JP6078083B2 - 魚類寄生虫駆除方法 - Google Patents

Description

本発明は、魚類寄生虫の駆除方法に関する。詳細には、葉酸合成阻害剤及び／又は葉酸活性化阻害剤を有効成分とする魚類寄生虫の駆除方法である。特に、養殖魚への寄生が問題となっている魚類寄生虫の駆除方法に関する。

海面養殖において寄生虫症は安定した生産の妨げとなるために、非常に大きな問題である。原生動物亜界繊毛虫門に属する海水白点虫Cryptocaryon irritansは海水魚へ寄生し白点病を引き起こす。その結果として寄生魚は衰弱し死に至る。近年、養殖魚に対する海水白点虫の寄生は日本の養殖業において深刻な問題となっている。海水白点虫はヒラメParalichthys olivaceus、カンパチSeriola dumerili、ブリSeriola quinqueradiata、マダイPagrus major、トラフグTakifugu rubripesに寄生することがこれまで報告されている。海水白点虫以外の白点虫として淡水白点虫Ichthyophthirius multifiliisが存在する。海水白点虫の生活史と淡水魚の白点病を引き起こす淡水白点虫の生活史とは類似しており、魚体内に寄生し宿主を死に至らしめるトロホント（成虫）、魚体から離脱し海水中に出てきたプロトモント、プロトモントが沈降して水底などに付着して活動を停止したトモント（シスト、耐性卵ともいう）、及びトモントから再び放出され、寄生する宿主となる魚を探しながら水中を浮遊するセロント（仔虫）のステージを繰り返す。トロホントは魚の表皮及び鰓の上皮組織に寄生し、宿主の組織から栄養摂取し目に見えるほどの大きさまでに成長する。

セロントは比較的薬物に弱く比較的容易に殺すことができ、寿命も短い。ホロント（寄生した仔虫）は魚の体表の真皮近くの表皮層にまで入り込み成虫（トロホント）となるので、これらを魚の体表の外側から薬物で駆除するのは困難である。シストも外殻に覆われており、薬物で駆除するのは困難である。したがって、白点虫の駆除のためには定期的に薬浴を繰り返し、体表の真皮層に入り込んでいないセロントやトロホントを駆除して白点虫の数を減らしていき、最終的には増殖サイクルを断ち切る。このような時間をかけて駆除する方法が採用されているが、魚の斃死被害をくいとめられない場合がある。

経口投与剤としては、マダイの白点病に対して塩化リゾチームが水産用医薬品として認可されている。また、ラクトフェリンも水産用添加剤として市販されている（特許文献１）。ラクトフェリンを４０mg／kg魚体重／日の割合で経口投与すると、２８日の実験期間中、感染はみられなかったのに対し、無添加飼料を与えた魚では大半が死亡したとする報告がある。塩化リゾチームやラクトフェリンの作用機序は宿主魚の非特異的生体防御能を高めるものと考えられており、その効果には限界がある（非特許文献１）。経口投与で直接寄生虫を駆除できる寄生虫薬が待望されている。

サルファ剤はスルホンアミド基を有する抗菌剤として知られており、細菌の葉酸合成を阻害するメカニズムが知られている。また、サルファ剤と同様に葉酸に関連するメカニズムで抗菌作用を示す薬剤として、葉酸代謝拮抗剤として知られるトリメトプリム、オルメトプリムなどがある。メトトレキセート、アミノプテリンは葉酸の誘導体であり、それぞれ、抗がん剤、殺鼠剤として使用されている。
スルファジメトキシン、スルファモノメトキシン、スルファモノメトキシンとオルメトプリムの配合剤は抗菌・抗生物質というカテゴリーで水産用医薬品として認可されている。サルファ剤はもともと抗菌剤であるが、ヒトにおいてはマラリアに、また、動物用医薬品として、動物や鶏のコクシジウム病などに有効であることが知られている（特許文献２）。

特開平９−３０１８０７号 特公昭５１−１６３４６号

小川和夫（２００４）：原虫症．魚介類の感染症・寄生虫病 （若林久嗣・室賀清邦 編），恒星社厚生閣，ｐｐ．２８５−３２０。 Dickerson, H. W., Dawe, D. L. (1995) Ichthyophthirius multifiliis and Cryptocaryon irritans (Phylum Ciliophora). In: Woo, P. T. K. (Ed), Fish Diseases and Disorders. Protozoan and Metazoan Infection, vol.1, CAB International, UK, pp.181-227.

本発明は、魚類の寄生虫、特に白点虫の駆除方法を提供することを目的とする。特に、本発明は、水槽や生簀などの同一環境内に多数の魚が一緒に飼育されている養殖魚に適した寄生虫の駆除方法を提供することを目的とする。養殖魚の場合、ヒトや動物のように１個体ずつ個別に隔離して治療することは難しく、水槽や生簀内の魚の一部にでも寄生虫症が発生すると瞬く間に全体に感染が広がる。したがって、一部にでも発症が認められたら、水槽や生簀の全個体に対して投薬し、全体の寄生虫を制御しなければならない。また、漁場内で蔓延した場合、同一漁場内の全生簀の魚に投薬して、寄生虫を制御しなければならない。多くの生簀は海洋や湖沼、河川にあり、外に開かれているので、寄生虫が入りこむのを遮断することはできない。

発明者らは、魚類の寄生虫駆除剤として有効な物質を得るために、広範な範囲の化合物について検討を重ねた。動物用の寄生虫薬として知られているものも数多く検討したが、寄生虫は寄生虫自体も多くの種類に分かれ、宿主もいろいろであるため、動物の寄生虫症に有効な抗寄生虫症薬が魚類の寄生虫症に有効であるとは限らず、白点虫に有効なものはなかなか見つからなかった。その中で、葉酸代謝に関するメカニズムを有するものが、白点虫に有効であることを見出し、本発明を完成させた。同時係属中の特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６９６７３）は葉酸合成阻害剤及び／又は葉酸活性化阻害剤を有効成分として含有する魚類の寄生虫駆除剤に関する。本発明では、特に生簀などの養殖場で多数一緒に飼育されている養殖魚の寄生虫の駆除に適した用法・用量を提供する。

本発明は、以下の（１）〜（１１）の魚類の寄生虫駆除方法を提供する。
（１）１日当たり１〜５０ｍｇ／ｋｇ魚体重の葉酸合成阻害剤及び／又は葉酸活性化阻害剤を魚類に投与することを含む、魚類の寄生虫駆除方法。
（２）葉酸合成阻害剤及び／又は葉酸活性化阻害剤を１〜２週間継続投与することを含む、上記（１）に記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（３）葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の合剤として投与する、上記（１）又は（２）に記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（４）葉酸合成阻害剤としてサルファ剤を投与する、上記（１）ないし（３）に記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（５）サルファ剤が、スルファメトキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファジメトキシン、スルファメラジン、スルフィソキサゾール、スルフィソミジン、スルファメチゾール、スルフィソゾール、及びこれらの薬学的に許容しうる塩から選択される、上記（４）に記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（６）葉酸活性化阻害剤としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を投与する、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（７）葉酸活性化阻害剤が、ピリメタミン、トリメトプリム、オルメトプリム、メトトレキサート、デノプテリン、プテロプテリン、アミノプテリン、エダトレキサート、ピリトレキシム、及び、これらの薬学的に許容しうる塩から選択される、上記（６）に記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（８）寄生虫が原生動物亜界に属する寄生虫である、上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の魚類の寄生虫駆除剤。
（９）寄生虫が原生動物亜界繊毛虫門に属する寄生虫である、（８）に記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（１０）寄生虫が白点虫である、上記（９）に記載の魚類の寄生虫駆除方法。
（１１）魚類が、スズキ目、カレイ目、ニシン目、フグ目、コイ目、ウナギ目、ナマズ目、エイ目、カラシン目、ベラ亜目、キノボリウオ亜目、ハゼ亜目、カダヤシ目、オステオグロッスム目(アロワナ目)、セミオノートゥス目(ガー目)、ポリプテルス目、ダツ目、トウゴロウイワシ目、及びタウナギ目から選択される魚類である、上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の魚類の寄生虫駆除方法。

本発明の魚類寄生虫駆除方法により、魚類の寄生虫、特に繊毛虫に属する寄生虫を駆除することができる。特に、養殖業界で問題となっている白点虫に有効である。本発明の白点虫駆除剤は経口投与、特に飼料に混合して給餌する方法で投与することができ、魚体に寄生している寄生虫に対しても成長阻害効果や殺虫効果を発揮する。本発明の用法・用量は、大量の魚が一緒に飼育されている養殖場での寄生虫駆除に適する。すなわち、低用量で寄生虫を制御しながら、１〜２週間継続投与することにより、寄生虫を全滅させるので、魚に対する負担が少なく、養殖場において耐性菌が発生するのを抑え、薬物の残留量も最小限で済む。また、１〜２週間継続投与することにより、次世代の寄生虫にも持続的に作用し、しかも環境水から混入してくる新たな寄生虫も制御することができる。すなわち、養殖漁場全体の寄生虫を制御することができる。

