JP6132551B2 - シャペロン活性を保持するプロテアーゼ欠損ＤｅｇＰ並びにノックアウトＴｓｐ及びｐｔｒ遺伝子を持つ、組換えタンパク質発現のための細菌株 - Google Patents

Description

本発明は、組換え細菌宿主株、詳細には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関する。本発明はまた、かかる細胞中で目的タンパク質を生産する方法に関する。

大腸菌などの細菌細胞は一般に、組換えタンパク質の生産に用いられる。大腸菌などの細菌細胞を組換えタンパク質の生産に用いることには、とりわけプラスミドを介した遺伝子挿入を可能にする宿主細胞としての細菌細胞の多用途性のために、多くの利点がある。大腸菌は、ヒトのインスリンを包含する多くの組換えタンパク質を生産するのに用いられてきた。

組換えタンパク質を生産するのに細菌細胞を用いることには多くの利点があるにもかかわらず、プロテアーゼ感受性タンパク質の生産が困難であることを包含する大きな制限が未だにある。プロテアーゼは、大腸菌のペリプラズム及び細胞質内の古くなった及びミスフォールドしたタンパク質の代謝回転において重要な役割を果たす。細菌のプロテアーゼは目的の組換えタンパク質を分解するように働き、それによって活性タンパク質の収量をしばしば顕著に低減させる。

多数の細菌プロテアーゼが同定されている。大腸菌において、プロテアーゼＩＩＩ（ｐｔｒ）、ＤｅｇＰ、ＯｍｐＴ、Ｔｓｐ、ｐｒｌＣ、ｐｔｒＡ、ｐｔｒＢ、ｐｅｐＡ−Ｔ、ｔｓｈ、ｅｓｐｃ、ｅａｔＡ、ｃｌｐＰ及びｌｏｎを包含するプロテアーゼが同定されている。

プロテアーゼＩＩＩ（ｐｔｒ）タンパク質は、高分子量のタンパク質を分解する１１０ｋＤａのペリプラズムプロテアーゼである。

Ｔｓｐ（Ｐｒｃとしても知られる）は、６０ｋＤａのペリプラズムプロテアーゼである。最初に知られたＴｓｐの基質はペニシリン結合タンパク質３（ＰＢＰ３）（「大腸菌のペニシリン結合タンパク質３のＣ末端プロセシングに関係する切断部位の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ３ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」；Ｎａｇａｓａｗａ Ｈ、Ｓａｋａｇａｍｉ Ｙ、Ｓｕｚｕｋｉ Ａ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ、Ｈａｒａ Ｈ、Ｈｉｒｏｔａ Ｙ．、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８９ Ｎｏｖ；１７１（１１）：５８９０〜３ページ及び「ペニシリン結合タンパク質３のＣ末端プロセシングに関係する大腸菌Ｔｓｐ遺伝子のクローニング、マッピング及び特徴付け（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔｓｐ ｇｅｎｅ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）」；Ｈａｒａ Ｈ、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ、Ｈｉｇａｓｈｉｔａｎｉ Ａ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｙ．、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９１ Ａｕｇ；１７３（１５）：４７９９〜８１３ページ）であったが、その後、Ｔｓｐはファージ尾部タンパク質を切断することも可能であることが発見され、それ故、尾部特異的プロテアーゼ（Ｔｓｐ）として再度命名された（Ｓｉｌｂｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２９５〜２９９ページ（１９９２））。Ｓｉｌｂｅｒら（「ｐｒｃ（ｔｓｐ）遺伝子の欠失は大腸菌Ｋ−１２におけるさらなる尾部特異的タンパク質分解活性についての証拠を提供する（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｃ（ｔｓｐ）ｇｅｎｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｔａｉｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２）」；Ｓｉｌｂｅｒ，Ｋ．Ｒ．、Ｓａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．；Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９９４ ２４２：２３７〜２４０ページ）は、ｐｒｃ遺伝子のセグメントを、Ｋａｎ^ｒマーカーを含む断片で置換することにより変異が作出されたｐｒｃ欠失株（ＫＳ１０００）を記載する。

ＤｅｇＰ（ＨｔｒＡとしても知られる）は、シャペロン及びプロテアーゼとしての二重の機能を持つ４６ｋＤａのタンパク質である（「セリンペプチダーゼのファミリー（Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」；Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＮＤ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＡＪ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４；２４４：１９〜６１ページ）。

組換えタンパク質の収量に影響を及ぼすため、細菌プロテアーゼをノックアウトすることが知られている。

Ｇｅｏｒｇｉｏｕら（「複数の分泌性プロテアーゼを欠損した大腸菌株の構築及び特徴付け：プロテアーゼＩＩＩは高分子量の基質をインビボで分解する（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ｐｒｏｔｅａｓｅ ＩＩＩ ｄｅｇｒａｄｅｓ ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）」、Ｂａｎｅｙｘ Ｆ、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ．、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１ Ａｐｒ；１７３（８）：２６９６〜７０３ページ）は、ｐｔｒ遺伝子の挿入による不活化により構築されたプロテアーゼＩＩＩを欠損した大腸菌株の増殖特性及びタンパク質安定性に対する作用を研究し、プロテアーゼ感受性の分泌性ポリペプチド発現の増加を観察した。ｐｔｒ変異を含み、分泌性プロテアーゼＤｅｇＰも欠損した株もまた生産され、この株では増殖速度が減少し、タンパク質発現が増加することが見出された。Ｇｅｏｒｇｉｏｕらにおいて、プロテアーゼＩＩＩ及び／又はＤｅｇＰを欠損した大腸菌株は多数のゲノム変異を既に含むＫＳ２７２親株から構築された。

ＵＳ５２６４３６５（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら）は、発現系と組み合わされたときにタンパク質分解感受性ポリペプチドの生産に有用なプロテアーゼ欠損大腸菌宿主の構築を開示する。

Ｍｅｅｒｍａｎら（「分泌性組換えタンパク質のタンパク質分解安定性に影響を及ぼす全ての既知の遺伝子座を欠損した大腸菌株の構築及び特徴付け（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ａｌｌ Ｋｎｏｗｎ Ｌｏｃｉ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｍｅｅｒｍａｎ Ｈ．Ｊ．、Ｇｅｏｒｇｅｏｕ Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４ Ｎｏｖ；１２；１１０７〜１１１０ページ）は、熱ショックタンパク質合成に関与するＲＮＡポリメラーゼσ因子であるｒｐｏＨにおける変異、並びにＤｅｇＰ、プロテアーゼＩＩＩ、Ｔｓｐ（Ｐｒｃ）及びＯｍｐＴを包含するプロテアーゼ遺伝子における変異の異なる組み合わせを含む大腸菌株を開示するが、ここでプロテアーゼ遺伝子の無発現変異は挿入による変異により引き起こされた。Ｍｅｅｒｍａｎらにおいて、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩＩＩ及びＤｅｇＰの１つ又は複数を欠損した大腸菌株は、多数のゲノム変異を既に含むＫＳ２７２親株から構築された。

ＵＳ５５０８１９２（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら）は、プロテアーゼ欠損細菌宿主における組換えポリペプチド並びにｒｐｏＨ遺伝子における変異も保有する一重、二重、三重及び四重のプロテアーゼ欠損細菌構築物を生産する方法を開示する。

Ｃｈｅｎらは、遺伝子の上流及び下流領域を増幅すること及び選択マーカー及びｓｐｒＷ１４８Ｒ変異を含むベクターにおいてこれらを一緒に連結することにより作出される、ｐｒｃ（Ｔｓｐ）及びＤｅｇＰにおける異なる変異の組み合わせを保有する大腸菌株の構築を記載する（「大腸菌のペリプラズムにおける組換え抗体断片の高レベル蓄積は三重変異体（ΔＤｅｇＰ Δｐｒｃ ｓｐｒ Ｗ１４８Ｒ）宿主株を必要とする（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｌａｓｍ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａ ｔｒｉｐｌｅ−ｍｕｔａｎｔ（ΔＤｅｇＰ Δｐｒｃ ｓｐｒ Ｗ１４８Ｒ）ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎ．）」、Ｃｈｅｎ Ｃ、Ｓｎｅｄｅｃｏｒ Ｂ、Ｎｉｓｈｉｈａｒａ ＪＣ、Ｊｏｌｙ ＪＣ、ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎ、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＤＣ、Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ ＪＥ、Ｃｈａｍｐｉｏｎ ＫＭ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４ Ｍａｒ ５；８５（５）：４６３〜７４ページ）。ΔＤｅｇＰ、Δｐｒｃ及びＷ１４８Ｒｓｐｒ変異の組み合わせは、最も高いレベルの抗体軽鎖、抗体重鎖及びＦ（ａｂ’）２−ＬＺを与えることが見出された。ＥＰ１３４１８９９は、プロテアーゼであるＤｅｇＰ及びＰｒｃをそれぞれコードする染色体のＤｅｇＰ及びｐｒｃを欠損し、ｐｒｃ変異型を持つ株により表される増殖表現型を抑制するタンパク質をコードする変異ｓｐｒ遺伝子を持つ大腸菌株を開示する。

Ｋａｎｄｉｌｏｇｉａｎｎａｋｉら（「プロテアーゼ欠損大腸菌変異体における組換えヒト抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ断片の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍｕｔａｎｔｓ．）」、Ｋａｎｄｉｌｏｇｉａｎｎａｋｉ Ｍ、Ｋｏｕｔｓｏｕｄａｋｉｓ Ｇ、Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ Ａ、Ｋｒａｍｂｏｖｉｔｉｓ Ｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００１ Ｊｕｎ；７（６）：６５９〜６４ページ）は、ｓｃＦｖタンパク質の発現のためのプロテアーゼ欠損株の利用を記載する。

組換えタンパク質の発現に以前に用いられたプロテアーゼ欠損細菌株は、例えば大腸菌株におけるｐｈｏＡ、ｆｈｕＡ、ｌａｃ、ｒｅｃ、ｇａｌ、ａｒａ、ａｒｇ、ｔｈｉ及びｐｒｏなどの細胞代謝及びＤＮＡ複製に関係する遺伝子のさらなる変異を含む。これらの変異は細胞増殖、安定性、組換えタンパク質発現収量及び毒性に対する作用を包含する、宿主細胞に対する多くの有害作用を持つ可能性がある。これらのゲノム変異を１つ又は複数持つ株、とりわけこれらの変異を多数持つ株は、細菌の増殖速度を工業的なタンパク質生産に適さないレベルへと低減させる適応度の喪失を示す可能性がある。さらに、上述のゲノム変異のいずれかが、シス及び／又はトランスの他の遺伝子に予測不可能な害のある方法で影響を及ぼし、それによって株の表現型、適応度及びタンパク質プロファイルを変える可能性がある。さらに、大きく変異した細胞の使用は、商業的使用、とりわけ治療的使用のための組換えタンパク質の生産に一般に適さないが、その理由はかかる株は一般に不完全な代謝経路を持っていて、そのため最少培地又は合成培地中でほとんど又は全く増殖しない可能性があるためである。

プロテアーゼ欠損細菌株はまた、遺伝子コード配列中へのＤＮＡ配列の挿入により作出される、１つ又は複数のプロテアーゼコード遺伝子へのノックアウト変異を典型的に含む。挿入されるＤＮＡ配列は、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを典型的にコードする。この変異方法は標的プロテアーゼをノックアウトするのに有効である可能性がある一方、この方法に関連した不利点は多い。１つの不利点は、宿主のゲノム内に破損を引き起こす、抗生物質耐性遺伝子などの外来ＤＮＡの挿入であり、この破損は不利益なタンパク質の過剰発現及び／又は他の必須タンパク質の下方制御若しくはノックアウトを包含する望まない作用を多数もたらす可能性がある。この作用はとりわけ標的プロテアーゼ遺伝子のすぐ上流又は下流に位置する遺伝子について明らかである。外来ＤＮＡ、とりわけ抗生物質耐性遺伝子の挿入のさらなる不利点は宿主細胞に対する未知の表現型改変であり、この改変は標的タンパク質の発現及び／又は宿主細胞の増殖に影響を及ぼし、また宿主細胞を治療薬としての使用が意図されるタンパク質の生産に適さなくする可能性もある。抗生物質耐性タンパク質は、とりわけヒトに投与する治療薬の生産のための大規模製造の生物学的安全性要件について、特に不利である。抗生物質耐性マーカー挿入のさらなる不利点は、抗生物質耐性遺伝子によりコードされるタンパク質の発現により作出される、細胞への代謝的な負担である。ノックアウト変異などの遺伝子操作のマーカーとしての使用のための抗生物質耐性マーカーの使用はまた、利用可能な異なる抗生物質耐性マーカーの数により限定される。

したがって、組換えタンパク質の生産のための有利な手段を与える新たな細菌株を提供することが依然として必要である。

上記の問題の１つ又は複数を解決することが本発明の目的である。

第一の態様において、本発明は、以下の変異プロテアーゼ遺伝子、
ａ．低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である、変異Ｔｓｐ遺伝子、
ｂ．低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である、変異ｐｔｒ遺伝子、及び
ｃ．シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子
の１つ又は複数を含む組換えグラム陰性細菌細胞であって、
変異Ｔｓｐ遺伝子及び／又は変異ｐｔｒ遺伝子及び／又は変異ＤｅｇＰ遺伝子並びに任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて、野生型細菌細胞と遺伝的に同質である、上記組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である変異Ｔｓｐ遺伝子を含み、さらなる変異プロテアーゼ遺伝子を含まない細胞を提供する。したがって本発明は、変異Ｔｓｐ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である変異ｐｔｒ遺伝子を含み、さらなる変異プロテアーゼ遺伝子を含まない細胞を提供する。したがって本発明は、変異ｐｔｒ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含み、さらなる変異プロテアーゼ遺伝子を含まない細胞を提供する。したがって本発明は、変異ＤｅｇＰ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子並びに低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である変異Ｔｓｐ遺伝子を含み、さらなる変異プロテアーゼ遺伝子を含まない細胞を提供する。したがって本発明は、変異ＤｅｇＰ遺伝子及び変異Ｔｓｐ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である変異ｐｔｒ遺伝子及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である変異Ｔｓｐ遺伝子を含み、さらなる変異プロテアーゼ遺伝子を含まない細胞を提供する。したがって本発明は、変異ｐｔｒ遺伝子及び変異Ｔｓｐ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子並びに低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である変異ｐｔｒ遺伝子を含み、さらなる変異プロテアーゼ遺伝子を含まない細胞を提供する。したがって本発明は、変異ＤｅｇＰ遺伝子及び変異ｐｔｒ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である変異ｐｔｒ遺伝子、並びに低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である変異Ｔｓｐ遺伝子を含み、さらなる変異プロテアーゼ遺伝子を含まない細胞を提供する。したがって本発明は、変異ＤｅｇＰ遺伝子、変異ｐｔｒ遺伝子及び変異Ｔｓｐ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細胞を提供する。

