JP6040595B2 - ハプテン標準液およびそれを含むハプテン定量試薬 - Google Patents

Description

本発明は、試料中に含まれるハプテンを定量する際用いるハプテン標準液、および前記標準液を含むハプテン定量試薬に関する。

抗原抗体反応を利用して特定のハプテンを測定する場合には、当該ハプテンを認識する抗体の特異性の高さが測定系の正確度を左右する。

通常、ハプテンに対して特異性の高い抗体を得るには、前記ハプテンの類似構造物質と交差反応性を示さない抗体を選択する。例えば、ハプテンがステロイドホルモンの場合は、試料（例えば血液、血清などの体液）中に存在する、ステロール骨格を有した物質やステロール骨格に類似した構造を有した物質等との交差反応を調査の上、前記物質に対する交差反応が極力低い抗体を選択する。ところが、ステロイドホルモンの場合、試料中に存在する当該ステロイドホルモンの類似構造物質の種類が多く、単一の特異性を有したモノクローナル抗体の技術をもってしても、当該ステロイドホルモンのみを認識する抗体を得るのは困難である。そのため一般的には、前記類似構造物質に対する交差反応率が５％以下であれば、当該ステロイドホルモンに対する抗体として良好な特異性を有する、とされている。しかしながら、前記良好な特異性を有した抗体であっても、前記類似構造物質の中には、当該ステロイドホルモンの１０倍以上の濃度で試料中に存在する物質があり、その場合は、前記抗体が有するわずかな交差反応により、ステロイドホルモンの定量値に大きく影響する可能性があった。また実際に抗原抗体反応を利用して試料（例えば血液、血清などの体液）中のハプテンを測定する場合、試料毎に交差反応の影響が異なるという問題もあった。

特開平１１−３５２１２６号公報

前述した問題を解決する方法として、測定対象物質であるハプテンと前記ハプテンと交差反応性を有する物質とを共存させた標準液を用いて、前記ハプテンを抗原抗体反応により測定する方法がある（特許文献１）。当該方法では、標準液を測定する際、測定対象物質（ハプテン）の濃度に応じた交差反応が生じるため、交差反応を加味した検量線を作成することができる。したがって、ハプテンを含む試料を測定した結果を、前記検量線にあてはめることで、試料中に含まれる交差反応性を示す物質（前記ハプテンの類似構造物質）による影響を抑制した形で定量値を得ることができる。しかしながら、ハプテンがステロイドホルモンの場合では、
（１）標準液に添加する前記ステロイドホルモンの類似構造物質が高額であり、
（２）類似構造物質の標準液への添加濃度がｐｇ／ｍＬオーダーからｎｇ／ｍＬオーダーと非常に低濃度であり、
（３）類似構造物質が内分泌かく乱物質（環境ホルモン）として作用する可能性があり、標準液の製造、使用または廃棄におけるリスクを否定できないため、
前記方法を容易に適用できなかった。

そこで本発明の目的は、試料中に含まれるハプテンを定量する際用いるハプテン標準液であって、ハプテン濃度が低濃度域であっても、前記ハプテンの類似構造物質による影響を受けることなく、ハプテン濃度を正確に定量可能な標準液を提供することにある。

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行なった結果、糖質を共存させた標準液を用いて検量線を作成し、それを用いて試料中のハプテン濃度を定量すると、試料中に含まれる前記ハプテンの類似構造物質による影響が抑えられ、結果として試料中のハプテン濃度を正確に定量できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明の第一の態様は、試料中に含まれるハプテンを定量する際用いる、前記ハプテンに糖類を共存させたハプテン標準液である。

また本発明の第二の態様は、ハプテンがステロイドホルモンである、前記第一の態様に記載の標準液である。

また本発明の第三の態様は、試料が血清試料であり、糖類が４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）のスクロースである、前記第二の態様に記載の標準液である。

さらに本発明の第四の態様は、ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンを含むハプテン測定試薬と、前記ハプテンに糖類を共存させた標準液とを含む、ハプテン定量試薬である。

さらに本発明の第五の態様は、
ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンを含むハプテン測定試薬を用いて、前記ハプテンに糖類を共存させたハプテン標準液を測定し、
前記標準液中のハプテン濃度に対する測定値から検量線を作成し、
前記ハプテン測定試薬を用いて試料を測定して得られた測定値から、前記検量線を用いて試料中の前記ハプテン量を定量する、
ハプテンの定量方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明におけるハプテンとは、通常競合法により測定する、低分子量の物質であれば特に限定はなく、一例として、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チロキシン（Ｔ４）、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ２）等の甲状腺ホルモンや、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）等のステロイドホルモンがあげられる。特にエストラジオール（Ｅ２）に代表されるステロイドホルモンが、本発明の試薬で測定するハプテンとして好ましい。