図１は実施例１の結果を対照区の寄生数を１とした時の各区の寄生数で示した図である。 図２は実施例２における、暴露３日後の各区マダイの鰓に寄生している白点虫の写真である。細長いのは鰓で、それに付着している黒い丸形〜楕円形に見えているのが白点虫である。図中、（ａ）は薬剤無添加飼料を給餌する対照区、（ｂ）はスルファジメトキシン２１６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム２４ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間経口投与する区、（ｃ）はスルファメトキサゾール４２９ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム８６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間経口投与する区をそれぞれ意味する。 図３は実施例２の結果を暴露３日後の寄生虫長の比較で示した図である。図３において、＊はＰ＜０．０１を意味する。 図４は実施例３と４の各区寄生虫の成長率を示した図である。対象区を１００としたときの白点虫の大きさを比較した。各区とも測定した白点虫数を６０個体とした。図４において、一番左側の棒グラフ（control：対象区）は無投薬の場合の結果を表し、左から２番目〜８番目の棒グラフは各々の葉酸合成阻害剤（SDMX, SMXZ, SMMX, SMDN, SID, SMZ, 及びSIZ）を３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間投与した場合の結果を表し、左から９番目〜１２番目の棒グラフは各々の葉酸活性化阻害剤（MTX, PRY, TMP, 及びPMD）を６０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間投与した場合の結果を表し、一番右側の棒グラフ（SDMX+TMP）は葉酸合成阻害剤であるSDMXを２１６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日と葉酸活性化阻害剤であるTMPを２４ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とを３日間投与した場合の結果を表す。全ての区で対象区と比較して有意差があった（Ｐ≦０．０１）． 図５は実施例５の試験概要を示した図である。 図６において、（ａ）は実施例５の暴露３日目の対照区２の寄生数を示した図であり、（ｂ）は実施例５の暴露５日目の各区の寄生数の比較を示した図である。 図７は実施例５の各区の（ａ）シスト数と（ｂ）シストサイズの比較を示した図である。（ａ）は暴露５日後、及び９日後の各区のシスト数を表す。（ａ）において、白い棒グラフ（□）は暴露５日後の結果を、黒い棒グラフ（■）は暴露９日後の結果をそれぞれ表す。（ｂ）は暴露５日後の各区のシスト長を表す。（ａ）及び（ｂ）において、＊はＰ＜０．０１を意味する。 図８は実施例５の各区の斃死数の比較を示した図である。 図９において、（ａ）は実施例６の無投薬区の暴露３日後の対照区２の寄生数を示した図であり、（ｂ）は実施例６の暴露５日後の各区のシスト長を示した図である。（ａ）及び（ｂ）において、＊はＰ＜０．０１を意味する。 図１０は実施例６の各区の斃死数の比較を示した図である。 図１１は実施例７の暴露３日後の対照区２の寄生数を示した図である。 図１２において、（ａ）は実施例７の各区の暴露５日後の平均寄生数を示した図であり、（ｂ）は実施例７の各区の暴露５日後の平均寄生虫長を示した図である。（ｂ）において、＊はＰ＜０．０５を意味する。 図１３は実施例７の暴露後の各区の寄生数の推移を示した表である。 図１４は実施例７の各区の斃死数の比較を示した図である。 図１５において、（ａ）は実施例８の暴露３日後の各区トラフグの白点虫寄生数（平均寄生数）の比較を示した図であり、（ｂ）は実施例８の暴露３日後の各区トラフグに寄生していた白点虫の寄生虫長（平均寄生虫長）の比較を示した図である。（ｂ）において、＊はＰ＜０．０１を意味する。 図１６において、（ａ）は実施例９の暴露３日後の各区ヒラメの白点虫寄生数（平均寄生数）の比較を示した図であり、（ｂ）は実施例９の暴露３日後の各区ヒラメに寄生していた白点虫の寄生虫長（平均寄生虫長）の比較を示した図である。（ａ）において、＊はＰ＜０．０５を意味し、＊＊はＰ＜０．０１を意味する。（ｂ）において、＊はＰ＜０．０１を意味する。 図１７において、（ａ）は実施例１０の暴露３日後の各区カンパチの白点虫寄生数（平均寄生数）の比較を示した図であり、（ｂ）は実施例１０の暴露３日後の各区カンパチに寄生していた白点虫の寄生虫長（平均寄生虫長）の比較を示した図である。（ａ）において、＊はＰ＜０．０５を意味し、（ｂ）において、＊はＰ＜０．０１を意味する。 図１８において、（ａ）は実施例１１の暴露３日後の各区マハタの白点虫寄生数（平均寄生数）の比較を示した図であり、（ｂ）は実施例１１の暴露３日後の各区マハタに寄生していた白点虫の寄生虫長（平均寄生虫長）の比較を示した図である。（ａ）において、＊はＰ＜０．０５を意味する。（ｂ）において、＊はＰ＜０．０５を意味し、＊＊はＰ＜０．０１を意味する。 図１９は実施例１２の暴露３日目と７日目の各区寄生数の比較を示した図である。 図２０は実施例１２の暴露９日目の供試魚（黒出目金）の淡水白点虫寄生状況を撮影した図である。（ａ）は対象区の感染９日目の状況を表す。供試魚の体表に無数の白点虫が見られる。（ｂ）はSMMX+OMPの配合剤を投与した区の感染９日目の状況を表す。対象区と比較して白点虫はほとんど見られない。 図２１は実施例１３の暴露１４日後の各試験区の寄生数を示した図である。 図２２は実施例１３の各試験区の試験期間中の死亡推移を示した図である。 図２３は実施例１３の暴露１５日後の各試験区の寄生数を示した図である。 図２４は実施例１４の各試験区の試験期間中の死亡推移を示した図である。

本発明において魚類とは、海水魚、淡水魚のいずれの魚種を含む。実用上は寄生虫を駆除する必要が生じる養殖魚や観賞魚として取り扱われている魚種である。中でも特に産業上重要なのは、養殖魚であり、例えば、フグ目フグ科のトラフグ、スズキ目ハタ科のハタ、スズキ目シクリッド科のティラピア、ナマズ目ナマズ科あるいはコイ目ナマズ科のナマズ、コイ目ソウギョ亜科のソウギョ、アブラミス亜科のハクレンやコクレン、サケ目サケ科の大西洋サケ・マスノスケやニジマス、ナマズ目アメリカナマズ科のチャネルキャットフィッシュやパンガシウス科のチャーやバサ、コイ目コイ亜科のキンギョや錦鯉など、白点虫などの魚類寄生虫の寄生が知られている魚種、あるいは魚類寄生虫の寄生の可能性がある魚種において、本発明の方法を予防的あるいは治療的に用いることができる。

本発明の対象となる魚種には、淡水及び海水の中で生存している全ての年齢の養殖魚、水族館や商業の鑑賞魚が含まれる。特に白点虫等の寄生が知られている魚種としては、養殖魚では、スズキ目、カレイ目、ニシン目、フグ目、コイ目、ウナギ目、ナマズ目、ネズミギス目、エイ目、カラシン目、ベラ亜目、キノボリウオ亜目、ハゼ亜目、カダヤシ目、オステオグロッスム目(アロワナ目)、セミオノートゥス目(ガー目)、ポリプテルス目、ダツ目、トウゴロウイワシ目、タウナギ目の魚類などであり、ブリ類、ハタ類、タイ類、ヒラメ類、サケ類、フグ類、コイ類、ウナギ類、ナマズ類、ラスボラ類、ドジョウ類、プンティウス類、アナバス類、淡水フグ類、シクリッド類、ナマズ類、カラシン類、プラティ類、モーリー類、グッピー類、グラミー類、ベタ類、スネークヘッド類、卵生めだか類、キンギョ類、フナ類などの魚である。具体的には、カンパチ、ヒレナガカンパチ、ブリ（ハマチ）、ヒラマサ、マアジ、シマアジ、マサバ、スズキ、マダイ、イシダイ、イシガキダイ、ティラピア、スギ、キジハタ、クエ、マハタ、チャイロマルハタ、ヤイトハタ、サラサハタ、スジアラ、タマカイ、カサゴ、クロマグロ、ミナミマグロ、メバチマグロ、キハダマグロ、ビンナガマグロ、ヒラメ、マツカワ、ホシガレイ、ターボット、オヒョウ、ニジマス、大西洋サケ、ギンザケ、ベニザケ、アユ、トラフグ、カワハギ、キイロハギ、コイ、日本ウナギ、ヨーロッパウナギ、アメリカナマズ、サバヒー（Milkfish）、ハクレン、コクレン、ソウギョ、ケツギョ、ナイルティラピア、ペヘレイ、バラマンディ、ヨーロッパスズキ、レッドドラム、コモンカープ、コビア、バサ、チャー、Catla、Roho labeo、ラスボラ・ヘテロモルファ、ラスボラ・ヘンゲリー、ラスボラ・エスペイ、ラスボラ・アクセルロディ、ボララス・マクラータ、ロングノーズローチ、クーリーローチ、クラウンローチ、グリーン・スマトラ、オデッサ・バルブ、パール・ダニオ、セルフィンモーリー、ブラックモーリー、アカヒレ、ベトナムアカヒレ、グラミー、ベタ、スネークヘッド、ミドリフグ、ハチノジフグ、マレーフグ、メコンフグ、淡水エイ、ニードル・ガー、デルモゲニー、トビハゼ、シルバーアロワナ、ブラックアロワナ、アジア・アロワナ、ノーザンバラムンディ、スポッテッドバラムンディ、オスカー、アストロノータス・オルビクラータス、エンゼルフィッシュ、アルタム・エンゼル、スカラレ・エンゼル、ディスカス、ドワーフ・シクリッド、パピリオクロミス・ラミレジィ、パピリオクロミス・アルティスピノーサ、グリーンドワーフ・シクリッド、アピストグラマ、プカルパエンシス、タニエアカラ・エンディディ、ナンナカラ、ディスクロッスス、コリドラス、プレコストムス、オトシンクルス、カージナルテトラ、ネオンテトラ、カージナルテトラ、グリーンネオンテトラ、ラミーノーズテトラ、グローライトテトラ、ブラックネオンテトラ、レモンテトラ、ダイヤモンドテトラ、レッドファントムテトラ、エンペラーテトラ、ペンギンテトラ、ダイヤモンド・ピラニア、ピラニア・ナッテリー、ブラック・ピラニア、ピラニア・ピラヤ、アフィセミオン、エピプラティス、ノソブランキウス、プロカトーパス、アプリケイリクティス、イエロー・ピーコック、イエローストライプシクリッド、スキアエノクロミス・フライエリィ、ラビドクロミス・カエルレウス、ジュリドクロミス・トラスクリプトゥス、ジュエル・フィッシュ、ティラピア・ブティコフェリィ、肺魚、レインボーフィッシュ、ネオンドワーフ・レインボー、ニューギニア・レインボー、バタフライ・レインボー、ポポンデッタ・レインボー、セレベス・レインボー、マダガスカル・レインボー、バディス・バディス、アミメウナギ、ポリプテルス、ビキール・ビキール、キンギョ、錦鯉などが例示される。