好ましい実施形態において、上で言及される変異ｐｔｒ遺伝子及び／又は変異Ｔｓｐ遺伝子はノックアウト変異である。

本発明者らは、上述の変異プロテアーゼの１つ又は複数を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である細菌宿主株は、目的の組換えタンパク質の生産に有利な宿主を提供することを見出した。本発明により提供される細胞は、変異していない細胞と比較して低減されたプロテアーゼ活性を持ち、目的の組換えタンパク質、とりわけタンパク質分解感受性の目的タンパク質のタンパク質分解を低減することができる。加えて本発明による細胞は、上述のプロテアーゼ変異の１つ又は複数を導入するためにゲノム配列に最小限の変異のみを保有し、細胞の増殖及び／又は目的タンパク質を発現する能力に対して有害な作用を持つ可能性がある他の変異を保有しない。

本発明により提供されるグラム陰性細胞の１つ又は複数は、目的の組換えタンパク質を高収量で提供することができる。本発明により提供されるグラム陰性細胞の１つ又は複数は、目的タンパク質の高速生産を提供することができる。本細胞の１つ又は複数は、目的の組換えタンパク質の速い初期収量を提供することができる。さらに、本細胞の１つ又は複数は、良好な増殖プロファイルを示すことができる。

第二の態様において、本発明は、
ａ．遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子、並びに／又は
ｂ．遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子、並びに
ｃ．任意選択で、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子
を含む、組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、並びに遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子、並びに遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、並びに遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子、並びに遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含むノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含む細胞を提供する。

本発明の第二の態様により提供される細胞は、プロテアーゼ欠損株を提供するのに当該技術分野で典型的に用いられるＤＮＡ挿入を利用するノックアウト変異法の上記の不利点を克服する。本発明において、ｐｔｒ遺伝子及び／又はＴｓｐ遺伝子へのノックアウト変異は、遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンにより与えられる。標的ノックアウト遺伝子の開始コドンへのミスセンス点変異などの変異により、標的遺伝子がコード配列の開始部に適した開始コドンを含まないことが確実となる。遺伝子開始コドンと停止コドンの間に位置する１つ又は複数の停止コドンの挿入により、たとえ遺伝子の転写が開始されても、全長のコード配列は転写されないことが確実となる。宿主のゲノムは、開始コドンを変異させる及び／又は１つ若しくは複数の停止コドンを挿入するのに最小限の破損を必要とし、それによって標的タンパク質の発現及び／又は宿主細胞の増殖に対するゲノム破損の有害な作用を最小化する。本発明の細胞はまた、細胞ゲノムへの最小限の破損によって、治療薬としての使用が意図されるタンパク質の生産により適し得る。

第三の態様において、本発明は、上述の本発明の第一の態様又は第二の態様において規定されている組換えグラム陰性細菌細胞中で目的の組換えタンパク質を発現させるステップを含む、目的の組換えタンパク質を生産する方法を提供する。

野生型ｐｔｒ（プロテアーゼＩＩＩ）及びノックアウト変異ｐｔｒ（プロテアーゼＩＩＩ）のタンパク質及び遺伝子配列の５’末端を示す図である。 野生型Ｔｓｐ及びノックアウト変異Ｔｓｐのタンパク質及び遺伝子配列の５’末端を示す図である。 野生型ＤｅｇＰ及び変異ＤｅｇＰのタンパク質及び遺伝子配列の領域を示す図である。 大腸菌野生型Ｗ３１１０と比較した、ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を保有する大腸菌株ＭＸＥ００１並びにノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ＤｅｇＰ遺伝子を保有する大腸菌株ＭＸＥ００５の増殖を示す図である。 野生型Ｗ３１１０と比較した、ＭＸＥ００５及びＭＸＥ００１におけるＦａｂ’の発現を示す図である。 野生型Ｗ３１１０と比較した、ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子及びノックアウト変異プロテアーゼＩＩＩを保有する大腸菌株ＭＸＥ００４の増殖を示す図である。 ＭＸＥ００４及びＷ３１１０におけるＦａｂ’の発現を示す図である。 ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０におけるＦａｂの発現を示す図である。 ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００５及び野生型Ｗ３１１０についての発酵実験中の軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖（Ｈ鎖）及びＦａｂ’の発現を示す図である。 Ｆａｂ’の相対的断片化を示す、野生型Ｗ３１１０、ＭＸＥ００１及びＭＸＥ００５についてのウエスタンブロット分析の結果を示す図である。 対照のＷ３１１０と比較したＭＸＥ００１の増殖プロファイルを示す図である。 対照の大腸菌Ｗ３１１０と比較した大腸菌株ＭＸＥ００１由来の上清（点線）及びペリプラズム（実線）からのＦａｂ’収量を示す図である。 対照のＷ３１１０と比較した大腸菌株ＭＸＥ００１の上清及びペリプラズムからの総Ｆａｂ’収量を示す図である。 対照のＷ３１１０と比較した大腸菌株ＭＸＥ００１のＦａｂ’特異的な生産速度を示す図である。 対照のＷ３１１０と比較したＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５の増殖プロファイルを示す図である。 大腸菌株ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０対照の上清（点線）及びペリプラズム（実線）からのＦａｂ’収量を示す図である。 大腸菌株ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５の上清及びペリプラズムからの総Ｆａｂ’収量を示す図である。 大腸菌株ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０対照のＦａｂ’特異的な生産速度を示す図である。 大腸菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＴＯＰ１０、Ｓｔｂｌ３及びＳｕｒｅと比較した大腸菌株Ｗ３１１０、ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５の増殖プロファイルを示す図である。

配列の簡単な説明
配列番号１は、開始コドンの上流に６ヌクレオチドＡＴＧＡＡＣを包含する、変異していないＴｓｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号２は、変異していないＴｓｐタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、開始コドンの上流に６ヌクレオチドＡＴＧＡＡＴを包含する、変異ノックアウトＴｓｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号４は、変異していないプロテアーゼＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号５は、変異していないプロテアーゼＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６は、変異ノックアウトプロテアーゼＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号７は、変異していないＤｅｇＰ遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号８は、変異していないＤｅｇＰタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号９は、変異ＤｅｇＰ遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、変異ＤｅｇＰタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、抗ＴＮＦ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、抗ＴＮＦ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、抗ＴＮＦ抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、抗ＴＮＦ抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、変異Ｔｓｐ遺伝子の領域のためのＡｓｅ Ｉ制限部位を含む３’オリゴヌクレオチドプライマー配列である。
配列番号１６は、変異Ｔｓｐ遺伝子の領域のためのＡｓｅ Ｉ制限部位を含む５’オリゴヌクレオチドプライマー配列である。
配列番号１７は、変異プロテアーゼＩＩＩ遺伝子の領域のためのＡｓｅ Ｉ制限部位を含む３’オリゴヌクレオチドプライマー配列である。
配列番号１８は、変異プロテアーゼＩＩＩ遺伝子の領域のためのＡｓｅ Ｉ制限部位を含む５’オリゴヌクレオチドプライマー配列である。
配列番号１９は、変異ＤｅｇＰ遺伝子の領域のためのＡｓｅ Ｉ制限部位を含む５’オリゴヌクレオチドプライマー配列である。
配列番号２０は、変異ＤｅｇＰ遺伝子の領域のためのＡｓｅ Ｉ制限部位を含む３’オリゴヌクレオチドプライマー配列である。

本発明の第一の態様及び第二の態様において、本発明者らは、１つ又は複数のプロテアーゼ変異を導入するのに必要とされるゲノムへの最小限の変異のみを含む、目的タンパク質を発現するのに適した組換えグラム陰性細菌細胞を提供した。本発明の第一の態様において、細菌細胞は野生型細菌細胞と、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、変異ｐｔｒ並びに変異Ｔｓｐ遺伝子から選択される１つ又は複数の変異プロテアーゼ遺伝子、並びに任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のみが異なる。本発明の第二の態様において、細菌細胞はＴｓｐ及び／又はプロテアーゼＩＩＩのノックアウト変異を含み、ここでＴｓｐ及び／又はプロテアーゼＩＩＩ遺伝子は遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含む。

本発明の第一及び第二の態様により提供される細胞は変異していない細胞と比較して低減されたプロテアーゼ活性を持ち、目的の組換えタンパク質、とりわけタンパク質分解感受性である目的タンパク質のタンパク質分解を低減させることができる。それ故、本発明の第一及び第二の態様により提供されるグラム陰性細胞の１つ又は複数は、変異していない細菌細胞と比較して、インタクトな目的の組換えタンパク質を高収量で及び目的タンパク質のタンパク質分解断片を低収量又は好ましくは無収量で提供することができる。

当業者は、候補の細胞クローンが所望の目的タンパク質収量を持つかを見るために、発酵法、ＥＬＩＳＡ及びタンパク質Ｇ ｈｐｌｃを包含する当該技術分野でよく知られている方法を用いて、当該クローンを試験することが容易に可能であろう。適した発酵法はＨｕｍｐｈｒｅｙｓ Ｄ Ｐら（１９９７）、「大腸菌における二量体Ｆａｂの形成：ヒンジのサイズ及びアイソタイプ、鎖間ジスルフィド結合の存在、Ｆａｂ’発現レベル、尾部の配列並びに増殖条件の影響（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｃ Ｆａｂｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｉｎｇｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｉｓｏｔｙｐｅ，ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｂｏｎｄ，Ｆａｂ’ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ，ｔａｉｌ ｐｉｅｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．）」、Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨ．２０９：１９３〜２０２ページ；Ｂａｃｋｌｕｎｄ Ｅ．Ｒｅｅｋｓ Ｄ．Ｍａｒｋｌａｎｄ Ｋ．Ｗｅｉｒ Ｎ．Ｂｏｗｅｒｉｎｇ Ｌ．Ｌａｒｓｓｏｎ Ｇ．、「大腸菌におけるペリプラズム産物保持のための流加回分の設計（Ｆｅｄｂａｔｃｈ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖ’ｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３５（４）：３５８〜６５ページ、２００８ Ｊｕｌ ３１；Ｃｈａｍｐｉｏｎ ＫＭ．Ｎｉｓｈｉｈａｒａ ＪＣ．Ｊｏｌｙ ＪＣ．Ａｒｎｏｔｔ Ｄ．、「異なる生物製剤の発酵プロセス完了時の大腸菌プロテオームの類似性（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｕｐｏｎ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．）」、［Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ］Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１（９）：１１３３〜４８ページ、２００１ Ｓｅｐ；及びＨｏｒｎ Ｕ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ Ｗ．Ｋｒｅｂｂｅｒ Ａ．Ｋｎｕｐｆｅｒ Ｕ．Ｋｕｊａｕ Ｍ．Ｗｅｎｄｅｒｏｔｈ Ｒ．Ｍｕｌｌｅｒ Ｋ．Ｍａｔｚｋｕ Ｓ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ Ｄ．、「非制限増殖条件下で最適化発現ベクター及び高細胞密度発酵を用いた大腸菌における機能的二量体ミニ抗体の高容積収量（Ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｍｅｒｉｃ ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｕｓｉｎｇ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｎｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｒｔｉｃｌｅ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖ’ｔ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４６（５−６）：５２４〜３２ページ、１９９６ Ｄｅｃ．に記載される。当業者は、タンパク質が正しくフォールドされているかを見るために、タンパク質Ｇ ＨＰＬＣ、円二色法、ＮＭＲ、Ｘ線結晶解析法及びエピトープアフィニティー測定法などの当該技術分野でよく知られている方法を用いて、分泌されるタンパク質を試験することが容易に可能であろう。

本発明の第一及び第二の態様の組換え細菌細胞の１つ又は複数は、変異していない細菌細胞と比較して顕著に改善されたタンパク質収量を示し得る。改善されたタンパク質収量はペリプラズムのタンパク質収量及び／又は上清のタンパク質収量とすることができる。本発明の第一及び第二の態様の組換え細菌細胞の１つ又は複数は、目的タンパク質のより高速な生産が可能であり、それ故、変異していない細菌細胞と比較して同じ量の目的タンパク質がより短い時間で生産され得る。目的タンパク質のより高速な生産は、細胞増殖の初期期間、例えばタンパク質発現の誘導後の最初の５、１０、２０又は３０時間にわたって特に顕著であり得る。

Ｔｓｐ変異、好ましくはノックアウト変異を単独で又はＤｅｇＰ変異若しくはプロテアーゼＩＩＩ変異との組み合わせで含む本発明による細胞がとりわけ好ましい。これらの細胞は変異していない細胞と比較して、目的タンパク質のより高い収量及びより高速な初期収量を示す。変異Ｔｓｐ遺伝子を単独で又は変異ＤｅｇＰ遺伝子又は変異ｐｔｒ遺伝子との組み合わせで含むかかる細胞系の例は、遺伝子型ΔＴｓｐを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＨＰＡ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４４で寄託された変異体大腸菌細胞株ＭＸＥ００１、遺伝子型ΔＴｓｐΔｐｔｒを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＨＰＡ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４７で寄託されたＭＸＥ００４、及び遺伝子型ΔＴｓｐ、ＤｅｇＰ Ｓ２１０Ａを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＨＰＡ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４８で寄託されたＭＸＥ００５である。

さらに本細胞の１つ又は複数は、変異していない細菌細胞と実質的に同じ又は変異していない細菌細胞と比較して改善されたものであってもよい、細胞増殖及び／又は複製を包含する良好な増殖プロファイルを示すことができる。

本発明の第一の態様による細胞のゲノムは、野生型細胞と比較してゲノムへの最小限の破損を持ったものであり、それによって宿主細胞において典型的に見出される、他の細胞性タンパク質の発現に対する他の変異の有害な作用を低減する。したがって、本発明の第一の態様による組換え宿主細胞の１つ又は複数は、ゲノム配列へのさらなる遺伝子改変変異を含む細胞と比較して、改善されたタンパク質発現及び／又は改善された増殖プロファイルを示すことができる。

本発明の第二の態様による細胞のゲノムは、ノックアウト変異を導入するためのゲノムへの最小限の破損を持ったものであり、それによって抗生物質耐性マーカーなどのＤＮＡを挿入することによりプロテアーゼ遺伝子のノックアウトを作出することの有害な作用を低減する。したがって、本発明の第二の態様による組換え宿主細胞の１つ又は複数は、抗生物質耐性マーカーなどのＤＮＡの挿入により作出されるプロテアーゼのノックアウト変異を含む細胞と比較して、改善されたタンパク質発現及び／又は改善された増殖プロファイルを示すことができる。

