JP6116142B2 - 走査型共焦点レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、走査型共焦点レーザ顕微鏡に関し、特に、標本の三次元画像を生成する走査型共焦点レーザ顕微鏡に関する。

走査型共焦点レーザ顕微鏡により生体標本の三次元画像を生成する方法として、標本の光軸方向に異なる面のスライス画像を、対物レンズなどを光軸方向に移動させることで順次取得し、それらを合成する方法が知られている。

しかしながら、ガルバノミラーなどにより光軸と直交する方向に標本を走査することで取得されるスライス画像はその取得に相応の時間を要するため、各面のスライス画像を順次取得する上述した方法を用いた場合には、三次元画像を高速に生成することが難しい。

このため、近年では、より高速に３次元画像を生成し得る走査型共焦点レーザ顕微鏡が求められている。そのような顕微鏡は、例えば、特許文献１で開示されている。

特開２００９−１９８９８０号公報

特許文献１に開示される顕微鏡は、複数のスライス画像を同時に取得することができる。しかしながら、特許文献１に開示される顕微鏡には、種々の技術的な課題が存在する。

例えば、特許文献１に開示される顕微鏡は、同時に取得するスライス画像の枚数と同じ数だけ照明手段と検出手段を有しているため、装置が大型化しやすい。また、特許文献１に開示される顕微鏡は、照明と検出の両方に用いられる光学素子を集光位置に配置しているため、その光学素子に埃などが付着した場合に、大きく性能が劣化してしまう。特に、可干渉性の強いレーザ光が作用する照明においては、その影響は顕著である。
このため、特許文献１に開示される顕微鏡とは異なる構成を有する、高速に３次元画像を生成し得る走査型共焦点レーザ顕微鏡が求められている。
以上のような実情を踏まえ、本発明は、１回の標本走査で複数のスライス画像を取得し得る走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供することを課題とする。

本願の第１の態様は、レーザ光を出射する単一のレーザ光源と、前記単一のレーザ光源から出射された前記レーザ光を標本の光軸方向に異なる複数の集光位置に集光させる多焦点形成部であって、前記レーザ光を分割する光路分割手段と、前記光路分割手段で分割されたレーザ光の少なくとも１つの光路上の光学素子を制御して、前記複数の集光位置のうちの少なくとも１つの集光位置を光軸方向に変更する集光位置変更手段を含む多焦点形成部と、各々が前記複数の集光位置のうちの対応する集光位置からの検出光と他の位置からの検出光とを分割する複数の共焦点手段と、各々が前記複数の集光位置のうちの対応する集光位置から生じる検出光を前記複数の共焦点手段のうちの対応する共焦点手段を介して検出する複数の検出手段と、前記集光位置変更手段により変更された集光位置と前記複数の共焦点手段のうちの前記変更された集光位置に対応する共焦点手段との共役関係を維持する検出位置変更手段と、を含む多焦点検出部と、を含む走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第２の態様は、第１の態様に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記多焦点形成部は、さらに、前記光路分割手段で分割されたレーザ光の少なくとも１つの光路上に、集光レンズと、前記集光レンズを介して入射するレーザ光を前記集光レンズに向けて反射させて前記光路分割手段に入射させる反射部材と、を含み、前記集光位置変更手段は、前記集光レンズと前記反射部材との間隔を変更する走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第３の態様は、第１の態様に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記多焦点形成部は、さらに、前記光路分割手段で分割されたレーザ光の少なくとも１つの光路上に、デフォーマブルミラーを含み、前記集光位置変更手段は、前記デフォーマブルミラーの曲率を変更する走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第４の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記多焦点形成部は、収斂状態が異なる複数の光束であって、前記複数の光束の光軸の方向が互いに異なる、という複数の光束を出射する走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第５の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記複数の共焦点手段の各々は、対応する集光位置からの検出光を反射させ、他の位置からの検出光を透過させる、または、対応する集光位置からの検出光を透過させ、他の位置からの検出光を反射させる走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第６の態様は、第５の態様に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記複数の共焦点手段の各々は、対応する集光位置と共役な位置に開口が形成された、反射コーティングされた部材である走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第７の態様は、第５の態様に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記複数の共焦点手段の各々は、対応する集光位置と共役な位置に反射コーティングされた、透明部材である走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第８の態様は、第５の態様乃至第７の態様のいずれか１つに記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記検出位置変更手段は、前記集光位置変更手段により変更される集光位置に対応する共焦点手段の前記標本側に配置された光学素子を移動させる、または、交換する走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本願の第９の態様は、第５の態様乃至第７の態様のいずれか１つに記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、前記検出位置変更手段は、前記集光位置変更手段により変更される集光位置に対応する共焦点手段を光軸方向に移動させる走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、１回の標本走査で複数のスライス画像を取得し得る走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供することができる。