本発明において寄生虫とは、原虫である。1980年に国際原生動物学会が提唱した従来の分類体系によると、魚類に寄生する種を含む原虫類は、肉質鞭毛虫、繊毛虫、アピコンプレックス、微胞子虫、ミクソゾアの門に分類される。
しかし近年、このような分類体系の根本的な見直しがなされている。国際原生動物学会が2005年に提唱した最新の分類体系では真核生物全体は6群のスーパーグループに分けられており、その下に第1段階、第2段階の分類群を配している。また高位のグループの名称に従来の界,門といった名称を使用しない、従来の肉質鞭毛虫門は様々なスーパーグループに分かれて位置づけられているなど、従来の分類体系とは大きく異なっている。この新しい分類体系は分子生物学的データや電子顕微鏡観察に基づいており、人為分類からより系統進化に基づいた分類体系となっており、この基本的な方向性は広く受け入れられていくと考えられるが、未だ不確定な部分も残しており、今後も修正が加えられる可能性がある。（良永和義・横山博著 改訂・魚病学概論(小川和夫・室賀清邦 編) 恒星社厚生閣,pp.92）。
本発明は、この中で特に白点虫の属する繊毛虫に有効である。具体的には、繊毛虫に属する、白点虫（Ichthyophthirius multifiliis、Cryptocaryon irritans）、トリコジナ（Trichodina sp.）、キロドネラ（Chilodonella sp.）、キネトフラグミノフォーラ類のBrooklynella hostilis、スクーチカ（Uronema marinum、Philasterides dicentrarchi、Miamiensis avidus、Uronema nigricans、Uronema sp.）などが例示される。特に、海水白点虫、淡水白点虫に有効である。

発明者らは、葉酸合成阻害剤、葉酸活性化阻害剤など葉酸の機能を阻害するメカニズムを有する薬剤が魚類の寄生虫駆除作用を有することを見出した。それら薬剤は寄生虫を駆除するだけでなく、寄生虫の成長も阻害するものであった。これは白点虫が自ら葉酸を合成し、その生存、成長に葉酸を必須成分とする原虫であることを示している。葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の合剤を投与したところ、さらに明らかな成長阻害及び駆虫効果が認められた。ごく少数の本虫がシストになったが、その大きさは対照区と比べ、有意に小さいものであった。これらシストを１２日間観察した結果、孵化の遅延やシストの発生異常が観察され、正常に成長しない状態にあった。したがって、葉酸の合成やその利用を妨げる作用を有する薬剤は魚類の寄生虫の駆除に有効である。

本発明における葉酸合成阻害剤とは、抗菌剤として知られている薬物群である。細菌はグアノシンを原料として数段階の反応を経て２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロリン酸を生合成し、これにパラアミノ安息香酸（PABA）が付加してジヒドロプテリン酸（DHP）になる。この反応を触媒する酵素がDHPシンテターゼであるが、サルファ剤に代表される葉酸合成阻害剤はPABAの代謝拮抗剤として働き、DHPの合成を阻害する。その結果、細菌は葉酸を生合成できなくなる。テトラヒドロ葉酸（THF）はプリンやチミンなどの核酸塩基あるいはメチオニン、セリン、グリシンなどのアミノ酸の生合成に必須な補酵素であるため、その合成が阻害されると細菌の増殖は抑制される。一方、ヒトをはじめとする高等動物ではDHP合成経路はなく、外部から取り入れた葉酸を還元してTHFを合成するので、サルファ剤の作用を受けない。抗結核薬であるパラアミノサリチル酸や抗癩薬であるジアミノジフェニルスルホンも同様な機序で抗菌活性を示す。サルファ剤はスルファニルアミドを基本骨格としアミド基が各種の複素環によって置換された化合物群の総称である。サルファ剤としては数千種類におよぶ化合物が合成されているが、本発明に用いるサルファ剤としてはヒトや動物で効果や安全性が確認されたもの、特に魚類用抗菌剤として使用されているサルファ剤を用いるのが好ましい。そのようなサルファ剤としては、スルファメトキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファジメトキシン、スルファメラジン、スルフィソキサゾール、スルフィソミジン、スルファメチゾール、スルフィソゾールが例示され、更にその他のサルファ剤としては、スルファジミジン（スルファメサジン）、スルファキノキサリン、スルファジアジン（スルファダイアジン）、スルファグアニシン、スルファセタミド、スルファメトキシピリダジン、スルファエトキシピリダジン、スルファクロルピラジン、スルファクロルピリダジン、サルファサラジン、スルファトロキサゾール、スルファチアゾール、スルファベンズアミド、スルファドキシン、スルファニトラン、スルファニルアミド、スルファピリジン、スルファブロモメタジン、スルファモイルダブソン、プララトレキセート（次世代葉酸拮抗剤）などが例示される。

本発明における、葉酸活性化阻害剤とは、葉酸合成阻害剤以外の葉酸の代謝に関与する、葉酸活性化阻害剤、葉酸拮抗剤、葉酸アナログなどと称される薬物である。葉酸活性化阻害剤の主なものとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤が知られている。ジヒドロ葉酸を活性型のテトラヒドロ葉酸に還元する酵素の阻害剤である。これらは葉酸合成阻害剤と組み合わせた合剤としても利用され、抗菌剤として相乗効果を示すことが知られている。また、葉酸拮抗剤、あるいは葉酸アナログなどとも呼ばれる葉酸と類似の構造を有し、やはり酵素阻害などにより、葉酸の活性化を阻害する薬物も知られている。これら葉酸活性化阻害剤としては、ピリメタミン、トリメトプリム、オルメトプリム、メトトレキサート、デノプテリン、プテロプテリン、アミノプテリン、エダトレキサート、ピリトレキシム、ジアベリジン、ペンタミジン、ペメトレキセド、トリメトレキセートなどが知られている。

