JP6077331B2 - Ｔｒｐａ１活性化組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ＴＲＰＡ１活性化組成物に関し、より詳細にはアクリル酸及び／又は特定の不飽和アルデヒドを有効成分とするＴＲＰＡ１活性化組成物に関する。

Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｋｙｒｉｎ １（ＴＲＰＡ１）は、膜６回貫通領域と、Ｎ末端に１４〜１８回のアンキリンリピート構造とを持つ、カルシウム選択性が高い非選択性カチオンチャネルである（非特許文献１〜２）。ＴＲＰＡ１は、１７℃以下の侵害性冷刺激によって活性化される温度感受性ＴＲＰチャネルとして２００３年に報告された。その後、ＴＲＰＡ１は、ワサビやマスタードの辛味成分であるアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、シナモン由来の桂皮アルデヒド、生ニンニク由来のアリシン等によって活性化されることが示されている（非特許文献１〜２）。

上記ＴＲＰＡ１活性化成分をヒトを含む哺乳類へ投与又は塗布することでＴＲＰＡ１が活性化されると、冷涼感やスパイシー感が喚起される。１７℃以下の冷感刺激によって、ＴＲＰＡ１を活性化させると、体熱産生を促進し、放熱を抑制することによって、体温低下が抑制される。冷環境下での体温低下抑制は、炭酸水の刺激によっても起こり得る（非特許文献３）。ＴＲＰＡ１の活性化は、また、体脂肪蓄積抑制（非特許文献４）、脂肪細胞の分化誘導（特許文献１）、発毛の低減（特許文献２）、便秘型過敏性腸症候群、弛緩性便秘及び機能性胃腸障害の予防又は治療（特許文献３）、皮膚バリアー機能回復促進（特許文献４）等を誘導することが報告されている。

ＴＲＰＡ１が活性化されると、細胞外カルシウムを介してコレシストキニン（ＣＣＫ）分泌を誘導することが報告されている（非特許文献５）。ＣＣＫは、脂質、蛋白質等を摂取することで十二指腸粘膜細胞から分泌される消化管ホルモンである。このホルモンは、膵臓からの酵素分泌を亢進すること、胆嚢収縮作用を有すること、胃の幽門を閉じて胃内容物の十二指腸への輸送を遅延させることが知られている（非特許文献６）。

特開２００６−１９９６４７ 特表２００９−５２９４９４ ＷＯ２００９／１２３０８０ 特開２０１１−４２６２４

Ｔｏｍｉｎａｇａ Ｍ，"Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ （ＴＲＰ） ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＴＲＰＶ１ ａｎｄ ＴＲＰＡ１"，ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ，１３０（３），２８９−２９４（２０１０） Ｋａｒａｓｈｉｍａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，"ＴＲＰ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｓｏｒｓ"，Ｆｕｋｕｏｋａ Ｉｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，１０２（３），４８−５５，２０１１ Ｓａｗａｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｒｂｏｎａｔｅｄ ｗａｔｅｒ ｏｎ ｂｏｄｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ"，２０１２年農芸化学年会要旨集，発表番号：３Ｊ１５ａ０１ Ｔａｍｕｒａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ，ａ ＴＲＰＡ１ Ａｇｏｎｉｓｔ，Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｖｉｓｃｅｒａｌ Ｆａｔｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｆｅｄ ａ Ｈｉｇｈ−Ｆａｔ ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｄｉｅｔ"，Ｊ Ｎｕｔｒ Ｓｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ（Ｔｏｋｙｏ）２０１２；５８（１）：９−１３ Ａ．Ｋ．Ｐｕｒｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，"ＴＲＰＡ１ ｃｈａｎｎｅｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ．"，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８２，（２００８），２２９−２３２ 栄養機能化学，栄養機能化学研究会編，朝倉書店，１９９６年発行，４２頁

ＴＲＰＡ１活性化成分として従来知られたアリルイソチオシアネート、桂皮アルデヒド等の化学物質は、不安定である、水に難溶なため用途が限定されるといった欠点を有する。

そこで、本発明の課題は、安全、安定かつ利用度の高い新規なＴＲＰＡ１活性化成分を見出し、その用途を提供することにある。

本発明者等は、食品成分によるCCK分泌促進作用について培養細胞での研究を進める中で、意外にも、アクリル酸及び特定の構造をもつ不飽和アルデヒドにＴＲＰＡ１活性化作用があることを発見し、本発明に至った。すなわち、本発明は、アクリル酸、及び／又は、少なくとも２位又は４位に二重結合を有する主鎖の炭素数４〜１２の不飽和アルデヒドであって、ただし、二重結合の位置が２位のみの場合は主鎖の炭素数が４〜９であり、そして二重結合の位置が４位のみの場合は主鎖の炭素数が９〜１２である前記不飽和アルデヒドを有効成分として含むＴＲＰＡ１活性化組成物である。本明細書において、二重結合の位置番号は、ＩＵＰＡＣ命名法に従う。

