JP6132302B2

JP6132302B2 - 抗血管新生活性を有し、抗凝血効果を有さない、ヘパラナーゼ阻害剤としての部分的に脱硫酸化されたグリコサミノグリカンの誘導体

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Publication number: JP6132302B2
Application number: JP2013112054A
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Inventors: ベニト・カス; ジャンジャコモ・トッリ; アンナマリア・ナッジ; ジュゼッペ・ジャンニーニ; クラウディオ・ピサノ; セルジョ・ペンコ
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Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2017-05-24
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Description

本明細書に記載する本発明は、部分的に脱硫酸化されたグリコサミノグリカン誘導体、特にヘパリン、その調製方法、その転移性形態を含む腫瘍などの病状、およびヘパラナーゼの阻害により恩恵をこうむるあらゆる治療効能のために有用な薬物の調製のための活性成分としての使用、そしてそれを含む医薬組成物に関する。

Tumor Biological Research Unit of the Hadassah-Hebrew University Hospital-Israel (Isr. Med. Assoc. J. 2000, 2,37-45 ; J. Med. Chem. 2000,43、2591-600; Invasion Metastasis 1994-95,14、290-302; Exp. Cell Res. 1992,201、208-15;)において行なわれた研究は、腫瘍血管新生および転移におけるヘパリン−結合性増殖因子、ヘパラン硫酸およびヘパラン硫酸−分解酵素（ヘパラナーゼ）の関与に注目している。これらの研究は、強力なヘパラナーゼ阻害活性を有するヘパリン誘導体およびヘパリン／ヘパラン硫酸擬似体のスクリーニングおよび同定に適用されている（Nature Med. 1999、5, 735-6; Science、1999、285, 33-4）。

腫瘍細胞は、細胞表面上および細胞外マトリックス中のヘパラン硫酸プロテオグリカンの多糖鎖を分解する、エンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼの１つである、酵素ヘパラナーゼを放出する。

ヘパラナーゼの腫瘍血管新生における関与は、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）内のその貯蔵所からｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）およびその他の増殖因子を放出する能力と相関している。これらの増殖因子は、正常および病的状態における新血管新生の誘導のメカニズムを提供する。

ヘパラナーゼはしたがって、腫瘍細胞侵入および転移を促進するだけでなく、これら腫瘍進行における重要な段階の両方において腫瘍血管新生を促進している可能性がある。

ヘパラナーゼ酵素の特異的阻害剤は、ヘパラン硫酸によって貯蔵される増殖因子の放出及び活性化、そしてＥＣＭの破壊を妨げるため、抗癌剤の開発の非常に有望なアプローチであるとみなされている。

したがって、抗血管新生薬に対する１つの可能性のある治療アプローチは、強力かつ選択的なヘパラナーゼ阻害剤を開発することである。

血管新生についての議論に関しては、本出願人による国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号を参照されたい。

ヘパラナーゼが関与する別の重要な局面は、炎症および自己免疫である。実際、ヘパラナーゼ活性は、免疫系の活性化細胞が循環系を離れて炎症および自己免疫応答の両方を誘発する能力と相関している。血小板、顆粒球、ＴおよびＢリンパ球、マクロファージおよび肥満細胞と内皮下ＥＣＭとの相互作用は、ヘパラナーゼ活性によるヘパラン硫酸の分解と関連している。該酵素は細胞内区画（即ち、リソソーム、特定の顆粒）から様々な活性化シグナルに応答して放出され、これは炎症部位および自己免疫病変におけるその調節された関与および存在を示唆している。実験動物をヘパラナーゼ阻害剤（即ち、低分子量ヘパリン−ＬＭＷＨの非抗凝血種）で処理すると、実験動物における実験的自己免疫脊髄脳炎（ＥＡＥ）、アジュバント関節炎および移植片拒絶の発生率が顕著に低減し、これによってヘパラナーゼ阻害剤が自己免疫および炎症性疾患の阻害に適用可能なことが示される。

ヘパリン
ヘパリンは、長さが様々で硫酸化の程度も様々な天然の多糖の不均一な混合物であり、抗凝血活性を有し、肝臓（ヘパリンは肝臓から最初に単離された）、筋肉、肺、胸腺および脾臓に存在する、結合組織の肥満細胞によって分泌される。

規則的(regular)配列に加えて、抗トロンビン活性の活性部位に対応する配列がヘパリン中に同定された。

ヘパリンおよびその誘導体の抗腫瘍および転移抑制活性は、そのヘパラナーゼを阻害する能力によって、増殖因子の阻害および血管新生の調節に用いられる。

ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、遍在性のタンパク質リガンドである。タンパク質は、単なる固定化またはタンパク分解作用に対する保護から、生物活性、例えば血管新生の特定の調節まで様々な作用のために、ＨＳ鎖に結合する。

ヘパリンおよびヘパラン硫酸（ＨＳ）の両方において、炭水化物骨格は、Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびヘキスロン酸（ＧｌｃＡまたはＩｄｏＡ）の繰り返し単位からなる。

ヘパリンにおいて、ＧｌｃＮ残基は主にＮ−硫酸化されているが、ＨＳにおいてはこれらはＮ−硫酸化およびＮ−アセチル化の両方がなされており、少量の非置換ＮＨ_２基が存在する。

ＨＳはまた平均するとヘパリンよりもＯ−硫酸化が少ない。

血管新生性疾患、例えば腫瘍、特に転移の治療におけるヘパリンの使用は、ヘパリンの抗凝血活性によってかなり制限されている。

ヘパリンに化学修飾を行なって抗凝血能力を減少させ、同時に抗腫瘍特性を維持する試みがなされた。

抗トロンビン部位におけるグルクロン酸単位の開裂により、ヘパリンの抗トロンビンに対するアフィニティーが減少する：このようにして抗凝血効果が低く、抗血管新生特性を維持したヘパリンが利用可能となる。

ヘパラナーゼ
ヘパラナーゼはエンドグリコシダーゼのファミリーに属する酵素であり（エンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）およびヘパリンの鎖の内部グリコシド結合を加水分解する。

これらのエンドグリコシダーゼは、腫瘍細胞の増殖、転移および腫瘍の新血管新生に関与する。これらの酵素は抗血管新生活性の生物学的標的である。科学文献において多くの構造／活性相関研究がなされている（例えば、Lapierre F. et al.、Glycobiology、vol. 6、(3)、355-366,1996を参照されたい）。多くの局面がいまだに解明されていないが、ヘパリンおよびその誘導体によるヘパラナーゼの阻害に関する研究が報告されている。これらの研究では、特定の試験を用いることにより、新規でより選択的な誘導体の取得を導く構造タイプが考案されるようになった。

Lapierre et al．の上記研究において、ヘパリン誘導体が２−Ｏ脱硫酸化または「グリコール開裂」（過ヨウ素酸による酸化、次いで水素化ホウ素ナトリウムによる還元）によって得られると記載されている。本明細書においてそれぞれ「２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリン」および「ＲＯ−ヘパリン」と呼ぶこれらの誘導体は、コルチコステロイドの存在下でのＣＡＭ試験によって評価したところ部分的にヘパリンの抗血管新生活性を維持していた（同書、360ページ）。

ヘパリンよりも近いヘパラン硫酸の擬似体であるＮ−アシルヘパリン誘導体がＮ−硫酸化誘導体よりいくらか低い程度ではあるがヘパラナーゼを阻害することが報告された（Irimira T.、Biochemistry 1986,25、5322-5328; Ishai-Michaeli R. 、et al, Biochemistry 1992,31、2080-2088）。

