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JP6074574B2 - 方法及び組成物 - Google Patents
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Description

本発明は、ポリペプチドの修飾及び制約、特に、例えばファージディスプレイに関して、該ポリペプチドをコードする核酸との複合体における遺伝的にコード化されたポリペプチドに関する。
生物学的標的に対して高度の親和性及び特異性を有する分子の作製は、化学、生物学及び製薬学において主要な課題である。特に、結合リガンドは、生物学的プロセスに介入することができる薬物の創出に重要である。選択した標的リガンドに結合するリガンドの創出は、一般に、複数の推定結合分子を作製し、該分子を結合特性について試験する方法を含む。
抗体のような大きな生体高分子構造の単離のために、生物学的in vitro選択方法が効率的に用いられているが、こうした方法は、小分子薬物の単離には、これまであまり実用的ではなかった。生物学的in vitro選択方法は一般に、ポリペプチド、RNA又はDNAのような生体高分子に限定されている。例えば、ペプチドのような短い生体高分子も生物学的標的に結合することができるが、これらは構造的可変性の問題を有する可能性があり、体液中でタンパク質分解を被りやすくなる虞がある。加えて、短い線状ペプチドの結合親和性は弱いことが多い。遺伝的にコード化された小ペプチドライブラリーを制約するための様々な環化戦略が知られている。ファージディスプレイされるペプチドは、例えば、2つの隣接システイン残基の酸化により環化されることが知られている。mRNAでコード化される環状ペプチドライブラリーは、化学的架橋試薬で、ペプチドのN-末端アミンとリシン残基を連結することにより作製されることが知られている。この戦略は、シグナル伝達タンパク質Gαi1に結合するレドックス不感受性大環状分子の単離に用いられていた（Millward, S. W.ら、ACS Chem. Biol., 2007）。遺伝的にコード化されたポリペプチドライブラリーに非天然ビルディングブロックを組み込むことにより、ライブラリーの多様性を拡大するか、又は天然のアミノ酸が提供することができない特性を挿入する目的で用いるための様々な戦略も知られている。しかし、こうした戦略は、遺伝的にコード化された線状ポリペプチドへの限られた数の小さな有機付加物の付加を可能にしたにすぎない。例えば、Frankel, A.らは、mRNAディスプレイによりコード化された天然ポリペプチドに非天然アミノ酸を組み込んだ（Frankel, A.ら、Chem. Biol., 2003）。Jespers L.らは、ファージ上にディスプレイされる抗体レパートリーの超可変ループに蛍光レポーター分子を化学的に連結して、抗原結合についてこのレパートリーを選択した（Jespers, L.,ら、Prot. Eng., 2004）。Dwyer, M. A.らは、非天然アミノ酸を含むプロテアーゼインヒビターライブラリーの作製のために、天然の化学的連結により、ファージディスプレイされるペプチドのレパートリーに合成ペプチドを結合させた（Dwyer, M. A.ら、Chemistry & Biology, 2000）。また、有機小分子も、mRNAでコード化されるコンビナトリアルペプチドレパートリーに連結されている。Roberts, R.W.の研究チームは、黄色ブドウ球菌ペニシリン結合タンパク質2aのインヒビターを選択するために、ペニシリン部分をmRNAディスプレイペプチドライブラリーの固定位置に結合させた（Li, S.及びRoberts, W. R., Chem. & Biol., 2003）。
より多様な分子アーキテクチャー（例えば、分枝分子）を有し、しかも、非天然ビルディングブロックから形成されるコンビナトリアル化合物ライブラリーに対しin vitro選択を適用するために、様々な方法論が提案されている。生物学的in vitro選択方法とは違い、これらの方法論では、DNAタグを有機小分子に結合させるのに化学的戦略を用いる。Brenner S.及びLerner R. A.は、ビーズ上のユニークなヌクレオチド配列で化学物質の大きなライブラリーの個々のメンバーをコードするために、パラレルコンビナトリアル合成方法を提案した（Brenner, S.及びLerner, R. A., PNAS, 1992）。化学物質を標的に結合させた後、ヌクレオチドタグの配列決定により遺伝コードをデコードする。Liu D. R.らは、有機分子の小コレクションをDNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートし、様々な抗原で親和性選択を実施した（Doyon, J. B.ら、JACS, 2003）。Neri D.らは、2本のDNA鎖のハイブリダイゼーションによる、DNAにコードされるさらに小さい化学サブライブラリーの自己集合によって、分子対の大きなレパートリーを作製した（Melkko, S.ら、Nature Biotechnol., 2004）。この方法論は、小分子リガンドの親和性成熟に用いられ、成功している。Halpin D. R.及びHarris P. B.は、コンビナトリアル化学ライブラリーのin vitro進化のための戦略を開発したが、これは、選択した化合物の増幅により、複数の選択ラウンドを実施することを含む（Halpin, D. R.及びHarbury, P. B., PLOS Biology, 2004）。Woiwode T. F.らは、該化学的構造が何であるかがファージのゲノムにより明示されるように、合成化合物のライブラリーをバクテリオファージ粒子のコートタンパク質に結合させた（Woiwode, T. F., Chem. & Biol., 2003）。DNA明示化学化合物を用いる上記戦略はすべて、モデル実験では効率的であることが証明され、そのうちのいくつかは、新規の小分子バインダーをもたらしてもいる。しかし、大きな化合物ライブラリーのコード化及び選択した化合物の増幅は、生物学的選択系における同等の方法より、はるかに多くの労力を要することが明らかになっている。
Jespersら（2004 Protein engineering design and selection, 第17巻、第10号、ページ709〜713）は、化学合成抗体ライブラリーからの光学バイオセンサーの選択について記載している。この文献は、ファージ上にディスプレイされる抗体レパートリーの超可変ループを介した蛍光レポーター分子の結合に関する。特に、上記文献は、合成抗体レパートリーの超可変ループ（相補性決定領域、すなわちCDR）への蛍光レポーター分子の連結について記載している。蛍光レポーター分子は、単一共有結合により、超可変ループにおける人工的に導入したシステイン残基に連結させる。1対1結合を実施する。ファージ粒子上のシステイン残基をDTTで還元し、当分野で周知のように、慣用のポリエチレングリコール（PEG）沈殿により過剰の還元剤を除去した。
Dowyerらは、生合成ファージディスプレイを開示し、化学及び遺伝的多様性を併せ持つ新規のタンパク質工学ツールについて記載している。Dwyerら（Chem Biol 2000、第7巻、第4号、ページ263-274）は、非天然アミノ酸を有する合成ペプチドと、目的のタンパク質の主要構造残基を含む合成ペプチドのライブラリーとの化学的連結について記載している。これを実施する理由は、各々が、非天然アミノ酸を組み込んだ定常セグメントを有する多様なプロテアーゼ配列を作製するためであった。非天然アミノ酸を含む合成ペプチドを、天然の化学的連結により単純に結合することにより、2つのペプチド断片を互いに連結させた。連結化合物は一切開示されていない。得られたポリペプチドの制約又は構造的制約は全く達成されなかった。特定の部分とポリペプチド鎖の共有結合も一切開示されていない。
すでに様々な研究チームがシステイン残基を含むポリペプチドを合成分子構造に結合している（Kemp, D. S.及びMcNamara, P. E., J. Org. Chem, 1985：Timmerman, P.ら、ChemBioChem, 2005）。Meloenらは、タンパク質表面の構造模倣のための合成スカフォールト上への複数のペプチドループの高速かつ定量環化のためにトリス(ブロモメチル)ベンゼン及びその関連分子を使用した（Timmerman, P.ら、ChemBioChem, 2005)。候補薬化合物の作製のための方法であって、該化合物が、例えば、トリス(ブロモメチル)ベンゼンのような分子スカフォールドにシステイン含有ポリペプチドを連結することにより作製される方法は、WO 2004/077062及びWO 2006/078161に開示されている。
WO 2004/077062及びWO 2006/078161に記載される方法は、例えばスクリーニング工程において個々の化合物をサンプリングすることに基づくものである。個々の化合物又は化合物の小セットのスクリーニングは時間がかかり、多数の化合物を分析する場合には高価になる可能性がある。スクリーニングアッセイでアッセイすることができる化合物の数は一般に、数千以下である。さらに、システイン含有ペプチドをハロメチル含有スカフォールド（例えば、トリス(ブロモメチル)ベンゼンなど）に結合するための、WO 2004/077062に記載される反応条件は、遺伝的にコード化されたシステイン含有ペプチドを修飾するのに適していない。
WO 2004/077062は、候補薬化合物を選択する方法を開示している。特に、上記文献は、第1反応基及び第2反応基を含む様々なスカフォールド分子、並びに該スカフォールドを別の分子と接触させて、連結反応において上記スカフォールドと別の分子との間に少なくとも2つの連結を形成するステップを開示している。この方法には多くの制限がある。第一に、これは、合成ペプチドの使用、及び個別容器におけるin vitro化学反応に基づいている。そのため、多大な労力を要する。上記方法を自動化する機会、又は多くの独立した反応を並行して実施することにより、各変異体を手で作製せずに多数のペプチド変異体のスクリーニングに該方法を適用する機会は全くない。上記文献には遺伝的にコード化された多様性の記述がなく、また、勿論、遺伝的にコード化されたファージライブラリーへの適用の記述もない。実際に、上記文献に開示される反応条件は、ファージ粒子上に開示される反応を実施することが困難又は不可能であることを示している。
WO 2006/078161は、結合化合物、免疫原性化合物及びペプチド模倣物を開示している。上記文献は、既存のタンパク質から得られたペプチドの様々なコレクションの人工的合成を開示している。次に、こうしたペプチドを、コンビナトリアルライブラリーを作製するために導入された、いくつかのアミノ酸改変を有する定常合成ペプチドと結合させる。化学的連結を介して上記多様性を導入して、様々なアミノ酸改変を特徴とするペプチドを分離することにより、所望の結合活性を見出す機会の増加が達成される。上記文献の図７は、様々なループペプチド構築物の合成の概略図を示す。上記文献には、遺伝的にコード化されたペプチドライブラリーの開示は一切ない。また、上記文献には、ファージディスプレイ方法の使用の開示もない。上記文献は、ファージディスプレイと適合しないと考えられる方法を開示している。例えば、上記文献に示される化学では、おそらくファージコートと反応する連結分子が形成されるであろう。該連結分子はファージ粒子と架橋する危険性がある。ファージ粒子は、記載の化学に付されると、不活性化される（例えばその感染力を失う）可能性が高い。上記文献は、独立した化学コンジュゲーション反応における様々な合成ペプチドの操作に焦点が絞られいる。
Millwardら（2007 Chemical Biology、第2巻、第9号、ページ625-634）は、親和性のように、タンパク質表面を抗体と結合させる環状ペプチドの設計を開示している。上記文献は、遺伝的にコード化されたライブラリーから得られる様々なペプチドの環化を開示している。ポリペプチドは、該ポリペプチドにおける化学架橋剤とN-末端アミン及びリシンのアミンとの反応により環化される。上記文献化学では、遺伝的にコード化されたライブラリーは、mRNAディスプレイライブラリーである。上記文献は、得られたポリペプチドといずれの連結化合物の結合も開示していない。上記文献は、レドックス不感受性環化ペプチドの作製に関連している。上記文献に開示される化学は、ポリペプチドにおいて達成される化学架橋剤とN-末端アミン及びリシンのアミンとの反応による環化である。環化反応は、50ミリモルのリン酸バッファー（pH 8）中で、DSG（DMF中ml当たり1 mg）の添加により実施される。多くても、上記文献が開示しているのは、環状ペプチドの作製を目的とする、架橋部分を介したポリペプチド鎖の2つの部分の架橋に過ぎない。
米国特許出願公開2003/0235852は、非天然アミノ酸残基を有するペプチドを含む核酸−ペプチドディスプレイライブラリー、及びペプチド修飾物質を用いて、上記ライブラリーを作製する方法を開示している。換言すれば、上記文献は、非天然アミノ酸又はアミノ酸のいずれかを含む、遺伝的にコード化されたペプチドライブラリーであって、非天然ビルディングブロック（例えばペニシリン）を、翻訳後に、化学反応において結合させる、上記ペプチドライブラリーを開示している。上記文献は、翻訳されたペプチドと、該ペプチドをコードする核酸の公知の結合方法に焦点が絞られている。上記文献が取り組む別の課題は、どのようにして非天然アミノ酸を該ペプチドに組み込むかである。これは、当分野で周知のように、サプレッサーtRNAを使用して、アンバー／オーカー／オパールコドンに応答して非天然アミノ酸を組み込むことにより主として達成される。その他の副次的実施形態では、非天然アミノ酸は、「ペプチド修飾物質」を用いた翻訳ペプチドの処理により、翻訳後に創出される。上記試薬は、一般に、既存のアミノ酸残基を改変して、これを非天然アミノ酸残基に変換する、あるいは、これを別の化学部分との結合に対して機能的に反応性にする、又は受容性にすることを目的とするものである。具体的には、上記文献は、目的のポリペプチドにおけるシステイン残基と、βラクタム抗生物質の6-ブロモアセチルペニシラン酸との翻訳後コンジュゲーションを教示している。これにより、システイン残基側鎖との単結合を介した、上記ペニシリン類似体と目的のポリペプチドとのコンジュゲーションが達成される。ポリペプチドに連結させる分子の多重結合は全く開示されていない。ポリペプチドの構造的制約も一切記載されていない。また、上記文献に開示される方法では、ペプチドループ又はその他の複合体3次構造は形成されず、従って、この方法は、単純に、単結合を介してポリペプチドに別の単一分子群を結合する方法にすぎない。上記文献では、ポリペプチドに修飾を実施するために、慣用的コンジュゲーション化学が用いられている。
本発明は、有利なことに、遺伝的にコード化された多様性、特に遺伝的にコード化されたポリペプチドライブラリーと、化学的修飾及び構造的制約の組合せを可能にする。
さらに、本明細書に開示される方法は、少なくとも3つの共有結合により連結化合物とポリペプチド分子の連結を初めて達成する。これは、ポリペプチドの構造的制約、特に、ポリペプチドの少なくとも2つのセグメントの互いに対する構造的制約という利点をもたらす。対照的に、従来の架橋方法、すなわち、2つの共有結合のみを形成する連結物質の使用では、ポリペプチドの単一セグメントしか制約しない。
本発明の利点はこれらの技術的特徴から生じるものであるが、例えばその三重結合構造により、本発明のコンジュゲート分子は2つ以上のペプチドループを有し、これらループは標的と相互作用することができる。複数の結合ループによって、単一ペプチドループのみを有する分子より高い結合親和性を得ることができる。
さらに、標的との相互作用のための2つ以上の結合ループを含む本発明の1分子の相互作用表面は、標的との単一ペプチドループしか含まない1分子の表面より広い。結合表面が広い方が、改善された結合親和性を提供することができ、及び／又は改善された特異性も提供することができる。
従って、一態様では、本発明は、
（i）ポリペプチド、
（ii）（i）のポリペプチドをコードする核酸、
（iii）上記ポリペプチドに結合した連結化合物
を含み、上記連結化合物は、少なくとも3つの異なる共有結合により上記ポリペプチドに結合している複合体を提供する。
さらに具体的には、本発明は、ファージ粒子を含む複合体であって、該ファージ粒子が、
（i）ポリペプチド、
（ii）（i）のポリペプチドをコードする核酸、
（iii）上記ポリペプチドに結合した連結化合物
を含み、上記連結化合物は、少なくとも3つの異なる共有結合により上記ポリペプチドに結合している、上記複合体を提供する。
共有結合は、好適には、各々が、連結化合物とポリペプチドの一部同士の個別の結合であるという意味で、異なる共有結合である。例えば、ポリペプチドと連結化合物同士の単架橋で、単架橋が3つの共有結合から構成される（例：連結化合物-x-y-ポリペプチド；尚、"-"は共有結合を表す）ものは、少なくとも3つの異なる共有結合を含むとみなさない。というのは、これらの3つの結合は、連結化合物から標的ポリペプチドまでの3つの個別の架橋又は連結ではないからである。重視すべき原則は、連結化合物／分子コアとポリペプチドが少なくとも3つの個別の共有架橋結合により結合していることである。
好適には、少なくとも3つの共有結合の各々は、ポリペプチドの個別のアミノ酸残基と一緒に形成される。換言すれば、個別のアミノ酸残基は、好適には個々の又は異なるアミノ酸残基であり、１よりも多い結合を単一種又は単一型のアミノ酸残基と一緒に形成してもよく、例えば、結合の2つは各々、システイン残基と一緒に形成されたものでもよいが、好適には2つのシステイン残基は個別のシステイン残基である。
前述した複合体の連結化合物−ポリペプチド部分は、「コンジュゲート」と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、コンジュゲート（すなわち、本発明の複合体に含まれるものに対応するポリペプチド-連結化合物部分）を個別に合成してもよい。この実施形態では、コンジュゲートは核酸と複合体形成しなくてもよい。これについては、以下にさらに詳しく説明する。
好適には、「コード化（コード）する」は、当分野において一般的意味を有する。すなわち、ヌクレオチド配列をポリペプチド配列に変換するためのユニバーサルなトリプレットコードの意味でコードすることを指す。従来の技術では、「コードする」は、例えばユニークなヌクレオチド配列を用いて、1分子をタグ標識する場合、「タグ標識する」又は「デコンボリューションする（deconvoluting）」意味で用いられていたようであり、ヌクレオチド配列がわかれば「デコードする」ことができる、すなわち、該構造に対して生物学的関係を持つことさえなく、どのタグ標識部分が存在するかをユーザーは知ることができる。しかし、本発明では、「コードする」及び「デコードする」は、伝統的な一般的意味で用いられ、ヌクレオチド配列からアミノ酸配列への翻訳の意味でコードすることを指す。
好適には前記連結化合物は有機分子を含む。好適には該連結化合物は、有機小分子を含む。
好適には前記共有結合は、連結化合物とポリペプチドのアミノ酸残基との間で形成される。
好適には前記ポリペプチドは、システイン残基を含み、好適には連結化合物とポリペプチドの結合のための3つの異なる共有結合の少なくとも1つは、上記システイン残基との結合を含む。
好適には前記連結化合物は、それがポリペプチドに結合する共有結合の数に対応する分子対称を有する。
好適には前記連結化合物は、3回分子対称を有し、該連結化合物は、3つの共有結合により前記ポリペプチドに結合している。
好適には前記連結化合物は、構造的に剛性の化学基を含む。
好適には前記連結化合物は、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む。
別の態様では、本発明は、前述の複合体に関する。
好適には前記ポリペプチドは、mRNAディスプレイされるポリペプチドである。
好適には前記ポリペプチドは、ファージ粒子に含まれる。
核酸は、当分野におけるその一般的意味を有し、DNA、RNA又は好適な別の任意の核酸を含みうる。核酸としては、オリゴヌクレオチド若しくはファージゲノム又は当業者には周知の他の好適な核酸の例がある。
好適には前記核酸は、ファージ粒子に含まれる。
別の態様では、本発明は、前述のように、少なくとも2つの異なる複合体を含む、遺伝的にコード化されたポリペプチドライブラリーに関する。
別の態様では、本発明は、複合体を作製する方法であって、以下のステップ：
（i）ポリペプチドを用意するステップ、
（ii）連結化合物を用意するステップ、
（iii）上記連結化合物とポリペプチドとの間での少なくとも3つの共有結合の形成により、上記連結化合物を上記ポリペプチドに結合させるステップ
を含む、上記方法に関する。
好適には前記ポリペプチドの反応基を還元し、好適にはステップ（iii）の前に、還元反応基を含むポリペプチドを濾過により精製する。好適には、前記反応基がシステインを含む場合、該反応基を還元する。尚、この実施形態では、精製は、例えば濾過による、還元剤からの精製である。
好適には濾過精製ステップの後、前記連結化合物との結合のために、脱気バッファー中、キレート剤の存在下でのインキュベーションにより、前記ポリペプチドを還元状態に維持する。
好適にはステップ（iii）は、アセトニトリルを含む水性バッファー中、pH 8で、前記ポリペプチドと連結化合物を一緒に30℃でインキュベートすることを含む。
好適には前記ポリペプチドはファージ粒子に含まれる。
好適には前記連結化合物は、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む。
好適には前記トリス-(ブロモメチル)ベンゼンは、10μMで存在する。
好適には前記トリス-(ブロモメチル)ベンゼンは、10μMで存在し、前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）であり、前記アセトニトリルは、20％で存在し、また、前記インキュベーションステップ（iii）は、1時間にわたり実施する。
好適には前記方法は、ポリペプチド鎖の1以上の結合を切断するさらなるステップ（iv）を含む。これは、ポリペプチド鎖を修飾する利点を有する。例えば、上記ステップは、例えば前記ポリペプチドと連結化合物との結合に挟まれたポリペプチド鎖に切断を実施すれば、単一連結化合物に結合する複数のポリペプチドが生成されるという利点を有するであろう。好適には前記切断ステップは、前記ポリペプチドをプロテアーゼに接触させることを含む。
別の実施形態では、本発明は、前述した方法により得られる複合体に関する。
別の態様では、本発明は、リガンドに結合することができる、前記請求項のいずれかに記載の複合体を同定する方法であって、以下のステップ：
（i）前述の複合体を用意するステップ、
（ii）上記複合体をリガンドと接触させるステップ、
（iii）上記リガンドと結合する複合体を選択するステップ
を含む、上記方法に関する。
こうした選択方法は、いずれの好適な形式で実施してもよい。好適にはリガンドを固定化する。続いて複合体を固定化リガンドと接触させる。次に、非結合複合体を洗い流す。このようにして、固定化リガンドに結合する複合体を濃縮又は選択する。一実施形態では、複合体は、リガンドの放出、すなわち、複合体−リガンド部分を放出又は溶離することにより、回収することができる。しかし、固定化リガンドからの溶離（分離）により複合体を回収するのが好適である。この実施形態では、溶離した複合体は、溶離ステップにおいて、もはやリガンドに結合しない。
複合体、又は該複合体のポリペプチド、又は該複合体のポリペプチド−連結化合物コンジュゲートは、他の環境においても有用となりうる。例えば、これらは、小分子薬などの薬物の設計のためのベースとして有用であり、あるいはCDR若しくは結合部分（例えば、結合パートナーのタグ標識若しくは検出のための）として、又は相互作用の詳細な知識を活用することができる他の用途にも有用となりうる。
別の態様では、本発明は、前記複合体の核酸の配列を決定するステップをさらに含む、前述の方法に関する。
別の態様では、本発明は、前記リガンドに結合することができるものとして単離されるある量の複合体を製造するステップをさらに含む、前述の方法に関する。
別の態様では、本発明は、前記リガンドに結合することができるものとして単離される複合体に含まれるある量のポリペプチド−連結化合物部分を製造するステップをさらに含む、前述の方法に関する。この実施形態では、ポリペプチド−連結化合物部分は、核酸の非存在下で有利に合成することができる。
別の態様では、本発明は、本発明の方法により単離又は同定されるある量のポリペプチドを製造するステップをさらに含み、該製造ステップが、上記連結化合物をポリペプチドに結合させることを含み、上記ポリペプチドは、組換えにより発現されるか又は化学的に合成されたものである、前述の方法に関する。別の実施形態では、本発明は、本発明の方法により単離又は同定されるある量のポリペプチドを製造するステップをさらに含み、該製造ステップが、連結化合物を上記ポリペプチドに結合させることを含み、上記連結化合物は、少なくとも3つの共有結合により上記ポリペプチドに結合する限り、該ポリペプチドの単離又は同定中に結合した連結化合物とは異なるものであってもよく、上記ポリペプチドは、組換えにより発現されるか又は化学的に合成されたものである、前述の方法に関する。
別の態様では、本発明は、
（i）少なくとも2つのポリペプチド分子、及び
（ii）少なくとも1つの連結化合物分子
を含むコンジュゲートであって、上記少なくとも2つのポリペプチド分子の各々が、少なくとも1つの共有結合により、上記連結化合物分子に結合している、上記コンジュゲートに関する。好適には上記連結化合物は、合計少なくとも3つの異なる共有結合により少なくとも2つのポリペプチド分子に結合している。
別の態様では、本発明は、前記コンジュゲートが少なくとも3つのポリペプチド分子を含み、少なくとも3つのポリペプチド分子の各々が、少なくとも1つの共有結合により、上記連結化合物分子に結合している、前述のコンジュゲートに関する。好適には前記連結化合物は、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む。
別の態様では、本発明は、ACSDRFRNCPLWSGTCG、ACSTERRYCPIEIFPCG、ACAPWRTACYEDLMWCG、ACGTGEGRCRVNWTPCG、及びACSDRFRNCPADEALCGからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒト血漿カリクレインインヒビターに関する。