前記不飽和アルデヒドは、主鎖の炭素数が４〜１２であって２位及び４位に二重結合を有するジ不飽和アルデヒド、主鎖の炭素数が４〜９であって２位に二重結合を有するモノ不飽和アルデヒド、及び主鎖の炭素数が９〜１２であって４位に二重結合を有するモノ不飽和アルデヒドからなる群から選ばれることが好ましい。

前記ＴＲＰＡ１活性化組成物は、二重結合の位置が２位である前記不飽和アルデヒドを必須に含むことが好ましい。

前記ＴＲＰＡ１活性化組成物は、二重結合の位置が２位及び４位である前記不飽和アルデヒドを必須に含むことが好ましい。

前記不飽和アルデヒドはトランス体であることが好ましい。

前記ＴＲＰＡ１活性化組成物は、二重結合を２個有する前記不飽和アルデヒド及び二重結合を１個有する前記不飽和アルデヒド、又は、二種類の二重結合を２個有する前記不飽和アルデヒドを必須に含むことが好ましい。

二重結合が１個の前記不飽和アルデヒドは、ｔｒａｎｓ−２−オクテナールであることが好ましい。

本発明は、また、前記ＴＲＰＡ１活性化組成物を含む食欲抑制剤を提供する。

本発明は、また、前記ＴＲＰＡ１活性化組成物を含む食欲抑制食品を提供する。

本発明に使用される不飽和アルデヒドは、安定であり、水相及び油相のいずれにも添加可能である。また、不飽和アルデヒドの多くは、食品添加物として安全性が確認されており、安価に入手でき、液剤や固体製剤に加工し易い。したがって、本発明の組成物は、従来のＴＲＰＡ１活性成分よりも利用度が高い。

本発明の組成物の経口摂取によりＴＲＰＡ１が活性化されると、冷涼感やスパイシー感が喚起される。本発明の組成物は、冷涼感やスパイシー感を得ることができる飲料等への添加が期待される。したがって、本発明の組成物は、冷涼感喚起剤、スパイシー感喚起剤等の用途が期待される。さらに、本発明の組成物はＴＲＰＡ１を活性化することから、冷涼環境下での体温低下抑制剤、発毛低減剤、便秘型過敏性腸症候群・弛緩性便秘及び機能性胃腸障害の予防又は治療剤、皮膚バリアー機能回復促進剤等の用途が期待される。

ＣＣＫは、中枢に直接作用して食欲を抑制する、満腹感を誘起するという生理機能を有する。ＴＲＰＡ１活性化は、ＣＣＫ分泌誘導を介して食欲抑制や満腹感を誘導することになる。食欲抑制や満腹感が得られれば、体脂肪蓄積や肥満が抑制され、その結果、高脂血症、高コレステロール血症、高中性脂肪血症、高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳卒中、閉塞性動脈硬化症といった疾患の危険因子を低減できる。したがって、本発明の組成物は、体脂肪蓄積抑制剤、脂肪細胞の分化誘導剤、食欲抑制剤、肥満防止剤等の用途が期待される。

図１Ａは、細胞外カルシウムイオン存在下又は非存在下において本発明に従う不飽和アルデヒド（実施例１〜３）を含む評価溶液で細胞を処理した場合の、細胞内ＣＣＫ分泌量を示すグラフである。白抜きの棒グラフは細胞外カルシウムイオンが存在する系であり、斜線の棒グラフが非存在系である。図１Ｂは、細胞外カルシウムイオン存在下又は非存在下において本発明に従う不飽和アルデヒド（実施例２）を含む評価溶液で細胞を処理した場合の、細胞内カルシウムイオン濃度変化を、蛍光強度比（Δ３４０／３８０ｒａｔｉｏ）を指標として示すグラフである。 図２Ａは、ＴＲＰＡ１阻害剤（ＨＣ−０３００３１）無添加又は添加において、試験物質を含む評価溶液で細胞を処理した場合のＣＣＫ分泌量を示すグラフである。白抜きの棒グラフがＴＲＰＡ１阻害剤無添加であり、斜線の棒グラフがＴＲＰＡ１阻害剤添加である。図２Ｂは、ＴＲＰＡ１阻害剤無添加又は添加において、本発明に従う不飽和アルデヒドを含む評価溶液で細胞を処理した場合の細胞内カルシウムイオン濃度変化を、蛍光強度比を指標として示すグラフである。 図３Ａ及びＢは、本発明に従う不飽和アルデヒドを含む評価溶液（実施例２〜４）、並びに本発明に従わない不飽和アルデヒド（比較例１及び２）を含む溶液で細胞を処理した場合の細胞内カルシウムイオン濃度を示すグラフである。図３Ｃは、各例のカルシウムイオン濃度の最大値を比較した図である。