ヘパリンおよびＦＧＦ
ＦＧＦは多数の生理プロセス、例えば、細胞増殖及び分化を制御するだけでなく、その機能は腫瘍血管新生などの病理プロセスにも関与している。

ＦＧＦは、多糖補因子であるヘパリンまたはＨＳをＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）との結合およびその活性化のために要求する増殖因子である（増殖因子は、１０を超えるポリペプチドのファミリーであり、そのなかで酸性（ＦＧＦ−１）および塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）が最もよく研究されている）。

ヘパリンおよびＨＳがＦＧＦを活性化する正確な機構は知られていないが、しかしヘパリン／ＦＧＦ／ＦＧＦＲが「三分子」または「三元」複合体を形成することが知られている。

提案されている１つの機構は、ヘパリンおよびＨＳがＦＧＦのいわゆるサンドイッチ二量体化を誘導し、そのようにして二量体化したＦＧＦがＦＧＦＲと安定な複合体を形成するというものである。

ヘパリン誘導体の転移抑制活性
原発性腫瘍が転移性細胞を作る能力はおそらく抗腫瘍療法における重要な問題であろう。

ヘパラナーゼを阻害する大きな能力を有するヘパリン誘導体は、原発性腫瘍および転移の両方において血管新生も同様に阻害することができると考えられる。

さらに、ヘパラナーゼの阻害により腫瘍細胞の原発性腫瘍からその他の器官への遊走能力が減少する。

動物モデルにおける転移抑制活性は、ヘパリンおよびヘパリン誘導体（Bitan M. et al、Isr. J. Med. Sci. 1995,31、106- 108）およびその他の硫酸化多糖（Miao、H. Q. et al、Int. J. Cancer,1999 83,424-431、およびそれに引用されている文献）のヘパラナーゼ−阻害能力と相関していることが見出された。転移抑制活性の分子量依存性の研究により非常に低分子量のヘパリン（Sciumbata、T. 、et al, Invasion Metastasis 1996、16, 132-143）およびオリゴ糖ポリ硫酸（Parish、C. R. 、et al、Cancer Res. 1999,59、3433-3441）がかなりの転移抑制活性を保持していることが示された。一般にＮ−硫酸基の除去（Ｎ−脱硫酸化）はヘパリンの転移抑制能を減少させるが、結果として生じる遊離ＮＨ_２基のＮ−アシル化（Ｎ−アセチル化、Ｎ−ヘキサノイル化（Bitan M. 、1995）およびＮ−スクシニル化（Sciumbata、T. 、1996））によりこの活性は部分的に修復される。ヘパリンの転移抑制活性は、そのＯ−硫酸化の程度と反比例することが見出された（Bitan M.、1995）。しかし、イズロン酸残基の選択的２−Ｏ−脱硫酸化は、ヘパリンの転移抑制活性の強い低減を伴わなかった（Lapierre、F.、Glycobiology 1996、6,355-366）。

一般に、ヘパリンおよびその他の硫酸化多糖のヘパラナーゼ−阻害および転移抑制活性はともに分子量および硫酸化の程度の減少と共に低下するが（Bitan M. 、1995; Parish、C. R 1999）、これらの活性はまた多糖の炭水化物骨格（残基のタイプおよびグリコシド結合の位置）にも依存する（Parish、C. R 1999）。ヘパラナーゼの活性部位の三次元構造は未知であるため、どの多糖骨格および硫酸化パターンが最も酵素の阻害に有効であるかを予測するのは難しい。

現時点の知識に基き、血管新生−阻害作用に好適なヘパリン様分子の構造的要求は阻害しようとする標的に基いて２つのカテゴリーに分けられる。

ａ）ヘパラナーゼの阻害：この酵素は、Ｎ−アシル−グルコサミン−グルクロン酸（またはＮ−硫酸化グルコサミン残基、例えば、D. SandBack-Pikas et al. J. Biol. Chem. 、273,18777-18780 (1998)およびそこで引用されている文献を参照されたい）を含有する少なくとも８つの単糖単位のヘパリンおよびＨＳ配列を認識して切断するが、その阻害はテトラデカ（十四）糖より長いヘパリン断片（Bitan M. 、1995）または広範に硫酸化されたより短いオリゴ糖、例えば、マルトヘキサオース（maltohexaose）硫酸（ＭＨＳ）およびホスホマンノペンタオース(phosphomannopentaose）硫酸（ＰＩ−８８）（Parish、C. R 1999）によって効率的に達成される。しかし、長いヘパリン断片および高度に硫酸化されたオリゴ糖はともに抗凝血性、即ち潜在的転移抑制剤にはなれない性質を有する。

ｂ）血管新生増殖因子（線維芽細胞タイプ：ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２；血管内皮タイプ：ＶＥＧＦ；血管透過性タイプ：ＶＰＦ）の阻害：この目的のために、ヘパリン様化合物は好ましくは少なくとも５つの単糖単位の長さの配列を有し、２−硫酸化イズロン酸およびＮ、６−硫酸化グルコサミンを含む（例えば、M. Maccarana et al. J. Biol. Chem. 、268, 23989-23905 (1993)を参照されたい）。

文献にはトロンボスポンジン受容体に対する結合によって作用する抗血管新生活性を有する小ペプチド（５−１３アミノ酸）（米国特許第５３９９６６７号、University of Washington）あるいはより長いペプチド（およそ５０アミノ酸）が開示されている。

ＩＣ_５０＝７ｎＭにて内皮増殖を阻害することができる修飾された血小板因子は公知である（欧州特許第０５８９７１９号、Lilly）。

抗血管新生活性を有するオリゴ糖断片についても十分に記載されている：実際、炭水化物配列を変化させることによって、相互作用選択性が増加することが見出された。

さらに、ヘパリンは例えばいくつかのステロイドなどのそれ自体が抗血管新生性を有する物質のための媒体としても利用できる。これは血管内皮細胞に対するヘパリンのアフィニティーを利用して行なわれる；例えば国際特許出願第ＷＯ９３／１８７９３号、the University of Texas and Imperial Cancer Research Technologyを参照されたい。この文献では、ヘパリンがコルチゾールに結合した酸不安定性リンカー、例えば、アジピン酸ヒドラジンとともに請求されている。この結合した分子の抗血管新生効果は結合していない分子よりも、同時に投与した場合でさえも大きい。

Biochim. Biophys. Acta (1996)、1310,86-96において、Ｃ−２０においてヒドラジン基を有するステロイド（例えば、コルチゾール）に結合したヘパリンが記載されており、これは２つの結合していない分子よりも大きい抗血管新生活性を示す。