ファージにコードされるコンビナトリアル小化学ライブラリーの作製を示す図である。3つのシステイン残基を有する、ファージにコードされるペプチドを求核置換反応で三官能価化合物トリス-(ブロモメチル)ベンゼンに結合させる。得られた化学物質は、酵素反応によりさらに修飾してもよい。 ファージディスプレイされるペプチドをトリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）に連結するための反応条件の評価を示す図である。（Ａ）質量分析法により決定される、 20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA（pH 8）、20％ACN中、10μM TBMBと30℃で1時間の反応前及び反応後のGCGSGCGSGCG-D1-D2融合タンパク質の分子量。反応及び非反応ペプチド融合タンパク質の質量差は小分子コアメシチレンの質量に対応する。（Ｃ）還元した後、20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA（pH 8）、20％ACN中、様々な濃度のTBMBで、30℃で1時間処理したファージの力価（形質導入単位）。fdg3p0ss21（黒）及びライブラリー1（白）由来のファージの力価を示す。 選択したクローンのファージライブラリー設計及び配列を示す図である。（Ａ）ライブラリー1のクローンにより発現されるペプチド融合タンパク質のアミノ酸配列。大腸菌プロテアーゼによるタンパク質の分泌時に、N-末端アラニン、3つのシステインにより挟まれた2つのランダム6-アミノ酸配列、及び該ペプチドを遺伝子-3-タンパク質に連結するGly-Gly-Ser-Glyリンカーを含むペプチドを残して、リーダー配列を除去する。（Ｂ及びＣ）ヒト血漿カリクレイン（Ｂ）及びカテプシンG（Ｃ）で選択したクローンのアミノ酸配列。TBMB修飾ペプチド-D1-D2融合タンパク質の阻害活性を示す。配列類似性を各色でハイライト表示する。 ヒト血漿カリクレインインヒビターの親和性成熟を示す図である。（Ａ）ライブラリー2、3及び4の設計。各ライブラリーにおいて、ペプチドループの1つは、第1選択で同定した共通モチーフの配列を有し、他方は6個のランダムアミノ酸を含む。（Ｂ）ヒト血漿カリクレインで選択したクローンのアミノ酸配列。クローンは全て、ライブラリー2に由来する。TBMB修飾ペプチド-D1-D2融合タンパク質の阻害活性を示す。各色で第2結合ループにおける配列類似性をハイライト表示する。 TBMB修飾合成ペプチドによるヒト血漿カリクレインの阻害を示す。阻害活性は、様々なインヒビター濃度の活性比（阻害率／非阻害率）として表す。 「ソーセージ状」の構造として表すTBMB修飾ペプチドPK15の代表的NMR溶液構造を示す図である。ペプチドループを青色（ループ1）及び緑色（ループ2）で示す。ペプチドループ中及び末端のアミノ酸のα炭素原子を球体として表す。 1又は2つのシステインを含むペプチドと三官能価化合物TBMBの化学反応を示す図である。（Ａ）2つのシステイン残基を含むペプチド融合タンパク質とTBMBの妥当な反応メカニズム。（Ｂ）TBMBとの反応前及び反応後の、2つのシステインを含むペプチド融合タンパク質の質量スペクトル。（Ｃ）1つのシステイン残基を含むペプチド融合タンパク質とTBMBの妥当な反応メカニズム。（Ｄ）TBMBとの反応前及び反応後の、1つのシステイン残基を含むペプチド融合タンパク質の質量スペクトル。 アプロチニン及びTBMB修飾ペプチドPK15によるヒト血漿中の接触活性化の阻害を示す図である。アクチンにより誘発されるトロンビン産生に対するアプロチニン（Ａ）及びTBMB修飾ペプチドPK15（Ｂ）の作用。両インヒビターは、対照サンプルと比較してタイムラグの用量依存的延長を引き起こす。（Ｃ）XIIa因子及び血漿カリクレインの活性の合計を、様々な濃度のインヒビターで処置した3人のドナーのヒト血漿における比色基質H-D-Pro-Phe-Arg-pNAで測定した。接触活性化は、カオリンの添加により開始した。平均値及び標準的偏差を示す。 （ａ）ファージにコードされるコンビナトリアル小化学ライブラリーの作製。3つのシステイン残基を含む、ファージにコードされるペプチドを、求核置換反応で三官能価化合物トリス-(ブロモメチル)ベンゼンに結合させる。得られた化学物質は、任意で酵素反応によりさらに修飾することができる。（ｂ）ファージディスプレイにより単離した大環状血漿カリクレインインヒビター（P15）の化学構造。 ファージディスプレイされるペプチドとトリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）との連結のための反応条件の評価を示す図である。（ａ）質量分析法により決定した、20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA（pH 8）、20％ACN中、10μM TBMBと30℃で1時間の反応前及び反応後のGCGSGCGSGCG-D1-D2融合タンパク質の分子量。反応及び非反応ペプチド融合タンパク質の質量差は、小分子コアメシチレンの質量に対応する。（ｂ）還元後、20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA（pH 8）、20％ACN中、様々な濃度のTBMBで、30℃で1時間処理したファージの力価（形質導入単位）。fdg3p0ss21（黒）及びライブラリー1（白）由来のファージの力価を示す。 選択したクローンのファージライブラリー設計及び配列を示す図である。（ａ）ライブラリー1のクローンにより発現されるペプチド融合タンパク質のアミノ酸配列。大腸菌プロテアーゼによるタンパク質の分泌時に、N-末端アラニン、3つのシステインにより挟まれた2つのランダム6-アミノ酸配列、及び該ペプチドを遺伝子-3-タンパク質に連結するGly-Gly-Ser-Glyリンカーを含むペプチドを残して、リーダー配列を除去する。（ｂ及びｃ）ヒト血漿カリクレイン（ｂ）及びカテプシンG（ｃ）で選択したアミノ酸配列。（ｃ）TBMB修飾ペプチド-D1-D2融合タンパク質の阻害活性を示す。配列類似性を各色でハイライト表示する。 ヒト血漿カリクレインインヒビターの親和性成熟を示す図である。（ａ）ライブラリー2、3及び4の設計。各ライブラリーにおいて、ペプチドループの1つは、第1選択で同定した共通モチーフの配列を有し、他方は6個のランダムアミノ酸を含む。（ｂ）ヒト血漿カリクレインで選択したクローンのアミノ酸配列。クローンは全て、ライブラリー2に由来する。TBMB修飾ペプチド-D1-D2融合タンパク質の阻害活性を示す。各色で第2結合ループにおける配列類似性をハイライト表示する。 TBMB修飾合成ペプチドによるヒト血漿カリクレインの阻害を示す。阻害活性は、様々なインヒビター濃度の活性比（阻害率／非阻害率）として表す。クローンPK2、PK4、PK6及びPK13は、ライブラリー1を用いたファージ選択において単離した。PK15はライブラリー2に由来し、親和性成熟インヒビターである。 TBMB修飾ペプチドPK15のNMR溶液構造を示す図である。ペプチドループを黄色（ループ1）及びオレンジ色（ループ2）で示す。メシチレンコア、3つのシステイン残基並びに末端アラニン（N-末端）及びグリシン（C-末端）を灰色で示す。ペプチドの骨格原子はソーセージ状に表し、アミノ酸の副鎖はステック状に表す。 1又は2つのシステイン残基を含むペプチドと三官能価化合物TBMBの化学反応を示す図である。（ａ）2つのシステイン残基を含むペプチド融合タンパク質とTBMBの妥当な反応メカニズム。（ｂ）TBMBとの反応前及び反応後の、2つのシステインを含むペプチド融合タンパク質の質量スペクトル。（ｃ）1つのシステイン残基及び1つのリシン残基を含むペプチド融合タンパク質とTBMBの妥当な反応メカニズム。（ｄ）TBMBとの反応前及び反応後の、1つのシステイン残基及び1つのリシン残基を含むペプチド融合タンパク質の質量スペクトル。 アプロチニン又はTBMB修飾ペプチドPK15を用いた血漿カリクレインの阻害によるヒト血漿中のXII因子活性化の抑制を示す図である。3人のドナーのヒト血漿における内因性凝固経路をカオリンの添加により開始した。カオリンの陰荷電表面が少量のXII因子を活性化する。プレカリクレインは、活性化されたXII（XIIa）因子によりカリクレインに変換され、カリクレインが正のフィードバックを及ぼすことにより、さらに多くのXII因子を活性化する。XIIa因子の活性を比色基質H-D-Pro-Phe-Arg-pNAで測定した。XIIa因子活性の平均値及び標準的偏差を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、新規の特徴及び付随する利点をもたらすものであり、こうした特徴及び利点は、コア構造を含む、遺伝的にコード化された分子の作製に関してさらに詳細に説明することができる。特に、本発明は、公知のペプチド環化技法では達成されない構造的制約を提供する。さらに、公知の系、例えばRobertsによるもの（同上）における架橋剤は、本発明の中心核／連結化合物の特徴を備えていない。公知の系では、架橋剤は、レドックス不感受性環状ペプチドを作製する目的で、単純にジスルフィド結合の代わりに用いられていた。多数の付加物、例えば、本明細書に教示するような三重共有結合連結化合物−ポリペプチド複合体を含む中心コアの概念についての記述又は示唆は一切ない。実際に、本発明では、ポリペプチドは少なくとも3つの共有結合によりコア構造物に連結しており、これにより公知の系と比較して基本的な構造上の違いがもたらされる。3つ以上の結合による、コア構造物（連結化合物）と遺伝的コード化ポリペプチドとの連結は、これまでに示されたことのない複雑な反応である。
さらに、少なくとも3つの共有結合によるポリペプチドと連結化合物の連結によって、複数の異なる生成物を取得することができる。これは、選択プロセス及びデコード工程において問題を引き起こす可能性がある。しかし、本発明によれば、3つの反応基と、好ましくは3回回転対称を有する連結化合物を用いる解決策が提供され、この組合せは、単一生成物をもたらすという利点を有する。勿論、当業者である読者は、ある不明瞭な状況において、最も顕著には3つの同一反応基を有する正四面体型分子（これも3回回転対称を有するが、2つの立体異性体をもたらす）の例において、3回回転対称が複数の生成物をもたらすであろうことは理解されよう。それでも、理解を容易にするため、単一生成物の形成に対するこうした理論上の例外もありうることは認めた上で、本発明によれば、好適なことに、3回回転対称を有する連結化合物は単一生成物を提供する。前述した稀な状況では、正四面体型分子形成を回避し、これにより、単一生成物のみの形成を維持するように、ポリペプチドを選択するのが好適である。
本明細書に記載する方法及び組成物に用いられる連結化合物は、本発明の連結化合物が、標的ポリペプチドとの少なくとも3つの共有結合を形成することができる少なくとも3つの反応基を有する基本的要件において、公知の2価架橋剤（例えば、Millwardら（同上）が用いたもの）とは異なる。この特徴は本発明に多数の技術上の利益をもたらす。第一に、少なくとも3つの共有結合により連結化合物をポリペプチドに結合させることにより、少なくとも2つのポリペプチドループを形成する。これらのループは、連結化合物とポリペプチドの第1結合と第2結合の間、及び第2結合と第3結合の間に形成される。Millwardらにより記載された公知のリンカーは、ペプチドの2つの官能基を連結することができるだけで、2つ以上の制約ペプチドループを形成することはできない。
連結化合物−ポリペプチド結合の利点
連結化合物との3以上の連結を有する本発明の分子を、他の分子、例えば2つの連結のみを有する分子から区別するいくつかの特性がある。それらのいくつかを以下に説明する。
第一に、連結化合物との2つの連結を有する分子は、線状ペプチドの可変末端を互いに連結することにより制約されることは理解されよう。これはまた、連結化合物との3つ以上の共有結合を有する本発明の分子についても言えることである。しかし、連結化合物との3つ以上の共有結合を有する本発明の分子の立体構造は、2つのさらに別の作用によっても制約されており、これは、2つの連結のみを有する分子には当てはまらない：
i）少なくとも3つの共有結合により連結化合物に結合したポリペプチドは、少なくとも2つの制約ポリペプチドループを含み、
ii）ポリペプチドループは、非共有結合相互反応により互いに相互作用して、別の制約を生み出すことができ、
iii）ループの各々は、他のループが占有することができない空間を占有し、これがさらにその構造的可変性を制約する。
これらの点について説明するために、連結化合物に点A及び点Cでアンカーされたポリペプチドが取る可能性のある経路を推測することができる。同じ連結化合物に対し、点Aと点Cの間にアンカー点Bを導入すると、ポリペプチドが取る可能性のある経路はさらに制限され、従って、その構造エントロピーも制限される。リガンドへのペプチドの結合は、構造エントロピー損失を必要とする（しかも、ペプチドが、リガンドに相補的な立体構造を取ることができるという条件で）ため、中間点Bで制約されたペプチドABCとリガンド同士の結合親和性は、ペプチドACより高いと予想される。従って、本発明の制約分子を用いて、従来技術で可能であったものより高い結合親和性を達成することが可能である。
これらのキーポイントに加えて、ポリペプチドと連結化合物との間の3つ以上の共有結合のさらなる利点について以下に詳述する。
本発明の分子は、2つ以上の構造的に制約されたペプチドループの相互作用により標的に結合することができる。結合ループが多いほど、高い親和性及び特異性を取得することができる。抗体でも同等の作用が起こる。すなわち、抗体は、複数のCDRが標的と相互作用するとき、最もよく結合する。本発明の分子は、従って、相互作用のための複数のループの技術上の利点を有利に提供し、この利点は、2つ以下の結合を有する分子には存在しない。
第2の（又は次の）ペプチドループの実際の提供のほかに、こうしたループは、別のループを構造的に制約するという利点をもたらすことに留意する必要がある。これは、他のループが占有することはできない限られた3次元空間の一部を占有することにより達成される。あるいは、上記のことは、複数のループ同士の非共有結合相互作用によっても可能である。
以上の利点からも、より構造化されたリガンドほど、一般に、高い親和性（結合時に失われるエントロピーが少ない）及び特異性で結合すると指摘することができる。
本明細書で論じられるように、本発明は、2つ（又はそれ以上）のループの各々が異なる特性を有する環状ペプチド構造の作製も達成する。こうした構造は、単一の分子自体が、同じ全体構造の2つの異なる部分（ループ）に因ると考えられる二重特異性を有する事実を表すために、「二重特異性」と呼ばれる。このような実施形態の利点は、異なる標的（例えば、「抗原」）に結合するように、各ループを選択又は構築することができる点である。これは、本発明の3つの結合系のさらに別の顕著な特徴を示すものである。
これらの作用以外にも、本発明の分子はまた、ポリペプチド鎖の2つのセグメントの間に単一抗原（又は別の物質）を挟むことも可能にする。勿論この可能性は、1以下のループしかないポリペプチド構築物には存在しない。当然ながら、採用する特定の配置は、用いられる特定の構築物の形状に左右されうるが、本発明は、従来の技術とは対照的にこれを可能にする。
勿論、以上の論考は、本発明に従い作製したループについて述べたものである。いくつかの実施形態では、続いてこれらのループを切断する。こうした実施形態であっても、ループは形成されることに留意する必要がある。簡単に言えば、ループ状分子を中間物として処理してから、該中間物をループの切断によりさらに処理することによって、結合（tether）した多重線状ペプチド構造を作製する。上記実施形態では、ペプチド切断後に、ペプチドを3つ以上の共有結合により連結化合物に連結させるため、分子は3つ以上のペプチド部分で修飾されることになる。こうした分子は、標的とより多くの相互作用を形成することができ、従って、より高度の結合親和性／特異性が予想され、これは、本明細書の3重結合系のさらに別の利点である。
2つ以上のポリペプチドループを有する本発明の分子は、単一ループのみを有するポリペプチド分子と比較して、標的リガンドとより多くの相互作用を形成することができ、従って、より高度の親和性及び／又は特異性を有することができる点で有利である。例えば、優れた親和性のために第2ループを改良するのが望ましいが、これは明らかに単一ループの分子では不可能である。
本発明の複合体において、連結化合物が、少なくとも2つのポリペプチドループを空間的に極めて近接して保持するのは利点である。これら2つ以上のループは、同じ標的リガンド上の様々なエピトープと同時に相互作用することができる。
さらに、2つ以上のループを有する利点は、「二重特異性」分子の製造に利用することができ、その場合、1つのループは、特定の特性若しくは結合親和性を有するものか、又はそれについて選択されたものであり、他方のループは、別の特性若しくは親和性について選択されたものである。これらの分子は、「二重特異性分子（bispecifics）」又は「二重特異性分子（dual specifics）」と呼ばれる。複数の種類が考えられる。例えば、以下のものがある：
（a）ループ1について選択した後、ループ2（又はそれ以上）について選択することにより作製した二重特異性分子、
（b）2つの連結した二環式大環状分子、
（c）1つの二環式大環状分子とペプチド又は薬物。
（a）の場合、これは、典型的に第1抗原に対するライブラリーの１アリコート、及び第2抗原に対する別のアリコートを作製／選択することにより、実施することができる。次に、例えば標準的技法、例えば、2つのループをコードする核酸セグメントを組換えて、第1ループ及び第2ループの様々な組合せの新規ライブラリーを提供することにより、選択したループを対として組み合わせることができる。次に、対として組み合わせた分子（例えば、ファージ）を両方の抗原に対する結合について逐次スクリーニング及び／又は選択することができる。このようにして、2つの個別の抗原に結合することができる二重特異性分子を作製することができる。当然、この方法は、さらなる任意のステップで増強することができ、例えば、各抗原の結合親和性を各ループの突然変異により改善することができ、その場合、該突然変異は部位指定突然変異でも、又はランダム突然変異であってもよい。
上記方法の変形では、ライブラリーの1アリコートを第1抗原に対する結合について選択することができる。結合に最も重要なループは、例えばバインダーとして選択したものから「共通配列」の検査により同定することができ、また、他方のループは、第2抗原に対してランダム化して、選択することができる。
最も好適には（a）に記載したようなタイプの二重特異性分子をファージ上に作製する。
前記（b）及び（c）に記載した変異型分子も同様にファージとして作製することができる（前記と同様の方法で）。あるいは、多くの場合、2つの連結した物質を個別に選択した後、化学合成のステップで融合することもでき、これにより、その選択／構築を単純化することが可能である。
本発明の連結化合物が各ペプチドループの基部でアミノ酸残基を介した共有結合によりポリペプチドセグメントと連結する役割を果たす以外にも、該連結化合物は、別のアミノ酸残基などのポリペプチド鎖の別の要素とのさらなる非共有結合相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用）にも関与していることは、本発明の態様の別の有意かつ有利な特徴である。対照的に、Millwardらの二価リンカーは、線状で、しかも高度に可変性であり（プロピル）、その唯一の役割は、ポリペプチドの2つの末端を連結して、レドックス不感受性環状ペプチドを形成することである。Millwardらのリンカーは、小さく、しかも高度に可変性であるため、有意な非共有結合相互作用を形成すると予想することはできず、また、実際にそれを達成した証拠もない。本発明のこの利点については、有利な非共有結合相互作用の証拠と一緒に、実施例の節でさらに詳しく説明する。従って、好適には本明細書に説明した共有結合に加えて、1以上の非共有結合相互作用によりポリペプチドを連結化合物に結合させる。これは、本発明の複合体／コンジュゲートに構造的制約のレベル増加をもたらすというさらに別の利点を有する。
複数のペプチドループを有する分子は、一般に、単一ペプチドループを有するポリペプチドより構造化されていることは、本発明の利点である。高度に構造化された分子は、より高度に特異性である傾向がある。また、十分に構造化された分子は、一般に優れた結合親和性も有する。さらに、複数のペプチドループを有する分子は、単一ペプチドループを有するポリペプチドと比較して、標的リガンドとの相互作用をより多く形成することができる。
本発明の連結化合物はまた、それ自身の化学構造に由来する構造的制約を課することも、本発明の態様のさらなる利点である。例えば、いくつかの化学基は、非可変性であること、回転を阻止すること、立体障害又は制約を賦与すること、剛性構造を呈示すること、あるいはまた、複合体にスカフォールド又は制約を賦与することがわかっている。従って、好適には本発明の連結化合物は、スカフォールド基、例えば剛性のスカフォールド基を含む。このスカフォールド基の機能は、本発明の複合体に分子構造又は制約を賦与することである。本発明の好ましい連結化合物、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）に関連して、この特徴は、TBMBのベンゼン基の平面構造を参照にして説明することができる。このベンゼン基は、その平面の特徴のために剛性であることから、連結化合物のスカフォールド基、特に剛性スカフォールド基として用いることができる。
従って、本発明の非常に好ましい実施形態では、連結化合物は、ポリペプチドとの少なくとも3つの共有結合により課される構造的制約を賦与し、連結化合物とポリペプチドとの非共有結合を介したさらなる構造を賦与し、さらには、本発明の連結化合物は、それ自身の化学構造の性質による構造的制約も課して、剛性のスカフォールドの役割を果たす。例えば、連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）である場合と同様のものを含むときのベンゼン基の平面構造である。
連結化合物
連結化合物は、「分子コア」と呼ばれることもある。好適には、連結化合物は分子対称を有する。好適には、連結化合物は、3つの反応基を有し、かつ3回対称を有する。これは、単一反応生成物のみを生成するという利点がある。連結化合物が対称分子でない場合には、複数の反応生成物が生成される可能性がある。これは、複雑化を招いたり、又は別の反応生成物から所望の異性体を分離することを要したりする可能性がある。適切な対称を有する連結化合物を用いることにより、このような問題は有利に改善される。
作製されるポリペプチドが、従来の環状ペプチドより高度な複雑度を有することは本発明の利点である。例えば、本発明に従い作製されるポリペプチドは、別の化学物質との相互作用のために2を超えるループを有してもよい。さらに、本発明に従い作製されるポリペプチドは、従来技術に基づくポリペプチドより高いレベルの制約を享受する。これら2つの作用が一緒になって、ポリペプチドの複数のループ（又は「環」）が、共通の連結化合物との結合を介して互いに物理的に極めて接近して保持されているという、さらに別の利点を生み出す。これは、ポリペプチドの構造に対する制約のレベル増大をもたらす。
一般に、従来技術の環状ポリペプチドは、複数のシステイン残基、例えば2つのシステイン残基を用いて結合されて、ペプチドの2つの部分の間に架橋を形成し、これにより環状ポリペプチドを形成する。しかし、こうした分子はレドックス感受性である。Millwardらの方法は、レドックス不感受性の環状ペプチドの作製に直接向けられている。この点で、Millwardらの方法は、従来技術から逸脱し、教示内容も、ポリペプチドの修飾のための反応基としてのシステインの使用からかけ離れている。対照的に、本発明によれば、システインは好ましい反応基である。
連結化合物との少なくとも3つ異なる共有結合のための3つ以上の反応基があれば、上記反応基のすべてがシステインである必要はない。例えば、3つの反応基は、1つのシステインと2つの別の好適な反応基を含んでもよく、それらは、例えばリシン、セレノシステイン又はその他を含んでもよい。最も好適には、3つの反応基の全てがシステインである。
従来の技術では、単一ループポリペプチドの作製しか達成されなかった。本発明によれば、ポリペプチドを様々な位置で連結化合物と結合させることにより、少なくとも2つ又はそれ以上のループを作製することができる。
本発明の方法は、ポリペプチドとの少なくとも3つの結合を含む。これは、より高度の分子制約という利点を有する。これは、別の部分との相互作用のための複数のポリペプチドループの呈示という別の利点も有する。
公知の方法では、ポリペプチド、例えば遺伝的にコード化されたポリペプチドに架橋剤を導入するか、又は結合させていた。対照的に、本発明は、同じポリペプチドの様々な部分の多重配位のための連結化合物を提供する。
好適には前記連結化合物は小分子でよい。好適には連結化合物は、有機小分子である。
好適には前記連結化合物は、天然モノマー、例えば、ヌクレオシド、糖、若しくはステロイドであってもよいし、又はこれらに基づくものであってもよい。好適には連結化合物は、こうした物質の短いポリマー、例えば二量体又は三量体であってもよい。
好適には前記連結化合物は、既知の毒性、好適には低毒性の化合物である。好適な化合物の例として、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、又は既存の薬物、例えばタマザパンがある。
好適には前記連結化合物は、高分子であってよい。好適には連結化合物は、アミノ酸、ヌクレオチド又は炭水化物から構成される高分子である。
好適には前記連結化合物は、標的ポリペプチドの官能基と反応して、共有結合を形成することができる反応基を含む。
前記連結化合物は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル及びハロゲン化アシルなどの化学基を含んでもよい。
好適には連結化合物は、トリス(ブロモメチル)ベンゼン又はその誘導体を含むか、又はそれからなるものでよい。
好適には連結化合物は、標的ポリペプチドの3つの官能基と連結化合物との反応により、単一生成物異性体を生成するように、3回回転対称を有する。
いくつかの実施形態では、連結化合物は、コード化ポリペプチドの4つの官能基と連結化合物との反応により、2つ以下の生成物異性体を生成するように、正四面体型形状を有するものであってもよい。
好適な連結化合物は、1,3,5-トリス(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）である。
好適な連結化合物は、2,4,6-トリス(ブロモメチル)メシチレンである。これは、1,3,5-トリス(ブロモメチル)ベンゼンと類似しているが、ベンゼン環に結合した3つのメチル基をさらに含んでいる。これは、上記追加のメチル基が、ポリペプチドとのさらなる接触点を形成するため、さらなる構造的制約が加えられるという利点を有する。
本発明の連結化合物は、小分子又は高分子構造のいずれかから選択する。上記連結化合物は、有機成分、無機成分、又は有機と無機の成分から構成される。
好ましい実施形態では、連結化合物は、有機小分子、例えば、線状アルカンである。さらに好適には連結化合物は、分枝アルカン、環状アルカン、多環式アルカン、アロメート（aromate）、複素環式アルカン又は複素環式アロメートであり、これらは可変性が低い（すなわち、剛性が高い）という利点をもたらす。
別の実施形態では、連結化合物は、高分子構造、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド又は多糖から選択される。
本発明の連結化合物は、本発明のコード化ライブラリーのポリペプチドの官能基が連結化合物との共有結合を形成するのを可能にする化学基を含む。上記化学基は、広範な官能基から選択され、例えば、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキル及びハロゲン化アシルなどがある。
一実施形態では、本発明の連結化合物はトリス(ブロモメチル)ベンゼン又はその誘導体である。
ポリペプチド
コード化ポリペプチドの官能基は、天然又は非天然アミノ酸の側鎖により好適に提供される。コード化ポリペプチドの官能基は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、グアニジニウム基、フェノール基又はヒドロキシル基から好適に選択される。コード化ポリペプチドの官能基は、アジド基、ケト-カルボニル基、アルキン基、ビニル基、又はハロゲン化アリール基から好適に選択される。コード化ポリペプチドの官能基は、好適にはポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端である。
いくつかの実施形態では、連結化合物に連結するためのポリペプチドの官能基の各々は、同じタイプのものである。例えば、各官能基はシステイン残基であってもよい。
いくつかの実施形態では、連結化合物に連結するための官能基は、2つ以上の異なるタイプを含んでも、又は3つ以上の異なるタイプを含んでもよい。例えば、官能基は、2つのシステイン残基と1つのリシン残基を含んでもよいし、又は1つのシステイン残基、1つのリシン残基及び1つのN-末端アミンを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、天然アミノ酸のような別のアミノ酸が、ポリペプチド、例えば本発明のファージディスプレイされるペプチドを化学的に修飾するのに適している。
システインは、その反応性が他の全てのアミノ酸とは最も異なるという利点があるため、最も好適である。システインのチオール基と反応させるために連結化合物で用いることができる反応基は、ハロゲン化アルキル（又はハロゲノアルカン若しくはハロアルカンとも呼ばれる）である。例として、ブロモメチルベンゼン（例としてTBMBが挙げられる反応基）又はヨードアセトアミドがある。タンパク質中で化合物をシステインに選択的に連結させるために用いられるその他の反応基はマレイミドである。本発明において連結化合物として用いることができるマレイミドの例として、トリス-(2-マレイミドエチル)アミン、トリス-(2-マレイミドエチル)ベンゼン、トリス-(マレイミド)ベンゼンがある。セレノシステインもまた、システインに対して類似の反応性を有する天然アミノ酸であり、同じ反応に用いることができる。従って、システインについて述べる場合はいつも、文中に別の提案のない限り、一般にセレノシステインを代わりに用いることも可能である。最も好適にはシステインを用いる。
リシン（及びペプチドのN-末端の一級アミン）もまた、連結化合物と連結させることによりファージ上のペプチドを修飾するための官能基として適している。しかし、これらは、ファージタンパク質においてシステインより豊富であり、ファージ粒子が架橋される、又はその感染性を失う危険性がより高い。それにもかかわらず、本発明者らは、リシンが、連結化合物との第2の、又は連続した連結を形成するために、分子内反応において特に有用である（例えば、連結化合物がファージペプチドとすでに連結しているとき）ことを見出した。この場合、連結化合物は、ディスプレイされるペプチド（特に、極めて近接したリシン）と選択的に反応する。一級アミンと選択的に反応する官能基は、スクシンイミド、アルデヒド又はハロゲン化アルキルである。ハロゲン化アルキルについては、読者には、様々な反応性を有するハロゲン化アルキルが存在することは周知であろう。付随するいくつかの実施例で用いたブロモメチル基の場合、ベンゼン環の電子はカチオン遷移状態を安定化することができる。この特定のハロゲン化アルキルは従って、ベンゼン基に連結していないハロゲン化アルキルより100〜1,000倍反応性が高い。連結化合物として用いるスクシンイミドの例として、トリス-(スクシンイミジルアミノトリアセテート)、1,3,5-ベンゼン三酢酸がある。連結化合物として用いるアルデヒドの例としては、トリホルミルメタンがある。連結化合物として用いるハロゲン化アルキルの例としては、1,3,5-トリス(ブロモメチル)-2,4,6-トリメチルベンゼン、1,3,5-トリス(ブロモメチル)ベンゼン、1,3,5-トリス(ブロモメチル)-2,4,6-トリエチルベンゼンがある。
いくつかの実施形態では、分子リンカー又は修飾は、連結化合物の結合前に、コード化ポリペプチドの官能基に付加する（又は付加することにより、上記官能基を形成する）ことができる。尚、上記リンカー又は修飾は、連結化合物と反応することができるものである。
連結化合物と連結させるための官能基を含むアミノ酸は、コード化ポリペプチド内のいずれの好適な位置に配置してもよい。形成される特定の構造又はループに影響を与える目的で、官能基を有するアミノ酸の位置は、生成されるポリペプチドに突然変異を起こす目的で、ポリペプチドをコードする核酸を操作することにより、熟練した技術者が変更してもよい。
当業者のニーズ又は本発明を適用する目的に応じて、コード化ポリペプチドのアミノ酸の各々が、突然変異誘発（例えば、限局的変化の（restricted variance）突然変異誘発）の標的であってもよい。明らかに、連結化合物との結合のための少なくとも3つの官能基が、目的のポリペプチドに必要である。連結化合物に結合させるのに必要なもの以外のアミノ酸は、技術者のニーズに応じて自由に変更することができ、このようなアミノ酸を「可変アミノ酸」と呼ぶ。コード化ポリペプチド（例えば、ポリペプチドライブラリーメンバー）の可変アミノ酸は、ランダム化しても、部分的にランダム化してもよいし、定常であってもよい。
標的ポリペプチドは、連結化合物結合セグメントを含む。これは、連結化合物が結合する領域である。好適にはポリペプチドの官能基に関する前記説明を上記結合セグメントに適用する。好適には標的ポリペプチドの連結化合物結合セグメントは、1〜20個のアミノ酸残基を含む。好適には標的ポリペプチドの連結化合物結合セグメントは、9個以下のアミノ酸を含む。これは、該ポリペプチドのセグメントを連結化合物に結合させると、ポリペプチドセグメントにさらに構造的制約を課するという利点を有する。
