JP6092845B2 - 少なくとも１種の酵素の代謝能を判定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、請求項１の前提部に記載の少なくとも１種の酵素の代謝能を判定する方法、および請求項１６または１７にそれぞれ記載のそのような方法における様々な^１３Ｃ−標識基質の使用に関する。

酵素は、動物およびヒトの身体における有害物質の分解に著しく寄与する。基質を触媒作用で転化する多くの様々な酵素、例えばシトクロムがある。

酵素または酵素系（以下、常に酵素に関してのみ言及するが、両方を意味する）は重要な機能を担うので、生物体内における酵素の機能的能力を判定することが非常に重要である。今日、こうした判定は、例えば、生物の体外で細胞培養において直接検査することによって行われ、こうした判定には、酵素がその本来の環境で検査されないという欠点がある。生物体内での検査は、典型的には、同位元素で標識した基質を投与することを含むものであり、こうした基質は酵素によって代謝される。投与または施用は、例えば、心臓への直接注入などの外科的介入によって、あるいは、例えば、基質を経口的に摂取するなどの他の方法によって行われる。

この場合、非外科的施用は、血液中の基質の利用能が数分を要するという欠点をほぼ常に有する。すなわち、血液中の基質の濃度Ｓが増加し始めて最大濃度に達する（代謝による濃度減少の可能性を考慮しない）までの期間は数分である。

別法は、基質を事前投与しない微量ガス（痕跡ガス：trace gases）の高感度検出である。しかし、これには、検査された個人の正確な既往歴および呼吸空気中のガスの濃縮の原因すべてが分からなければならないという欠点がある。しかしながら、原則の問題として、この既往歴は、十分に正確に判定できない。

本発明の基礎となる課題は、酵素の代謝能を高精度かつ時間分解で判定できる方法を提供することである。さらに、このような方法に適切な基質を提供することである。

本課題は、請求項１の特徴を有する方法で実現される。少なくとも１種の酵素の代謝能を判定するこのような方法は、後に説明するステップを含む。

第１に、個人が吐き出した空気中における産物の濃度の時間分解判定を行う。この場合、産物は、個人に事前投与した基質の、個人の少なくとも１種の酵素により代謝によって生成される。多くの場合、全酵素系が、対応する基質の代謝に関与している。少なくとも個人が吐き出した空気中の産物濃度が最大に達するまで産物濃度を判定する。

続いて、開始時間と終了時間との間の産物濃度の時間分解判定によって得られた産物濃度の測定値にモデル関数を適合させる。すなわち、経験的に得られた測定値を、式で規定できる数学的関数で適合させる。

最後に、酵素の代謝能を、モデル関数を規定するモデル関数のパラメータに基づいて判定する。このために、モデル関数の様々なパラメータを基本的に使用できる。

特許請求する方法に関して特別なことは、酵素の代謝能の判定をモデル関数の少なくとも２個のパラメータに基づいて行うことである。しかし、これらのパラメータは、同時にモデル関数の最大値およびモデル関数の時定数ではない場合があり、特にモデル関数が単一指数関数であるときにそうではない。さらに、モデル関数の開始時間ｔ_０および／または終了時間ｔ_ｍをパラメータとして選択しない場合もある。

これらの基本条件が満たされたとき、別々に向上する様々な基質の代謝の速度論的性質、および、このように多様な産物を生成する速度論的性質を分析でき、最終的に酵素または酵素系の代謝能を判定できる。モデル関数のパラメータを選択することにより、酵素の代謝能に関する結論を直接得ることが可能になる。酵素の代謝能は、特定の身体機能に関する個人の健康状態の定量的判定の基準として使用できる。これはプロセスの後続ステップで行うことができるが、そのステップは特許請求する方法の一部ではない。酵素は身体の様々な臓器または区画で生じるので、本方法は多数の後続検査の基準として適する。好ましくは、本方法は、例えば、肝機能容量または肝臓の微小循環によって特徴付けられた肝臓状態の分析基準になり得る。

判定する酵素の代謝能の信頼性の高い有意なデータを得るのに、個人の血液中の基質の利用能を確実に迅速にできたとき、本方法は大きな利点となる。基質の経口摂取は、一般にこの目的に適さない。

血液中の基質濃度（代謝なし）の時間的依存性を関数Ｓ（ｔ）によって規定する。血液中の基質の利用能または放出のより正確な定義を与えるために、ここで放出期間ＦＺを定義する。Ｃ_ｍａｘを血液中の期待最大基質濃度（代謝なし）とし、血液中の基質濃度がＣ_ｍａｘの４％〜６％に増加したときの時間をｔ_０とし、血液中の基質濃度がＣ_ｍａｘの４０％〜６０％に増加、特に、血液中の基質濃度がＣ_ｍａｘの４０％超、５０％超、または６０％超にあるときの時間をｔ_ｍとすると、放出期間ＦＺは、ｔ_ｍとｔ_０との間の時間差となる（ＦＺ＝ｔ_ｍ−ｔ_０）。言い換えると、放出期間は、血液中の基質濃度（濃度がＣ_ｍａｘの０％をわずかに超えているが、まだＣ_ｍａｘの１桁の％範囲にあると仮定する）が１０倍、特に１２倍、特に１５倍、とりわけ２０倍に増加するのに必要な期間である。

基質を標準的に経口により投与した場合の放出期間は、典型的には５分超であり、日によって相当な個人間変動がある。この理由から、放出期間が長期となる投与は、測定結果が関数Ｓ（ｔ）で畳み込まれ（convoluted）、その結果、未知の関数で「不鮮明（blurred）」になるので、歪んだ結果を導く。

