JP6146797B2 - Ｈｅｒ２タンパク質検出プローブ、ｈｅｒ２タンパク質検出プローブの製造方法およびｈｅｒ２タンパク質の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＨＥＲ２タンパク質検出技術に関し、特に新規の融合タンパク質、その融合タンパク質を用いるＨＥＲ２タンパク質検出プローブ、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造方法およびＨＥＲ２タンパク質の検出方法に関する。

ＨＥＲ２は、心臓や神経の発達や維持に関与し、その他の細胞でも細胞増殖、分化などの調節に関与する受容体型チロシンキナーゼであり、１２３４残基から形成される約１８５ｋＤａの糖タンパク質である。多くの癌細胞でＨＥＲ２が過剰発現していることから、癌マーカーとして知られている。癌マーカーであるＨＥＲ２を検出するために、ＨＥＲ２に対する抗体に標識化合物を結合させた分子が用いられている。標識化合物を抗体に結合させるには、通常、化学結合法が用いられている。一方、ＨＥＲ２に特異的に結合する分子として、プロテインＡのＺドメインが知られている（例えば、非特許文献１−３参照）。これは抗体に比べ分子の大きさが小さく、大腸菌等の微生物で作製可能であり、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）として知られているほか、標識分子と化学結合させたハイプリッド分子が作製されている。

しかしながら、標識分子と抗体を化学的に結合した分子は、抗体の結合力が低下したり、標識分子の性能が低下することがある。特に、標識分子が酵素の場合は、酵素の性能が低下することが避けられない。また、標識分子と抗体を化学的に結合させる場合は、結合させるための化学反応や、化学反応後に結合しなかった余分な単体の分子を除去する精製作業が必要になり、作製するための手間が多くかかる。さらには、抗体を生産するには、一般的に、ウサギやマウス、ヤギといった高等生物を用いる必要があり、高コストであることが避けられないほか実験動物を使用せざるを得ない。

一方、アミノ酸のリシン（Ｌｙｓ）とグルタミン（Ｇｌｎ）の側鎖同士を結合する活性を持つ酵素であるトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、タンパク質に対して部位特異的に酵素修飾する技術がある（例えば、特許文献１、非特許文献４参照）。

特開２００８−５４６５８号公報

Karin Nord, Elin Gunneriusson, Jenny Ringdahl, Stefan Stahl, Mathias Uhlen, Pre-Ake Nygren, Binding protein s selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain, Nat.Biotechnol.,15, 772-777(1997) Anna Orlova, Mikaela Magnusson, Tove L.J.Eriksson, Martin Nilsson, Barbro Larsson, Ingmarie Hoiden-Guthenberg, Charles Widstrom, Jorgen Carlsson, Vladirmir Tolrmachev, Stefan Stahl, Fredrik Y.Nilsson, Tumor Imaging Using a Picomolar Affinity HER2 Binding Affibody Molecule, Cancer Res 2006;66:(8).April 15, 2006 Ilya Lyakhov, Rafal Zielinski, Monika Kuban, Gabriela Kramer-Marek, Robert Fisher, 0leg Chertov, Lakshman Bindu, Jacek capala, HER2- and EGFR-Specific Affiprobes: Novel Recombinant Oprical Probes for Cell Imaging, ChemBioChem 2010, 11, 345-350 M.Kitaoka, Y.Tsuruda, Y Tanaka, M.Goto, M.Mitsumori, K.Hayashi, Y.Hiraishi, K.Miyawaki, S.Noji, N.Kamiya, Transglutaminase-mediated synthesis of a novel DNA-(enzyme)n probe for highly sensitive DNA detection, Chem.Eur.J., 19, 5387-5392(2011)

本発明の目的は、良好な感度でＨＥＲ２タンパク質を検出可能であり、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造等に適用可能な融合タンパク質を提供することにある。