標的ポリペプチドは、好適には配列AC(X)6C(X)6CG（配列中、Xはランダム天然アミノ酸を表し、Aはアラニンを、Cはシステインを、またGはグリシンをそれぞれ表す）を含む。
標的ポリペプチドは、好適には配列(X)lY(X)mY(X)nY(X)o（配列中、Yは、官能基を含むアミノ酸を表し、Xはランダムアミノ酸を表し、m及びnは、介在ポリペプチドセグメントの長さを定める1〜20までの数であり、l及びoは、隣接ポリペプチドセグメントの長さを定める0〜20までの数である）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の複合体は、配列AC(X)6C(X)6CGを有するポリペプチドを含むものでよい。一実施形態では、本発明のライブラリーメンバー又は複合体は、メシチレン連結化合物と、配列AC(X)6C(X)6CGを有するポリペプチドを含むものでよく、上記ポリペプチドは、該システイン残基と一緒に3つのチオエーテル結合を形成するポリペプチドのシステイン残基を介して連結化合物の環外メチル基に結合し、上記配列中、Xはアミノ酸（好適には天然アミノ酸）を表し、Aはアラニンを、Cはシステインを、またGはグリシンをそれぞれ表す。
好適には標的ポリペプチドはヒト血漿カリクレインのインヒビターを含み、ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の1つ以上を含む：GCSDRFRNCPADEALCG、ACSDRFRNCPLWSGTCG、ACSTERRYCPIEIFPCG、ACAPWRTACYEDLMWCG、ACGTGEGRCRVNWTPCG又は関連配列。
関連配列とは、少なくとも50％同一性、好適には少なくとも60％同一性、好適には少なくとも70％同一性、好適には少なくとも80％同一性、好適には少なくとも90％同一性、好適には少なくとも95％同一性、好適には少なくとも98％同一性、好適には少なくとも99％同一性を有するアミノ酸配列を意味する。同一性は、基準配列の少なくとも10アミノ酸、好適には少なくとも12アミノ酸、好適には少なくとも14アミノ酸、好適には少なくとも16アミノ酸、好適には少なくとも17アミノ酸又は全長の連続したセグメントから好適に判断する。
好適には標的ポリペプチドは、ヒトカテプシンGのインヒビターを含み、ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の1つ以上を含む：ACEYGDLWCGWDPPVCG、ACIFDLGFCHNDWWNCG、ACLRAQEDCVYDRGFCG又は関連配列。
好適には標的ポリペプチドは、ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のインヒビターを含み、ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の1つ以上を含む：ACNSRFSGCQIDLLMCG、ACSRYEVDCRGRGSACG又は関連配列。
好適には標的ポリペプチドは、少なくとも105のメンバー、さらに好適には少なくとも109のメンバーを含むポリペプチドのライブラリーに含まれる。本発明はまた、かかるライブラリーにも関する。
ポリペプチドの反応基
本発明の連結化合物は、ポリペプチドの官能基又は反応基を介してポリペプチドに結合させることができる。これらは、一般にポリペプチドポリマーに存在する特定のアミノ酸の側鎖から形成される。上記反応基は、システイン側鎖、リシン側鎖、若しくはN-末端アミン基又はその他いずれかの好適な反応基であってもよい。
好適には少なくとも1つの官能基はシステイン基である。リシン又はN-末端アミンのような基は、一般に、好都合な期間内にそれ自体で連結化合物と結合するのに十分反応性ではない。しかし、一旦連結化合物が少なくとも1つのシステインに引きつけられるか、又はこれと結合すれば、一般的反応速度論から、その後、リシン又はアミン結合が迅速かつ安定に形成されることになる。この理由から、好適には少なくとも1つの官能基はシステイン基である。
システイン／リシン／アミン基以外のポリペプチドの反応基を所望する場合には、標的ポリペプチドについて選択した特定の官能反応基と対を形成するように、別の連結化合物を選択することができる。
好適にはシステイン、リシン又はアミン基を目的のポリペプチドの官能基又は反応基として用いる。
好適には少なくとも3つの共有結合を連結化合物と目的のポリペプチドとの間に形成する。
いくつかの実施形態では、4つ又はそれ以上の結合を連結化合物と目的のポリペプチドとの間に形成する。しかし、4つ以上の結合を用いると、一般に形成される生成物混合物はますます複雑になり、後の使用又は適用ができなくなる虞がある。そのため、連結化合物と目的のポリペプチドとの間での3つ又は4つの結合が好ましい。どんな実施形態においても、連結化合物の分子対称が好ましい。3つの官能基又は反応基を有する連結化合物が最も好ましい。3回分子対称を有する連結化合物が最も好ましい。
本発明の遺伝的にコード化されたポリペプチドの官能基は、連結化合物／分子コアとの共有結合を形成することができる。官能基は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸内の特定の原子団である。好ましくは、特有の化学反応性を有する官能基を用いて、ポリペプチドを連結化合物に連結させることにより、本発明の複合体を形成する。上記特有の官能基の使用により、連結化合物／分子コアと、ポリペプチドの指定官能基のみとの結合が可能になるが、ポリペプチドの多様性要素、複合体の核酸又は別の成分の他の化学基には結合しない。
天然アミノ酸の好適な官能基は、システインのチオール基、リシンのアミノ基、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジニウム基、チロシンのフェノール基又はセリンのヒドロキシル基である。非天然アミノ酸は、アジド、ケト-カルボニル、アルキン、ビニル、又はハロゲン化アリール基などの非常に多様な官能基を提供することができる。ポリペプチドの末端のアミノ基及びカルボキシル基はまた、連結化合物／分子コアとの共有結合を形成するための官能基の役割も果たすことができる。
本発明のコード化ポリペプチドは、好適には少なくとも3つの官能基を含む。上記ポリペプチドはまた、4つ以上の官能基を含むこともできる。用いる官能基が多いほど、多くの多様性セグメントを連結化合物／分子コアに結合させることができる。しかし、過剰な数の官能基と連結化合物／分子コアの連結は、操作不可能な数の生成物異性体をもたらす可能性があることから、推奨されない。好適には連結化合物との3つ、4つ又は5つの共有結合を用い、非常に好適には3つ又は4つの共有結合を、最も好適には3つの共有結合を用いる。
好ましい実施形態では、3つの官能基を含む、コード化ポリペプチドを作製する。該ポリペプチドと、3回回転対称を有する連結化合物／分子コアとの反応により、単一生成物異性体が生成される。単一生成物異性体の作製は、いくつかの理由で好ましい。化合物ライブラリーの核酸（「遺伝コード」と呼ばれることもある）は、ポリペプチドの一次配列のみをコードするが、コード化ポリペプチドと分子コアとの反応時に形成される分子の異性状態はコードしない。1つの生成物異性体のみを形成することができれば、生成物異性体に対する核酸の割当ては明瞭に定められる。複数の生成物異性体が形成されれば、核酸はスクリーニング又は選択プロセスで単離された生成物異性体の性質に関する情報を与えることができない。単一生成物異性体の形成はまた、本発明のライブラリーの特定のメンバーを合成する場合にも有利である。この場合、ポリペプチドと連結化合物との化学反応により、異性体の混合物ではなく、単一生成物異性体が得られる。
本発明の別の実施形態では、4つの官能基を含む、コード化ポリペプチドが作製される。上記ポリペプチドと、正四面型対称を有する連結化合物／分子コアとの反応により、2つの生成物異性体が生成される。2つの異なる生成物異性体が1つの同じ核酸（「遺伝コード」）によりコード化される場合でも、単離された異性体の異性体としての性質は、両異性体を化学的に合成し、2つの異性体を分離し、標的リガンドとの結合について両異性体を試験することにより、決定することができる。
本発明の一実施形態では、ポリペプチドの官能基の少なくとも1つは、残りの官能基に対して直交する。直交官能基を使用すれば、分子コアの特定の部位にこの直交官能基を向けることが可能になる。直交官能基を含む連結戦略を用いて、形成される生成物異性体の数を制限することができる。言い換えれば、少なくとも3つの結合の残りについて選択された官能基に対して、少なくとも3つの結合の1以上について別の、又は異なる官能基を選択することにより、連結化合物上の特定の位置に対するポリペプチドの特定の官能基の特定の順序の結合又は方向付けを有効に達成することができる。
別の実施形態では、本発明のコード化ポリペプチドの官能基を分子リンカーと反応させるが、上記リンカーは、最終的結合状態にある連結化合物とポリペプチドとの間に介入するように、連結化合物／分子スカフォールドと反応することができる。
遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーの好適なアミノ酸は、任意の天然又は非天然アミノ酸で置換することができる。但し、ポリペプチドを分子コアに架橋するための官能基を含むものは、置換可能なアミノ酸から除外する。改変が可能な隣接アミノ酸の群は、ポリペプチドセグメントとして定義される。単一のポリペプチドセグメントの大きさは、好適には1〜20アミノ酸の範囲である。ポリペプチドセグメントはランダム配列、定常配列、又はランダム及び定常アミノ酸を含む配列のいずれかを有する。官能基を含むアミノ酸は、本発明のコード化ポリペプチド内の規定位置又はランダムな位置のいずれかに配置する。
一実施形態では、連結化合物／分子コアとの結合のための2アミノ酸含有官能基によって結合されたポリペプチドセグメントは、10以下のアミノ酸からなる短いアミノ酸配列である。コード化ポリペプチド配列と分子コアとの反応により、高度の構造的制約を有するライブラリーメンバーが作製される。構造的に制約されたリガンドは、一般に、より特異的であり、より高い結合親和性を有する。構造的制約はまた、例えば、体液中でのタンパク質分解からリガンドを保護することができる。
一実施形態では、3つの官能基を含む、コード化ポリペプチドは、配列(X)lY(X)mY(X)nY(X)o（配列中、Yは、官能基を含むアミノ酸を表し、Xはランダムアミノ酸を表し、m及びnは、介在ポリペプチドセグメントの長さを定める1〜20までの数であり、l及びoは、隣接ポリペプチドセグメントの長さを定める0〜20までの数である）を含む。
好ましい実施形態では、本発明のコード化されたポリペプチドライブラリーは、配列AC(X)6C(X)6CG（Aはアラニンを表し、Cはシステインを表し、Xはランダム天然アミノ酸を表し、またGはグリシンを表す）を含む。
チオール媒介コンジュゲーションに代わる方法を用いて、共有結合相互作用を介して連結化合物をペプチドに結合させることもできる。あるいは、こうした方法は、別の部分（例えば、連結化合物とは異なる目的の小分子など）を本発明に従い選択又は単離した後、ポリペプチドに対する該部分の修飾又は結合に用いてもよい。この実施形態では、このとき、明らかに結合は共有結合である必要はなく、非共有結合も含みうる。上記方法は、相補的官能基を担持する小分子と一緒に、必要な化学官能基を含む非天然アミノ酸を担持するタンパク質及びペプチドをディスプレイするファージを作製することにより、あるいは、選択／単離段階後に分子を作製する場合には、化学的又は組換えにより合成したポリペプチドに非天然アミノ酸を組み込むことにより、チオール媒介方法の代わりに（又はこれと組み合わせて）用いることもできる。
ファージ上のペプチド及びタンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸は、以下のもの含んでもよい：1）ヒドラジン、ヒドロキシルアミン及びそれらの誘導体と特異的に反応させることができるケトン官能基（例えば、パラ又はメタアセチル−フェニルアラニンに存在するもの）（Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli. Wang L, Zhang Z, Brock A, Schultz PG. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 7；100(1):56-61; Bioorg Med Chem Lett. 2006 Oct 15；16(20):5356-9. Genetic introduction of a diketone-containing amino acid into proteins. Zeng H, Xie J, Schultz PG）、2）銅触媒「クリックケミストリー」若しくは系統促進（3+2）環化付加（cyloadditions）によりアルキンと反応して、対応するトリアゾールを形成することができるアジド（例えば、p-アジド-フェニルアラニンに存在するもの）（Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Chin JW, Santoro SW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7;124(31):9026-7；Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Deiters A, Cropp TA, Mukherji M, Chin JW, Anderson JC, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Oct 1;125(39):11782-3）、又はスタウディンガーライゲーション（Staudinger ligation）により、アリールホスフィンと反応して、対応するアミドを形成することができるアジド（Selective Staudinger modification of proteins containing p-azidophenylalanine. Tsao ML, Tian F, Schultz PG. Chembiochem. 2005 Dec;6(12):2147-9）、4）アジドと反応して、対応するトリアゾールを形成することができるアルキン（In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli. Deiters A, Schultz PG. Bioorg Med Chem Lett. 2005 Mar 1;15(5):1521-4）、5）1以上の適切に間隔をあけたヒドロキシル基を含む化合物と特異的に反応することができる、又はハロゲン化化合物とのパラジウム媒介結合を起こすことができる、ボロン酸（ボロネート）（Angew Chem Int Ed Engl. 2008；47(43):8220-3. A genetically encoded boronate-containing amino acid., Brustad E, Bushey ML, Lee JW, Groff D, Liu W, Schultz PG）、6）金属イオンと特異的に配位結合することができる金属キレート化アミノ酸（例えば、ビピリジルを担持するもの）（Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(48):9239-42. A genetically encoded bidentate, metal-binding amino acid. Xie J, Liu W, Schultz PG）。
非天然アミノ酸は、以下のものを担持するプラスミド又はプラスミドの組合せで大腸菌を形質転換することにより、ファージ上にディスプレイされるタンパク質及びペプチドに組み込むことができる：1）コドンに応答して非天然アミノ酸の組込みを指令する直交アミノアシル-tRNAシンテターゼ及びtRNA、2）非天然アミノ酸組込みの部位に、選択したコドンを含むように改変されたファージDNA又はファージミドプラスミド（Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Nov 18; 105(46):17688-93. Protein evolution with an expanded genetic code. Liu CC, Mack AV, Tsao ML, Mills JH, Lee HS, Choe H, Farzan M, Schultz PG, Smider VV; A phage display system with unnatural amino acids. Tian F, Tsao ML, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2004 Dec 15；126(49):15962-3）。直交アミノアシル-tRNAシンテターゼ及びtRNAは、メタン生成菌（Methancoccus janaschii）チロシル対又はシンテターゼ（Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Chin JW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20;99(17):11020-4）及びピロリシンを自然に組み込むtRNA対（Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Yanagisawa T, Ishii R, Fukunaga R, Kobayashi T, Sakamoto K, Yokoyama S. Chem Biol. 2008 Nov 24；15(11):1187-97；Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Neumann H, Peak-Chew SY, Chin JW. Nat Chem Biol. 2008 Apr;4(4):232-4. Epub 2008 Feb 179）に由来するものでよい。組込みのためのコドンは、アンバーコドン（UAG）、別の終止コドン（UGA、又はUAA）でもよいし、あるいは4塩基コドンであってもよい。アミノアシル-tRNAシンテターゼ及びtRNAは、既存のベクターから作製することができ、このようなベクターとして以下のものがある：pBK系のベクター、pSUP（Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Ryu Y, Schultz PG.Nat Methods. 2006 Apr;3(4):263-5）ベクター、及びpDULEベクター（Nat Methods. 2005 May;2(5):377-84. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Farrell IS, Toroney R, Hazen JL, Mehl RA, Chin JW）。用いられる大腸菌株は、F’線毛を発現する（一般にtraオペロンを介して）。アンバー抑制を用いる場合、大腸菌株自体は、活性アンバーサプレッサーtRNA遺伝子を含まない。アミノ酸は、好ましくは1mM以上の最終濃度で増殖培地に添加する。アミノ酸組込みの効率は、直交リボソーム結合部位を有する発現構築物を用いて、リボ-Xを含む遺伝子を翻訳することにより、高めることができる（Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Wang K, Neumann H, Peak-Chew SY, Chin JW. Nat Biotechnol. 2007 Jul;25(7):770-7）。これは、リガンドとの複数の結合部位をもたらす非天然アミノ酸の効率的多重部位組込みを可能にすることができる。
ファージ精製
ファージ精製のためのいずれの好適な手段を用いてもよい。標準的な技法を本発明に適用することができる。例えば、ファージは、濾過により、又はPEG沈殿などの沈殿により精製することができ、PEG沈殿の場合には、ファージ粒子を作製した後、以前記載されているように、ポリエチレン−グリコール（PEG）沈殿により精製することができる。
さらに詳細な手引きが必要な場合には、Jespersら（Protein Engineering Design and Selection 2004 17(10):709-713. Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries.）を参照にする。好適にはファージは、上記文献に教示されているように精製することができる。尚、上記文献の全文は、ファージ精製の方法についての参照として本明細書に明示的に組み込むものとし、特に、Jespersらの第709頁右欄の途中からの材料及び方法の節の始めの部分を参照にする。
さらに、ファージは、Marksら、J.Mol.Biol vol222、pp581-597により公開されているように精製してもよい。尚、上記文献は、ファージ作製／精製をどのように実施するかの具体的説明のための参照として本明細書に明示的に組み込むものとする。
さらに詳細な手引きが必要な場合には、ファージを以下のように還元し、精製することができる。約5 x 1012個のファージ粒子を1 mM ジチオトレイトール（DTT）と室温で30分にわたり反応させた後、PEG沈殿させる。水ですすいだ後、ペレットを1 mlの反応バッファー（10 mMリン酸バッファー、1 mM EDTA、pH 7.8）中に再懸濁させる。次に、ファージを任意で50μlの1.6 mM N-[(2-ヨードアセトキシ)エチル]-N-メチルアミノ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール（NBDIA）（Molecular Probes）と室温で2時間にわたり反応させるか、又はより好適には本明細書に記載の連結化合物と反応させる。反応は、ファージ粒子のPEG沈殿により停止する。
ファージを作製／精製することができるさらに別の方法は、Schreier及びCortese（A fast and simple method for sequencing DNA cloned in the single-stranded bacteriophage M13. Journal of molecular biology 129(1):169-72, 1979）に教示されている通りである。上記文献は、Sangerら（1977）のチェーンターミネーションDNA配列決定法を扱っており、この方法は鋳型として一本鎖DNAを必要とする。M13ファージDNAは、一本鎖として存在するため、M13にクローニングされるすべてのDNA配列は、この形態で容易に取得することができる。Schreier及びCorteseは、配列決定の鋳型として用いるのに十分純粋なM13一本鎖DNAが、ファージ粒子の簡単な遠心分離及びフェノールでの抽出により作製することができることを示している。Schreier及びCorteseの文献は、ファージの精製方法についての参照として本明細書に明示的に組み込むものとする。疑念を避けるために、フェノール抽出は核酸精製を目的とすることから、本発明の複合体の作製では実施しない。従って、Schreier及びCorteseのフェノールステップは除外するのが好適である。Schreier及びCortese方法は、精製されたファージ粒子の時点までしか実施しない。
従って、ファージの精製のための当分野で公知の様々な技術がある。本発明に関して、こうした精製は、連結化合物との結合のために（特に該結合がシステイン残基を介するものであるとき）目的のポリペプチドにおいて官能基を還元するのに用いた還元剤の除去のために用いる。
任意で、以下の反応化学の節で説明するように、ファージ精製のための特に有利な方法を採用してもよい。これらの方法は本発明に必須の要素として考えられるわけではないが、特に有用な方法、又は本発明のファージ粒子を作製する最良の方法を提供しうることに特に留意すべきである。しかし、連結化合物の結合前に、還元剤の除去段階でファージ上の還元官能基／反応基の再酸化の防止に注意を払うのであれば、これを達成するのに原則としてどのような方法を用いてもよい。記載する濾過方法が特に有効であるが、標準的方法より複雑でもあるため、技術者は、本発明の具体的作業に最も適した方法を選択すればよい。最も好適には濾過方法を用いる。
反応化学
三重結合連結化合物、すなわち本発明のポリペプチドコンジュゲート及びファージ粒子に関する概念上の見識に加えて、本発明者らは、生成物の遺伝的にコード化された部分の完全性を維持しながら、化学的結合を達成するために設定することができる一組の厳密な化学的条件も導き出した。ポリペプチドの修飾のための従来の技術は、過酷な化学及び独立したポリペプチド修飾反応を含むものであった。対照的に、本発明は、生成物の遺伝的にコード化された要素の機能及び完全性を有利に維持しながら、ポリペプチドの修飾のための新規な化学的条件を提供する。特に、遺伝的にコード化された要素が、これをコードするファージの表面にディスプレイされるポリペプチドである場合には、上記化学は、有利なことに、ファージの生物学的完全性を損なわない。本明細書には、こうした化学的反応を増強又は促進することができる限られた枠の条件があることを開示している。特に、以下にさらに詳細に説明するように、用いる溶媒及び温度は効率的反応に重要である。さらに、用いる試薬の濃度も、修飾しようとするポリペプチド部分の架橋又は損傷を改善又は排除しながら、正しい結合を促進するのに役立つ。
特に、最も効率的な反応には標的ポリペプチドにおけるシステインの還元が必要であることが開示される。明らかに、所望の結合を実施するためには、システインを化学的に還元するのに用いる還元剤を除去しなければならない。公知の方法の1つは、システインの還元にジチオトレイトール（DTT）を用いること、また、還元剤の除去のためには、ファージ粒子のような粒子を沈殿反応において沈殿させることである。こうした沈殿反応は、一般に、ファージ粒子の沈殿を引き起こす2.5 モルNaClと一緒に20％ポリエチレングリコール（PEG）を含む。しかし、本発明者らは、いくつかの実施形態では、これら特定の標準的条件が、恐らく還元されたシステイン残基の一部の再酸化のために、ポリペプチドにおけるシステイン残基と連結化合物との効率的反応をもたさなかったことを明らかにしている。これは、従来技術を理解しただけでは予測することができなかったことである。この標準的方法は、特に当業者が、開示されているように注意深く再酸化を評価／防止する必要性に敏感であれば、本発明において依然として用途が存在しうることに留意すべきである。しかし、本発明者らは、システインを還元状態に維持しながら、どのようにして還元剤を除去するかという難解な課題に取り組んできた。以下にさらに詳しく開示するように、解決策は、様々な戦略に見いだされ、そのようなものとして、トリスカルボキシエチル-ホスフィン、脱気バッファー、反応混合物におけるキレート剤の使用、及び好都合な化学的条件下で粒子を抽出するための濾過などがある。
例えば、連結化合物と標的ポリペプチドの結合のための反応条件を注意深く選択しなければならない。条件の選択は、本発明を適用する用途に応じて変化しうる。標的ポリペプチドがファージ粒子に含まれる場合には、特に注意を要する。手引きは本明細書及び実施例の節を通して提供する。
反応温度、連結化合物濃度、溶媒及び／又はpHなどの反応条件は、標的ポリペプチドの官能基と連結化合物との効率的反応を可能にし、しかも、ポリペプチドをコードする核酸を、単離された分子をデコード（例えば配列決定）する、並びに／あるいは該分子を増幅させる（例えば、PCRにより、若しくはファージ増殖により、又はその他の好適な技法により）条件において選択すべきである。さらに、反応条件は、ファージコートタンパク質を、これがファージを増殖させることを可能にする条件にしておくものでなければならない。
ファージにコードされるポリペプチドのチオール基は、連結化合物との結合の前に、還元剤で還元することができる。こうした実施形態では、特にファージディスプレイ実施形態、又は特に還元剤がTCEPであるとき、過剰の還元剤を、好適には濾過、例えばファージの濾過により除去する。これは、本発明者らが、PEG/NaCl沈殿のような還元剤の除去のための慣用的方法では、恐らく標的ポリペプチドの還元された官能性側基の再酸化のために、連結化合物との最適以下の反応を生じる可能性があることを初めて開示することから、特に有利である。従って、ポリペプチドの還元された（従って反応性の）官能基の優れた保存を達成することは、標的ポリペプチドを、還元の後、濾過による精製（還元剤の除去）によって作製する実施形態の利点である。
本発明において、コード化ポリペプチドを連結化合物に効率的に連結させると同時に、付加した核酸（及びファージコートタンパク質）を、その増幅又はデコードを可能にする条件において、反応条件を適用する。上記反応条件は、例えば、反応温度、連結化合物濃度、溶媒組成又はpHである。
本発明の一実施形態では、ポリペプチドを分子コアに連結させるためにシステイン残基のチオール基を官能基として用いる。いくつかの化学反応の場合、ポリペプチドのチオール基は還元する必要がある。ファージディスプレイされるポリペプチドにおけるチオール基は、例えば、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）のような還元剤の添加により効率的に還元する。過剰の還元剤は結合反応を妨害する可能性があるため、ファージの濾過により効率的にこれを除去する。
TCEPの除去後のチオール基の再酸化は、反応バッファーの脱気により防止するのが好適である。
また、チオール基の再酸化は、キレート化、例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）によるキレート化による金属イオンの錯体形成により防止しても好適である。
最も好適にはチオール基の再酸化は、キレート化及び脱気バッファーの使用の両方により防止又は阻止する。
本発明の一実施形態では、ポリペプチドと連結化合物との結合は、ポリペプチドの反応基、例えばファージにコードされるポリペプチドのチオール基を連結化合物と1時間にわたり反応させることにより達成する。