従来技術から周知の長期放出期間、およびその後の酵素の代謝能を判定する際に付随する欠点は、基質の非外科的投与を用いて、検査する個人の代謝器官に標的誘導することによって回避することができる。標的誘導では、基質の投与量は事前に決定されており、その結果、後続ステップの解釈の段階において、基質の投与量に関する代謝器官の反応を見積もることができる。好ましくは、もっぱらガスを産物として検査し、その濃度は、基質の投与の結果として、代謝器官の誘導により変化する。基質による代謝器官の誘導、およびその後すぐに迅速に続く代謝の応答は、特許請求する方法の後続用途の重要なポイントである。

一実施形態では、説明した代謝器官の標的誘導は、産物の濃度の時間分解判定のステップより前に行う方法の一部である。

基質の投与および放出は、投与の種類および方法に依存するが、放出期間（すなわち、血液中の基質の利用能）が、６０秒より速く、特に５０秒より速く、特に４０秒より速く、特に３０秒より速く、特に２０秒より速く、とりわけ１０秒より速くなるような最良の方法で行う。

したがって、個人の血液中の基質の放出時間を前述の時間内とできる剤形で基質を投与するのが最も良い。このような短期の放出期間は、様々な形態の投与または施用によって基本的に実現できる。解釈を制限せずに、ここにいくつか提示する：ａ）基質を含有するエアロゾルの吸入、ｂ）例えば効率的なナノ担体を用いた皮膚経由の投与、ｃ）エネルギー吸収で放出される切り替え可能な（特に活性化可能な）基質の経口摂取。したがって、経口投与後、束縛状態にある非分解性の基質は、エネルギーを印加することによって、特に光によって、１秒以内に完全に放出できる。このような束縛状態の基質はまた、専門用語でケージド化合物と呼ばれる。このようなケージド化合物を使用すると、常に誘導可能な、対応する代謝可能基質が超速で選択的に放出できるようになる。

血液中の基質の迅速な利用能は、検査される代謝能と酵素に対する基質の迅速な利用能とを保証する。

基質が血液中に存在し、酵素上にあるとき、基質は酵素によって代謝され得る。その結果として、産物（複数可）が生成され、以下、単に個々の産物と称する。代謝ステップは、非常に迅速でなければならず、１０秒以内、特に５秒以内、特に１秒以内、特に０．１秒以内、特に０．０１秒以内、特に０．００１秒以内に完了するのが最も良い。基質の利用能の時間スケールにおいて、これは事実上の瞬間的な代謝を保証する。基質の代謝中に生じた産物（複数可）Ｐは、血液中に溶解され、肺から吐き出され、その結果、個人が吐き出した空気中に検出できる。今回１種の産物についてしか言及しなかったとしても、本方法の諸実施形態はまた、それによって個々の産物だけでなく複数の産物も検出される場合を含む。

酵素の代謝能を規定するのに、様々な適合関数の様々なパラメータを使用できる。適切なパラメータの例は、モデル関数の最大値、モデル関数のｉ番目モーメント（ｉ＝１，２，３，４，．．．）、モデル関数のｊ番目中心モーメント（ｊ＝１，２，３，４，．．．）、モデル関数の標準偏差、モデル関数の時定数、時定数の重心、重心からの時定数の平均偏差、時定数の変動、時定数の分布、時定数の重み付け、時定数の分布の重み付け、時定数の変動の重み付けを含む群からのパラメータである。

モデル関数のモーメントは、例えば、Bronstein and SemendjajewによるHandbook of mathematics（６６５〜６６８頁、第２５版、１９９１年）で説明されている。この参考文献では、多数の他のモデル関数およびモデルパラメータも見ることができ、それらを本発明の範囲内において個々にまたは互いに組み合わせて使用できる。

モデル関数の規定に非常に適した２個のパラメータの例は、呼吸空気中の産物Ｐの最大濃度または総計Ｐ_ｍａｘ、およびｔ_０からｔ_ｍまでのモデル関数の第１モーメントである。第１モーメントＭ_１を、

によって定義し、

において、ｉ＝１として、ｔ_０とｔ_ｍとの間のすべての測定点ｋに関する合計を計算する。式中、ｔ_ｋは、ｋ番目の測定点の時間であり、ｐ_ｋは、時間ｔ_ｋにおける呼吸空気中の産物Ｐの濃度の測定値である。

モデル関数の規定に非常に適した２個のパラメータのさらなる例は、呼吸空気中の産物Ｐの最大濃度または総計Ｐ_ｍａｘ、およびｔ_０からｔ_ｍまでのモデル関数の第２中心モーメントである。第２中心モーメントＭＺ_２を、

によって定義し、

において、ｉ＝２とする。第２中心モーメントは、第１モーメントの分散であり、検査した代謝の立ち上がり関数（rising function）の分布幅を与える。

パラメータのさらなる組合せ、例えば、Ｐ_ｍａｘ、Ｍ_１、およびＭＺ_２の組合せ、ならびにより高次なモーメント、より高次な中心モーメント、または他のパラメータとの組み合わせ、特に前述の他のパラメータの組合せが可能であり、それらは、検査した酵素に応じて、酵素の代謝能に関する直接情報をもたらす。

モデル関数は、基本的に１個または複数の時定数を有し得る。例えば、複数の関数の組合せをモデル関数として使用する場合、モデル関数は複数の時定数を有する。複数の時定数の存在は、例えば、時定数の重心、重心からの時定数の平均偏差、時定数の変動、時定数の分布、時定数の重み付け、時定数の分布の重み付け、または時定数の変動の重み付けをパラメータとして選択できるという事実の前提条件である。

