JP6045369B2 - 一酸化窒素産生抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、一酸化窒素産生抑制剤に関する。

一酸化窒素は生体内の様々な細胞において産生され、血管弛緩、血小板凝集抑制作用、神経伝達物質、抗腫瘍、殺菌作用等の重要な役割を担っている。好中球、マクロファージ、平滑筋、肝細胞において、各種サイトカイン刺激によって誘導された一酸化窒素は、過剰に産生されると神経細胞を活性化し、神経伝達を経由し大脳の痛み認識領域を活性化する。これにより疼痛が発症する。また、過剰に産生された一酸化窒素は、血管細胞障害、心筋収縮力低下、自己免疫疾患などの原因でもある（非特許文献１および２）。従って、過剰な一酸化窒素の産生を抑制し、かつ長時間連続服用にも適した安全性の高い一酸化窒素産生抑制剤が求められていた。

ホップはビールの苦味、香り付けに用いられるなど、長く人々に摂取されている。また、ホップは民間薬としても用いられており、その効用としては鎮静効果、入眠・安眠効果、食欲増進、健胃作用、利尿作用などが知られている。さらに、近年ではホップエキスや、ホップ成分であるキサントフモールなどに一酸化窒素産生抑制効果があることが報告されている（非特許文献３）。

イソフムロンはホップエキスを異性化して得られる物質であり、ホップエキスには全く含まれていないか、含まれていてもごく微量である。イソフムロンには血圧降下剤、血管柔軟性改善剤の有効成分としての効果が報告されているが（特許文献１）、一酸化窒素産生抑制効果は知られていなかった。

特許文献２には、田七人参などのサポニン含有植物に加水分解処理を施してサポゲニン高含有組成物が得られることが記載されている。特許文献３にはチョウセンニンジン等のＰａｎａｘ種植物葉抽出物が運動能力もしくは疲労回復の改善、酸化反応予防効果を有することが記載されている。特許文献４には、三七根、熟地黄及び五加皮からなる混合生薬剤抽出物が、一酸化窒素生成抑制効果を有することが記載されている。

Ｊ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｍｅｄ．Ｓｃｈ．２００２：６９（１）ｐｐ．１３−１８ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７，１８６（３），３６５−３７３ Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００５，６８，４３−４９

国際公開第０４／０６４８１８号 国際公開第２０１０／０２９９１５号 特表２０１１−５１２４０４号公報 特表２００８−５２８４８３号公報

しかしながら、ホップエキスの一酸化窒素産生抑制効果は不十分であった。また、キサントフモールは疎水性が高いため製剤化の際に問題になる場合があった。さらに、田七人参酸処理物が一酸化窒素産生抑制効果を有することは知られていなかった。

本発明は、顕著な一酸化窒素産生抑制効果を示し、かつ、安全面で優れる一酸化窒素産生抑制剤を提供することを目的とする。

本発明は以下の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩および／または田七人参酸処理物を含有する一酸化窒素産生抑制剤。
〔２〕上記〔１〕に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する飲食品または医薬品。
〔３〕疼痛の予防または緩和効果を有する、上記〔２〕に記載の飲食品または医薬品。
〔４〕血管細胞障害、心筋収縮力低下または自己免疫疾患の緩和効果を有する、上記〔２〕に記載の飲食品または医薬品。

本発明によれば、一酸化窒素の産生を顕著に抑制し、かつ、安全面で優れる一酸化窒素産生抑制剤が提供される。本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、疼痛、血管細胞障害、心筋収縮力低下または自己免疫疾患の緩和剤として有用である。

図１は、イソフムロンの一酸化窒素産生抑制効果の濃度依存性を示す図である。 図２は、イソフムロンの疼痛緩和効果を示す図である。 図３は、田七人参酸処理物の一酸化窒素産生抑制効果の濃度依存性を示す図である。 図４は、イソフムロンおよび／または田七人参酸処理物の一酸化窒素産生抑制効果を示す図である。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩および／または田七人参酸処理物を有効成分として含有する。本発明は、イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する一酸化窒素産生抑制剤、田七人参酸処理物を有効成分として含有する一酸化窒素産生抑制剤、イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩および田七人参酸処理物を有効成分として含有する一酸化窒素産生抑制剤（一酸化窒素産生抑制組成物）を提供する。