また、本発明の目的は、良好な感度でＨＥＲ２タンパク質を検出可能なＨＥＲ２タンパク質検出プローブ、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造方法およびＨＥＲ２タンパク質の検出方法を提供することにある。

また、本発明は、複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体に、リシン（Ｌｙｓ）残基を有する複数の融合タンパク質が結合されて構成されており、前記複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体は、下記式（５）のヌクレオシド三リン酸誘導体が複数導入された核酸であり、前記融合タンパク質は、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とが融合されたものであり、リシン（Ｌｙｓ）残基を含むタグを有する、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブである。
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−または−（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）

また、本発明は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体に、リシン（Ｌｙｓ）残基を有する複数の融合タンパク質を結合し、前記複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体は、下記式（５）のヌクレオシド三リン酸誘導体が複数導入された核酸であり、前記融合タンパク質は、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とが融合されたものであり、リシン（Ｌｙｓ）残基を含むタグを有する、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造方法である。
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−または−（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）

また、本発明は、ＨＥＲ２タンパク質の検出方法であって、前記ＨＥＲ２タンパク質検出プローブと、対象物中に存在するＨＥＲ２タンパク質とを結合させ、結合している前記ＨＥＲ２タンパク質検出プローブを、前記標識酵素により検出するＨＥＲ２タンパク質の検出方法である。

本発明では、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合させることにより、良好な感度でＨＥＲ２タンパク質を検出可能であり、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造等に適用可能な融合タンパク質を提供することができる。

また、本発明では、その融合タンパク質を用いることにより、良好な感度でＨＥＲ２タンパク質を検出可能なＨＥＲ２タンパク質検出プローブ、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造方法およびＨＥＲ２タンパク質の検出方法を提供することができる。

融合タンパク質（ＺＺ−ＡＰ）とＺ−ＱＧ導入ＤＮＡ（（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡ）とから、ＭＴＧを用いた反応により（ＺＺ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡプローブを得る方法の一例を示す概略図である。 Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成方法の一例を示す図である。 ｐＵＣｍｉｎｕｓＭＣＳ−ＺＺ−ＡＰプラスミドの情報を示す図である。 ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰの構築を示す図である。 ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＡＰの構築を示す図である。 ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＧＳ−ＡＰの構築を示す図である。 ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＧＳ−ＡＰの構築を示す図である。 実施例において得られた融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 実施例における各種ＡＰの酵素活性評価を示す図である。 実施例において、得られた融合タンパク質に対し、蛍光物質をリジンを含むタグに結合させた後に、ＨＥＲ２陽性細胞を特異的に検出した例を示す図である。 実施例において得られた融合タンパク質のＨＥＲ２特異的結合力評価におけるＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔの結果を示す図である。 実施例において得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例において得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのアニオン交換クロマトグラムの結果を示す図である（３１０ｂｐ）。 実施例において得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのアニオン交換クロマトグラムの結果を示す図である（９６０ｂｐ）。 実施例において得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのＺ−ＧＳ−ＡＰラベル量を示す図である（３１０ｂｐ）。 実施例において得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのＺ−ＧＳ−ＡＰラベル量を示す図である（９６０ｂｐ）。 実施例において得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡの酵素数増加によるシグナル増幅の効果に関するＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 実施例において得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのＺ_３４２の多価効果に関するＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。

本発明者らは、新規の融合タンパク質、およびその融合タンパク質を用いた新規高感度ＨＥＲ２タンパク質検出プローブの作製を検討した。アフィニティプロテインとして、例えば、Staphylococcal protein A由来Ｚドメインのライブラリからファージディスプレイ法を利用して選抜されたＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）に着目した。Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）は、抗体にはない特性としてサイズが約６ｋＤａと非常に小さく、翻訳後修飾を必要としないため、微生物を宿主とした大量発現が可能であることを大きな特徴とする。２００４年にＡｎｔｉ−ＨＥＲ２ Ａｆｆｉｂｏｄｙが、Ｗｉｋｍａｎらによって初めて報告され、２００６年には、Ｏｒｌｏｖａらによってアフィニティ成熟の行程を経て、よりアフィニティの強いＺ_{ｈｅｒ２：３４２}（Ｚ_３４２）が見出され、二量体化させるとアフィニティが増大することが示された。