本発明の実施例１に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。 本発明の実施例２に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。 本発明の実施例３に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。 本発明の実施例４に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。 本発明の実施例５に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。 本発明の実施例６に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の多焦点形成部の構成を例示した図である。 本発明の実施例６に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の多焦点検出部の構成を例示した図である。 本発明の実施例７に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。 本発明の実施例７に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の走査対象範囲を説明するための図である。

図１は、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。図１に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡１は、対物レンズ１７の光軸方向に異なる標本１８の複数の面のスライス画像を同時に取得して、標本１８の３次元画像を生成する走査型共焦点レーザ顕微鏡である。

走査型共焦点レーザ顕微鏡１は、照明光路上に、ファイバ光源ユニット２と、コリメートレンズ３と、多焦点形成部４と、リレー光学系１１と、レーザ光を透過させ標本１８からの蛍光を反射させるダイクロイックミラー１２と、標本１８を対物レンズ１７の光軸と直交する方向に走査するガルバノミラー１３と、瞳レンズ１４と、結像レンズ１５と、ミラー１６と、対物レンズ１７と、備えている。

ファイバ光源ユニット２は、標本１８を励起するレーザ光を出射する単一のレーザ光源２ａと、光ファイバ２ｃと、レーザ光を光ファイバ２ｃの入射端に集光させるカップリングレンズ２ｂと、を備えている。光ファイバ２ｃの射出端から発散光束として出射されたレーザ光は、コリメートレンズ３によりコリメートされて、コリメートレンズ３から平行光束として出射される。

多焦点形成部４は、レーザ光を分割するための偏光ビームスプリッタ（以降、ＰＢＳと記す）５と、ＰＢＳ５により分割されたレーザ光の一方の光路上に配置された、λ／４板６と、ミラー７と、λ／４板８と、集光レンズ９と、集光レンズ９の光軸方向に移動自在に配置されたミラー１０と、を備えている。多焦点形成部４は、さらに、集光レンズに近接して配置されているミラー１０を光軸方向に移動させる第１の制御部２７を備えている。

ＰＢＳ５は、平行光束としてＰＢＳ５の斜面に入射したレーザ光のうちのＰ偏光成分を透過させ、レーザ光のＳ偏光成分を反射させる特性を有している。このため、ファイバ光源ユニット２から出射される直線偏光であるレーザ光がＰＢＳ５の斜面に対してＳ偏光成分とＰ偏光成分を有するようにレーザ光源２ａが配置されることで、ＰＢＳ５はレーザ光を分割する光路分割手段として機能する。

多焦点形成部４に入射したレーザ光のうちＰＢＳ５の斜面を透過したＰ偏光であるレーザ光は、Ｐ偏光のまま多焦点形成部４から出射される。一方、ＰＢＳ５の斜面を反射したＳ偏光であるレーザ光は、ミラー７で反射して再びＰＢＳ５に入射する。レーザ光はＰＢＳ５の斜面を反射してからＰＢＳ５に再入射するまでの間に２度λ／４板６を通過してＰ偏光となっているため、再入射したＰＢＳ５の斜面を透過する。さらに、ＰＢＳ５の斜面を透過したＰ偏光であるレーザ光は、集光レンズ９を介して入射するミラー１０で反射して再びＰＢＳ５に入射する。レーザ光はＰＢＳ５の斜面を透過してからＰＢＳ５に再入射するまでの間に２度λ／４板８を通過してＳ偏光となっているため、再入射したＰＢＳ５の斜面を反射して、多焦点形成部４から出射される。つまり、ＰＢＳ５でＰ偏光成分とＳ偏光成分に分割されたレーザ光は、それぞれの偏光方向が直交した状態で多焦点形成部４から出射される。

また、多焦点形成部４のミラー１０は、集光レンズ９を介して入射するレーザ光を集光レンズ９に向けて反射させてＰＢＳ５に再入射させる反射部材であり、上述したように、第１の制御部２７により集光レンズ９の光軸方向に移動自在である。このため、ミラー１０で反射したレーザ光は、ミラー１０の位置に応じて異なる状態で多焦点形成部４から出射される。具体的には、ミラー１０が集光レンズ９の焦点面に配置されている場合であれば平行光束として、ミラー１０が焦点面より集光レンズ９から離れた面に配置されている場合であれば収斂光束として、ミラー１０が焦点面より集光レンズ９に近い面に配置されている場合であれば発散光束として、多焦点形成部４から出射される。

