（７）前記側鎖に親水性基を有する重合性モノマーが、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する（４）乃至（６）いずれか１項に記載の分析用担体。
（８）生理活性物質を固定化するアミノ基と反応する官能基を有する重合性モノマーが下記の一般式［２］ で表される物質である（２）乃至（７）いずれか１項に記載の分析用
担体。
（ 式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコ
ール残基またはアルキレン基を示す。Ｗはアミノ基と反応する官能基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
（９）前記担体の表面に導入する重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる１種以上である（２）乃至（８）いずれか１項に記載の分析用担体。
（１０）前記担体の表面に導入する連鎖移動基がメルカプト基である（２）乃至（８）いずれか１項に記載の分析用担体。
（１１）前記担体が無機材料からなる（１）乃至（１０）いずれか１項に記載の分析用担体。
（１２）前記無機材料が無機酸化物からなる（１１）に記載の分析用担体。
（１３）前記無機酸化物が酸化ケイ素である請求の（１２）に記載の分析用担体。
（１４）前記担体の形状が粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートである（１）乃至（１３）記載の分析用担体。
（１５）前記担体の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる担体表面の官能基との共有結合の形成によってなされる（２）乃至（１４）いずれか１項に記載の分析用担体。
（１６）前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである（１５）に記載の分析用担体。（１７）（１）乃至（１６）いずれか１項に記載の分析担体であって、高分子化合物を含む層の前記アミノ基と反応する官能基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用担体。
（１８）前記生理活性物質が酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、糖タンパク質等のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、核酸、糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体、シアル化糖鎖等の糖鎖、脂質、低分子化合物、上述以外の高分子有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子などから選ばれる少なくとも一つである（１７）に記載の分析用担体。
（１９）（１）乃至（１８）いずれか１項に記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性水溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性水溶液中で担体を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む分析担体の製造方法。
（２０）（１）乃至（１８）いずれか１項に記載の分析用担体の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した担体と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む分析担体の製造方法。
（２１）前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする（１９）に記載の分析用担体の製造方法。
（２２）（１）乃至（１８）いずれか１項に記載の分析用担体の製造方法であって、高分子化合物を含む層を形成した担体に生理活性物質をリン酸塩緩衝液に溶解した溶液を接触させる工程を含む生分析用担体の製造方法。
（２３）前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である（２２）に記載の分析用担体の製造方法。
（２４）前記リン酸塩がリン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、又はリン酸水素二ナトリウムのいずれかを含む（２２）または（２３）に記載の分析用担体の製造方法。
（２５）（２２）乃至（２４）のいずれか１項に記載の生理活性物質固定化分析用担体を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用担体の使用方法。
The present invention is as follows.
(1) An analytical carrier having a function of capturing a physiologically active substance, wherein a polymer is immobilized on the surface of the carrier, and the polymer has a first repeating unit having a hydrophilic group in a side chain. And a second repeating unit having a functional group that reacts with an amino group at the end of the side chain.
(2) A functional group that introduces a polymerizable functional group or chain transfer group on the surface of the carrier and reacts with the polymerizable monomer having a hydrophilic group on the carrier and side chain, and an amino group that immobilizes the physiologically active substance. By mixing a polymerizable component containing a polymerizable monomer having, and then allowing the polymerization reaction to proceed,
The analytical carrier according to (1), wherein a layer containing a polymer compound is formed on the surface of the carrier.
(3) The analytical carrier according to (1) or (2), wherein the functional group that reacts with the amino group is an epoxy group.
(4) The analytical carrier according to any one of (2) to (3), wherein the polymerizable monomer having a hydrophilic group in the side chain contains a monomer represented by the following general formula [1].
(In the formula, R1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R2 represents a hydrophilic group, X represents an alkylene group or an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms, and p represents an integer of 1 to 100. p When X is an integer of 2 or more and 100 or less, the repeated Xs may be the same or different, and when X is an ethylene glycol residue, R2 is optional because it itself is hydrophilic. The functional group can be selected.)
(5) The analytical carrier according to any one of (1) to (4), wherein the hydrophilic group is a functional group having a betaine structure.
(6) The analytical carrier according to (5), wherein the functional group having a betaine structure is a phosphorylcholine group.
(7) The analytical carrier according to any one of (4) to (6), wherein the polymerizable monomer having a hydrophilic group in the side chain has 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine.
(8) The polymerizable monomer having a functional group that reacts with an amino group for immobilizing a physiologically active substance is a substance represented by the following general formula [2]: (2) to (7) Carrier for analysis.
(In the formula, R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group, Y represents an alkylene glycol residue or alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, W represents a functional group that reacts with an amino group, and q represents an integer of 1 to 100. When q is an integer of 2 or more and 100 or less, the repeated Ys may be the same or different.
(9) The analysis according to any one of (2) to (8), wherein the polymerizable functional group introduced to the surface of the carrier is at least one selected from the group consisting of a methacryl group, an acryl group, and a vinyl group. Carrier.