本発明の寄生虫駆除剤は経口投与で効果を発現することができる。また、薬剤を溶解した液に魚を漬ける薬浴による投与や注射による投与も可能である。

本発明の寄生虫駆除剤の投与量については、経口投与の場合、１日当り魚体重１kgに対して有効成分である葉酸合成阻害剤、葉酸活性化阻害剤もしくは前記葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の合剤を１〜２０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与する。また、1回の投与期間は１〜１５日間が適当である。閉鎖系である水槽であれば、完全に寄生虫をなくしてしまうことも可能であるが、外海と接触している生簀ではその環境によって、寄生虫の生存・残存状態がさまざまであるから、魚の健康状態、寄生虫の寄生状態を把握しながら、休薬期間と上記の投与を繰り返すのが好ましい。例えば、スルファモノメトキシンとオルメトプリムの合剤、あるいは、スルファジメトキシンとピリメタミンの合剤の場合、１日当り魚体重１kgに対して２５〜５００ｍｇを３〜１５日経口投与することにより、十分な効果が得られる。寄生虫のライフサイクルを考慮して、この投与を繰り返すのが好ましい。
少数の魚を飼育する観賞魚などの場合ではなく、多数の魚を水槽や生簀などで一緒に飼育する養殖魚の場合は、寄生虫感染魚だけを隔離して飼育するようなことはできないため、一部の魚に感染が認められた場合でも、その養殖場全体の魚について投薬する必要がある。その場合、最小限の薬物量で寄生虫を制御することが、使用薬物の総量を最小限にすることができるので好ましい。本発明の薬物は抗菌作用も有するので、多く用いることは耐性菌の発生にもつながり好ましくなく、また、使用量は少ないほど、魚に与える負担も少なくて済む。寄生虫感染の程度や魚種にもよるが、１日当たり、１〜５０ｍｇ／ｋｇ魚体重の葉酸合成阻害剤及び／又は葉酸活性化阻害剤を１〜２週間継続して経口投与するのが好ましい。特に好ましい用量は、５〜２５ｍｇ／ｋｇ魚体重である。これらの用量を１〜２週間継続経口投与することにより、次世代の寄生虫も制御することができる。投与終了後、または約１〜２週間の投与継続後の段階で、魚の寄生虫感染状況を確認する。多くの場合、1日当たり５〜２５ｍｇ／ｋｇ魚体重の用量を５〜２０日間、好ましくは１〜２週間継続投与することで、養殖場の寄生虫感染は制御することができる。魚の鰓などを検査した結果、複数の魚に寄生虫が寄生していた場合、再度、同様の用法用量の治療を繰り返す。検査で、寄生虫の感染が認められない場合でも、２週間程度を目安に定期的に寄生虫感染状況を確認するのが好ましい。

また、飼育水に駆除剤を溶解し、これに魚体を浸漬し、直接接触させることもでき、その場合、有効成分の濃度が０．５〜５００ｐｐｍとなるように溶解させた飼育水に、対象魚を１０分間〜１５日間入れて接触させる。注射の場合は、１回に０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｋｇを投与する。なお、この場合の投与期間は１〜１５日間が適当である。

本発明の寄生虫駆除剤は、有効成分である前記化合物を単独で用いる他、必要に応じて他の物質、例えば担体、安定剤、溶媒、賦形剤、希釈剤などの補助的成分と組み合わせて用いることができる。葉酸合成阻害剤、葉酸活性化阻害剤は広くヒト、動物に用いられており、魚類にも抗菌剤として使用されている化合物であり、各種の製剤が知られている。本発明の目的に用いる場合もそれらに使用されている製剤を使用することができる。

また、形態も粉末、顆粒、錠剤、カプセルなど、通常これらの化合物に使用されている形態のいずれでもよい。化合物の味や臭いに敏感な魚の場合は、コーティングなどの方法により、飼料の嗜好性の低下を防止し、化合物が漏出しにくくすることができる。

魚類の場合、経口投与の薬剤は飼料に添加して用いるのが通常である。本発明の寄生虫駆除剤を飼料に添加する場合、それぞれの魚種用に必要とする栄養成分や物性が考慮された飼料を用いるのが好ましい。通常、魚粉、糟糠類、でんぷん、ミネラル、ビタミン、魚油などを混合してペレット状にしたもの、もしくは、イワシなどの冷凍魚と魚粉にビタミンなどを添加した粉末飼料（マッシュ）とを混合してペレット状にしたものなどが使用されている。魚の種類、サイズによって、１日の摂餌量はほぼ決まっているので、上記の用法用量となるよう換算した量の本寄生虫駆除剤を飼料に添加する。本寄生虫駆除は１日量を１回で投与しても、数回に分けて投与してもかまわない。

以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

本実施例で用いた薬剤は以下の製品である。
・スルファモノメトキシン＋オルメトプリム配合剤(Sulfamonomethoxine,Ormetoprim)
商品名「水産用エクテシン」、製造販売元 明治製菓株式会社、製造元 第一ファインケミカル株式会社
・スルファモノメトキシン(Sulfamonomethoxine)
商品名「水産用ダイメトンソーダ」、製造販売元 明治製菓株式会社、製造元 第一ファインケミカル株式会社
・スルフィソゾールナトリウム(Sulfisozole Na)
商品名「イスランソーダ」、販売元 シェリング・プラウ アニマルヘルス株式会社、製造販売元 セラケム株式会社
・スルファメトキサゾール(Sulfamethoxazole)、スルファジメトキシン(Sulfadimethoxine)、スルフィソミジン標準品(Sulfisomidine)、ピリメタミン(Pyrimethamine)、トリメトプリム(Trimethoprim)、メトトレキサート(Methotrexate)、和光純薬株式会社製、試薬
・オルメトプリム標準品(Ormetoprim)、関東化学株式会社製 試薬
・イセチオン酸ペンタミジン塩(Pentamidine Isetionate Salt)、スルファメラジン(Sulfamerazine)、スルファメチゾール(Sulfamethizole)、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製 試薬
実施例においてペレットに薬剤を添加と記載されている場合、薬剤を低糖化還元水飴（エスイー３０、日研化成株式会社製）を含む水溶液に溶かし、ペレットの表面に展着させて用いた。

＜マダイの白点虫寄生に対する葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の経口投与による駆虫効果−１＞
試験方法：平均魚体重約２０ｇのマダイ７０尾を２００リットル水槽で約７日間飼育し、25℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。注水は２．４リットル／分とした。寄生虫感染は、２００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約２０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各１０尾を１００リットル水槽７基に収容した。飼育期間中の注水は１．２リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、左側の鰓に寄生している白点虫を数えた。また、同時に寄生虫の大きさを観察した。

試験区：ピリメタミン８ｍｇ／ｋｇ魚体重／日で３日間経口投与する区、トリメトプリム５０ｍｇ／kg魚体重／日で３日間経口投与する区、スルファモノメトキシン３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日で３日間経口投与する区、スルファメラジンナトリウム５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日で３日間経口投与する区、スルファジメトキシン２１６mg／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム２４ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間経口投与する区、スルファメトキサゾール４２９ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム８６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間経口投与する区、薬剤無添加飼料を給餌する対照区の計７区を設定した。各薬剤の所定量をモイスト飼料（魚粉、魚油、活性グルテン、グアガム、ビタミンミックス、ミネラルミックス、フィードオイル、大豆レシチンを、それぞれ８０、３、２、４、３、６、２重量％の比率で混合し、本粉体に粉体重量の３０％重量の水を加えよく混合してペレット状にしたもの）に添加して試験飼料とした。

効果の判定：寄生数の比較、寄生虫形態を観察することで行った。

寄生虫形態を観察した結果、全薬剤投与区でマダイの鰓に寄生している本虫の大きさは対照区と比べ小さいことが判明した。本虫長は対照区で約３５０μｍ、全薬剤投与区で１００から２５０μｍであった。本結果は葉酸合成阻害剤ならびに葉酸活性化阻害剤が共通して本虫の成長を阻害することを示している。従って、本虫は自ら葉酸を合成する寄生虫であり、それを阻害することで成長を抑制できることが明らかとなった。寄生数の結果を図１に示した。ピリメタミン投与区、トリメトプリム投与区、スルファジメトキシンとトリメトプリム投与区及びスルファメトキサゾールとトリメトプリム投与区において寄生数が多い傾向を示した。本結果は本虫の成長が極端に阻害されたため、本虫がシストになるための宿主からの離脱が遅れたためと考えられる。海水温２５℃程度での白点虫の生活環は、まず約4日でシストから３０μｍほどの仔虫が孵化し、それが宿主の鰓や体表に寄生して約３日間宿主から栄養を取り３５０μｍ程に成長する。成長した本虫は宿主から離脱しシストになる。

＜マダイの白点虫寄生に対する葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の経口投与による駆虫効果−２＞
試験方法：平均魚体重約３９ｇのマダイ２４尾を２００リットル水槽で約７日間飼育し、２５℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。注水は２．４リットル／分とした。寄生虫感染は、２００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約１７万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各８尾を１００リットル水槽３基に収容した。飼育期間中の注水は１．２リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、鰓に寄生している白点虫長を測定した。

試験区：スルファジメトキシン２１６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム２４ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間経口投与する区、スルファメトキサゾール４２９ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム８６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を３日間経口投与する区、薬剤無添加飼料を給餌する対照区の計３区を設定した。各薬剤の所定量をモイスト飼料に添加して試験飼料とした。

効果の判定：鰓に寄生している本虫の寄生虫長を比較することで行った。

結果を図２と図３に示した。スルファジメトキシンとトリメトプリム投与区及びスルファメトキサゾールとトリメトプリム投与区の寄生虫長は対照区の本虫長と比べ優位に小さく（P＜0.01）、その成長が阻害されていた。従って、実施例１の結果が再現された。また、薬剤投与区の本虫の動きは対照区と比べ鈍く明らかに薬剤の影響を受けていた。

＜マダイの白点虫寄生に対する葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の経口投与による駆虫効果−３＞
試験方法：平均魚体重約９１ｇのマダイ５６尾を５００リットル水槽で約１２日間飼育し、２５℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。注水は２．４リットル／分とした。寄生虫感染は、５００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約５０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各７尾を１００リットル水槽８基に収容した。飼育期間中の注水は１．４リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、鰓に寄生している白点虫長を測定した。