イソフムロンはポリフェノール類の一種であり、イソα酸、３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテニル）−２−（３−メチル−１−オキソブチル）−４−（４−メチル−１−オキソ−３−ペンテニル）−２−シクロペンテン−１−オンとも呼ばれる。イソフムロンは以下の式で表される。

イソフムロンは、その構造中に含まれる１つ以上の水素が他の置換基に置換されている、いわゆる誘導体であってもよいが、イソフムロン自体であることが好ましい。イソフムロンは、その薬理学的に許容される塩であってもよい。

薬理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、またはパラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩；アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸塩が挙げられる。

イソフムロンまたはその薬理学的に許容される塩は例えばホップエキスを異性化することにより得ることができる。ホップエキスは、ヨーロッパ原産のアサ科に分類される多年生植物であるホップ（学名Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の全部または一部（好ましくは、毬果または毬果を含む部分）から溶媒による抽出法や超臨界二酸化炭素抽出法などにより抽出される。溶媒としては、例えば、水、アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコール）、酢酸エチルエステル等の低級アルキルエステル、エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどのグリコール類、アセトン、酢酸等の極性溶媒、ベンゼンやヘキサン等の炭化水素、エチルエーテルや石油エーテルなどのエーテル等が挙げられる。溶媒による抽出や超臨界二酸化炭素抽出を行った後は、必要に応じて、濾過処理、減圧等濃縮処理、精製処理などを行ってもよい。

イソフムロンまたはその薬理学的に許容される塩は、化学合成などにより人工的に合成されたものを用いてもよいし、市販品を用いてもよい。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤が有効成分としてイソフムロンまたはその薬理学的に許容される塩を含有する場合において、イソフムロンまたはその薬理学的に許容される塩の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に制限は無く、また適応される被投与生体の年齢、状態などの種々の要因により適宜変えることができる。目的の一酸化窒素産生抑制効果を得るために好ましい一酸化窒素産生抑制剤の投与量としては、イソフムロンの量として５０ｍｇ／ｄａｙ以上であることが好ましく、１００ｍｇ／ｄａｙ以上であることがより好ましい。また、添加量に見合う投与量、および食経験の観点からは、３００ｍｇ／ｄａｙ以下であることが好ましく、２００ｍｇ／ｄａｙ以下であることがより好ましい。イソフムロンまたはその薬理学的に許容される塩を含む一酸化窒素産生抑制剤の投与量は、イソフムロンの量として５０〜３００ｍｇ／ｄａｙであることがより好ましい。１００〜２００ｍｇ／ｄａｙ以下であることがより好ましい。

田七人参酸処理物は、田七人参を酸処理して得られる処理物である。

酸処理の対象である田七人参は、植物体を構成する一部分または全体であればよいが、根（根茎であってもよい）の一部を含んでいることが好ましい。用部は生のまま酸処理に供してもよく、その前に洗浄、乾燥、適当な大きさへの切断、破砕、裁断、粉砕等の前処理を行ってもよい。前処理を行うことにより、酸処理をより効率的に行うことが可能である。田七人参は市販品を利用してもよい。

酸処理とは、田七人参に酸を作用させる処理である。酸は強酸であることが好ましい。強酸としては例えば、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸等の無機酸が挙げられ、塩酸が好ましい。酸は酸水溶液であることが好ましく、強酸水溶液であることがより好ましい。酸水溶液における酸の濃度は、通常は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌであり、０．５ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。この範囲であることにより、酸処理を効率よく、かつ十分に進めることができる。田七人参に対する酸水溶液の使用量は、通常は２〜２０倍容量である。この範囲であることにより酸処理を効率よく、かつ十分に進めることができる。

