JP6073585B2 - １，５−ｄ−アンヒドログルシトールの製造法 - Google Patents

Description

本発明は、１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの微生物による製造法に関する。

１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール（以下１，５−ＡＧ）は、グルコースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールであり、多くの動植物が生合成することから、食品中にも広く分布している物質である。１，５−ＡＧは動物体内で代謝的に安定であり、ラットやマウスでは１，５−ＡＧとして与えた放射性のうち、その後の４８時間の呼気に排出される量は全体の１％以下である（非特許文献１参照）との報告があり、低カロリーあるいはノンカロリー甘味料として利用できる。更に 産業上、研究試薬や臨床検査試薬として利用されている。
１，５−ＡＧの調製法としてはβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートからの化学合成法（非特許文献２参照）が報告されている。その合成法はβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートをエーテルに溶解後、臭化水素によるＢｒ化、水素化アルミニウムリチウムによる脱アセチル化することにより行われる。

その他の調製法としてプロテア種の葉から１，５−ＡＧをエタノール、ヘキサン等の有機溶媒で１．５−ＡＧの抽出、単離、晶析して１，５−ＡＧを調製する方法も報告されている（非特許文献３参照）。
これらの化学合成や植物からの抽出は、プロセスが多段的で煩雑であり、エーテルやヘキサン等の有機溶媒を用いている為、１，５−ＡＧを食品とするには、それらの分離、処理の必要性が生じる。更には安全性の点からも疑問が残る。
これらの問題点を解決する手段として、製造プロセスが簡略で、かつエーテル等の有機溶媒を用いない製造法が求められる。

１，５−ＡＧは大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ ）により生合成されること（非特許文献１参照）が報告されている。しかし、大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ ）による生合成は工業生産を目的としておらず、１，５−ＡＧ生成量は１Ｌあたり数マイクログラム程度であり、工業生産的に満足できるものではない。
更に、パラディウム触媒存在下での１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下１，５−ＡＦ）への水素添加による１，５−ＡＧの調製法が報告されているが（非特許文献４参照）１，５−ＡＧの他に１，５−ＡＭが生じ、反応生成物の１／５程度であり効率的に獲得することが困難である。

１，５−ＡＧの原料となり得る１，５−ＡＦは澱粉などのα−１，４−グルカンをα−１，４−グルカンリアーゼで分解することによって調整できる糖質であり、その生産技術が提案されている（特許文献１参照）。１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに効率よく変換する方法の開発が望まれているが、近年、１，５−ＡＧの工業的な生産方法として１，５−ＡＦを微生物に接触させて製造する方法が提案されている（特許文献２参照）。この製法では外因性の１，５−ＡＦが微生物によって１，５−ＡＧに変換される。しかしながら、上記方法は１，５−ＡＧの生産量が低く工業的に必ずしも満足のいくものではなかった。また、培養終了後の培養液には１，５−ＡＧ以外の生成物あるいは未反応の原料が含まれるため、高い純度の１，５−ＡＧを生産するには分離工程が必要であり（特許文献２参照）、その工程で１，５−ＡＧの回収率が低下する。また、１，５−ＡＧを高純度、高回収率で分離回収できる方法（特許文献３参照）が提案されているが、分離工程で１，５−ＡＧ液が希釈されるため、分離工程前後に濃縮作業が必要であり、工業レベルで生産するためには１，５−ＡＧ製造プロセスの簡便化が求められる。

特開２００５−１６８４５４号公報 特開２００８−５４５３１号公報 特開２０１２−７９０７号公報 特開２００９−２１５２３１号公報

生化学 第６９巻 第１２号，ｐｐ．１３６１−１３７２，（１９９７） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２，４５４７−４５５３（１９５４） Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ９，１９５９−１９６０ （１９８３） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７（２００２）８７３−８９０

本発明はこのような従来の問題点を解決して、１，５−ＡＦを出発物質とし１，５−ＡＧへの高い変換能を有する微生物を用いて１，５−ＡＧを製造する方法を提供することにある。

鋭意検討した結果、本発明者らは１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する高い能力を持つゲオトリクム・キャンディダム種の菌株を見出し、この菌株にかつグルコース以外の炭水化物を使用することにより、菌株によっては１，５−ＡＦを高い生産性でほぼ全量１，５−ＡＧへ変換することができることを究明し本発明に到達した。
すなわち、本発明は１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する高い能力を持つゲオトリクム・キャンディダム種の菌株をグルコース以外の炭水化物を含む培地中で接触させ、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換せしめ、生じた１，５−ＡＧを採取することを特徴とする１，５−ＡＧの製造法である。

