JP6136236B2 - Purification method of recombinant protein - Google Patents
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Description
本発明は、異種タンパク質を発現可能な大腸菌の培養液から、前記タンパク質を精製する方法に関する。特に本発明は、前記培養液からエンドトキシン含量の少ない前記タンパク質を取得するための精製方法に関する。 The present invention relates to a method for purifying a protein from a culture solution of E. coli capable of expressing a heterologous protein. In particular, the present invention relates to a purification method for obtaining the protein having a low endotoxin content from the culture solution.
遺伝子工学的手法を用いて大腸菌で異種タンパク質を発現させる場合、大腸菌をはじめとするグラム陰性菌には、細胞膜の構成成分であるリポ多糖やタンパク質の複合体からなるエンドトキシンが多く含まれている。エンドトキシンは哺乳類の体内に混入すると、発熱を促すサイトカインを放出したり、細胞死を誘発するなど毒性を示す（非特許文献１）。そのため大腸菌で発現した異種タンパク質を、特に医薬品用途で使用する際は、毒素ショックを避ける意味でも、前記タンパク質へのエンドトキシンの混入を避ける必要がある。 When heterologous proteins are expressed in Escherichia coli using genetic engineering techniques, gram-negative bacteria such as Escherichia coli contain many endotoxins composed of lipopolysaccharide and protein complexes that are constituents of cell membranes. Endotoxin, when mixed in the body of mammals, exhibits toxicity such as releasing cytokines that promote fever and inducing cell death (Non-patent Document 1). Therefore, when a heterologous protein expressed in E. coli is used for pharmaceutical purposes, it is necessary to avoid contamination of endotoxin into the protein in order to avoid toxin shock.
エンドトキシンを除去する従来の方法として、活性炭やエンドトキシンを特異的に吸着する多孔体で吸着除去する方法（特許文献１および２）や、限外ろ過膜やろ過助剤を利用したろ過法（特許文献３）などが知られている。しかしながらこれらの方法は、吸着によるタンパク質の失活や収量の低下が問題であった。また、エンドトキシンを完全に失活する方法として、２５０℃で３０分以上加熱する方法（第十四改正日本薬局方エンドトキシン試験法）や、酸／塩基によりエンドトキシンを分解する方法（特許文献４）が知られているが、これらの方法もタンパク質の失活や分解の問題を有していた。
As conventional methods for removing endotoxin, a method of adsorbing and removing with a porous body that specifically adsorbs activated carbon and endotoxin (
本発明の目的は、異種タンパク質を発現可能な大腸菌の培養液から、エンドトキシン含量の少ない前記タンパク質を取得するための精製方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a purification method for obtaining the protein having a low endotoxin content from a culture solution of E. coli capable of expressing a heterologous protein.
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、異種タンパク質を発現可能な大腸菌の抽出物から前記タンパク質を精製する際に、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むクロマトグラフィーによる精製を行なうことで、エンドトキシン含量の少ない前記タンパク質を取得できることを見出し、本発明の完成に至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have added a quaternary ammonium salt to the extract when purifying the protein from an E. coli extract capable of expressing a heterologous protein. The inventors have found that the protein having a low endotoxin content can be obtained by performing purification by chromatography including at least purification by cation exchange chromatography, and the present invention has been completed.
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
（ｉ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物から、クロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する方法であって、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含む、前記精製方法。
That is, the present invention includes the following inventions:
(I) A method for purifying the protein by chromatography from an extract of recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding the protein, wherein the extract is quaternary. The said purification method which refine | purifies by the said chromatography after adding an ammonium salt, and the purification by the said chromatography contains the refinement | purification by cation exchange chromatography at least.
（ｉｉ）第四級アンモニウム塩が臭化セチルトリメチルアンモニウム塩である、（ｉ）に記載の精製方法。 (Ii) The purification method according to (i), wherein the quaternary ammonium salt is a cetyltrimethylammonium bromide salt.
（ｉｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製が、カルボキシメチル基を導入した担体を用いた精製である、（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかに記載の精製方法。 (Iii) The purification method according to any one of (i) and (ii), wherein the purification by cation exchange chromatography is purification using a carrier into which a carboxymethyl group has been introduced.