(10) The analytical carrier according to any one of (2) to (8), wherein the chain transfer group introduced onto the surface of the carrier is a mercapto group.
(11) The analytical carrier according to any one of (1) to (10), wherein the carrier is made of an inorganic material.
(12) The analytical carrier according to (11), wherein the inorganic material comprises an inorganic oxide.
(13) The carrier for analysis according to (12), wherein the inorganic oxide is silicon oxide.
(14) The analytical carrier according to any one of (1) to (13), wherein the shape of the carrier is a particle, a substrate, a fiber, a filter, a membrane, or a sheet.
(15) The introduction of a polymerizable functional group or chain transfer group to the surface of the carrier is a covalent bond between a silane coupling agent having a polymerizable functional group or a chain transfer group and a functional group on the surface of the carrier serving as a nucleus. The carrier for analysis according to any one of (2) to (14), wherein
(16) The analytical carrier according to (15), wherein the silane coupling agent having a polymerizable functional group or a chain transfer group is an alkoxysilane having a polymerizable functional group or a chain transfer group. (17) The analytical carrier according to any one of (1) to (16), wherein the physiologically active substance is immobilized via a functional group that reacts with the amino group of the layer containing the polymer compound. Characteristic analytical carrier.
(18) The physiologically active substance is an enzyme, antibody, lectin, receptor, protein A, protein G, protein A / G, avidin, streptavidin, neutravidin, glutathione-S-transferase, glycoprotein, etc., peptide, amino acid , Hormones, nucleic acids, sugars, oligosaccharides, polysaccharides, sialic acid derivatives, sugar chains such as sialylated sugar chains, lipids, low molecular compounds, high molecular organic substances other than those described above, inorganic substances, or a fusion thereof, or The analytical carrier according to (17), which is at least one selected from a virus or a molecule constituting a cell.
(19) A method for producing an analytical carrier according to any one of (1) to (18), wherein an alkoxysilane having a polymerizable functional group or a chain transfer group is hydrolyzed in an acidic aqueous solution, Next, a method for producing an analytical carrier comprising the steps of heating the carrier with stirring in an acidic aqueous solution of an alkoxysilane having a polymerizable functional group or a chain transfer group, and further heating after drying.
(20) A method for producing an analytical carrier according to any one of (1) to (18), wherein a carrier having a polymerizable functional group or chain transfer group introduced therein and a polymerizable monomer are mixed in a solvent. The manufacturing method of the analytical support | carrier which includes the process of advancing a polymerization reaction by this, and the process of drying.
(21) The method for producing an analytical carrier according to (19), wherein the polymerization reaction is a radical polymerization reaction.
(22) The method for producing an analytical carrier according to any one of (1) to (18), wherein a physiologically active substance is dissolved in a phosphate buffer in a carrier in which a layer containing a polymer compound is formed. A method for producing a bioanalytical carrier comprising a step of contacting a solution.
(23) The method for producing an analytical carrier according to (22), wherein a phosphate concentration of the phosphate buffer is 0.1 M or more and 5 M or less.
(24) The analytical carrier according to (22) or (23), wherein the phosphate includes any one of potassium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, or disodium hydrogen phosphate. Manufacturing method.
(25) The biologically active substance-immobilized analysis carrier according to any one of (22) to (24), a target biomolecule solution, blood, plasma, serum, cell disruption solution, cell culture solution, and A method for using an analytical carrier, which comprises recovering a target biological material by contacting with at least one solution selected from a tissue disruption solution.
本発明により生理活性物質を固定化することができる担体、特に反応触媒を必要とせず生理活性物質を固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した担体を簡便に作製し、提供することが可能となった。 According to the present invention, a carrier capable of immobilizing a physiologically active substance, particularly a carrier capable of immobilizing a physiologically active substance without requiring a reaction catalyst and suppressing nonspecific adsorption, is simply prepared and provided. Became possible.
以下、本発明の分析用担体、その製造方法および使用方法について説明する。 Hereinafter, the analytical carrier of the present invention, its production method and use method will be described.
本発明の分析用担体は、生理活性物質を固定化する機能を有する担体であって、担体表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にアミノ基と反応する官能基を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。 The analytical carrier of the present invention is a carrier having a function of immobilizing a physiologically active substance, wherein a polymer is immobilized on the surface of the carrier, and the polymer has a hydrophilic group in the side chain. It has 1 repeating unit and the 2nd repeating unit which has a functional group which reacts with an amino group at the terminal of a side chain, It is characterized by the above-mentioned.
本発明の分析用担体は、生理活性物質を捕捉する機能を有するものである。具体的には、アミノ基と反応する官能基を有する分析用担体に関するものであり、該官能基を用いて生理活性物質のアミノ基との結合反応を利用するものである。 The analytical carrier of the present invention has a function of capturing a physiologically active substance. Specifically, the present invention relates to an analytical carrier having a functional group that reacts with an amino group, and utilizes a binding reaction with an amino group of a physiologically active substance using the functional group.