酸処理は低級アルコールの存在下で行うことが好ましい。これにより田七人参と酸との親和性を向上させ、効率よく酸処理を進めることが可能となる。また、田七人参酸処理物の味及び取扱性を高めることができる点でも有利である。低級アルコールとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノールであり、安全性の点からより好ましくはエタノールである。酸処理液総量に対する低級アルコールの使用量は、１〜８０容量％であることが好ましく、１０〜５０容量％であることがより好ましく、２０〜４０容量％であることが更に好ましい。これにより、効率よく十分に酸処理を進めることができる。酸処理液総量とは、酸水溶液及び低級アルコールを含む全反応液量のことをいう。酸処理液総量は、田七人参酸処理物に対し、２〜２０倍容量であることが好ましい。これにより、効率よく十分に酸処理を進めることができる。酸処理の際には、適宜酸処理液を撹拌してもよい。

酸処理における処理温度は、６０〜１００℃が好ましく、７０〜９０℃がより好ましい。これにより、特殊な製造設備を要さずに効率よく十分に酸処理を進めることができる。酸処理の処理時間は、３０分〜２４時間が好ましく、２〜８時間がより好ましい。これにより反応が進みすぎることがなく効率よく十分に酸処理を進めることができる。

酸処理後には通常、中和、濾過、乾燥等の処理を行う。好ましくは中和、濾過及び乾燥をこの順に行う。中和、濾過及び乾燥はそれぞれ公知の手法により行うことができる。

中和は例えば、酸処理後の処理液に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基水溶液を適宜加えて行うことができる。中和後のｐＨは５〜８であることが好ましい。

濾過は例えば吸引濾過などにより行うことができる。濾過後の残渣を田七人参酸処理物として用いることができる。濾過は１回行ってもよいし、２回以上繰り返して行ってもよい。酸処理において低級アルコールを使用する場合は、濾過前の処理物に水を加えてもよい。これにより酸処理物中のサポゲニンを濾過後の残渣に残留させることができる。水の添加量は、添加後の処理物中の低級アルコール濃度が５０容量％以下となる量が好ましく、３０容量％以下となる量であることがより好ましく、１０容量％以下となる量が更に好ましい。

酸処理において低級アルコールを使用する場合には、濾過前に減圧濃縮による低級アルコールの留去を行ってもよい。これにより酸処理物中のサポゲニンを濾過後の残渣に残留させることができる。減圧濃縮の際の濃縮温度は７０℃以下が好ましく、４０℃〜５０℃がより好ましい。留去後の低級アルコール濃度は５０容量％以下であることが好ましく、３０容量％以下であることがより好ましく、１０容量％以下であることが更に好ましい。

減圧濃縮と濾過の際の加水とは、いずれかを行ってもよいし両方を行ってもよく、後者を行うことが好ましい。両方を行う場合には、減圧濃縮を先に行うことが好ましい。

乾燥は例えば、凍結乾燥、通風乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥などが挙げられ、好ましくは凍結乾燥である。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤の有効成分が田七人参酸処理物を含む場合の、田七人参酸処理物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に制限は無く、また適応される被投与生体の年齢、状態などの種々の要因により適宜変えることができる。目的の一酸化窒素産生抑制効果を得るために好ましい一酸化窒素産生抑制剤の投与量としては、田七人参酸処理物の量として１０ｍｇ／ｄａｙ以上であることが好ましく、２５ｍｇ／ｄａｙ以上であることがより好ましい。また、添加量に見合う投与量、および食経験の観点からは、５０００ｍｇ／ｄａｙ以下であることが好ましい。田七人参酸処理物を有効成分として含む一酸化窒素産生抑制剤の投与量は、田七人参酸処理物の量として１０〜５０００ｍｇ／ｄａｙであることがより好ましい。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤の有効成分は、イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩および／または田七人参酸処理物であり、好ましくはイソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩単独、または、イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩と田七人参酸処理物との組み合わせである。有効成分がイソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩と田七人参酸処理物との組み合わせである場合、田七人参酸処理物に対するイソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩の質量比が０．０２〜１０であることが好ましく、０．２〜１．０であることがより好ましい。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、そのままの形態で、最終製品（例えば、飲食物、医薬品、医薬部外品など）として用いることもできる。また、飲食品用の添加剤、医薬用の添加剤、医薬部外品用の添加剤として用いることができる。これにより、飲食品、医薬品、医薬部外品に、一酸化窒素産生抑制効果を付与することができる。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩および／または田七人参酸処理物を有効成分としていればよく、上記以外の成分であってかつグルコサミン以外の成分薬理学的に許容される基剤をさらに有して組成物の形態であってもよい。薬理学的に許容される基剤の一例としては、主に貯蔵および流通における安定性を確保する成分（例えば保存安定剤など）が挙げられる。その他、目的の最終製品（例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品など）を構成する諸成分から選ばれる１または２以上の種類の成分（好ましくは１〜３種類程度、より好ましくは１種類程度）を含有していてもよい。