欧州特許第０２４６６５４号Daiichi Sc．には抗血管新生活性を有する硫酸化多糖が記載されており、これは第二相試験中である。欧州特許第０３９４９７１号、Pharmacia & Upjohn-Harvard Coll. には、六糖−ヘパリン断片−が記載されており、これは硫酸化の程度が低く、内皮細胞の増殖とＦＧＦ−１によって刺激される血管新生を阻害することができる。欧州特許第０６１８２３４号、Alfa Wassermanには、求核性基を有するヘパリンまたはヘパラン構造の半合成グリコサミノグリカンの調製方法が記載されている。国際特許出願第ＷＯ９５／０５１８２号、Glycomedには、様々な、抗凝血、抗血管新生および抗炎症活性を有する硫酸化オリゴ糖が記載されている。米国特許第５８０８０２１号、Glycomedには実質的に非脱重合した２−Ｏ、３−Ｏ脱硫酸化されたヘパリンであって、脱硫酸化パーセンテージがイズロン酸の２位（Ｉ，２−Ｏ）およびグルコサミン単位の３位（Ａ、３−Ｏ）においてそれぞれ最初のパーセンテージのおよそ９９％からおよそ７５％であるものの調製方法が記載されている。この方法では、二価金属のカチオン、例えば、カルシウムまたは銅の存在下で脱硫酸化を行なうとされており、その結果得られた産物は凍結乾燥される。脱硫酸化されたヘパリンは抗血管新生活性を有する。欧州特許第０２５１１３４号、Yeda Res & Dev Co Ltd et al、には、血液凝固性以下の用量のヘパリンまたはその誘導体の同種移植片拒絶の予防および自己免疫疾患の治療のための使用が開示されている。ヘパリンの活性はヘパラナーゼの阻害によって与えられる。国際特許出願第ＷＯ８８／０５３０１号、Univ.Australian Nat．には、ヘパラナーゼ阻害剤である、硫酸化多糖を含有する転移抑制および／または抗炎症性組成物が開示されている。ヘパリン、フコイダン（fucoidan）、ペントサン（pentosan）硫酸、デキストラン硫酸が提供される。国際特許出願第ＷＯ９２／０１００３号、Univ. Texas Systemには、抗凝固活性を有さないヘパリン誘導体の、ヘパラナーゼ阻害剤としての使用が開示されている。これらの誘導体はスルフアミノまたはＯ−硫酸基を有し、分子量が１０００−１５０００であって、それぞれの末端単量体単位が、保護基に結合した末端Ｏ原子を有する単量体繰り返し単位である。国際特許出願第ＷＯ９４／１４８５１号および第ＷＯ９６／０６８６７号、Glycomed、では、２−Ｏ位において少なくとも９６．７％脱硫酸化され、３−Ｏ位において少なくとも７５％脱硫酸化された２−Ｏ，３−Ｏ−脱硫酸化された粘膜のヘパリンまたはその断片であって、非−抗凝血ヘパラナーゼ阻害剤として有用なものが開示されている。国際特許出願第ＷＯ９５／０９６３７号および第ＷＯ９６／０９８２８号、Glycomed、には高度に硫酸化されたマルトオリゴ糖化合物であって、ヘパリン様特性を有する化合物が開示されている。国際特許出願第ＷＯ９５／３０４２４号、Glycomed、にはヘパラナーゼ阻害活性を有する６−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンまたはその断片が提供されている。国際特許出願第ＷＯ９６／３３７２６号、Univ. Australian Nat.には、硫酸化されたオリゴ糖がヘパラナーゼ阻害活性を有するヘパラン擬似体として開示されている。国際特許出願第ＷＯ０１／３５９６７号、Knoll AG、にはヘパラナーゼ阻害剤の投与による心不全および関連する疾患の治療方法が提供されている。ヘパラナーゼ阻害剤のなかでも部分的に還元されたＣＯＯＨ基を有するヘパリン、または少なくとも部分的にＮ−脱硫酸化およびＮ−アセチル化されたヘパリン、または少なくとも部分的にＮ、Ｏ−脱硫酸化およびＮ−再硫酸化された（resulphated)ヘパリン、またはＯ−アセチル化されたヘパリンが言及されている。

本明細書に記載する本発明の目的は、ヘパラナーゼ阻害および／またはＦＧＦ増殖因子阻害機構に基いて、抗血管新生活性を生じさせる最適なグリコサミノグリカン構造を見出すことである。本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、実質的にヘパリン誘導体の典型的な副作用、例えば、抗凝血活性が無い抗血管新生活性を有する薬物を提供することである。

本出願人による国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号には、グリコサミノグリカン類、特に、全ウロン酸単位の６０％以下の程度で脱硫酸化された、脱硫酸化されたヘパリンが開示されている。これらの誘導体は抗血管新生活性を有し、抗凝血活性を有さない。該化合物はＦＧＦの阻害に基いて抗血管新生活性を発揮する。ヘパラナーゼを阻害する活性は予測されていなかった。

国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号も一般的に、様々な程度にＮ−脱硫酸化され、所望により全部または一部がアセチル化されたグリコサミン残基を含有する修飾ヘパリンを提供する。該文献による一般的教示には明示的には、Ｎ−脱硫酸化、およびその後の所望による全部または一部のアセチル化段階は記載されていない。

（発明の概要）
この度、様々な程度にＮ−脱硫酸化され、任意にさらに全部または一部がＮ−アシル化（好ましくはＮ−アセチル化）されたグルコサミン残基を含有するグリコサミノグリカン、例えば、ヘパリン様グリコサミノグリカン、ヘパリンまたは修飾ヘパリンを、イズロン酸単位の制御された２−Ｏ−脱硫酸化処理（ここで脱硫酸化の程度は全ウロン酸単位の６０％以下である）に供することにより、増殖因子−媒介血管新生特性が維持されることが見出された。

驚くべきことに、上述の国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号に開示された２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンも、ヘパラナーゼの阻害剤である。この性質はさらに非−硫酸化ウロン酸残基のグリコール開裂によって増強されることが見出された。グリコール開裂は、抗凝血活性の劇的な喪失を導く化学修飾であり（Casu B. 、et al、Arzneim. Forsch. (Drug Res.) 1986,36、637-642）、５０％Ｎ−脱硫酸化に続きその結果得られた遊離アミノ基のＮ−アセチル化によって得られる部分的にＮ−アセチル化されたヘパリンおよび２−Ｏ−脱硫酸化された化合物のヘパラナーゼ−阻害特性を劇的に増強することも見出された。

本発明に記載の条件下で行なわれる脱硫酸化により、２位と３位においてオキシラン環を有するイズロン酸単位も形成される。本発明に記載の条件下でのオキシラン環の開裂により、Ｌ−イズロン酸またはＬ−ガラクツロン酸単位が生じる。

本明細書に記載する本発明の目的は、該グリコサミノグリカン誘導体のヘパラナーゼおよび／またはＦＧＦ増殖因子阻害活性を有する薬物の調製のための使用である。

本発明によると、該グリコサミノグリカン誘導体は好ましくはヘパリン様グリコサミノグリカンである。また本発明によると、該グリコサミノグリカン誘導体は、様々な程度にＮ−脱硫酸化され、さらに所望により全部または一部がＮ−アセチル化されたグリコサミン残基を含む修飾ヘパリンである。

１つの特定の態様において、本明細書に記載する本発明は、式（Ｉ）の化合物に関する：

［式中、Ｕ環は以下の意味である：

ＸおよびＸ’は、同一でも異なっていてもよく、アルデヒド基または−ＣＨ_２−Ｄ基である（ここでＤはヒドロキシルまたはアミノ酸、ペプチドまたは炭水化物またはオリゴ糖残基）；
ＲおよびＲ_１は、同一でも異なっていてもよく、ＳＯ_３、Ｃ_１−Ｃ_８アシル残基（所望により少なくとも１のさらなるカルボキシ基を有していてもよい）；アセチル、ヘキサノイル、スクシニル、ピバロイルが好ましいアシル残基；
ｎおよびｍは、同一でも異なっていてもよく、１から４０の間である；ｎ＋ｍの合計は６から４０の間である；ｍ：ｎ比は１０：２から１：１の間である；
以下の記号

は、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖にわたって統計的に分布しているが、順にならんでいる必要は無いことを示す］。