本発明の第一及び第二の態様により提供される細胞はまた、細胞ゲノムにさらなる破損を含む細胞と比較して、治療タンパク質の生産への使用にもより適している。

本発明は以下に、より詳細に説明される。本明細書に記載される全ての実施形態は、特に他に述べられていない限り、本発明の第一、第二及び第三の態様を参照する。

用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、文脈により別途示されない限り、本明細書で交換可能に用いられる。「ペプチド」は１０以下のアミノ酸を指すことが意図される。

用語「ポリヌクレオチド」としては、文脈により別途示されない限り、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられる。

本明細書で用いられる場合、本明細書の文脈における用語「含む」は「包含する」と解釈されるべきである。

本発明の文脈における変異していない細胞又は対照細胞は、細胞が上述のプロテアーゼ変異を保有するように改変されていない、本発明の組換えグラム陰性細胞と同じタイプの細胞を意味する。例えば、変異していない細胞は野生型細胞であってもよく、１つ又は複数の変異を導入する改変の前の本発明の細胞と同じ宿主細胞集団に由来するものであってもよい。

表現「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」及び「株」は交換可能に用いられる。

本発明の文脈における用語「遺伝的に同質な」は、本発明の細胞のゲノムが、上述の変異プロテアーゼ遺伝子の１つ又は複数、及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて野生型細胞と比較して実質的に同一又は同一のゲノム配列を持つことを意味する。この実施形態において、本発明による細胞は、野生型細胞と比較してさらなる非天然の又は遺伝子改変の変異を含まない。一実施形態において、本発明による細胞は、上述のプロテアーゼ変異及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて、起こり得るあらゆる天然の変異を考慮に入れ、野生型細胞と比較して実質的に同一のゲノム配列を持ってもよい。例えば遺伝子置換ベクターによるプロテアーゼ変異の株への導入の間、及び目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの株への導入の間、ゲノム変異はさらに１つ又は複数、株に導入され得ることにも留意すべきである。したがって、一実施形態において、本発明による細胞は、上述のプロテアーゼ変異及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて、起こり得るあらゆる天然の変異並びにプロテアーゼ変異及び／又は目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入に由来し得る任意のさらなるゲノム変異を考慮に入れ、野生型細胞と比較して実質的に同一のゲノム配列を持ってもよい。

細胞代謝及びＤＮＡ複製に関係する遺伝子変異の例としては、当該技術分野において大腸菌株において一般に用いられるが本発明による細胞において用いられないものであり、ｐｈｏＡ、ｆｈｕＡ、ｌａｃ、ｒｅｃ、ｇａｌ、ａｒａ、ａｒｇ、ｔｈｉ及びｐｒｏが挙げられる。

一実施形態において、本発明による細胞は、上述のプロテアーゼ変異及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて、野生型細胞と比較して正確に同一のゲノム配列を持ってもよい。

本発明の文脈における用語「野生型」は、天然に生じ得る又は環境から単離され得る、いかなる遺伝子改変変異も保有しない、グラム陰性細菌細胞の株を意味する。大腸菌の野生型株の例は、Ｗ３１１０ Ｋ−１２株などのＷ３１１０である。野生型株の例としては、

を包含するＫ−１２株ファミリーの株が挙げられる。野生型の大腸菌株のさらなる例としては、Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）及びＢ株（ＡＴＣＣ２３２２６）が挙げられる。

任意の適したグラム陰性細菌が本発明の組換え細胞を生産するための親細胞として用いられ得る。適したグラム陰性細菌としては、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）及び大腸菌が挙げられる。好ましくは親細胞は大腸菌である。任意の適した大腸菌の株が本発明において親細胞として用いられ得る。適した大腸菌株の例としては、

を含むＫ−１２株ファミリーが挙げられる。さらなる適した大腸菌株としては、Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）及びＢ株（ＡＴＣＣ２３２２６）が挙げられる。好ましくはＫ−１２ Ｗ３１１０などの野生型Ｗ３１１０株が用いられる。

本発明の第一の態様による細胞は、１つ又は複数の変異プロテアーゼ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である。本発明の第二の態様による細胞もまた好ましくは、１つ又は複数の変異プロテアーゼ遺伝子及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除いて野生型細菌細胞と遺伝的に同質である。

好ましい実施形態において、細胞は、上述のプロテアーゼ変異及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて野生型の大腸菌細胞と遺伝的に同質である。より好ましくは、本発明による細胞は、上述のプロテアーゼ変異及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて大腸菌株Ｗ３１１０と遺伝的に同質である。本発明による細胞が上述のプロテアーゼ変異及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて同質遺伝子的であり得る、他の適した野生型の大腸菌細胞の例としては、

を包含するＫ−１２株ファミリーの株が挙げられる。本発明による細胞が上述のプロテアーゼ変異及び任意選択で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを除いて同質遺伝子的であり得る、さらなる適した野生型の大腸菌株の例としては、Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）及びＢ株（ＡＴＣＣ２３２２６）が挙げられる。

本発明の細胞は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことにより、野生型細胞とさらに異なり得る。この実施形態において、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞の中に形質転換される及び／又は宿主細胞のゲノム内に組み込まれる適した発現ベクターの中に含有され得る。目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノム内に挿入される実施形態において、本発明の細胞はまた、挿入される目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に起因して、野生型細胞と異なるであろう。好ましくは、ポリヌクレオチドは細胞において発現ベクターの中にあり、それによって宿主細胞のゲノムへの最小限の破損を引き起こす。

本発明のある特定の実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含む。本明細書で用いられる「ＤｅｇＰ」は、シャペロン及びプロテアーゼとしての二重の機能を持つＤｅｇＰタンパク質（ＨｔｒＡとしても知られる）をコードする遺伝子を意味する（「セリンペプチダーゼのファミリー（Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」；Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＮＤ、Ｂａｒｒｅｔｔ ＡＪ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４；２４４：１９〜６１ページ）。変異していないＤｅｇＰ遺伝子の配列は配列番号７に示され、変異していないＤｅｇＰタンパク質の配列は配列番号８に示される。

低温では、ＤｅｇＰはシャペロンとして機能し、高温ではＤｅｇＰはプロテアーゼとして機能する傾向がある（「広範に保存される熱ショックタンパク質におけるシャペロンからプロテアーゼへの温度依存的スイッチ（Ａ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｒｏｍ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｗｉｄｅｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ．）」、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌｕｍｅ ９７、Ｉｓｓｕｅ ３、３３９〜３４７ページ．Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ、Ｂｅｉｌ Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ Ｍ）及び「大腸菌からのＨｔｒＡ（ＤｅｇＰ）タンパク質の低温でのタンパク質分解活性（Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＨｔｒＡ（ＤｅｇＰ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｔ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ）」、Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｏｎｅｋ Ｊら Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００８、１５４、３６４９〜３６５８ページ）。

細胞がＤｅｇＰ変異を含む実施形態において、細胞におけるＤｅｇＰ変異は、シャペロン活性を持つが完全なプロテアーゼ活性を持たないＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を提供する。

本発明の文脈における表現「シャペロン活性を持つ」は、変異ＤｅｇＰタンパク質が野生型の変異していないＤｅｇＰタンパク質と比較して同じ又は実質的に同じシャペロン活性を持つことを意味する。好ましくは、変異ＤｅｇＰ遺伝子は、野生型の変異していないＤｅｇＰタンパク質の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上のシャペロン活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする。より好ましくは、変異ＤｅｇＰ遺伝子は、野生型ＤｅｇＰと比較して同じシャペロン活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする。

本発明の文脈における表現「低減されたプロテアーゼ活性を持つ」は、変異ＤｅｇＰタンパク質が野生型の変異していないＤｅｇＰタンパク質と比較して完全なプロテアーゼ活性を持たないことを意味する。好ましくは、変異ＤｅｇＰ遺伝子は、野生型の変異していないＤｅｇＰタンパク質の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下又は５％以下のプロテアーゼ活性しか持たないＤｅｇＰタンパク質をコードする。より好ましくは、変異ＤｅｇＰ遺伝子はプロテアーゼ活性を持たないＤｅｇＰタンパク質をコードする。細胞は染色体のＤｅｇＰを欠損していない、すなわちＤｅｇＰ遺伝子配列がいずれの形態のＤｅｇＰタンパク質の発現も妨げるようには欠失又は変異されていない。

シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つタンパク質を生産するため、任意の適した変異がＤｅｇＰ遺伝子中に導入され得る。グラム陰性細菌から発現されるＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ及びシャペロン活性は、当業者により、ＤｅｇＰのプロテアーゼ活性及びシャペロン活性がＤｅｇＰの天然の基質であるＭａｌＳに対して試験されたＳｐｉｅｓｓらに記載された方法（「広範に保存される熱ショックタンパク質におけるシャペロンからプロテアーゼへの温度依存的スイッチ（Ａ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｒｏｍ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｗｉｄｅｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ．）」、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌｕｍｅ ９７、Ｉｓｓｕｅ ３、３３９〜３４７ページ．Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ、Ｂｅｉｌ Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ Ｍ）、及び「大腸菌からのＨｔｒＡ（ＤｅｇＰ）タンパク質の低温でのタンパク質分解活性（Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＨｔｒＡ（ＤｅｇＰ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｔ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ）」、Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｏｎｅｋ Ｊら Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００８、１５４、３６４９〜３６５８ページに記載された方法などの任意の適切な方法により、容易に試験され得る。

ＤｅｇＰはセリンプロテアーゼであり、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０のアミノ酸残基の触媒三残基からなる活性中心を持つ（「セリンペプチダーゼのファミリー（Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９４、２４４：１９〜６１ページ Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ及びＢａｒｒｅｔｔ Ａ）。シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つタンパク質を生産するためのＤｅｇＰ変異は、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０のうちの１、２又は３個へのミスセンス変異などの変異を含むことができる。したがって、変異ＤｅｇＰ遺伝子は以下を含むことができる。
・ Ｈｉｓ１０５への変異、又は
・ Ａｓｐ１３５への変異、又は
・ Ｓｅｒ２１０への変異、又は
・ Ｈｉｓ１０５及びＡｓｐ１３５への変異、又は
・ Ｈｉｓ１０５及びＳｅｒ２１０への変異、又は
・ Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０への変異、又は
・ Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０への変異

Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０のうちの１、２又は３個は、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つタンパク質をもたらす任意の適したアミノ酸へと変異され得る。例えばＨｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０のうちの１、２又は３個は、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小さいアミノ酸へと変異され得る。さらなる適した変異は、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０のうちの１、２又は３個を逆の性質を持つアミノ酸へと変化させることであり、それはＡｓｐ１３５のＬｙｓ又はＡｒｇへの変異、極性のＨｉｓ１０５のＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ又はＬｅｕなどの非極性アミノ酸への変異、及び小さな親水性のＳｅｒ２１０のＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ又はＴｙｒなどの大きな又は疎水性の残基への変異などである。好ましくは、ＤｅｇＰ遺伝子は図１ｃに示されるような点変異Ｓ２１０Ａを含み、この変異はシャペロン活性を持つがプロテアーゼ活性を持たないタンパク質を生産することが見出された（「広範に保存される熱ショックタンパク質におけるシャペロンからプロテアーゼへの温度依存的スイッチ（Ａ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｒｏｍ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｗｉｄｅｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ．）」、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌｕｍｅ ９７、Ｉｓｓｕｅ ３、３３９〜３４７ページ．Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ、Ｂｅｉｌ Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ Ｍ）。

本発明はまた、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供するが、ここでＤｅｇＰ遺伝子は上で論じられたようにＨｉｓ１０５への変異、又はＡｓｐ１３５への変異、又はＨｉｓ１０５及びＡｓｐ１３５への変異、又はＨｉｓ１０５及びＳｅｒ２１０への変異、又はＡｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０への変異、又はＨｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０への変異を含む。

ＤｅｇＰは２個のＰＤＺドメイン、ＰＤＺ１（残基２６０〜３５８）及びＰＤＺ２（残基３５９〜４４８）を持ち、これらはタンパク質−タンパク質相互作用を仲介する（「広範に保存される熱ショックタンパク質におけるシャペロンからプロテアーゼへの温度依存的スイッチ（Ａ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｒｏｍ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｗｉｄｅｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ．）」、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌｕｍｅ ９７、Ｉｓｓｕｅ ３、３３９〜３４７ページ．Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ、Ｂｅｉｌ Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ Ｍ）。本発明の一実施形態において、ｄｅｇＰ遺伝子はＰＤＺ１ドメイン及び／又はＰＤＺ２ドメインを欠失するように変異される。ＰＤＺ１及びＰＤＺ２の欠失はＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ活性の全喪失及び野生型のＤｅｇＰタンパク質と比較して低下したシャペロン活性をもたらす一方、ＰＤＺ１又はＰＤＺ２いずれかの欠失は野生型のＤｅｇＰタンパク質と比較して５％のプロテアーゼ活性及び同様のシャペロン活性をもたらす（「広範に保存される熱ショックタンパク質におけるシャペロンからプロテアーゼへの温度依存的スイッチ（Ａ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｒｏｍ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ ａ Ｗｉｄｅｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ．）」、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌｕｍｅ ９７、Ｉｓｓｕｅ ３、３３９〜３４７ページ．Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ、Ｂｅｉｌ Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ Ｍ）。

本発明はまた、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供するが、ここでｄｅｇＰ遺伝子は上で論じられたようにＰＤＺ１ドメイン及び／又はＰＤＺ２ドメインを欠失するように変異される。

変異ＤｅｇＰ遺伝子はまた、例えば図１ｃに示されるように、同定及びスクリーニング方法において役立つためにＡｓｅ Ｉなどのサイレントな非天然の制限部位を含むことができる。

点変異Ｓ２１０Ａ及びＡｓｅ Ｉ制限マーカー部位を含む変異ＤｅｇＰ遺伝子の好ましい配列は配列番号９に示され、コードされるタンパク質配列は配列番号１０に示される。配列番号９の変異ＤｅｇＰ配列において作製された変異は図１ｃに示される。

細胞がシャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含む本発明の実施形態において、本発明により提供される細胞の１つ又は複数は、ＤｅｇＰ遺伝子が染色体欠損のＤｅｇＰなどのＤｅｇＰの発現を妨げるノックアウトのＤｅｇＰへと変異している変異細胞と比べて、正しくフォールドされたタンパク質の細胞からの改善された収量を提供することができる。ＤｅｇＰの発現を妨げるノックアウト変異ＤｅｇＰ遺伝子を含む細胞においてＤｅｇＰのシャペロン活性は全て失われる一方、本発明による細胞においては、完全なプロテアーゼ活性は失われるもののＤｅｇＰのシャペロン活性は保持される。これらの実施形態において、本発明による１つ又は複数の細胞はより低いプロテアーゼ活性を持ってタンパク質のタンパク質分解を妨げる一方、シャペロン活性を維持して宿主細胞におけるタンパク質の正しいフォールディング及び輸送を実現する。