本発明のハプテン標準液は、一定濃度のハプテンに糖質を共存させることを特徴としている。当該標準液は少なくとも使用時に液体状態であればよく、使用前は液体状態であってもよいし、凍結乾燥状態であってもよい。本発明のハプテン標準液に共存させる糖質は、水溶性であれば特に制限がなく、一例として、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース等の二糖類、β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン等の多糖類、マンニトール、キシリトール、イノシトール、シクリトール等の糖アルコールがあげられる。なおハプテン測定に影響する、前記ハプテンと交差反応性を示す物質（前記ハプテンの類似構造物質）の種類およびその濃度は、測定対象試料によって異なる。そのため、本発明のハプテン標準液に共存させる糖質の種類およびその濃度は、測定対象試料に応じて適宜最適なものを選択するとよい。

本発明のハプテン標準液に共存させる糖類をスクリーニング（選択）する方法の一例を以下に示す。なお本発明のハプテン標準液に共存させる糖類の濃度をスクリーニングする際も、以下に示す方法と同様な方法で行なうことができる。
（１）各種濃度のハプテンに候補となる糖質を共存させた、ハプテン標準液を作製する。
（２）前記ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンとを含むハプテン測定試薬に、（１）で作製した標準液を添加し、競合法による測定を行なう。
（３）（２）の測定で得られた測定値（例えば、蛍光強度や発光強度）から、（１）で作製した標準液中のハプテン濃度に対する検量線をそれぞれ作成する。
（４）複数の測定対象試料（例えば血液、血清などの体液）について、（２）と同様の測定を行ない、（３）で作成した各検量線に基づき、試料中のハプテン濃度（定量値）をそれぞれ算出する。
（５）（４）で測定した試料と同じ試料を交差反応の影響がない測定方法（例えば、クロマトグラフ質量分析法）で測定して得られたハプテン濃度（定量値）と、（４）で算出した定量値とを比較し、両者の値がもっとも一致した糖質を、本発明のハプテン標準液に含ませる糖質として採用する。

なお、共存させる糖質の影響が強いと、ハプテン標準液を測定した時の応答が試料を測定した時の応答より低くなり、検量線から算出した、試料中のハプテン濃度（定量値）がマイナス値となるおそれがある。そのため糖質を本発明のハプテン標準液に共存させる際、前記定量値がマイナス値とならない糖類およびその濃度を検討する必要がある。具体的には、ハプテンがステロイドホルモンのひとつであるエストラジオール（Ｅ２）であり、測定対象試料が血清である場合の、本発明のハプテン標準液に共存させる糖質の好ましい例として、４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）のスクロースがあげられる。

本発明のハプテン標準液は、前記ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンとを含むハプテン測定試薬と組み合わせることで、試料中に含まれるハプテン濃度を、前記ハプテンと交差反応性を示す物質の影響を受けることなく正確に定量することができる。測定対象試料に特に限定はなく、一例として、血清、血漿、全血等の血液検体、尿、リンパ液、羊水、唾液、乳汁といった体液があげられる。前記ハプテン測定試薬に含まれる、ハプテンに標識させる物質は、当該物質の存否を検出器により検出可能な物質であればよく、一例として、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質があげられる。前記物質は前記ハプテンに直接標識してもよく、前記ハプテンと特異的に結合する物質（例えば抗ハプテン抗体）を利用して間接的に標識してもよい。

尚、本発明のハプテン標準液は、前記ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンとを含むハプテン測定試薬を用いた測定におけるコントロールとしても用いることができる。

本発明は試料中に含まれるハプテンを定量する際用いるハプテン標準液であって、糖類を共存させることを特徴としている。本発明のハプテン標準液を、ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンを含むハプテン測定試薬と組み合わせることで、前記ハプテンに対する交差反応性を示す物質（前記ハプテンの類似構造物質）を多く含む試料に対しても交差反応の影響を抑制することができ、結果として前記試料中の前記ハプテン濃度を正確に定量することができる。

エストラジオール標準液に共存させるスクロースの濃度を検討した結果を示す図である。 スクロースを５％（ｗ／ｖ）共存させた標準液、またはスクロースが共存しない標準液を用いてそれぞれ検量線を作成し、作成した各検量線から各試料中のエストラジオール濃度を定量した結果を示す図である。

以下、血清試料中に含まれるエストラジオール（Ｅ２）量の測定を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。