所望により少なくとも１のさらなるカルボキシ基を有していてもよいＣ_１−Ｃ_８アシル残基の例としては、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、およびすべての可能な異性体、オキサリル、マロニル、スクシニル、ピバロイル、グルタロイルが挙げられる；アセチル、ヘキサノイル、ピバロイルが好ましいアシル残基である。

ＲまたはＲ_１がＮ−アシル基の場合、それらは好ましくはＲ＋Ｒ_１の合計の４０から６０％である。好ましくは、ｍはｎ以上である。好ましくはｎはｍ＋ｎの合計の４０から６０％である。

上記式（Ｉ）の化合物であって、ＲおよびＲ_１がＣ_１またはＣ_３−Ｃ_８アシル残基であるものは新規である。

本明細書に記載する本発明の主題である化合物は、興味深い抗血管新生活性を有するヘパラナーゼを阻害する高い能力によって特徴付けられ、それゆえヘパラナーゼの阻害によって恩恵をこうむる病状、異常な血管新生に基く病状、および特に転移の治療のための薬物の調製のための活性成分として有用である。

本発明による化合物は、ＦＧＦ類も阻害する。

好ましいことに、本発明による化合物は、全く存在しないわけではないにしろ、抗凝血特性が低く、したがって、ヘパリンに典型的な副作用を回避または低減することができる。さらなる利点は、本発明による化合物は、機器分析技術、例えばＮＭＲ分光法によって特徴付けることができ、したがって、工業的観点から非常に望ましい工程の管理が可能であるという事実による。

修飾ヘパリンの場合も、分子量（ＭＷ）は、血管新生阻害剤を製造する際に非常に重要な機能を有する。実際、分子量（ＭＷ）の五糖単位に対応する値までの低減によっては抗血管新生活性は失われないということは周知である。一方、一定の長さを超えると、短い鎖と比べてヘパリン鎖はＦＧＦの活性化を阻害するよりむしろ、ヘパラナーゼのよりよい阻害剤であるということが確立されている。しかし、ヘパラナーゼの阻害のための最適な鎖の長さは阻害剤の構造（炭水化物骨格の構造、結合の位置、硫酸化パターン）に依存するため、新規なタイプの潜在的阻害剤については個々に確立しなければならない。

化合物の^１３ＣＮＭＲスペクトルを示す図である。化合物ＳＴ２０１０の^１３ＣＮＭＲスペクトルを示す図である。化合物ＳＴ２０４１の^１３ＣＮＭＲスペクトルを示す図である。

（発明の詳細な記載）
様々な程度のＮ−脱硫酸化および所望によりさらに全部または一部がアセチル化されたグリコサミン残基を含有する本発明による化合物は、本明細書において具体的に開示され、新規化合物として特許請求の範囲に記載される。

脱硫酸化の程度とは、開始ヘパリンに最初存在していた全ウロン酸に対する非−硫酸化イズロン酸のパーセンテージである。最初の好ましい脱硫酸化パーセンテージの範囲の一例はおよそ４０からおよそ６０％である。

式（Ｉ）の化合物のなかで、第一の好ましい化合物は、分子量（ＭＷ）が１１２００で、多分散指標（polydispersion index）Ｄが１．３で、脱硫酸化の程度が１．９９（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比として表した）で、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ５０％である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ１５１４とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ｍ：ｎ＝１：１であり、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖中に規則正しく繰り返して分布している。

第２の好ましい化合物は、分子量（ＭＷ）が３０５０で、多分散指標が２．２で、脱硫酸化の程度が１．９９（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比として表した）で、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ５０％である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたＬＭＷヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ２０１０とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ｍ：ｎ＝１：１であり、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖中に規則正しく繰り返して分布している。この化合物はＳＴ１５１４の亜硝酸脱重合、アルデヒド基の還元によって得られ、それゆえそのほとんどの還元末端残基はアンヒドロマンノース（anhydromannose）残基である：

第３の好ましい化合物は、分子量がＭｎ＝５８００、Ｍｗ＝７５２０で、多分散指標が１．２９４で、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ５０％である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたＬＭＷヘパリンである、該化合物（以下、ＳＴ２１８４とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ｍ：ｎ＝１：１であり、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖中に規則正しく繰り返して分布している。この化合物は、ＳＴ１５１４の亜硝酸脱重合、アルデヒド基の還元によって得られ、それゆえそのほとんどの還元末端残基はアンヒドロマンノース残基である。

第４の好ましい化合物は、分子量（ＭＷ）が１１２００で、多分散指標が１．３で、脱硫酸化の程度が１．６で（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比として表した）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％である、部分的にＮ−脱硫酸化されてＮ−再アセチル化された（reacetyled)ヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ１５１８とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の５０％がＮ−アセチルである。

第５の好ましい化合物は、分子量Ｍｎ＝４７８０、Ｍｗ＝１００００で、多分散指標が２．０９２で、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％である、部分的にＮ−脱硫酸化され、Ｎ−再アセチル化されたＬＭＷヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ２１６８とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の５０％がＮ−アセチルである。

第６の好ましい化合物は、分子量Ｍｎ＝１０８９０、Ｍｗ＝２２３７０で、多分散指標が２．０５４である、部分的にＮ−脱硫酸化されＮ−再アセチル化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ２０３７とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の２７％がＮ−アセチルである。

第７の好ましい化合物は、分子量がＭｎ＝１０２１０、Ｍｗ＝２１２７０で、多分散指標が２．０８３である、部分的にＮ−脱硫酸化され、Ｎ−再アセチル化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ２０３８とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の３９％がＮ−アセチルである。

第８の好ましい化合物は、分子量がＭｎ＝１１０７０、Ｍｗ＝２２０００で、多分散指標が１．９８７である、部分的にＮ−脱硫酸化され、Ｎ−再アセチル化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ２０４１とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の６４％がＮ−アセチルである。

第９の好ましい化合物は、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％である、部分的にＮ−脱硫酸化され、Ｎ−再アセチル化されたヘパリンである。該化合物は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の２７％がＮ−アセチルである（ＳＴ２１８５）。

第１０の好ましい化合物は、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％である、部分的にＮ−脱硫酸化され、Ｎ−再アセチル化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ２１８６とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の３９％がＮ−アセチルである。

第１１の好ましい化合物は、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％である、部分的にＮ−脱硫酸化され、Ｎ−再アセチル化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ２１８７とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ＲとＲ_１との合計の６４％がＮ−アセチルである。

第１２の好ましい化合物は、分子量（ＭＷ）が１２９００Ｄで、多分散指標Ｄが１．５で、脱硫酸化の程度が１．９で（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比として表した）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージが：５％エポキシド基、２９％酸化および還元されたウロン酸残基である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ１５１３とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ｍ：ｎ＝１：１であり、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖中に規則正しく繰り返して分布している。

第１３の好ましい化合物は、分子量（ＭＷ）が９２００Ｄで、多分散指標Ｄが１．５で、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージが：１１％エポキシド基、２７．５％酸化および還元されたウロン酸残基である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンである。該化合物（以下ＳＴ１５１５とも称する）は式（Ｉ）に含まれ、対応する定義において、ｍ：ｎ＝１：１であり、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖中に規則正しく繰り返して分布している。

第１４の好ましい化合物は、分子量（ＭＷ）が１１０００Ｄで、多分散指標Ｄが１．５で、脱硫酸化の程度が１．９３で（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比として表した）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージが：５％エポキシド基、２９％酸化および還元されたウロン酸残基である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンである。