（ｉｖ）タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載の精製方法。 (Iv) The purification method according to any one of (i) to (iii), wherein the protein is a human Fc-binding protein.
（ｖ）ヒトＦｃ結合性タンパク質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、（ｉｖ）に記載の精製方法。 (V) a human Fc-binding protein comprising (1) a protein comprising at least the 16th glutamine to 289th valine amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (2) the sequence of SEQ ID NO: 1 The protein according to (iv), wherein the protein comprises at least the 16th glutamine to 289th valine in the amino acid sequence, and at least one of the amino acids is substituted, inserted or deleted with another amino acid. Purification method.
（ｖｉ）ヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物に第四級アンモニウム塩を添加後、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むクロマトグラフィーによる精製を行なうことで得られた、ヒトＦｃ結合性タンパク質。 (Vi) A quaternary ammonium salt is added to an extract of recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding a human Fc-binding protein, followed by purification by cation exchange chromatography. A human Fc-binding protein obtained by performing chromatographic purification at least.
（ｖｉｉ）（ｖｉ）に記載のヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化して得られる、免疫グロブリン吸着剤。 (Vii) An immunoglobulin adsorbent obtained by immobilizing the human Fc-binding protein according to (vi) on a carrier.
以下に、本発明を詳細に説明する。 The present invention is described in detail below.
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物から、クロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する際、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むことを特徴としている。 In the present invention, when the protein is purified by chromatography from an extract of recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding the protein, a quaternary ammonium salt is added to the extract. And the purification by chromatography is performed, and the purification by chromatography includes at least the purification by cation exchange chromatography.
本発明における、組換え大腸菌の抽出物は、組換え大腸菌の培養液を遠心分離して得られる菌体を適切な緩衝液で懸濁してから細胞を破砕（物理的破砕、薬剤による破砕等）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで取得することができる。破砕に用いる薬剤の一例として、１５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡと６ｍＭ ＭｇＳＯ４と２５０Ｕ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）と０．３ｇ／Ｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅと０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）と０．０５％ デオキシコール酸ナトリウムと５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）があげられる。なお、細胞破砕後、ｐＨ２．５からｐＨ５．０の条件下で酸処理すると、破砕液に含まれる夾雑タンパク質が効率的に除去できるため、好ましい（特願２０１２−２４４４３５号）。 In the present invention, the recombinant Escherichia coli extract is prepared by suspending cells obtained by centrifuging a recombinant Escherichia coli culture solution with an appropriate buffer, and then disrupting the cells (physical disruption, disruption with drugs, etc.). Then, it can acquire by removing a crushing residue by centrifugation. As an example of the drug used for crushing, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6 mM MgSO 4 , 250 U / L Benzonase (trade name), 0.3 g / L Lysozyme, 0.2% Triton X-100 (trade name) and 0.05 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing% sodium deoxycholate and 50 mM CaCl 2 . In addition, it is preferable to perform acid treatment under conditions of pH 2.5 to pH 5.0 after cell disruption because contaminating proteins contained in the disruption solution can be efficiently removed (Japanese Patent Application No. 2012-244435).
本発明の特徴の一つである、組換え大腸菌の抽出物に添加する第四級アンモニウム塩は、負電荷に帯電しているエンドトキシンを吸着除去できることが期待される。第四級アンモニウム塩の例としては、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム塩等のジアルキルジメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジウム等のアルキルピリジウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウムがあげられる。この中でも、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）が本発明で用いる第四級アンモニウム塩として好ましい。 It is expected that the quaternary ammonium salt added to the recombinant Escherichia coli extract, which is one of the features of the present invention, can adsorb and remove endotoxin charged to a negative charge. Examples of quaternary ammonium salts include stearyl trimethyl ammonium chloride, lauryl trimethyl ammonium chloride, alkyl trimethyl ammonium salts such as lauryl trimethyl ammonium bromide, cetyl trimethyl ammonium bromide, and dialkyl dimethyl ammonium salts such as distearyl dimethyl ammonium chloride. And alkylpyridinium salts such as cetylpyridinium chloride, alkyldimethylbenzylammonium salts, benzethonium chloride, and benzalkonium chloride. Among these, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) is preferable as the quaternary ammonium salt used in the present invention.