本発明者らは、遺伝子工学的手法により、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合した融合タンパク質を発現させることを検討し、新規の融合タンパク質を得た。また、部位特異的に酵素修飾する技術として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。融合タンパク質の発現の際に、標識酵素にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）またはＧｌｎ残基（Ｑ）を含むＴＧａｓｅ認識配列をタグとして付与して、タグを付与した融合タンパク質を得る。一方、ＰＣＲ法等を利用して、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基（Ｑ）またはＬｙｓ残基（Ｋ）を少なくとも１つ、好ましくは複数導入したＤＮＡを調製する。これらをＴＧａｓｅ触媒反応により架橋させることで、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素が少なくとも１つ、好ましくは複数導入されたＨＥＲ２タンパク質検出プローブを創製する。

例えば図１に示すように、遺伝子工学的手法により、ＨＥＲ２に特異的に結合する能力を持つＺ_３４２の二量体（ＺＺ）と大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）とを融合した融合タンパク質（Ｚ_３４２）_２−ＢＡＰとして発現させ、その際、ＢＡＰのＣ末端側にＭＴＧ認識配列Ｋ−ｔａｇ（ＭＲＨＫＧＳ）を付与して、（Ｚ_３４２）_２−ＢＡＰ−ＣＫ（ＺＺ−ＡＰ）等の新規の融合タンパク質を得る。一方、ＰＣＲ法を利用して、ＭＴＧ認識基質であるＺ−ＱＧを少なくとも１つ、好ましくは複数導入したＤＮＡ(（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡ)、ｎ＝１以上）を調製する。これらをＭＴＧ触媒反応により架橋させることで、Ｚ_３４２の二量体（ＺＺ）とＢＡＰが少なくとも１つ、好ましくは複数導入されたＨＥＲ２タンパク質検出プローブ（（ＺＺ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡ）を創製する。

このような複合体を作製することで、例えば、１分子のプローブ中に導入する標識酵素数を増加することにより、シグナルの増幅による検出の高感度化が期待される。また、プローブ中に抗原認識部となるＺ_３４２の二量体（ＺＺ）を導入することにより、Ｚ_３４２の多価効果による抗原に対する見かけの親和力の増大が期待される。さらにＤＮＡの特性を利用して負電荷による水溶性の付与、構造体の厳密な分子設計等も可能である。また、Ａｆｆｉｂｏｄｙライブラリの変異は１３カ所のみであることから、ＨＥＲ２だけでなくあらゆるタンパク質検出技術の革新的プラットフォームとなることが期待される。

＜融合タンパク質＞
本発明の実施形態に係る融合タンパク質は、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なアフィニティ分子と標識酵素との融合タンパク質であり、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合した融合タンパク質である。本実施形態に係る融合タンパク質は、微生物等で生産可能である。この融合タンパク質を用いて、ＨＥＲ２タンパク質を特異的に検出することができる。

本実施形態に係る融合タンパク質は、部位特異的な酵素修飾が可能なタグを有することが好ましく、ＴＧａｓｅによる部位特異的な酵素修飾が可能なタグ、例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するタグを有することがより好ましい。ＨＥＲ２タンパク質に対して特異的に結合することで知られているプロテインＡ変異体であるＺドメインと、標識酵素のハイブリッド分子を、融合タンパク質として作製する。これにより、化学結合法によらずに、ＨＥＲ２に対するアフィニティ分子と標識酵素のハイプリット体を作製することができる。