好ましくは、モデル関数（または適合関数）は、一階微分方程式の解関数、二階微分方程式の解関数、三階微分方程式の解関数、様々な階数の微分方程式の組合せの解関数、または時間の関数としての多指数関数である。様々な階数の微分方程式の組合せを使用する場合、解関数はまたゼロ階微分方程式の寄与も含み得る。

呼気のとりわけ単純な測定を可能にし、同時に高精度な測定を実現し、それによって得られた測定値の情報性の価値を著しく向上させ、最良の産物の濃度判定はフロースルーで行われる。

ベール−ランベルト（Beer-Lambert）の法則に従う吸収測定によって、既知の吸光係数および測定セルの既知の経路長を用いて、検査する物質の濃度を直ちに得ることができる。好ましくは、さらに、濃度判定に使用する測定器を貫流する呼気の流速も決定される。次いで、検査する産物の量は、測定器を貫流した産物の濃度および体積から計算できる。測定器を貫流した体積は、体積流量と、体積流量を観察した時間とを乗算することで得られる。

計測器の呼吸抵抗は、この場合、好ましくは１００ｍｂａｒ未満、特に８０ｍｂａｒ未満、特に７０ｍｂａｒ未満、とりわけ６０ｍｂａｒ未満である。これは、例えば、バルブなし、かつ空気フラップなしの開放構造によって実現される。

血液中の産物の増加は、呼吸空気において比例して反映される。産物の量または濃度は、時間の関数として呼吸空気において測定する。一実施形態では、呼気を十分に（完全に）計測器に流し通し、それを用いて産物を検出する。すなわち、この実施形態では、個人の少なくとも１回の呼吸の全呼気を呼気として使用する。したがって、呼吸空気中の産物の濃度は、補間を使用しないことで測定誤差を最小限にしながらとりわけ有利な方法で判定できる。

別の一実施形態では、１回の呼吸、または複数回の呼吸（約２〜２０回の呼吸、特に３〜１５回の呼吸、特に４〜１０回の呼吸、特に５〜８回の呼吸）の呼気を完全に混合し、次いで、この混合物の一部を計測器に流し通し、それを用いて産物を検出する。

特によく再現できるデータを得るために、呼吸中の産物濃度を判定する間、検査する個人を安定状態に置くのが最も良い。ヒトおよび動物の場合、こうした安定状態は、例えば、呼気中の産物濃度を判定する間、生物に激しい動きをさせないことで保証できる。例えば、個人が横になっているなどの場合、脚を水平位から４５度上げると、呼吸空気中の産物濃度の測定値が変わる可能性がある。生物体内の血液およびその分布の保存機能のために、歩く、走る、または立つ動作は、呼気中の産物濃度の値を変化させる。したがって、個人が本質的に静止位置にいる間に産物濃度の判定を行うのが最も良い。この静止位置は、横になっている位置、または座っている位置であり得る。個人の脚の位置および／または身体の上部の位置が、所定位置と比較して４５度未満、特に３０度未満、とりわけ１５度未満しか変化していないときが有利である。個人が横になっている場合、この所定位置は、例えば、本質的に個人の水平位である。

好ましくは、産物濃度（すなわち代謝動力学的性質）の増加のみを最大値になるまで分析する。この最大値は、個人が吐き出した空気中の産物の最大濃度に相当する。この増加には、好ましくは、４０分未満、特に２０分未満、とりわけ１０分未満かかる。増加の時間が長くなるほど、身体自体の過程が結果に影響を及ぼす可能性があり、それによって、得られた測定データの精度が低下することが確実になる。

今回特許請求する方法の実施は、ＮＭＲ分光法および／またはＣＴを用いて行い、赤外分光法および／または質量分析による実施とはわずかに異なる。ＮＭＲ分光法およびＣＴは、画像化測定法であり、例えば次の方法で使用できる：
ａ）ＮＭＲ分光法およびＣＴによって、対象となる空間領域を検査する。さらに、呼吸空気中の産物を分析する。両方の測定を比較して、新規な情報を得る。
ｂ）ＮＭＲ分光法およびＣＴによって、対象となる空間領域を検査し、さらに、呼気中の産物を分析する。両方の測定を時間順に比較して、新規な情報を得る。本明細書では、ＮＭＲ分光法およびＣＴは、空間分解法における産物濃度の増加および減少を追跡できる。この場合、同位元素で標識した基質または高電子密度を有する基質を使用すると、特に有利な方法でＮＭＲ分光法およびＣＴの使用が可能になる。

他の個人との比較を可能にするために、検査する個人の体重に対して正規化を行うのが好ましい。特に、このような正規化は、代謝能を示す得られた値を個人の体重で除算することで行うことができる。代謝能を示し、対応する値を得る際に使用するモデル関数において体重を既に使用している場合、体重は方法全体中で２回考慮される。例として、代謝能を示す値が、分母にｋｇ^２が在る単位を有することが考えられる。これは、個人の体重で２回連続して除算（または個人の体重の２乗で１回除算）したことに由来する。