第四級アンモニウム塩の添加濃度については、抽出物中の夾雑物の影響や臨界ミセル濃度などを考慮し、適宜設定すればよく、一例としてＣＴＡＢの場合、終濃度で０．０５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の間、好ましくは終濃度０．１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間、特に好ましくは終濃度０．３％（ｗ／ｖ）から０．７％（ｗ／ｖ）の間である。 The addition concentration of the quaternary ammonium salt may be appropriately set in consideration of the influence of contaminants in the extract, the critical micelle concentration, and the like. For example, in the case of CTAB, the final concentration is 0.05% (w / w v) to 2% (w / v), preferably between 0.1% (w / v) to 1% (w / v), particularly preferably 0.3% (w / v) ) To 0.7% (w / v).
本発明では、組換え大腸菌の抽出物に第四級アンモニウム塩を添加した後は、クロマトグラフィーによる精製を行なうが、その際、陽イオンクロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むことを特徴としている。陽イオンクロマトグラフィーによる精製で用いる担体の一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０（東ソー製）やＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）といったカルボキシメチル基を導入した担体や、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０（東ソー製）といったスルホプロピル基を導入した担体があげられる。中でも、カルボキシメチル基を導入した担体を用いて陽イオンクロマトグラフィーによる精製を行なうと好ましい。なお陽イオンクロマトグラフィーによる精製において、組換え大腸菌の抽出物や溶出に用いる緩衝液に尿素を添加すると、高純度かつ高い回収率でＦｃ結合性タンパク質を精製することができるため好ましい（特願２０１１−１２６０８４号）。 In the present invention, after adding a quaternary ammonium salt to the recombinant Escherichia coli extract, purification by chromatography is performed, and at this time, at least purification by cation chromatography is included. Examples of carriers used for purification by cation chromatography include carriers introduced with a carboxymethyl group such as TOYOPEARL CM-650 (manufactured by Tosoh Corp.) and CM Sepharose Fast Flow (manufactured by GE Healthcare Corp.), and TOYOPEARL SP-650 (manufactured by Tosoh Corp.). And a carrier having a sulfopropyl group introduced therein. Among them, it is preferable to carry out purification by cation chromatography using a carrier into which a carboxymethyl group has been introduced. In the purification by cation chromatography, it is preferable to add urea to the recombinant Escherichia coli extract or the buffer used for elution because the Fc-binding protein can be purified with high purity and high recovery rate (Japanese Patent Application No. 2011). -128604).
なお本発明における、クロマトグラフィーによる精製は、陽イオンクロマトグラフィーによる精製を少なくとも含んでいればよく、陽イオンクロマトグラフィー以外の原理を利用したクロマトグラフィーによる精製をさらに行なってもよい。特に、疎水クロマトグラフィーによる精製をさらに行なうと、組換え大腸菌の抽出物に含まれる夾雑物を効率的に除去できるため好ましい。疎水クロマトグラフィーによる精製で用いる担体の一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｅｔｈｅｒ−６５０（東ソー製）といったエーテル基を導入した担体や、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０（東ソー製）といったフェニル基を導入した担体や、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０（東ソー製）といったブチル基を導入した担体があげられる。中でも、フェニル基を導入した担体を用いて疎水クロマトグラフィーによる精製を行なうと好ましい。 In the present invention, the purification by chromatography only needs to include at least purification by cation chromatography, and may be further purified by chromatography using a principle other than cation chromatography. In particular, further purification by hydrophobic chromatography is preferred because impurities contained in the recombinant Escherichia coli extract can be efficiently removed. As an example of a carrier used for purification by hydrophobic chromatography, a carrier into which an ether group such as TOYOPEARL Ether-650 (manufactured by Tosoh) is introduced, a carrier into which a phenyl group is introduced such as TOYOPEARL Phenyl-650 (manufactured by Tosoh), TOYOPEARL Butyl-650 Examples thereof include a carrier introduced with a butyl group (Tosoh). Among them, it is preferable to perform purification by hydrophobic chromatography using a carrier into which a phenyl group is introduced.