化学結合法によらず、標識酵素とアフィニティ分子が融合した融合タンパク質を得ることにより、アフィニティ分子の性能をほとんど低下させることない。また、融合タンパク質が部位特異的な酵素修飾が可能なタグを有することにより、アフィニティ分子の性能をほとんど低下させることなく、蛍光物質等の標識を可能にする。さらに、そのタグを利用し、高分子担体に複数の融合タンパク質を連結させることにより、ＨＥＲ２タンパク質の検出能力および性能を向上させることも可能となる。

アフィニティ分子である、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体としては、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）として知られているものがある。Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）は、Staphylococcal protein Aの免疫グロブリン結合領域のうち、Ｂドメインに由来するタンパク質である。Ｂドメインは、比較的に短くＣｙｓ残基を持たない５８残基のペプチド（約６ｋＤａ）であり、３つのα−ヘリックスから形成される。フォールディング速度は、既報のタンパク質の中でも最も迅速なものの１つであり、加えて高い水溶性と耐熱性を有する。このＢドメインに対し、化学的な耐性を高めるために変異を導入した組み換え体は、Ｚドメイン（Zwt, pI 5.16，Ｍｗ＝６６４０）と称される。変異導入によるＺドメインは、抗体のＦｃ部に対するアフィニティを維持する一方で、Ｆａｂ領域に対する弱いアフィニティが欠損されている。Ｚドメインの耐性力と、多種多様な免疫グロブリン種、プロテインＡ、免疫グロブリン結合ドメインの誘導体に特異的に結合する能力から、バイオテクノロジの分野で広く利用されている。Ｚドメインの有益な性質は、抗体結合種としての性質にとどまらず、いっそう広範にわたる多様なアプリケーションにおいても優れた利点である。

標識酵素としては、発色反応などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。融合タンパク質を大腸菌で作製できるように、標識酵素にバクテリア由来アルカリホスファターゼを用いることが好ましい。

ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合した融合タンパク質としては、Ｚドメイン（Ｚ）が２つ連なり、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）が融合したＺＺ−ＡＰの他に、１つのＺドメインにアルカリホスファターゼが融合したＺ−ＡＰ、または発現効率等への影響も考慮し、ＺＺとＡＰの間、ＺとＡＰの間に空間的余裕をもたせるためにリンカーを導入した分子（ＺＺ−ｌｉｎｋｅｒ−ＡＰ、Ｚ−ｌｉｎｋｅｒ−ＡＰ）等がある。

リンカーとしては、ＧＧＧＧＳリンカー、ＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳリンカー等が挙げられる。

本発明の実施形態に係る融合タンパク質は、ＨＥＲ２タンパク質の特異的検出、後述するＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造等に適用可能な他、分離、精製等に利用可能である。

本発明の実施形態に係る融合タンパク質は、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合したものであるが、アフィニティ分子は、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体以外にも、一本鎖抗体、ラクダ抗体等であってもよい。

＜ＨＥＲ２タンパク質検出プローブおよびその製造方法＞
本実施形態に係るＨＥＲ２タンパク質検出プローブは、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体に、リシン（Ｌｙｓ）残基を含む部位特異的な酵素修飾が可能なタグを有する、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合した少なくとも１つの融合タンパク質が結合されて構成されているものである。または、本実施形態に係るＨＥＲ２タンパク質検出プローブは、少なくとも１つのリシン（Ｌｙｓ）残基を有する高分子担体に、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を含む部位特異的な酵素修飾が可能なタグを有する、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合した少なくとも１つの融合タンパク質が結合されて構成されているものである。

また、本実施形態に係るＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造方法は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体に、リシン（Ｌｙｓ）残基を含む部位特異的な酵素修飾が可能なタグを有する、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合した少なくとも１つの融合タンパク質を結合する方法である。または、本実施形態に係るＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造方法は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、少なくとも１つのリシン（Ｌｙｓ）残基を有する高分子担体に、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を含む部位特異的な酵素修飾が可能なタグを有する、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とを融合した少なくとも１つの融合タンパク質を結合する方法である。