薬理学的に許容される基剤は、本発明の目的を損なわない限り、特に限定されない。例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、発色剤、矯味剤、着香剤、酸化防止剤、防腐剤、呈味剤、酸味剤、甘味剤、強化剤、ビタミン剤、膨張剤、増粘剤、界面活性剤などの中から、製剤に必要な諸特性（例えば、製剤安定性）を損なわないものであって、最終製品（例えば、医薬品、医薬部外品、飲食品）の剤形に応じたものを１種または２種以上選択することができる。また、薬理学的に許容される基剤は、一酸化窒素産生抑制効果を有する他の成分であってもよい。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤の投与形態は特に限定されない。例えば、経口投与（例えば、口腔内投与、舌下投与など）、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与など）などが挙げられる。これらの中でも侵襲性の少ない投与形態が好ましく、経口投与であることがより好ましい。本発明の一酸化窒素産生抑制剤を飲食品として用いる場合には、経口投与されることが好ましい。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤の剤形は、飲食品、医薬品および医薬部外品のいずれとするかによって適宜決定することができ、特に限定されない。経口投与される際の剤形の例としては、液状（液剤）、シロップ状（シロップ剤）、錠剤（錠剤）、カプセル状（カプセル剤）、粉末状（顆粒、細粒）、ソフトカプセル状（ソフトカプセル剤）、液状（液剤）、シロップ状（シロップ剤）、固形状、半液体状、クリーム状、ペースト状が挙げられる。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤の投与時期は特に限定されないが、通常は一酸化窒素が発生する間に投与され、一酸化窒素の発生初期に投与されることが好ましい。

本発明の一酸化窒素発生抑制剤は、生体内で一酸化窒素の産生を抑制する。これにより、一酸化窒素がもたらす弊害、例えば、疼痛、血管細胞障害、心筋収縮力低下、自己免疫疾患などを緩和できるので、これらの緩和用の飲食品もしくは医薬品として利用できる。中でもイソフムロン、その薬理学的に許容される塩および田七人参酸処理物は鎮痛効果に優れており、疼痛の予防または緩和用の飲食品もしくは医薬品として有用である。疼痛は急性疼痛と慢性疼痛に分類され、本発明はこれらのいずれにも効果があるが、急性疼痛を対象とすることが好ましい。

疼痛、血管細胞障害、心筋収縮力低下または自己免疫疾患の緩和のために用いる場合の、飲食品または医薬品の投与時期は特に限定されないが、通常は症状が出現した際に投与され、症状出現初期に投与されることが好ましい。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤の摂取対象者は特に限定されないが、例えば、炎症、外傷などにより痛みを感じている対象者、血管細胞障害、心筋収縮力低下、自己免疫疾患により不調を感じている対象者に適している。また、特段の問題のない対象者であっても、一酸化窒素産生抑制を目的として日常的に摂取することができる。