試験区：スルファメトキサゾール（SMXZ）３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、スルファジメトキシン（SDMX）３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、スルファモノメトキシン（SMMX）３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、スルファメラジン（SMDN）３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、スルフィソミジン（SID）３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、スルファメチゾール（SMZ）３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、スルフィソゾール（SIZ）３００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日をそれぞれ３日間経口投与する区、薬剤無添加飼料を給餌する対照区の計８区を設定した。各薬剤の所定量をモイスト飼料に添加して試験飼料とした。

効果の判定：鰓に寄生している本虫の寄生虫長を比較することで行った。

また、本結果は実施例４と合わせて後述した。

＜マダイの白点虫寄生に対する葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の経口投与による駆虫効果−４＞
試験方法：平均魚体重約１１３．５ｇのマダイ４２尾を５００リットル水槽で約１２日間飼育し、２５℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。注水は２．４リットル／分とした。寄生虫感染は、５００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約５０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各７尾を１００リットル水槽６基に収容した。飼育期間中の注水は１．４リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、鰓に寄生している白点虫長を測定した。

試験区：トリメトプリム（TMP）６０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、メトトレキサート（MTX）６０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、ピリメタミン（PRY）６０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日、イセチオン酸ペンタミジン塩（PMD）６０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日をそれぞれ３日間経口投与する区、スルファジメトキシン２１６mg／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム２４ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合して３日間経口投与する区、薬剤無添加飼料を給餌する対照区の計６区を設定した。各薬剤の所定量をモイスト飼料に添加して試験飼料とした。

効果の判定：鰓に寄生している本虫の寄生虫長を比較することで行った。

実施例３と４の結果を図４に示した。薬剤を投与した全ての区の寄生虫長は対照区の本虫長と比べ有意に小さく（P＜0.01）、その成長が阻害されていた。さらに、全ての薬剤投与区において、本虫の動きは対照区と比べ鈍いことが観察された。これは、本虫が薬剤の影響を受けて生命を維持するための機能が低下していることを示している。先の実施例１の結果ならびに本実施例３、４の結果は、葉酸合成阻害剤ならびに葉酸活性化阻害剤が共通して本虫の成長を阻害する、白点虫の生命活動に悪影響を及ぼすことを示している。従って、本虫は自ら葉酸を合成する寄生虫であり、それを阻害することでその成長や寄生活動を抑制できることが明らかとなった。また、葉酸合成阻害剤又は葉酸活性化阻害剤をそれぞれ単独で投与した区よりも、葉酸合成阻害剤（スルファジメトキシン)と葉酸活性化阻害剤(トリメトプリム)の配合剤を投与した区の方が本虫の成長をより阻害していた。従って、本虫の駆除には葉酸合成阻害剤や葉酸活性化阻害剤単独での投与よりも葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤を投与する方が高い駆虫効果が得られることが考えられた。

＜マダイの白点虫寄生に対する葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の経口投与による駆虫効果−５＞
試験方法：平均魚体重約３２ｇのマダイ６２尾を２００リットル水槽で約７日間飼育し、２５℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。注水は２．４リットル／分とした。寄生虫感染は、２００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約２０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各１５尾を１００リットル水槽４基に収容した。予め、これら１００リットル水槽には、各区のシスト形成状況を観察するためにスライドグラス６枚を投入した。また、暴露して３日後の本虫の感染状況を調べるために、残りの２尾を１００リットル水槽１基に収容した。飼育期間中の注水は１．２リットル／分とした。試験概要を図５に示した。薬剤を含む試験飼料は暴露後から５日間連続給餌する区と１５日間連続投与する区を設定し、試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に本虫の感染状況を調べる区の魚２尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。暴露させてから５日後に各区３尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。同時にシスト形成状況を知るために、投入しておいたスライドグラスを回収し、付着しているシストを数えた。これらシストが孵化するかを調べるために、海水を含む３００ｍｌビーカーにシストが付着しているスライドグラスを入れ、１２日間観察した。継続してシストの形成状況を知るために、各区にスライドグラス６枚を再度投入した。暴露してから２３日後まで継続して飼育した。飼育期間中の全ての斃死魚の左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、いずれかの区で大量斃死が認められた場合、他の全区から各３尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。また同時に、投入しておいたスライドグラスを回収しシストを数えた。継続して飼育する区にはシストの形成状況を知るためにスライドグラス６枚を再度投入した。

試験区：図５に示す各薬剤の所定量をモイスト飼料に添加して試験飼料とした。また、薬剤投与区において、薬剤投与期間終了後は対照区と同じ薬剤無添加飼料を給餌した。

効果の判定：寄生数、シスト形成数、シスト長、シストの孵化有無、斃死尾数を比較することで行った。

暴露３日後の感染確認区（対照区２）の左鰓の寄生数は約３００個体であった（図６a）。この結果は、本試験で白点虫の感染が目的どおり成立していることを示している。図６bに暴露５日後の各区の本虫寄生数を示した。対照区の寄生数はほぼ０であった。図７aに暴露５日後と暴露９日後のシスト形成数の結果を示した。対照区のシスト形成数は他の区と比べ明らかに多く、本虫はシストになるために宿主鰓から離脱しシストになったと考えられた。試験区１の本虫寄生数は対照区同様に少ない結果となった。しかし、シスト形成数は対照区と比べ明らかに少ない結果となった（P＜0.01）。このことは、試験区１の本虫はシストになる前に死滅したと考えられた。従って、スルファジメトキシン・トリメトプリム投与は明らかに駆虫効果を有することが明らかとなった。一方、試験区２、３の寄生数は明らかに多く、本虫の成長が阻害されたために宿主からの離脱が遅れたものと推測された。対照区１以外の区でも少数であるが（P<0.01）シスト形成が認められた。薬剤投与区のシスト長は対照区と比べ明らかに小さく影響を受けていた（図７b）。また、これらシストの孵化率を12日間観察することで調べたところ、対照区が100％、試験１が95.8％、試験２が35％、試験３が45.2％であった。孵化までの日数は、対照区１が３日、試験区１が８日から１０日、試験区２、３が１０日から１２日であった。従って、これら薬剤が本虫シスト形成後もシストの正常な発生を阻害していることが明らかとなった。

対照区において暴露９日後に供試魚全てが斃死した（図８）。左鰓の本虫寄生数を調べたところ、１０００個体以上の白点虫が寄生していた。これはシストから孵化した仔虫が再感染したものと考えられた。暴露９日後の試験区１、２及び３から各３尾をサンプリングし、左鰓の寄生数を調べたところ全ての個体で本虫の寄生が認められなかった。これはシスト数が少なく且つシストの正常な発生が阻害され、新たな仔虫が孵化していないためと考えられた。図７bに暴露９日後のシスト形成数の結果を示した。試験区２、３においてシスト数はほぼ０であった。試験区２、３においては暴露５日後に鰓に多くの本虫寄生が観察されたが暴露９日後に鰓の本虫寄生は認められなかった、暴露９日後にシスト形成数はほぼ０であった、などから寄生していた本虫は５日から９日の間に死滅したと考えられた。従って、スルファメトキサゾール・トリメトプリム投与は駆虫効果を有することが判明した。

その後、試験区１から３を継続して試験開始から３０日間飼育した。飼育期間中、試験区１で３尾、試験区２で１尾、試験区３で１尾の斃死が発生した。斃死魚の鰓を観察したところ、白点虫は観察されなかった。全ての斃死魚は両目を失っており、斃死原因は共食いであると判断された。飼育終了時に全ての魚をサンプリングし鰓を観察したが、全区（試験区１から３）において白点虫の寄生は認められなかった。同時にスライドグラスを回収しシスト有無を調べたが、シストは観察されなかった。従って、試験区１から３の生残魚は白点虫感染から完全に治癒したものと考えられた。

以上の結果から、葉酸合成阻害剤、葉酸活性阻害剤は、本虫の成長を阻害するだけでなく、本虫に対する駆虫効果、そしてシスト形成後も持続的に作用しシストの正常な発生を阻害する効果を有することが明らかになった。

＜マダイの白点虫寄生に対する葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤からなる配合剤の経口投与による駆虫効果＞
試験方法：平均魚体重約６２ｇのマダイ１０３尾を５００リットル水槽で約１３日間飼育し、25℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。注水は２．４リットル／分とした。寄生虫感染は、５００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約６０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各２０尾を１００リットル水槽５基に収容した。また、暴露して３日後の本虫の感染状況を調べるために、残りの３尾を１００リットル水槽１基に収容した。飼育期間中の注水は１．２リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は５日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日、３日、４日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に本虫の感染状況を調べる区の魚３尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。暴露させてから５日後に各区の供試魚４尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、同時に寄生虫の大きさを観察した。

暴露してから２７日後まで継続して飼育した。飼育期間中の全ての斃死魚の左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、いずれかの区で本虫が原因と考えられる大量斃死が起きた場合、他の全区から各３尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。