本発明の組成物には、アクリル酸及び／又は少なくとも２位又は４位に二重結合を有する主鎖の炭素数４〜１２の不飽和アルデヒド（以下、単に「本発明に従う不飽和アルデヒド」という）を必須の有効成分として含む。ただし、前記不飽和アルデヒドの二重結合の位置が２位のみであるモノ不飽和アルデヒドの主鎖炭素数は４〜９である。主鎖の炭素数が１０以上であるとＴＲＰＡ１活性化能が低下する。また、前記不飽和アルデヒドの二重結合の位置が４位のみであるモノ不飽和アルデヒドの主鎖炭素数は９〜１２である。主鎖の炭素数が８以下であるとＴＲＰＡ１活性化能が低下する。

非特許文献５によれば、マウス及びヒトの十二指腸粘膜内、並びにマウス腸内神経由来細胞株ＳＴＣ−１（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ＳＴＣ−１ ｃｅｌｌｓ）内にＴＲＰＡ１ ｍＲＮＡが検出された。ＳＴＣ−１細胞株をＡＩＴＣで刺激すると、細胞内カルシウムイオンが増大し、そしてＣＣＫ分泌を顕著に刺激した。また、ＡＩＴＣ誘導ＣＣＫ分泌は、細胞外カルシウムイオンの欠乏やルテニウムレッド（ＴＲＰＡ１アンタゴニスト）によって完全にブロックされた。この非特許文献５の知見から、ＴＲＰＡ１を活性化する候補物質のＴＲＰＡ１阻害剤の存在下でのＣＣＫ分泌活性、あるいは候補物質の細胞外カルシウムイオンの存在又は非存在下でのＣＣＫ分泌活性を調べることで、候補物質のＴＲＰＡ１活性能が調査可能である。

本発明に従う不飽和アルデヒドは、本明細書の実施例に実証されるように、ＳＴＣ−１細胞株を用いたＴＲＰＡ１阻害剤試験及び細胞外カルシウムイオン枯渇試験において、ＴＲＰＡ１活性化成分であるＡＩＴＣと全く同様の挙動を示した。したがって、本発明に従う不飽和アルデヒドを有効成分とする組成物はＴＲＰＡ１活性化能を有するといえる。一方、飽和アルデヒド、飽和又は不飽和アルコール、飽和脂肪酸又はアクリル酸を除く不飽和脂肪酸や飽和又は不飽和炭化水素は、ＣＣＫ分泌促進活性によって評価可能なＴＲＰＡ１活性化能が劣る。

なお、主鎖の炭素数が３で２位に二重結合を有する不飽和アルデヒドであるプロぺナールにもＴＲＰＡ１活性化能が認められるが、ＧＨＳ（化学品の分類及び表示に関する世界調和システム）によると、急性毒性の分類が区分２（飲み込むと生命に危険）と記載されており、毒性が強いと考えられるため、ヒトが摂取する上で組成物として不適である。主鎖の炭素数が１２を超えると、常温で固体となるものもあり、液状の製剤や食品に利用すると分離・沈殿することが予想され使用上の制限を受ける場合がある。二重結合の位置が少なくとも２位又は４位でない場合にも、ＴＲＰＡ１活性化能が劣る。

上記不飽和アルデヒドの具体例としては、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘプタジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ノナジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ドデカジエナール、２，３−ブタジエナール、２，４−ペンタジエナール、３，４−ペンタジエナール、２，７−オクタジエナール、２，６−オクタジエナール、２，４−オクタジエナール、２，６−ノナジエナール、４，７−デカジエナール、２，４−ウンデカジエナール、２，６−ドデカジエナール、３，７−ジメチル−２，６−ノナジエナール、ｔｒａｎｓ−２−メチル−２，６−ヘプタジエナール、２，４−ジメチル−２，６−ヘプタジエナール、３，６−ジメチル−２，５−ヘプタジエナール、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール、３，７−ジメチル−２，７−オクタジエナール、２，４−ジエチル−２，６−ヘプタジエナール、３，４，８−トリメチル−２，７−ノナジエナール、５，９−ジメチル−４，９−デカジエナール、４，８−ジメチル−４，９−デカジエナール、５，９−ジメチル−４，８−デカジエナール、ｔｒａｎｓ−２−メチル−６−メチレン−２，７−オクタジエナール、４，５−ヘキサジエナール、４，７−ウンデカジエナール、ｔｒａｎｓ−２−ブテナール、ｔｒａｎｓ−２−ヘプテナール、ｔｒａｎｓ−２−オクテナール、ｔｒａｎｓ−２−ノネナール、ｔｒａｎｓ−２−ペンテナール、３−メチル−２−ブテナール、ｔｒａｎｓ−２−メチル−２−ブテナール、２−エチル−２−ブテナール、４−メチル−２−ペンテナール、ｔｒａｎｓ−２−メチル−２−ペンテナール、２−メチル−２−オクテナール、２−プロピル−２−ヘプテナール、３−プロピル−２−ヘプテナール、４−（２，５−ジメチルシクロへキシリデン）−２−ブテナール、２−ブチル−２−オクテナール、５−（メチルチオ）−２−［（メチルチオ）メチル］−２−ペンテナール、４−メチル−２−［（メチルチオ）メチル］−２−ヘキセナール、５−メチル−２−［（メチルチオ）メチル］−２−ヘキセナール、４−メチル−２−［（メチルチオ）メチル］−２−ペンテナール、２−［（メチルチオ）メチル］−２−ブテナール、２−エチル−２−ヘキセナール、２−ブチル−２−オクテナール、ｔｒａｎｓ−４−デセナール、ｃｉｓ−４−デセナール、４−ノネナール、４−ドデセナール、４−ウンデセナール、２−メチル−４−ウンデセナール、２−メチル−４−ドデセナール、２，４，６−オクタトリエナール、５，９−ジメチル−２，４，８−デカトリエナール、２，４，６−ノナトリエナール、２，４，８−ウンデカトリエナール、２，４，６，８−ウンデカテトラエナール、２，４，６，８−ノナテトラエナール、２，４，６，８−デカテトラエナール、２，４，６，８，１０−ウンデカペンタエナール、２，４，６，８，１０−ドデカペンタエナール等が挙げられる。