当業者は、タンパク質が正しくフォールドされているかを見るために、タンパク質Ｇ ＨＰＬＣ、円二色法、ＮＭＲ、Ｘ線結晶解析法及びエピトープアフィニティー測定法などの当該技術分野でよく知られている方法を用いて、分泌されるタンパク質を試験することが容易に可能であろう。

これらの実施形態において、本発明による１つ又は複数の細胞は、ＤｅｇＰの発現を妨げる変異ノックアウトＤｅｇＰ遺伝子を保有する細胞と比較して改善された細胞増殖を持つことができる。理論に縛られるのを望むことなく、シャペロン活性を必要とする全てのタンパク質を処理する細胞の能力を増加させることができるシャペロン活性を保持するＤｅｇＰプロテアーゼに起因して、改善された細胞増殖が表され得る。したがって、細胞の増殖及び複製のために必要な正しくフォールドされたタンパク質の生産は、本発明の細胞の１つ又は複数においてＤｅｇＰノックアウト変異を保有する細胞と比較して増加させることができ、それによって増殖を制御する細胞経路を改善する。さらに、既知のＤｅｇＰプロテアーゼ欠損株は一般に温度感受性で、典型的にはおよそ２８℃より高い温度で増殖しない。一方、本発明による細胞は温度感受性でなく、細菌からのタンパク質の工業規模生産に典型的に用いられるおよそ３０℃〜およそ３７℃の温度を包含する、２８℃以上の温度で増殖させることができる。

本発明のある特定の実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を含む。本明細書で用いられる「ｐｔｒ遺伝子」は、高分子量のタンパク質を分解するプロテアーゼであるプロテアーゼＩＩＩをコードする遺伝子を意味する。変異していないｐｔｒ遺伝子の配列は配列番号４に示され、変異していないプロテアーゼＩＩＩタンパク質の配列は配列番号５に示される。

本発明のある特定の実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含む。本明細書で用いられる「Ｔｓｐ遺伝子」は、ペニシリン結合タンパク質−３（ＰＢＰ３）及びファージ尾部タンパク質に対して働くことが可能なペリプラズムのプロテアーゼであるプロテアーゼＴｓｐ（Ｐｒｃとしても知られる）をコードする遺伝子を意味する。変異していないＴｓｐ遺伝子の配列は配列番号１に示され、変異していないＴｓｐタンパク質の配列は配列番号２に示される。

本発明の第一の態様において、変異ｐｔｒ遺伝子又はプロテアーゼＩＩＩをコードする変異ｐｔｒ遺伝子というのは、別途示されていない限り、低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする変異ｐｔｒ遺伝子又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子のいずれかをいう。

本発明の第一の態様において、変異Ｔｓｐ遺伝子又はＴｓｐをコードする変異Ｔｓｐ遺伝子というのは、別途示されていない限り、低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子のいずれかをいう。

本発明の第一の態様において、本発明の文脈における表現「低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする変異ｐｔｒ遺伝子」及び「低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子」は、変異ｐｔｒ遺伝子又は変異Ｔｓｐ遺伝子が野生型の変異していないｐｔｒ遺伝子又はＴｓｐ遺伝子と比較して完全なプロテアーゼ活性を持たないことを意味する。

本発明の第一の態様において、好ましくは、変異ｐｔｒ遺伝子は野生型の変異していないプロテアーゼＩＩＩタンパク質の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下又は５％以下のプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩをコードする。より好ましくは、変異ｐｔｒ遺伝子はプロテアーゼ活性を持たないプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードする。この実施形態において、細胞は染色体のｐｔｒを欠損していない、すなわちｐｔｒ遺伝子配列はいずれの形態のプロテアーゼＩＩＩタンパク質の発現も妨げるようには欠失又は変異されていない。

低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩタンパク質を生産するため、任意の適した変異がｐｔｒ遺伝子中に導入され得る。グラム陰性細菌から発現されるプロテアーゼＩＩＩタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者により、当該技術分野における任意の適した方法により、容易に試験され得る。

本発明の第一の態様において、好ましくは、変異Ｔｓｐ遺伝子は野生型の変異していないＴｓｐタンパク質の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下又は５％以下のプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードする。より好ましくは、変異Ｔｓｐ遺伝子はプロテアーゼ活性を持たないＴｓｐタンパク質をコードする。この実施形態において、細胞は染色体のＴｓｐを欠損していない、すなわちＴｓｐ遺伝子配列はいずれの形態のＴｓｐタンパク質の発現も妨げるようには欠失又は変異されていない。

低減されたプロテアーゼ活性を持つタンパク質を生産するため、任意の適した変異がＴｓｐ遺伝子中に導入され得る。グラム陰性細菌から発現されるＴｓｐタンパク質のプロテアーゼ活性は当業者により、Ｔｓｐのプロテアーゼ活性が試験されたＫｅｉｌｅｒらに記載された方法（「Ｔｓｐプロテアーゼ^＊の活性部位残基の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｓｐ Ｐｒｏｔｅａｓｅ^＊）」、ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２７０、Ｎｏ．４８、Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １、２８８６４〜２８８６８ページ、１９９５ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｃ．Ｋｅｉｌｅｒ及びＲｏｂｅｒｔ Ｔ．Ｓａｕｅｒ）などの当該技術分野における任意の適した方法により、容易に試験され得る。

ＴｓｐはＫｅｉｌｅｒら（上記）において残基Ｓ４３０、Ｄ４４１及びＫ４５５を含む活性部位を持つものとして報告されており、残基Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３及びＴ４５２はＴｓｐの構造を維持するのに重要である。Ｋｅｉｌｅｒら（上記）は、変異Ｔｓｐ遺伝子Ｓ４３０Ａ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ及びＴ４５２Ａは検出可能なプロテアーゼ活性を持たなかったという知見を報告する。変異Ｔｓｐ遺伝子Ｓ４３０Ｃはおよそ５〜１０％の野生型活性を呈したことがさらに報告されている。したがって、低減されたプロテアーゼ活性を持つタンパク質を生産するためのＴｓｐ変異は、残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３及びＴ４５２の１つ又は複数へのミスセンス変異などの変異を含むことができる。好ましくは、低減されたプロテアーゼ活性を持つタンパク質を生産するためのＴｓｐ変異は、活性部位残基Ｓ４３０、Ｄ４４１及びＫ４５５の１、２又は３個全てへのミスセンス変異などの変異を含むことができる。

したがって、変異Ｔｓｐ遺伝子は以下を含むことができる。
・ Ｓ４３０への変異、又は
・ Ｄ４４１への変異、又は
・ Ｋ４５５への変異、又は
・ Ｓ４３０及びＤ４４１への変異、又は
・ Ｓ４３０及びＫ４５５への変異、又は
・ Ｄ４４１及びＫ４５５への変異、又は
・ Ｓ４３０、Ｄ４４１及びＫ４５５への変異

Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３及びＴ４５２の１つ又は複数は、低減されたプロテアーゼ活性を持つタンパク質をもたらす任意の適したアミノ酸へと変異され得る。適した変異の例はＳ４３０Ａ、Ｓ４３０Ｃ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ及びＴ４５２Ａである。変異Ｔｓｐ遺伝子は活性部位残基への１、２又は３個の変異を含むことができ、例えば遺伝子は以下を含むことができる。
・ Ｓ４３０Ａ若しくはＳ４３０Ｃ、及び／又は
・ Ｄ４４１Ａ及び／又は
・ Ｋ４５５Ａ若しくはＫ４５５Ｈ若しくはＫ４５５Ｒ

好ましくは、Ｔｓｐ遺伝子は点変異Ｓ４３０Ａ又はＳ４３０Ｃを含む。

本発明はまた、変異Ｔｓｐ遺伝子を含む組換えグラム陰性細菌細胞を提供するが、ここで変異Ｔｓｐ遺伝子は低減されたプロテアーゼ活性を持つＴｓｐタンパク質をコードし、Ｔｓｐ遺伝子は上で論じられたように残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３及びＴ４５２の１つ又は複数へのミスセンス変異などの変異を含む。

本発明の第一の態様において、本発明の文脈における表現「ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子」及び「ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子」は、遺伝子が１つ又は複数の変異を含み、それによって遺伝子によりコードされるタンパク質の無発現を引き起こして、ノックアウト変異遺伝子によりコードされるタンパク質を欠損した細胞を提供することを意味する。ノックアウト遺伝子は部分的に又は全てが転写され得るが、コードされるタンパク質には翻訳され得ない。

本発明の第一の態様において、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子及び／又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は、任意の適した方法で、例えば１つ又は複数の欠失変異、挿入変異、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異及びフレームシフト変異により変異され得るものであり、タンパク質の無発現を引き起こす。例えば、遺伝子は抗生物質耐性マーカーなどの外来ＤＮＡ配列の遺伝子コード配列中への挿入によりノックアウトされ得る。

本発明の第一の態様の好ましい実施形態において、遺伝子は抗生物質耐性マーカーなどの外来ＤＮＡ配列の遺伝子コード配列中への挿入により変異されない。好ましくはＴｓｐ遺伝子及び／又はプロテアーゼＩＩＩ遺伝子は、遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含み、それによってＴｓｐタンパク質及び／又はプロテアーゼＩＩＩタンパク質の発現を妨げる。

本発明の第二の態様による細胞はＴｓｐ及び／又はプロテアーゼＩＩＩのノックアウト変異を含み、ここでＴｓｐ遺伝子及び／又はプロテアーゼＩＩＩ遺伝子は遺伝子開始コドンへの変異並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含み、それによってＴｓｐタンパク質及び／又はプロテアーゼＩＩＩタンパク質の発現を妨げる。

標的ノックアウト遺伝子の開始コドンへの変異は開始コドンの機能の喪失を引き起こし、それによって標的遺伝子がコード配列の開始部に適した開始コドンを含まないことが確実となる。開始コドンへの変異は、開始コドンのヌクレオチドの１、２又は３個全てのミスセンス変異であってもよい。代替的に又は付加的に、開始コドンは挿入又は欠失フレームシフト変異により変異されてもよい。

ｐｔｒ遺伝子及びＴｓｐ遺伝子はＡＴＧ開始コドンを各々含む。ＡＴＧコドン２個がコード配列の５’末端に存在するＴｓｐ遺伝子において見出されるように、遺伝子が適切に位置する開始コドンを２個以上含む場合、ＡＴＧコドンの１個又は両方がミスセンス変異により変異され得る。

好ましい実施形態において、ｐｔｒ遺伝子は図１ａに示されるようにＡＴＧ開始コドンをＡＴＴへと変化させるよう変異される。好ましい実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は図１ｂに示されるように２番目のＡＴＧコドン（コドン３）がＴＣＧへと変異される。

ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子及び／又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ又は複数の停止コドンを代替的に又は付加的に含むことができる。好ましくはノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子及び／又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は、開始コドン及び１つ又は複数の挿入される停止コドンの両方へのミスセンス変異を含む。

１つ又は複数の挿入される停止コドンは好ましくはインフレームの停止コドンである。しかしながら、１つ又は複数の挿入される停止コドンは、代替的に又は付加的にフレーム外の停止コドンであってもよい。１つ又は複数のフレーム外の停止コドンは、フレーム外の開始コドンが挿入又は欠失フレームシフト変異によりインフレームの開始コドンへと変化する翻訳を停止するのに必要とされ得る。１つ又は複数の停止コドンは、ナンセンス点変異及びフレームシフト変異を包含する任意の適した変異により導入され得る。１つ又は複数の停止コドンは好ましくはフレームシフト変異及び／又は挿入変異により、好ましくは遺伝子配列のセグメントを停止コドンを含む配列で置換することにより導入される。例えばＡｓｅ Ｉ制限部位が挿入されてもよく、これは停止コドンＴＡＡを含む。

好ましい実施形態において、ｐｔｒ遺伝子は図１ａに示されるように、Ａｓｅ Ｉ制限部位の挿入によりインフレームの停止コドンを挿入するよう変異される。

好ましい実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は図１ｂに示されるように５番目のコドンから「Ｔ」を欠失するように変異され、それによってコドン１１及び１６に停止コドンをもたらすフレームシフトを引き起こす。好ましい実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は図１ｂに示されるようにＡｓｅ Ｉ制限部位を挿入するように変異され、コドン２１に３個目のインフレームの停止コドンを作出する。

好ましい実施形態において、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子は配列番号６のＤＮＡ配列を持つ。配列番号６のノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子配列において作製された変異は図１ａに示される。

好ましい実施形態において、ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は配列番号３のＤＮＡ配列を持ち、これは開始コドンの上流に６ヌクレオチドＡＴＧＡＡＴを包含する。配列番号３のノックアウト変異Ｔｓｐ配列において作製された変異は図１ｂに示される。一実施形態において、変異Ｔｓｐ遺伝子は配列番号３のヌクレオチド７〜２０４８のＤＮＡ配列を持つ。

上記のノックアウト変異は有利であり、その理由はこれらの変異が標的のノックアウト遺伝子部位の上流又は下流の染色体ＤＮＡに最小限の破損を引き起こす又は破損を引き起こさず、細胞の目的タンパク質、とりわけ治療タンパク質の発現への適合性に影響を及ぼす可能性がある抗生物質耐性マーカーなどの外来ＤＮＡの挿入及び保持を必要としないためである。したがって、本発明による細胞の１つ又は複数は、プロテアーゼ遺伝子が外来ＤＮＡの遺伝子コード配列中への挿入によりノックアウトされた細胞と比較して、改善された増殖プロファイル及び／又はタンパク質発現を示すことができる。

ノックアウト変異を包含する多くの遺伝子改変変異は、成功裏に変異した細胞の選択及び同定を実現する抗生物質耐性マーカーの使用に関与する。しかしながら上で論じたように、抗生物質耐性マーカーを用いることには多数の不利点がある。