好適にはこれらを30℃で反応させる。
好適にはこれらを濃度10μMの連結化合物（例えば、トリス(ブロモメチル)ベンゼン）と反応させる。
好適には反応は水性バッファー中で行う。
好適には反応はpH8で行う。
好適には反応バッファーは、アセトニトリルを含む。好適には反応バッファーは、20％アセトニトリルを含む。
最も好適には反応は、前記条件の2つ以上を特徴とする。好適には反応は、前記条件の3つ以上を特徴とする。好適には反応は、前記条件の4つ以上を特徴とする。好適には反応は、前記条件の5つ以上を特徴とする。好適には反応は、前記条件の6つ以上を特徴とする。好適には反応は、前記条件の各々を特徴とする。
前記反応条件は、ポリペプチドのチオール基をトリス(ブロモメチル)ベンゼンの反応基と定量的に反応させるように最適化する。同じ反応条件下で、約20％のファージ粒子は、増幅及びデコードのために遺伝コードを細菌細胞に導入するように、依然として感染性のままである。
一実施形態では、連結化合物、例えばTBMBと、標的ポリペプチド、例えばファージにコードされるポリペプチドとの結合は、20％アセトニトリルを含む水性バッファー（pH 8）中で、濃度10μMのTBMB（すなわちトリス(ブロモメチル)ベンゼン）で、ポリペプチドのチオール基を30℃で1時間にわたり反応（インキュベーション）させることにより実施することができる。
本発明はまた、ファージ感染性に対する、反応物中の連結化合物の濃度の作用も開示する。特に、本発明は、好適には反応に用いる連結化合物の濃度を最小限にする。言い換えれば、常に十分な連結化合物がファージのポリペプチドと連結した状態になるのであれば、ファージのポリペプチドとの反応時に用いる連結化合物の濃度は低ければ低いほどよい。この方法において存在する連結化合物を最小限にする利点は、連結化合物の連結後のファージ感染性の優れた保存である。例えば、連結化合物がTBMBであるとき、連結化合物の濃度が100μMを超えると、感染性を損なう可能性がある。従って、好適には連結化合物がTBMBである場合、ポリペプチドとの結合時に存在するTBMBの濃度は100μMより低いのが好適である。最も好適には上記濃度は実施例の節に開示する通りである。
結合後修飾
いくつかの実施形態では、ポリペプチド−連結化合物複合体は、結合後の時点で修飾することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド要素は、連結化合物／分子コアに結合した後、タンパク質分解により切断される。切断により、連結化合物／分子コアに結合した異なるペプチド断片を有するリガンドが生成される。
例えば、ポリペプチドと分子コアの結合後、ポリペプチドの1以上のアミド結合をタンパク質分解により切断することができる。これは、短いポリペプチドを形成する利点を有し、その各々は、少なくとも1つの共有結合により連結化合物に結合しているが、異なる分子構造を呈示し、これらは、親ポリペプチドをコードする核酸を含む複合体中に保持される。ポリペプチドの切断は、好適には当分野で公知のあらゆる好適な手段、例えば制御加水分解、又はさらに好適には適切なプロテアーゼによる酵素切断によって触媒する。プロテアーゼは、任意の好適なプロテアーゼでよいが、好ましくは特定のポリペプチド認識配列又はモチーフを含むプロテアーゼである。これは、より限定的及び／又はより推定可能なポリペプチド切断生成物の作製を有利に達成する。実際に、上記実施形態では、プロテアーゼ認識配列は、例えば標的ポリペプチドをコードする核酸の操作により、体系的に付加したり、又は標的ポリペプチドから除去したりすることができる。これは、有利なことに、本発明に従いディスプレイされる分子において、より高度な制御をもたらし、しかも、より高度の多様性を達成することを可能にする。最も好適にはポリペプチドは、少なくとも1つのプロテアーゼ認識部位を含む。好適には各切断部位は、連結化合物との共有結合に用いられる、ポリペプチド上の官能基同士の間のアミノ酸配列内に含まれる。好適には各認識部位は、連結化合物との共有結合に用いられる、ポリペプチド上の官能基同士の間のアミノ酸配列内に含まれる。
ペプチドループは、好適には特定のアミノ酸位置でポリペプチドを認識してプロセシングするプロテアーゼ、例えばトリプシン（P1位置のアルギニン若しくはリシン）又はサーモリシン（P1位置の脂肪族側鎖）で切断される。酵素は、ディスプレイされる分子のペプチドループの効率的なプロセシングを可能にするが、ファージ粒子は残しておく濃度で用いる。最適な条件は、ポリペプチドループの長さ及び用いるプロテアーゼに応じて変化しうる。例えばトリプシンは一般に、TBS-Caバッファー（25 mM Tris HCl/137 mM NaCl/1 mM CaCl2、pH 7.4）中200 nMで、10℃で10分にわたり用いる。ディスプレイされるポリペプチドを修飾するのに適しているが、ファージは残す全種類のプロテアーゼがKristensen, P.及びWinter, G.（Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages Fold Des. 1998;3(5):321-8）に記載されている。ファージ上のペプチドの酵素プロセシングは「部分的タンパク質分解」となる場合もある。というのは、限られた数のファージコートタンパク質が切断されるのを除外することができないからである。従って、条件の最適化では、標的の最大限の切断と、ファージ粒子の最大限の保存との間の最良の均衡を好適に選択する。
好適には標的ポリペプチドは、少なくとも1つの上記タンパク質分解切断部位を含む。
好適には標的ポリペプチドは、少なくとも2つの上記タンパク質分解切断部位を含む。
好適には標的ポリペプチドは、少なくとも3つの上記タンパク質分解切断部位を含む。
前記タンパク質分解の実施形態の各々において、好適には第1プロテアーゼ部位は、標的ポリペプチドと連結化合物の間の第1共有結合に対し遠位に存在する。これは、連結化合物が複合体に保持されるという利点を有する。というのは、標識ポリペプチドが第1共有結合の前で切断されると、ポリペプチド−連結化合物複合体は、標的ポリペプチドをコードする核酸から分離されてしまうが、これは本発明の大部分の用途に望ましくないからである。
短いループ（短いとは、例えば6以下のアミノ酸残基を指す）の使用は、ループ内で切断するいくつかのプロテアーゼの能力を損なう可能性がある。この場合、プロテアーゼに接触する可能性が高い、より長いループを選択することが望ましいこともある。さらに、エンドプロテアーゼによるループの切断後に、別のエンドプロテアーゼで、あるいは実際にはエキソプロテアーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼ又はアミノペプチダーゼにより上記ループを切断しなおすのが望ましいこともある。
標的ポリペプチドが1以上のプロテアーゼ部位を含む場合、好適には部位の各々は、標的ポリペプチドと連結化合物との間に形成される2つの共有結合の間に存在する。必要であれば、結合同士の間に複数の切断部位が存在してもよい。
切断の実施形態では、好適には親ポリペプチドは、少なくとも3つの共有結合により連結化合物に結合しているか否かの評価のための完全体として考えられる。より好適には標的ポリペプチドは、それが少なくとも3つの共有結合により連結化合物に結合しているか否かを評価するとき、インタクトな（非切断）ポリペプチドであるとみなされる。このような非切断ポリペプチドは、典型的に二環式である。
合成
目的のポリペプチドを本発明に従い単離又は同定した後、可能な場合はいつでも、その後の合成を単純化することができることに留意すべきである。例えば、目的の配列を決定することができ、また標準的技法による合成で製造した後、in vitroでの連結化合物との反応を実施することができる。これを実施する場合、遺伝的にコード化された担体粒子の機能性又は完全性を保存する必要はもはやないため、標準的化学を用いてもよい。これにより、さらに下流の実験又は確認のための可溶性材料の高速大規模製造が可能になる。これに関して、候補又はリード材料の大規模製造は、Meloen及びTimbermanに開示されているような慣用的化学を用いて達成することができる。
従って、本発明はまた、本明細書に記載のように選択したポリペプチド又はコンジュゲートの製造であって、以下に説明するように任意の別のステップを含む、上記製造にも関する。最も好適には上記ステップは、ファージではなく、化学合成により製造された最終生成物ポリペプチド／コンジュゲートについて実施する。
任意で、例えば初期単離／同定ステップ後にコンジュゲート又は複合体を製造する場合には、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換してもよい。
記載される修飾／付加を説明するために、受容体と反応するポリペプチドの選択の例を考慮することは有用である。N-末端又はC-末端でペプチドを伸長するのが望ましいこともある。これは、例えば第2の標的に結合する線状尾部などの尾部を有する、1標的に結合する大環状ペプチドを製造する上で有用であると考えられ、このようなペプチドとして例えば以下のものがある：細胞貫通ペプチド（例：例えばVP22、HIV-Tatなどに由来するもの）、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）若しくは化学的に設計されたタンパク質（例：ポリアルギニン）、又は例えば（Chen及びHarrison Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4、p821 "Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracellular targets"）に記載されているその他のペプチド。これは、特定の標的、例えば細胞内標的に対して選択された大環状分子が細胞に進入するのを補助する又は可能にするという利点を有する。
ペプチドを伸長するために、標準的固相又は液相化学を用いて、該ペプチドのN-末端又はC-末端で該ペプチドを化学的に簡単に伸長することができる。標準的タンパク質化学を用いて、活性化可能なN-末端又はC-末端を導入してもよい。あるいは、断片縮合若しくはネイティブ化学ライゲーションにより、例えば（Dawson PE, Muir TW, Clark-Lewis I, Kent, SBH. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-77）に記載のように、又は酵素により、例えば（Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins Chang TK, Jackson DY, Burnier JP, Wells JA Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20;91(26):12544-8若しくはBioorganic & Medicinal Chemistry Letters Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003 Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics Hikari A.I. Yoshihara, Sami Mahrus and James A. Wells）に記載のようにサブチリガーゼを用いて、付加を実施することも可能である。
あるいは、ジスルフィド結合を介したさらなるコンジュゲーションによりペプチドを伸長又は修飾してもよい。これには、第1ペプチド及び第2ペプチドが、細胞の還元環境内で互いから1回解離するのを可能にするという別の利点もある。この場合、連結化合物（例えば、TBMB）は、3つのシステイン基と反応するように、第1ペプチドの化学合成中に付加することができ、次に別のシステインを第1ペプチドのN-末端に付加することにより、該システインが第2ペプチドの遊離システインとしか反応しないようにすることができる。
類似の技法を2つの二環式大環状分子の合成／連結に同様に適用する。
さらには、同じ方法で、適切な化学を用いて、N-末端若しくはC-末端での連結により、又は側鎖を介して別の薬物の付加も達成することができる。好適には連結は、いずれの物質の活性もブロッキングしないような方法で実施する。
従って、本発明はさらに、ポリペプチドのN-末端又はC-末端の1以上で該ポリペプチドを伸長するステップをさらに含む、前述の方法に関する。
従って、本発明はさらに、前記複合体又は前記ポリペプチド−連結化合物コンジュゲートを別のポリペプチドにコンジュゲートするステップをさらに含む、前述の方法に関する。
従って、本発明はさらに、前記コンジュゲーションが、以下のステップ：
（i）前記連結化合物との結合後、前記ポリペプチドに別のシステインを付加するステップ、及び
（ii）別のシステインとのジスルフィルド結合により、前記ポリペプチドを別のポリペプチドにコンジュゲートするステップ
により実施される、前述の方法に関する。
遺伝的にコード化される多様性
目的のポリペプチドは好適には遺伝的にコード化される。これにより、多様性の増大と共に、取り扱いやすさの利点がもたらされる。遺伝的にコード化されたポリペプチドライブラリーの一例は、mRNAディスプレイライブラリーである。別の例は、複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（rgdp）ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーである。好適には、目的のポリペプチドは、一般にファージディスプレイライブラリーとして遺伝的にコード化される。
従って、好適には本発明の複合体は、複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（rgdp）、例えばファージ粒子を含む。上記実施形態では、好適には核酸はファージゲノムに含まれる。上記実施形態では、好適にはポリペプチドはファージコートに含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明を用いて、遺伝的にコード化されたポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを製造することができ、該ポリペプチドは、いくつかの核酸を対応するポリペプチドに翻訳して、連結化合物の分子を該ポリペプチドに連結させることにより作製される。
遺伝的にコード化されたポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ又はmRNAディスプレイにより作製することができる。
好適には遺伝的にコード化されたポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーは、ファージディスプレイにより作製する。ファージディスプレイの実施形態では、好適には以下に記載する確立された方法に従いポリペプチドをファージ上にディスプレイする。最も好適にはこうしたディスプレイは、目的の標的ポリペプチドと、目的のポリペプチドの外部ディスプレイを可能にする操作遺伝子との融合により達成し、好適には上記操作遺伝子は、ファージの操作遺伝子9（p9すなわち遺伝子IX）、遺伝子8（遺伝子VIII）、遺伝子7（p7すなわち遺伝子VII）、遺伝子6（p6すなわち遺伝子VI）又は遺伝子3（p3すなわち遺伝子III）を含む。上記タンパク質は、連結化合物、例えばTBMBと反応する可能性があるシステインの含有数が少ないか、又は全く含まないという利点を提供する。p6の場合、システイン84をセリンに突然変異させるのが有利である。p7及びp9のシステインは恐らく埋没しているため、必ずしも突然変異させて除去する必要はない。p8はシステイン残基を含まないという利点を提供する。従って、さらに好適には前記操作遺伝子は、ファージの操作遺伝子8（遺伝子VIII）、遺伝子6（遺伝子VI）又は遺伝子3（遺伝子III）を含む。
最も好適には上記ディスプレイは、目的の標的ポリペプチドと、ドメイン1及びドメイン2のシステイン残基を欠失する操作遺伝子3タンパク質との融合により達成される。上記融合は、当分野で公知の任意の好適な方法、例えばファージ遺伝子IIIタンパク質をコードする核酸を操作して、システインをコードするコドンを、別のアミノ酸をコードするコドンに変更することにより、そして標的ポリペプチドをコードする核酸配列を、フレーム内の遺伝子IIIコード配列に挿入して、該ポリペプチドがファージ粒子の外部に遺伝子III融合タンパク質としてディスプレイされるようにすることにより、達成することができる。
得られる操作遺伝子がファージを感染性にする、すなわち感染及び増殖が可能にしておくことは本発明の利点である。操作された遺伝子が遺伝子3以外の遺伝子（例えば遺伝子6又は遺伝子8）であるときでも、やはり遺伝子3を操作して、1以上のシステイン残基（例えば全てのシステイン残基）を除去するのが望ましいこともある。
好ましい実施形態では、本発明の遺伝的コード化ポリペプチドは、核酸を翻訳した後、作製したポリペプチドを前記コードと関連付けることにより作製する。表現型と遺伝子型の連結により、コード化されたリガンドレパートリーを増幅又はデコードすることが可能になる。ポリペプチドをそのポリヌクレオチドコードと関連付けるために、様々な方法が利用可能である。こうした技法として、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、酵母ディスプレイ及び細菌ディスプレイなどがある。1013までの個別メンバーを含む、コード化されたポリペプチドレパートリーが前記の方法で作製されている。本発明に従い作製することができる個別リガンドの数は、慣用的スクリーニングで一般にアッセイされる個別分子の数を明らかに上回っている。
好ましい実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いて、本発明のポリペプチドを遺伝的にコードする。ファージディスプレイは、ポリペプチドの遺伝子をファージコートタンパク質の遺伝子に融合させる方法である。ファージを細菌細胞において作製する場合には、ポリペプチドをコートタンパク質の融合物として発現させる。ファージ粒子の集合時に、ポリペプチドがファージの表面上にディスプレイされる。ファージレパートリーを固定化抗原と接触させると、いくつかのファージは抗原に結合したまま残るが、他のファージは洗浄により洗い流される。ファージを溶離して、増殖させることができる。選択したファージのポリペプチドをコードするDNAを配列決定する。ファージディスプレイを用いて、1010を超える個別ポリペプチドをコードすることができる。ファージディスプレイの好ましい態様は、遺伝コードである一本鎖DNAをコート内にパッキングすることである。上記コートは、分子コアとの反応からDNAを保護することができる。
別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドライブラリーを遺伝子3タンパク質融合物としてファージ上にディスプレイする。各ファージ粒子は上記ファージコートタンパク質の約3〜5コピーを有する。修飾ポリペプチドの複数コピーのディスプレイの結果、マイクロモル程度の親和性を有するリガンド（弱いバインダー）もファージ選択において単離することができる。あるいは、ファージミドを用いて、ファージ当たりのポリペプチドの数を減少させることにより、結合活性作用を回避して、より高度の親和性を有するリガンドを選択する。
別の好ましい実施形態では、修飾コートタンパク質を含むファージを、本発明のポリペプチドライブラリーをコードするために用いる。特に、コートタンパク質において特定タイプのアミノ酸が欠失した又はその数が少ないファージを用いる。上記コートタンパク質は、分子コアが上記特定タイプのアミノ酸に対して反応性であるとき、有利となる可能性がある。これは、分子コアを架橋するための、ディスプレイされるポリペプチドの官能基が天然アミノ酸であり、同じタイプの天然アミノ酸がファージコートの表面露出領域に存在する場合に明確とである。修飾コートタンパク質を含む上記ファージを使用すれば、複数ファージのアミノ酸と上記分子コアとの反応によるファージ粒子の架橋を防止することができる。さらに、上記ファージを用いることにより、ポリペプチド中の官能基及びファージコートタンパク質のアミノ酸側鎖の両者と、上記分子コアとの架橋を低減することもできる。
さらに別の好ましい実施形態では、ドメイン1及びドメイン2におけるジスルフィド架橋C7-C36、C46-C53、C188-C201のシステイン残基を欠失する遺伝子3タンパク質を含むファージを用いて、本発明のポリペプチドライブラリーをディスプレイする。上記位置（C7C、C36I、C46I、C53V、C188V、C201A）における突然変異と、低下した熱安定性を補償するための遺伝子3タンパク質における14の追加突然変異（T13I、N15G、R29W、N39K、G55A、T56I、I60V、T101I、Q129H、N138G、L198P、F199L、S207L、D209Y）を含むファージが、Schmidt F. X.らにより作製された（Kather, I.ら、J. Mol. Biol., 2005）。ポリペプチドと分子コアを架橋するための官能アミノ酸の1以上がシステイン残基であれば、前記副次的コートタンパク質においてチオール基を含まないファージが適している。ファージコートタンパク質におけるシステイン残基の除去により、ポリペプチドと連結化合物との結合反応に対するシステイン残基の妨害を防止する。
本発明に適用するための上記ファージ例について以下にさらに詳しく説明する。
FX Schmidのジスフィルド不含ファージ（ドメインD1-D2）は、ベクターfCKCBS（Krebber, C., 1997, J. Mol. Biol.）由来のfdファージを含む。ベクターfCKCBSは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ATCC: 15669-B2）から取得したfdファージベクターに基づく。
野生型fdファージのp3のドメイン1及びドメイン2のアミノ酸配列は、例えばPubMedデータベースにおいて一般に入手可能である。参照のために、配列例を以下に挙げる：
AETVESCLAKPHTENSFTNVWKDDKTLDRYANYEGCLWNATGVVVCTGDETQCYGTWVPIGLA
IPENEGGGSEGGGSEGGGSEGGGTKPPEYGDTPIPGYTYINPLDGTYPPGTEQNPANPNPSLEES
QPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGTVTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDCAF
HSGFNEDPFVCEYQGQSSDLPQPPVNAPSG。
FX Schmidらは、4つのアミノ酸を突然変異させることにより、前記ファージのp3を進化的に安定化させた（Martin, A.及びSchmid, FX., 2003, J. Mol. Biol.)。これに続く研究で、FX Schmidらは、6つのシステインを突然変異させて、3つのジスルフィド架橋を除去した後、別の突然変異を挿入することにより、安定性の損失を補償した（Kather, I.及びSchmid FX., 2005, J. Mol. Biol.）。複数の進化サイクルにおいて、クローン19、20、21、及び23を作製し、これらはすべてジスフィルド不含のp3を有し、その熱安定性は異なっている。
実施例の節でさらに詳しく説明するように、突然変異体21（「クローン21」）は記載のように作製することもできるし、又はFX Schmidらから簡単に取得することができる。FX Schmidの文献によれば、上記クローンは、ドメイン1及びドメイン2に以下の突然変異を含む：C7S、T13I、N15G、R29W、C36I、N39K、C46I、C53V、G55A、T101I、Q129H、C188V、F199L、C201A、D209Y。さらに、本発明者らは、上記クローンを配列決定し、それを野生型fdファージと比較したとき、ドメイン1及びドメイン2に突然変異：P11S及びP198Lを見出した。理論に束縛されるわけではないが、上記突然変異は、ベクターfCKCBSのファージにすでに存在していたと想定される。
クローン21のドメインD1及びドメインD2は、以下のアミノ酸配列を有する：
AETVESSLAKSHIEGSFTNVWKDDKTLDWYANYEGILWKATGVVVITGDETQVYATWVPIGLA
IPENEGGGSEGGGSEGGGSEGGGTKPPEYGDTPIPGYIYINPLDGTYPPGTEQNPANPNPSLEES
HPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGTVTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDVAF
HSGFNEDLLVAEYQGQSSYLPQPPVNAPSG。
本発明はまた、本発明に従い作製したライブラリーに関する。
本発明は、本発明の複合体に対する分子若しくは物質の結合（又は結合への影響）についてのスクリーニングに適用することができる。本発明の複合体の一例は、連結化合物が結合した標的ポリペプチドである。当業者は、任意の慣用的スクリーニング形式を採用することができる。用いる具体的形式は、技術者の目的に応じて変わりうる。例えば、ハイスループットスクリーニングが所望の場合には、高密度で、高速の転換及び操作の簡易性が最も重要であろう。典型的にはファージパニング、ｍRNAディスプレイなどのような技法を、それらが当分野で適用されているように、本発明に適用することができる。本発明の重要な利点は、目的のポリペプチドに対する連結化合物の三重共有結合であり、得られる複合体をスクリーニングする具体的形式（あるいは別の相互作用の候補モジュレーターとしての、又は別のスクリーニングにおける、該複合体の使用）は、本発明を実施する者の選択の問題である。
一実施形態では、スクリーニングは、本発明のライブラリーを標的リガンドと接触させた後、該リガンドに結合する1以上のライブラリーメンバーを単離することにより実施する。
別の実施形態では、前記ライブラリーの個々のメンバーをスクリーニングにおいて標的リガンドと接触させた後、該標的リガンドに結合するライブラリーのメンバーを同定する。
別の実施形態では、前記ライブラリーのメンバーを同時に標的リガンドと接触させた後、該標的リガンドに結合するライブラリーのメンバーを選択する。
標的リガンドは、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、DNA又はRNAとすることができる。
標的リガンドは、受容体、受容体リガンド、酵素、ホルモン又はサイトカインなどである。
標的リガンドは、原核生物タンパク質、真核生物タンパク質、又は古細菌タンパク質でよい。より具体的には、標的リガンドは、哺乳動物タンパク質又は昆虫タンパク質又は細菌タンパク質又は真菌タンパク質又はウイルスタンパク質でよい。
標的リガンドは、酵素、例えばプロテアーゼとすることができる。より具体的には、標的リガンドは、エラスターゼ、血漿カリクレイン、カテプシンG又はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子でよい。
本発明はまた、本発明に従いスクリーニングから単離されるライブラリーメンバーも包含することに留意すべきである。好適には本発明のスクリーニング方法は、本発明の複合体に結合することができるものとして単離されるある量のリガンドを製造するステップをさらに含む。スクリーニングを反対の形式で実施する場合（すなわち、本発明の複合体を、用意したリガンドに結合する能力により同定するとき）、好適には本発明のスクリーニング方法は、上記リガンドに結合することができるものとして単離されるある量の本発明の複合体を製造するステップをさらに含む。
本発明はまた、本発明に従いスクリーニングにより単離される、又は単離することができるライブラリーメンバーにも関し、上記メンバーは後に、本発明の複合体の一部として上記ポリペプチドをコードした核酸をそれ以上用いることなく、作製／製造される。例えば、好適な本発明の方法は、連結化合物をポリペプチドに結合させることによって、本発明の方法により単離又は同定されるある量のポリペプチドを製造する別のステップをさらに含み、上記ポリペプチドは、組換えにより発現されるか、又は化学的に合成される。例えば、上記実施形態でポリペプチドを組換えにより合成する場合には、本発明の複合体の一部としての、上記ポリペプチドを本来コードする核酸はもはや直接存在しないが、中間ステップ、例えば、複合体の本来の核酸のPCR増幅又はクローニングステップには存在していたと考えられ、これにより、ポリペプチドを追加ステップにおいて合成することができる鋳型核酸の作製が達成される。
さらなる利点
複合体自体が増幅可能であることは本発明の利点である。従って、本発明の複合体又はライブラリーは、増幅−選択−（所望であれば反復して）−濃縮することができる。これは、単一ラウンドの選択後にデコンボリューション（deconvoluted）する必要がある従来の技法とは対照的である。
本発明は、有利なことに、非常に大きなライブラリーを構築し、スクリーニングすることを可能にする。
好適には連結化合物は可変性又は剛性のいずれでもよく、さらに好適には連結化合物は剛性である。これは、生成物分子に対する分子制約が大きくなるという利点を有する。
いくつかの実施形態において、連結化合物は、3以上の結合で分子を保持することにより該分子を制約するだけでなく、スカフォールドとして作用することによっても保持する。ペプチドのアミノ酸は、スカフォールドと相互作用して、密な構造を形成することができる。この現象は、CDRのアミノ酸がスカフォールドのアミノ酸と相互作用する抗生物質にも見出されることがある。従って、本発明は、コンジュゲートしたポリペプチド、例えばファージ粒子に含まれるものに上記の有利な特徴を初めて賦与するものである。
いくつかの実施形態では、対称形状を有する連結化合物を用いる。これは、生成物混合物（例えば異性体）ではなく、単一生成物が得られるという利点を有する。