前記不飽和アルデヒドは、好ましくは主鎖の炭素数が４〜１２であって２位及び４位に二重結合を有するジ不飽和アルデヒド、主鎖の炭素数が４〜９であって２位に二重結合を有するモノ不飽和アルデヒド、及び主鎖の炭素数が９〜１２であって４位に二重結合を有するモノ不飽和アルデヒドからなる群から選ばれる。そのような不飽和アルデヒドの例には、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘプタジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ノナジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ドデカジエナール、２−ブテナール、ｔｒａｎｓ−２−ヘプテナール、ｔｒａｎｓ−２−オクテナール、ｔｒａｎｓ−２−ノネナール、ｔｒａｎｓ−４−デセナール、ｃｉｓ−４−デセナール等が挙げられる。

本発明の組成物は、二重結合の位置が２位である前記不飽和アルデヒドを必須に含むことが好ましい。そのような不飽和アルデヒドの例には、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘプタジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ノナジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ドデカジエナール、２−ブテナール（クロトンアルデヒド）、ｔｒａｎｓ−２−ヘプテナール、ｔｒａｎｓ−２−オクテナール、ｔｒａｎｓ−２−ノネナール等が挙げられる。

二重結合の位置が２位及び４位である前記不飽和アルデヒドを必須に含むと、組成物のＴＲＰＡ１活性化能がより高くなる点で特に好ましい。そのような不飽和アルデヒドの例には、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘプタジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ノナジエナール、ｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ドデカジエナール等が挙げられる。

前記不飽和アルデヒドは、トランス体であることが好ましい。

本発明の組成物は、二重結合を２個有する前記不飽和アルデヒド及び二重結合を１個有する前記不飽和アルデヒド、又は、二種類の二重結合を２個有する前記不飽和アルデヒドを必須に含むことが好ましい。二種類以上の不飽和アルデヒドの組み合わせは、ＴＲＰＡ１活性化能を相乗的に促進することが判明した。二重結合が１個の前記不飽和アルデヒドは、炭素数８以下であることが好ましく、ｔｒａｎｓ−２−オクテナールであることがより好ましい。二重結合が２個の前記不飽和アルデヒドは、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘプタジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナールであることが好ましい。また、二種類の二重結合を２個有する前記不飽和アルデヒドを必須に含む場合には、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘプタジエナールを必須に含むことが好ましい。

本発明の組成物は、従来のＴＲＰＡ１活性化成分と同様に、ヒトを含む動物において、冷涼感やスパイシー感の喚起、体温低下抑制（特に、冷環境下での抑制）、脂肪細胞の分化誘導、発毛の低減、便秘型過敏性腸症候群、弛緩性便秘及び機能性胃腸障害の予防又は治療、皮膚バリアー機能回復促進、胃内容物の排泄遅延、摂餌量（食欲）の減少、空腹感の低減、満腹感の増大等の効果が期待される。そこで、本発明の組成物の具体的な用途には、冷涼感やスパイシー感を得ることができる飲料、食欲抑制、過食症予防・改善、肥満症予防・改善、体脂肪蓄積抑制の効果のある飲食物等への添加が挙げられる。

本発明の組成物は、医薬及び機能性食品として提供され得る。組成物中のアクリル酸及び／又は不飽和アルデヒドの含有量は、通常、０．００５〜６０重量％であり、好ましくは０．０５〜３０重量％である。