一実施形態では、モデル関数は、次式で表すことができる：
ＭｅｔＰｏｗ＝ｃａｌ＊［Ｆ（産物，ｔ）−ｆ（産物，ｔ）_ｎａｔ］＊ｇ（Ｐ）＊ｈ（ｎ）＊Ｌ（ｎ／Ｍ）＊（ｎ／Ｍ^２）＊Ｖ（ｎ／Ｍ）
式中、
ＭｅｔＰｏｗは、代謝能を示し、
ｃａｌは、補正を考慮した定数であり、
Ｆ（産物，ｔ）は、吐き出された産物の動力学的性質を表す関数であり、
ｆ（産物，ｔ）_ｎａｔは、基質投与前の個人が吐き出した空気中の産物の自然存在比を表す関数であり、
ｇ（Ｐ）は、個人の活動状態に対する個人の産物の生成速度Ｐの依存性を表す関数であり、
ｈ（ｎ）は、基質分子１個につき生成される産物分子の数を表す関数であり、
Ｌ（ｎ／Ｍ）は、投与した基質分子の数ｎに依存する代謝能の非線形挙動を表す関数であり、Ｍは、個人の体重を示し、
Ｖ（ｎ／Ｍ）は、基質の様々な投与手順に起因する依存性を表す関数である。

手本とすべきモデル関数のこれらの個々の関数および定数のすべてを、^１３Ｃ−標識基質の代謝の産物としての^１３ＣＯ_２に関する特定の実施形態についてより詳細に以下に説明する。これらの説明は、前述のＭｅｔＰｏｗの一般式に限定すると解釈すべきではなく、このモデル関数の個々のパラメータをより良く理解するための一助である。

特許請求する方法の好ましい一例は、酵素の代謝能の判定を用いた、^１３Ｃ−標識基質の代謝動力学的性質を介して測定される臓器、例えば肝臓の代謝機能の判定である。可能な基質は^１３Ｃ−メタセチンであり、これは肝細胞中で酵素ＣＹＰ４５０ １Ａ２によって^１３ＣＯ_２およびパラセタモールに代謝される。また、^１３Ｃ−カフェインなどの他の基質も対応する判定に適する。

代謝生成された^１３ＣＯ_２の動力学的性質は、肝臓または他の臓器の代謝機能についての情報を提供する。都合の悪いことに、^１３ＣＯ_２の自然存在比は、人体中の合計ＣＯ_２の約１．１％である。したがって、身体中の自然存在比と、肝臓での基質代謝によって生成され追加された^１３ＣＯ_２とを区別しなければならない。代謝産物が異なる他の基質は、これらの制約に悩むことはないかもしれない。身体中の^１３ＣＯ_２の自然存在比を判定する一般的な方法は、基質投与の前に^１３ＣＯ_２と^１２ＣＯ_２の比を測定することである。測定操作に応じて、自然存在比を、関数ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２）_ｎａｔによって計算する。この関数の２種の可能な例は、次のとおりである：
ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２）_ｎａｔ＝ｋ１＊^１３ＣＯ_２／^１２ＣＯ_２＊０．０１１、
ｋ１は定数；
または
ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２）_ｎａｔ＝ｋ２＊（ｋ３＊^１３ＣＯ_２−^１２ＣＯ_２）／（^１３ＣＯ_２−^１２ＣＯ_２）、
ｋ２およびｋ３は定数。

また、他の関数も可能である。特に、身体中の^１３ＣＯ_２の自然存在比を、一定期間にわたって判定する場合、または別個の時点での種々の測定の平均値として表す場合、時間の依存性を考慮することになる。したがって、この関数は、ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２，ｔ）_ｎａｔとして書かれる。時間依存性がない場合、ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２，ｔ）_ｎａｔは、ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２）_ｎａｔと等しい。

吐き出された^１３ＣＯ_２の動力学的性質、または吐き出された^１３ＣＯ_２／^１２ＣＯ_２の比の動力学的性質から代謝機能を判定するために、関数Ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２，ｔ）を使用する。関数Ｆの最も簡単な形は、時間ｔ_ｍａｘでの動力学的性質の最大値をとることである。別のオプションでは、動力学的性質の第１もしくは第２モーメントを使用するか、または最大値までの曲線下面積と最大の半値までの曲線下面積とこれらの時点の期間との組合せを使用する。また、前述の関数を使用する他の組合せも可能である。

一実施形態では、肝臓の代謝力ＭｅｔＰｏｗ（選択した酵素の代謝能と同一）を表す総関数を次式で示す：
ＭｅｔＰｏｗ＝ｃａｌ＊［Ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２，ｔ）−ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２，ｔ）_ｎａｔ］＊ｇ（Ｐ_ＣＯ２）＊ｈ（ｎ）＊Ｌ（ｎ／Ｍ）＊（ｎ／Ｍ^２）＊Ｖ（ｎ／Ｍ）

この式では、定数ｃａｌは、特に、実験の較正および医療用途に起因する補正を考慮に入れる。

Ｐ_ＣＯ２は、全ＣＯ_２生産速度を示し、それは呼吸している個人の活動状態（静止または運動）に依存し、呼気中の本来の^１２ＣＯ_２および^１３ＣＯ_２の値を判定する。したがって、この場合、全ＣＯ_２生産速度は、関数ｇ（Ｐ_ＣＯ２）によって表される。静止している個人の最も単純な例では、関数は、ｇ（Ｐ_ＣＯ２）＝ｋ４＊Ｐ_ＣＯ２（但し、ｋ４＝１）から得られる。

関数ｈ（ｎ）は、肝臓によって^１３ＣＯ_２に代謝される分子の一部を表す。基質分子の数ｎはｍｏｌ単位で示す。基質に応じて、ｎはｘと０との間で変化でき、ｘは０超の数である。高機能基質は、ｘの値が１に近い、または１超である。ｘ＝３の基質は、代謝によって基質分子１個につき^１３ＣＯ_２分子が３個生成することを意味する。