本発明のさらなる実施形態は、抗生物質耐性マーカーを用いることについての上述の不利点を克服するもので、ここではシャペロン活性を持つがプロテアーゼ活性を持たないＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、プロテアーゼＩＩＩをコードする変異ｐｔｒ遺伝子及びプロテアーゼＴｓｐをコードする変異Ｔｓｐ遺伝子の１つ又は複数から選択される変異プロテアーゼ遺伝子が制限マーカー部位を１つ又は複数含むように変異される。制限部位は遺伝子の中に遺伝子改変されるもので、非天然である。制限マーカー部位は、必要とされる染色体の変異を含む正しく改変された細胞のスクリーニング及び同定を実現することから、有利である。変異プロテアーゼ遺伝子を１つ又は複数保有するように改変された細胞は、細胞溶解液からのゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、非天然の制限マーカー部位を含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド対を用いて分析され得る。増幅されたＤＮＡは次いでアガロースゲル電気泳動により、ＤＮＡを非天然の制限マーカー部位で消化することが可能な適した制限酵素とのインキュベーションの前後に分析され得る。制限酵素とのインキュベーション後のＤＮＡ断片の存在は、細胞が変異プロテアーゼ遺伝子を１つ又は複数保有するように改変することに成功したことを裏付ける。

ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子が配列番号６のＤＮＡ配列を持つ実施形態において、配列番号１７及び配列番号１８に示されるオリゴヌクレオチドプライマー配列は、形質転換された細胞のゲノムＤＮＡから非天然のＡｓｅ Ｉ制限部位を含むＤＮＡの領域を増幅するのに用いられ得る。増幅されたゲノムＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ中の変異ｐｔｒ遺伝子の存在を確認するため、次いでＡｓｅ Ｉ制限酵素とインキュベートされ、ゲル電気泳動により分析され得る。

ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が配列番号３又は配列番号３のヌクレオチド７〜２０４８のＤＮＡ配列を持つ実施形態において、配列番号１５及び配列番号１６に示されるオリゴヌクレオチドプライマー配列は、形質転換された細胞のゲノムＤＮＡから非天然のＡｓｅ Ｉ制限部位を含むＤＮＡの領域を増幅するのに用いられ得る。増幅されたゲノムＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ中の変異Ｔｓｐ遺伝子の存在を確認するため、次いでＡｓｅ Ｉ制限酵素とインキュベートされ、ゲル電気泳動により分析され得る。

変異ＤｅｇＰ遺伝子が配列番号９のＤＮＡ配列を持つ実施形態において、配列番号１９及び配列番号２０に示されるオリゴヌクレオチドプライマー配列は、形質転換された細胞のゲノムＤＮＡから非天然のＡｓｅ Ｉ制限部位を含むＤＮＡの領域を増幅するのに用いられ得る。増幅されたゲノムＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ中の変異ＤｅｇＰ遺伝子の存在を確認するため、次いでＡｓｅ Ｉ制限酵素とインキュベートされ、ゲル電気泳動により分析され得る。

１つ又は複数の制限部位は、１つ又は複数の欠失変異、挿入変異、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異及びフレームシフト変異を包含する任意の適した変異により導入され得る。制限部位は上記のように開始コドンの変異及び／又は１つ若しくは複数の停止コドンを導入する変異により導入され得る。この実施形態は、制限マーカー部位が、導入されるノックアウト変異の直接的な固有のマーカーであることから、有利である。

Ａｓｅ Ｉ制限部位などのインフレームの停止コドンを含む制限マーカー部位が挿入され得る。これは、挿入される制限部位が制限マーカー部位及び遺伝子コード配列の完全な転写を妨げるための停止コドンの両方として作用することから、とりわけ有利である。例えば、図１ａに示されるような停止コドンがＡｓｅ Ｉ部位の導入によりｐｔｒ遺伝子に導入される実施形態において、この挿入は制限部位をも作出する。例えば、図１ｂに示されるような停止コドンがＡｓｅ Ｉ部位の導入によりＴｓｐ遺伝子にコドン２１で導入される実施形態において、この挿入は制限部位をも作出する。

制限マーカー部位は、開始コドンへの変異及び任意選択で１つ又は複数のさらなる点変異により挿入され得る。この実施形態において、制限マーカー部位は好ましくはＥｃｏＲ Ｉ制限部位である。これは、開始コドンへの変異は制限マーカー部位をも作出することから、とりわけ有利である。例えば、図１ａに示されるようなｐｔｒ遺伝子の開始コドンがＡＴＴへと変化している実施形態において、この変化はＥｃｏＲ Ｉマーカー部位を作出する。例えば、図１ｂに示されるようなＴｓｐ遺伝子の開始コドン（コドン３）がＡＴＧからＴＣＧへと変化している実施形態において、図１ｂに示されるようなコドン２のＡＡＣからＡＡＴへのさらなる点変異及びコドン３のＡＴＧからＴＣＧへの変異はＥｃｏＲ Ｉ制限マーカー部位を作出する。

ＤｅｇＰ遺伝子において、マーカー制限部位はサイレントなコドン変化を用いて導入され得る。例えば、図１ｃに示されるようにＡｓｅ Ｉ部位がサイレントな制限マーカー部位として用いられ得るが、ここでＴＡＡ停止コドンはフレーム外である。

ｐｔｒ遺伝子及び／又はＴｓｐ遺伝子が低減されたプロテアーゼ活性を持つプロテアーゼＩＩＩ又はＴｓｐをコードするように変異される本発明の実施形態において、１つ又は複数のマーカー制限部位がサイレントなコドン変化を用いて導入され得る。

本発明による組換えグラム陰性細菌細胞は任意の適した手段により生産され得る。当業者は染色体の遺伝子配列を変異遺伝子配列で置換するのに用いられ得る、適した技術を知っている。相同組換えによる宿主染色体内への組み込みを実現する、適したベクターが利用され得る。

適した遺伝子置換法は、例えばＨａｍｉｌｔｏｎら（「大腸菌において欠失及び遺伝子置換を生成する新たな方法（Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃ．Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔ．１９８９、Ｖｏｌ．１７１、Ｎｏ．９ ４６１７〜４６２２ページ）、Ｓｋｏｒｕｐｓｋｉら（「対立遺伝子交換のためのポジティブ選択ベクター（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ）」、Ｓｋｏｒｕｐｓｋｉ Ｋ及びＴａｙｌｏｒ Ｒ．Ｋ．、Ｇｅｎｅ、１９９６、１６９、４７〜５２ページ）、Ｋｉｅｌら（「相同組換え及びプラスミド分離による大腸菌変異株の構築のための一般的方法（Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）」、Ｋｉｅｌ Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９８７、２０７：２９４〜３０１ページ）、Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら（「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓａｃＢ遺伝子及び温度感受性のｐＳＣ１０１レプリコンを用いた大腸菌における対立遺伝子交換（Ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓａｃＢ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐＳＣ１０１ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）」、Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄ Ｉ．Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９１、５（６）、１４４７〜１４５７ページ）及びＲｉｅｄら（「グラム陰性細菌においてマーカー変換・追い出し変異誘発により部位特異的未標識変異を構築するためのｎｐｔＩ−ｓａｃＢ−ｓａｃＲカートリッジ（Ａｎ ｎｐｔＩ−ｓａｃＢ−ｓａｃＲ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔｅｄ， ｕｎｍａｒｋｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｍａｒｋｅｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ−ｅｖｉｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」、Ｒｉｅｄ Ｊ．Ｌ．及びＣｏｌｌｍｅｒ Ａ．、Ｇｅｎｅ ５７（１９８７）２３９〜２４６ページ）に記載される。相同組換え／置換を可能にする適したプラスミドはｐＫＯ３プラスミドである（Ｌｉｎｋら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７９、６２２８〜６２３７ページ）。

変異に成功した株は、コロニーＰＣＲ ＤＮＡシークエンシング及びコロニーＰＣＲ制限酵素マッピングを包含する当該技術分野でよく知られている方法を用いて同定され得る。

細胞が変異プロテアーゼ遺伝子の２個又は３個を含む実施形態において、変異プロテアーゼはグラム陰性細菌の中に同一の又は異なるベクター上で導入され得る。

一実施形態において、本発明は、遺伝子型ΔＴｓｐを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＨＰＡ）、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、６１ Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ Ａｖｅｎｕｅ、ロンドン、ＮＷ９ ５ＥＱ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４４で寄託された変異体大腸菌細胞株ＭＸＥ００１を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、遺伝子型Δｐｔｒを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＨＰＡ）、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、６１ Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ Ａｖｅｎｕｅ、ロンドン、ＮＷ９ ５ＥＱ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４５で寄託された変異体大腸菌細胞株ＭＸＥ００２を提供する。一実施形態において、本発明は、遺伝子型ＤｅｇＰ Ｓ２１０Ａを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＨＰＡ）、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、６１ Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ Ａｖｅｎｕｅ、ロンドン、ＮＷ９ ５ＥＱ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４６で寄託された変異体大腸菌細胞株ＭＸＥ００３を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、遺伝子型ΔＴｓｐΔｐｔｒを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＨＰＡ）、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、６１ Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ Ａｖｅｎｕｅ、ロンドン、ＮＷ９ ５ＥＱ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４７で寄託された変異体大腸菌細胞株ＭＸＥ００４を提供する。

一実施形態において、本発明は、遺伝子型ΔＴｓｐ、ＤｅｇＰ Ｓ２１０Ａを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＨＰＡ）、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、６１ Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ Ａｖｅｎｕｅ、ロンドン、ＮＷ９ ５ＥＱ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４８で寄託された変異体大腸菌細胞株ＭＸＥ００５を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、遺伝子型Δｐｔｒ、ＤｅｇＰ Ｓ２１０Ａを持ち、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＨＰＡ）、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、６１ Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ Ａｖｅｎｕｅ、ロンドン、ＮＷ９ ５ＥＱ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４９で寄託された変異体大腸菌細胞株ＭＸＥ００６を提供する。

一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｏｍｐＴの欠損などのノックアウト変異ｏｍｐＴ遺伝子を保有しない。一実施形態において、本発明による細胞は、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子及び／又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子のほかに任意のさらなるノックアウト変異プロテアーゼ遺伝子を保有しない。

本発明による細胞は目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むことができる。目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は外因性であっても内因性であってもよい。目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は宿主の染色体内に組み込まれてもよく、組み込まれない状態でベクター、典型的にプラスミド中にあってもよい。

一実施形態において、本発明による細胞は目的タンパク質を発現する。本明細書の文脈における「目的タンパク質」は、発現のためのポリペプチド、通常は組換えポリペプチドをいうことが意図される。しかしながら、目的タンパク質は、宿主細胞中の内因性遺伝子から発現される内因性タンパク質であってもよい。

本明細書で用いられる「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築又は生産されるタンパク質をいう。目的タンパク質は、内因性タンパク質若しくは例えば減弱された生物活性を有するその変異バージョン又はそれらの断片と同一な、外因性ベクターから発現される外因性の配列とすることができる。代替として、目的タンパク質は、正常時には宿主細胞により発現されない異種タンパク質であってもよい。

目的タンパク質は、治療的、予防的又は診断的タンパク質を包含する任意の適したタンパク質とすることができる。

一実施形態において、目的タンパク質は、炎症性疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維性障害並びにがんを包含する疾患又は障害の治療において有用である。

用語「炎症性疾患」又は「障害」及び「免疫疾患又は障害」は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックル・ウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植及び移植片対宿主疾患を包含する。

用語「線維性障害」は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は皮膚硬化症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧、末期腎疾患、腹膜線維症（連続的携帯式腹膜透析）、肝硬変、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、心臓反応性線維症、瘢痕、ケロイド、熱傷、皮膚潰瘍、血管形成、冠動脈バイパス外科手術、関節形成及び白内障の外科手術を包含する。

用語「がん」は、上皮から生じ、皮膚、又はより一般には例えば乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱又は腸といった生体器官の内膜に見出される悪性新生物を包含する。がんは隣接する組織へと浸潤し、例えば骨、肝臓、肺又は脳といった遠位の器官に伝播する（転移する）傾向がある。

タンパク質は、タンパク質分解感受性のポリペプチド、すなわち天然状態において又は分泌の間のいずれかで、大腸菌などのグラム陰性細菌の１つ又は複数のプロテアーゼにより切断されやすい、切断感受性の、又は切断されるタンパク質とすることができる。一実施形態において、目的タンパク質はＤｅｇＰ、プロテアーゼＩＩＩ及びＴｓｐから選択されるプロテアーゼに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、目的タンパク質はプロテアーゼＤｅｇＰ及びプロテアーゼＩＩＩに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、目的タンパク質はプロテアーゼＤｅｇＰ及びＴｓｐに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、目的タンパク質はプロテアーゼＴｓｐ及びプロテアーゼＩＩＩに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、目的タンパク質はプロテアーゼＤｅｇＰ、プロテアーゼＩＩＩ及びＴｓｐに対してタンパク質分解感受性である。

好ましくはタンパク質は真核生物のポリペプチドである。

本発明による細胞により発現される目的タンパク質は、例えば免疫原、２個の異種タンパク質を含む融合タンパク質又は抗体とすることができる。目的タンパク質として使用する抗体としては、モノクローナル抗体、多価抗体、多特異的抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はキメラ抗体が挙げられる。抗体は任意の種からのものであることが可能であるが、好ましくはモノクローナル抗体、ヒト抗体又はヒト化断片に由来する。抗体は免疫グロブリン分子の任意のクラス（例としてＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＡ）又はサブクラスに由来することが可能で、例えばマウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを包含する任意の種から取得され得る。抗体断片のパーツは２以上の種から取得され得るものであり、例えば抗体断片はキメラであってもよい。１つの例において、定常領域はある種から、可変領域は別の種からのものである。

抗体は、全長の重鎖及び軽鎖を持つ完全な抗体分子、又は例としてＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ−Ｆｖ、又はＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３３１に記載されるようなＦａｂ−ｄＡｂなどの二重特異性抗体といった完全な抗体分子の断片とすることができる。

抗体は任意の標的抗原に特異的であり得る。抗原は例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質といった細胞関連タンパク質であってもよく、又は抗原は可溶性タンパク質であってもよい。目的の抗原はまた、例えば受容体及び／又はその対応するリガンドといった、疾患又は感染症の間に上方制御されるタンパク質などの医学的に関連のある任意のタンパク質であってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例としては、例えばβ１インテグリンなどのインテグリンや例としてＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチンといった接着分子、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ジュジュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、並びに適切な場合はそれらの受容体が挙げられる。

可溶性抗原としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６又はＩＬ１７Ａ及び／若しくはＩＬ１７ＦなどのＩＬ−１７などのインターロイキン、例えば呼吸合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原といったウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られた）、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子並びにＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、並びに適切な場合はそれらの受容体が挙げられる。他の抗原としては、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロリズム剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が挙げられる。

一実施形態において、抗体は目的抗原の活性を機能的に変えるのに用いられ得る。例えば抗体は、前記抗原の活性を直接的に又は間接的に中和、アンタゴナイズ又はアゴナイズすることができる。