従って、多焦点形成部４は、平行光束として入射するレーザ光源２からのレーザ光を収斂状態の異なる複数のレーザ光束（実線で示す平行光束と、破線で示す収斂光束）に変換して出射する。ここで、収斂状態とは、光束が収斂光束である状態だけでなく、平行光束である状態や発散光束である状態も含むものである。収斂状態の異なる光束は、リレー光学系１１を介して入射するダイクロイックミラー１２を透過し、複数の光学素子（ガルバノミラー１３、瞳レンズ１４、結像レンズ１５、ミラー１６、対物レンズ１７）を介して標本１８の光軸方向に異なる集光位置（集光位置Ｐ１、集光位置Ｐ２）に集光する。即ち、多焦点形成部４は、レーザ光を標本１８の光軸方向に異なる複数の集光位置に集光させるための手段として機能する。

また、多焦点形成部４では、第１の制御部２７がミラー１０を光軸方向に移動させることで、ミラー１０で反射したレーザ光の標本１８上の集光位置Ｐ２が光軸方向に変化する。即ち、第１の制御部２７は、多焦点形成部４により形成される複数の集光位置のうちの少なくとも１つの集光位置を光軸方向に変更する集光位置変更手段であり、多焦点形成部４は、集光位置変更手段として第１の制御部２７を備えている。

なお、走査型共焦点レーザ顕微鏡１では、集光レンズ９の瞳位置は、リレー光学系１１によりガルバノミラー１３に投影されていることが望ましい。このとき、集光レンズ９の瞳位置とガルバノミラー１３は光学的に共役な関係となっている。このため、ミラー１０の位置を変えてもケラレによる光量ロスがなく、ＮＡが一定となるため解像力の低下が起こらずに集光位置Ｐ１と集光位置Ｐ２とを分離することができる。

走査型共焦点レーザ顕微鏡１は、さらに、ダイクロイックミラー１２により照明光路から分岐した検出光路上に、複数の集光位置からの蛍光の各々を検出光として同時に且つ別個に検出する多焦点検出部１９を備えている。

多焦点検出部１９は、集光レンズ２０と、複数の共焦点絞り（共焦点絞り２１、共焦点絞り２４）と、複数のバリアフィルタ（バリアフィルタ２２、バリアフィルタ２５）と、複数の光電子増倍管（以降、ＰＭＴと記す。ＰＭＴ２３、ＰＭＴ２６）と、を備えている。多焦点検出部１９は、さらに、共焦点絞り２４を光軸方向に移動させる第２の制御部２８を備えている。

複数の共焦点絞りの各々は、多焦点形成部４により形成される複数の集光位置のうちの対応する集光位置と共役な位置に開口が形成された、反射コーティングされた部材である。具体的には、共焦点絞り２１は多焦点形成部４から平行光束として射出されるレーザ光（図１の実線）の集光位置Ｐ１に対応する共焦点絞りであり、共焦点絞り２４は多焦点形成部４から収斂光束として射出されるレーザ光（図１の破線）の集光位置Ｐ２に対応する共焦点絞りである。

複数のバリアフィルタの各々は、対応する共焦点手段を介して入射する光に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタである。具体的には、バリアフィルタ２２は集光位置Ｐ１及び共焦点絞り２１に対応するバリアフィルタであり、バリアフィルタ２５は集光位置Ｐ２及び共焦点絞り２４に対応するバリアフィルタである。

複数のＰＭＴの各々は、対応する集光位置から生じる、対応する共焦点手段を介して入射する蛍光を検出する検出手段である。具体的には、ＰＭＴ２３は集光位置Ｐ１及び共焦点絞り２１に対応する検出手段であり、ＰＭＴ２６は集光位置Ｐ２及び共焦点絞り２４に対応する検出手段である。

第２の制御部２８は、第１の制御部２７がミラー１０を光軸方向に移動させることにより変更される集光位置Ｐ２に対応する共焦点絞り２４を、光軸方向に移動させる手段であり、第１の制御部２７と電気的に接続されている。

複数の集光位置の各々から生じた蛍光は、対物レンズ１７、ミラー１６、結像レンズ１５、瞳レンズ１４、ガルバノミラー１３を介して入射するダイクロイックミラー１２で反射し、多焦点検出部１９に入射する。