試験区：スルファメトキサゾール１２５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム２５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区、スルファモノメトキシン１１２．５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム３７．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区、スルファジメトキシン１３５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とトリメトプリム１５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区、スルファジメトキシン１３６．４mg／ｋｇ魚体重／日とピリメタミン１３．６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区、薬剤無添加飼料を給餌する無投薬区の計５区を設定した。配合剤投与区の薬剤投与量は、配合剤として１５０mg／kg魚体重／日となるよう設定している。各薬剤の所定量をモイスト飼料に添加して試験飼料とした。

効果の判定：寄生数、寄生虫形態、シスト形態、斃死尾数を比較することで行った。

暴露３日後の感染確認区（無投薬区）のマダイ３尾の左鰓の平均寄生数は1尾あたり１５５個体であった（図９a）。この結果は、本試験で白点虫の感染が目的どおり成立していることを示している。また、鰓に寄生していた本虫６０個体の平均寄生虫長は約２０４μmであった。暴露３日後に無投薬区のマダイ１尾が斃死した。左鰓の本虫寄生数は１８０個体であり、斃死するほどの寄生数ではなかった。斃死魚は左目を失っており、斃死原因は共食いであると判断された。

暴露５日後の各区の本虫寄生数は、無投薬区が０個体、試験区１が３個体、試験区２が１個体、試験区３が０個体、試験区４が２個体であった。このことから全ての区において、本虫がシストになるために宿主鰓から離脱したことが考えられた。

暴露５日目後の宿主から離脱した各区３０個体のシスト長の比較結果を図９bに示した。無投薬区の平均シスト径は約３２０μmであった。試験区１の平均シスト径は約２１５μm、試験区２の平均シスト長は約２０６μm、試験区３の平均シスト長は約２２６μm、試験区４の平均シスト長は約２１３μmであった。全ての薬剤投与区でシスト長は対照区と比べ有意に小さく、本虫はシストになれたものの薬剤の影響を受け成長が阻害されていた。

暴露７日後に無投薬区、試験区２及び試験区４でマダイ各１尾が斃死した。左鰓の本虫寄生数は無投薬区の斃死魚が８個体、試験区２及び試験区４の斃死魚は０個体であった。全ての斃死魚は両目を失っており、斃死原因は共食いであると判断された。

無投薬区において暴露９日後に供試魚が斃死し始めた（図１０）。暴露９日後に死亡した供試魚の左鰓の本虫寄生数を調べたところ、１０００個体以上の白点虫が寄生していた。これはシストから孵化した仔虫が再感染したものと考えられた。暴露９日後の試験区１、２、３及び４から各３尾をサンプリングし、左鰓の寄生数を調べたところ、全ての個体で本虫の寄生数は０であった。無投薬区の供試魚は暴露１０日後に全滅した。その後、試験区１から４を継続して試験開始から２７日間飼育した。

暴露１３日後に試験区１と試験区３でマダイ各１尾が斃死した。左鰓の本虫寄生数は試験区１の斃死魚が６個体、試験区３の斃死魚が２３個体であった。斃死魚は両目を失っており、斃死原因は共食いであると判断された。

暴露１５日後に試験区１から４の供試魚を各３尾サンプリングし、左鰓の本虫寄生数を調べたところ、試験区１が平均５個体、試験区２が平均１個体、試験区３が平均６．３個体、試験区４が３．７個体であった。

暴露２１日後に試験区１のマダイ１尾が斃死した。左鰓の本虫寄生数は５４個体であった。斃死魚は両目を失っており、斃死原因は共食いであると判断された。同日、試験区３のマダイ４尾が斃死した。４尾のうち、両目を失っているものが２尾、左目を失っているものが１尾、白点虫症の症状である目の白濁と体表の発赤が観察されたものが１尾であった。斃死魚の左鰓の本虫寄生数は平均７８８個体であった。白点虫感染の症状が観察された１尾は白点虫症により斃死したものと推察された。

暴露２２日後に試験区１、試験区２、試験区４から各３尾、試験区３から１尾をサンプリングし、左鰓の本虫寄生数を調べたところ、試験区１は平均９．３個体、試験区２は平均９個体、試験区３は２９４個体、試験区４は平均２．７個体であった。その後、暴露２４日後に試験区３が３尾斃死し、翌２５日後に試験区１、試験区３、試験区４が全滅した。いずれも左鰓には１０００個体以上の本虫寄生が確認された。暴露２７日後に試験区２の生残魚６尾を全てサンプリングし、試験を終了した。取り上げた供試魚の左鰓には平均１０００個体以上の本虫が寄生していた。

これらの結果から、試験した全ての配合剤は抗白点虫作用を有することが明らかとなった。その中でも試験区２のスルファモノメトキシンとオルメトプリム配合区の効果が最も高いことが考えられた。このことは使用した薬剤の組み合わせと、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合量の違いによるものと推測された。本試験における葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合比は試験区１が５対１、試験区２が３対１、試験区３が９対１、試験区４が１０対１であった。従って、葉酸活性化阻害剤の配合割合が多い方が、より本虫に対する効果が高くなるものと推察された。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる配合剤の異なる投与量におけるマダイの白点虫寄生に対する駆虫効果＞
試験方法：平均魚体重３８ｇのマダイ１０４尾を５００リットル水槽で１９日間飼育し、２４．９℃の水温に馴致した。その間は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２．５％とした。
寄生虫感染は、５００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約６０万個体を投入し、１時間寄生虫に供試魚を暴露させることで行なった。暴露後、各２０尾を１００リットル水槽５基に収容した。また、暴露して３日後の本虫の感染状況を調べるために、残りの４尾を１００リットル水槽１基に収容した。注水は１．４リットル/分とした。薬剤を含む試験飼料は５日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日後、暴露２日後、暴露３日後、暴露４日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に本虫の感染状況を調べる区の魚４尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。暴露させてから５日後に各区５尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、同時に寄生虫の大きさを観察した。

暴露してから２９日後まで継続して飼育した。飼育期間中の全ての斃死魚の左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、いずれかの区で本虫が原因と考えられる大量斃死が起きた場合、他の全区から各３尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。

試験区：試験区１（スルファモノメトキシン３７．５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム１２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区(合剤として５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)）、試験区２（スルファモノメトキシン７５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム２５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区(合剤として１００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)）、試験区３（スルファモノメトキシン１８７．５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム６２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区(合剤として２５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)）、試験区４（スルファモノメトキシン３７５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム１２５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し５日間経口投与する区(合剤として５００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)）、薬剤無添加飼料を給餌する対照区の計５区を設定した。各薬剤の所定量をモイスト飼料に添加して試験飼料とした。

効果の判定：寄生数、寄生虫形態、シスト形態、斃死尾数を比較することで行った。

暴露３日後の感染確認区（対照区２）のマダイ４尾の左鰓の平均寄生数は1尾あたり４２０個体であった(図１１)。この結果は、本試験で白点虫の感染が目的どおり成立していることを示している。

試験飼料投与時に魚の摂餌状況を観察した。対照区及び試験区１から試験区３は試験試料を全て摂餌したが、試験区４(合剤として５００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)のみ摂餌後に吐き出す個体が散見された。このことは、合剤として５００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日と投与量が比較的多い場合、飼料への本剤添加はマダイの摂餌に悪影響を及ぼす可能性があることを示唆している。暴露５日後の各区５尾の左鰓に寄生していた白点虫数の平均は、対照区が約０．３個体、試験区１が約４０．３個体、試験区２が約１５７．８個体、試験区３が約１４０．３個体、試験区４が約１８４個体であった(図１２a)。このときの試験区１から試験区４の寄生虫長を図１２ｂに示した。また、各水槽底に予め敷いてあったスライドガラスに付着したシストの径（シスト長）を各区３０個体ずつ比較したところ、対照区が約３２０μm、試験区１が約２１５μm、試験区２が２０６μm、試験区３が２２６μm、試験区４が２１３μmであった。これらの結果は、比較的少ない投与量である５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日から比較的多い投与量である５００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日いずれにおいても、本虫の成長を阻害する効果、シストになるための宿主からの離脱を阻害する効果などを有することを示している。

図１３に暴露後の各区マダイの左鰓に寄生した白点虫数の推移を示した。また、図１４に試験期間中の死亡推移を示した。対照区において暴露９日目に供試魚が大量斃死し、翌１０日目に全て斃死した。左鰓の本虫寄生数を調べたところ、いずれも１０００個体以上の白点虫が寄生していた。これは実施例５と同様にシストから孵化した仔虫が再感染したものと考えられた。暴露９日目の試験区１、２、３及び４から各４尾をサンプリングし、左鰓の寄生数を調べたところ全ての個体で本虫の寄生数は０であった。これはシスト数が少ないため、シストの正常な発生が阻害されているため、シストの正常な発生が阻害され仔虫の孵化が遅延されているため、などに起因するものと考えられた。

試験区３で暴露１２日目に１尾の斃死が発生した。斃死魚の鰓を観察したところ、白点虫は観察されなかった。斃死魚は両眼を失っており、斃死原因は共食いであると判断された。試験区１において暴露１８日目に供試魚が全て斃死した。斃死魚の左鰓の本虫の寄生数を調べたところいずれも１０００個体以上の白点虫が寄生していた。試験区２、３及び４の供試魚３尾をサンプリングし、左鰓の本虫寄生数を調べたところ試験区２が１尾あたり平均約７４個体、試験区３が約４個体、試験区４が約１個体であった。その後、試験区１から４を継続して試験開始から２９日間飼育した。