ここで、生理活性物質とは、例えば酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、糖タンパク質等のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、核酸、糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体、シアル化糖鎖等の糖鎖、脂質、低分子化合物、上述以外の高分子有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子等を挙げることができる。 Here, the physiologically active substance is a protein such as an enzyme, antibody, lectin, receptor, protein A, protein G, protein A / G, avidin, streptavidin, neutravidin, glutathione-S-transferase, glycoprotein, or the like. Amino acids, hormones, nucleic acids, sugars, oligosaccharides, polysaccharides, sialic acid derivatives, sugar chains such as sialylated sugar chains, lipids, low molecular weight compounds, macromolecular organic substances other than those described above, inorganic substances, or fusions thereof, Alternatively, a virus or a molecule constituting a cell can be used.
前記担体の基材の表面には、重合体が固定されている。この重合体は、アミノ基と反応する官能基を持ち生理活性物質を効率良く、かつ簡易に担体に結合することを可能とするものである。さらに、この生理活性物質以外の物質（検出対象以外のタンパク質等）の非特異吸着を効果的に抑制するものである。 A polymer is fixed on the surface of the substrate of the carrier. This polymer has a functional group that reacts with an amino group, and allows a physiologically active substance to be bound to a carrier efficiently and easily. Furthermore, non-specific adsorption of substances other than the physiologically active substance (proteins other than the detection target) is effectively suppressed.
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にアミノ基と反応する官能基を有する第２繰り返しユニットと、を有する。すなわち、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制し、側鎖の末端にアミノ基と反応する官能基を有する第２繰り返しユニットが生理活性物質を捕捉することができるものである。 The polymer has a first repeating unit having a hydrophilic group in the side chain and a second repeating unit having a functional group that reacts with an amino group at the end of the side chain. That is, the first repeating unit having a hydrophilic group in the side chain suppresses nonspecific adsorption of proteins other than the detection target, and the second repeating unit having a functional group that reacts with an amino group at the end of the side chain is physiological. An active substance can be captured.
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、例えばアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ベタイン構造を有する官能基、とりわけホスホリルコリン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するものである。これにより、血清や細胞ライセート等に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。 The first repeating unit having a hydrophilic group in the side chain includes, for example, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue, a functional group having a betaine structure, particularly an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a phosphorylcholine group, etc. It is derived from. Thereby, the nonspecific adsorption | suction of the protein contained in serum, a cell lysate, etc. can be suppressed significantly.
具体的にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。 Specifically, the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue comprises a chain of a (meth) acryl group and an alkylene glycol residue X having 1 to 10 carbon atoms, as shown by the following formula (1). A compound is preferred.
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は親水性基を示す。Ｘはアルキレン
基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、異なっていてもよい。また、Ｘがエチレングリコール残基の場合、これ自体が親水性を示すのでＲ２は任意の官能基を選択できる。）
(In the formula, R1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R2 represents a hydrophilic group, X represents an alkylene group or an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms, and p represents an integer of 1 to 100. p When X is an integer of 2 or more and 100 or less, the repeated Xs may be the same or different, and when X is an ethylene glycol residue, R2 is optional because it itself is hydrophilic. The functional group can be selected.)
前記式（１）中のアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。 The alkylene glycol residue X in the formula (1) has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6, more preferably 2 to 4, still more preferably 2 to 3, most preferably. Is 2. When the carbon number is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption.
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｐは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数ｑが、２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
Moreover, the repeating number p of the alkylene glycol residue Y is not particularly limited, but is preferably an integer of 1 to 100, more preferably an integer of 2 to 100, still more preferably 2 to 95. It is an integer, most preferably an integer of 4 to 90. When the repeat number q is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption.
In addition, when the repeating number q is 2 or more and 100 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue Y to be repeated may be the same or different.
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、具体的にはメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。 Specific examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue include methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, polyethylene glycol (meth) acrylate, and methoxydiethylene glycol (meth) acrylate. , Ethoxydiethylene glycol (meth) acrylate, (meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain, phenoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, etc., but less non-specific adsorption of components other than the target physiologically active substance From the viewpoint of availability, methoxypolyethylene glycol methacrylate or ethoxypolyethylene glycol methacrylate is preferred.
ベタイン構造を有する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基とベタイン構造を有する官能基を有する官能基が、アルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖を介して結合した化合物であることが好ましい。 As the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group having a betaine structure, as shown by the following formula (1), a functional group having a (meth) acrylic group and a functional group having a betaine structure is an alkylene group or A compound bonded via a chain of an alkylene glycol residue X having 1 to 10 carbon atoms is preferable.
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２はベタイン構造を有する官能基を示す。Ｘはアルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一
であっても、異なっていてもよい。）
(Wherein R1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R2 represents a functional group having a betaine structure, X represents an alkylene group or an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms, and p represents an integer of 1 to 100) When p is an integer of 2 or more and 100 or less, the repeated Xs may be the same or different.