少なくとも3つの共有結合を介して連結化合物をペプチドに連結させるために合成反応が確立されている。従来の化学反応条件を、遺伝的にコード化されたペプチドに容易に適用することはできない。本発明者らは、感染性を有利に保存しながら、コンジュゲーションに適用することができる一組の具体的条件を開示する。
特に、ペプチド＋化学物質（すなわちペプチド＋連結化合物）の組み合わせについて、直接の読み取りが得られることは本発明の利点である。
増幅させやすい合成化学ライブラリーを創出することは本発明の利点である。言い換えれば、従来の技術では、目的の小分子を増幅／読み取ることは不可能な方法で化学ライブラリーを創出していた。すなわち、この方法では、核酸が従来の化学ライブラリーに存在していたとしても、成長／増幅は可能ではなく、ハイブリダイゼーション又は他の同様の技術しか可能ではなかった。
同様の利点は、本明細書に記載の方法、例えば、連結化合物をポリペプチドに連結させるのに用いる化学的条件からも得られ、上記条件は、有利にも、複合体がファージ粒子を含む場合、複合体の感染性を保存する。
さらなる用途
本発明はまた、分子コアに結合したポリペプチドを含む遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーを作製する方法であって、（a）分子コアとの共有結合を形成することができる官能基を含むポリペプチドの遺伝的にコード化されたライブラリーを作製するステップ、（b）少なくとも3つの共有結合により上記ライブラリーを上記コアに化学的に連結させるステップを含む、上記方法も提供する。
広義の態様では、本発明は、該ポリペプチドに結合した連結化合物を含むポリペプチドであって、該連結化合物が、少なくとも3つの異なる共有結合により上記ポリペプチドに結合している、上記ポリペプチドに関する。特に、本発明は、本発明の方法により取得可能であるか、又は取得される上記ポリペプチドに関する。
本発明はまた、薬物又は薬物標的として用いるためのペプチド模倣物又は小分子模倣物の設計及び／又は選択にも適用することができる。
本発明はまた、遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーを作製する方法及びそのリガンドを単離する方法も提供する。
本発明は、DNA配列決定からの標的ヒットの同定、及び該標的ヒットのペプチドにおける共通配列の同定、並びにその後の上記ペプチドの合成に適用することができる。例えば、共通ペプチドは、この分析により設計することができ、該共通ペプチドは、スクリーニング段階から回収したヒットのいずれかと必ずしも同一ではないアミノ酸配列を含んでもよく、その後この共通ペプチドを本発明に従い合成することができる。
前記複合体はファージ粒子を含んでいてもよい。
従って、遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーを作製する方法であって、上記ライブラリーが、少なくとも3つの共有結合により分子コアに結合しているポリペプチドを含む、上記方法が提供される。また、前記方法で作製されるライブラリーも提供される。さらに、前記ライブラリーを標的リガンドと接触させて、該リガンドに結合するメンバーを単離する方法が提供され、該方法で作製されるライブラリーメンバーも同様に提供される。
WO 2004/077062及びWO 2006/078161の公知の方法とははっきりと対照的に、本発明は複合体の大きなライブラリーの作製及びアッセイのための方法を提供する。WO 2004/077062及びWO 2004/077062によれば、数百又は数千の化合物を作製及びスクリーニングする公知の方法が提供されている。本発明は、化合物ライブラリーを遺伝的にコードするための方法を提供する。これにより、数百万、数十億以上の個別化合物を作製して、アッセイすることができる。
WO 2004/077062及びWO 2006/078161の公知の方法とは対照的に、in vitro選択原理を用いることにより、単一の反応コンパートメントにおいて大きな化合物ライブラリーをアッセイする方法を提供する。WO 2004/077062及びWO 2006/078161に従い作製される化合物とは対照的に、本発明の複合体は、単離される複合体の同定を可能にする核酸を含み、好適には該核酸は上記複合体のポリペプチドをコードする。
本発明は、例えば、ファージ粒子のような複合体の核酸を残す、特にファージ粒子の感染性を残す、反応条件、例えば連結化合物濃度、反応時間、反応温度などを提供する。言い換えれば、本明細書に示す化学は、上記複合体の核酸の機能を保存すると共に、該複合体の生物学的機能を保存する。ファージ粒子を含む複合体の実施例では、本明細書に示す化学は、有利なことに、ファージ粒子の保存される機能性を増強し、複合体形成後に核酸の増幅にこれを用いることを可能にする、又はその可能性をさらに高くする。
本発明はまた、記載される方法で作製される、遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化合物ライブラリーも含む。
本発明はまた、連結化合物に結合した三環式ポリペプチドにも関する。上記ポリペプチドは、例えば本発明の連結化合物に結合した二環式ポリペプチドのN-末端とC-末端を結合することにより形成することができる。このようにして、結合したN-末端とC末端は第3のループを形成し、三環式ポリペプチドが作製される。この実施形態は、好適にはファージ上で実施されず、好適には本発明のポリペプチド−連結化合物コンジュゲート上で実施される。N-末端とC-末端の結合は、慣用的なペプチド化学の事項である。何らかの手引きが必要な場合には、C-末端を活性化するか、並びに／あるいはN-末端及びC-末端を伸長して、例えばシステインを各末端に付加した後、ジスルフィド結合により両者を結合してもよい。あるいは、N/C末端に組み込んだリンカー領域の使用により結合を達成してもよい。あるいはまた、慣用的ペプチド結合によりN-末端とC-末端を結合してもよい。これ以外にも、N-末端とC-末端を結合するための別の好適な手段を用いてもよく、例えばN-C-環化は、標準的方法、例えば以下の文献に開示されているような方法により実施することができる：Lindeら、Peptide Science 90, 671-682 (2008) "Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides"、又はHessら、J. Med. Chem. 51, 1026-1034 (2008) "backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4 receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treating obesity"。前記三環式分子の利点の1つは、特にエキソプロテアーゼ作用による遊離末端のタンパク質分解が回避されることである。この性質の三環式ポリペプチドの別の利点は、第3のループが、一般に適用可能な機能、例えばBSA結合、細胞進入若しくは輸送作用、タグ標識又はその他の類似用途に使用しうることである。前記第3のループは、一般に選択のために利用可能ではなく（なぜなら、これはファージ上で形成されるのではなく、ポリペプチド−連結化合物上でのみ形成されるからである）、従って、これを別の生物学的機能のために使用するので、有利なことにループ1及び2の両方は、特異性の選択／創出のために残っている。従って、本発明は、前記三環式ポリペプチド、その製造及び用途にも関する。
本発明はまた、遺伝的にコード化された化合物ライブラリーを標的リガンドと接触させる方法、及び上記標的リガンドに結合するリガンドを同定する方法も提供する。遺伝的にコード化された化合物ライブラリーはスクリーニング又は選択工程のいずれかによりアッセイする。
スクリーニング工程では、ライブラリーの個々のメンバーをアッセイする。例えば、ライブラリーの1メンバーの複数のコピーを標的リガンドと一緒にインキュベートする。ライブラリーのメンバーを接触させる前又は接触後に上記標識リガンドを固定化した後、非結合メンバーを洗浄により除去する。結合リガンドは、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）において検出する。標的リガンドに結合するライブラリーのメンバーのアミノ酸配列を遺伝コードの配列決定により決定する。
選択工程では、コード化された化合物ライブラリーの複数のメンバーを標的リガンドと接触させる。ライブラリーのメンバーを接触させる前又は接触後に上記標識リガンドを固定化した後、非結合メンバーを洗浄により除去する。結合リガンドの遺伝コードを配列決定する。あるいは、選択したリガンドを増幅して、さらなる選択ラウンドを実施する。
本発明の一実施形態では、化合物ライブラリーをファージディスプレイによりコードし、ファージパニングにより選択を実施する。
本発明の標的リガンドは、タンパク質、DNA、RNA又は多糖でよい。該タンパク質は、受容体、酵素、ホルモン、サイトカイン又はウイルスタンパク質でよい。考えられるタンパク質標的リガンドは、プロテアーゼであり、該プロテアーゼは、エラスターゼ、血漿カリクレイン、カテプシンG又はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子でよい。
本発明はまた、本発明の方法で単離される、コード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーも含む。上記メンバーは、遺伝コードと結合させて、又は結合させずに作製することができる。好ましい実施形態では、核酸が欠失した前記メンバーを薬物又は薬物リードとして用いる。
標的リガンドに結合することができる、コード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーの複数のメンバーを本発明の方法で単離した。前記メンバーは、メシチレンコアと、配列AC(X)6C(X)6CGを有するポリペプチドとから構成されており、上記ポリペプチドは、3つのチオエーテル結合を形成するシステイン残基を介して上記コアの環外メチル基に結合され、上記配列中、Xは天然アミノ酸を表し、Aはアラニンを、Cはシステインを、またGはグリシンをそれぞれ表す。上記メンバーのペプチド部分は、組換えにより発現させたものでもよいし、化学的に合成したものであってもよい。
本発明は、本発明のコード化コンビナトリアル化学ライブラリーから本発明の方法で単離されるヒト血漿カリクレインのインヒビターを提供する。上記インヒビターは、ポリペプチド配列：GCSDRFRNCPADEALCG、ACSDRFRNCPLWSGTCG、ACSTERRYCPIEIFPCG、ACAPWRTACYEDLMWCG、ACGTGEGRCRVNWTPCG又は関連配列のいずれかを有し、上記システインのチオール基はメシチレンコアに結合されている。
本発明はまた、本発明のコード化コンビナトリアル化学ライブラリーから本発明の方法で単離されるヒトカテプシンGのインヒビターも提供する。上記インヒビターは、ポリペプチド配列：ACEYGDLWCGWDPPVCG、ACIFDLGFCHNDWWNCG、ACLRAQEDCVYDRGFCG又は関連配列のいずれかを有し、上記システインのチオール基はメシチレンコアに結合されている。
本発明はまた、本発明のコード化コンビナトリアル化学ライブラリーから本発明の方法で単離されるヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のインヒビターも提供する。上記インヒビターは、ポリペプチド配列：ACNSRFSGCQIDLLMCG、ACSRYEVDCRGRGSACG又は関連配列のいずれかを有し、上記システインのチオール基はメシチレンコアに結合されている。
生物学的標的
多くの分子を試験するほど、所望の特性を有するリガンドを同定する見込みも増大することから、可能な限り多くの分子を創出して、アッセイすることが重要である。また、一般に、より高度の親和性を有するリガンドは、より大きな分子レパートリーをアッセイするときに得られる。
研究者らは、典型的に、スクリーニング又は選択方法を用いて分子を評価する。スクリーニングは、標的を修飾する能力について化合物を個別にアッセイするプロセスである。スクリーニング工程は多用用途であり、多様な構造を有する分子レパートリーのアッセイを可能にする。しかし、個別のアッセイによるスクリーニングは、時間がかかる可能性があり、特定の標的への結合について試験することができるユニークな分子の数は一般に106以下の化学物質である。対照的に、選択方法は一般に、はるかに多数の様々な分子のサンプリングを可能にする。従って、選択方法は、本発明の適用に、より好適に用いられる。選択工程において、分子は単一の反応容器中でアッセイし、好都合な特性（すなわち、結合）を有するものを不活性分子から物理的に分離する。同時に1013以上の個別化合物を作製して、アッセイすることができる選択戦略が利用可能である。有力な親和性選択方法の例として、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ又はRNA/DNAアプタマー方法がある。上記の生物学的in vitro選択方法は、リガンドレパートリーがDNA又はRNAによりコード化される点で共通している。上記方法は、選択したリガンドの増幅、及び配列決定による同定を可能にする。ファージディスプレイ技術は、例えば実質的にあらゆる標的に対して非常に高度の結合親和性を有する抗体の単離のために用いられている。
工業用途
本発明は、生物学、生物工学及び製剤学の分野において有用な分子の発見に適用することが可能である。特に、本発明は、薬物又は薬物リードの作製のための方法に関する。
本発明は、遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーの作製方法、及び該ライブラリーのメンバーの単離方法を含む。さらに、本発明は、上記方法で作製したライブラリー、及び該方法で単離したライブラリーのメンバーも含む。
本発明はまた、遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーの作製方法であって、上記ライブラリーのメンバーは、中心の分子コアと、該コアに付加される複数の多様性要素を含む、上記方法を提供する。上記遺伝的コード化ライブラリーは次の2つのステップにより作製される：第1ステップでは、分子コアとの共有結合を形成することができる官能基を含む、遺伝的コード化ポリペプチドライブラリーを用意する。第2ステップでは、遺伝的コード化ポリペプチドライブラリーを少なくとも3つの共有結合により上記分子コアに化学的に架橋させる。
本発明の遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーの分子は、様々な付加物により拡張されるコア構造を有する。生物学的方法で作製される最新式技術の遺伝的コード化コンビナトリアル化学ライブラリーとは違い、本発明のライブラリーは、非線状の分枝構造を有する分子を提供する。こうした分枝構造を有する分子は、中心コアから離れた位置に向かう複数の付加物の相互作用により標的に結合することができるため、標的リガンドとの結合に適している。
線状ポリマー構造とは対照的に、本発明の複合体は構造的可変性が低い。溶解状態で、それらは限られたセットの立体構造しか取らない。その結果、上記複合体又はポリペプチドと標的リガンドの結合は、著しいエントロピーの損失を伴わないため、高度の結合親和性を得ることができる。
本発明の複合体／ライブラリーのポリペプチドは遺伝的にコード化される。これにより、非常に有力な生物学的コード方法が可能になる。というのは、例えばファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ又はmRNAディスプレイをその作製に適用することができ、これにより、数百万、数十億又はそれ以上の個別メンバーを含むリガンドライブラリーを作製することが可能になるからである。
遺伝的にコード化されたコンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーのポリペプチド付加物の配列は変化しうる。例外は、分子コアにポリペプチドを架橋させるための官能基を保有するアミノ酸であるが、これについては以下にさらに詳しく説明する。ポリペプチド付加物は、非常に広範なコンビナトリアル多様性を含むことができる。標的リガンドに対する高親和性バインダーを単離する確率はライブラリーのサイズに応じて増加するため、大きなコンビナトリアルレパートリーを呈示することが重要である。
ポリペプチド、DNA又はRNAアプタマーのような線状バイオポリマーとは違い、本発明の遺伝的コード化コンビナトリアル化学ライブラリーの複合体及びメンバーは、複合体三次構造を形成しない。本発明の遺伝的コード化コンビナトリアル化学ライブラリーの複合体及びメンバーは、不可逆な変性による不活性化の危険性が大幅に低減するという利点を有する。従って、有利なことに、変性による凝集体の形成の可能性は低い。
本発明の遺伝的にコード化されたライブラリーは、好適には少なくとも105個の個別メンバーを含む。好ましくは、上記ライブラリーは、数百万又は数十億以上の個別メンバーを含む。上記ライブラリーのサイズは、ポリペプチドをコードする核酸を該ポリペプチドと連結させるのに用いられる方法により決定する。本発明の好ましい実施形態では、生物学的方法を用いて、遺伝的にコード化されたポリペプチドレパートリーを作製する。コードするポリヌクレオチドコードに連結させるポリペプチドの個別メンバーの数は、用いる方法に応じて1013を超えることもある。
以下の図面を参照しながら実施例により本発明を以下に説明する。
以下の実施例は、本来例示を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。
概観
実施例では、ファージにコードされるコンビナトリアル化学ライブラリーの製造について説明する。
生物学的標的に対して高度の親和性及び特異性を有する合成分子を見出すことは、薬物の発見における主要な課題である。近年in vitro選択方法を用いて、実質的にほとんどの標的に対する抗体又はアプタマーとして大きな分子構造物を単離することが可能になったが、高い親和性を有する有機小分子バインダーの作製は、依然として困難な課題であった。本発明では、ペプチド部分（例えばポリペプチド）で修飾した有機分子コア（連結化合物）から構築される小分子構造物の単離のための戦略を開示する。実施例では便宜のために、ファージディスプレイ技術を用いて、小分子のペプチド画分をコードし、非常に大きなコンビナトリアル化学レパートリーの作製及び選択を可能にした。反応条件は、3つのチオエーテル結合を介して、17アミノ酸のペプチドをベンゼン分子に選択的に結合（tether）させるが、ファージ粒子のコートタンパク質は残しておくように選択した。ミクロモル以下の親和性を有する高度に特異的なバインダーが、2つのヒトセリンプロテアーゼ、すなわち、血漿カリクレイン及びカテプシンGに対して得られた。見掛けkiが1.5 nMのヒト血漿カリクレインの親和性成熟インヒビターは、ヒト血漿中の接触活性化を効率的に抑制した。
実施例の背景
生物学的標的に対して高度の親和性及び特異性を有する分子は、多様な疾患に対する効率的かつ選択的な治療法を開発するために必要である。選択した標的に対する新規の有機小分子薬物を見出す方法は、一般に、標識を修飾する能力について化学物質の大きなライブラリーを試験する、ハイスループットスクリーニングを含む。しかし、上記方法は、時間及び費用がかかり、しかも特定の標的に対して試験することができるユニークな分子の数は一般的に百万以下の化学物質である。スクリーニングは往々にしてリードのみを提供し、これらは、後に実験的方法又は化学的設計のいずれかによりさらに改善する必要がある。結合分子を作製するさらに有力な方法は、生物学的in vitro選択方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ又はRNA/DNAアプタマー方法である。上記方法は、ポリペプチド、RNA又はDNAの大きなコンビナトリアルレパートリー（109〜1013）の高速作製、続いて、高親和性を有するバインダーの単離を可能にする。しかし、上記方法は抗体又はアプタマーのような大きなバイオポリマー構造に制限されていることから、小分子発見のためにそれらを用いることはできなかった。
コンビナトリアル化学ライブラリーにin vitro選択を適用する目的で、有機分子とその構造を指定するタグを結合させるための様々な方法が提案されている。ほとんどの手法で、親和性選択後に有機小分子を同定するためにDNAタグの使用が提案されていた。ビーズ上でユニークなヌクレオチド配列を有する化学物質の大きなライブラリーの個別々のメンバーをコードするためのパラレルコンビナトリアル合成の方法が提案されている（Brenner, S.及びLerner, R. A., PNAS, 1992）。化学物質を標的に結合した後、ヌクレオチドタグの配列決定により遺伝コードをデコードする。有機分子の小さなコレクションをDNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートして、様々な抗原による親和性選択が実施されている（Doyon, J. B.ら、JACS, 2003）。Neri D.らは、2本のDNA鎖のハイブリダイゼーションによる、小さなDNAにコードされる化学サブライブラリーの自己集合によって分子対の大きなレパートリーを作製した（Melkko, S.ら、Nature Biotechnol., 2004）。この方法は、小分子リガンドの親和性成熟に用いられ、成功している。Halpin D. R.及びHarris P. B.は、コンビナトリアル化学ライブラリーのin vitro進化の戦略を開発し、これは、選択した化合物の増幅により、複数の選択ラウンドを実施することを含む（Halpin, D. R.及びHarbury, P. B., PLOS Biology, 2004）。Woiwode T. F.らは、合成化合物のライブラリーをバクテリオファージ粒子のコートタンパク質に結合させることにより、化学構造の種類（identity）がファージのゲノムにコードされている（Woiwode, T. F., Chem. & Biol., 2003）。DNAにコードされる化学化合物を使用する上記戦略は全て、モデル実験において効率的であることが証明され、そのいくつかは新規の小分子バインダーをもたらしてもいる。しかし、大きな化合物ライブラリーのコード化、及び選択した化合物の増幅は、生物学的選択系における同等の手順よりはるかに多くの労力を要することが明らかになった。
本発明では、中心の有機小分子に結合（tether）した複数のポリペプチド断片から構築されるハイブリッドペプチド−小分子構造物をコードするための戦略を教示する。ペプチド部分はファージ粒子によりコードされるが、これは、非常に広範で複雑な多様性の生成及び選択を可能にする。本発明者らは、ペプチド断片を小分子に連結させるための以下の反応工程を構想した（図１に概略的に示す）。反応基を備える化学構造物をファージディスプレイされたペプチドと共にインキュベートする。ペプチド中の特定のアミノ酸（例えばシステイン）が小分子の官能基と反応して、共有結合を形成するが、最初の連結が、連続した連結を加速する。次いで、得られた分子を親和性選択に付す。あるいは、多環式構造の特定のペプチド結合を酵素により切断して、異なるペプチド物質で修飾された小さな化学構造物を取得する。ファージディスプレイされるポリペプチドレパートリーと小分子との結合は慣用的ではない。何故なら、単一生成物を取得するために、該反応は特異的かつ選択的である必要があるためである。また、反応体は、好適にはファージ粒子を損なわないようにすべきである。さらに、複数の部位を介してペプチドに小分子を連結させれば、生成物混合物が容易に生成されるか、又はファージ粒子同士が架橋する可能性があるため、複雑度のレベルがさらに上昇する。実際に、2以上の結合を介して、ファージにディスプレイされるポリペプチドに小分子を連結させた例は当分野で知られていない。
材料及び方法
ペプチド−D12融合タンパク質と化学スカフォールドの化学結合
N-末端で融合したペプチドNACGSGCGSGCGCを含む及び含まないg3pのドメインD1-D2（成熟fd-g3pのアミノ酸残基2〜217を含む）を大腸菌において発現させた。リーダー配列と、C-末端ヘキサヒスチジンタグ付きD1-D2遺伝子とを含むpUC119系発現ベクター（pUC119H6D12と称する）は、ケンブリッジにある分子生物学研究所（LMB）のPhil Holliger氏により親切にも提供された。N-末端ペプチドを有するD1-D2の発現用のプラスミドを、プライマーpepd12ba（ペプチド配列をコードする）及びd12foを用いたD1-D2遺伝子のPCR増幅、次いでSfiI/NotI消化pUC119H6D12との連結によりクローニングした。合計20個のアミノ酸突然変異を有するジスフィルド不含D1-D2の発現用の遺伝子は、ベイルート大学のInsa Kather及びFranz Xaver Schmidの両氏から親切にも提供された。上記遺伝子を、プライマー対d120ssba/d120ssfo、pepd120ssba/d120ssfo、P2cd120ssba/d120ssfo又はP1cd120ssba/d120ssfoのいずれかを用いて、ベクターfdg3p0ss21からPCR増幅した後、N-末端融合ペプチドNACGSGCGSGCGC、NAGSGCGSGCGC又はNAGSGKGSGCGCを含む及び含まないジスフィルド不含D1-D2の発現用のpUC119H6D12にSfiI/NotI連結させた。6つのタンパク質は全て、TG1大腸菌細胞において30℃で8時間にわたり発現させ、ペリプラズム画分をNi-アフィニティークロマトグラフィー及び20 mM NH4HCO3（pH 7.4）中、Superdex 75カラムでのゲル濾過により段階的に精製した。酸化スルフヒドリル基は、20 mM NH4HCO3（pH 8）中、1 mM TCEPと一緒にタンパク質（1〜10μM）を42℃で1時間インキュベートすることにより還元した。還元剤は、20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA、pH 8バッファーを用いて、10,000のMWCO（Vivascience、英国ストーンハウス）を有するビバスピン（vivaspin）20フィルターで除去した。上記タンパク質のチオール基を反応バッファー（20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA、pH 8、20％ACN）中の10μM TBMBと30℃で1時間インキュベートすることにより反応させた。非反応TBMBの除去及び濃縮のために、タンパク質をmicrocon YM-30（Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード）で濾過した。タンパク質の分子量（5〜10μM）を4容量の50％MeOH、1％ギ酸中での変性、及びエレクトロスプレーイオン化（Micromass、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いた飛行時間型質量分析により分析した。分子量は、MassLynxバージョン4.1を用いて多価タンパク質質量スペクトルをデコンボリューションすることにより取得した。ファージの存在下での化学的修飾反応の実施は、TCEP還元前にタンパク質に最終濃度1010 t.u.までPEG精製ファージを添加することにより試験した。ファージは、TBMB反応後、PD-10カラム（Amersham Pharmacia、スエーデン、ウプサラ）でのゲル濾過により取り出した。
ファージペプチドライブラリーの創出
配列Ala-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys、リンカーGly-Gly-Ser-Gly並びに2つのジスフィルド不含ドメインD1及びD2を含むセミランダムペプチドをコードする遺伝子を正しい配向でファージベクターfd0D12にクローニングして、ファージライブラリー1を取得した。遺伝子3のD1及びD2ドメインの遺伝子を欠失し、かつ第2のSfil制限部位を有するベクターfd0D12を、プライマーecoG3pNba及びpelbsfiecofoを用いたfdg3p0ss21の全プラスミドPCR増幅（Kather, I.ら、J. Mol. Biol., 2005）により事前に創出した。ペプチドレパートリーをコードする遺伝子と、遺伝子3の2つのドメインを2つの連続的PCR反応で段階的に創出した。第1に、D1及びD2の遺伝子を、2つのプライマーprepcr及びsfi2foで、ベクターfdg3p0ss21を鋳型として用いてPCR増幅した。第2に、上記ランダムペプチドをコードするDNAを、プライマーsficx6ba及びsfi2foを用いるPCR反応中に添加した。33及び9μgのSfil消化fd0D12プラスミドと、PCR生成物との連結により、12の20x20 cmクロラムフェニコール（30μg/ml）2YTプレート上に4.4x109のコロニーが形成された。2YT培地を含むプレートからコロニーをこすり取り、15％グリセロールを添加してから−80℃で保存した。グリセロール原液を1リットルの2YT/クロラムフェニコール（30μg/ml）培養物でOD600＝0.1まで希釈した後、ファージを30℃で一晩発現させた（12〜16時間）。
ファージディスプレイされるペプチドと小分子の化学結合
典型的には、1011〜1012 t.u.のPEG精製ファージを、20 mlの20 mM NH4HCO3（pH 8）中、1mM TCEP で42℃にて1時間にわたり還元した。ファージをvivaspin-20フィルター（MWCO 10,000）において4,000 rpmで回転させることにより、1 mlの量まで減少させ、10 mlの氷冷反応バッファー（20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA、pH 8）で2回洗浄した。還元したファージの量を反応バッファーで32 mlに調節した後、ACN中8 mlの50μM TBMBを添加して、最終濃度10 μMを取得した。反応物を30℃で1時間インキュベートした後、氷上で1/5量の20％PEG、2.5M NaClを用いたファージの沈殿、及び4,000 rpmでの30分の遠心分離により非反応TBMBを除去した。
ヒト血漿カリクレイン及びカテプシンGを用いたファージ選択