集光位置Ｐ１、集光位置Ｐ２から生じた蛍光は、集光位置の違いにより集光レンズ２０に異なる収斂状態で入射し、異なる位置に集光する。集光位置Ｐ１から生じた蛍光は、集光位置Ｐ１と光学的に共役な位置に形成された共焦点絞り２１の開口に集光して共焦点絞り２１を通過し、バリアフィルタ２２を介してＰＭＴ２３で検出される。一方、集光位置Ｐ１を除く他の位置から生じた光は、反射コーティングされた共焦点絞り２１を反射する。共焦点絞り２１を反射した光のうち集光位置Ｐ２から生じた蛍光は、集光位置Ｐ２と光学的に共役な位置に形成された共焦点絞り２４の開口に集光して共焦点絞り２４を通過し、バリアフィルタ２５を介してＰＭＴ２６で検出される。また、集光位置Ｐ１及び集光位置Ｐ２を除く他の位置から生じた光は、反射コーティングされた共焦点絞り２４を反射する。つまり、共焦点絞り２１及び共焦点絞り２４は、対応する集光位置からの蛍光を反射させて他の位置からの光を透過させることで、それらを分割する共焦点手段である。

第１の制御部２７がミラー１０を制御して集光位置Ｐ２を変化させると、第２の制御部２８は、共焦点絞り２４の開口が集光位置Ｐ２と光学的に共役な位置に位置するように、共焦点絞り２４を光軸方向に移動させる。つまり、第２の制御部２８は、第１の制御部２７と連動して動作し、第１の制御部２７により変更された集光位置Ｐ２とその集光位置Ｐ２に対応する共焦点手段である共焦点絞り２４との共役関係を維持する検出位置変更手段であり、多焦点検出部１９は、検出位置変更手段として第２の制御部２８を備えている。

以上のように構成された走査型共焦点レーザ顕微鏡１によれば、１回の標本走査で光軸方向に異なる複数の標本面を同時に走査して複数のスライス画像を取得することができるため、高速に３次元画像を生成することができる。

また、走査型共焦点レーザ顕微鏡１は、単一のレーザ光源から出射されたレーザ光を複数の集光位置に集光させる構成を採用しているため、集光位置毎にレーザ光源を設ける必要がなく、走査型共焦点レーザ顕微鏡１の構成の大型化を最小限に抑えることができる。

さらに、走査型共焦点レーザ顕微鏡１では、ミラー１０を移動させるだけで集光位置を変化させることが可能であり、また、共焦点絞り２４を移動させるだけで変化した集光位置からの蛍光を検出することができる。このため、照明系と検出系のそれぞれの最小限の光学素子の制御によって、生成する３次元画像の解像度などに応じて、同時に取得するスライド画像間の間隔を調整することができる。従って、照明系や検出系の全体を標本に対して相対的に移動させるような大掛かりな制御機構を必要としないため、小型の制御機構を採用して装置全体をコンパクトに構成することが可能となる。

また、走査型共焦点レーザ顕微鏡１では、照明光路上の集光位置に光学素子を配置しない構成を採用しているため、集光位置に配置された光学素子に付着した埃などによって高い干渉性を有するレーザ光が散乱し大幅に光量を損失するといった自体を避けることができる。なお、走査型共焦点レーザ顕微鏡１では、ミラー１０が集光レンズ９の焦点位置に配置された状態では、ミラー１０は集光位置に位置することになるが、標本１８の複数の面を同時に走査するためにはミラー１０は集光レンズ９の焦点位置からずれた位置に配置されるのが通常である。従って、走査型共焦点レーザ顕微鏡１によれば、単一の光源からのレーザ光を効率良く標本に照射することが可能である。

本実施例では、第１の制御部２７がミラー１０を光軸方向に移動させることによって、集光位置を変化させる構成が例示されているが、第１の制御部２７は、集光レンズ９とミラー１０との間隔を変更するように構成されていれば良く、例えば、ミラー１０の代わりに集光レンズ９を移動させてもよい。また、集光レンズ９を複数のレンズで構成し、第１の制御部２７が集光レンズ９を構成するレンズ間の距離を変化させることで集光位置を変化させてもよい。また、第１の制御部２７が厚さの異なる複数の透明部材から選択した部材を集光レンズ９とミラー１０の間に挿入することで集光位置を変化させてもよい。

また、本実施例では、光路分割手段としてＰＢＳ５を例示したが、光路分割手段は、レーザ光を分割する機能を有していれば良く、例えば、ＰＢＳ５の代わりにハーフミラーを用いてもよい。この場合、λ／４板６及びλ／４板８を省略することができる。

図２は、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。図２に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡３０は、多焦点形成部４の代わりに多焦点形成部３１を含んでいる点が、図１に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡１と異なっている。走査型共焦点レーザ顕微鏡３０のその他の構成は、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様であるため、詳細な説明は省略する。

多焦点形成部３１は、図２に示されるように、集光レンズ９及びミラー１０の代わりにデフォーマブルミラー３２を含み、第１の制御部２７がデフォーマブルミラー３２の曲率を変更する点が、図１に例示される多焦点形成部４と異なっている。