本発明によれば、ゲオトリクム・キャンディダム種の菌株を用いることにより１，５−ＡＧ生産性が向上し、更にグルコース以外の炭水化物を用いることにより１，５−ＡＦをほぼ１，５−ＡＧに変換することができるため、発酵終了後の培養液中には１，５−ＡＧ以外の物質が殆ど存在しないようにすることができる。これにより、１，５−ＡＧの生産性が向上しただけではなく、製造プロセスの分離工程が必要なくなるため、簡便な方法で１，５−ＡＧを製造することができ、コスト低減にもつながることから、１，５−ＡＧを工業的に有利に製造することができる。更に、１，５−ＡＧの収率が高いため、１，５−ＡＧ生産量あたりに排出される排水量を減らすことができエコロジー効果も期待できる。

１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する高い能力を持つゲオトリクム・キャンディダム種の菌株としては、具体的にはＮＢＲＣ５７６７、ＮＢＲＣ４６０１、ＮＢＲＣ５９５９およびＮＢＲＣ９５４２などが挙げられる。これら菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ から入手可能である。但し、本発明に用いられるゲオトリクム・キャンディダム種の菌株は、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を有するゲオトリクム・キャンディダム種の菌株であれば全てが使用可能であり、上記菌株に限定されるものではない。

本発明のゲオトリクム・キャンディダム種の菌株は、前記の菌株より紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株などいずれの株であっても良い。
微生物培養のための１，５−ＡＦを含む培養液は、グルコース以外の炭水化物、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。グルコース以外の炭水化物としては、例えばフルクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、マンノースなどが挙げられる。フルクトースが特に好ましい。有機栄養源としては、例えばビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物などが適宜使用される。無機イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、リン酸イオン、カルシウムイオンなどが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５−ＡＦ水溶液を添加して１，５−ＡＧ採取用の培地とした。

培養条件は特別な制限もなく、例えば好気条件下でｐＨ３〜７及び温度２０〜４０℃の範囲で行い、適当なｐＨと温度を保ちながら２〜７日程度培養を行うことができる。
このようにして培養液中に生成した１，５−ＡＧを通常実施される周知の手段で培養物より精製する。具体的には、遠心分離、珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮後、結晶化させた。結晶化の方法としては、例えば、１，５−ＡＧの水溶液から結晶１，５−ＡＧを析出させる方法（特許文献４（特開２００９−２１５２３１５号公報））等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
このようにして培養液中に生成した１，５−ＡＧを分離工程を介さずに通常実施される周知の手段で精製し、採取する。具体的には、遠心分離、珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮する。濃縮後、結晶化させた。

なお、培養液中の１，５−ＡＧ生成量はＨＰＬＣで速やかに測定することができ、１，５−ＡＧ生成量が最高に達した時点で培養を終了した。ＨＰＬＣ測定の詳細条件は以下に示す。
分離カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＰ８１０−ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓ連結（昭和電工（株）製、三菱化学（株）製）、移動相：蒸留水、流速：１．０ ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、検出：示差屈折率検出器、サンプル供与量：２０ μＬの条件で測定した。

以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ／ｖ）％である。１，５−ＡＧの生産量は上記のＨＰＬＣ測定により検出された１，５−ＡＧのピーク面積を、あらかじめ作成した標準試料の検量線から求めた。また、１，５−ＡＧへの変換率は培地中に添加した１，５−ＡＦが１，５−ＡＧに変換された割合を示す。なお、実施例１〜３は参考例である。

実施例１（各酵母の１，５−ＡＧ生産性の比較）
グルコース２．０％、ペプトン２．０％および酵母エキス１．０％からなる培地（ｐＨ ６．０）、５０ｍｌを容量３００ｍｌの振盪フラスコに分注し、それに斜面培地（グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％、寒天粉末１．５％、ｐＨ ６．０）で培養した特許文献１（特開２００５−１６８４５４号公報）に記載されている酵母の中で最も１，５−ＡＧ生産性の高いシゾサッカロマイセス・ポンベ（ＮＢＲＣ １６０８）とゲオトリクム・キャンディダム（ＮＢＲＣ５７６７）をそれぞれ１白金耳接触し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。前記と同組成培地５０ｍｌを振盪フラスコに分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ溶液を１％となるように添加した。この培地に前記種培養液をそれぞれ１ｍｌずつ添加し、３０℃で３日間、１３０ｒｐｍで振盪培養した。遠心分離で菌体を除去した後、ＨＰＬＣにて培養液中に生成した１，５−ＡＧを定量した。その結果は表１に示した。１，５−ＡＧの生産量はＮＢＲＣ ５７６７がＮＢＲＣ １６０８より約１．６倍高かった。