ヒト血漿カリクレイン（XIIa因子で活性化）をInnovative Research（米国ミシガン州サウスフィールド）から購入し、PBS（pH 7.4）／5％DMSO中、5倍モル過剰量のスルホ-NHS-LC-ビオチン（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を用いて、室温で1時間にわたり濃度1.2μMでビオチン化した。ビオチン化タンパク質を、50 mM NaAc（pH 5.5）、200 mM NaClのバッファーを用いて、PD-10カラムで精製した。容易にビオチン化されるヒトカテプシンGは、Lee Biosolutions（米国ミシガン州セントルイス）から購入した。ビオチン化抗原（5〜20μg）を50μl磁気ストレプトアビジンビーズ（Dynal、M-280、Invitrogen製；英国ペイズリー）と一緒に4℃で20分インキュベートした。抗原をコーティングしたビーズを洗浄バッファー（10 mM Tris-Cl、pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1mM CaCl2）で2回洗浄した後、1％BSA及び0.1％tween 20を含む0.5 mlの洗浄バッファー中で30分にわたりブロッキングした。化学的に修飾したファージ（典型的には 2 ml洗浄バッファーに溶解させた1010〜1011 t.u.）を、3％BSA及び0.3％tween 20を含む1 mlの洗浄バッファーの添加によりブロッキングした。3 mlのブロッキング済ファージをピペットで0.5 mlのブロッキング済磁気ビーズに添加し、回転輪上で、室温にてインキュベートした。ビーズは、0.1％tween 20を含む洗浄バッファーで8回、次に洗浄バッファーで2回洗浄した後、100μlの50 μMグリシン（pH 2.2）と一緒に5分インキュベートした。溶離したファージを中和のために50μlの1 M Tris-Cl（pH 8）に移し、OD600=0.4の50 ml TG1細胞と一緒に37℃で90分インキュベートした後、細胞を大きな2YT/クロラムフェニコールプレートに塗布した。同じ手順を用いて、さらに2ラウンドのパニングを実施した。第2ラウンドの選択では、ニュートラビジンをコーティングした磁気ビーズを用いて、ストレプトアビジン特異的ペプチドの濃縮を防止する。ニュートラビジンビーズは、供給者の指示に従って、0.8 mgのニュートラビジン (Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を0.5 mlトシル活性化磁気ビーズ（Dynal, M-280、Invitrogen製、英国ペイズリー）と反応させることにより調製した。
プロテアーゼインヒビターを同定するためのスクリーニング手順
第2及び第3ラウンドのバイオパニング後に選択したクローンのプラスミドDNAを、プライマー21seqba及びflagfoを用いて単一チューブでPCR増幅した後、SfiI及びNotI部位でベクターpUC119H6D12にクローニングして、C-末端FLAGタグ及びヘキサ−ヒスチジン−タグ付きのジスルフィド不含D1ドメイン及びD2ドメインに融合したペプチドのペリプラズム発現を実施する。連結したプラスミドをTG1細胞にエレクトロポレーションし、2YT/アンピシリン（100μg/ml）プレートに塗布した。組換えタンパク質を発現するクローンを以下のように同定した：96-ディープウェルプレート中の2YT/アンピシリン（100μg/ml）の1 ml培養物に個々のコロニーの細胞を接種した後、37℃でインキュベートした。培養物が濁ったら、タンパク質発現を1 mM IPTGで誘導した後、プレートを30℃で一晩300 rpmで振盪した。細胞を3,500 rpmで30分の遠心分離によりペレット化し、1 mg/mlリゾチームを含む洗浄バッファーで溶解させた後、3,500 rpmで旋回させることにより、細胞片をペレット化した。上清を非特異的吸着のために96ウェルpolysorpプレート（Nunc、デンマーク、ロスキレ）に移した。ウェルを0.1％ tween 20含有洗浄バッファーで2回すすいだ後、1％ BSA及び0.1％tween 20含有洗浄バッファーで1時間かけてブロッキングした。抗FLAG M2-ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）を1:5,000希釈してから、1％BSA及び0.1％tween 20を含む洗浄バッファーでブロッキングした後、プレートに1時間かけて添加した。ウェルを洗浄（0.1％tween 20含有洗浄バッファーで5回、デタージェントなしで1回）した後、結合したペルオキシダーゼをTMB基質溶液（eBiosciences、米国サンディエゴ）で検出した。タンパク質を発現するクローンのプラスミドDNAを配列決定した（Geneservice、英国ケンブリッジ）。選択したクローンを800 ml スケール上に発現させてから、Ni-アフィニティークロマトフラフィーにより精製した後、前述のようにゲル濾過に付した。前述した手順を用いて、ペプチドを化学的に修飾した後、280 nmで吸光度を測定することにより、生成物の濃度を決定した。様々な濃度の修飾ペプチド融合タンパク質（2倍希釈）をヒト血漿カリクレイン（0.1 nM）又はカテプシンG（20 nM）と一緒にインキュベートした後、10 mM Tris-Cl（pH 7.4）、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％BSA、0.01％triton-X100中で残留活性を決定することにより、IC50を測定した。ヒト血漿カリクレイン活性は、Spectramax Gemini蛍光プレートリーダー（355 nmで励起、460 nmで発光記録；Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）で濃度100μMの蛍光発生基質Z-Phe-Arg-AMC（Bachem、スイス、Bubendorf）を用いて測定した。ヒトカテプシンG活性は、Spectramax吸光プレートリーダー（410 nmで記録；Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）で、濃度1 mMの比色基質N-Suc-Ala-Ala-Phe-Pro-pNA（Bachem、スイス、ブーベンドルフ）を用いて測定した。
ヒト血漿カリクレインインヒビターの親和性成熟についてのファージ選択
3つのペプチドファージライブラリーを主にライブラリー1（前記参照）として創出したが、sficx6baの代わりに、縮重プライマーsficx6abc（ライブラリー2）、sficx6abb（ライブラリー3）及びsficx6aba（ライブラリー4）を用いて創出した。連結反応物のTG1細胞へのエレクトロポレーションにより、9.5x108（ライブラリー2）、1.1x109（ライブラリー3）及び1.2x109（ライブラリー4）の形質転換体を取得した。各ライブラリーのファージを1 Lの培養物中で産生させ、精製し、プールした後、TBMBと反応させた。3ラウンドのパニングを、本質的に前述の選択と同様に実施するが、より低い濃度のビオチン化ヒト血漿カリクレインを用いて実施した（第1及び第2ラウンドでは1 nM、第3ラウンドでは200 pM）。
二環式ペプチドの化学合成
N-末端に遊離アミン及びC-末端にアミドを有するペプチドを固相化学（JPT Peptide Technologies、ドイツ、ベルリン）により25 mgスケールで化学的に合成した。1 mlの60％NH4HCO3（pH 8）及び30％ACN（1 mM）中の粗ペプチドをTBMB（1.2 mM）と室温で1時間反応させた。流量2 ml/分でのACN及び0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液から構成される移動相を含むC18カラム及び勾配溶離を用いた逆相高速液体クロマトフラフィー（HPLC）により、反応生成物を精製した。精製したペプチドは、凍結乾燥した後、活性測定のためにDMSO、又は50 mM Tris-Cl（pH 7.8）、150 mM NaClのバッファーに溶解させた。
ヒト血漿カリクレインインヒビターの活性及び特異性
様々な濃度のインヒビター（典型的には、10μM〜0.5 pMの範囲）とのインキュベーション（30分、室温）時の酵素の残留活性を測定することにより、阻害活性（IC50）を決定した。ヒト血漿カリクレイン（0.1 nM）及びXIa因子（0.8 nM；Innovative Research、米国ミズーリ州サウスフィールド）の活性はZ-Phe-Arg-AMC（100μM）で、ヒトトロンビン（2 nM；Innovative Research、米国ミシガン州サウスフィールド）の活性は10 mM Tris-Cl（pH 7.4）、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％BSA、0.01％triton X-100及び5％DMSO中、Boc-Phe-Ser-Arg-AMC（100μM）で測定した。シグナルペプチドを含むR&D Systems（米国ミネソタ州ミネアポリス）製の組換えマウス血漿カリクレインを0.5 mg/mlサーモリシンでタンパク質分解により37℃で1時間活性化した。マウス血漿カリクレイン（3 nM）の活性は、50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、10 mM CaCl2及び250 mM NaCl、0.1％BSA、0.01％triton X-100及び5％DMSO中のZ-Phe-Arg-AMC（100μM）で測定した。1つの結合ループにおいて加水分解されるインヒビターは、TBMB修飾ペプチドPK15をヒト血漿カリクレインとモル比5：1で、37℃にて24時間インキュベートした後、該酵素を60℃で熱不活性化する（30分）ことにより作製した。Cheng-Prusoffの式（Cheng, Y.及びPrusoff, W. H., Biochem. Pharmacol., 1973）に従い見掛けKi値を計算した。
ヒト血漿における接触活性化の測定
個別ドナーからの正常なヒト血漿を3H Biomedical（スエーデン、ウプサラ）から購入した。血漿を1,500xgで20℃にて15分遠心分離して、乏血小板血漿（PPP）を取得した。PPPのアリコートを80℃でポリプロピレンチューブ中に保存した。5、50、500若しくは5,000 nMのアプロチニン（Roche、ドイツ、マンハイム）又はTBMB修飾ペプチドPK15を含む60μlのPPPのサンプルを調製した。20μlの1:10希釈アクチンFS（Dade Behring、ドイツ、マールブルグ）と、20μlの20 mM HEPESバッファー（pH 7.4）、100 mM CaCl2、50 mg/ml BSA及び1 mM Z-Gly-Gly-Arg-AMCを血漿サンプルに添加して、蛍光プレートリーダー（355 nmで励起、460 nmで発光記録；PHERAStar, Labtech、ドイツ、オッフェンブルグ）で蛍光強度をモニタリングすることにより、トロンビン活性化時間を37℃で測定した。XIIa因子及びヒト血漿カリクレインの活性化を以下のように測定した。2μgカオリンを血漿サンプルに添加し、よく混合して、37℃で20分インキュベートした。サンプルを50 mM Tris-Cl（pH 7.8）、150 mM NaClで250倍希釈した。吸光プレートリーダー（450 nmで吸光；Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）を用いて、血漿カリクレイン様活性を発色基質H-D-Pro-Phe-Arg-pNA（100μM；Bachem、スイス、ブーベンドルフ）で測定した。
TBMB修飾ペプチドPK15の構造決定
1 mgのTBMB修飾ペプチドPK15を550μlの10 mM重水素化Tris HCl pH 6.6、150 mM NaCl、10mM MgCl2、1 mM CaCl2に溶解させて、1 mMのインヒビター濃度を取得した。インヒビターのスペクトルを800 MHzで記録した（TCI cryoprobeを備えたBruker Avance）。スペクトル割当は、TOCSY及びNOESYスペクトルに基づくものである。距離制限は、NOESYスペクトルから得たものである。50の構造配座異性体（コンフォーマー）が算出された。プログラムPyMOLを分子モデルの構造解析及び視覚化のために用いた。
［実施例１］複合体の作製
本実施例では、ファージディスプレイされるペプチドと小分子の結合を説明する。本実施例のポリペプチドは、ファージディスプレイされるペプチドである。核酸はファージ粒子に含まれる。本実施例の連結化合物は小分子（本実施例ではTBMB）である。
3つのシステイン残基を含むペプチドをアンカーするためのスカフォールドとして小有機化合物トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を用いた（Kemp, D.S.及びMcNamara、P. E., J. Org. Chem, 1985; 図１Ｂ）。芳香族スカフォールドにコンジュゲートしたハロゲンアルカンは、室温で水性溶媒中のシステインのチオール基と特異的に反応する（Stefanova, H. I., Biochemistry, 1993）。Meloenらは、以前に複数のシステインを含むペプチドの固定化のためにブロモメチル置換合成スカフォールドを用いた（Timmerman, P.ら、ChemBioChem, 2005）。置換反応に必要な穏やかな条件は、ファージの機能性を残す上で好都合である（Olofsson, L.,ら、J. of Molecular Recognition, 1998）。システインの側鎖は20の天然アミノ酸のうち最も顕著な反応性を有することから、システインをアンカー点として選択した。また、システイン残基はファージコートのタンパク質において稀有である（pIII中に8つのシステイン、pVI、pVII及びpIX中に1つのシステイン；Petrenko, V. A.及びSmith, G. P., Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery, 2005）。TBMB分子の3回回転対称は、ペプチドにおける3つのシステインとの反応時にユニークな構造及び空間異性体の形成を確実にする。
次に、ファージ上のペプチドの修飾のための反応条件を入念に検討した。利用可能な方法で、ファージ上の化学修飾ペプチドを検出することは難しいと思われたため、マイナーファージコートタンパク質pIIIの2つの可溶性ドメインD1及びD2を含むN-末端融合物として、ペプチドNGCGSGCGSGCGCを発現させた後、質量分析法によりTBMBとの反応前及び反応後のタンパク質の分子量を分析した。ペプチド中の3つのシステインをスカフォールドに選択的に結合させ、しかもpIIIのD1ドメイン及びD2ドメインの3つのジスルフィド架橋（C7-C36、C46-C53、C188-C201）を残す試みは失敗した。これをきっかけに、本発明者らは、Schmidt F. X.ら（Kather, I.ら、J. Mol. Biol., 2005）により近年開発されたジスルフィド不含遺伝子-3-タンパク質を利用することにした。システイン不含gIIIタンパク質のN末端ドメインに融合したペプチドをトリス(カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）で還元した。還元剤はTBMBスカフォールドのブロモメチル基と反応することがわかったため、タンパク質へのTBMBの添加前にこれを除去した。TCEP除去後のチオール基の再酸化は、反応バッファーの脱気、及び5 mM EDTAでの金属イオンの錯体化により防止することができた。チオール基と様々な濃度のTBMBとの反応及び生成物の質量分析から、濃度10μMのTBMBが、30℃で1時間のペプチドの定量的修飾に十分であることが明らかになった。主として1生成物が予想した分子量（Δ予想質量＝114 Da；図２Ａ）で形成された。融合ペプチドを含まないジスルフィド不含D1-D2をTBMBとインキュベートしたところ、その質量は変化しなかったが、これは、別のアミノ酸との非特異的反応が起こっていないことを示している。ファージ粒子を反応物に添加した（ミリリットル当たり1010 t.u.）ところ、容器中の高密度のファージコートタンパク質がペプチドとTBMBとの反応を妨害しないことが明らかになった。意外にも、2つのシステイン残基のみを含むペプチド（NAGSGCGSGCGC-D1-D2）とTBMBの反応により、残るブロモメチル基とN-末端の1級アミンとの反応に一致する分子量の生成物が得られることがわかった（図７Ａ及び図７Ｂ）。同様に、1システイン及び1リシンを含むペプチド（NAGSGKGSGCGC-D1-D2）とTBMBの反応により、リシン及びN-末端の1級アミンが、残る2つのブロモメチル基と反応するときに予想される分子量が得られることがわかった（図７Ｃ及び図７Ｄ）。
次に、TBMBで修飾したファージがまだ細菌に感染することができるか否かを試験した。反応物中のTBMB濃度が高ければ高いほど、感染性のままであるファージは少ないことを見出した（図２Ｂ）。ペプチドの定量的修飾を可能にする反応条件（10μM TBMB、30℃で1時間の反応）では、感染性ファージの数は5倍減少した。
［実施例２］スクリーニング
本実施例は、ヒト血漿カリクレイン及びカテプシンGのインヒビターの親和性選択を示す。
ファージにコードされるペプチド−小分子ハイブリッド構造物を選択する実現可能性について、2つのヒト抗原：血漿カリクレイン及びカテプシンGを用いて試験した。複雑度が4.4x109変異体のマイナーコートタンパク質pIII上にペプチドをディスプレイするファージのライブラリーを創出した。ペプチドは、3つのシステインにより挟まれた6つのランダムアミノ酸の2つの配列（Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys；図３Ａ）を含むように設計した。シグナル配列の正しいプロセシングを確実にするため、アラニンをペプチドのN-末端に付加した。Gly-Gly-Ser-Glyリンカーを第3システインと遺伝子-3-タンパク質との間に配置した。ジスルフィド不含遺伝子-3-タンパク質を含むファージは野生型ファージと比較して感染性が約100倍低かったため、大量のファージ粒子を作製した。1リットルの培養物を30℃で一晩インキュベートすることにより、典型的には1011〜1012個の感染性粒子が得られた。約1012個の精製感染性ファージ粒子をTBMBスカフォールドで化学的に修飾した後、2つのビオチン化プロテアーゼのいずれかと一緒にインキュベートした。結合ファージを磁性ストレプトアビジンビーズ上に捕捉し、さらなる2回の選択ラウンドに付した。第2又は第3選択ラウンドで捕捉されたファージの数の増加は、特定のバインダーが濃縮されたことを示していた。ペプチドの配列決定から、ループの一方又は両方のいずれかにおいて様々な共通配列が明らかになった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。選択ペプチドのDNAを集団PCRにより増幅した後、D1-D2融合タンパク質としてのペプチドのペリプラズム発現のための新規プラスミドに挿入した。別の選択クローンとの配列類似性を示すか又は多数のコピーに存在するペプチド融合タンパク質を発現させ、精製し、化学的に修飾した後、その阻害活性について試験した。最良の血漿カリクレイン及びカテプシンGインヒビターは、D1-D2融合物として試験したとき、IC50がそれぞれ400 nM（PK2及びPK4）及び100 nM（CG2及びCG4）であった。
［実施例３］スクリーニング
本実施例では、ヒト血漿カリクレインインヒビターの親和性成熟について説明する。ヒト血漿カリクレインに対して選択したクローンのアミノ酸配列の比較から、様々なクローン群が、主に潜在的結合ループの1つにおいて高度の配列類似性を有することが明らかにされた。本発明者らは、二環式分子が保存結合ループと主に相互作用しているのに対し、多様なアミノ酸組成を有するループは、プロテアーゼとの最適な相互作用の達成まで進化しなかったと想定した。従って、新規のファージライブラリーは、血漿カリクレインを用いた選択で見出された3つの共通領域の1つの配列を含むループと、6つのランダムアミノ酸を含むループの両方を有するペプチドで創出した（図４Ａ）。より低い抗原濃度（1 nM〜200 pM）を用いた、より高い選択圧でのファージパニングにより、第2相互作用ループ中に共通配列を有するクローンを取得した（図４Ｂ）。阻害アッセイから、D1-D2融合物として試験したとき、最良のインヒビター（PK15）のIC50が、約20倍改善した（20 nM）ことがわかった。
［実施例４］複合体の特定決定
化学的に合成したインヒビターの活性及び特異性を調べた。
一次選択で単離した4つの最良のヒト血漿カリクレインインヒビター（PK2、PK4、PK6、PK13）、並びに親和性成熟選択からの最良のインヒビター（P15）の合成ペプチドを固相合成により作製した。ペプチドは、ファージディスプレイされるペプチドの電荷及び化学的環境を厳密に呈示する目的で、N-末端に遊離アミノ基を含むアラニンを、またC-末端にアミド化グリシンを有するように設計した。合成TBMB反応ペプチドは、対応するTBMB反応D1-D2融合ペプチドより約10倍低いIC50を有することがわかった（表Ａ ；図５）。D1-D2融合物としてのペプチドの親和性が低いのは、該ペプチドと遺伝子-3-タンパク質ドメインとの分子内結合、従って、低い見掛けインヒビター濃度に起因するものであろう。TBMB修飾ペプチドPK15の見掛けKiをCheng-Prusoffの式で計算したところ、1.5 nMであることがわかった（Cheng, Y.及びPrusoff, W. H., Biochem. Pharmacol., 1973）。線状、すなわち非制約ペプチドのIC50は、TBMB修飾ペプチドより少なくとも250倍高かった（表Ａ）。
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ヒト血漿カリクレインとインキュベートしたインヒビターの質量分析は、18 Daの質量減少を示したが、これは、インヒビターのループの1つにおけるペプチド結合が加水分解されたことを示唆している。カリクレイン処理インヒビターの阻害活性（IC50）は、インタクトな二環式TBMB修飾ペプチドPK15と同じくらい優れていた。
マウス血漿カリクレイン（79％配列同一性）又は相同ヒトセリンプロテアーゼXIa因子（ヒトセリンプロテアーゼ内のヒト血漿カリクレインと最も高い配列同一性；63％を共有する）及びトロンビン（36％配列同一性）に対する阻害活性を測定することにより、5つのインヒビターの特異性を試験した。マウス血漿カリクレイン又は相同ヒト血清プロテアーゼのいずれも、試験した最高濃度（10μM）で阻害されなかった。
［実施例５］
本実施例では、ヒト血漿カリクレインインヒビターによるヒト血漿中の接触活性化の阻害を説明する。
ヒト血漿カリクレインは、接触活性化における最初の事象で重要な役割を果たす。様々なインヒビター濃度の存在下でヒト血漿中のトロンビン活性化時間の延長（prolongation）を測定することにより、接触活性化を阻害するTBMB修飾ペプチドPK15の能力を試験した。トロンビンは、活性化される血液凝固経路の活性化カスケードにおける最後の酵素である。インヒビター濃度50 nMで、TBMB修飾ペプチドPK15は、トロンビン形成を遅延させたのに対し、アプロチニン、すなわちヒト血漿カリクレインの6 kDaタンパク質インヒビターは全く効果がなかった（図８Ａ及び７Ｂ）。5μMという高いインヒビター濃度では、トロンビン活性化のタイムラグは、小分子インヒビターよりアプロチニンの方が長かった。アプロチニンは、広範囲に使用されるインヒビターであり、高濃度で用いられると、内因性経路で他のプロテアーゼを阻害しうる。別のアッセイでは、TBMB修飾ペプチドPK15が、3人のドナーのヒト血漿中でXIIa因子及び血漿カリクレインの活性化を抑制することができるか否かを試験した。2つのプロテアーゼの活性化は、5μMのTBMB修飾ペプチドPK15で実質的に抑制することができた。同じ阻害効果を取得するのに約30倍高い濃度のアプロチニンが必要であると推定される（図８Ｃ）。
［実施例６］TBMB修飾ペプチドPK15の構造決定
TBMB修飾ペプチドPK15の立体構造は、pH 6.6の水溶液中での2D 1H NMR分光学により決定した。化学シフト割当を標準的方法により達成した。NOESYスペクトルの解析により、限定された骨格構造の証拠が得られた。中央ベンゼン環の3つのプロトンの化学シフトが顕著であり、これらはその異なる空間環境の結果として分析することができた。NOESY由来の距離制約を用いて、平均溶液構造を計算した（図６）。
実施例１〜６の概要
非天然小分子構造物（すなわち、本発明の複合体）のペプチド画分をコードするためのファージディスプレイ技術を参照しながら、本発明を説明した。遺伝コードにより、非常に大きなコンビナトリアルレパートリーの容易な作製、選択及び増幅が可能になる。この手法の主要な問題は、ファージにコードされるペプチドレパートリーを小分子コアに結合（tether)させることである。本発明者らは、好都合な合成戦略を開発し、いくつかの実験において最適反応条件を確立した。試薬濃度、溶媒組成及び反応温度は、ファージ粒子を残しながら、ファージ上の線状ペプチドを小分子に特異的に結合するように、注意深く選択しなければならなかった。ジスルフィド不含遺伝子-3-タンパク質を含む特定のファージを用いて、小分子とファージコートのシステイン残基との反応による生成物混合物の生成防止を促進する。
本発明のin vitro選択方法の効率を試験するために、ヒト血漿カリクレイン及びカテプシンGを標的として選択した。より低いナノモル範囲の親和性を有する分子を2つの標的に対して単離した後、提案された選択戦略及び分子設計が高親和性バインダーをもたらすことができることを確認した。ヒト血漿カリクレインインヒビターの特異性を評価する場合、XIa因子若しくはトロンビンとしてのマウス血漿カリクレイン又は相同ヒト血漿プロテアーゼのいずれも阻害されなかったことがわかった。ヒト血漿カリクレインに対する特異的低分子量インヒビター（Young, W. B.ら、Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2006）及び他のヒトセリンプロテアーゼの作製は、瑣末的ではない（Abbenante, G.及びFairlie, D. P., Medicinal Chemistry, 2005並びにTurk, B., Nature Rev. Drug Discovery, 2006に概説）ことから、上記の知見は満足のゆくものであった。小分子構造の化学合成が可能になれば、特定のアミノ酸を非天然ビルディングブロックで置換することができ、これにより、インヒビターの親和性がさらに改善される。
溶液中のNMRによる血漿カリクレインインヒビターの1つの構造決定により、該分子が、規定の骨格構造を有することが示された。予想通り、疎水性ベンゼン環は分子のコアを形成する。しかし、この特定の単一ポリペプチド−連結化合物の組合せの場合、アミノ酸側鎖のいずれも、ベンゼン環内に高密にパッキングされていなかった。所望であれば、ペプチド画分のより高密なパッキングを取得するために、ペプチド骨格又はアミノ酸側鎖と相互作用する可能性をより多く提供する化学構造を有する別のスカフォールドを用いるのが有利である。例えば、環位置2、4及び6の1,3,5-トリス-(ブロモメチル)-ベンゼンスカフォールドの水素原子を3つの同じ化学置換基で置換することができる。
本明細書に説明する選択では、ペプチドを3つの連結により小分子スカフォールドに結合させて、二環式ペプチド構造を取得する分子設計を用いた。勿論、ペプチドループをプロテアーゼにより切断した後、選択を実施して、異なるペプチド部分を含む小分子を取得する、別の分子アーキテクチャーの創出を選択／スクリーニング実施形態に用いてもよい。実際に、本研究において、酵素とのインキュベーションの際、TBMB修飾インヒビターPK15をヒト血漿カリクレインにより切断したとき、2つの異なるペプチド部分を含む構造が形成された。単独に消化した分子は、非加水分解形態と同等に優れた阻害活性を有することがわかった。ペプチドループの切断はまた、さらなる化学反応により、別の化学構造を新生アミノ末端又はカルボキシ末端に結合させる可能性も賦与する。
ヒト血漿中での接触活性化を阻害する能力を試験することにより、進化させたヒト血漿カリクレインの治療可能性を評価した。心肺バイパス法（CPB）を含む心臓手術では、血液とCPB機械及び管の人工表面との接触により、複数の血漿プロテアーゼ経路が活性化される。その結果、重篤な合併症、例えば、全身性炎症応答症候群（SIRS）、すなわち、患者の心臓及び肺機能を損なうおそれのある全身炎症状態が起こる可能性がある（Miller, B. E.ら、J. of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia, 1997）。血漿カリクレインは、接触活性化の最初の事象、並びに別のプロテアーゼ経路、例えば、線維素溶解及び補体系の増幅において重要な役割を果たす。心臓手術中に接触活性化を抑制する一般的戦略は、血漿カリクレインの活性をアプロチニン（ウシ肺組織由来の広範囲に使用される6 kDaプロテアーゼインヒビター）でブロッキングすることである。上記インヒビターは、Kiが30 nMの血漿カリクレインに結合するため、XII因子活性化の抑制により内因性凝固経路を遮断する。さらに、血漿カリクレインの阻害により、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を低減し、これにより線維素溶解及び関連する出血を軽減する。アプロチニンはまた、プラスミンの直接インヒビターである（Ki＝30 nM）。プラスミンの直接阻害は抗線維素溶解作用の主要なメカニズムであり、これにより、失血の軽減及び輸血の必要性の低減が可能になると考えられる。上記薬物にはまた、アナフィラキシー及び腎毒性のような副作用もある（Mahdy A. M.及びWebster N. R., Br. J. Anaesth., 2004に概要）。ヒトクニッツドメインスカフォールド（6 kDa）に基づく別の血漿カリクレインインヒビターが近年開発された（Markland, W,ら、Biochemistry, 1996）。薬物は、血漿カリクレインに対して有意に高度の親和性（Ki＝30 nM）及び特異性を有し、そのヒトフレームワークのために免疫原性が低いと予想される。これは、フェーズ2臨床試験で最近試験されている（Dyax Corp., www.dyax.com）。本発明者らの新規に開発したリードインヒビターは、生成物クニッツドメイン系インヒビターより、ヒト血漿カリクレインに対する親和性は約50倍低いものの、ex vivoで接触活性化を効率的に抑制することが証明された。そのサイズが小さい（2 kDa）ことから、容易な化学合成を可能にするだけではなく、有利なことに免疫原性反応の危険性も最小限にするため、該化合物は、開発／CPB操作における用途のための魅力的なリードインヒビターとなる。