本発明の組成物は、有効成分としてのアクリル酸及び／又は不飽和アルデヒド以外に、薬理学上あるいは食品学上許容されるその他の添加剤を本発明の効果を阻害しない範囲で添加することができる。そのような添加剤の例には、コーンスターチ、結晶セルロース、ラクトース等の賦形剤；澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；メチルセルロース又はその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン等の結合剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油等の滑沢剤；キサンチン誘導体、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、果糖、ブドウ糖、ソルビトール等の甘味料、矯味剤、クエン酸等の酸味料、香料、着色剤、ビタミン類、ミネラル類、脂質等が挙げられる。

本発明の組成物の形状は、特に限定されず、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤や、ドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤が挙げられる。

本発明の組成物の投与方法は、特に制限がない。医薬では、経口と非経口（静注、筋注、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、経皮投与等）のいずれでもよい。

本発明の組成物の医薬としての用量は、投与される患者の年齢、体重や既往症（例えば肥満症）によって変わり得る。具体的な用量は、成人１日当たりのアクリル酸及び／又は不飽和アルデヒド摂取量として、通常、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。

本発明の組成物の機能性食品としての摂取量は、摂取する対象の年齢、体重や既往症（例えば肥満症）によって変わり得る。具体的な用量は、成人１日当たりのアクリル酸及び／又は不飽和アルデヒド摂取量として、通常、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇ体重である。

本発明は、また、上記組成物を含む食品を提供する。食品には、愛玩動物を対象とした飼料も含まれる。食品の中に本発明の組成物を添加しておくことで、食品の摂取量を抑制することができる。食品の例は、特に限定されず、例えば、サラダ、唐揚げ、豆腐、こんにゃく等の惣菜；スープ；パン、米飯及びヌードル；クッキー、マフィン、ケーキ、チップス、スナック、チョコレート、ゼリー、プリン、チューインガム、キャンディ等の菓子類；ヨーグルト、牛乳等の乳製品；ハム、ソーセージ、かまぼこ等の魚肉練り製品；コーヒー、ジュース、スポーツ飲料等の飲料；並びにドレッシング、醤油、ソース等の調味料等の一般加工食品が挙げられる。

食欲抑制食品への組成物の添加量は、アクリル酸及び／又は不飽和アルデヒドとして、通常、０．００１〜０．０３重量％であり、好ましくは０．００３〜０．０１５重量％である。

以下に、本発明に従う実施例、及び比較例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限られるものではない。

〔実施例１〜４〕CCK分泌促進に基づくＴＲＰＡ１活性化能の評価（１）
本発明に従う不飽和アルデヒドがＴＲＰＡ１活性を有するか否かを、非特許文献５と同様の方法で試験した。具体的には、ＴＲＰＡ１阻害剤の存在下及び非存在下において、試験物質を含有する評価溶液で細胞を処理し、ＣＣＫ分泌量及び細胞内カルシウムイオン濃度を調べること、並びに細胞外カルシウムイオン存在下及び非存在下でのＣＣＫ分泌量及び細胞内カルシウムイオン濃度を調べることにより、試験物質のＴＲＰＡ１活性化能を評価した。

１−１．試験物質の用意
本発明に従う不飽和アルデヒドとして、以下の試薬を用意した。
実施例１：ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール（ｔ，ｔ−２，４−Ｃ６）（東京化成工業株式会社より入手）、
実施例２：ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナール（ｔ，ｔ−２，４−Ｃ１０）（東京化成工業株式会社より入手）、
実施例３：ｔ−２−オクテナール（ｔ−２−Ｃ８）（東京化成工業株式会社より入手）、及び
実施例４：ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ドデカジエナール（ｔ，ｔ−２，４−Ｃ１２）（和光純薬工業株式会社より入手）
また、比較のため、本発明に従わない不飽和アルデヒドとして、以下の試薬（いずれも東京化成工業株式会社より入手）を用意した。
比較例１：ｔｒａｎｓ−２−デセナール（ｔ−２−Ｃ１０）、及び
比較例２：ｔｒａｎｓ−２−ドデセナール（ｔ−２−Ｃ１２）

また、ＴＲＰＡ１活性化成分として公知の試薬（シグマアルドリッチジャパン株式会社より入手）を、陽性対照として用意した。
参考例１：アリルイソチオシアネート（ＴＲＰＡ１アゴニスト、ＡＩＴＣ）
また、ＴＲＰＡ１活性化を介さずにＣＣＫ分泌を促進する対照として苦味受容体アゴニストを用いた。
参考例２：デナトニウム（苦味受容体アゴニスト、Ｄｅｎａｔｏｎｉｕｍ）

１−２．評価溶液の調製
試験物質をエタノール（ＥｔＯＨ）に溶解後、ＨＥＰＥＳバッファー（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、４．５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）にてエタノール溶液が０．１ｖｏｌ％になるように希釈して評価溶液とした。