暴露２１日目に試験区２の供試魚が１尾斃死し、翌２２日目に全て斃死した。死亡した供試魚の左鰓の本虫寄生数は１尾あたり約１０００個体であった。

その後、暴露２９日目まで継続して飼育した。暴露２９日目に生残していた試験区３及び試験区４の供試魚を全て取り上げ、左鰓の本虫寄生数を数えたところ試験区３及び試験区４ともに一尾あたり平均１０００個体以上の白点虫が観察された。対照区が全滅した日から試験区１(合剤５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)では全滅を８日間、試験区２(合剤１００ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)では１２日間、試験区３及び試験区４では１９日間以上遅らせた。これらの結果は、本薬剤の投与量に依存して本虫に対する駆虫効果が高くなることを示している。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる配合剤のトラフグの白点虫寄生に対する駆虫効果＞
試験方法：平均魚体重約１８３ｇのトラフグ１５尾を２００リットル水槽で約２０日間飼育し、25℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、３ｍｍ径のトラフグ用ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。寄生虫感染は、２００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約２０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各５尾を１００リットル水槽３基に収容した。注水は１．４リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫数を調べた。また、同時に寄生虫の大きさを観察し測定した。

試験区：スルファモノメトキシン１１２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム３７．５ｍｇ／kg魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SMMX+OMP区）、スルファジメトキシン１３６．４mg／ｋｇ魚体重／日とピリメタミン１３．６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SDMX+PRY区）、薬剤無添加飼料を給餌する対照区（Control区）の計３区を設定した。各薬剤の所定量を市販EP飼料に添加して試験飼料とした。なお、餌に薬剤を均一に添加させるため、餌の量の５％量の水と５％量のデンプンを薬剤に加え混ぜ合わせたものを餌に添加した。

効果の判定：寄生数の比較、寄生虫形態を観察することで行った。

寄生数を比較した結果、無投薬である対照区と比較して、いずれの薬剤投与区においても寄生数が多い傾向を示した(図１５a)。平均寄生数は片鰓あたり対照区が約４０５個体、スルファモノメトキシンとオルメトプリム配合投与区が約５４４個体、スルファジメトキシンとピリメタミン配合投与区が約５５８個体であり、両薬剤は本虫がシストになるための宿主からの離脱を阻止していた。

また、寄生虫形態を観察した結果、全薬剤投与区でトラフグの鰓に寄生している本虫の大きさは対照区と比べ有意に小さいことが判明した(図１５b)。本虫長は対照区で約２５２μｍ、スルファモノメトキシンとオルメトプリム配合投与区で約１６４μｍ、スルファジメトキシンとピリメタミン配合投与区で約１９７μｍであり、いずれの薬剤投与区においても本虫の成長が阻害されていた。

本結果から、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤は、トラフグの白点虫症に対しても、マダイの白点虫症同様に抗白点虫作用を発揮することが明らかとなった。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる配合剤のヒラメの白点虫寄生に対する駆虫効果＞
試験方法：平均魚体重約４７ｇのヒラメ２１尾を２００リットル水槽で約８日間飼育し、25℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。注水は２．２リットル／分とした。寄生虫感染は、２００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約２０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各７尾を１００リットル水槽３基に収容した。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、同時に寄生虫の大きさを観察した。

試験区：スルファモノメトキシン１１２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム３７．５ｍｇ／kg魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SMMX+OMP区）、スルファジメトキシン１３６．４mg／ｋｇ魚体重／日とピリメタミン１３．６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SDMX+PRY区）、薬剤無添加飼料を給餌する対照区（Control区）の計３区を設定した。各薬剤の所定量を市販EP飼料に添加して試験飼料とした。なお、餌に薬剤を均一に添加させるため、餌の量の５％量の水と５％量のデンプンを薬剤に加え混ぜ合わせたものを餌に添加した。

効果の判定：寄生数の比較、寄生虫形態を観察することで行った。

寄生数を比較した結果、対照区と比較して、いずれの薬剤投与区においても寄生数が多い傾向を示した(図１６a)。両薬剤は本虫がシストになるための宿主からの離脱を阻止していた。

また、寄生虫形態を観察した結果、全薬剤投与区でヒラメの鰓に寄生している本虫の大きさは対照区と比べ有意に小さいことが判明した(図１６b)。

本結果から、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤は、ヒラメの白点虫症に対しても、マダイの白点虫症同様に抗白点虫作用を発揮することが明らかとなった。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる配合剤のカンパチの白点虫寄生に対する駆虫効果＞
試験方法：平均魚体重約２６ｇのカンパチ２４尾を２００リットル水槽で約７日間飼育し、２５℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の２％とした。寄生虫感染は、２００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約２０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各８尾を１００リットル水槽３基に収容した。注水は１．４リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、同時に寄生虫の大きさを観察した。

試験区：スルファモノメトキシン１１２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム３７．５ｍｇ／kg魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SMMX+OMP区）、スルファジメトキシン１３６．４mg／ｋｇ魚体重／日とピリメタミン１３．６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SDMX+PRY区）、薬剤無添加飼料を給餌する対照区（Control区）の計３区を設定した。各薬剤の所定量を市販飼料（日本水産株式会社製、２．５ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）に添加して試験飼料とした。なお、餌に薬剤を均一に添加させるため、餌の量の５％量の水と５％量のデンプンを薬剤に加え混ぜ合わせたものを餌に添加した。

効果の判定：寄生数の比較、寄生虫形態を観察することで行った。

寄生数を比較した結果、対照区と比較して、いずれの薬剤投与区においても寄生数が多い傾向を示した(図１７a)。両薬剤は本虫がシストになるための宿主からの離脱を阻止していた。

また、寄生虫形態を観察した結果、全薬剤投与区でカンパチの鰓に寄生している本虫の大きさは対照区と比べ有意に小さいことが判明した(図１７b)。

本結果から、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤は、カンパチの白点虫症に対しても、マダイの白点虫症同様に抗白点虫作用を発揮することが明らかとなった。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる配合剤のマハタの白点虫寄生に対する駆虫効果＞
試験方法：２５℃の水温に馴致した平均魚体重約１４ｇのマハタ２１尾を１００リットル水槽で約１日間飼育し、試験に使用した。その間の給餌は市販飼料（日本水産株式会社製、２ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）を与え、給餌率を魚体重の３％とした。寄生虫感染は、１００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化仔虫約１０万個体を投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。暴露後、各７尾を１００リットル水槽３基に収容した。注水は１．４リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は３日間連続給餌とし、その給餌時期は、仔虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、暴露１日、２日後とした。試験飼料の給餌率は魚体重の２％とした。暴露させてから３日後に全ての魚をサンプリングし、左側の鰓に寄生している白点虫を数えた。また、同時に寄生虫の大きさを観察した。

試験区：スルファモノメトキシン１１２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム３７．５ｍｇ／kg魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SMMX+OMP区）、スルファジメトキシン１３６．４mg／ｋｇ魚体重／日とピリメタミン１３．６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を配合して３日間経口投与する区（SDMX+PRY区）、薬剤無添加飼料を給餌する対照区（Control区）の計３区を設定した。各薬剤の所定量を市販EP飼料に添加して試験飼料とした。なお、餌に薬剤を均一に添加させるため、餌の量の５％量の水と５％量のデンプンを薬剤に加え混ぜ合わせたものを餌に添加した。

効果の判定：寄生数の比較、寄生虫形態を観察することで行った。

寄生数を比較した結果、対照区と比較して、いずれの薬剤投与区においても寄生数が多い傾向を示した(図１８a)。両薬剤は本虫がシストになるための宿主からの離脱を阻止していた。

また、寄生虫形態を観察した結果、全薬剤投与区でマハタの鰓に寄生している本虫の大きさは対照区と比べ有意に小さいことが判明した(図１８b)。

本結果から、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤は、マハタの白点虫症に対しても、マダイの白点虫症同様に抗白点虫作用を発揮することが明らかとなった。

以上の結果から、葉酸合成阻害剤ならびに葉酸活性化阻害剤は共通して本虫の成長を阻害し、さらにシストの発生をも阻害することが判明した。従って、本虫は自ら葉酸を合成する寄生虫であり、それを阻害することでその成長や寄生活動を抑制できることが明らかとなった。また、葉酸合成阻害剤又は葉酸活性化阻害剤をそれぞれ単独で宿主魚に投与することにより明らかな抗白点虫作用を得られるが、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤を投与する方が高い駆虫効果が得られることも判明した。葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤は、試験した全ての魚種、すなわちスズキ目魚類であるマダイ・カンパチ・マハタ、フグ目魚類であるトラフグ、カレイ目魚類であるヒラメにおいて抗白点虫作用を発揮した。従って、葉酸合成阻害剤、葉酸活性化阻害剤ならびにその配合剤は、さまざまな魚種で発生する海水白点虫症に対して抗白点虫作用を発揮することが考えられた。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる配合剤の淡水白点虫寄生に対する駆虫効果＞
試験方法：２１℃の水温に馴致した平均魚体重約３．６ｇの黒出目金１８尾を２５L水槽1基で３日間飼育した後、淡水白点虫に感染しているレッドグラミーと２日間混養し淡水白点虫に感染させ、新たにセットした２５L水槽２基に黒出目金のみをそれぞれ８尾収容し試験に使用した。残った２尾の黒出目金は感染成立を確認するため、寄生数を調べた。その時の１尾あたりの体表寄生数は平均６６個体であった。