［実施例７］非共有結合相互作用
本発明の連結化合物は、連結化合物と標的ポリペプチドの間に形成される非共有結合によって、標的ポリペプチド上の構造的制約に影響を与える／これを安定化する、又はこの構造的制約を課するというさらなる利点をもたらす。上記非共有結合は、有利なことに、連結化合物と標的ポリペプチドとの間の共有結合に加えて提供される。
こうした結合及び制約は、架橋などの従来の方法では提供されないことに留意すべきである。第1に、架橋剤は一般に、構造的制約に寄与するには小さすぎ、及び／又は可変性が高すぎる。第2に、前述した公知架橋の特定の例（例えば、Roberts、米国特許出願2003/0235852A1）では、二価リンカーは、意図的な設計によって小さく（プロピル）、しかも高度に可変性であり、これが何らかの非共有結合相互作用を形成したか、又はポリペプチド内の2つの残基の結合以外に何らかの構造的制約を課したという証拠は全くない。いずれの場合でも、従来の上記架橋剤は二価のみである。
本実施例では、連結化合物と本発明の標的ポリペプチドとの間に有利な非共有結合が可能であることを証明する。
本発明の方法で作製したヒト血漿カリクレインインヒビターの構造（前記実施例を参照）をNMRにより解明した。提案した構造では、ポリペプチドの数個の炭素原子が連結化合物の炭素原子に近接している（＜4オングストローム）。これは、非共有結合相互作用が、本実施例の疎水性相互作用では、コアと本発明のポリペプチドの間に存在することを示している。
上記相互作用は、以下の通りである：
Ser3 CB - Rng C26 3.62Å
Ser3 CB - Rng C2 4.0Å
Ser3 CB - Rng CMe2 3.63Å
Cys2 CB - Rng CMe2 2.56Å
Cys9 CB - Rng C29 3.13Å
Cys9 CB - Rng C9 3.32Å
Pro10 CG - Rng CMe9 3.8Å
Pro10 CD - Rng CMe9 3.13Å
Cys16 CB - Rng C16 3.43Å
Cys16 CB - Rng C26 3.79Å
さらに、ポリペプチドの水素原子と連結化合物の水素原子の間の水素−水素相互作用を1H-NMR NOESY分光学により検出した。
従って、本発明の連結化合物と標的ポリペプチドの間の複数クラスの非共有結合相互作用が証明された。これらは、有利なことに、本発明のポリペプチドにさらなる構造的制約をもたらす。
［実施例８］ファージにコードされるコンビナトリアル化学ライブラリー
概観
ファージディスプレイ技術は、コンビナトリアルライブラリーから治療用抗体を作製するのに有効であるが、小分子薬物の製造に適用するのが困難であることは以前証明されている。本明細書では、非リボソームペプチドシンターゼにより産生される大環状化合物の模倣物の選択のためのファージ戦略を説明する。3つの反応性システイン残基を有し、各々が数個のランダムアミノ酸残基によって隔てられ、ファージ遺伝子-3-タンパク質に融合したペプチドレパートリーを設計した。反応性システインを介した連結化合物（本実施例では、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン）とのコンジュゲーションにより、メシチレンコアにアンカーした2つのペプチドループを有するペプチドコンジュゲートのレパートリーが作製された。反復親和性選択により、複数の酵素インヒビターが得られ、さらなる突然変異誘発及び選択の後、ヒト血漿カリクレインに特異的なリードインヒビター（PK15）（Ki＝1.5 nM）を単離したが、これはex vivoで試験したヒト血漿における内因性凝固経路を効率的に遮断した。従って、この手法は、こうした大環状模倣物を作製及びスクリーニングする有力な手段を提供することが証明される。
背景
受容体、酵素及び核酸標的に対する新規リガンドの発見は、治療用薬物の開発における第1段階を示すものである。小有機リガンドに基づく薬物の場合、ハイスループットスクリーニング（HTS）が一般的な戦略となっており、該戦略では、化合物の大きなライブラリーを合成（又は購入）し、各化合物を標的との結合についてアッセイする。ロボットを使用して、毎日105〜106個の化合物をスクリーニングすることが可能だが、ヒットは、一般に、その結合親和性及び標的特異性を改善するためにさらに進んだ化学を必要とする1,2。核酸、ペプチド若しくはタンパク質に基づく薬物の場合、生物学的選択方法は、別の戦略を提供する。こうした方法（例えばファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ又はRNA/DNAアプタマー技術）は、以下のことに依存する：（a）多様なライブラリーの創出であって、該ライブラリーの各メンバーの表現型（標的との結合）がその遺伝子型（コードするDNA又はRNA）と相関している、並びに（b）ライブラリーメンバーを標的との結合について選択した後、増幅する（宿主細胞での複製により、又はコードされる核酸のin vitroでのコピーにより）反復サイクル。各選択ラウンドでは、バインダーはこれにより非バインダーに対して濃縮される。少数ラウンドの選択により非常に大きなライブラリー（109〜1013メンバー）を効率的にスクリーニングすることができ、しかもリードヒットを突然変異及びさらなる選択3により改良することができる。上記手法は非常に有力であり、Humira（商標）4,5のような治療用抗体を創出するのに用いられている。小有機リガンドの単離のための選択方法を開発するために、いくつかの試みがなされてきた。典型的には、容易に合成、配列決定、増幅及び／又はハイブリダイズすることができるDNAがタグとして用いられている。例えば、小分子を各々、ユニークDNA6（又はバクテリオファージ7）タグにコンジュゲートすることができ、コンジュゲートを互いに混合することにより、タグ標識小分子ライブラリーを創出する。標的に対するライブラリーの選択後、その（増幅された）タグの配列により、小分子「ヒット」を同定することができる。あるいは、コンビナトリアル化学ライブラリーの合成中にDNAタグを導入することができる。例えば、小分子及び対応するタグは、同じビーズ上で並行して合成する8か、又はタグのハイブリダイゼーションを用いて、化学合成の経路を制御する9。こうしたライブラリーから、選択したヒットの合成経路（及びその構造）をタグの配列から導き出すことができる。その巧妙さにもかかわらず、上記方法には共通の欠点がある。すなわち、第1ラウンドの選択中にしか小分子はDNAタグに連結せず、これにより反復サイクルが不可能になる（また、適用が小ライブラリーに制限される）ことである。従って、従来の技術には多くの問題点がある。
本実施例では、本発明を用いて、ペプチド大環状化合物の模倣物を創出するための選択プロセス中にファージ上のペプチドを化学的に修飾することができることを証明する10,11。近年、反応性側鎖（例えば、システイン）を介してペプチドを有機スカフォールドの官能基に結合させることにより、ペプチドループで修飾した有機コアを含む多環式ペプチドコンジュゲートを作製する方法が記載されている。構造はペプチド大環状薬物を暗示するものであるため、本発明者らは、線維状ファージ上で上記コンジュゲートのライブラリーを創出して、選択する可能性を探究した（図９ａ）。ペプチド大環状分子は通常、非リボソームペプチドシンターゼ13,14によりin vivoで作製されるが、本発明者らの戦略はin vivoでのリボソーム合成、次にex vivoでの化学コンジュゲーションを用いる。
結果
有機スカフォールドと、ファージ上にディスプレイされるペプチドのコンジュゲーション
3つのシステイン残基を含むペプチドをアンカーするためのスカフォールド（連結化合物）として小有機化合物トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を用いた12,15（図９ａ）。室温で水性溶媒中に反応が起こり、TBMB分子の3回回転対称は、ユニークな構造及び空間異性体の形成を確実にする。
まず、質量分析法による生成物の分子量を分析しながら、ペプチドpIIIの可溶性D1-D2ドメインに融合したペプチドNGCGSGCGSGCGCのコンジュゲーションのための反応条件を作成した。しかし、D1及びD2のジスルフィド架橋（C7-C36、C46-C53、C188-C201）を残しながら、ペプチドの3つのシステイン残基をTBMBと選択的にコンジュゲートすることはできなかった。これをきっかけに、本発明者らは、Schmidt F. X.ら16により近年開発されたジスルフィド不含遺伝子-3-タンパク質を利用することにした。ペプチド-D1-D2（ジスルフィド不含）融合タンパク質をトリス-(カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）で還元し、TCEPを除去した後、TBMBを添加した。濃度10μMのTBMBが、30℃で1時間のペプチド-融合タンパク質との定量的反応に十分であり、これにより、主として、予想分子量（Δ予想質量＝114 Da；図１０ａ）を有する1つの生成物が得られた。（ジスルフィド不含）D1-D2タンパク質を含む生成物は全く検出されなかった。意外にも、2つのシステイン残基のみを含むペプチド-D1-D2（ジスルフィド不含）融合物（NAGSGCGSGCGC-D1-D2）とTBMBの反応により、両システインとペプチドN-末端のαアミノ基との反応に一致する分子量の生成物が得られることがわかった（図１５ａ及び図１５ｂ）。同様に、1システイン及び1リシンを含むペプチド-D1-D2（ジスルフィド不含）融合物（NAGSGKGSGCGC-D1-D2）とTBMBの反応により、システイン、N-末端のαアミノ基及びリシンのεアミノ基の反応に一致する分子量が得られることがわかった（図１５ｃ及び図１５ｄ）。好適な条件を見出して、ペプチドNGCGSGCGSGCGCを担持する（ジスルフィド不含p3）ファージとTBMBを反応させた。これは、ファージ感染性の若干の減少（5倍）を招いた（図１０ｂ）。
多環式ポリペプチドライブラリーの創出及び親和性選択
（ジスルフィド不含p3）ファージ上でのディスプレイのために3つのシステインにより挟まれる6つのランダムアミノ酸の2つの配列を含むペプチド（Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys；図１１ａ）のライブラリーを設計した。シグナル配列の正しいプロセシングを確実にするために、アラニン残基をペプチドのN-末端に付加した。Gly-Gly-Ser-Glyリンカーを第3システインと遺伝子-3-タンパク質との間に配置した。（ジスルフィド不含p3）ファージは野生型ファージと比較して感染性が100倍低かったため、大量のファージ粒子をライブラリーから作製した（推定4.4x109変異体）。1リットルの培養物を30℃で一晩インキュベートすることにより、典型的には1011〜1012個の感染性粒子を取得した。
ヒトプロテアーゼ血漿カリクレイン及びカテプシンGの結合及び阻害のための多環式ペプチドのライブラリーを試験した。約1012個の精製済感染性ファージ粒子をTBMBで化学的に修飾した後、ビオチン化標的タンパク質と一緒にインキュベートした。磁性ストレプトアビジン又はアビジンビーズに捕捉後、濃縮したファージをさらに2ラウンドの選択に付して処理した。このとき、各ラウンドは増幅（細菌感染による）、化学的コンジュゲーション及びビオチン化標的を用いた捕捉を含んだ。ファージ力価は第2及び第3選択ラウンド後に増加したが、これは特定のバインダーの濃縮を示唆している。上記ペプチドをコードするDNAを、第3ラウンドにおけるファージの選択集団からPCR増幅して、ペプチドD1-D2（ジスルフィド不含D1-D2）融合タンパク質としてのペリプラズム発現のために再クローニングした後、配列決定した。これにより、ペプチドループの一方又は両方において共通配列が明らかになり（図１１ｂ及び図１１ｃ）、そのいくつかを発現させ、精製し、TBMBとコンジュゲートさせた後、プロテアーゼに対するその阻害活性について試験した。最良の血漿カリクレイン及びカテプシンGインヒビターは、D1-D2融合物として試験したとき、IC50がそれぞれ400 nM（PK2及びPK4）並びに100 nM（CG2及びCG4）であった。ファージ選択したクローンを阻害（結合ではなく）についてスクリーニングしたため、プロテアーゼに結合するが、それを阻害しない分子も選択されたか否かについては述べることはできない。しかし、ファージ選択後、試験したクローンの大部分が阻害活性をディスプレイしたという知見は、主にインヒビターが選択されたことを示唆している。
ヒト血漿カリクレインインヒビターの親和性成熟
カリクレインバインダーの配列のほとんどが、一方又は他方のペプチドループにおける共通配列であることが明らかにされた。一方のループにおける3つの共通領域の1つと、他方のループにおける6つのランダムアミノ酸を含む、3つの新規ライブラリーを創出した（図１２ａ）。ライブラリーを混合し、ストリンジェントな条件（1 nM〜200 pMビオチン化カリクレイン）下でファージパニングした。ランダム配列は新しい共通配列に収束し、両ループに共通配列を有するクローンが得られた（図１２ｂ）。阻害アッセイから、最良のインヒビター（PK15）のIC50は、D1-D2融合物として試験したとき、20 nMであることがわかった。
化学的に合成したインヒビターの活性及び特異性
一次選択からの4つのカリクレインインヒビター（PK2、PK4、PK6及びPK13）、並びに親和性成熟選択からの最良のインヒビター（P15）に対応する合成ペプチドを固相化学合成により作製した。ペプチドは、ファージディスプレイされるペプチドの電荷及び化学的環境を呈示するように、N-末端にアラニン残基を、またC-末端にアミド化グリシンを有するものであった。TBMBをコンジュゲートした合成ペプチドは、非コンジュゲートペプチドより少なくとも250倍強力な、カリクレイン活性のインヒビターであった（表１）。
表１：化学的に合成したペプチドインヒビター。5つの血漿カリクレインインヒビターのアミノ酸配列（17-mer）を示す。合成ペプチドの配列は、クローンPK2、PK4、PK6、PK13（ライブラリー1を用いてファージ選択で単離した）及びクローンP15（ライブラリー2から単離した親和性成熟クローン）に由来する。TBMBによるペプチドの修飾前及び修飾後の分子量及び阻害活性を示す。
Figure 0006074574
これらは、ペプチドD1-D2コンジュゲートより10倍以上強力なインヒビターであった（表１；図１３）。恐らく、これは、コンジュゲートしたペプチド部分とD1-D2部分の結合によるものであろう。ペプチドコンジュゲートPK15の見掛け阻害定数（Ki）（図９ｂ）をCheng-Prusoffの式17で計算したところ、1.5 nMであることがわかった。コンジュゲートPK15とカリクレインとのインキュベーションは、18 Daの質量増加が示すように、長時間のインキュベーション後にペプチド結合の加水分解を引き起こす（37℃で24時間後に90％切断）が、切断及び非切断サンプルの阻害活性は同様であることが証明された（それぞれ、IC50 2.2 nM及び1.6 nM）。
また、5つのインヒビターは、マウス血漿カリクレイン（79％配列同一性）又は相同ヒトセリンプロテアーゼXIa因子（63％配列同一性）及びトロンビン（36％配列同一性）に対しても試験した。いずれも、試験した最高濃度（10μM）で上記酵素を阻害しなかった。
ヒト血漿カリクレインインヒビターによる内因性凝固経路の遮断
ヒト血漿カリクレインは、内因性凝固経路の最初の事象において、XII因子をXIIa因子（続いて、これは上記経路における次のプロテアーゼに作用する）に変換することにより、重要な役割を果たす。コンジュゲートPK15がヒト血漿サンプル中でXIIa因子の活性化を阻害することができるか否かを試験した。上記経路をカオリンで誘発し、XIIa因子の活性を比色基質で測定した。XIIaの活性は、160 nMコンジュゲートPK15の存在下で半減した（図１６）。比較すると、同じ効果を得るのに、5μMのアプロチニン、すなわち、やはり血漿カリクレインインヒビター（Ki＝30 nM）として臨床的に用いられる6 kDaウシセリンプロテアーゼインヒビターが必要であった。
TBMB修飾ペプチドPK15の構造決定
コンジュゲートPK15の2D 1H NMRスペクトルを記録したところ、TOCSY及びNOESYスペクトルの化学シフトの配列特異的アラインメントが可能であった。NOESY由来の距離制約に基づいて計算したインヒビターの立体構造を図１４に示す。2つのペプチドループはメシチレンコアの周囲に配置され、該コアにループを共有結合するが、両ループは互いに相互作用しない。上記ループは、コアに対して高密にパッキングしないが、ポリペプチドのいくつかの炭素原子（Cys 9 CB、Cys16 CA、Gly 17 CA）は、分子コアの原子の4Å以内であり、これは、何らかの疎水性相互作用が存在しうることを示唆している。
実施例８についての論考
いかにして、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）12と、線維状バクテリオファージ上にディスプレイされるシステインリッチペプチドのライブラリーとの反応により、反復選択を施すことができるコンジュゲート（本発明の複合体）を作製するかを説明してきた。ファージを残しながら、ディスプレイされるペプチドとコンジュゲートすることは難題であった。本発明者らは、試薬濃度、溶媒組成及び反応温度を変化させ、また遺伝子-3-タンパク質中のジスルフィドが欠失したファージを使用しなければならなかった。＞109のメンバーのライブラリー及び反復選択から、強力なヒト血漿カリクレインインヒビター（＜2,000 Da）を単離することに成功した。Ki＝1.5 nMの本発明のリードインヒビター（PK15）は、ex vivoで試験したヒト血漿中の内因性凝固経路を効率的に遮断し、しかも高度に特異的であった。上記インヒビターは、マウス血漿カリクレイン又は相同ヒト血漿プロテアーゼであるXIa因子及びトロンビンは阻害しなかった。
本発明のレパートリーは、各々が6つのランダムアミノ酸によって隔てられた3つのシステインを含む17残基のペプチドから構築されるものであった。TBMBとのコンジュゲーション後、ペプチドは、実際に、NMRにより解明されたPK15カリクレインインヒビターの構造により確認されるように、メシチレンコアに結合した2つの6残基ループを形成すると予想される（図１４）。上記多環式ペプチドは、ジスルフィド結合ペプチド及び線状ペプチドのいずれに対しても利点を有するはずである。ジスルフィド結合ペプチドに対する多環式ペプチドの利点は、いったん形成された炭素−イオウ共有結合は置換に対して不活性であり18、また還元環境においても安定している18ことである。線状ペプチドに対する多環式ペプチドの利点は、それらが架橋され、より制約されていることである。これは、以下の2つの主要な結果をもたらす：（a）制約されたペプチドは、より堅固に標的と結合する（構造エントロピーの損失が小さいため）と予想される。ファージディスプレイにより単離されるペプチドインヒビターについての参照文献を見直したところ、大部分がジスルフィドを含み、マイクロモル範囲の阻害定数を有することがわかった（表３）。
表３：ファージ選択されたペプチドインヒビター。ペプチドの配列、酵素標的及び結合親和性を示す。ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基には下線を引いた。
Figure 0006074574
2つのペプチドインヒビターのみがPK15と同等に強力であった。両者とも、ジスルフィド結合と、少なくとも2つのトリプトファン残基を含んでいた19,20。これは、制約された立体構造及び疎水性相互作用の可能性が、こうした高親和性に重要であること；（b）制約（及び架橋）ペプチドはまた、線状ペプチドより切断及び／又は不活性化に対する耐性も高いはずであることを示している。実際に、本発明者らの研究では、インヒビターPK15は、ヒト血漿カリクレインとの長時間インキュベーション後に一方のループで切断されたが、インタクトかつ活性のままであった。
多環式コンジュゲートは、遺伝子操作及び化学的操作の両方を施すことができる。PK15の分子量（1939.4 Da）は、いくつかのペプチド大環状薬物（表２）より高いが、これより短いループを用いることも可能である。例えば、システインの間隔を変更することにより、ループ長を容易に変更したり、又は追加のセグメントをペプチド末端に付加する。
Figure 0006074574
別の改変としては、ループの突然変異誘発（例えばPK15の親和性成熟によるもの）；システインの位置で「枝分かれした」ペプチドセグメントの作製を目的とする、一方若しくは両方のループにおけるタンパク質分解切断；ループ切断後の新生ペプチド末端との化学的コンジュゲーション21、又は変異体有機コアの使用などがある。例えば、より大きな有機コア、又はより多くの官能基を含むものは、ループ又は標的と、より広範囲に相互作用することができ、全く新しい機能、例えば蛍光を導入するのに用いることもできる。上記操作を、ファージにディスプレイされるコンジュゲートに実施すれば、反復プロセスによりその改変が選択可能となるであろう。ペプチドコンジュゲートもまた、化学合成を施すことが可能であるため、さらなる改変（例えば非天然アミノ酸による置換）を合成により導入することができる。
ヒト血漿カリクレインのインヒビターは、遺伝性血管性浮腫（angiodema）の治療及び冠動脈バイパス術のために臨床的に開発中であるが、カリクレインに特異的な小分子を作製するのは難しいことがわかっている（22、23を参照）。本発明者らが、ファージ上で多環式ペプチドコンジュゲートの反復選択により高い親和性及び高度に特異的なインヒビターをこのように容易に取得したという事実は、この戦略にとってよい前兆である（augers）。
材料及び方法
ファージ上でのTBMBによるペプチドレパートリーの化学的修飾
プラスミドfdg3p0ss2116に基づくファージペプチドライブラリーをクローニングして、以下のように作製した。典型的には、1011〜1012 t.u.のPEG精製ファージを、20 mlの20 mM NH4HCO3（pH 8）中、1mM TCEPで42℃にて1時間にわたり還元した。ファージをvivaspin 20フィルター（MWCO 10,000）において4,000 rpmで回転させることにより、還元バッファーの量を1 mlまで減少させ、10 mlの氷冷反応バッファー（20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA、pH 8）で2回洗浄した。還元したファージの量を反応バッファーで32 mlに調節した後、ACN中8 mlの50μM TBMBを添加して、最終TBMB濃度10μMを取得した。反応物を30℃で1時間インキュベートした後、氷上で1/5量の20％PEG、2.5M NaClを用いたファージの沈殿、及び4,000 rpmでの30分の遠心分離により非反応TBMBを除去した。
ヒト血漿カリクレイン及びカテプシンGを用いたファージ選択
ビオチン化ヒト血漿カリクレイン及びカテプシンG（5〜20μg；ビオチン化に用いるプロトコルは以下に見出すことができる）を、1％BSA及び0.1％tween 20を含む0.5 ml洗浄バッファー（10 mM Tris-Cl、pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1mM CaCl2）中で30分にわたりブロッキングした。化学的に修飾したファージ（典型的には 2 ml洗浄バッファーに溶解させた1010〜1011 t.u.）を、3％BSA及び0.3％tween 20を含む1 mlの洗浄バッファーの添加及び30分のインキュベーションによりブロッキングした。3 mlのブロッキング済ファージをピペットで0.5 mlのブロッキング済抗原に添加し、回転輪上で、室温にて30分インキュベートした。50μl磁性ストレプトアビジンビーズ（Dynal, M-280、Invitrogen製、英国ペイズリー）を、1％BSA及び0.1％tweenを含む0.5 mlの洗浄バッファー中30分のインキュベーションによりブロッキングした。ブロッキング済ビーズをファージ／抗原混合物に添加し、回転輪上で、室温にて5分インキュベートした。ビーズは、0.1％tween 20を含む洗浄バッファーで8回、次に洗浄バッファーで2回洗浄した後、100μlの50 μMグリシン、pH 2.2と一緒に5分インキュベートした。溶離したファージを中和のために50μlの1 M Tris-Cl（pH 8）に移し、OD600＝0.4の50 mlのTG1細胞と一緒に 37℃で90分インキュベートした後、細胞を大きな2YT/クロラムフェニコールプレートに塗布した。同じ手順を用いて、2ラウンドのパニングをさらに実施した。第2ラウンドの選択では、ニュートラビジンをコーティングした磁性ビーズを用いて、ストレプトアビジン特異的ペプチドの濃縮を阻止した。ニュートラビジンビーズは、0.8 mgニュートラビジン (Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を0.5 mlトシル活性化磁性ビーズ（Dynal, M-280、Invitrogen製、英国ペイズリー）と、供給者の指示に従って反応させることにより調製した。
阻害活性についてスクリーニング選択されるクローン
第2及び第3ラウンドのバイオパニングにおいて選択されたペプチドをコードする遺伝子を、ペプチド-D1-D2融合タンパク質（ジスルフィド不含D1-D2タンパク質；クローニング及び発現手順は以下に記載する）の発現用のpUC119ベクターにクローニングした。上記ペプチドの酸化スルフヒドリル基は、20 mM NH4HCO3（pH 8）中の1 mM TCEPと一緒にタンパク質（1〜10μM）を42℃で1時間インキュベートすることにより、還元した。20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA（pH 8）バッファーを用いて、PD-10カラム（Amersham Pharmacia、スエーデン、ウプサラ）によるサイズ排除クロマトフラフィーにより還元剤を除去した。タンパク質のチオール基を反応バッファー（20 mM NH4HCO3、5 mM EDTA（pH 8）、20％ACN）中、10μM TBMBと30℃で1時間のインキュベーションにより反応させた。非反応TBMBの除去及び濃縮のために、タンパク質をmicrocon YM-3（Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード）で濾過した。生成物の濃度は、280 nmでの吸光度を測定することにより決定した。様々な濃度の修飾ペプチド融合タンパク質（2倍希釈）をヒト血漿カリクレイン（0.1 nM）又はカテプシンG（20 nM）と一緒にインキュベートした後、10 mM Tris-Cl（pH 7.4）、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％BSA、0.01％triton-X100中で残留活性を決定することにより、IC50を測定した。ヒト血漿カリクレイン活性は、Spectramax Gemini蛍光プレートリーダー（355 nmで励起、460 nmで発光記録；Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）で濃度100μMの蛍光発生基質Z-Phe-Arg-AMC（Bachem、スイス、ブーベンドルフ）を用いて測定した。ヒトカテプシンG活性は、Spectramax吸光プレートリーダー（410 nmで記録；Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）で、濃度1 mMの比色基質N-Suc-Ala-Ala-Phe-Pro-pNA（Bachem、スイス、Bubendorf）を用いて測定した。
二環式ペプチドの化学合成
N-末端に遊離アミンを、またC-末端にアミドを有するペプチドを固相化学（JPT Peptide Technologies、ドイツ、ベルリン）により25 mgスケールで化学的に合成した。1 mlの70％NH4HCO3（pH 8）及び30％ACN（1 mM）中の粗ペプチドをTBMB（1.2 mM）と室温で1時間反応させた。流量 2 ml/分でのACN及び0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液から構成される移動相を含むC18カラム及び勾配溶離を用いた逆相高速液体クロマトフラフィー（HPLC）により、反応生成物を精製した。精製したペプチドは、凍結乾燥した後、活性測定のためにDMSO又は50 mM Tris-Cl（pH 7.8）、150 mM NaClのバッファーに溶解させた。
ペプチド-D12融合タンパク質のクローニング及び発現
N-末端に融合したペプチドNACGSGCGSGCGCを含む及び含まないg3pのドメインD1-D2（成熟fd-g3pのアミノ酸残基2〜217を含む）を大腸菌において発現させた。リーダー配列と、C-末端ヘキサ−ヒスチジンタグ付きD1-D2遺伝子とを含むpUC119系の発現ベクター（本明細書中、pUC119H6D12と称する）は、ケンブリッジにある分子生物学研究所（LMB）のPhil Holliger氏により親切にも提供されたものである。N-末端ペプチドを有するD1-D2の発現用のプラスミドを、プライマーpepd12ba（ペプチド配列をコードする）及びd12foを用いたD1-D2遺伝子のPCR増幅、次いでSfiI/NotI消化pUC119H6D12ベクターとの連結によりクローニングした。合計20個のアミノ酸を有するジスフィルド不含D1-D2の発現用の遺伝子を、プライマー対d120ssba/d120ssfo、pepd120ssba/d120ssfo、P2cd120ssba/d120ssfo又はP1cd120ssba/d120ssfoのいずれかを用いて、ベクターfdg3p0ss21からPCR増幅した後、pUC119H6D12にSfiI/NotI連結させて、N-末端融合ペプチドNACGSGCGSGCGC、NAGSGCGSGCGC又はNAGSGKGSGCGCを含む及び含まないジスフィルド不含D1-D2の発現を実施した。6つのタンパク質は全て、TG1大腸菌細胞において30℃で8時間にわたり発現させ、ペリプラズム画分を20 mM NH4HCO3（pH 7.4）中で、Ni-アフィニティークロマトフラフィー及びSuperdex 75カラムでのゲル濾過により段階的に精製した。