実施例１ 標準液に共存させる糖類濃度の検討
Ｅ２標準液に共存させる最適な糖類濃度を検討した。
（１）ステロイドホルモンを除去した血清（ＴＲＩＮＡ ＢＩＯＲＥＡＣＴＩＶＥ ＡＧ社製）に対して、スクロースを０％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）および７％（ｗ／ｖ）共存させたベース血清（Ｅ２未添加のＥ２標準液）をそれぞれ作製した。
（２）Ｅ２を認識する抗体を磁性ビーズに結合して得られた固相抗体に、Ｅ２誘導体にウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（オリエンタル酵母社製）を化学結合により標識して得られた酵素標識抗原と牛皮由来ペプタイド（ニッピ社製）とを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を添加後、凍結乾燥することで、Ｅ２測定試薬を作製した。
（３）（２）で作製したＥ２測定試薬および市販の全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−２０００、東ソー社製）を用いて、下記に示す方法で試料を測定した。測定試料としては、（１）で作製したベース血清または同位体希釈ガスクロマトグラフ質量分析法（ＩＤ−ＧＣ／ＭＳ法）によりＥ２濃度がゼロと値付けされたヒト血清試料（リファレンス検体）を用いた。
（３−１）（２）で作製したＥ２測定試薬に前記測定試料を添加し、３７℃で１０分間反応させた。
（３−２）Ｂ／Ｆ分離操作後、ＡＬＰの基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ）を添加した。
（３−３）ＡＬＰによって４ＭＵＰが分解されて生成する４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光強度から４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／秒）（ＦＵ）を算出した。

結果を表１および図１に示す。スクロースの共存量が増えるに従い、ＦＵ値は減少し、スクロースを４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）共存させた時にリファレンス検体のＦＵ値とほぼ同等（１００±２％以内）の値を示した。すなわち、Ｅ２標準液にスクロースを４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）共存させることで、血清試料中に含まれる、Ｅ２と交差反応性を示す物質（Ｅ２類似構造物質）の影響を反映させることができる。

実施例２ ヒト血清検体の測定
スクロースが共存しないＥ２標準液、またはスクロースを共存させたＥ２標準液で検量線を作成し、当該作成した検量線を基に、ヒト血清試料を測定した。
（１）（１）で作製した各ベース血清のうち、スクロースが共存しないベース血清（０％（ｗ／ｖ））、またはスクロースを５％（ｗ／ｖ）共存させたベース血清に対し、エタノールに溶解したＥ２をそれぞれ添加し、６点濃度のＥ２標準液をそれぞれ作製した。
（２）実施例１（３）に記載の方法により、Ｅ２標準液を測定し、ＦＵ値を算出した。ＦＵ値は試料中のＥ２濃度に比例するため、標準液中のＥ２濃度に対するＦＵ値をプロットすることで検量線を作成した。
（３）実施例１（３）に記載の方法により、ヒト血清試料３８試料（あらかじめ同位体希釈ガスクロマトグラフ質量分析計法（ＩＤ−ＧＣ／ＭＳ法）でＥ２濃度の値付けを行なった試料）を測定し、（２）で作成した検量線を用いて、各試料中に含まれるＥ２濃度を定量した。

結果を表２および図２に示す。糖類であるスクロースが共存しないＥ２標準液で検量線を作成した場合は、特にＥ２濃度の低いヒト血清試料において、ＩＤ−ＧＣ／ＭＳ法で値付けされたＥ２濃度との乖離が大きく、Ｅ２濃度が５０ｐｇ／ｍＬ以下のヒト血清検体では２倍以上高値となっていた。すなわち、スクロースが共存しないＥ２標準液で検量線を作成した場合は、特に低濃度域において、ヒト血清試料中に含まれる、Ｅ２と交差反応性を示す物質の影響を受けていることがわかる。一方、スクロースを５％（ｗ／ｖ）共存させたＥ２標準液で検量線を作成した場合は、Ｅ２濃度が５０ｐｇ／ｍＬ以下のヒト血清検体であっても、ＩＤ−ＧＣ／ＭＳ法で値付けされたＥ２濃度との乖離は最大でも３０％程度に抑えることができた。つまり、検量線を作成する際に使用するＥ２標準液に糖類であるスクロースを一定量共存させることで、試料（検体）中に含まれるＥ２と交差反応性を示す物質の影響を低減させることができ、結果として、前記物質の影響を受けやすい、低濃度のＥ２を含む試料であってもＥ２を正確に定量できることがわかる。

Claims (3)

1. ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンを含むハプテン測定試薬を用いて試料中に含まれるハプテンを定量する際用いる、検量線を作成するための、前記ハプテンに糖類を共存させたハプテン標準液であって、ハプテンがエストラジオールであり、糖類が４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）のスクロースである、前記標準液。
2. ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンを含むハプテン測定試薬と、前記ハプテンに糖類を共存させた標準液とを含む、ハプテン定量試薬であって、ハプテンがエストラジオールであり、糖類が４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）のスクロースである、前記定量試薬。
3. ハプテンを認識する抗体と標識した前記ハプテンを含むハプテン測定試薬を用いて、前記ハプテンに糖類を共存させたハプテン標準液を測定し、
   前記標準液中のハプテン濃度に対する測定値から検量線を作成し、
   前記ハプテン測定試薬を用いて試料を測定して得られた測定値から、前記検量線を用いて試料中の前記ハプテン量を定量する、
   ハプテンの定量方法であって、
   ハプテンがエストラジオールであり、糖類が４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）のスクロースである、前記定量方法。

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