好ましい実施形態において、本発明による細胞により発現される目的タンパク質は抗ＴＮＦ抗体であり、より好ましくはＷＯ０１／０９４５８５（この内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載される抗ＴＮＦ Ｆａｂ’である。

好ましくは抗体分子はヒトＴＮＦ（以前はＴＮＦαとして知られた）に特異性を持ち、その軽鎖は配列番号１１の軽鎖可変領域を含み、その重鎖は配列番号１２の重鎖可変領域を含む。

好ましくはヒトＴＮＦに特異性を持つ抗体分子はＦａｂ’であり、配列番号１３を含む又は配列番号１３からなる軽鎖配列、及び配列番号１４を含む又は配列番号１４からなる重鎖配列を持つ。

本発明の発明者らは驚くべきことに、本発明による１つ又は複数の細胞における発現によりＦａｂ収量が改善され得ることを発見した。理論に縛られるのを望むことなく、シャペロン活性及び低減されたプロテアーゼ活性を持つ本発明の株において用いられる変異ＤｅｇＰ遺伝子はＦａｂ収量を改善するが、その理由はＤｅｇＰのシャペロン活性がＦａｂの正しいフォールディングを促進するためである。

発現後、抗体断片は例えばエフェクター分子などの別の実体へのコンジュゲーションにより、さらに処理されてもよい。

本明細書で用いられる用語エフェクター分子としては、例えば、抗悪性腫瘍剤、薬剤、毒素（細菌又は植物起源の酵素活性毒素及びその断片など、例としてリシン及びその断片）、例えば酵素といった生物活性タンパク質、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然のポリマー、例としてＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片といった核酸及びその断片、放射性核種、とりわけ放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子、並びに蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出され得る化合物などのレポーター基が挙げられる。エフェクター分子は抗体又はその断片に任意の適した方法により付着され得るものであり、例えば抗体断片はＷＯ０５／００３１７１又はＷＯ０５／００３１７０（これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載される少なくとも１つのエフェクター分子に付着するよう改変され得る。ＷＯ０５／００３１７１又はＷＯ０５／００３１７０はまた、適したエフェクター分子を記載している。

一実施形態において、抗体又はＦａｂなどのその断片は、必要な場合、例えば全抗体と同様に、必要とされる性質を有する産物を生成するようＰＥＧ化される。例えば抗体はＰＥＧ化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ’とすることができ、ＷＯ０１／０９４５８５に記載されるように、好ましくは重鎖のＣ末端でシステイン残基の１つにリジル−マレイミド誘導基を付着していて、ここでリジル残基の２個のアミノ基の各々は、分子量およそ２０，０００Ｄａであるメトキシポリ（エチレングリコール）残基と、メトキシポリ（エチレングリコール）残基の全体平均分子量がおよそ４０，０００Ｄａであるように、より好ましくはリジル−マレイミド誘導基が［１−［［［２−［［３−（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）−１−オキソプロピル］アミノ］エチル］アミノ］−カルボニル］−１，５−ペンタンジイル］ビス（イミノカルボニル）であるように共有結合している。

細胞はまた、さらなる目的タンパク質を１つ又は複数コードするさらなるポリヌクレオチド配列を含んでもよい。

目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは別のポリペプチドとの融合物として、好ましくはシグナル配列又は成熟したポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を持つ他のポリペプチドとして発現され得る。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識され処理されるものでなければならない。生来の又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識せず処理しない原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は原核生物のシグナル配列に置き換えられる。適したシグナル配列としては、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＬａｍＢ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣが挙げられる。

一実施形態において、発現カセットは目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するのに本発明において利用され、このヌクレオチドは１つ又は複数の目的タンパク質をコードする１つ又は複数のタンパク質コード配列及び１つ又は複数の制御性発現配列を典型的に含む。１つ又は複数の制御性発現配列としてはプロモーターを挙げることができる。１つ又は複数の制御性発現配列としてはまた、終結配列などの３’非翻訳領域を挙げることができる。適したプロモーターはより詳細に下で論じられる。

一実施形態において、本発明による細胞はプラスミドなどのベクターを含む。ベクターは好ましくは上に規定される発現カセットの１つ又は複数を含む。

本発明における使用のためのベクターは、上に規定される発現カセットを適したベクター中に挿入することにより生産され得る。代替として、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を指揮する制御性発現配列がベクター中に含有されてもよく、であるからポリヌクレオチドのコード領域のみがベクターを完全なものにするのに必要とされ得る。

本発明により宿主細胞をポリヌクレオチドで形質転換するのに利用され得るベクターの例としては、以下が挙げられる。
・ ｐＢＲ３２２若しくはＰＡＣＹＣ１８４などのプラスミド、及び／又は
・ 細菌ファージなどのウイルスベクター
・ トランスポゾンなどの転位性の遺伝要素

多くの形態の発現ベクターが利用可能である。かかるベクターはプラスミドのＤＮＡ複製開始点、抗生物質選択マーカー、プロモーター、並びにマルチクローニング部位（発現カセット）及びリボソーム結合部位をコードするＤＮＡ配列により分離される転写ターミネーターを通常含む。

本発明において利用されるプロモーターは、関連のポリヌクレオチドに直接的に連結されることが可能であり、代替として適切な位置に、例えば関連のポリペプチドが挿入されるときに関連のプロモーターが同じベクターの上で働くことが可能であるようにベクター中に置かれることが可能である。一実施形態において、プロモーターは自身が働くポリヌクレオチドのコード部分の前に置かれ、これは例えば各々のポリヌクレオチドのコード部分の前に置かれる関連のプロモーターである。本明細書で用いられる「前」とは、プロモーターがコードするポリヌクレオチド部分との関係で５’側に置かれることを意味することが意図される。

プロモーターは宿主細胞に対して内因性であっても外因性であってもよい。適したプロモーターとしては、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ＰｈｏＡ、Ｉｐｐ、Ａｒａｂ、Ｔｅｔ及びＴ７が挙げられる。

利用される１つ又は複数のプロモーターは誘導性のプロモーターであってもよい。

細菌系における使用のための発現ユニットはまた、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）リボソーム配列を一般に含有する。

ポリヌクレオチド配列が例えば抗体軽鎖及び抗体重鎖といった２つ以上の目的タンパク質についての２つ以上のコードする配列を含む本発明の実施形態において、ポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡの中央における翻訳開始を許容する１つ又は複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むことができる。ＩＲＥＳ配列はコードするポリヌクレオチド配列の間に位置することができ、ｍＲＮＡの分離した翻訳を促進してコードされるポリペプチド配列を生産する。

ターミネーターは宿主細胞に対して内因性であって外因性であってもよい。適したターミネーターはｒｒｎＢである。

プロモーター及びターミネーターを包含するさらなる適した転写制御因子並びにタンパク質標的化方法は「大腸菌において遺伝子の高レベル発現を達成するためのストラテジー（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、Ｓａｖｖａｓ Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｓｅｐｔ １９９６、５１２〜５３８ページに見出され得る。

ポリヌクレオチドに関して本明細書に記載される本発明の実施形態は、関連の態様が同様に適用されることが可能な限り、本発明の代替的な実施形態、例えばベクター、発現カセット及び／又はその中で利用される構成要素を含む宿主細胞に等しく適用する。

本発明の第三の態様によると、本発明の第一又は第二の態様において上記される組換えグラム陰性細菌細胞中で目的の組換えタンパク質を発現させるステップを含む、目的の組換えタンパク質を生産する方法が提供される。

本発明の方法において好ましく利用されるグラム陰性細菌細胞及び目的タンパク質は詳細が上に記載されている。

目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが外因性であるとき、ポリヌクレオチドは当該技術分野で知られている任意の適した手段を用いて宿主細胞の中に組み入れられ得る。典型的に、ポリヌクレオチドは細胞中に形質転換される発現ベクターの一部として組み入れられる。したがって、１つの態様において、本発明による細胞は目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。

ポリヌクレオチド配列は標準的な技術を用いることで、例えば塩化ルビジウム、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを利用することで、細胞中に形質転換されることが可能である。

本発明による方法はまた、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換に成功した安定な細胞の選択を促進する選択系を利用することもできる。選択系は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列の共形質転換を典型的に利用する。一実施形態において、細胞中に形質転換される各ポリヌクレオチドは、１つ又は複数の選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。したがって、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びマーカーをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドの形質転換は共に起こり、所望のタンパク質を生産する細胞を選ぶのに選択系を利用することが可能である。

１つ又は複数のマーカーを発現することが可能な細胞は、例えば毒素又は抗生物質の添加といった特定の人工的に課された条件下で生存／生育／増殖することができるが、それは細胞の中に組み込まれる選択系のポリペプチド／遺伝子又はポリペプチドの構成要素により付与される性質（例として抗生物質耐性）のためである。１つ又は複数のマーカーを発現することが不可能な細胞は人工的に課された条件下で生存／生育／増殖することができない。人工的に課された条件は必要に応じてより強力な又はより弱いものを選択することが可能である。

任意の適した選択系が本発明において利用され得る。典型的に選択系は、例えばテトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子といった既知の抗生物質への耐性を与える遺伝子を１つ又は複数、ベクター中に包含することに基づき得る。関連の抗生物質存在下で生育する細胞は、抗生物質への耐性を付与する遺伝子と所望のタンパク質との両者を発現することから、選択することが可能である。

一実施形態において、本発明による方法は形質転換された細胞を、それによって目的タンパク質を発現させるために培地中で培養するステップをさらに含む。

誘導性の発現系又は構成的プロモーターが本発明において目的タンパク質を発現させるのに用いられ得る。適した誘導性の発現系及び構成的プロモーターは当該技術分野でよく知られている。

任意の適した培地が形質転換された細胞を培養するのに用いられ得る。培地は特異的な選択系に適合されてもよく、例えば培地は形質転換に成功した細胞だけが培地中で増殖することが許容されるように抗生物質を含んでもよい。

培地から取得された細胞は必要に応じてさらなるスクリーニング及び／又は精製に供され得る。本方法は必要に応じて目的タンパク質を抽出し精製するステップを１つ又は複数、さらに含んでもよい。

ポリペプチドは、細胞質、ペリプラズム又は培養培地を包含する株から回収され得る。

タンパク質を精製するのに用いられる特異的な方法（単数又は複数）は、タンパク質のタイプに依存する。適した方法としては、イムノアフィニティーカラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、シリカでのクロマトグラフィー、Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ及びＤＥＡＥなどのイオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、硫酸アンモニウム沈殿並びにゲル濾過が挙げられる。

抗体は培養培地及び／又は細胞質抽出液及び／又はペリプラズム抽出液から従来の抗体精製手法により適切に分離され得るものであり、この手法としては、例えばタンパク質Ａ−セファロース、タンパク質Ｇクロマトグラフィー、タンパク質Ｌクロマトグラフィー、硫黄親和性混合型樹脂、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム、エタノール若しくはＰＥＧ分画／沈殿、イオン交換膜、膨張層吸着クロマトグラフィー（ＥＢＡ）又は擬似移動床式クロマトグラフィーなどがある。

本方法はまた、目的タンパク質の発現量を測定して目的タンパク質の発現レベルが高い細胞を選択するさらなるステップを包含する。

本明細書に記載される１つ又は複数の方法ステップは、バイオリアクターなどの適した容器内で組み合わせで行われ得る。

（例１）
変異体大腸菌細胞株の作製
用いられた宿主細胞株はＷ３１１０遺伝子型：Ｆ−ＬＡＭ−ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１ ｒｐｈ１（ＡＴＣＣ番号２７３２５）であった。

Ｗ３１１０Ａは、図に示されるようにＷ３１１０の異なるバッチである。

次の変異体大腸菌細胞株がｐＫＯ３相同組換え／置換プラスミドを用いる遺伝子置換ベクター系を用いて作製された（Ｌｉｎｋら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７９、６２２８〜６２３７ページ）。

ＭＸＥ００１株は、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＨＰＡ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４４で寄託された。
ＭＸＥ００４株は、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＨＰＡ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４７で寄託された。
ＭＸＥ００５株は、２００９年５月２１日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＨＰＡ、英国にアクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４８で寄託された。

Ｔｓｐ、プロテアーゼＩＩＩ及びＤｅｇＰ組み込みカセットはＳａｌ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ制限断片として同様に制限ｐＫＯ３プラスミドの中に移動された。

プラスミドはクロラムフェニコールマーカーとともにｐＳＣ１０１複製開始点（ＲｅｐＡ）の温度感受性変異体を用いて、染色体組み込みイベントを行い、選択する。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子はショ糖で増殖する大腸菌にとって致死的であり、そのため（クロラムフェニコールマーカー及びｐＳＣ１０１開始点を伴って）脱組み込み及びプラスミドキュアリングイベントを行い、選択するのに用いられる。この方法論は以前に記載されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７１、４６１７〜４６２２ページ及びＢｌｏｍｆｉｅｌｄら、１９９１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５、１４４７〜１４５７ページ）。ｐＫＯ３系は挿入される遺伝子を除いて全ての選択マーカーを宿主のゲノムから除去する。

次のプラスミドが構築された。
配列番号３に示されるようにＥｃｏＲ Ｉ及びＡｓｅ Ｉ制限マーカーを含むノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含むｐＭＸＥ１９１
配列番号６に示されるようにＥｃｏＲ Ｉ及びＡｓｅ Ｉ制限マーカーを含むノックアウト変異プロテアーゼＩＩＩ遺伝子を含むｐＭＸＥ１９２
配列番号９に示されるようにＡｓｅ Ｉを含む変異ＤｅｇＰ遺伝子を含むｐＭＸＥ１９２

これらのプラスミドは次いでＣｈｕｎｇ ＣＴら「同一溶液中での細菌細胞の形質転換及び保存（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．）」ＰＮＡＳ ８６：２１７２〜２１７５ページ（１９８９）に見出される方法を用いて調製された化学的コンピテント大腸菌Ｗ３１１０細胞に形質転換された。

１日目
４０μｌの大腸菌細胞は、冷却されたＢｉｏＲａｄ ０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット内で（１０ｐｇ）１μｌのｐＫＯ３ ＤＮＡと混合された後、２５００Ｖ、２５μＦ及び２００Ωでエレクトロポレーションされた。１０００μｌの２×ＰＹが速やかに添加され、細胞はインキュベーター内で３０℃、１時間、２５０ｒｐｍで振とうすることにより回復した。細胞は２×ＰＹ中で段階的に１／１０希釈された後、１００μｌの一定分量がクロラムフェニコールを２０μｇ／ｍｌ含有する３０℃及び４３℃に予め加温された２×ＰＹ寒天プレート上に蒔かれた。プレートは３０℃及び４３℃で終夜インキュベートされた。