本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、各種飲食品として利用することができる。例えば、飲料（清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、粉末飲料、果実飲料、乳飲料、ゼリー飲料など）、菓子類（クッキー、ケーキ、ガム、キャンディー、タブレット、グミ、饅頭、羊羹、プリン、ゼリー、アイスクリーム、シャーベットなど）、水産加工品（かまぼこ、ちくわ、はんぺんなど）、畜産加工品（ハンバーグ、ハム、ソーセージ、ウィンナー、チーズ、バター、ヨーグルト、生クリーム、チーズ、マーガリン、発酵乳など）、スープ（粉末状スープ、液状スープなど）、主食類（ご飯類、麺（乾麺、生麺）、パン、シリアルなど）、調味料（マヨネーズ、ショートニング、ドレッシング、ソース、たれ、しょうゆなど）が挙げられる。更に、本発明の一酸化窒素産生抑制剤は、健康食品、機能性食品、栄養補助食品（サプリメント）、特定保健用食品、医療用食品、病者用食品、乳児用食品、介護用食品、高齢者用食品等の飲食品として利用することもできる。

本発明において一酸化窒素産生抑制効果は、インターロイキン−１βなどのサイトカインにより刺激された肝実質細胞にサンプルを添加して、サンプルを添加しない場合と比較して一酸化窒素産生量が減少していることにより確認できる。

本発明において疼痛緩和効果（鎮痛効果）は、マウスに疼痛誘発処理を施し、このマウスに対し、末梢神経活動を電気的に測定することにより確認できる。

実施例１〜４および比較例１〜５（一酸化窒素産生抑制試験）
１．肝実質細胞の準備
５−７週齢のＷｉｓｔａｒ雄性ラットをソムノペンチル麻酔下で開腹し、３７℃に保温したＨＥＰＥＳ溶液を門脈より灌流して肝臓を脱血した。前記灌流液を、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ液に変え、さらに１０分間灌流した。この肝臓を濾過して得られた肝実質細胞を実験に供した。

前記肝実質細胞を、１０％牛胎児血清を含むウイリアムズ培地Ｅに懸濁し、６穴平底マイクロプレートに１×１０⁶細胞／２ｍＬ／ｗｅｌｌの割合で細胞を播種した後、５％の二酸化炭素存在下、３７℃において２４時間培養した。なお、培地は培養２時間目と６時間目に交換した。２４時間培養後に培養液を、１０ｎＭ インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）と試験薬物とを含むウイリアムズ培地Ｅに替え、８時間インキュベートした。

試験薬物としては１５μＭ イソフムロン（実施例１）、３０μＭ イソフムロン（実施例２）、６０μＭ イソフムロン（実施例３）、１００μＭ イソフムロン（実施例４）、ホップエキス〔１５μＭ イソフムロンに相当〕（比較例１）、ホップエキス〔３０μＭ イソフムロンに相当〕（比較例２）、ホップエキス〔６０μＭ イソフムロンに相当〕（比較例３）、ホップエキス〔１００μＭ イソフムロンに相当〕（比較例４）を用いた。イソフムロンはＨｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製を、ホップエキスは丸善製薬社製をそれぞれ用いた。なお、各ホップエキスの後に〔〕内に示した濃度は、各ホップエキスの水分蒸発後の残留物が全てイソフムロンに異性化したと仮定した場合のイソフムロンの濃度（μＭ）である（残留物をイソフムロンの分子量で割りモル数を算出して濃度に換算した）。また、試験薬物を添加しなかったほかは実施例１などと同様に行った（比較例５）。

２．一酸化窒素産生量の測定
各培養液を１５０μＬ採取し、グリース試薬１５０μＬと９６ｗｅｌｌプレート上で混合し、５分間放置した後、吸光度（５４０ｎｍ）を測定した。各測定値の、比較例５の測定値を１００％とした時の割合を一酸化窒素産生量（％）とした。実施例１〜４および比較例１〜４の一酸化窒素産生量を作用濃度の順に、濃度依存性として図１に示した。

図１から明らかな通り、ホップエキスと比較してイソフムロンは高い一酸化窒素産生抑制効果を示し、イソフムロンの濃度が高いほど、より顕著な一酸化窒素産生抑制効果が示された。