ベタイン構造を有するエチレン系不飽和重合性モノマーには、カルボキシベタイン系モノマー、スルホベタイン系モノマー、ホスホベタイン系モノマーなどがある。また、ホスホリルコリン構造を有するモノマーもベタイン構造を有するモノマーの一種である。これらのなかでは、ホスホリルコリン構造を有するモノマーが非特異吸着の抑制効果が高く、好ましい。 Examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a betaine structure include a carboxybetaine monomer, a sulfobetaine monomer, and a phosphobetaine monomer. A monomer having a phosphorylcholine structure is also a kind of monomer having a betaine structure. Among these, a monomer having a phosphorylcholine structure is preferable because it has a high effect of suppressing nonspecific adsorption.
カルボキシベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム等が挙げられる。 Specific examples of the carboxybetaine monomer include dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxy). Ethyl) (3-carboxylatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-carboxylatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (4-carboxylatobutyl) aminium, dimethyl (2-acryloyl) Oxyethyl) (4-carboxylatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (carboxy Tomechiru) aminium, and the like.
スルホベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。 Specific examples of the sulfobetaine monomer include dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxy). Ethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (4-sulfonatobutyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) ) (4-sulfonatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (sulfonatomethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (sulfonatomethyl) aminium, and the like.
ホスホベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。 Specific examples of the phosphobetaine monomer include dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (3 -Phosphonatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-phosphonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (4-phosphonatobutyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (4- Phosphonatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (phosphonatomethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (phosphonatomethyl) aminium, and the like.
ホスホリルコリン構造を有する重合性不飽和モノマーの具体例としては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン等が挙げられる。これらの中では、入手性から２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが最も好ましい。 Specific examples of the polymerizable unsaturated monomer having a phosphorylcholine structure include 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxyethoxyethyl phosphorylcholine, 6- (meth) acryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10- (meta ) Acryloyloxyethoxynonyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxypropyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxybutyl phosphorylcholine and the like. Among these, 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine is most preferable from the viewpoint of availability.
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、先に挙げたアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するもの、ベタイン構造を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するもの以外でもよく、例えば２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシプロピル
（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネートおよびその塩、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸およびその塩等、各親水性基を側鎖に有するモノマーに由来するものでもよい。
The first repeating unit having a hydrophilic group in the side chain is derived from the above-described ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a betaine structure, or the like. For example, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate and its monosubstituted ester, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate and its monosubstituted ester, 2-hydroxybutyl (meth) acrylate and its Monosubstituted ester of hydroxyl group, glycerol mono (meth) acrylate, 2-methoxyethyl (meth) acrylate, 2-ethoxyethyl (meth) acrylate, 2- (meth) acryloyloxyethyl succinate and its salt, 2- (meth) Acryloyloxyethyl phthalate Beauty salts thereof, may each hydrophilic group derived from the monomer having a side chain.
前記側鎖の末端にアミノ基と反応する官能基を有する第２繰り返しユニットは、例えば
末端にアミノ基と反応する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。
The second repeating unit having a functional group that reacts with an amino group at the end of the side chain is preferably derived from, for example, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group that reacts with an amino group at the end.
また、第２繰り返しユニットのアミノ基と反応する官能基は、生理活性物質中に存在するアミノ基と反応する官能基が好ましい。特に低分子物質との結合反応を起こさせるためには、触媒等を必要としない自己反応型の官能基であることが好ましい。 The functional group that reacts with the amino group of the second repeating unit is preferably a functional group that reacts with the amino group present in the physiologically active substance. In particular, in order to cause a binding reaction with a low-molecular substance, a self-reactive functional group that does not require a catalyst or the like is preferable.
末端にアミノ基と反応する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（２）で示されるように、（メタ）アクリル基とアミノ基と反応する官能基が、アルキレン基または炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖を介して結合した化合物であることが好ましい。 As shown in the following formula (2), the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group that reacts with an amino group at the terminal has a functional group that reacts with a (meth) acryl group and an amino group as an alkylene group or carbon It is preferable that it is a compound couple | bonded through the chain | strand of the alkylene glycol residue Y of several 1-10.
（ 式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙはアルキレン基または炭素数１〜１０
のアルキレングリコール残基を示す。Ｗはアミノ基と反応する官能基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
(Wherein R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, Y represents an alkylene group or a carbon number of 1 to 10)
Represents an alkylene glycol residue. W represents a functional group that reacts with an amino group. q shows the integer of 1-100. When q is an integer of 2 or more and 100 or less, the repeated Ys may be the same or different. )
前記式（２）中のＹがアルキレン基である場合、ｑは１〜１００の整数であり、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、最も好ましくは１〜６である。ｑの値が大きくなりすぎると、タンパク質の非特異吸着が大きくなる。 When Y in the formula (2) is an alkylene group, q is an integer of 1 to 100, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 6. . If the value of q becomes too large, nonspecific adsorption of the protein increases.