クロマトグラフィーによる精製を行なう際は、精製対象溶液に含まれるタンパク量や各クロマトグラフィー用担体が有するタンパク吸着性能を考慮して決定した量の前記担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、クロマトグラフィー用担体は、精製対象溶液を導入する前に、あらかじめ適切な緩衝液（トリス／塩酸緩衝液、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等）により平衡化しておくとよい。 When purifying by chromatography, the amount of the protein determined in consideration of the amount of protein contained in the solution to be purified and the protein adsorption performance of each chromatography carrier can be packed in an appropriate open column. That's fine. The chromatographic carrier is preferably equilibrated in advance with an appropriate buffer (Tris / HCl buffer, glycine / sodium hydroxide buffer, phosphate buffer, etc.) before introducing the solution to be purified. .
本発明で精製したタンパク質の分析方法は、従来から知られている安定かつ効率的に定量できる方法の中から適宜選択すればよい。例えば、タンパク質濃度の測定はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ製）等の市販のキットを用いればよく、精製溶液中に含まれるエンドトキシンの測定もＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（和光純薬製）等の市販のキットを用いればよい。 The analysis method of the protein purified in the present invention may be appropriately selected from conventionally known methods that allow stable and efficient quantification. For example, protein concentration may be measured using a commercially available kit such as Bio-Rad Protein Assay (manufactured by BioRad), and endotoxin contained in the purified solution may be measured using a commercially available kit such as Endosafe-PTS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). May be used.
本発明の方法で精製するタンパク質は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌の菌体内に発現するタンパク質であれば特に限定されない。ここでは前記タンパク質の一例である、ヒトＦｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。 The protein to be purified by the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a protein expressed in the cells of recombinant E. coli obtained by transforming E. coli using a vector containing a polynucleotide encoding the protein. Here, human Fc-binding protein, which is an example of the protein, will be described in detail.
本明細書においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域（図１ではＥＣ領域））を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するポリペプチドのうち、少なくとも抗体（免疫グロブリンＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のヒトＦｃ結合性タンパク質があげられる。
In this specification, human Fc-binding protein refers to the extracellular region of human FcγRI (specifically, in the case of natural human FcγRI, the region from the 16th to the 292nd of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 (FIG. 1 Then, it refers to the protein constituting the EC region)). However, it may not necessarily be the entire region of the human FcγRI extracellular region, and among the polypeptides constituting the human FcγRI extracellular region, a region capable of expressing at least the original function of binding to the Fc region of an antibody (immunoglobulin G) As long as it contains the polypeptide. As an example of the human Fc binding protein,
(I) a protein comprising amino acids from at least the 16th glutamine to the 289th valine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(Ii) including at least the 16th glutamine to 289th valine amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and at least one of the amino acids is substituted, inserted or deleted with another amino acid protein,
Can be given. Specific examples of the above (ii) include the human Fc binding protein disclosed in JP2011-206046.
本発明の精製方法で得られたタンパク質は、宿主（大腸菌）に多く含まれるエンドトキシンの含有量が大幅に削減されている。そのため、本発明の精製方法により得られたヒトＦｃ結合性タンパク質は、医薬品、バイオセンサー、臨床検査薬等の医薬品用途での利用が可能となる。特に本発明の精製方法で得られたヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化すると、抗体医薬といった、医薬品用途で利用する免疫グロブリンを精製するための吸着剤としての利用ができるため好ましい。 In the protein obtained by the purification method of the present invention, the content of endotoxin contained in a large amount in the host (E. coli) is greatly reduced. Therefore, the human Fc-binding protein obtained by the purification method of the present invention can be used for pharmaceutical applications such as pharmaceuticals, biosensors, and clinical diagnostics. In particular, it is preferable to immobilize the human Fc-binding protein obtained by the purification method of the present invention on a carrier because it can be used as an adsorbent for purifying immunoglobulins used for pharmaceutical applications such as antibody drugs.