ペプチド-D12融合タンパク質の質量分析
タンパク質（5〜10μM）の分子量を4容量の50％MeOH、1％ギ酸中でのタンパク質の変性、及びエレクトロスプレーイオン化（Micromass、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いた飛行時間型質量分析により決定した。分子量は、MassLynxバージョン4.1を用いた多価タンパク質質量スペクトルのデコンボリューションにより取得した。
ファージペプチドライブラリー1の創出
配列Ala-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys、リンカーGly-Gly-Ser-Gly並びに2つのジスフィルド不含ドメインD1及びD2を含むセミランダムペプチドをコードする遺伝子を正しい配向でファージベクターfd0D12にクローニングして、ファージライブラリー1を取得した。遺伝子3のD1ドメイン及びD2ドメインの遺伝子を欠失し、かつ第2のSfil制限部位を有するベクターfd0D12を、プライマーecoG3pNba及びpelbsfiecofoを用いたfdg3p0ss21の全プラスミドPCR増幅により、事前に創出した。ペプチドレパートリーをコードする遺伝子と、遺伝子3の2つのドメインを2つの連続したPCR反応で段階的に創出した。第1に、D1及びD2の遺伝子を、2つのプライマーprepcr及びsfi2foで、ベクターfdg3p0ss21を鋳型として用いて、PCR増幅した。第2に、上記ランダムペプチドをコードするDNAを、プライマーsficx6ba及びsfi2foを用いるPCR反応中に添加した。33及び9μgのSfi消化fd0D12プラスミドと、PCR生成物の連結により、12の20x20 cmクロラムフェニコール（30μg/ml）2YTプレート上に4.4x109のコロニーが形成された。2YT培地を含むプレートからコロニーをこすり取り、15％グリセロールを添加してから−80℃で保存した。グリセロール原液を1リットルの2YT/クロラムフェニコール（30μg/ml）培養物でOD600＝0.1まで希釈した後、ファージを30℃で一晩（12〜16時間）発現させた。
抗原のビオチン化
ヒト血漿カリクレイン（XIIa因子で活性化）をInnovative Research（米国ミシガン州サウスフィールド）から購入し、PBS（pH 7.4）／5％DMSO中、5倍モル過剰量のスルホ-NHS-LC-ビオチン（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を用いて、室温で1時間にわたり濃度1.2μMでビオチン化した。ビオチン化タンパク質を、50 mM NaAc（pH 5.5）、200 mM NaClのバッファーを用いて、PD-10カラムで精製した。容易にビオチン化されるヒトカテプシンGは、Lee Biosolutions（米国ミシガン州セントルイス）から購入した。
ファージ選択クローンのサブクローニング及び発現スクリーニング
第2ラウンド及び第3ラウンドのバイオパニング後に選択されたクローンのプラスミドDNAを、プライマー21seqba及びflagfoを用いて単一チューブでPCR増幅した後、SfiI及びNotI部位でベクターpUC119H6D12にクローニングして、C-末端FLAGタグ及びヘキサ−ヒスチジン−タグ付きのジスルフィド不含D1ドメイン及びD2ドメインに融合したペプチドのペリプラズム発現を実施する。連結したプラスミドをTG1細胞にエレクトロポレーションし、2YT/アンピシリン（100μg/ml）プレートに塗布した。組換えタンパク質を発現するクローンを以下のように同定した：96-ディープウェルプレート（1 ml/ウェル）中の培地（100μg/mlアンピシリンを含む2YT）に個々のコロニーの細胞を接種した後、37℃でインキュベートした。培養物が濁ったら、タンパク質発現を1 mM IPTGで誘導した後、プレートを30℃で一晩300 rpmで振盪した。細胞を3,500 rpmで30分の遠心分離によりペレット化し、1 mg/mlリゾチームを含む洗浄バッファーで溶解させた後、3,500 rpmで旋回させることにより、細胞片をペレット化した。上清を96-ウェルpolysorpプレート（Nunc、デンマーク、Roskilde）に移して、非特異的吸着を実施した。ウェルを0.1％ tween 20含有洗浄バッファーで2回すすいだ後、1％ BSA及び0.1％tween 20含有洗浄バッファーで1時間かけてブロッキングした。抗FLAG M2-ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma-Aldrich米国ミズーリ州セントルイス）を1:5,000希釈してから、1％BSA及び0.1％tween 20を含む洗浄バッファーでブロッキングした後、プレートに1時間かけて添加した。ウェルを洗浄（0.1％tween 20含有洗浄バッファーで5回、デタージェントを含まないバッファーで1回）した後、結合ペルオキシダーゼをTMB基質溶液（eBiosciences、米国サンディエゴ）で検出した。タンパク質を発現するクローンのプラスミドDNAを配列決定した（Geneservice、英国ケンブリッジ）。
ヒト血漿カリクレインの親和性成熟
3つのペプチドファージライブラリーを主にライブラリー1（前記参照）として創出したが、sficx6baの代わりに、縮重プライマーsficx6abc（ライブラリー2）、sficx6abb（ライブラリー3）及びsficx6aba（ライブラリー4）を用いて創出した。TG1細胞への連結反応物のエレクトロポレーションにより、9.5x108（ライブラリー2）、1.1x109（ライブラリー3）及び1.2x109 （ライブラリー4）の形質転換体が得られた。各ライブラリーのファージは、1 Lの培養物中で作製し、精製し、プールした後、TBMBと反応させた。3ラウンドのパニングを、材料及び方法の節に記載した選択と実質的に同様に実施するが、より低い濃度のビオチン化ヒト血漿カリクレインを用いて実施した（第1及び第2ラウンドでは1 nM、第3ラウンドでは200 pM）。
ヒト血漿カリクレインインヒビターの活性及び特異性の測定
阻害活性（IC50）は、様々な濃度（典型的には10μM〜0.5μM)のインヒビターとのインキュベーション（30分、室温）時の酵素の残留活性を測定することにより決定した。ヒト血漿カリクレイン（0.1 nM）及びXIa因子（0.8 nM; Innovative Research、米国ミシガン州サウスフィールド）の活性は、Z-Phe-Arg-AMC（100μM）で、また、ヒトトロンビン（2 nM；Innovative Research、米国ミシガン州サウスフィールド）の活性は、10 mM Tris-Cl（pH 7.4）、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％BSA、0.01％triton X-100及び5％DMSO中のBoc-Phe-Ser-Arg-AMC（100μM）で測定した。シグナルペプチドを含むR&D Systems（米国ミネソタ州ミネアポリス）製の組換えマウス血漿カリクレインを0.5 mg/mlサーモリシンでタンパク質分解により37℃で1時間活性化した。マウス血漿カリクレイン（3 nM）の活性は、50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、10 mM CaCl2及び250 mM NaCl、0.1％BSA、0.01％triton X-100及び5％DMSO中のZ-Phe-Arg-AMC（100μM）で測定した。1つの結合ループにおいて加水分解されたインヒビターは、TBMB修飾ペプチドPK15とヒト血漿カリクレインのモル比5：1、37℃で24時間のインキュベーション後、該酵素の60℃での熱不活性化（30分）により作製した。Cheng-Prusoffの式に従い見掛けKi値を計算した。
ヒト血漿におけるXII因子活性化の測定
個別ドナーからの正常なヒト血漿を3H Biomedical（スエーデン、ウプサラ）から購入した。血漿を1,500xgで、20℃にて15分遠心分離して、乏血小板血漿（PPP）を取得した。PPPのアリコートを80℃でポリプロピレンチューブ中に保存した。5、50、500若しくは5,000 nMのアプロチニン（Roche、ドイツ、マンハイム）又はTBMB修飾ペプチドPK15を含む60μlのPPPのサンプルを調製した。XIIa因子の活性化は以下のように測定した。2μgのカオリンを血漿サンプルに添加し、よく混合して、37℃で20分インキュベートした。サンプルを50 mM Tris-Cl（pH 7.8）、150 mM NaClで250倍希釈した。吸光プレートリーダー（450 nmで吸光；Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）を用いて、血漿カリクレイン様活性を発色基質H-D-Pro-Phe-Arg-pNA（100μM；Bachem、スイス、ブーベンドルフ）で測定した。同じ発色基質はまた、血漿カリクレインによっても認識され、修飾される。しかし、XIIa因子活性を50％低下させるのに必要なインヒビター濃度（TBMB修飾ペプチドPK15については160 nM、アプロチニンについては5μM)では、血漿カリクレインは実質的に阻害され、上記基質で測定することはできない。
TBMB修飾ペプチドPK15の構造決定
1 mgのTBMB修飾ペプチドPK15を550μlの10 mM重水素化Tris-Cl（pH 6.6）、150 mM NaCl、10mM MgCl2、1 mM CaCl2に溶解させて、インヒビター濃度1 mMを取得した。インヒビターのスペクトルを800 MHzで記録した（ TCI cryoprobeを備えたBruker Avance）。スペクトル割当は、TOCSY及びNOESYスペクトルに基づく。合計199のNOE制約があり、そのうち77は残基間、122が残基内であった。図６に示す構造は、50の計算された構造配座異性体（コンフォーマー）の平均構造である。プログラムPyMOLを分子モデルの構造分析及び視覚化のために用いた。
材料及び方法の段落の参照文献：
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以上、本明細書に記載するすべての刊行物は、本明細書に参照として組み込むものとする。本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の記載された態様及び実施形態の様々な変更及び変形が当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を説明してきたが、特許請求の範囲に記載の本発明を、こうした特定の実施形態に不当に限定するべきではないことは理解すべきである。実際に、当業者には明らかな、本発明を実施するための前記方法の様々な変更は、添付の特許請求の範囲に含むものとする。
配列表
DNAプライマーの配列
ヌクレアーゼ制限部位に下線を付した：
pepd12ba
5’CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCTGTGGTGCAGAAACTGTTGAAAGTTG-3’
d12fo
5’-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTC-3’
d120ssba
5’-CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3’
d120ssfo
5’-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3’
pepd120ssba
5’CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCTGTGGTGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3’
p2cd120ssba
5’CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCTGTGGTGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3’
p1cd120ssba
5’CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGGGCTCTGGCAAAGGTTCCGGCTGTGGTGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3’
ecoG3pNba
5’GCATGAATTCCAGTCAGTACGGCCTCGGGGGCCATGGCTTCTGGTACCCCGGTTAAC-3’
pelbsfiecofo
5’GCATGAATTCCGATGACTGAGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGGAACAACTAAAGGAAT -3’
prepcrba
5’-GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3’
sfi2fo
5’-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCGGACGGAGCATTGACAGG-3’
sficx6ba
5’TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3’
flagfo
5’CATTCTGCGGCCGCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTGCAGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3’
sficx6aba
5’TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGCCGCGTTAATTGGACCCCGTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3’
sficx6abb
5’TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTGCGCCGTGGCGCACCGCGTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3’
sficx6abc
5’TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTAGCGATCGTTTTCGTAATTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3’
ペプチドの配列は実施例の節に開示のとおりである。
実施例８のDNAプライマーの配列
ヌクレアーゼ制限部位に下線を付した：
pepd12ba 5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCTGTGGTGCAGAAACTGTTGAAAGTTG-3'
d12fo 5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTC-3'
d120ssba 5'-CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3'
d120ssfo 5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3'
pepd120ssba 5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCTGTGGTGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3'
p2cd120ssba 5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCTGTGGTGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3'
p1cd120ssba 5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGGGCTCTGGCAAAGGTTCCGGCTGTGGTGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3'
ecoG3pNba 5'-GCATGAATTCCAGTCAGTACGGCCTCGGGGGCCATGGCTTCTGGTACCCCGGTTAAC-3'
pelbsfiecofo 5'-GCATGAATTCCGATGACTGAGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGGAACAACTAAAGGAAT -3'
prepcrba 5'-GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3'
sfi2fo 5'-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCGGACGGAGCATTGACAGG-3'
sficx6ba 5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3'
flagfo 5'-CATTCTGCGGCCGCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTGCAGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3'
sficx6aba 5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGCCGCGTTAATTGGACCCCGTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3'
sficx6abb 5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTGCGCCGTGGCGCACCGCGTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3'
sficx6abc 5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTAGCGATCGTTTTCGTAATTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3'
[１] ファージ粒子を含む複合体であって、
（i）ポリペプチド、
（ii）（i）のポリペプチドをコードする核酸、
（iii）上記ポリペプチドに結合した連結化合物
を含み、上記連結化合物は、少なくとも3つの異なる共有結合により上記ポリペプチドに結合している、上記複合体。
[２] 前記連結化合物が、それがポリペプチドに結合する共有結合の数に対応する分子対称を有する、１に記載の複合体。
[３] 前記連結化合物が、3回分子対称を有し、該連結化合物は、3つの共有結合により前記ポリペプチドに結合している、２に記載の複合体。
[４] 前記連結化合物が、構造的に剛性の化学基を含む、１〜３のいずれかに記載の複合体。
[５] 前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、４に記載の複合体。
[６] 前記ポリペプチドがシステイン残基を含み、該ポリペプチドと前記連結化合物の結合のための3つの異なる共有結合の少なくとも1つが、上記システイン残基との結合を含む、１〜５のいずれかに記載の複合体。
[７] １〜６のいずれかに記載の少なくとも2つの異なる複合体を含む、遺伝的にコード化されたポリペプチドライブラリー。
[８] 複合体を作製する方法であって、以下のステップ：
（i）ポリペプチドを含むファージ粒子を用意するステップ、
（ii）連結化合物を用意するステップ、
（iii）上記連結化合物とポリペプチドとの間での少なくとも3つの共有結合の形成により、上記連結化合物を上記ポリペプチドに結合させるステップ
を含む、上記方法。
[９] 前記ポリペプチドの反応基を還元し、ステップ（iii）の前に、還元反応基を含むポリペプチドを濾過により精製する、８に記載の方法。
[１０] 前記濾過精製ステップの後、前記連結化合物との結合のために、脱気バッファー中、キレート剤の存在下でのインキュベーションにより、前記ポリペプチドを還元状態に維持する、９に記載の方法。
[１１] ステップ（iii）が、アセトニトリルを含む水性バッファーにおいて、前記ポリペプチドと連結化合物を一緒に30℃にてpH8でインキュベートすることを含む、８〜１０のいずれかに記載の方法。
[１２] 前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、８〜１１のいずれかに記載の方法。
[１３] 前記トリス-(ブロモメチル)ベンゼンが、10μmで存在する、１２に記載の方法。
[１４] 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）であり、前記アセトニトリルが、20％で存在し、また、前記インキュベーションステップ（iii）を1時間にわたり実施する、１３に記載の方法。
[１５] 前記ポリペプチド鎖の1以上の結合を切断するさらなるステップ（iv）を含む、８〜１４のいずれかに記載の方法。
[１６] 前記切断ステップが、前記ポリペプチドをプロテアーゼに接触させることを含む、１５に記載の方法。
[１７] ８〜１６のいずれかに記載の方法により得られる複合体。
[１８] リガンドに結合することができる、１〜１７のいずれかに記載の複合体を同定する方法であって、以下のステップ：
（i）１〜１７のいずれかに記載の複合体を用意するステップ、
（ii）上記複合体をリガンドと接触させるステップ、
（iii）上記リガンドと結合する複合体を選択するステップ
を含む、上記方法。
[１９] 前記複合体の核酸の配列を決定するステップをさらに含む、１８に記載の方法。
[２０] 前記リガンドに結合することができるものとして単離されるある量の複合体を製造するステップをさらに含む、１８に記載の方法。
[２１] 本発明の方法により単離又は同定されるある量のポリペプチド-連結化合物コンジュゲートを製造するステップをさらに含み、該製造ステップが、上記連結化合物をポリペプチドに結合させることを含み、上記ポリペプチドは、組換えにより発現されるか又は化学的に合成されたものである、１８に記載の方法。
[２２] 前記ポリペプチドのN-末端又はC-末端の1以上で、該ポリペプチドを伸長するステップをさらに含む、２１に記載の方法。
[２３] 前記ポリペプチド−連結化合物コンジュゲートを別のポリペプチドに結合させるステップをさらに含む、２１又は２２のいずれかに記載の方法。
[２４] 前記コンジュゲートが、以下のステップ：
（i）連結化合物との結合後、前記ポリペプチドに別のシステインを付加するステップ、及び
（ii）別のシステインとのジスルフィルド結合により、前記ポリペプチドを該別のポリペプチドにコンジュゲートさせるステップ
により実施される、２３に記載の方法。
[２５]（i）少なくとも2つのポリペプチド分子、及び
（ii）少なくとも1つの連結化合物分子
を含むコンジュゲートであって、上記少なくとも2つのポリペプチド分子の各々が、少なくとも1つの共有結合により、上記連結化合物分子に結合している、上記コンジュゲート。
[２６] 前記コンジュゲートが少なくとも3つのポリペプチド分子を含み、前記少なくとも3つのポリペプチド分子の各々が、少なくとも1つの共有結合により、上記連結化合物分子に結合している、２５に記載のコンジュゲート。
[２７] 前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、２５又は２６に記載のコンジュゲート。
[２８] 前記コンジュゲートが、１５又は１６に記載の方法により得られる、２５〜２７のいずれかに記載のコンジュゲート。

Claims (23)

  1. ファージ粒子を含む複合体であって、
    （i）ポリペプチド、
    （ii）（i）のポリペプチドをコードする核酸、
    （iii）上記ポリペプチドに結合した連結化合物
    を含み、上記連結化合物は、少なくとも3つの異なる共有結合により上記ポリペプチドに結合している、上記複合体。
  2. 前記連結化合物が、それがポリペプチドに結合する共有結合の数に対応する分子対称を有する、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記連結化合物が、3回分子対称を有し、該連結化合物は、3つの共有結合により前記ポリペプチドに結合している、請求項２に記載の複合体。
  4. 前記連結化合物が、構造的に剛性の化学基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
  5. 前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、請求項４に記載の複合体。
  6. 前記ポリペプチドがシステイン残基を含み、該ポリペプチドと前記連結化合物の結合のための3つの異なる共有結合の少なくとも1つが、上記システイン残基との結合を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
  7. 請求項１〜６のいずれかに記載の少なくとも2つの異なる複合体を含む、遺伝的にコード化されたポリペプチドライブラリー。
  8. 複合体を作製する方法であって、以下のステップ：
    （i）ポリペプチドを含むファージ粒子を用意するステップ、
    （ii）連結化合物を用意するステップ、
    （iii）上記連結化合物とポリペプチドとの間での少なくとも3つの共有結合の形成により、上記連結化合物を上記ポリペプチドに結合させるステップ
    を含む、上記方法。
  9. 前記ポリペプチドの反応基を還元し、ステップ（iii）の前に、還元反応基を含むポリペプチドを濾過により精製する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記濾過精製ステップの後、前記連結化合物との結合のために、脱気バッファー中、キレート剤の存在下でのインキュベーションにより、前記ポリペプチドを還元状態に維持する、請求項９に記載の方法。
  11. ステップ（iii）が、アセトニトリルを含む水性バッファーにおいて、前記ポリペプチドと連結化合物を一緒に30℃にてpH8でインキュベートすることを含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記トリス-(ブロモメチル)ベンゼンが、10μMで存在する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）であり、前記アセトニトリルが、20％で存在し、また、前記インキュベーションステップ（iii）を1時間にわたり実施する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ポリペプチド鎖の1以上の結合を切断するさらなるステップ（iv）を含む、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記切断ステップが、前記ポリペプチドをプロテアーゼに接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. リガンドに結合することができる、請求項１〜７のいずれかに記載の複合体を同定する方法であって、以下のステップ：
    （i）請求項１〜７のいずれかに記載の複合体を用意するステップ、
    （ii）上記複合体をリガンドと接触させるステップ、
    （iii）上記リガンドと結合する複合体を選択するステップ
    を含む、上記方法。
  18. 前記複合体の核酸の配列を決定するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記リガンドに結合することができるものとして単離されるある量の複合体を製造するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 請求項１８に記載の方法により同定される複合体に含まれるある量のポリペプチド-連結化合物コンジュゲートを製造するステップをさらに含み、該製造ステップが、上記連結化合物をポリペプチドに結合させることを含み、上記ポリペプチドは、組換えにより発現されるか又は化学的に合成されたものである、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記ポリペプチドのN-末端又はC-末端の1以上で、該ポリペプチドを伸長するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ポリペプチド−連結化合物コンジュゲートを別のポリペプチドに結合させるステップをさらに含む、請求項２０又は２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記コンジュゲートが、以下のステップ：
    （i）連結化合物との結合後、前記ポリペプチドに別のシステインを付加するステップ、
    及び
    （ii）別のシステインとのジスルフィド結合により、前記ポリペプチドを該別のポリペプチドにコンジュゲートさせるステップ
    により実施される、請求項２２に記載の方法。

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