１−３．ＣＣＫ分泌量の測定方法
マウス小腸由来のＣＣＫ産生細胞株ＳＴＣ−１を、４８ウェルプレート中で、１０％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地にて、３７℃、５％ＣＯ_２存在下、サブコンフルエントになるまで２〜３日間培養した。ＨＥＰＥＳバッファーでウェルを洗浄後、１００μＭの試験物質を含有する評価溶液を１００μＬ添加し、３７℃にて６０分間インキュベーションした。上清を回収後、遠心分離（８００×ｇ、５分、４℃）により剥離細胞を沈殿させ、その上清８０μＬを回収し、凍結保存した。上清中のＣＣＫ濃度を、Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製）にて測定した。

１−４．細胞内カルシウム濃度の測定方法
ＣＣＫ産生細胞株ＳＴＣ−１の細胞内カルシウムイオン濃度動態を、蛍光プローブＦｕｒａ ２−ＡＭを用いてモニタリングした。このプローブは、カルシウムイオン選択的な錯体形成挙動を示すＢＡＰＴＡ構造を有し、さらに細胞内へ取り込まれるように脂溶性を高めたアセオキシメチル（ＡＭ）体である。アセトキシメチル基は細胞内でエステラーゼにより加水分解され、Ｆｕｒａ−２が細胞内へ分散される。

細胞内カルシウムイオン濃度が高くなると、３４０ｎｍ励起の蛍光強度が上昇し、３８０ｎｍ励起の蛍光強度が低下する。蛍光強度比（＝Ｆ_{ｅｘ．３４０ｎｍ}／Ｆ_{ｅｘ．３８０ｎｍ}）は、細胞内カルシウムイオン濃度の指標となる。図中、蛍光強度比をΔ３４０／３８０ｒａｔｉｏと称する。

まず、ＳＴＣ−１細胞をカバースリップ上に２日間培養した。次いで、０．００５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（界面活性剤、ライフテクノロジーズジャパン株式会社より入手）を含むＨＥＰＥＳバッファーにＦｕｒａ−２−ＡＭ（細胞内カルシウムイオン指示薬、ライフテクノロジーズジャパン株式会社より入手）を２μＭになるように溶解した。上記溶液中に細胞を培養したカバースリップを暴露し、３７℃の温度で２０分間保持することで、Ｆｕｒａ−２−ＡＭを細胞内に取り込ませた。カバースリップをフォルダに固定し、ＨＥＰＥＳバッファーの入ったキュベットに浸した。

上記キュベットを蛍光光度計（製品名ＣＡＦ−１１０、日本分光株式会社製）にセットした。キュベット内の溶液を２５℃で１０００ｒｐｍにて攪拌しながら、カバースリップ上の細胞を試料溶液に暴露した。そして、二励起波長（３４０ｎｍ，３８０ｎｍ）、及び蛍光波長（５１０ｎｍ）での蛍光強度を、評価溶液の暴露３分前〜暴露５分後にわたって測定した。蛍光強度から蛍光強度比Δ３４０／３８０ｒａｔｉｏを求めた。

１−５．試験物質のＣＣＫ分泌促進及びカルシウムイオンシグナル誘導に関する細胞外カルシウムイオンの影響
図１Ａは、細胞外カルシウムイオン存在下又は非存在下において、本発明に従う不飽和アルデヒド（実施例１〜３）を含む試料溶液で細胞を処理した場合のＣＣＫ分泌量の変化を示すグラフである。図から、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール（実施例１）、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４デカジエナール（実施例２）、及びｔ−２−オクテナール（実施例３）は、細胞外カルシウムイオンの存在下では、陰性対照（０．１％ ＥｔＯＨ）と比べて有意に高いＣＣＫ分泌誘導を示した。しかし、カルシウム非存在下の系では、ＣＣＫ分泌活性が抑制された。

図１Ｂは、細胞外カルシウムイオン存在下又は非存在下において、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４デカジエナール（実施例２）を含む試料溶液で細胞を処理した場合の細胞内カルシウムイオン濃度変化を、蛍光強度比で示すグラフである。

図１Ａ及び１Ｂから、実施例２のｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナールは、非特許文献５でのＡＩＴＣと同様に、細胞外カルシウム非存在下では細胞内カルシウムシグナル誘導能を消失することがわかる。