関数Ｖ（ｎ／Ｍ）は、基質の様々な投与手順に起因する依存性を表す。例えば、経口投与および静脈内投与は、代謝過程および時定数が異なる。これらの差を関数Ｖ（ｎ／Ｍ）によって補正する。

代謝される基質分子の数は基質分子が増加するにつれて増加するので、動力学的性質の測定信号値は、基質分子の数の増加に伴って増加する。肝臓代謝では、体重の２乗Ｍ^２につき特定量の分子を投与するのが有用である。これは、肝臓が体重の２乗の増加に伴ってその力を増大させることを考慮に入れている。したがって、肝臓の代謝力は、ｎ／Ｍ^２に比例する。

最後に、身体内の分布過程、肝細胞の細胞膜における拡散および輸送過程のために、判定した肝臓の代謝力「ＭｅｔＰｏｗ」は、投与した基質分子の数ｎに非線形に依存する。関数Ｌ（ｎ／Ｍ）は、この機能性を表す。関数Ｌ（ｎ／Ｍ）は、線形依存を示すいくつかの範囲を有するが、投与量が増加するにつれて、ますます線形依存から外れる。

一実施形態では、ｇ（Ｐ）はＰである。−すなわち、産物がＣＯ_２である場合、ｇ（Ｐ_ＣＯ２）はＰ_ＣＯ２であり、各々−および／またはＶ（ｎ／Ｍ）は１であり、および／またはｈ（ｎ）は１である。

最も単純な例では、さらなる好ましい一実施形態を表すと、ｇ（Ｐ_ＣＯ２）＝Ｐ_ＣＯ２、Ｖ（ｎ／Ｍ）＝１、およびｈ（ｎ）＝１のとき、肝臓代謝力は、次式で計算される：
ＭｅｔＰｏｗ＝ｃａｌ＊［Ｆ（^１３ＣＯ，^１２ＣＯ_２，ｔ）−ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２，ｔ）_ｎａｔ］＊Ｐ_ＣＯ２＊（ｎ／Ｍ^２）＊Ｌ（ｎ／Ｍ）

一実施形態では、ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２）_ｎａｔと同じ方法で、例えば、前述の対応する２式のうちの１式によって、Ｆ（^１３ＣＯ_２，^１２ＣＯ_２，ｔ）を計算することが可能である。

肝臓代謝力ＭｅｔＰｏｗは、投与量（ｎ／Ｍ）の変動および関数Ｌ（ｎ／Ｍ）の補間によって最大可能な肝臓能の判定に使用できる。いずれの場合でも、代謝力は、選択した酵素の代謝能と同等と見なすことができる。ここでは肝臓代謝力を実例として選択したが、上記の説明のすべてを、臓器の機能または代謝力に対してさらに演繹することなく、一般に臓器の代謝力にも転換でき、また、酵素の代謝能の判定にも適用できる。

産物濃度を判定するために、様々な高感度および時間分解の測定方法、例えば、赤外線吸収分光法、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ分光法）、またはコンピュータトモグラフィ（ＣＴ）、例えば、ＣＴ容積測定の形態などを、個別にまたは互いに組み合わせて使用できる。このような組合せによって、個々の測定方法のそれぞれの利点を互いに組み合わせることができ、このようにして、酵素の代謝能についての補足またはより正確な説明ができる。

一方で、検査する個人の酵素によって代謝できる適切な基質と、容易に検出できるその代謝産物とは、^１３Ｃ−標識メタセチン、^１３Ｃ−標識フェナセチン、^１３Ｃ−標識アミノピリン、^１３Ｃ−標識カフェイン、^１３Ｃ−標識エリスロマイシン、および／または^１３Ｃ−標識エトキシクマリンである。上記の説明に従う方法におけるこれらの基質の個別または組合せでの使用もまた、本発明の主題である。

ここでの好ましい投与量は、個人の体重１ｋｇにつき約０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、特に個人の体重１ｋｇにつき０．５ｍｇ〜９ｍｇ、特に１ｍｇ〜８ｍｇ、特に２ｍｇ〜７ｍｇ、特に３ｍｇ〜６ｍｇ、とりわけ４ｍｇ〜５ｍｇである。

本方法の範囲内において、好ましくは、呼気中の^１３Ｃ−標識代謝産物の絶対含有量、特に^１３ＣＯ_２含有量を判定する。この場合、呼気中の^１３Ｃ−標識産物の含有量、特に^１３ＣＯ_２含有量の測定は、リアルタイムにも連続的にも行うことができる。計測器において呼気中の^１３Ｃ−標識代謝産物の濃度、特に^１３ＣＯ_２濃度を連続判定すると、より多くのデータポイントが検出されて、それによってその検出されたデータポイントからより高い解像度および精度の測定曲線が計算される。

多くの基質が、個人が吐き出した空気中の産物濃度の判定による代謝動力学的性質の直接検出に適するであろうが、残念なことに溶解しにくい。これらの基質を経口摂取し、後に光誘導で血液中で活性化させる場合（caged compounds）、これは欠点ではない。別の形態の投与は、部分的に、これらの基質を、例えば水溶液またはわずかに揮発性の溶液に溶解できることに依存している。このため、ナノ担体を使用でき、特にモデル化でき、したがって、ナノ担体は十分な形態で基質を取り込むことができる領域を含有できる。ナノ担体の発展は、広範囲にわたる可能性をもたらし、赤外分光法、質量分析、ＣＴ、および／またはＮＭＲ分光法における呼吸の分析に使用できる。