２日目
３０℃で増殖したコロニー数はエレクトロポレーション効率の推定を出すものであったが、４３℃での増殖を生き延びたコロニーは潜在的な組み込みイベントを表す。４３℃プレートから単一コロニーが採取され、１０ｍｌの２×ＰＹに再懸濁された。このうちの１００μｌが５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する３０℃に予め加温された２×ＰＹ寒天プレート上に蒔かれ、単一コロニーを生成した。プレートは３０℃で終夜インキュベートされた。

３日目
ここでのコロニーは潜在的な同時に起こる脱組み込み及びプラスミドキュアリングイベントを表す。脱組み込み及びキュアリングイベントが増殖において早期に発生する場合、コロニー塊の大部分はクローンであろう。単一コロニーが採取され、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌ又は５％（ｗ／ｖ）ショ糖のいずれかを含有する２×ＰＹ寒天上にレプリカプレートが作成された。プレートは３０℃で終夜インキュベートされた。

４日目
ショ糖で増殖し、且つクロラムフェニコールで死滅するコロニーは、潜在的な染色体置換及びプラスミドキュアリングイベントを表す。これらのコロニーが採取され、変異特異的なオリゴヌクレオチドでのＰＣＲによりスクリーニングされた。正しいサイズの陽性ＰＣＲバンドを生成したコロニーが５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する２×ＰＹ寒天上に現れて単一コロニーを生成し、プレートは３０℃で終夜インキュベートされた。

５日目
ＰＣＲ陽性、クロラムフェニコール感受性及びショ糖耐性の大腸菌の単一コロニーがグリセロールストック、化学的コンピテントセルを作るのに用いられ、５’及び３’隣接オリゴでのＰＣＲ反応のためのＰＣＲ鋳型として働いて、Ｔａｑポリメラーゼを用いたダイレクトＤＮＡシークエンシングのためのＰＣＲ産物を生成した。

細胞株ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５は、図１ａ、１ｂ及び１ｃに示されるような非天然のＡｓｅ Ｉ制限部位を含む各変異プロテアーゼ遺伝子の領域をオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより試験され、１つ又は複数の変異プロテアーゼ遺伝子を保有するゲノムＤＮＡの改変の成功が確認された。増幅されたＤＮＡ領域は次いでゲル電気泳動によりＡｓｅ Ｉ制限酵素とのインキュベーションの前後に分析され、変異遺伝子中の非天然のＡｓｅ Ｉ制限部位の存在が確認された。この方法は次のように実施された。

次のオリゴがＰＣＲを用いてＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０から調製された大腸菌細胞溶解液からのゲノムＤＮＡを増幅するのに用いられた。

溶解液は細胞の単一コロニーを２０ｕｌの１×ＰＣＲバッファー中で９５℃で１０分間加熱することにより調製された。混合液は室温まで冷やされ、次いで１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。上清は移され、「細胞溶解液」としてラベルされた。

各々の株はオリゴのＴｓｐ対、プロテアーゼＩＩＩ対及びＤｅｇＰ対を対毎に用いて増幅された。

ＤＮＡは標準的なＰＣＲ手法を用いて増幅された。
５ｕｌ バッファー×１０（Ｒｏｃｈｅ）
１ｕｌ ｄＮＴＰ混合液（Ｒｏｃｈｅ、１０ｍＭ混合液）
１．５ｕｌ ５’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
１．５ｕｌ ３’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
２ｕｌ 細胞溶解液
０．５ｕｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ ５Ｕ／ｕｌ）
３８．５ｕｌ Ｈ２Ｏ

ＰＣＲサイクル
９４℃ １分間
９４℃ １分間）
５５℃ １分間） ３０サイクル繰り返される
７２℃ １分間）
７２℃ １０分間

反応が完了したら、２５ｕｌがＡｓｅ Ｉでの消化のために新しい微量遠心チューブへと移された。２５ｕｌのＰＣＲ反応液に１９ｕｌのＨ２Ｏ、５ｕｌのバッファー３（ＮＥＢ）、１ｕｌのＡｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）が添加、混合され、３７℃で２時間インキュベートされた。

残りのＰＣＲ反応液に５ｕｌのローディングバッファー（×６）が添加され、２０ｕｌが０．８％ ＴＡＥ ２００ｍｌアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋エチジウムブロマイド（５ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）上にロードされて、１００ボルトで１時間泳動された。１０ｕｌのサイズマーカー（Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＮＡマーカー ０．１〜１２Ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）が最終レーン内にロードされた。

Ａｓｅ Ｉ消化が完了したら、１０ｕｌのローディングバッファー（×６）が添加され、２０ｕｌが０．８％ ＴＡＥアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋エチジウムブロマイド（５ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）上にロードされて、１００ボルトで１時間泳動された。１０ｕｌのサイズマーカー（Ｐｅｒｆｅｃｔ ＤＮＡマーカー ０．１〜１２Ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）が最終レーン内にロードされた。

両方のゲルはＵＶトランスルミネーターを用いて可視化された。

増幅された全てのゲノム断片はＴｓｐについて２．８Ｋｂ、プロテアーゼＩＩＩについて１．８Ｋｂ、及びＤｅｇＰについて２．２Ｋ．ｂの正しいサイズのバンドを示した。

Ａｓｅ Ｉでの消化後、これにより導入されたＡｓｅ Ｉ部位がプロテアーゼ欠損株の中には存在するが、Ｗ３１１０対照の中には存在しないことを確認した。

ＭＸＥ００１：Ｔｓｐプライマーセットを用いて増幅されたゲノムＤＮＡ及び結果として生じたＤＮＡがＡｓｅ Ｉで消化され、２．２Ｋｂｐ及び０．６Ｋｂｐのバンドを生じた。

ＭＸＥ００４：Ｔｓｐプライマーセット及びプロテアーゼＩＩＩプライマーセットを用いて増幅されたゲノムＤＮＡ及び結果として生じたＤＮＡがＡｓｅ Ｉで消化され、２．２Ｋｂｐ及び０．６Ｋｂｐのバンド（Ｔｓｐ断片）並びに１．０Ｋｂｐ及び０．８Ｋｂｐのバンド（プロテアーゼＩＩＩ断片）を生じた。

ＭＸＥ００５ Ｔｓｐプライマーセット及びＤｅｇＰプライマーセットを用いて増幅されたゲノムＤＮＡ及び結果として生じたＤＮＡがＡｓｅ Ｉで消化され、２．２Ｋｂｐ及び０．６Ｋｂｐのバンド（Ｔｓｐ断片）並びに１．２５Ｋｂｐ及び０．９５Ｋｂｐのバンド（ＤｅｇＰ断片）を生じた。

Ｗ３１１０のＰＣＲ増幅されたＤＮＡはＡｓｅ Ｉ制限酵素により消化されなかった。

ＣＤＰ８７０ Ｆａｂ’（抗ＴＮＦ Ｆａｂ’）の発現ベクターであるプラスミドｐＭＸＥ１１７（ｐＴＴＯ ＣＤＰ８７０又は４０．４）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら １９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨＬ ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．において見出すことができる従来の制限クローニング方法論を用いて構築された。プラスミドｐＭＸＥ１１７（ｐＴＴＯ ＣＤＰ８７０又は４０．４）は強いｔａｃプロモーター及びｌａｃオペレーター配列という特徴を含有した。Ｆａｂの軽鎖及び重鎖遺伝子は単一のジシストロニックなメッセージとして転写された。大腸菌ＯｍｐＡタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡは軽鎖及び重鎖遺伝子配列の両方の５’末端へと融合され、ポリペプチドの大腸菌ペリプラズムへの移行を指揮した。転写は二重転写ターミネーターｒｒｎＢ ｔ１ｔ２を用いて終結された。ｌａｃＩｑ遺伝子は恒常的に発現されるＬａｃ Ｉリプレッサータンパク質をコードした。これはｔａｃプロモーターからの転写を、脱抑制がアロラクトース又はＩＰＴＧの存在により誘導されるまで抑制した。用いられた複製開始点はｐ１５Ａで、これは低いコピー数を維持した。プラスミドは抗生物質選択のためのテトラサイクリン耐性遺伝子を含有した。

ｐＭＸＥ１１７は次いでＣｈｕｎｇ Ｃ．Ｔら「同一溶液中での細菌細胞の形質転換及び保存（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．）」ＰＮＡＳ ８６：２１７２〜２１７５ページ（１９８９）に見出される方法を用いて調製された化学的コンピテントなプロテアーゼ欠損細胞（株ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５）並びにＷ３１１０細胞の中に形質転換された。

（例２）
振とうフラスコ培養を用いた変異大腸菌株における抗ＴＮＦα Ｆａｂ’の発現
株ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５は、増殖及び抗ＴＮＦα Ｆａｂ’の発現をＷ３１１０に対して比較する振とうフラスコ実験において試験された。

用いられた振とうフラスコ実験プロトコールは次のように行われた。

合成培地順応細胞の調製
単一コロニーは５ｍｌの２×ＰＹ（１％ ｐｈｙｔｏｎｅ、Ｄｉｆｃｏ、０．５％酵母エキス、Ｄｉｆｃｏ、０．５％ ＮａＣｌ）ブロス＋テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）１０ｕｇ／ｍｌの中に採取され、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で終夜増殖させた。１００ｕｌのこの終夜培養液は２００ｍｌの化学合成ＳＭ６Ｅ培地（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６、３０９〜３２０ページに記載）＋テトラサイクリン１０ｕｇ／ｍｌに接種するのに用いられ、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で終夜増殖させた。１００ｕｌのこの第二の終夜培養液は、第二の２００ｍｌのＳＭ６Ｅ培地＋テトラサイクリン１０ｕｇ／ｍｌの入ったフラスコに接種するのに用いられた。これは培養液がＯＤ６００およそ２に達するまで増殖させた。培養液は短時間遠心分離されて細胞が回収された後、１００ｍｌのＳＭ６Ｅに再懸濁された。グリセロールが終濃度１２．５％になるように添加された後、一定分量の「順応細胞」が−８０℃で保存された。

２００ｍｌ振とうフラスコ実験
振とうフラスコ培養は２ｍｌの一定分量の融解された合成培地「順応細胞」を２００ｍｌのＳＭ６Ｅ培地＋テトラサイクリン１０ｕｇ／ｍｌに添加することにより開始された。これらは２５０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で終夜増殖させた。試験される各々の株は３連で増殖させた。

２．０のＯＤ６００まで増殖させた細胞はＩＰＴＧを２００ｕＭになるように添加することにより異種タンパク質の生産のために誘導された。１ｍｌの培養サンプルが１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間及び２４時間で採取され、１３，２００ｒｐｍで５分間の遠心分離後、細胞ペレットは２００ｕｌのペリプラズム抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４）に再懸濁された。ペリプラズム抽出液は３０℃で終夜、２５０ｒｐｍで撹拌された。翌日、抽出液は１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、上清がデカンテーションで除去されて「ペリプラズム抽出液」として−２０℃で保存された。使用済みの細胞ペレットは廃棄された。

ＥＬＩＳＡ定量
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートは４℃で終夜、ＡＢ１４１（ウサギ抗ヒトＣＨ１、ＵＣＢ）２μｇｍｌ^−１でＰＢＳ中でコーティングされた。３００ｕｌのサンプル／コンジュゲートバッファー（ＰＢＳ、ＢＳＡ ０．２％（ｗ／ｖ）、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％（ｖ／ｖ））で３回洗浄後、サンプル及び標準の１／２段階希釈がプレート上で１００μｌのサンプル／コンジュゲートバッファー中で行われ、プレートは室温で１時間、２５０ｒ．ｐ．ｍで撹拌された。３００ｕｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％（ｖ／ｖ））で３回洗浄後、１００μｌの露出抗体６０６２（ウサギ抗ヒトκ ＨＲＰコンジュゲート、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）がサンプル／コンジュゲートバッファーで１／１０００に希釈した後に添加された。プレートは次いで室温で１時間、２５０ｒ．ｐ．ｍで撹拌された。３００ｕｌの洗浄バッファーで３回洗浄後、１００μｌのＴＭＢ基質が添加され（ＴＭＢ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）：ｄＨ_２Ｏの５０：５０混合液）、Ａ_６３０が自動プレートリーダーを用いて記録された。ペリプラズム抽出液中のＦａｂ’濃度は適切なアイソタイプの精製Ｆａｂ’標準との比較により算出された。

図２は野生型Ｗ３１１０と比較したＭＸＥ００５及びＭＸＥ００１の増殖を示す。図３は野生型Ｗ３１１０と比較したＭＸＥ００５及びＭＸＥ００１株からのＦａｂ’の改善された発現を示す。

図４はＭＸＥ００４及びＷ３１１０の増殖を示し、図５はＭＸＥ００４及びＷ３１１０におけるＦａｂ’の発現を示し、図５ではＭＸＥ００４からの発現はＷ３１１０より高かったことが分かる。

（例３）
振とうフラスコ培養を用いた変異大腸菌株における抗ｍＩＬ１３マウスＦａｂの発現
株ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及び野生型Ｗ３１１０細胞はマウス化抗ｍＩＬ１３ Ｆａｂ’を発現するプラスミドｐＭＫＣ００６で形質転換され、実験が２４時間後の代わりに６時間後に停止されたこと以外は例２に記載されたものと同じ振とうフラスコ方法を用いて試験された。

図６はＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０における抗ｍＩＬ−１３マウスＦａｂの発現を示し、ここではＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５はＷ３１１０と比較してより高いＦａｂ発現を示すことが分かる。

（例４）
変異大腸菌株からの軽鎖及び重鎖の発現分析
例２に記載された振とうフラスコ実験の、プラスミドｐＭＸＥ１１７で形質転換された株ＭＸＥ００５及び野生型Ｗ３１１０細胞由来のペリプラズム抽出液は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行われる表面プラスモン共鳴結合アッセイを用いて試験された。抗ＴＮＦα Ｆａｂ’はＣＭ５センサーチップ上に標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ化学作用を用いて固定された。残渣のＮＨＳエステルはエタノールアミン塩酸塩（１Ｍ）で不活化された。

Ｆａｂ’断片は固定化されたモノクローナル抗重鎖抗体又は固定化されたモノクローナル抗軽鎖抗体のいずれかにより別々のフローセル内に捕捉された。結合したＦａｂ’の存在は、第二のステップにおける相補的なモノクローナル抗体（抗軽鎖又は抗重鎖）の結合により明らかにされた。高レベルの固定化抗体は、大量輸送が限定された条件下で測定が行われることを確実にするが、ここで結合についての会合速度定数の寄与はサンプル中のＦａｂ’濃度によりなされる寄与との比較において低い。第二のステップで用いられる溶液相のモノクローナル抗体は、結合がこの相互作用の会合速度定数により限定されないよう高濃度で表面上を通過する。