実施例２（各ゲオトリクム属の１，５−ＡＧ生産性の比較）
グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％からなる培地（ｐＨ ６．０）５０ｍｌを容量３００ｍｌの振盪フラスコに分注し、斜面培地（グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％、寒天粉末１．５％、ｐＨ ６．０）で培養した表２に示す菌株をそれぞれ１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。前記と同組成培地５０ｍｌを振盪フラスコに分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ溶液を１％となるように添加した。この培地に前記種培養液を１ｍｌ添加し、３０℃で２日間、１３０ｒｐｍで振盪培養した。遠心分離で菌体を除去した後、ＨＰＬＣにて培養液中に生成した１，５−ＡＧを定量した。その結果を表２に示した。これよりゲオトリクム属の中で１，５−ＡＧ生産性が高い種はキャンディダム種であった。

実施例３（各ゲオトリクム・キャンディダムの１，５−ＡＧ生産性の比較）
グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％からなる培地（ｐＨ ６．０）５０ｍｌを容量３００ｍｌの振盪フラスコに分注し、斜面培地（グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％、寒天粉末１．５％、ｐＨ ６．０）で培養した表３に示す菌株をそれぞれ１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。前記と同組成培地５０ｍｌを振盪フラスコに分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ溶液を６％となるように添加した。この培地に前記種培養液を１ｍｌ添加し、３０℃で３日間、１３０ｒｐｍで振盪培養した。遠心分離で菌体を除去した後、ＨＰＬＣにて培養液中に生成した１，５−ＡＧを定量した。その結果を表３に示した。用いたゲオトリクム・キャンディダムの中で１，５−ＡＧ生産性が最も高い株はＮＢＲＣ ５７６７であった。

実施例４（炭水化物の種類による１，５−ＡＧ生産性比較）
グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％からなる培地（ｐＨ ６．０）５０ｍｌを容量３００ｍｌの振盪フラスコに分注し、斜面培地（グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％、寒天粉末１．５％、ｐＨ ６．０）で培養したゲオトリクム・キャンディダム（ＮＢＲＣ ５７６７）を１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。前記と同組成培地５ｍｌを試験管に分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ溶液を４％となるように、同様に除菌処理した表４に示す炭水化物を１％になるように添加した。この培地に前記種培養液を０．１ｍｌ添加し、３０℃で３日間、１３０ｒｐｍで振盪培養した。遠心分離で菌体を除去した後、ＨＰＬＣにて培養液中に生成した１，５−ＡＧを定量した。その結果を表４に示した。用いたグルコース以外の炭水化物で１，５−ＡＧの生産性が向上し、その中で最も生産性の高い炭水化物はフルクトースであった。

実施例５（炭水化物の濃度と１，５−ＡＧ生産性の関係）
グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％からなる培地（ｐＨ ６．０）５０ｍｌを容量３００ｍｌの振盪フラスコに分注し、斜面培地（グルコース２．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス１．０％、寒天粉末１．５％、ｐＨ ６．０）で培養したゲオトリクム・キャンディダム（ＮＢＲＣ ５７６７）を１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。前記と同組成培地５０ｍｌを振盪フラスコに分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ溶液を６％となるように、同様に除菌処理した表５に示す炭水化物を各濃度になるように添加した。この培地に前記種培養液を１ｍｌ添加し、３０℃で３日間、１３０ｒｐｍで振盪培養した。遠心分離で菌体を除去した後、ＨＰＬＣにて培養液中に生成した１，５−ＡＧを定量した。その結果を表５に示した。これよりフルクトースを２％添加した場合が１，５−ＡＧ生産性が最も高く、１，５−ＡＧの生産量が４９ｇ／Ｌ、１，５−ＡＧへの変換率が８１．２％であり、この時の培養液中にはほぼ１，５−ＡＧ以外の物質がふくまれていなかった。

Claims (2)

1. ゲオトリクム・キャンディダム種の菌株を１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースとグルコース以外の炭水化物を含む培地中で接触させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを生成させ、そして生成した１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを採取することを特徴とする１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法。
2. ゲオトリクム・キャンディダム種の菌株がＮＢＲＣ ５７６７、ＮＢＲＣ ４６０１、ＮＢＲＣ ５９５９またはＮＢＲＣ ９５４２
   である請求項１に記載の１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール製造法。