ケージド化合物またはナノ担体を利用したくない場合、基質の溶解性をより向上させるのに、例えばプロピレングリコールなどの可溶化剤の使用を推奨できる。したがって、上記説明の方法における^１３Ｃ−メタセチンと可溶化剤、特にプロピレングリコールとの水溶液の使用も本発明の主題である。

この場合、可溶化剤、特にプロピレングリコールの濃度は、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、特に２０〜８０ｍｇ／ｍｌ、特に３０〜７０ｍｇ／ｍｌ、とりわけ４０〜６０ｍｇ／ｍｌであり、^１３Ｃ−メタセチンの濃度は、好ましくは０．２〜０．６％（重量／重量）、特に０．３〜０．５％（重量／重量）、または約０．４％（重量／重量）である。

別の一実施形態では、^１３Ｃ−メタセチンは、さらに高い濃度、すなわち、３％（重量／重量）超、特に４％（重量／重量）超、特に５％（重量／重量）超の濃度で使用する。この場合、可溶化剤の濃度は、前述の範囲内にあり得る。

今回特許請求する本発明のさらなる利点および詳細を、例示的な実施形態の図を用いてさらに説明する。

図１は、測定期間にわたる代謝産物の濃度の速度論的性質のグラフ図を示す。 図２は、実施形態に従って判定した非線形の肝臓代謝力のグラフ図を示す。

図１は、個人が吐き出した空気中の測定対象である産物の濃度を時間の関数としたグラフ図を示す。基質として、個人の体重１ｋｇにつき^１３Ｃ−標識メタセチンを用量２ｍｇで個人に投与した。その際の放出期間は６０秒より短かった。個人の身体において、^１３Ｃ−標識メタセチンは、肝臓中でパラセタモールおよび^１３Ｃ−標識ＣＯ_２に代謝された。その^１３Ｃ−標識ＣＯ_２を個人が吐き出した空気中の産物として検出した。

図１の図は、呼気中の、ベースラインを超えるデルタ値（Delta-Over-Baseline-value：ＤＯＢ値）としての^１３ＣＯ_２濃度の増加を示す。この図では、１ＤＯＢは、^１３ＣＯ_２と^１２ＣＯ_２の比の変化の自然比を超える部分を、１０００分の１単位で表す。次いで、図１に示す、得られた測定値を、適切なモデル関数に適合させる。これは図１にまだ示していない。今回、このモデル関数−よく知られた関数式等−から、関数を規定する異なるパラメータを導出できる。これらのパラメータから、検査した酵素系の代謝能について結論を出すことができる。

最大メタセチン（methacetine）代謝の時点（ｔ_ｍａｘ，約６．５分）および最大の半分のメタセチン（methacetine）代謝の時点（ｔ_１／２，約１．５分）を図１に示す。

メタセチンは肝臓中でほぼ単独で代謝されるので、特定の代謝動力学的性質を用いて、投与した基質の、肝臓にある酵素による代謝を直接かつ直ちに追跡することが可能である。このようにして、投与したメタセチンを肝臓中の酵素ＣＹＰ４５０ １Ａ２で脱メチル化する。投与したメタセチンの速度論的性質の増加およびそこから誘導したパラメータを解釈することによって、今回、肝臓機能を直接判定することが可能である。この場合、例えば、呼気中の最大産物濃度の値Ｐ_ｍａｘから、健常な肝細胞の数およびこのように代謝に役立つ肝臓体積に関する説明が可能になる。一方、測定値に適合させた、モデル関数の時定数（複数可）の形での増加から、基質が肝細胞に入る速度に関する説明が可能になる。したがって、モデル関数の時定数（複数可）から、肝臓が基質を少しでも吸収できるかどうかに関する説明が可能になる。時定数の分散から、肝細胞の基質感受性に関する細胞間の差について結論を出すことができる。

図２は、メタセチン代謝によって判定した非線形の肝臓代謝力を示す。メタセチンを様々な投与量で投与した後に観察された様々なメタセチン代謝に関して、代謝力を前述の式に従って判定した。詳細には、体重１ｋｇにつき^１３Ｃ−標識メタセチンを１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、および８ｍｇ投与した。

体重Ｍの１ｋｇあたりの１ｍｇならびに２ｍｇの^１３Ｃ−標識メタセチンは、測定信号において線形依存性を示す。投与を４ｍｇ／ｋｇに増加すると、線形挙動から１０％のずれを示し、８ｍｇ／ｋｇの投与は、線形挙動から２０％超のずれを示す。