感染初日より、対照区は市販飼料（日本水産株式会社製、２ｍｍ径の初期試料ＥＰ（エクスパンデット）ペレット）に水を添加したもの、試験区は薬剤を含む試験飼料を毎日与えた。給餌量は総魚体重の０．７％とした。

試験区は、スルファモノメトキシン１１２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム３７．５ｍｇ／kg魚体重／日(合剤として１５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)を配合し、毎日投与した。

効果の判定は試験開始３日目と７日目に各区全試験魚の体表に寄生している本虫の数を目視でカウントした。また、試験期間中に死亡魚が出た場合は、体表に寄生している本虫の数をカウントした。

３日目の本虫寄生数は対照区が平均２．９個体、試験区が平均０．９個体であり、７日目の本虫寄生数は対照区が平均５０．８個体、試験区が平均０．１個体であった(図１９)。

試験開始９日目の対照区と試験区の供試魚を図２０に示した。この時点で対照区の供試魚には無数の淡水白点虫の寄生が目視で観察された。一方、試験区の供試魚には寄生が僅かに認められただけであった。

試験開始１１日目に対照区の供試魚が全滅した。斃死魚の体表、鰭を調べたところ２０００個体以上の本虫が観察され、本虫は明らかに増殖していた。同日に試験区の供試魚全てを取り上げ体表、鰭を調べたが、本虫の寄生は認められなかった。これらの結果から、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤は、淡水白点虫に対して駆虫効果を有することが判明した。従って、淡水白点虫も海水白点虫同様に自ら葉酸を合成する寄生虫であり、それを阻害することでその成長や寄生活動を抑制できることが明らかとなった。

海水白点虫の場合、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤の配合剤は、試験した全ての魚種、で抗白点虫作用を発揮した。従って、葉酸合成阻害剤、葉酸活性化阻害剤ならびにその配合剤は、さまざまな魚種で発生する淡水白点虫症に対して抗白点虫作用を発揮することが考えられた。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる合剤の低用量におけるトラフグの白点虫寄生に対する駆虫効果−１＞
試験方法：平均魚体重１３０ｇのトラフグ４８尾を５００リットル水槽で１３日間飼育し、２４．５℃の水温に馴致した。その間は市販飼料を与え、給餌率を魚体重の１．５％とした。寄生虫感染は、５００リットル水槽を止水とし、白点虫孵化子虫約２０万個体を投入し、１時間寄生虫に供試魚を暴露させることで行なった。暴露後、各１２尾を１００リットル水槽４基に収容した。注水は１．４リットル/分とした。薬剤を含む試験飼料は１４日間連続給餌とし、その時期は、子虫暴露後１００リットル水槽に収容してから２時間後、以降暴露後１３日目まで２４時間毎とした。試験飼料の給餌率は魚体重の１％とした。暴露させてから１４日後に各区３尾をサンプリングし、左側の鰓に寄生している白点虫を数えた(図２１)。

暴露してから２８日後まで継続して飼育した。飼育期間中の全ての斃死魚の左鰓に寄生している白点虫を数えた。また、いずれかの区で大量斃死が起きた場合、他の全区から各２尾をサンプリングし、左鰓に寄生している白点虫を数えた。

試験区１ スルファモノメトキシン１８．７５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム６．２５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し１４日間経口投与する区(合剤として２５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)、試験区２ スルファモノメトキシン３７．５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム１２．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し１４日間経口投与する区(合剤として５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)、試験区３ スルファモノメトキシン１１２．５mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム３７．５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し１４日間経口投与する区(合剤として１５０ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)、薬剤無添加飼料を給餌する対照区の計４区を設定した。各薬剤の所定量を市販EP飼料に添加して試験飼料とした。なお、餌に薬剤を均一に添加させるため、餌の量の５％量の水と５％量のデンプンを薬剤に加え混ぜ合わせたものを餌に添加した。
効果の判定：寄生数と斃死尾数を比較することで行った。

暴露１４日目の各区３尾の左鰓に寄生していた白点虫数の平均は、対照区が約２９個体、試験区１が約１．３個体、試験区２が０個体、試験区３が０個体であった(図２１)。

図２２に試験期間中の死亡推移を示した。対照区において暴露１６日目に供試魚が白点虫症により大量死した。死亡魚左鰓の本虫寄生数を調べたところ、いずれも１０００個体以上の白点虫が寄生していた。これはシストから孵化した子虫が再感染したものと考えられた。暴露１６日目の試験区１、２、及び３から各２尾をサンプリングし、左鰓の寄生数を調べたところ試験区１が０個体、試験区２が約５．５個体、試験区３が０個体であった(図２３)。

その後、２８日目までの試験期間中に、各試験区に１〜３個体の死亡が発生した。死亡魚の左鰓の白点虫寄生数を数えたところ、暴露２２日目に死亡した試験区１の１尾にのみ１個体の白点虫が確認された。その他の死亡魚の左鰓の白点虫寄生数はすべて０個体であった。

これらの結果から、すべての試験区において葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる合剤は少ない投与量(１５０ｍｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ Ｂ.Ｗ.)においても、白点虫をほぼ１００％駆虫していることが判明した。

＜葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる合剤の低用量におけるトラフグの白点虫寄生に対する駆虫効果−２＞
試験方法：平均魚体重約１６０ｇのトラフグを各区６又は７尾それぞれ１００リットル水槽３基で約８日間飼育し、２４．５℃の水温に馴致した。その間の給餌は市販飼料を与え、給餌率を魚体重の１．５％とした。寄生虫感染は、１００リットル水槽３基を止水とし、白点虫孵化仔虫約２０万個体を各水槽に投入し、１時間寄生虫に魚を暴露させることで行った。注水は１．４リットル／分とした。薬剤を含む試験飼料は１４日間連続給餌とし、その時期は、仔虫暴露後２時間後、以降１３日目まで２４時間毎とした。試験飼料の給餌率は魚体重の１％とした。暴露させてから供試魚が死亡した場合には、左側の鰓に寄生している白点虫を数えた。

試験区１ スルファモノメトキシン６mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム２ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し１４日間経口投与する区(合剤として８ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)、
試験区２ スルファモノメトキシン１８mg／ｋｇ魚体重／日とオルメトプリム６ｍｇ／ｋｇ魚体重／日を混合し１４日間経口投与する区(合剤として２４ｍｇ／ｋｇ魚体重／日)、薬剤無添加飼料を給餌する対照区の計３区を設定した。各薬剤の所定量を市販EP飼料に添加して試験飼料とした。なお、餌に薬剤を均一に添加させるため、餌の量の５％量の水と５％量のデンプンを薬剤に加え混ぜ合わせたものを餌に添加した。
効果の判定：寄生数と斃死尾数を比較することで行った。

図２４に暴露後の死亡推移を示した。暴露から９日目に対照区供試魚が白点虫症により全滅した。死亡魚の左側の鰓の白点虫寄生数を数えたところ、平均して２００００個体以上の白点虫が確認された。その後、５７日間飼育を継続した。試験区１及び２では白点虫症による死亡は認められなかった。暴露後５７日目に残りの試験区１と２の供試魚をすべて取り上げ、左側の鰓の白点虫の数をカウントした。それぞれの平均寄生数は試験区１が０．５個体、試験区２が１２．７個体であった。これらの結果から、葉酸合成阻害剤と葉酸活性化阻害剤からなる合剤は極少量の投与においても、白点虫を駆虫する作用があることが判明した。

本発明の寄生虫駆除方法は経口投与により魚類寄生虫の駆除効果を発現し、これまで効果的な薬剤がなかった白点虫などの寄生虫に対しても効果を発揮する。特に養殖魚の寄生虫症の予防・治療に使用することができる。

Claims (2)

1. １日当たり１〜５０ｍｇ／ｋｇ魚体重の葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の合剤を魚類に経口投与することを含む魚類の寄生虫である白点虫の駆除方法。但し、葉酸合成阻害剤は、スルファメトキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファジメトキシン及びこれらの薬学的に許容しうる塩から選択されるいずれかであり、葉酸活性化阻害剤はピリメタミン、トリメトプリム、オルメトプリム及びこれらの薬学的に許容しうる塩から選択されるいずれかであり、魚類は、スズキ目、カレイ目、フグ目及びコイ目から選択されるいずれかの魚類である。
2. 葉酸合成阻害剤及び葉酸活性化阻害剤の合剤を１〜２週間継続経口投与することを含む、請求項１に記載の方法。