化合物ＳＴ１５１４、ＳＴ１５１３、ＳＴ１５１６およびＳＴ１５１５の調製については国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号に具体的に開示されている。

本明細書に記載する本発明による部分的に２−Ｏ−脱硫酸化された誘導体は上記国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号に開示されたようにして調製される。

本発明による、Ｎ−脱硫酸化され、所望によりＮ−アセチル化されたグリコサミノグリカンに関する限りは、これらは、２−Ｏ−部分的に脱硫酸化されたヘパリンの調製も可能とする以下の工程を含む方法によって調製することができる：
ａ）ＤＭＳＯ：Ｈ_２Ｏ９５：５ｖ：ｖ中、周囲温度での０．５から８時間、好ましくはおよそ２時間の、スルフアミノ（sulphamino）残基の加溶媒分解性加水分解によるグルコサミン残基の２位の硫酸基の全部または一部の除去による、Ｎ−脱硫酸化；
ｂ）アルカリ性水溶液（ｐＨ８−９）中、アシル化剤、例えば、アシル無水物による処理により、グルコサミン残基の２位において全部または部分的にアシル化された基を生じさせることによる、グルコサミン残基の２位において全体または部分的に脱硫酸化された基のＮ−アシル化；
次いで、得られた化合物を以下の工程ｃ）、ｄ）またはｅ）およびｆ−ｇ）に供するか、あるいは直接以下の工程ｆ）に供する；
ｃ）周囲温度からおよそ１００℃の温度、好ましくは５０から７０℃、より好ましくはおよそ６５℃での塩基処理、本工程により、イズロン酸の２位における硫酸基が制御されたパーセンテージで除去され、エポキシド基が形成される；そして、所望により、
ｄ）およそｐＨ７、およそ５０℃からおよそ１００℃の温度、好ましくはおよそ７０℃での該エポキシド環の開裂、本工程により、ガラクツロン酸残基が生じる；あるいは、
ｅ）およそ０℃から３０℃、好ましくはおよそ２５℃での該エポキシド環の開裂、本工程により、イズロン酸残基が生じる；そして所望により、
ｆ）過ヨウ素酸ナトリウムによるジオールの酸化、本工程により、グリコシド環に開裂が生じ、修飾残基あたり２つのアルデヒド基が形成される；そして所望により、
ｇ）該アルデヒド基の一級アルコールへの還元、そして所望により、Ｄ基のヒドロキシル以外の式（Ｉ）で決められた様々な意味のなかに包含される基への変換；
ｈ）所望により工程ｇ）で得られた化合物を酸加水分解する、本工程により規則的配列に対応するオリゴ糖が得られる。これは好ましくは亜硝酸による脱アミノによる。この反応は、Ｎ−硫酸グルコサミン残基と次のウロン酸の間の結合の切断によるもので、通常ＬＭＷヘパリンを得るために用いられる。この反応により非還元末端においてウロン酸からなる残基、還元末端においてアンヒドロ(anhydro）マンノース残基を有するＬＭＷ化合物が得られる。後者はさらにホウ化水素での還元により修飾してアンヒドロマンニトールとすることができる。得られたＬＭＷ化合物は、少なくとも１つのグリコール開裂イズロン酸残基を含む；あるいは、
ｉ）工程ｇ）で得られた生成物を部分的酵素加水分解にかける、ここで用いる酵素は、リアーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、またはその均等物からなる群から選択される、本工程により、オリゴ糖、好ましくは４糖または８糖であって、不飽和イズロン酸からなる非還元末端残基、Ｎ−スルホグルコサミンからなる還元残基を有し、少なくとも１つの開環イズロン酸残基を有するものが得られる。
ｉ）所望により工程ｃ）で得られた化合物または工程ｄ）で得られた生成物を部分的酵素加水分解により処理する；そして所望により、
ｊ）ｂ）、ｃ）、およびｆ）のいずれかの工程で得られた生成物を部分的６−Ｏ−脱硫酸化に供する；あるいは、
ｋ）部分的にまたは全体が６−脱硫酸化された開始ヘパリンを工程ｂ）、ｃ）およびｆ）に供する。

本発明による２−Ｏ−脱硫酸化された誘導体は、工程ａ）およびｂ）を省略することにより、上記の方法により得られる。

本発明による方法を以下のスキームによって図示する：

本明細書に記載する本発明によると、好ましい化合物は：
上記の方法において、工程ａ）およびｂ）を省略し、工程ｃ）を６０℃で４５分行ない、工程ｄ）を７０℃でｐＨ７で行なうことにより得られ、分子量（ＭＷ）が１１２００で、多分散指標Ｄが１．３で、脱硫酸化の程度が１．９９で（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比で表した）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ５０％（以下ＳＴ１５１４とも称する）である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリン；

上記の方法において、工程ａ）とｂ）を省略し、工程ｃ）を６０℃で４５分行ない、工程ｄ）を７０℃でｐＨ７で行ない、次いで工程ｆ）、ｇ）およびｈ）を脱アミノによって行なうことにより得られ、分子量（ＭＷ）が３０５０で、多分散指標Ｄが２．２で、脱硫酸化の程度が１．９９で（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比で表した）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ５０％（以下ＳＴ２０１０とも称する）である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたＬＭＷヘパリン；

上記の方法において、工程ａ）とｂ）を省略し、工程ｃ）を６０℃で４５分行ない、工程ｄ）を７０℃でｐＨ７で行ない、次いで工程ｆ）、ｇ）およびｈ）を脱アミノによって行なうことにより得られ、分子量がＭｎ＝５８００、Ｍｗ＝７５２０で、多分散指標Ｄが１．２９４で、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ５０％（以下ＳＴ２１８４とも称する）である、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたＬＭＷヘパリン；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）を省略し、工程ｆ）を４℃で一晩行ない、工程ｇ）を室温で３時間行なうことにより得られ、分子量（ＭＷ）が１１２００で、多分散指標Ｄが１．３で、脱硫酸化の程度が１．６で（ＳＯ_３ ⁻：ＣＯＯ⁻モル比で表した）、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％（以下ＳＴ１５１８とも称する）である、ヘパリンＮ−アセチル（５０％）；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）を省略し、工程ｆ）を４℃で一晩行ない、工程ｇ）を室温で３時間行ない、工程ｈ）を亜硝酸脱アミノによって４℃で１７分行ない、次いでアルデヒド基をホウ化水素で室温で３時間還元することにより得られ、分子量がＭｗ＝４７８０、Ｍｎ＝１００００で、多分散指標Ｄが２．０９２で、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％（以下ＳＴ２１６８とも称する）である、ＬＭＷヘパリンＮ−アセチル（５０％）；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）を省略することにより得られ、分子量がＭｎ＝１０８９０、Ｍｗ＝２２３７０で、多分散指標Ｄが２．０５４である（以下ＳＴ２０３７とも称する）、ヘパリンＮ−アセチル（２７％）；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）を省略することにより得られ、分子量がＭｎ＝１０２１０、Ｍｗ＝２１２７０で、多分散指標Ｄが２．０８３である（以下ＳＴ２０３８とも称する）、ヘパリンＮ−アセチル（３９％）；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）を省略することにより得られ、分子量がＭｎ＝１１０７０、Ｍｗ＝２２０００、多分散指標Ｄが１．９８７である（以下ＳＴ２０４１とも称する）、ヘパリンＮ−アセチル（６４％）；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）を省略することにより得られ、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％（以下ＳＴ２１８５とも称する）である、ヘパリンＮ−アセチル（２７％）；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）を省略することにより得られ、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％（以下ＳＴ２１８６とも称する）である、ヘパリンＮ−アセチル（３９％）；