多焦点形成部３１は、第１の制御部２７がデフォーマブルミラー３２の曲率を変更することで、デフォーマブルミラー３２で反射したレーザ光の収斂状態を変更することができる。
従って、走査型共焦点レーザ顕微鏡３０によっても、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。

図３は、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。図３に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡４０は、多焦点形成部４の代わりに多焦点形成部４１を含んでいる点が、図１に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡１と異なっている。走査型共焦点レーザ顕微鏡４０のその他の構成は、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様であるため、詳細な説明は省略する。

多焦点形成部４１は、図３に示されるように、レーザ光の特定の偏光成分の位相を変調する位相変調型空間光変調器（以降、ＬＣＯＳと記す）４３と、コリメートレンズ３からのレーザ光をＬＣＯＳ４３に向けて反射し、ＬＣＯＳ４３からのレーザ光をリレー光学系１１（図１を参照）に向けて反射するプリズム４２とを備えている。さらに、多焦点形成部４１は、ＬＣＯＳ４３を制御する第１の制御部２７を備えている。

ＬＣＯＳ４３は、対物レンズ１７の瞳（及びガルバノミラー１３）と光学的に共役な位置に配置されていて、ＬＣＯＳ４３に入射するレーザ光のうちの、ＬＣＯＳ４３の液晶分子の配向方向に平行な偏光方向を有する成分の位相を変調して、その波面を制御する。
なお、ＬＣＯＳ４３は、対物レンズ１７の瞳位置からずれて配置されていても目的の効果を得ることができる。

多焦点形成部４１は、第１の制御部２７がＬＣＯＳ４３を制御して入射するレーザ光の一部の位相を変調することで、収斂状態の異なる複数のレーザ光束を出射することができる。
従って、走査型共焦点レーザ顕微鏡４０によっても、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。

図４は、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。図４に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡５０は、多焦点検出部１９の代わりに多焦点検出部５１を含んでいる点が、図１に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡１と異なっている。走査型共焦点レーザ顕微鏡５０のその他の構成は、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様であるため、詳細な説明は省略する。

多焦点検出部５１は、図４に示されるように、レンズ５２を含み、第２の制御部２８がレンズ５２を光軸方向に移動させる点が、図１に例示される多焦点検出部１９と異なっている。なお、レンズ５２は、共焦点絞り２１と共焦点絞り２４の間、即ち、集光位置Ｐ２に対応する共焦点絞り２４の標本側に配置されている。

多焦点検出部５１は、第２の制御部２８が集光位置Ｐ２と共焦点絞り２４との共役関係を維持するようにレンズ５２を光軸方向に移動させることで、ミラー１０（図１を参照）の位置によらず集光位置Ｐ２からの蛍光を検出することができる。
従って、走査型共焦点レーザ顕微鏡５０によっても、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。

本実施例では、第２の制御部２８がレンズ５２を光軸方向に移動させることによって、集光位置Ｐ２と共焦点絞り２４との共役関係を維持する構成が例示されているが、第２の制御部２８は、集光位置Ｐ２と共焦点絞り２４との共役関係を維持するように光学素子を制御すればよい。従って、例えば、レンズ５２を複数のレンズで構成し、第１の制御部２８がレンズ５２を構成するレンズ間の距離を変化させることで集光位置Ｐ２と共焦点絞り２４との共役関係を維持してもよい。また、第２の制御部２８が厚さの異なる複数の透明部材または焦点距離の異なる複数のレンズから選択した光学素子を共焦点絞り２４の標本側に挿入することで集光位置Ｐ２と共焦点絞り２４との共役関係を維持してもよい。

図５は、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成の一部を例示した図である。図５に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡６０は、多焦点検出部１９の代わりに多焦点検出部６１を含んでいる点が、図１に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡１と異なっている。走査型共焦点レーザ顕微鏡６０のその他の構成は、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様であるため、詳細な説明は省略する。

多焦点検出部６１は、図５に示されるように、共焦点絞り２１の代わりに集光位置Ｐ１と共役な位置に微小ミラー６３を備えた透明部材６２を、共焦点絞り２４の代わりに共焦点絞り６４を含む点、及び、第２の制御部２８が共焦点絞り６４を集光レンズ２０の光軸方向に移動させる点が、図１に例示される多焦点検出部１９と異なっている。なお、透明部材６２の微小ミラー６３は、透明部材６２の領域のうちの集光位置Ｐ１と共役な位置を含む微小な領域に反射コーティングすることで形成される。