これらの結果は、イソフムロンが顕著な一酸化窒素産生抑制効果を発揮すること、および、一酸化窒素の過剰産生に伴う症状、例えば疼痛、血管細胞障害、心筋収縮力低下、自己免疫疾患の緩和剤として有用であることを示している。

実施例５および比較例６〜９（疼痛緩和効果）
１．疼痛誘発マウスの作製
毛刈処理を施したマウス（ＩＣＲ、オス、６〜８週齢、日本ＳＬＣ）の背部皮膚に起炎物質を皮内投与することにより、疼痛を起こし、持続的な神経発火状態を形成させた。起炎物質としては、酵母を生理食塩水に懸濁した３０質量％酵母懸濁液を用い、これを正中線に沿って５０μＬ×２〜５箇所投与した。

２．痛みの評価
酵母投与１日後に、末梢神経活動（電気生理学）測定を行い、その装置としては白金双極電極（ユニークメディカル、ＴＦ２０１−００５）、細胞外記録用増幅器（ＷＰＩ、ＤＡＭ８０）、オシロスコープ（Ｔｅｋｒｏｎｉｘ、ＴＤＳ２００２）、データ記録解析システム（ＣＥＤ、ＭＩＣＯ１４０１ｍｋＩＩ）を用いた。測定手順は、ソムノペンチルで麻酔をしたマウスの背部皮膚を切開し、計測中に動かないよう四肢を粘着テープで作業台に固定した上、Ｃ線維を含む神経束１本を傷つけぬようにピンセットで拾い上げ双極電極に乗せた。５０μＶ程度の微小活動電位は、前置増幅器を介し細胞外記録法により導出した。用いたフィルター条件はｈｉｇｈ ｃｕｔ（１ｋＨｚ）およびｌｏｗ ｃｕｔ（１５０Ｈｚ）とし、一定閾値以上の活動電位の発生数を計測し発火頻度を調べた。試験薬物は、マウスを装置に固定し活動電位を測定しながら、尾静脈から投与し、薬剤投与後４５分後から３分間の神経発火回数を求めた。

試験薬物は、生理食塩水に溶解または希釈して、１ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、マウス１ｋｇあたり４ｍＬを投与した。なお、これは２５ｇのマウスであれば０．１ｍＬの試験薬物を投与することを意味する。実施例５ではマウス１ｋｇあたり４ｍｇ イソフムロンを投与、比較例６ではマウス１ｋｇあたり４ｍｇ ホップエキスを投与した。なお、ホップエキスは水分蒸発後の残留物がマウス１ｋｇあたり４ｍｇになるように調製した。比較例７（生理食塩水）は、実施例５の試験薬物を、試験薬物を含まない生理食塩水に変えた以外は実施例５と同様に行った。また、比較例８では、起炎物質は投与したが、試験薬物は投与しなかった。更に、比較例９では、起炎物質および試験薬物を投与せずコントロール（無処置）とした。実施例及び比較例は、それぞれマウス５匹を用いて実施した。なお、イソフムロンは、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製を、ホップエキスは丸善製薬株式会社製をそれぞれ用いた。

実施例５および比較例６〜９の、比較例８を１００％とした場合の神経発火回数の相対値（％）を、図２に示した。

図２に示す通り、比較例６の神経発火回数は比較例７および８とほぼ同じであったが、実施例５の神経発火回数は比較例８の半分以下と顕著に低かった。この結果は、イソフムロンが高い鎮痛抑制効果を示し、疼痛の予防または緩和剤として有用であることを示すものである。

実施例６〜１３及び比較例１０（一酸化窒素産生抑制試験）
１．細胞の調製
５−８週齢のＷｉｓｔａｒ雄性ラットをソムノペンチル麻酔下で開腹し、３７℃に保温したＨＥＰＥＳ溶液を５分間灌流して肝臓を脱血した。前記灌流液を、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ液に変え、さらに１０分間灌流した。この肝臓を濾過して得られた肝実質細胞を実験に供した。