上記の方法において、工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）を省略することにより得られ、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがおよそ３０％（以下ＳＴ２１８７とも称する）である、ヘパリンＮ−アセチル（６４％）。

化合物ＳＴ１５１４、ＳＴ１５１３、ＳＴ１５１６およびＳＴ１５１５の調製については、国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号に具体的に開示されている。

分子量はＨＰＬＣ−ＧＰＣ（高速液体クロマトグラフィー−ゲル振盪クロマトグラフィー）によって測定した。脱硫酸化の程度は、電気伝導度測定法により測定し、修飾ウロン酸のパーセンテージは、^１３Ｃ−ＮＭＲによって測定した。

ＭＷは分子量であり、Ｄは、ＭＷ／Ｍｎとして表した多分散指標である。

本明細書に記載する本発明によると、出発物質は様々な起源のグリコサミノグリカンであり、好ましくは天然のヘパリンである。Ｎ，６ジ硫酸のパーセンテージ含量が０から１００％の化学修飾されたヘパリンを使用することもできる。６−Ｏ−硫酸化グルコサミン含量が異なる物質から開始することにより、一つの開裂イズロン酸と別の開裂イズロン残の間の規則的配列の長さを調節することができる。本発明によるグリコシド環の開裂が存在するグリコサミノグリカンは通常当業者にＲＯ誘導体と称されており、これはグリコシド環が酸化作用、還元により開裂していることを意味する（Reduction-Oxidation-RO）。このグリコシド環の開裂は従来から「グリコール開裂」とも呼ばれる。開裂する環上に存在する２つの一級ヒドロキシの形成によってこのように呼ばれる。本明細書で言及する該化合物は「ＲＯ」または「グリコール開裂」誘導体とも称される。

本明細書に記載する本発明のさらなる態様において、上記の開裂反応（「グリコール開裂」）に由来するアルデヒドおよび一級ヒドロキシはまた、それら自身を次なる官能化へと導く。それゆえ式（Ｉ）の化合物はグリコール開裂に由来する一級ヒドロキシ上に、ＸおよびＸ’について定義したように同じかまたは異なる基、例えば、オリゴ糖またはペプチド基であって、単一の糖またはアミノ酸から１単位より大きい、好ましくは２または３単位の長さの基を有していてもよい。

式（Ｉ）の化合物であって、ＸおよびＸ’がＣＨ_２ＯＨであるものをその他のタイプの薬剤のための媒体として使用することもできる。これは、処方された薬剤の通常の製造条件および保存条件において安定な結合を提供することができるヘパリン部分との好適な結合により、輸送された薬剤を体内、好ましくは標的器官の近くで放出するものである。輸送され得る薬剤の例としては、ステロイド性および非−ステロイド性の抗−炎症薬、コルチコステロイド、およびその他の転移抑制作用を有する薬剤が挙げられ、転移抑制作用を有する薬剤の場合、本発明の化合物およびそれに結合する転移抑制薬の別々の固有の活性の合計の結果として、転移抑制効果が増強される。それに伴い、標的の選択性が高まり、全身毒性が低下する。このような薬剤の例としてはメタロプロテイナーゼ阻害剤が挙げられる。有効に輸送されるその他の薬剤として、内皮レベルで作用するものがある。式（Ｉ）の化合物であって、ＸとＸ’がヒドロキシまたはアルデヒドではないものも、薬剤の媒体として利用でき、この場合、ＸおよびＸ’基は、輸送される分子、即ち本発明のグリコサミノグリカンと媒体として作用する分子の間の「スペーサー」として作用する。このような場合が望ましいのは、薬物動態学または薬物動力学の理由による。

本発明による化合物がヘパリン由来である場合、これらはヘパリンから開始して、例えば当業者に周知の技術を用いたＮ−脱硫酸化、次いでＮ−アシル化により調製される。例えば、Ｎ−脱硫酸化は、ＤＭＳＯ：Ｈ_２Ｏ溶液９５：５ｖ：ｖ中、室温で０．５から８時間の加溶媒分解によって行なわれ、次いで、アルカリ性条件下での、例えばアシル（即ち、アセチル、ヘキサノイル、スクシニル、ピバロイル）無水物によるＮ−アシル化を行なう。

続く２−Ｏ−脱硫酸化は、アルカリ性試薬、例えば、水酸化ナトリウムの存在下で周囲温度から１００℃の温度、好ましくは５０から７０℃、例えば６０℃で所望の２−Ｏ−脱硫酸化物を得るのに十分に長い時間行なう。２−Ｏ−脱硫酸化は方法のパラメーター、例えば反応物濃度、温度および反応時間を変えることによって制御する。１つの好ましい例は、基質濃度（グリコサミノグリカン）を一定の８０ｍｇ／ｍｌに維持しＮａＯＨ濃度を１Ｍに維持し、温度を６０℃の一定に維持し、脱硫酸化を１５から６０分間の反応時間によって制御することである。当業者であれば条件を例えば、反応温度を上げて反応時間を短くするなど、通常の実験的試行錯誤および一般知識に基いて変動させることができよう。

アルカリ性試薬による処理により、脱硫酸化された単位上にエポキシド環が存在することによって特徴付けられる中間体が生じる。驚くべきことに、これらの中間体は、式（Ｉ）の化合物と同様に、ヘパラナーゼ阻害特性を有することが判明した。それゆえ、本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、部分的に２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンの誘導体であり、したがって、電荷が減少したヘパリン、特に２−Ｏ−脱硫酸化が６０％以下のヘパリンであり、脱硫酸化部位のエポキシド環によって特徴付けられる。エポキシド環によって特徴付けられる該化合物は本発明の範囲に含まれる。

エポキシド環の形成に続き、公知の技術によって該環を開裂する。形成されたエポキシドのパーセンテージは、エポキシドを含有するウロン酸環の２位および３位の炭素に特徴的なおよそ５５ｐｐｍの^１３Ｃ−ＮＭＲシグナルの面積と芳香族シグナルの面積の総和（グルコサミンとウロン酸残基のＣ１）の間の比から算出される。開裂を加熱下で行うとガラクツロン酸残基が得られるが、エポキシド環の開裂を冷却下で行うとイズロン酸残基が得られる。エポキシド環を含む化合物の好適な例は、上記方法によって得られ、それぞれエポキシ化されたウロン酸含量が１４％（以下ＳＴ１５０９）、２４％（以下ＳＴ１５２５）および３０％（以下ＳＴ１５２６）のものである。

部分的に脱硫酸化されたヘパリンを次いで、上記方法にしたがって「グリコール開裂」（ＲＯと略称する）およびスミス(Smith)分解（ＳＤと略称する）に供する。

あるいは式（Ｉ）の化合物は、エポキシド中間体を経ずに得ることもできる。即ち、直接グリコール開裂および次いでスミス分解に供する。

上記方法により、ＸおよびＸ’基がともに−ＣＨ_２ＯＨである式（Ｉ）の化合物が得られる。

ＸおよびＸ’が−ＣＨ_２ＯＨ以外のものについては、当業者に周知のヒドロキシル基をその他の上記定義による基に変換する方法を用いればよい（例えば２６頁のスキーム（化６）、化合物ＳＴ１８２８、ＳＴ１８２９、ＳＴ１９１７およびＳＴ１９１９を参照されたい）。例えば、アミノ酸またはペプチドとの結合は、グリコール開裂反応に由来する中間体アルデヒドを還元的アミノ化反応により処理することによって行なうことができる（Hoffmann J. et al. Hydrocarbon Resarch、117、328-331 (1983) ）。これは、水性溶媒中で行ない、ヘパリン構造を維持することができる。