１−６．試験物質のＣＣＫ分泌促進及びカルシウムシグナル誘導に関するＴＲＰＡ１阻害剤の影響
図２Ａは、１００μＭのＴＲＰＡ１阻害剤（製品名：ＨＣ−０３００３１、シグマアルドリッチジャパン株式会より入手）を試料溶液に添加し、ＴＲＰＡ１を阻害した場合（以後、上記の処理を「ＴＲＰＡ１阻害剤処理」という。）と、ＴＲＰＡ１阻害剤を試料溶液に添加せず、ＴＲＰＡ１を阻害しなかった場合（以後、上記の処理を「ＴＲＰＡ１阻害剤未処理」という。）のＣＣＫ分泌量の変化を示すグラフである。図２Ａから、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４デカジエナール（実施例２）は、ＡＩＴＣ及びデナトニウムと同様に、陰性対照（０．１％ ＥｔＯＨ）と比べて有意に高いＣＣＫ分泌誘導を示す。ＡＩＴＣ及びｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４デカジエナールは、ＴＲＰＡ１阻害剤処理によりＣＣＫ分泌が抑制された。一方、苦味受容体アゴニストであるデナトニウムは、ＴＲＰＡ１阻害剤処理によってＣＣＫ分泌に影響しなかったことにより、ＨＣ−０３００３１はＴＲＰＡ１を選択的に阻害することが確かめられた。

図２Ｂは、１００μＭのＴＲＰＡ１阻害剤（ＨＣ−０３００３１）処理をした試料溶液で細胞を処理した場合と、ＴＲＰＡ１阻害剤未処理の溶媒対照（以下Vehicleと表記）で細胞を処理した場合の細胞内カルシウムイオン濃度変化を示すグラフである。図２Ｂから、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナール（実施例２）は、非特許文献５でのＡＩＴＣと同様に、ＴＲＰＡ１阻害剤処理により細胞内カルシウムシグナル誘導能を消失することがわかる。

図１〜２の内容を総合すると、本発明に従う不飽和アルデヒドは、細胞外カルシウムイオン依存的及びＴＲＰＡ１依存的であり、換言すると、ＴＲＰＡ１活性化能を有するといえる。

図３Ａ及びＢは、本発明に従う不飽和アルデヒドを含む試料溶液（実施例２〜４）、並びに本発明に従わない不飽和アルデヒド（比較例１及び２）を含む試料溶液で細胞を処理した場合のカルシウムイオン濃度変化を示すグラフである。図３Ｃは、各例のカルシウムイオン濃度の最大値を比較する図である。図から、実施例２〜４の不飽和アルデヒドは、細胞内カルシウムイオンシグナル誘導を促す。そして、これらの不飽和アルデヒドは、比較例１のｔｒａｎｓ−２−デセナール及び比較例２のｔｒａｎｓ−２−ドデセナールと比べて有意に高い誘導を示す。

〔実施例５〜１２〕CCK分泌促進に基づくＴＲＰＡ１活性の評価（２）
本発明に従う不飽和アルデヒドのＣＣＫ分泌活性を調査することにより、ＴＲＰＡ１活性の有無を調査した。
１−１．試験物質の用意
表１に示すように、主鎖の炭素数が３〜１３個であって、主鎖中に二重結合を０〜２個有するアルデヒド、ケトン、アルコール、脂肪酸及び炭化水素を用意した。試験に使用した各試薬の購入先は以下である。
東京化成工業株式会社より入手：
ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘキサジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ヘプタジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ノナジエナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナール、デカナール、ウンデカナール、ドデカナール、トリデカナール、ｔｒａｎｓ−２−デセナール、ｔｒａｎｓ−２−ノネナール、ｔｒａｎｓ−２−ドデセナール、ｔｒａｎｓ−２−オクテナール、アクリル酸、ｔｒａｎｓ−２−オクテン−１−オール、ｃｉｓ−４−デセン−１−オール、ｔｒａｎｓ−２−オクテン酸、デカナール、ドデカナール、トリデカナール、ｎ−トリデシルアルコール、ｔｒａｎｓ−３−デセン−２−オン、ｎ−オクタン酸、デカン酸、デカン、ｃｉｓ−２−デセン、及びｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−１，９−デカジエン
関東化学株式会社より入手：
ｔｒａｎｓ−２−ブテナール（クロトンアルデヒド）、オクタナール、ｔｒａｎｓ−２−ウンデセナール、オクタナール、ｎ−デシルアルコール、ドデシルアルコール、ラウリン酸、及びｎ−トリデカン酸
シグマアルドリッチジャパン株式会社より入手：
ｔｒａｎｓ−２−ヘプテナール、ブタナール（ブチルアルデヒド）、及びｃｉｓ−４−ヘプテナール
和光純薬工業株式会社より入手:
ノナナール、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−ドデカジエナール、ｔｒａｎｓ−４−デセナール、ｃｉｓ−４−デセナール、ｃｉｓ−７−デセナール、ｃｉｓ−６−ノネナール、ｔｒａｎｓ−１０−ウンデセナール、ｃｉｓ−４−デセナール、２−プロペン−１−オール、及び１−オクタノール

また、細胞試験系でのＣＣＫ分泌量が最大となる条件として、脱分極によりホルモン放出が生じる７０ｍＭ ＫＣｌ（陽性対照）を用意した。なお、一度に試験できる数が限られるため、試験物質を表１に示すように５つのグループに分けた。実験グループ間の不連続性を解消するために、各グループに常にｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナールを入れた。各試験物質の試験数は３とし、その平均値を求めた。