前記式（２）中のＹがアルキレングリコール残基である場合、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
When Y in the formula (2) is an alkylene glycol residue, the alkylene glycol residue Y has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, more preferably 2 to 4 carbon atoms, Preferably it is 2-3, and most preferably. When the carbon number is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption.
Further, the repeating number q of the alkylene glycol residue Y is not particularly limited, but is preferably an integer of 1 to 100, more preferably an integer of 2 to 100, still more preferably 2 to 95. It is an integer, most preferably an integer of 4 to 90. When the repeat number q is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption.
式（２）中のＷは、アミノ基と反応する官能基であれば特に限定するものではないが、好ましくは触媒を必要としない、エポキシ基や、活性エステル基であることが好ましい。具体的には例えば、エポキシ基や、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、嵩が小さく官能基密度を高
くできる点でエポキシ基が最も好ましい。具体的なモノマーの例としては（メタ）アクリル酸グリシジルが挙げられる。
W in the formula (2) is not particularly limited as long as it is a functional group that reacts with an amino group, but is preferably an epoxy group or an active ester group that does not require a catalyst. Specific examples include an epoxy group, a p-nitrophenyl active ester group, an N-hydroxysuccinimide active ester group, a phthalimide active ester group, a 5-norbornene-2, and 3-dicarboximide active ester group. However, an epoxy group is most preferable because it is small in volume and can increase the functional group density. Specific examples of the monomer include glycidyl (meth) acrylate.
前記重合体の前述した第１繰り返しユニットと、第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）は、特に限定されないが、９７／３〜５／９５であることが好ましく、特に９０／１０〜１０／９０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、生理活性物質を固定化する効果、ひいては該生理活性物質と特異的に結合する生体物質の捕捉効果に優れる。 The copolymerization ratio (first repeating unit / second repeating unit) between the first repeating unit and the second repeating unit of the polymer is not particularly limited, but may be 97/3 to 5/95. Particularly preferred is 90/10 to 10/90. When the copolymerization ratio is within the above range, non-specific adsorption is particularly effectively suppressed, and the effect of immobilizing the physiologically active substance and, in turn, the effect of capturing a biological substance that specifically binds to the physiologically active substance is excellent. .
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。 The copolymerization ratio can be calculated, for example, by evaluating the elemental composition by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).
前記重合体は、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在するアミノ基と反応する官能基が分散するために、有効に作用することができる。
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、５０００〜１００００００であることが好ましく、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
The polymer is preferably a random copolymer including a first repeating unit and a second repeating unit. Thereby, since the functional group which reacts with the amino group which exists in the terminal of the side chain of a 2nd repeating unit disperse | distributes, it can act effectively.
Although the weight average molecular weight of the said polymer is not specifically limited, It is preferable that it is 5000-1 million, and it is especially preferable that it is 10000-100,000. When the weight average molecular weight is within the above range, handling during synthesis is good, and nonspecific adsorption can be effectively suppressed.
本発明の分析用担体では、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーが担体から脱離するのを防ぐことができる。 In the analytical carrier of the present invention, a polymer comprising the first repeating unit, the second repeating unit, and a unit having a silane coupling agent in the side chain is bound to the substrate via the silane coupling agent. May be. This can prevent the polymer from being detached from the carrier.
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジエトキシシラン、３−メルカプトプロピルジメチルメトキシシラン、３−メルカプトプロピルジメチルエトキシシラン、メルカプトエチルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。 As the unit having a silane coupling agent in the side chain, methacryloxypropyldimethylmethoxysilane, methacryloxypropyldimethylethoxysilane, methacryloxypropylmethyldimethoxysilane, methacryloxypropylmethyldiethoxysilane, methacryloxypropyltrimethoxysilane, Methacryloxypropyltriethoxysilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, 3-mercaptopropyltriethoxysilane, 3-mercaptopropylmethyldimethoxysilane, 3-mercaptopropylmethyldiethoxysilane, 3-mercaptopropyldimethylmethoxysilane, 3- Examples include those derived from mercaptopropyldimethylethoxysilane and mercaptoethyltriethoxysilane.
シランカップリング剤により、担体に結合した重合体を形成する具体的な方法としては、無機酸化物の場合は、表面に存在する水酸基との間のカップリング反応で容易に結合させることができる。 As a specific method for forming a polymer bonded to a carrier with a silane coupling agent, in the case of an inorganic oxide, it can be easily bonded by a coupling reaction with a hydroxyl group present on the surface.
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーが担体表面から脱離することを防ぐことができることから、分析用担体しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着抑制成分およびアミノ基と反応する官能基の低減が抑制され、化学的、物理的安定した分析用担体を提供することが可能となる。 By using the silane coupling agent, it is possible to prevent the polymer from detaching from the surface of the carrier. Therefore, in the use as an analytical carrier, the polymer is prevented from being dissolved in repeated heat treatments and washing steps. Furthermore, it is possible to provide a chemically and physically stable analytical carrier in which reduction of a non-specific adsorption inhibiting component and a functional group that reacts with an amino group, which occurs due to polymer desorption, is suppressed. Is possible.