集光位置Ｐ１から生じた蛍光は、集光位置Ｐ１と共役な位置に形成された微小ミラー６３を反射し、バリアフィルタ２２を介してＰＭＴ２３で検出される。一方、集光位置Ｐ１を除く他の位置から生じた蛍光は、透明部材６２及びバリアフィルタ２５を透過する。透明部材６２及びバリアフィルタ２５を透過した蛍光のうち集光位置Ｐ２から生じた蛍光は、集光位置Ｐ２と光学的に共役な位置に形成された共焦点絞り６４の開口に集光して共焦点絞り６４を通過し、ＰＭＴ２６で検出される。

多焦点検出部６１は、第２の制御部２８が集光位置Ｐ２と共焦点絞り６４との共役関係を維持するように共焦点絞り６４を光軸方向に移動させることで、ミラー１０（図１を参照）の位置によらず集光位置Ｐ２からの蛍光を検出することができる。

従って、走査型共焦点レーザ顕微鏡６０によっても、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。なお、走査型共焦点レーザ顕微鏡６０では、蛍光の集光位置に光学素子（微小ミラー６３）が位置する構成を採用するが、蛍光はレーザ光に比べて可干渉性が低いため、大幅に検出光量を損失するといった自体は起こり得えない。

本実施例では、集光位置Ｐ２に対応する共焦点手段として共焦点絞り６４を例示したが、共焦点絞り６４の代わりに微小ミラーを備えた透明部材を用いてもよい。この場合、ＰＭＴ２６は微小ミラーの反射光路上に配置され、第２の制御部２８は微小ミラーと集光位置Ｐ２との光学的に共役な関係が維持されるように透明部材を移動させればよい。

図６及び図７は、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の多焦点形成部及び多焦点検出部の構成を例示した図である。本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡７０は、標本の光軸方向に異なる４面を同時に走査するために、多焦点形成部４の代わりに多焦点形成部７１を、多焦点検出部１９の代わりに多焦点検出部８１を含む点が、図１に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡１と異なっている。走査型共焦点レーザ顕微鏡７０のその他の構成は、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様であるため、詳細な説明は省略する。

図６に例示される多焦点形成部７１は、図１に例示される多焦点形成部４に相当する構成（第１の多焦点形成部７１ａ、第２の多焦点形成部７１ｂ）を直列に２つ並べて、且つ、その間に瞳リレー光学系７２とλ／４板７３を配置した構成を有している。つまり、多焦点形成部７１は、瞳リレー光学系７２と、λ／４板７３と、第２の多焦点形成部７１ｂ（ＰＢＳ７４、λ／４板７５、ミラー７６、λ／４板７７、集光レンズ７８、ミラー７９、第３の制御部８０）をさらに含む点、及び、第１の制御部２７及び第３の制御部８０が後述する多焦点検出部８１に含まれる第２の制御部２８、第４の制御部８８及び第５の制御部８９と連動する点、が多焦点形成部４と異なっている。

多焦点形成部７１では、第１の多焦点形成部７１ａから出射される異なる収斂状態の２光束（直線偏光）は、瞳リレー光学系７２を介して入射するλ／４板７３で円偏光に変換されて、第２の多焦点形成部７１ｂに入射する。そして、第２の多焦点形成部７１ｂに入射した２光束は、それぞれ、第２の多焦点形成部７１ｂで異なる収斂状態の２光束に変換されて出射される。即ち、多焦点形成部７１は、平行光束として入射するレーザ光源２からのレーザ光を、収斂状態の異なる４つのレーザ光束（実線で示す平行光束と、破線、一点鎖線、点線で示す３つの収斂光束）に変換して出射し、標本の光軸方向に異なる４つの集光位置に集光させるように機能する。

なお、多焦点形成部７１では、第１の制御部２７及び第３の制御部８０がミラー１０及びミラー７９を光軸方向に移動させることで、出射される４つのレーザ光束のうちの３つのレーザ光束が形成する３つの集光位置が光軸方向に変化する。

図７に例示される多焦点検出部８１は、多焦点形成部７１により形成される４つの集光位置に対応する、４つの共焦点絞り（共焦点絞り２１、共焦点絞り２４、共焦点絞り８２、共焦点絞り８５）と、４つのバリアフィルタ（バリアフィルタ２２、バリアフィルタ２５、バリアフィルタ８３、バリアフィルタ８６）と、４つのＰＭＴ（ＰＭＴ２３、ＰＭＴ２６、ＰＭＴ８４、ＰＭＴ８７）と、を含んでいる。また、共焦点絞り２４を移動させる第２の制御部２８と、共焦点絞り８２を移動させる第４の制御部８８と、共焦点絞り８５を移動させる第５の制御部８９と、を含んでいる。