ＶｅｈｉｃｌｅのＣＣＫ分泌量は、１０〜３０ｐＭの間で試験毎に変動した。実施例１〜１２の試験物質（１００μＭ）によるＣＣＫ分泌量は３０〜６０ｐＭに達し、常にＶｅｈｉｃｌｅの２〜３倍に増大した。一方、比較例の試験物質によるＣＣＫ分泌量は、Ｖｅｈｉｃｌｅと同程度であり、中にはＶｅｈｉｃｌｅより低いものも存在した。実施例に示すアクリル酸及び特定の不飽和アルデヒドにＣＣＫ分泌促進活性があることが確認された。

通常の状態に試験物質を添加したときのＣＣＫ分泌量の増減を知るために、測定値からＶｅｈｉｃｌｅ測定値を引いたものを真値とし、さらに、真値を対照である７０ｍＭ ＫＣｌの値で除することにより、ＣＣＫ分泌促進活性のスコアを求めた。実験グループごとに分散分析を行い、Ｖｅｈｉｃｌｅとの差異を検定し、Ｐ＜０．０５で有意な差があると判断した。結果を、表２Ａ及び表２Ｂに示す。

※：有意差あり（Ｐ＜０．０５）
−：有意差なし

※：有意差あり（Ｐ＜０．０５）
−：有意差なし

表２Ａ及び表２Ｂから、以下のことがわかる。実施例１〜２、４−６の不飽和アルデヒドには、有意差をもってＣＣＫ分泌促進活性が確認された。実施例１〜２、４−６と比較例１５〜３０との対比から、ＣＣＫ分泌促進活性は、アルコール、アクリル酸を除く脂肪酸及び炭化水素にはがないが、アルデヒドにあることがいえる。実施例１〜２、４−６と比較例３〜９との対比から、アルデヒドは、不飽和アルデヒドである必要がある。実施例１〜２、４−６と比較例１２〜１４との対比から、二重結合の位置は、２位及び４位である必要がある。

比較例３１〜３４と比較例１、８〜１０との対比から、２位にのみ二重結合を有する不飽和アルデヒドは、主鎖の炭素数が９以下である必要がある。また、比較例３５〜３６と比較例１１との対比から、４位にのみ二重結合を有する不飽和アルデヒドは、主鎖の炭素数が９以上である必要がある。

比較例３５と比較例３６との対比から、不飽和アルデヒドは、トランス体であることが好ましい。トランス体が優位であることは、最良の結果を示す実施例１〜５がすべてトランス体であることからも示唆される。

実施例１〜６に示すように、ＣＣＫ分泌促進活性の最良の結果は、２位及び４位に二重結合を有する不飽和アルデヒドである。特に、ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナールのＣＣＫ分泌促進活性が最も高い。

〔実施例１３〜２３〕ＣＣＫ分泌促進活性の相乗効果
二種類の不飽和アルデヒドを表３に示すように組み合わせて、ＣＣＫ分泌促進活性の評価を行った。二種類の試験物質の濃度を各５０μＭ（１−３の試験時の１／２の濃度）に変更した以外は、実施例１と同様の手順で試験した。結果を表３に示す。

表３より、二重結合を２個有する不飽和アルデヒド及び二重結合を１個有する不飽和アルデヒド、又は、二種類の二重結合を２個有する不飽和アルデヒドの組み合わせによれば、ＣＣＫ分泌活性が促進されることが確認された。特に、二重結合を２個有する不飽和アルデヒドと炭素数８以下の二重結合を１個有する不飽和アルデヒドとの組み合わせにおいて、ＣＣＫ分泌活性が強く促進されることが確認された。さらに好ましくは、２位及び４位に二重結合を有する不飽和アルデヒドと２位に二重結合を有するｔｒａｎｓ−２−オクテナールの組み合わせにおいて、ＣＣＫ分泌活性が強く促進されることが確認された。

Claims (7)

1. ２位及び４位に二重結合を有する主鎖の炭素数４〜１２のジ不飽和アルデヒドを有効成分として含むＴＲＰＡ１活性化組成物。
2. 前記ジ不飽和アルデヒドがトランス体であることを特徴とする、請求項１に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
3. 前記ジ不飽和アルデヒドが、ｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓ−２，４−デカジエナールである、請求項２に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
4. さらに、少なくとも２位又は４位に二重結合を有する主鎖の炭素数４〜１２の不飽和アルデヒドであって、ただし、二重結合の位置が２位のみの場合は主鎖の炭素数が４〜９であり、そして二重結合の位置が４位のみの場合は主鎖の炭素数が９〜１２である前記不飽和アルデヒドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
5. 二重結合が１個の前記不飽和アルデヒドがｔｒａｎｓ−２−オクテナールである、請求項４に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物を含む食欲抑制剤。
7. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物を含む食欲抑制食品。