また、アミノ基と反応する官能基の低減を防ぐことで、生理活性物質の固定化量を高く維持できることから、該生理活性物質が特異的に捕捉する物質（検出対象）の捕捉量が大きくなり、かつ、非特異吸着抑制成分の低減が抑制されていることから検出対象以外のタンパク質等に対する非特異吸着が少なくなり、Ｓ／Ｎ比の高い分析用担体を提供することが
できる。
In addition, since the amount of the physiologically active substance immobilized can be kept high by preventing the functional group that reacts with the amino group from being reduced, the amount of the substance (detection target) that the physiologically active substance specifically captures increases. And since the reduction | decrease of the nonspecific adsorption | suction suppression component is suppressed, the nonspecific adsorption | suction with respect to proteins other than a detection target etc. decreases, and the support | carrier for analysis with a high S / N ratio can be provided.
前記担体の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、アクリル系樹脂等の各種樹脂材料等が挙げられる。 The base material of the carrier is not particularly limited, and any organic material or inorganic material can be used. Examples of organic materials include porous agarose particles (trade name: Sepharose) and dextran particles (trade name: Sephadex) used as carriers for affinity chromatography, as well as polyacrylamide gel (trade name: Bio-Gel P, Biorad), polystyrene, ethylene-maleic anhydride copolymer, polymethyl methacrylate, polyolefin, polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polyamide, acrylic resin, and various resin materials.
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、アルミニウムおよびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が粒子自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。 Examples of the inorganic material include gold, silver, platinum, palladium, iridium, rhodium, osmium, iron, copper, cobalt, aluminum, and alloys and inorganic oxides thereof. Among these, inorganic oxides are preferable because the strength of the particles themselves is high. Among these, silicon oxide is most preferable because it is easy to handle.
担体の形状は粒子、基板、繊維、フィルター、膜、シートなど任意である。中でも粒子が表面に重合体が固定化しやすいため、好ましい。基板状の担体としてはは、例えばスライドガラス形状の平板状の基板や、マルチウェルプレート等を挙げることができる。 The shape of the carrier is arbitrary such as particles, substrates, fibers, filters, membranes, and sheets. Among these, particles are preferable because the polymer is easily fixed on the surface. Examples of the substrate-like carrier include a flat glass substrate having a slide glass shape, a multiwell plate, and the like.
粒子状の担体の場合、平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。 In the case of a particulate carrier, the average particle size is appropriately selected according to the purpose and application. In particular, in the case of an inorganic substance, the particle diameter can be easily controlled as compared with a method of producing organic particles by emulsion polymerization or suspension polymerization in which it is difficult to control the particle diameter.
具体的に、本発明の分析用担体に用いる粒子の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが好ましい。特には、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、最も１μｍ〜４０μｍが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。 Specifically, the particle diameter of the particles used for the analysis carrier of the present invention is preferably an average particle diameter of several nm to 100 μm, although it varies depending on the application. In particular, the thickness is preferably 100 nm to 50 μm, and most preferably 1 μm to 40 μm. When the average particle size of the substrate is within the above range, the balance between the amount of the physiologically active substance captured and the good handling is particularly excellent. Such an average particle diameter can be measured with a particle size distribution meter, for example.
（重合体固定担体の作製）
前記重合体固定担体の作製について述べる。本発明の担体の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、担体表面に、重合性官能基または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記側鎖に親水性基を有する重合性モノマーと、アミノ基と反応する官能基を有する重合性モノマーおよび該担体を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
(Production of polymer fixed carrier)
The production of the polymer fixed carrier will be described. The method for synthesizing the carrier of the present invention is not particularly limited, but for ease of synthesis, a silane coupling agent having a polymerizable functional group or a chain transfer group is immobilized on the surface of the carrier and the side chain is immobilized. It is preferable to radically polymerize a mixture containing a polymerizable monomer having a hydrophilic group, a polymerizable monomer having a functional group that reacts with an amino group, and the carrier in the presence of a polymerization initiator in a solvent.
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。 Any solvent may be used as long as each ethylenically unsaturated polymerizable monomer can be dissolved. Examples thereof include 2-butanone, methanol, ethanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, and chloroform. be able to. These solvents are used alone or in combination of two or more.
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル
などの有機過酸化物などを挙げることができる。
The polymerization initiator may be any ordinary radical initiator, such as 2,2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as “AIBN”), 1,1′-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile), and the like. Examples thereof include organic peroxides such as azo compounds, benzoyl peroxide, and lauryl peroxide.
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。 The chemical structure of the polymer compound of the present invention may be in any form such as random, block or graft.