４つの共焦点絞りの各々は、多焦点形成部７１により形成される４つの集光位置のうちの対応する集光位置と共役な位置に開口が形成された、反射コーティングされた部材であり、対応する集光位置以外からの光を反射するように構成されている。また、４つのバリアフィルタの各々は、対応する共焦点手段を介して入射する光に含まれるレーザ光を遮断するバリアフィルタであり、４つのＰＭＴの各々は、対応する集光位置から生じる、対応する共焦点手段を介して入射する蛍光を検出する検出手段である。

多焦点検出部８１は、第２の制御部２８が共焦点絞り２４を対応する集光位置との共役な関係が維持されるように移動させて、第４の制御部８８が共焦点絞り８２を対応する集光位置との共役な関係が維持されるように移動させて、第５の制御部８９が共焦点絞り８５を対応する集光位置との共役な関係が維持されるように移動させることで、つまり、第２の制御部２８、第４の制御部８８、及び、第５の制御部８９がそれぞれ第１の制御部２７及び第３の制御部８０と連動することで、多焦点形成部７１のミラー１０及びミラー７９の位置によらず、多焦点形成部７１が形成する４つの集光位置からの蛍光を同時且つ別個に検出することができる。

従って、走査型共焦点レーザ顕微鏡７０によれば、走査型共焦点レーザ顕微鏡１に比べて、１回の標本走査でより多くのスライス画像を取得することができるため、より高速に３次元画像を生成することができる。
本実施例では、標本の４つの面を同時に走査する構成を例示したが、同時に走査する面は４面に限られず、それ以上の面を同時に走査してもよい。

また、本実施例では、第１の多焦点形成部７１ａと第２の多焦点形成部７１ｂの間にλ／４板７３を配置する構成が例示されているが、ＰＢＳ７４に入射するレーザ光にＰＢＳ７４の斜面に対してＳ偏光成分とＰ偏光成分が含まれていればよいため、λ／４板７３の代わりにデポラライザまたはλ／２板を配置しても同様の効果を得ることが出来る。

また、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡７０は、２面を同時に走査する実施例１に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡１を４面同時に走査できるように変形したものであるが、他の実施例係る走査型共焦点レーザ顕微鏡を、４面同時に走査できるように変形してもよい。

図８は、本実施例に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。図８に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡９０は、ミラー７の代わりにミラー９２を含んでいる点が、図１に例示される走査型共焦点レーザ顕微鏡１と異なっている。走査型共焦点レーザ顕微鏡９０のその他の構成は、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様であるため、詳細な説明は省略する。

ミラー９２は、ＰＢＳ５の斜面を反射したレーザ光の進行方向に対してミラー９２の法線が傾くように配置されている点が、実施例１に係る走査型共焦点レーザ顕微鏡１のミラー７とは相違している。

ミラー９２が傾いているため、ＰＢＳ５で反射しミラー９２及びミラー１０を経由して出射されるレーザ光は、ＰＢＳ５を透過して出射されるレーザ光とは収斂状態が異なるだけではなく、光束の光軸の方向も異なっている。より具体的には、ＰＢＳ５を透過して出射される平行光束（図８の実線）の光軸はリレー光学系１１の光軸と一致するのに対して、ＰＢＳ５で反射しミラー９２を経由して出射される収斂光束の光軸はリレー光学系１１の光軸とは一致せずリレー光学系１１の光軸に対して傾いている。このため、多焦点形成部９１は、図８に示されるように、標本１８の光軸方向に異なり、且つ、光軸と直交する方向にも異なる複数の集光位置（集光位置Ｐ１、集光位置Ｐ２）を形成することができる。
なお、ミラー９２を傾ける代わりにミラー９２とＰＢＳ５の間に楔状のガラス板などの光路を曲げる光学素子を配置することによっても実現可能である。

なお、ミラー９２は、集光レンズ９の瞳位置（または瞳共役位置）に配置されることが望ましい。集光レンズ９の瞳位置に配置することで、ミラー９２の傾きに起因するガルバノミラー１３に入射する位置の変動を防止することができる。

従って、走査型共焦点レーザ顕微鏡９０によっても、走査型共焦点レーザ顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。さらに、走査型共焦点レーザ顕微鏡９０によれば、複数の集光位置が互いに光軸と直交する方向にもずれているため、集光位置間の光軸方向の距離が近い場合であっても、それぞれの集光位置からの蛍光を確実に別個に検出することができる。