前記肝実質細胞を、１０％牛胎児血清を含むウイリアムズ培地Ｅに懸濁し、６穴平底マイクロプレートに１×１０⁶細胞／２ｍＬ／ｄｉｓｈの割合で細胞を播種した後、５％の二酸化炭素存在下、３７℃において２４時間培養した。なお、培地は培養２時間目と６時間目に交換した。

２．一酸化窒素産生量の測定
２４時間培養後に培養液を、１０ｎＭ ＩＬ−１βと試験薬物を含むウイリアムズ培地Ｅに替え、８時間インキュベートした。培養液を１５０μＬ採取し、グリース試薬１５０μＬと９６ｗｅｌｌプレート上で混合し、５分間放置した後、吸光度（５４０ｎｍ）を測定し、一酸化窒素産生量を求めた。

試験薬物としては２７ｐｐｍ 田七人参酸処理物（実施例６）、９０ｐｐｍ 田七人参酸処理物（実施例７）、３００ｐｐｍ 田七人参酸処理物（実施例８）、３０ｐｐｍ 田七人参酸処理物（実施例９）、１５ｐｐｍ 田七人参酸処理物（実施例１０）、５ｐｐｍ イソフムロン（実施例１１）、１５ｐｐｍ 田七人参酸処理物と５ｐｐｍ イソフムロンの組み合わせ（実施例１２）、１５ｐｐｍ 田七人参酸処理物と５ｐｐｍ ホップエキスの組み合わせ（実施例１３）をそれぞれ用いた。また、試験薬物を添加しなかったほかは実施例１などと同様に行った（比較例１０）。イソフムロンはＨｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製を、ホップエキスは丸善製薬社製をそれぞれ用いた。

田七人参酸処理物の調製は以下の通りとした。田七人参粉末（松浦薬業株式会社製）１ｋｇを、５．９質量％塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ塩酸）と２５質量％エタノールを含む水溶液１０Ｌに懸濁し、ゆっくりと攪拌しながら８０℃で６時間反応させた。次いで、氷上で冷却後、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加えｐＨ７．０に調整した。前記ｐＨ調整後の溶液を蒸留水で１０倍希釈し、吸引ろ過し、ろ液と残渣にろ別した。得られた残渣を凍結乾燥し、１８０ｇの田七人参酸処理物を得た。

各測定値の、比較例１０の測定値を１００％とした時の相対値を一酸化窒素産生量（％）とした。一酸化窒素産生量に対する田七人参酸処理物の濃度依存性を図３に、各実施例のサンプルの一酸化窒素産生量を図４に、それぞれ示した。

図３から明らかな通り、田七人参酸処理物は高い一酸化窒素産生抑制効果を示し、田七人参酸処理物の濃度が高いほど、より顕著な一酸化窒素産生抑制効果が示された。これは限定されるものではないが、肝実質細胞の疾患、例えば肝炎、肝硬変に有効な事を示すものである。

図４から明らかなように、実施例７〜１３の一酸化窒素産生量は、比較例１０の一酸化窒素産生量よりも高かった。この結果は、田七人参酸処理物および／またはイソフムロンが優れた一酸化窒素産生抑制効果を有することを示している。

実施例１２の一酸化窒素産生量は、実施例１０及び１１と比較して顕著に低かった。この結果は、田七人参酸処理物とイソフムロンを組み合わせることにより、それぞれの単独の効果からは予想外の相乗効果が得られることを示している。

実施例１３の一酸化窒素産生量は、実施例１０と比較して差はなかった。この結果は、ホップエキスは実施例１２のイソフムロンとは異なり田七人参酸処理物による一酸化窒素産生抑制効果を高める作用がないことを示している。

Claims (4)

1. イソフムロンもしくはその薬理学的に許容される塩および田七人参酸処理物を含有する一酸化窒素産生抑制剤。
2. 請求項１に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する一酸化窒素産生抑制のための飲食品または医薬品。
3. 請求項１に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する疼痛の予防または緩和効果のための飲食品または医薬品。
4. 請求項１に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する血管細胞障害、心筋収縮力低下または自己免疫疾患の緩和効果のための飲食品または医薬品。

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