（生理活性物質の固定化）
本発明において生理活性物質を担体上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。生理活性物質を溶解又は分散した液体のｐＨは５．０〜１１．０であることが好ましく、ｐＨ６．０〜１０がより好ましい。この範囲外だと、生理活性物質が変性・分解する恐れがある。
(Immobilization of physiologically active substances)
In the present invention, when a physiologically active substance is immobilized on a carrier, a method of attaching a liquid in which the physiologically active substance is dissolved or dispersed is preferable. The pH of the liquid in which the physiologically active substance is dissolved or dispersed is preferably 5.0 to 11.0, and more preferably pH 6.0 to 10. Outside this range, the physiologically active substance may be denatured or decomposed.
生理活性物質付着後は、アミノエタノール等のアミノ基を有する低分子物質で担体を処理し未反応のアミノ基と反応する官能基を失活させてしまうことが好ましい。
固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、目的物以外の別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。
After attaching the physiologically active substance, it is preferable to deactivate the functional group that reacts with the unreacted amino group by treating the carrier with a low molecular substance having an amino group such as aminoethanol.
Depending on the properties of the hydrophilic group on the surface of the solid phase, nonspecific adsorption of another substance other than the target substance on the solid phase surface can be suppressed by washing with water or a buffer containing a surfactant.
前記生理活性物質は、酵素、抗体、レクチン、レセプター、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、糖タンパク質等のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、核酸、糖、オリゴ糖、多糖、シアル酸誘導体、シアル化糖鎖等の糖鎖、脂質、低分子化合物、上述以外の高分子有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子から選ばれる少なくとも一つである。
The physiologically active substances include enzymes, antibodies, lectins, receptors, protein A, protein G, protein A / G, avidin, streptavidin, neutravidin, glutathione-S-transferase, glycoprotein and other proteins, peptides, amino acids, hormones , Nucleic acids, sugars, oligosaccharides, polysaccharides, sialic acid derivatives, sugar chains such as sialylated sugar chains, lipids, low molecular weight compounds, macromolecular organic substances other than those described above, inorganic substances, or fusions thereof, or viruses, Or it is at least one chosen from the molecule | numerator which comprises a cell.
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example and a comparative example, this invention is not limited to this.
＜実施例＞
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液５０ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
<Example>
After adding 13 g of methacryloxypropyldimethylmethoxysilane (SIM 6486.5 manufactured by Gelest Co.) to a mixed solution of 50 mL of acetic acid aqueous solution of pH 3.0 and 50 mL of ethanol, hydrolyzing the silane coupling agent, silica beads (average particle size) 10 μg of 5 μm, 70 μm pore size, SMB70-5 manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd. was added and stirred at 70 ° C. for 2 hours, and then silica beads were collected from the reaction solution by suction filtration and heated at 100 ° C. for 1 hour. Then, after dispersing with ethanol and shaking well, the supernatant was removed by centrifugation and dried.
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下ＭＰＣモノマーと記載、日本油脂株式会社製）、メタクリル酸グリシジル（以下ＧＭＡと記載、和光純薬工業製）を、エタノールとメチルエチルケトンの混合溶媒に溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．６ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＭＰＣモノマー、ＧＭＡの順に８０：２０、５０：５０、２０：８０である。そこにＡＩＢＮを０．０２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で２２時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。 2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (hereinafter referred to as MPC monomer, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) and glycidyl methacrylate (hereinafter referred to as GMA, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are dissolved in a mixed solvent of ethanol and methyl ethyl ketone, and a monomer mixed solution Was made. The total monomer concentration is 0.6 mol / L, and the respective molar ratios are 80:20, 50:50, and 20:80 in the order of MPC monomer and GMA. AIBN was added there so that it might become 0.02 mol / L, and it stirred until it became uniform. Thereafter, 10 g of silica beads treated with the above methacryloxypropyldimethylmethoxysilane were added and reacted at 70 ° C. for 22 hours in an argon gas atmosphere. Next, silica beads were collected from the reaction solution by centrifugation, dispersed in dimethyl sulfoxide, shaken well, and then collected by suction filtration and dried.
（１次抗体固定化）
得られた粒子２０ｍｇに対し、５０μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）のりん酸水素二カリウム溶液１ｍＬを加え、室温にて１晩転倒混和した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、グリシジル基の不活性化を行った。
(Primary antibody immobilization)
To 20 mg of the obtained particles, 1 mL of a dipotassium hydrogen phosphate solution of CRP antibody (manufactured by Abnova) adjusted to 50 μg / mL was added and mixed by inversion overnight at room temperature. Washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween20. Further, the glycidyl group was inactivated by treatment with 0.1 mol / L 2-aminoethanol (solvent: pH 9.5, 0.05 mol / L Tris-HCl buffer) at room temperature for 1 hour.
（ＣＲＰとの反応）
ＣＲＰ抗体を固定化した粒子５ｍｇに３μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰのＰＢＳ溶液１ｍＬを加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
(Reaction with CRP)
1 mL of CRP in PBS prepared at 3 μg / mL was added to 5 mg of particles having the CRP antibody immobilized thereon, and mixed by inverting at room temperature for 1 hour. The particles were collected by centrifugation and washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween20.