図９は、走査型共焦点レーザ顕微鏡９０の走査対象範囲を説明するための図であり、図８に示す矢印Ａの方向から標本１８を見た図である。走査型共焦点レーザ顕微鏡９０では、集光位置Ｐ１と集光位置Ｐ２は光軸と直交する方向に異なっているため、図９に示されるように、１回の走査で取得される複数のスライス画像では、走査対象範囲にもずれが生じる。このため、走査型共焦点レーザ顕微鏡９０は、複数のスライス画像間で生じる画素ずれを補正してから、複数のスライス画像を合成して３次元画像を生成する。

１、３０、４０、５０、６０、７０、９０・・・走査型共焦点レーザ顕微鏡
２・・・ファイバ光源ユニット
２ａ・・・レーザ光源
２ｂ・・・カップリングレンズ
２ｃ・・・光ファイバ
３・・・コリメートレンズ
４、３１、４１、７１、９１・・・多焦点形成部
５、７４・・・ＰＢＳ
６、８、７３、７５、７７・・・λ／４板
７、１０、１６、７６、７９、９２・・・ミラー
９、２０、７８・・・集光レンズ
１１・・・リレー光学系
１２・・・ダイクロイックミラー
１３・・・ガルバノミラー
１４・・・瞳レンズ
１５・・・結像レンズ
１７・・・対物レンズ
１８・・・標本
１９、５１、６１、８１・・・多焦点検出部
２１、２４、６４、８２、８５・・・共焦点絞り
２２、２５、８３、８６・・・バリアフィルタ
２３、２６、８４、８７・・・ＰＭＴ
２７・・・第１の制御部
２８・・・第２の制御部
３２・・・デフォーマブルミラー
４２・・・プリズム
４３・・・ＬＣＯＳ
５２・・・レンズ
６２・・・透明部材
６３・・・微小ミラー
７１ａ・・・第１の多焦点形成部
７１ｂ・・・第２の多焦点形成部
７２・・・瞳リレー光学系
８０・・・第３の制御部
８８・・・第４の制御部
８９・・・第５の制御部
Ｐ１、Ｐ２・・・集光位置

Claims (9)

1. レーザ光を出射する単一のレーザ光源と、
   前記単一のレーザ光源から出射された前記レーザ光を標本の光軸方向に異なる複数の集光位置に集光させる多焦点形成部であって、前記レーザ光を分割する光路分割手段と、前記光路分割手段で分割されたレーザ光の少なくとも１つの光路上の光学素子を制御して、前記複数の集光位置のうちの少なくとも１つの集光位置を光軸方向に変更する集光位置変更手段を含む多焦点形成部と、
   各々が前記複数の集光位置のうちの対応する集光位置からの検出光と他の位置からの検出光とを分割する複数の共焦点手段と、各々が前記複数の集光位置のうちの対応する集光位置から生じる検出光を前記複数の共焦点手段のうちの対応する共焦点手段を介して検出する複数の検出手段と、前記集光位置変更手段により変更された集光位置と前記複数の共焦点手段のうちの前記変更された集光位置に対応する共焦点手段との共役関係を維持する検出位置変更手段と、を含む多焦点検出部と、を含む
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
2. 請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記多焦点形成部は、さらに、前記光路分割手段で分割されたレーザ光の少なくとも１つの光路上に、
   集光レンズと、
   前記集光レンズを介して入射するレーザ光を前記集光レンズに向けて反射させて前記光路分割手段に入射させる反射部材と、を含み、
   前記集光位置変更手段は、前記集光レンズと前記反射部材との間隔を変更する
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
3. 請求項１に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記多焦点形成部は、さらに、前記光路分割手段で分割されたレーザ光の少なくとも１つの光路上に、デフォーマブルミラーを含み、
   前記集光位置変更手段は、前記デフォーマブルミラーの曲率を変更する
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記多焦点形成部は、収斂状態が異なる複数の光束であって、前記複数の光束の光軸の方向が互いに異なる、という複数の光束を出射する
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
5. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記複数の共焦点手段の各々は、対応する集光位置からの検出光を反射させ、他の位置からの検出光を透過させる、または、対応する集光位置からの検出光を透過させ、他の位置からの検出光を反射させる
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
6. 請求項５に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記複数の共焦点手段の各々は、対応する集光位置と共役な位置に開口が形成された、反射コーティングされた部材である
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
7. 請求項５に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記複数の共焦点手段の各々は、対応する集光位置と共役な位置に反射コーティングされた、透明部材である
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
8. 請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記検出位置変更手段は、前記集光位置変更手段により変更される集光位置に対応する共焦点手段の前記標本側に配置された光学素子を移動させる、または、交換する
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
9. 請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記検出位置変更手段は、前記集光位置変更手段により変更される集光位置に対応する共焦点手段を光軸方向に移動させる
   ことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。

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