所望の場合、これは本明細書に記載する本発明のさらなる目的であるが、式（Ｉ）の化合物はさらに好適なｐＨ条件下、例えばｐＨ４で酸性試薬により分解することにより、オリゴ糖混合物を得ることができ、これは抗血管新生特性を保持している。

同様に、本発明の目的は、上記の方法の工程ｇ）、ｈ）、ｉ）およびｊ）のいずれかによって得られる化合物である。

本明細書に記載する本発明の目的は、活性成分として少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を、単独であるいは１または複数の式（Ｉ）の化合物と組み合わせて含む医薬組成物であるか、あるいは、１または複数の該式（Ｉ）の化合物と上記のＮ−アシル−脱硫酸化されたヘパリン、例えば、エポキシ化中間体とを組合せて含む医薬組成物である；後者は活性成分として医薬組成物において単独で用いることができる。本発明による活性成分は、医薬分野で通常用いられている適当な媒体および／または賦形剤、例えば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook”、latest editionに記載のものとの混合物として提供する。本発明による組成物は、治療的に有効な量の活性成分を含むものである。用量は当業者、例えば、臨床医またはプライマリケア医師により、治療すべき疾患のタイプ、患者の病状、またはその他の活性成分の同時投与を考慮して決定される。例えば、０．１から１００ｍｇ／ｋｇの用量が示される。

医薬組成物の例としては、経口または非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮投与されるもの、あるいは経鼻経口噴霧薬の形態が挙げられる。目的に適した医薬組成物は、錠剤、硬または軟カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤および用時液体調製用の固体形態などである。非経口投与用組成物としては例えば、あらゆる筋肉内、静脈内、皮下注射用形態および溶液、懸濁液、乳濁液が挙げられる。リポソーム製剤も言及すべきである。錠剤にはまた、活性成分の徐放形態のもの、例えば、経口投与形態、好適な層に被覆された状態、マイクロカプセルに封入された散剤、シクロデキストリンとの複合体、持効性製剤、例えば、皮下形態、例えば持効性注射剤またはインプラントが含まれる。

本明細書に記載する本発明による化合物は、抗−ヘパラナーゼおよび抗血管新生活性を有する。これによって、血管新生の変調を患う対象、一般的に哺乳類、特にヒト対象またはヘパラナーゼ活性の阻害処置を必要とする対象の治療に有用な薬物の調製のために好適なものとなる。

本発明の目的である薬物によって治療される疾患の例としては、原発性腫瘍、転移、糖尿病性網膜症、乾癬、水晶体後線維増殖症（retrolenticular fibroplasia）、血管形成術後再狭窄、冠状動脈バイパス、炎症、関節炎、自己免疫疾患、同種移植片拒絶、循環器疾患、繊維増殖(fibro-proliferative)疾患、異常な血小板凝集によって引き起こされる疾患、平滑筋増殖によって引き起こされる疾患、グッドパスチャー症候群、急性糸球体腎炎、新生児肺性高血圧、喘息、うっ血性心不全、成人性肺性高血圧、腎脈管高血圧、増殖性網膜症、実験的自己免疫脊髄脳炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病が挙げられる。

好ましいことに、本発明による化合物にはヘパリンに典型的にみられる副作用が実質的に無い。特に、本発明による化合物には実質的に抗凝血活性が無い。そのような活性が実質的に無いことは、当業者にとって臨床使用の観点から活性が無いか無視できる程度であることを意味する。

ヘパラナーゼ阻害活性はVlodavskyら(Bitan M. et al、1995）によって確立された方法によって測定した。該方法は、ヘパラナーゼによって引き起こされるヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）のヘパラン硫酸鎖の断片化の程度の評価に基く。硫酸標識化した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を通常ＨＳＰＧのソースとして用いる。硫酸標識化したＥＣＭを組換えヘパラナーゼとｐＨ６．２で様々な濃度の被験化合物の不在および存在下でインキュベートする。プロテオグリカン分解の発生を評価するために、インキュベーション培地を回収し、セファロース６Ｂカラム（０．９ｘ３０ｃｍ）でのゲル濾過にかける。フラクション（０．２ｍｌ）をＰＢＳで流速５ｍｌ／時間で溶出し、放射能をカウントする。排除体積（Ｖ_Ｏ）にブルーデキストランによって、全含有体積（Ｖ_ｔ）にフェノールレッドによって印を付ける。ＨＳ側鎖の分解断片はセファロース６Ｂから０．５＜Ｋ_ａｖ＜０．８（ピークＩＩ）にて溶出される。報告した実験条件下で、良好なヘパラナーゼ阻害剤はＨＳの断片化を１０μｇ／ｍｌ以下の濃度で阻害する。

結果を以下の表１に示す。

ＳＴ１５１８が１μｇ／ｍｌの濃度でも高い阻害活性を有することは言及に値する。

本発明による化合物、特に新規な化合物についてそのＦＧＦ増殖因子に関する活性を試験した。これには国際特許出願第ＷＯ０１／５５２２１号に記載したのと同じ実験モデルを用い、該引用文献において開示されたものと同程度の活性が示された。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

ＳＴ１５１８
過剰のピリジンをAmberlite IR120のカラムから前もって溶出された１ｇのヘパリン水溶液に添加した。溶液を減圧下で蒸発させた；その結果得られたヘパリンのピリジン塩を５０ｍｌのＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ９５：５混合物に溶解し、２０℃で２時間攪拌して、脱硫酸化の程度がおよそ５０％のものを得た。

次いで、溶液を等量のＮａＨＣＯ_３飽和溶液で希釈した。溶液を膜（カットオフ１０００−２０００Ｄ）中で蒸留水に対して透析した。最終生成物を減圧下での蒸留により単離した。

Ｎ−アセチル化されたヘパリンを、５０％Ｎ−脱硫酸化されたヘパリンのＮ−アセチル化によって調製した。１ｇのヘパリンを１０ｍｌの蒸留水に溶解した；溶液を４℃に冷却し、炭酸水素ナトリウムで飽和させた；６２５μｌの無水酢酸をこの溶液に添加し、混合物を４℃で２時間攪拌した。反応の間、炭酸水素ナトリウムの添加によりｐＨを制御して約８に維持した。次いで得られた溶液を膜（カットオフ２０００−１０００Ｄ）中で蒸留水に対して透析した。

１ｇのヘパリン５０％Ｎ−アセチル化されたヘパリンを２５ｍｌの蒸留水に溶解し、４℃に冷却し、２５ｍｌのＮａＩＯ_４の０．２Ｍの溶液を添加した後、溶液を暗条件下で２０時間撹拌し、反応をエチレングリコールの添加により停止させ、塩を接線方向の限外濾過によって除去した。数部に分けた４００ｍｇのＮａＢＨ_４を脱塩した溶液に添加した。溶液を周囲温度で３時間撹拌し、次いで希釈ＨＣｌで中性にし、接線方向の限外濾過によって脱塩した。

化合物の^１３ＣＮＭＲスペクトルを図１に示す。

ＳＴ２０１０およびＳＴ２１８４
５ｇのヘパリンを６３ｍｌのＮａＯＨのＩＮ溶液に溶解した。溶液を４５分間６０℃で攪拌し、冷却し、そして希釈ＨＣｌで中性にした。次いで溶液を７０℃で４８時間攪拌し、冷却し、膜（カットオフ２０００−１０００Ｄ）中で水に対して透析した。