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物から、クロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する方法において、前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含むことを特徴とする。本発明の精製方法は、組換え大腸菌の抽出物に多く含まれる、リポ多糖やタンパク質の複合体等のエンドトキシンを効果的に削減することができる。そのため、本発明の精製方法により得られた前記タンパク質は、医薬品用途目的に利用することができる。また本発明の精製方法は、スケールに関係なく実施できることから、前記タンパク質を工業的に生産する場合においても有用である。 The present invention relates to a method for purifying a protein by chromatography from an extract of recombinant Escherichia coli obtained by transforming Escherichia coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding the protein. The chromatography purification is performed after adding a salt, and the chromatography purification includes at least purification by cation exchange chromatography. The purification method of the present invention can effectively reduce endotoxins such as lipopolysaccharide and protein complex, which are contained in a large amount of recombinant Escherichia coli extract. Therefore, the protein obtained by the purification method of the present invention can be used for pharmaceutical purposes. Moreover, since the purification method of the present invention can be carried out regardless of the scale, it is useful even when the protein is industrially produced.
特に、前記タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、本発明の精製方法で得られたヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化することで、抗体医薬等医薬品用途で使用する免疫グロブリン吸着剤を製造することができる。 In particular, when the protein is a human Fc-binding protein, an immunoglobulin adsorbent for use in pharmaceutical applications such as antibody drugs is produced by immobilizing the human Fc-binding protein obtained by the purification method of the present invention on a carrier. can do.
以下、ヒトＦｃ結合性タンパク質の精製を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to purification of human Fc-binding protein, but the present invention is not limited thereto.
実施例１
（１）ヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、特開２０１２−０３４５９１号公報に記載の方法で培養することで、前記タンパク質を発現させた。
（２）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、抽出液（６５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５０Ｕ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）、０．０５ｇ／Ｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）および５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加して回収した菌体を懸濁させ、さらに臭化セチルトリメチルアンモニウム塩（ＣＴＡＢ）を終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）添加して撹拌することで、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（３）（２）で得られた菌体抽出液に、酢酸を、液のｐＨが３．５となるよう、撹拌しながら滴下することで酸処理を行ない、遠心分離により回収した上清を酸処理液とした。
（４）酸処理液に尿素を終濃度１ｍｏｌ／Ｌとなるよう添加後、あらかじめ平衡化緩衝液Ａ（１ｍｏｌ／Ｌ 尿素を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０））で平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィー用ゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０、東ソー製）を充填したカラムに添加し、平衡化緩衝液Ａで十分洗浄後、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液ＡでＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（５）（４）の溶出液を、特開２０１１−１２６８２７号に記載の疎水クロマトグラフィーを用いた方法によりヒトＦｃ結合性タンパク質を精製した。
（６）あらかじめ平衡化緩衝液Ｂ（脱エンドトキシン化した２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィー用ゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０、東ソー製）を充填したカラムに、（５）で精製したＦｃ結合性タンパク質溶液を添加した。
（７）平衡化緩衝液Ｂで十分量洗浄後、脱エンドトキシン化した１Ｍ ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液Ｂで溶出することで、高度に精製したヒトＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を得た。
（８）タンパク質濃度をＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド社製）で、エンドトキシン濃度をＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ（和光純薬社製）で、それぞれ測定したところ、タンパク質あたりのエンドトキシン含有量は３．４ＥＵ／ｍｇであった（ＥＵ：エンドトキシン活性単位）。
Example 1
(1) Recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding a human Fc-binding protein is cultured by the method described in JP2012-034591A, Protein was expressed.
(2) After recovering the cells from the recombinant Escherichia coli culture solution, the extract (650 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6 mM MgSO 4 , 250 U / L Benzonase (trade name), 0.05 g / L Lysozyme, 0.4% Triton) X-100 (trade name) and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 50 mM CaCl 2 ) were added to suspend the recovered cells, and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) was added at a final concentration. The protein expressed in the cells was extracted by adding 0.5% (w / v) and stirring.
(3) Acetic acid is added dropwise to the bacterial cell extract obtained in (2) while stirring so that the pH of the solution becomes 3.5, and the supernatant recovered by centrifugation is collected. An acid treatment solution was obtained.
(4) After adding urea to the acid treatment solution so as to have a final concentration of 1 mol / L, equilibrate in advance with equilibration buffer A (20 mmol / L phosphate buffer (pH 6.0) containing 1 mol / L urea). Added to a column packed with a gel for cation exchange chromatography (TOYOPEARL CM-650, manufactured by Tosoh Corporation), washed thoroughly with equilibration buffer A, and then Fc-bound with equilibration buffer A containing 1 mol / L NaCl. Sex protein was eluted.