アセンブルされたＦａｂ’断片及び正しくフォールドされたアセンブルされていない鎖はいずれも最初の捕捉ステップの間に検出される。二次抗体の結合はインタクトなＦａｂ’断片のみに対するものである。それ故、第一及び第二段階での相対的結合の分析はＦａｂ’サンプル中の過剰なアセンブルされていない軽鎖又は過剰なアセンブルされていない重鎖のいずれかの存在を明らかにし、アセンブリーの化学量論に対する情報を与える。

アッセイは両方の設定において各サンプルについて行われ、各サンプルは２連でランダム化された順番で流された。

（ｉ）アセンブルされたＦａｂ’の濃度が軽鎖の捕捉により決定されるものであった場合、サンプル及び標準（１０ｇｌ／ｍｉｎの）が固定化されたＨＰ６０５３上にインジェクトされ、ＨＰ６０４５を３００Ｒｇ／ｍｌで溶液相中の表面上を通過させる第二のステップが続いた。

（ｉｉ）アセンブルされたＦａｂ’の濃度が重鎖の捕捉により決定されるものであった場合、サンプル及び標準（１０ｔ ａｔ ｔＯｊｕＶｍｉｎ）が固定化されたＨＰ６０４５上にインジェクトされ、ＨＰ６０５３を５００１ｌｇ／ｍｌで溶液相中の表面上を通過させる第二のステップが続いた。いずれの場合においても、表面は１０ｇｉの３０ｍＭ ＨＣｌで、３０ｌ／ｍｉｎで再生された。

ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を用いて決定された共鳴ユニット数は、標準曲線に対して読み取られた。

図７は発酵過程の間の軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖（Ｈ鎖）及びＦａｂの発現を示し、ここではＭＸＥ００１からの２時間、４時間及び６時間後の軽鎖、重鎖及びＦａｂ’の発現がＷ３１１０と比較してより高いことが示される。図７は６時間後のＭＸＥ００５からの軽鎖がＷ３１１０と比較してより高く、ＭＸＥ００５からの２時間、４時間及び６時間後のＦａｂ’発現がＷ３１００と比較してより高いことを示す。

（例５）
Ｆａｂ’についての変異大腸菌株のタンパク質分解活性の分析
例２における振とうフラスコ実験の、プラスミドｐＭＸＥ１１７で形質転換された株ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００５及び野生型Ｗ３１１０細胞由来のペリプラズム抽出液は、ポリクローナルなウエスタンブロット分析において抗ＴＮＦα Ｆａｂ’のタンパク質分解と比較して次のように試験された。

１２ｕｌの各ペリプラズム抽出液＋４ｕｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は８５℃まで５分間加熱され、２５℃まで冷却されて、次いで短時間遠心分離されて、予め調製されたＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードされた。ＳｅｅＢｌｕｅ２サイズマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が分子量の推定に用いられた。ゲルは１５０Ｖで１時間電気泳動された後、タンパク質は１５０ｍＡで２時間のイムノブロッティングを用いて、予め湿らせたＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にトランスファーされた。膜は「ブロッキングバッファー」（ＰＢＳ、３％（ｗ／ｖ）粉乳、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ））中で穏やかに撹拌しながら１時間ブロッキングされた。ポリクローナルウサギ抗ヒトＦａｂ’血清（ＵＣＢ）が５ｍｌのブロッキングバッファー中の１：１０００の希釈でアプライされ、室温で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートされた。膜は、各回とも穏やかに撹拌しながらブロッキングバッファーで５分間、３回洗浄された。二次抗体（ロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ））がブロッキングバッファー中の１：５０００の希釈でアプライされ、室温で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートされた。膜は、各回とも穏やかに撹拌しながら５分間、４回洗浄され、初回はブロッキングバッファーで、その後ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎで２回、次いで最終回はＰＢＳで洗浄された。ブロットはＭｅｔａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｄａｂ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて可視化された。

図８はウエスタンブロット分析の結果を示し、Ｗ＝Ｗ３１１０、１＝ＭＸＥ００１（ΔＴｓｐ）及び５＝ＭＸＥ００５（ΔＴｓｐ、ＤｅｇＰ Ｓ２１０Ａ）である。１４ＫＤａ周辺の断片化は、発現されたＦａｂ’軽鎖のタンパク質分解断片を表すと考えられる。ＭＸＥ００１及びＭＸＥ００５は野生型Ｗ３１１０と比較して１４ＫＤａマーク周辺のタンパク質分解産物がより少ないことが分かる。理論に縛られることなく、このデータは抗ＴＮＦα Ｆａｂ’がＴｓｐ及びＤｅｇＰによるタンパク質分解に感受性であることを示唆する。

（例６）
高密度発酵を用いた変異大腸菌株の増殖及び変異大腸菌株におけるＦａｂ’の発現
株ＭＸＥ００５及び野生型Ｗ３１１０細胞は、増殖及び抗ＴＮＦα Ｆａｂ’の発現を比較する発酵実験において試験されたプラスミドｐＭＸＥ１１７で形質転換された。

増殖培地
発酵増殖培地は３．８６ｇ／ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４．Ｈ_２Ｏ及び１１２ｇ／ｌグリセロールを含むＳＭ６Ｅ培地（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６、３０９〜３２０ページに記載される）に基づくものであった。

種菌
種菌培養液は１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補充した同一培地中で増殖させた。培養液は３０℃で撹拌しながらおよそ２２時間インキュベートされた。

発酵
発酵槽（総容量２．５リットル）に、種菌培養液が０．３〜０．５のＯＤ_６００になるように接種した。温度は増殖期の間は３０℃に維持され、誘導の前に２５℃へと下げられた。溶存酸素濃度は可変の撹拌及び気流により３０％より高い空気飽和度で維持された。培養液のｐＨは１５％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨ及び１０％（ｖ／ｖ）濃Ｈ_２ＳＯ_４での自動滴定により７．０で制御された。発泡は１０％（ｖ／ｖ）Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３溶液（Ｓｃｈｉｌｌ及びＳｅｉｌａｃｈｅｒ）の添加により制御された。

多数の添加が発酵の異なる段階でなされた。バイオマス濃度がおよそ４０のＯＤ_６００に達したとき、マグネシウム塩及びＮａＨ_２ＰＯ_４．Ｈ_２Ｏが添加された。ＮａＨ_２ＰＯ_４．Ｈ_２Ｏのさらなる添加が誘導期の前及び間になされ、リン酸塩が過剰量で維持されることを確実にした。発酵開始時に存在するグリセロールが枯渇したとき（およそ７５のＯＤ_６００）、８０％（ｗ／ｗ）グリセロールの連続供給が適用された。発酵中の同じ時点で１７０μＭでのＩＰＴＧ供給が適用された。ＩＰＴＧ供給の開始は誘導の開始として受け取られた。発酵は典型的により低いグリセロール供給速度（０．５〜２．５ｍｌ／ｈ）で７０〜７３時間、より高いグリセロール供給速度（５．４〜１０．９ｍｌ／ｈ）で５０〜６０時間実行された。

バイオマス濃度及び増殖速度の測定
バイオマス濃度は６００ｎｍでの培養液の光学密度を測定することにより決定された。

ペリプラズムの抽出
細胞は培養サンプルから遠心分離により回収された。上清画分はさらなる分析のために（−２０℃で）保持された。細胞ペレット画分は抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で元の培養液の液量になるように再懸濁された。６０℃でおよそ１６時間のインキュベーションに続いて、抽出液は遠心分離により澄まされ、上清画分は分析のために（−２０℃で）保持された。

Ｆａｂ’の定量
ペリプラズム抽出液及び培養上清中のＦａｂ’濃度はＨｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６、３０９〜３２０ページに記載されるＦａｂ’アセンブリーＥＬＩＳＡにより決定された。

図９は対照のＷ３１１０と比較したＭＸＥ００１の増殖プロファイルを示し、これは増殖プロファイルがおよそ３５時間、実質的に同じであることを示す。

図１０は対照のＷ３１１０と比較した大腸菌株ＭＸＥ００１由来の上清（点線）及びペリプラズム（実線）からのＦａｂ収量を示す。ＭＸＥ００１株はおよそ３０時間までより高いペリプラズムのＦａｂ’発現を、発酵期間全体にわたって顕著により高い上清のＦａｂ’発現を示す。

図１１は対照のＷ３１１０と比較した大腸菌株ＭＸＥ００１の上清及びペリプラズムからの総Ｆａｂ’収量を示し、ここではＭＸＥ００５株が対照のＷ３１１０と比較してより高いＦａｂ’収量を得たことが分かる。

図１２は対照のＷ３１１０と比較した大腸菌株ＭＸＥ００１のＦａｂ’特異的な生産速度を示し、ここではＭＸＥ００１がＷ３１１０と比較して顕著により高い特異的な生産速度を持つことが分かる。

図１３は対照のＷ３１１０と比較したＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５の増殖プロファイルを示す。ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５の増殖プロファイルは対照のＷ３１１０と比較して、およそ３５時間の初期期間にわたってより速い。

図１４は大腸菌株ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０対照の上清（点線）及びペリプラズム（実線）からのＦａｂ’収量を示す。ＭＸＥ００５株はおよそ２８時間、対照と比較してより高いペリプラズムからのＦａｂ’収量を示し、発酵期間全体にわたって対照と比較して顕著により高い上清のＦａｂ’収量を示す。ＭＸＥ００４株はおよそ２０時間、対照と比較してより高いペリプラズムからのＦａｂ’収量を示し、発酵期間全体にわたって対照と比較して顕著により高い上清のＦａｂ’収量を示す。

図１５は大腸菌株ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５の上清及びペリプラズムからの総Ｆａｂ’収量を示し、ここではＭＸＥ００４株及びＭＸＥ００５株は対照と比較して顕著により高い収量を得たことが明確に分かる。

図１６は大腸菌株ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０対照のＦａｂ’特異的な生産速度を示し、ここではＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５はＷ３１１０と比較して顕著により高い特異的な生産速度を持つことが分かる。

（例７）
振とうフラスコ実験におけるＷ３１１０及び高度に変異した大腸菌株と比較した変異大腸菌株ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５の増殖
次の株が振とうフラスコ実験において分析され、増殖速度が評価された。
Ｗ３１１０由来の変異大腸菌株ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４及びＭＸＥ００５（例１）
野生型大腸菌株Ｗ３１１０
以下の遺伝子型を持つＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）

以下の遺伝子型を持つＳＴＢＬ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）

以下の遺伝子型を持つＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）

及び以下の遺伝子型を持つＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）

単一コロニーを５ｍｌのＬＢブロス（１リットルあたり１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、１０ｇ ＮａＣｌ）中に採取し、３７℃で終夜、２５０ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。終夜培養液は７５ｍｌのＬＢブロスにＯＤ_６６０が０．１になるよう接種するのに用いられた（ｎ＝２）。培養液は３７℃、２５０ｒｐｍで振とうしながら増殖させ、０．２ｍｌのサンプルが毎時間移され、ＯＤ_６００が記録された。ＯＤ６００は次いで１時間ごとの時間に対してプロットされ、結果は図１７に示される。大きく変異した大腸菌株はＭＸＥ００１、ＭＸＥ００４、ＭＸＥ００５及びＷ３１１０と比較してより低い増殖速度を持つことが図１７から見られる。

本発明は好ましい実施形態に関してとりわけ示され、記載されているが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲から逸脱することなく形態及び詳細における様々な変更がなされ得ることが当業者に理解されるであろう。

Claims (16)

1. 配列番号３の配列を含むノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である、変異Ｔｓｐ遺伝子と、
   任意選択で目的とする外因性の治療的、予防的又は診断的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む、組換えグラム陰性細菌細胞であって、
   前記変異Ｔｓｐ遺伝子を除いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞株Ｋ−１２ Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、Ｗ１４８５、Ｗ３１０１又はＢＷ３０２７０と遺伝的に同質である、上記組換えグラム陰性細菌細胞。
2. ａ．配列番号６の配列を含むノックアウト変異Ｐｔｒ遺伝子である、変異Ｐｔｒ遺伝子、あるいは
   ｂ．シャペロン活性及び５０％以下のプロテアーゼ活性を持つＤｅｇＰタンパク質をコードし、配列番号９の配列を含む、変異ＤｅｇＰ遺伝子
   を追加で含み、
   前記変異Ｔｓｐ遺伝子、及び前記変異Ｐｔｒ遺伝子又は変異ＤｅｇＰ遺伝子を除いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞株Ｋ−１２ Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、Ｗ１４８５、Ｗ３１０１又はＢＷ３０２７０と遺伝的に同質である、請求項１に記載の組換えグラム陰性細菌細胞。
3. 前記ノックアウト変異Ｐｔｒ遺伝子及び／又は前記ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、遺伝子開始コドンへの変異、並びに／又は遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子停止コドンの上流に位置する１つ若しくは複数の停止コドンを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
4. ＭＸＥ００１株（アクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４４）である、請求項１に記載の細胞。
5. シャペロン活性を持つがプロテアーゼ活性を持たないＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子及びノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含む、請求項２に記載の細胞。
6. ＭＸＥ００５株（アクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４８）である、請求項５に記載の細胞。
7. ノックアウト変異Ｐｔｒ遺伝子及びノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含む、請求項２に記載の細胞。
8. ＭＸＥ００４株（アクセッション番号ＮＣＴＣ１３４４７）である、請求項７に記載の細胞。
9. 前記変異ＤｅｇＰ遺伝子、前記変異Ｐｔｒ遺伝子及び／又は前記変異Ｔｓｐ遺伝子が、１つ又は複数の制限マーカー部位を含む、請求項１又は２に記載の細胞。
10. 前記ノックアウト変異Ｐｔｒ遺伝子及び／又は前記ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、インフレームの停止コドンを含む制限マーカー部位を含む、請求項９に記載の細胞。
11. 前記制限マーカー部位がＡｓｅ Ｉ制限部位である、請求項９に記載の細胞。
12. 前記ノックアウト変異Ｐｔｒ遺伝子及び／又は前記ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、遺伝子開始コドンへのミスセンス変異及び任意選択で１つ又は複数のさらなる点変異により作出される制限マーカー部位を含む、請求項９に記載の細胞。
13. 前記制限マーカー部位が、ＥｃｏＲ Ｉマーカー部位である、請求項１２に記載の細胞。
14. 前記目的タンパク質が、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載の細胞。
15. 前記抗体又はその抗原結合断片が、ＴＮＦに特異的である、請求項１４に記載の細胞。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換えグラム陰性細菌細胞中で目的の組換えタンパク質を発現させるステップを含む、目的の組換えタンパク質を生産する方法。

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