２ｇの２−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンを５０ｍｌの蒸留水に溶解し、４℃に冷却し、５０ｍｌのＮａＩＯ_４の０．２Ｍ溶液を添加した後、溶液を暗条件で２０時間攪拌し、反応をエチレングリコールの添加により停止させ、塩を接線方向の限外濾過により除去した。数部に分けた８００ｍｇのＮａＢＨ_４を脱塩した溶液に添加した。溶液を周囲温度で３時間撹拌し、希釈ＨＣｌで中性にし、接線方向の限外濾過によって脱塩した。

４００ｍｇの酸化−還元ヘパリンを２５ｍｌの蒸留水に溶解した。７ｍｇのＮａＮＯ_２を添加した後、ｐＨを希釈ＨＣｌで２に調整し、溶液を４℃で１７分間攪拌した。反応を中和によって停止させた。数部に分けた６０ｍｇのＮａＢＨ_４を脱塩した溶液に添加した。溶液を周囲温度で３時間攪拌し、次いで希釈ＨＣｌで中性にし、ゲル濾過によって分画した。２つの異なる分子量のフラクションを単離した：ＳＴ２０１０はＭｗ＝３０５０であり、ＳＴ２１８４はＭｎ＝５８００、Ｍｗ＝７５２０である。

化合物ＳＴ２０１０の^１３ＣＮＭＲスペクトルを図２に示す。

ＳＴ２０４１
過剰のピリジンをAmberlite IR120のカラムから前もって溶出しておいた２ｇのヘパリン水溶液に添加した。溶液を減圧下で蒸発させた；その結果得られたヘパリンのピリジン塩を１００ｍｌのＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ９５：５混合物に溶解し、２０℃で４時間攪拌し脱硫酸化の程度が約６４％のものを得た。

次いで溶液を等量のＮａＨＣＯ_３の飽和溶液で希釈した。溶液を膜（カットオフ１０００−２０００Ｄ）中で蒸留水に対して透析した。最終生成物を減圧下での蒸留により単離した。

化合物ＳＴ２０４１の^１３ＣＮＭＲスペクトルを図３に示す。

Claims

全部のグルコサミン残基の２位がＮ−脱硫酸化されかつＮ−アセチル化されたグリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物であって、該誘導体が下記式（Ｉ）：

（Ｉ）
［式中、Ｕ環は：

であり；
ＸおよびＸ’は、−ＣＨ_２−Ｄ基であり（ここでＤはヒドロキシ）；
ＲおよびＲ_１は、アセチル残基であり；
ｎおよびｍは、同一でも異なっていてもよく、１から４０の間であり；ｎ＋ｍの合計は６から４０の間であり；ｍ：ｎ比は１０：２から１：１の間であり；
以下の記号

は、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖にわたって統計的に分布しているが、順にならんでいる必要は無いことを示す］を有する医薬組成物。
ｍがｎ以上である請求項１に記載の医薬組成物。
ｎがｍ＋ｎの合計の４０から６０％の範囲である、請求項１−２のいずれかに記載の医薬組成物。
血管新生を阻害するための、請求項１−３のいずれかに記載の医薬組成物。
炎症の治療のための、請求項１−３のいずれかに記載の医薬組成物。
自己免疫疾患の治療のための、請求項１−３のいずれかに記載の医薬組成物。
原発性腫瘍、転移、糖尿病性網膜症、乾癬、水晶体後線維増殖症、血管形成術後再狭窄、冠状動脈バイパス、炎症、関節炎、自己免疫疾患、同種移植片拒絶、循環器疾患、繊維増殖疾患、異常な血小板凝集によって引き起こされる疾患、平滑筋増殖によって引き起こされる疾患、グッドパスチャー症候群、急性糸球体腎炎、新生児肺性高血圧、喘息、うっ血性心不全、成人性肺性高血圧、腎脈管高血圧、増殖性網膜症、多発性硬化症、実験的自己免疫脊髄脳炎、インシュリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群から選択される疾患の治療のための、請求項１−３のいずれかに記載の医薬組成物。
下記式（Ｉ）：

（Ｉ）
［式中、Ｕ環は：

であり；
ＸおよびＸ’は、−ＣＨ_２−Ｄ基であり（ここでＤはヒドロキシ）；
ＲおよびＲ_１は、アセチル残基であり；
ｎおよびｍは、同一でも異なっていてもよく、１から４０の間であり；ｎ＋ｍの合計は６から４０の間であり；ｍ：ｎ比は１０：２から１：１の間であり；
以下の記号

は、ｍおよびｎで示された単位が多糖鎖にわたって統計的に分布しているが、順にならんでいる必要は無いことを示す］を有する全部のグルコサミン残基の２位がＮ−脱硫酸化されかつＮ−アセチル化されたグリコサミノグリカン誘導体。
ｍがｎ以上である請求項８に記載の全部のグルコサミン残基の２位がＮ−脱硫酸化されかつＮ−アセチル化されたグリコサミノグリカン誘導体。
ｎがｍ＋ｎの合計の４０から６０％の範囲である、請求項８−９のいずれかに記載の全部のグルコサミン残基の２位がＮ−脱硫酸化されかつＮ−アセチル化されたグリコサミノグリカン誘導体。
請求項８−１０のいずれかに記載の化合物の開始ヘパリンからの調製方法であって、以下のいずれかから選択される工程：
工程ａ）＋ｂ）＋ｆ）＋ｇ）または
工程ａ）＋ｂ）＋ｆ）＋ｇ）＋ｈ）
［ここで、
ａ）ＤＭＳＯ：Ｈ_２Ｏ９５：５ｖ：ｖ中、周囲温度での０．５から８時間の、スルフアミノ残基の加溶媒分解性加水分解によるグルコサミン残基の２位の硫酸基の全部の除去によるＮ−脱硫酸化；
ｂ）アルカリ性水溶液（ｐＨ８−９）中、アセチル化剤による処理により、グルコサミン残基の２位において全部にアセチル化された基を生じさせることによる、グルコサミン残基の２位において全部に脱硫酸化された基のＮ−アセチル化；
ｆ）過ヨウ素酸ナトリウムによるジオールの酸化、本工程により、グリコシド環に開裂が生じ、１修飾残基あたり２つのアルデヒド基が形成される；
ｇ）該アルデヒド基の一級アルコールへの還元、
ｈ）工程ｇ）で得られた化合物を酸加水分解する、本工程により規則的配列に対応するオリゴ糖が得られる］を含む方法。
請求項１１に記載の方法であって、
工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｆ）を４℃で一晩行ない、工程ｇ）を室温で３時間行うか；あるいは、
工程ａ）を室温で２時間行ない、工程ｂ）を４℃で２時間行ない、工程ｆ）を４℃で一晩行ない、工程ｇ）を室温で３時間行ない、工程ｈ）を亜硝酸脱アミノによって４℃で１７分行ない、次いでアルデヒド基をホウ化水素で室温で３時間還元する、方法。
医薬上許容される媒体および賦形剤と混合して、請求項８−１０のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物を活性成分として含有する医薬組成物。
請求項８−１０のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物を媒体として薬剤と共に含有する医薬組成物。
該薬剤が以下からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物：
ステロイド性および非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、転移抑制作用を有する薬剤、内皮レベルで作用する薬剤。
該転移抑制薬がメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。