（２次抗体との反応）
ＣＲＰを反応させた粒子に、１μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）溶液を１ｍＬ加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
(Reaction with secondary antibody)
1 mL of HRP-labeled CRP antibody (Abnova) solution prepared to 1 μg / mL was added to the particles reacted with CRP, and mixed by inverting at room temperature for 1 hour. The particles were collected by centrifugation and washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween20.
（ＣＲＰ捕捉量の定量）
ＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体を反応させた粒子を、住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットを用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することによりＣＲＰの捕捉量を見積もった。
(Quantification of CRP capture amount)
The particles reacted with the HRP-labeled CRP antibody were colored using a peroxidase coloring kit manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and the amount of CRP captured was estimated by measuring the absorbance at 450 nm.
＜比較例＞
ＣＲＰ抗体を固定化せずに、２−アミノエタノールで不活性化のみを行った粒子に対し、実施例と同様のＣＲＰ捕捉量測定を行った。
<Comparative example>
The same amount of CRP trapped as in the Examples was measured on particles that were only inactivated with 2-aminoethanol without immobilizing the CRP antibody.
いずれの実施例においても、比較例よりも吸光度が大きく上昇しており、ＣＲＰ抗体を固定化したビーズがＣＲＰを捕捉できていることがわかる。
In any of the examples, the absorbance is greatly increased as compared with the comparative example, and it can be seen that the beads immobilized with the CRP antibody can capture the CRP.
本発明により生理活性物質を固定化することができる担体、特に反応触媒を必要とせず生理活性物質を固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した担体を簡便に作製し、提供することが可能となった。
According to the present invention, a carrier capable of immobilizing a physiologically active substance, particularly a carrier capable of immobilizing a physiologically active substance without requiring a reaction catalyst and suppressing nonspecific adsorption, is simply prepared and provided. Became possible.
Claims (22)
担体の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端に前記生理活性物質を固定化するアミノ基と反応する官能基としてエポキシ基を有する第２繰り返しユニットと
を有し、
前記第１繰り返しユニットが下記の一般式［１］で表される重合性モノマーに由来し、
前記第２繰り返しユニットが下記の一般式［２］ で表される重合性モノマーに由来し、
前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットとのモル比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が５０／５０〜５／９５であることを特徴とする分析用担体。 An analytical carrier having a function of capturing a physiologically active substance,
A polymer is immobilized on the surface of the carrier,
The polymer includes a first repeating unit having a hydrophilic group in a side chain;
Have a second repeating unit having an epoxy group as a functional group reactive to an amino group to immobilize the physiologically active substance at the end of the side chain,
The first repeating unit is derived from a polymerizable monomer represented by the following general formula [1],
The second repeating unit is derived from a polymerizable monomer represented by the following general formula [2]:
Wherein the molar ratio of the first repeating unit and the second repeating unit (first repeating unit / second repeat unit) is 50 / 50-5 / 95 der analytical carrier according to claim Rukoto.
前記重合体が、前記担体の表面に導入された重合性官能基または連鎖移動基と、前記一般式［１］で表される重合性モノマーと前記一般式［２］で表される重合性モノマーとを含む重合性成分と、の重合体である、請求項１記載の分析用担体。 A layer of the polymer is formed on the surface of the carrier;
Said polymer comprises a polymerizable functional group or chain transfer group is introduced on the surface of the carrier, the general formula [1] is Ru polymerizable monomer represented by the general formula [2] represented Ru polymerizable monomer The analytical carrier according to claim 1 , which is a polymer of a polymerizable component containing
前記重合性モノマーが、
下記の一般式［１］で表される第１繰り返しユニット用重合性モノマーと、
下記の一般式［２］ で表される第２繰り返しユニット重合性モノマーと、
を含み、
前記重合反応によって得られる重合体において、前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットとのモル比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が５０／５０〜５／９５である、分析用担体の製造方法。 17. The method for producing an analytical carrier according to any one of claims 1 to 16, wherein the polymerization reaction is carried out by mixing a polymerizable functional group or a carrier having a chain transfer group introduced therein and a polymerizable monomer in a solvent. Including a step of proceeding and a step of drying,
The polymerizable monomer is
A polymerizable monomer for a first repeating unit represented by the following general formula [1];
A second repeating unit polymerizable monomer represented by the following general formula [2]:
Including
Wherein the polymer obtained by the polymerization reaction, the molar ratio of the first repeating unit and the second repeating unit (first repeating unit / second repeat unit) is 50 / 50-5 / 95, analytical carrier Manufacturing method.
Minute析用carrier according to claim 14, lysate of a target biomolecule, blood, plasma, serum, cell lysate, target by contacting with at least one solution selected cell cultures, and tissues homogenate A method for using an analytical carrier, characterized in that a biological substance is collected.
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