この非線形性は関数Ｌ（ｎ／Ｍ）によって表され、式中、ｎは基質分子、すなわちメタセチン分子の数を示し、Ｍは単位ｋｇの体重を示す。この関数Ｌ（ｎ／Ｍ）は、個々の測定点の間の補間曲線によって図２に示すフィッティング曲線の部分を形成する。代謝力が基質の投与量に対して線形依存すると仮定し、非線形効果を考慮しなかった場合、直線的な曲線は仮定上の補間曲線を示す。
なお、本発明は、実施の態様として以下の内容を含む。
［態様１］
少なくとも１種の酵素の代謝能を判定する方法であって、
・個人が吐き出した空気中の産物濃度を時間分解判定するステップであって、前記産物が、前記個人に事前投与した基質の、前記個人の少なくとも１種の酵素により代謝によって生成され、前記産物濃度が、少なくとも前記個人が吐き出した空気中の産物濃度が最大に達するまで判定されるステップと、
・開始時間と終了時間との間の前記産物濃度の時間分解判定によって得られた前記産物濃度の測定値にモデル関数を適合させるステップと、
・前記酵素の代謝能を、前記モデル関数を規定するモデル関数のパラメータに基づいて判定するステップとを含む方法において、
前記酵素の代謝能の判定が、前記モデル関数の少なくとも２個のパラメータに基づいて行われ、前記モデル関数が単一指数関数である限りにおいて、前記モデル関数の最大値および前記モデル関数の時定数がパラメータとして同時に選択されず、さらに、前記開始時間および／または終了時間がパラメータとして選択されない条件の下であることを特徴とする方法。
［態様２］
態様１に記載の方法において、前記パラメータが、前記モデル関数の最大値、前記モデル関数のｉ番目モーメント（ｉ＝１，２，３，４，．．．）、前記モデル関数のｊ番目中心モーメント（ｊ＝１，２，３，４，．．．）、前記モデル関数の標準偏差、前記モデル関数の時定数、前記時定数の重心、前記重心からの前記時定数の平均偏差、前記時定数の変動、前記時定数の分布、前記時定数の重み付け、前記時定数の分布の重み付け、前記時定数の変動の重み付けを含む群から選択されることを特徴とする方法。
［態様３］
態様１または２に記載の方法において、前記モデル関数が、一階微分方程式の解関数、二階微分方程式の解関数、三階微分方程式の解関数、様々な階数の微分方程式の組合せの解関数、または時間の関数としての多指数関数であることを特徴とする方法。
［態様４］
態様１〜３のいずれか一態様に記載の方法において、前記産物濃度の前記判定がフロースルーで行われることを特徴とする方法。
［態様５］
態様４に記載の方法において、前記濃度の判定に使用する測定器を貫流する呼気の流速が測定されることを特徴とする方法。
［態様６］
態様１〜５のいずれか一態様に記載の方法において、前記産物濃度を判定するために測定器を使用し、前記測定器の呼吸抵抗が１００ｍｂａｒ未満であることを特徴とする方法。
［態様７］
態様１〜６のいずれか一態様に記載の方法において、前記個人の少なくとも１回の呼吸の全呼気が呼気として使用されることを特徴とする方法。
［態様８］
態様１〜７のいずれか一態様に記載の方法において、前記個人が本質的に静止位置にいる間に前記産物濃度の判定が行われることを特徴とする方法。
［態様９］
態様１〜８のいずれか一態様に記載の方法において、前記個人が横になっている、または座っている間に、前記産物濃度の判定が行われ、その際の前記個人の脚および／または身体の上部の位置が、所定位置と比較して４５度未満、特に３０度未満、とりわけ１５度未満しか変化していないことを特徴とする方法。
［態様１０］
態様１〜９のいずれか一態様に記載の方法において、前記産物濃度の判定が、呼気中の産物濃度が最大に達するまで本質的に行われることを特徴とする方法。
［態様１１］
態様１〜１０のいずれか一態様に記載の方法において、前記産物濃度の判定が、赤外線吸収分光法によって、質量分析によって、コンピュータトモグラフィによって、および／または核磁気共鳴分光法によって行われることを特徴とする方法。
［態様１２］
態様１〜１１のいずれか一態様に記載の方法において、前記モデル関数が次式によって表され：
ＭｅｔＰｏｗ＝ｃａｌ＊［Ｆ（産物，ｔ）−ｆ（産物，ｔ） _ｎａｔ ］＊ｇ（Ｐ）＊ｈ（ｎ）＊Ｌ（ｎ／Ｍ）＊（ｎ／Ｍ ^２ ）＊Ｖ（ｎ／Ｍ）
式中、
ＭｅｔＰｏｗは、代謝能を示し、
ｃａｌは、補正を考慮した定数であり、
Ｆ（産物，ｔ）は、吐き出された産物の動力学的性質を表す関数であり、
ｆ（産物，ｔ） _ｎａｔ は、基質投与前の前記個人が吐き出した空気中の前記産物の自然存在比を表す関数であり、
ｇ（Ｐ）は、前記個人の活動状態に対する前記個人の産物生成速度Ｐの依存性を表す関数であり、
ｈ（ｎ）は、基質分子１個につき生成される産物分子の数を表す関数であり、
Ｌ（ｎ／Ｍ）は、投与した基質分子の数ｎに依存する代謝能の非線形挙動を表す関数であり、Ｍは、前記個人の体重を示し、
Ｖ（ｎ／Ｍ）は、前記基質の様々な投与手順に起因する依存性を表す関数である
ことを特徴とする方法。
［態様１３］
態様１２に記載の方法において、ｇ（Ｐ）＝Ｐ、および／またはｈ（ｎ）＝１、および／またはＶ（ｎ／Ｍ）＝１であることを特徴とする方法。
［態様１４］
態様１〜１３のいずれか一態様に記載の方法において、前記モデル関数が次式によって表され：
ＭｅｔＰｏｗ＝ｃａｌ＊［Ｆ（ ^１３ ＣＯ _２ ， ^１２ ＣＯ _２ ，ｔ）−ｆ（ ^１３ ＣＯ _２ ， ^１２ ＣＯ _２ ，ｔ） _ｎａｔ ］＊ｇ（Ｐ _ＣＯ２ ）＊ｈ（ｎ）＊Ｌ（ｎ／Ｍ）＊（ｎ／Ｍ ^２ ）＊Ｖ（ｎ／Ｍ）、
式中、
ＭｅｔＰｏｗは、代謝能を示し、
ｃａｌは、補正を考慮した定数であり、
Ｆ（ ^１３ ＣＯ _２ ， ^１２ ＣＯ _２ ，ｔ）は、産物として吐き出された ^１３ ＣＯ _２ の動力学的性質を表す関数、または吐き出された ^１３ ＣＯ _２ ／ ^１２ ＣＯ _２ の比の動力学的性質を表す関数であり、
ｆ（ ^１３ ＣＯ _２ ， ^１２ ＣＯ _２ ，ｔ） _ｎａｔ は、基質投与前の前記個人が吐き出した空気中の ^１３ ＣＯ _２ と ^１２ ＣＯ _２ の自然存在比を表す関数であり、
ｇ（Ｐ _ＣＯ２ ）は、前記個人の活動状態に対する前記個人のＣＯ _２ 生成速度Ｐ _ＣＯ２ の依存性を表す関数であり、
ｈ（ｎ）は、基質分子１個につき生成されるＣＯ _２ 分子の数を表す関数であり、
Ｌ（ｎ／Ｍ）は、投与した基質分子の数ｎに依存する代謝能の非線形挙動を表す関数であり、Ｍは、前記個人の体重を示し、
Ｖ（ｎ／Ｍ）は、前記基質の様々な投与手順に起因する依存性を表す関数である
ことを特徴とする方法。
［態様１５］
態様１４に記載の方法において、ｇ（Ｐ _ＣＯ２ ）＝Ｐ _ＣＯ２ 、および／またはｈ（ｎ）＝１、および／またはＶ（ｎ／Ｍ）＝１であることを特徴とする方法。
［態様１６］
態様１〜１５のいずれか一態様に記載の方法において基質として使用するため、各々が ^１３ Ｃ−標識されている、メタセチン、フェナセチン、アミノピリン（aminopyrin）、カフェイン、エリスロマイシン、および／またはエトキシクマリン。
［態様１７］
態様１〜１５のいずれか一態様に記載の方法において基質として使用するための ^１３ Ｃ−メタセチンと可溶化剤との水溶液。
［態様１８］
態様１７に記載の使用のための ^１３ Ｃ−メタセチンと可溶化剤との水溶液において、前記可溶化剤の濃度が１０〜１００ｍｇ／ｍｌであり、前記 ^１３ Ｃ−メタセチンの濃度が０．２〜０．６％（重量／重量）であることを特徴とする水溶液。
［態様１９］
態様１７に記載の使用のための ^１３ Ｃ−メタセチンと可溶化剤との水溶液において、前記 ^１３ Ｃ−メタセチンの濃度が３％（重量／重量）超であることを特徴とする水溶液。