(5) The human Fc-binding protein was purified from the eluate of (4) by the method using hydrophobic chromatography described in JP2011-126927A.
(6) Column packed with cation-exchange chromatography gel (TOYOPEARL CM-650, manufactured by Tosoh) equilibrated in advance with equilibration buffer B (de-endotoxinized 20 mM phosphate buffer (pH 7.0)) The Fc-binding protein solution purified in (5) was added.
(7) After washing with a sufficient amount of equilibration buffer B, elution was performed with equilibration buffer B containing 1M NaCl that was de-endotoxinized to obtain a solution containing highly purified human Fc-binding protein.
(8) When the protein concentration was measured with Protein Assay Reagent (manufactured by Bio-Rad) and the endotoxin concentration was measured with Endosafe-PTS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the endotoxin content per protein was 3.4 EU / mg. (EU: endotoxin activity unit).
実施例２
実施例１の（２）で添加するＣＴＡＢを終濃度で０．１％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、７．５ＥＵ／ｍｇであった。
Example 2
The same experiment as in Example 1 was performed except that CTAB added in (2) of Example 1 was changed to a final concentration of 0.1% (w / v). As a result, it was 7.5 EU / mg.
実施例３
実施例１の（２）で添加するＣＴＡＢを終濃度で１％（ｗ／ｖ）とした他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、５．９ＥＵ／ｍｇであった。
Example 3
The same experiment as in Example 1 was performed, except that CTAB added in (2) of Example 1 was changed to a final concentration of 1% (w / v). The result was 5.9 EU / mg.
比較例１
実施例１（２）でＣＴＡＢを添加しない他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、エンドトキシン含有量は＞１００ＥＵ／ｍｇであった。
Comparative Example 1
The same experiment as in Example 1 was performed except that CTAB was not added in Example 1 (2). As a result, the endotoxin content was> 100 EU / mg.
比較例２
実施例１（４）および実施例１（６）に記載の陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行なわない他は、実施例１と同様の実験を行なった。結果、エンドトキシン含有量は＞１００００ＥＵ／ｍｇであった。
Comparative Example 2
The same experiment as in Example 1 was performed, except that the purification by cation exchange chromatography described in Example 1 (4) and Example 1 (6) was not performed. As a result, the endotoxin content was> 10000 EU / mg.
実施例および比較例の結果をまとめたものを表１に示す。タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる組換え大腸菌の抽出物からクロマトグラフィーにより前記タンパク質を精製する際、前記抽出物に第四級アンモニウム塩であるＣＴＡＢを添加後、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を含むクロマトグラフィーによる精製を行なうことで、組換え大腸菌により得られた異種タンパク質であっても、エンドトキシンの含有がほとんどない異種タンパク質を製造することができることがわかる。 Table 1 summarizes the results of Examples and Comparative Examples. When purifying the protein by chromatography from an extract of recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with an expression vector containing a protein-encoding polynucleotide, CTAB, which is a quaternary ammonium salt, is added to the extract. Later, it can be seen that by performing purification by chromatography including purification by cation exchange chromatography, it is possible to produce a heterologous protein almost free of endotoxin even if it is a heterologous protein obtained by recombinant Escherichia coli. .
Claims (5)
前記抽出物に第四級アンモニウム塩を添加してから前記クロマトグラフィーによる精製を行ない、かつ前記クロマトグラフィーによる精製が、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を少なくとも含みかつ第四級アンモニウム塩が前記抽出物に含まれるエンドトキシンを吸着したものを除去することを少なくとも含む、前記精製方法。 A method for purifying the protein by chromatography from an extract of recombinant E. coli obtained by transforming E. coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding the protein,
The extract subjected to purification by the chromatography after the addition of quaternary ammonium salt, and the purification by chromatography, at least contain and quaternary ammonium salt the extract purified by cation exchange chromatography The purification method comprising at least removing the adsorbed endotoxin contained in .
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質である、
請求項４に記載の精製方法。 Human Fc binding protein,
The amino acid sequence depicted in SEQ ID NO: 1 is a protein comprising amino acids from at least the 16th glutamine to 289 valine,
The purification method according to claim 4.
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