Claims (9)

1. 少なくとも１種の酵素の代謝能を判定するためにデータを得る方法であって、
   ・個人が吐き出した空気中の産物濃度を時間分解測定するステップであって、前記産物が、前記個人に事前投与した基質の、前記個人の少なくとも１種の酵素により代謝によって生成され、前記産物濃度が、少なくとも前記個人が吐き出した空気中の産物濃度が最大に達するまで測定されるステップと、
   ・前記産物濃度の時間分解測定によって得られた前記産物濃度の測定値の増加のみを対象として最大値になるまでモデル関数を適合させるステップと、
   ・前記酵素の代謝能を、前記モデル関数を規定するモデル関数のパラメータに基づいて判定するためにデータを得るステップとを含む方法において、
   前記モデル関数が微分方程式の解関数であり、前記酵素の代謝能の判定のためのデータの入手が、前記モデル関数の少なくとも２個のパラメータに基づいて行われ、
   前記モデル関数が単一指数関数である場合、前記モデル関数の最大値および前記モデル関数の時定数がパラメータとして同時に選択されず、
   前記モデル関数における開始時間および／または終了時間がパラメータとして選択されない条件の下であることを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記パラメータが、前記モデル関数の最大値、前記モデル関数のｉ番目モーメント（ｉ＝１，２，３，４，．．．）、前記モデル関数のｊ番目中心モーメント（ｊ＝１，２，３，４，．．．）、前記モデル関数の標準偏差、前記モデル関数の時定数、前記時定数の重心、前記重心からの前記時定数の平均偏差、前記時定数の変動、前記時定数の分布、前記時定数の重み付け、前記時定数の分布の重み付け、前記時定数の変動の重み付けを含む群から選択されることを特徴とする方法。
3. 請求項１または２に記載の方法において、前記産物濃度の測定に使用する測定器を貫流する呼気の流速が測定されることを特徴とする方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法において、前記個人が本質的に静止位置にいる間に前記産物濃度の測定が行われることを特徴とする方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、前記個人が横になっている、または座っている間に、前記産物濃度の測定が行われ、その際の前記個人の脚および／または身体の上部の位置が、測定開始時の横になっている、または座っている位置と比較して４５度未満しか変化していないことを特徴とする方法。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、前記基質が、各々が^１３Ｃ−標識されている、メタセチン、フェナセチン、アミノピリン（aminopyrin）、カフェイン、エリスロマイシン、および／またはエトキシクマリンから選択されることを特徴とする方法。
7. 請求項６に記載の方法において、前記基質が ^１３Ｃ−メタセチンであって、水溶液中で可溶化剤と共に供給されることを特徴とする方法。
8. 請求項７に記載の方法において、前記可溶化剤の濃度が１０〜１００ｍｇ／ｍｌであり、前記^１３Ｃ−メタセチンの濃度が０．２〜０．６％（重量／重量）であることを特徴とする方法。
9. 請求項７に記載の方法において、前記^１３Ｃ−メタセチンの濃度が３％（重量／重量）超であることを特徴とする方法。

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