上記融合タンパク質を高分子担体に共有結合的に導入する手法として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。このＴＧａｓｅを用いて、上記融合タンパク質を高分子担体に導入したＨＥＲ２タンパク質検出プローブの創製を行う。ＭＴＧ等は基質認識特性が高いため、高分子担体の反応点と上記融合タンパク質の反応タグ部分を選択的に架橋することができ、標識酵素の活性をほとんど低下させずに導入できる。

具体的には、例えば、図１に示すように、遺伝子工学的手法により、ＨＥＲ２に特異的に結合する能力を持つＺ_３４２の二量体（ＺＺ）と大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）とを融合した融合タンパク質（Ｚ_３４２）_２−ＢＡＰとして発現させ、その際、ＢＡＰのＣ末端側にＭＴＧ認識配列Ｋ−ｔａｇ（ＭＲＨＫＧＳ）を付与して、（Ｚ_３４２）_２−ＢＡＰ−ＣＫ（ＺＺ−ＡＰ）等の新規の融合タンパク質を得る。一方、例えば、図２に示すように、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）に、ＴＧａｓｅが認識するＧｌｎ（ＭＴＧ認識Ｇｌｎ）を有するＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体であるＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成する。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを用い、ＰＣＲ法を利用して、ＭＴＧ認識基質であるＺ−ＱＧを少なくとも１つ、好ましくは複数導入したＤＮＡ(（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡ)、ｎ＝１以上）を調製する。これらをＭＴＧ触媒反応により架橋させることで、Ｚ_３４２の二量体（ＺＺ）とＢＡＰが少なくとも１つ、好ましくは複数導入されたＨＥＲ２タンパク質検出プローブ（（ＺＺ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡ）を創製する。

なお、図１において、（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡにおけるＧｌｎ残基と、融合タンパク質におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、融合タンパク質（Ｚ_３４２）_２−ＢＡＰとして発現させる際、ＢＡＰのＣ末端側にＭＴＧ認識Ｇｌｎ残基を含むタグを付与して、融合タンパク質を得る。一方、ＭＴＧ認識Ｌｙｓ残基を少なくとも１つ、好ましくは複数導入したＤＮＡを調製する。これらをＭＴＧ触媒反応により架橋させることで、Ｚ_３４２の二量体（ＺＺ）とＢＡＰが少なくとも１つ、好ましくは複数導入されたＨＥＲ２タンパク質検出プローブ（（ＺＺ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡ）を創製する。

このようにして、ＨＥＲ２タンパク質の認識部位、標識酵素の活性部位への影響を抑制し、高分子担体に部位特異的に上記標識部分を含む融合タンパク質を導入することができる。

高分子担体としては、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡ等の核酸、アクリル酸ポリマ、メタクリル酸ポリマ、ポリアクリルアミド等の合成高分子等が挙げられる。核酸の配列および長さには特に制限はない。高分子担体がＤＮＡであることにより、ＤＮＡの特性を利用して負電荷による水溶性の付与、構造体の厳密な分子設計等も可能である。

高分子担体が核酸である場合、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を用いて、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎ残基またはＬｙｓ残基を少なくとも１つ、好ましくは複数導入したＤＮＡを調製すればよい。グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体としては、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体などが挙げられる。本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体において、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基は、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。

これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。

また、これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。

例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ．７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ．４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。

本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（１）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するウリジン三リン酸誘導体である。

（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）

本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（２）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するアデノシン三リン酸誘導体である。

（式（２）中、Ａ_１およびＡ_２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）

本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（３）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するシチジン三リン酸誘導体である。

（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）

本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（４）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するグアノシン三リン酸誘導体である。

（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）

Ａで表されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基としては、特に制限はないが、例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。

本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（５）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するＴＧａｓｅ基質修飾ヌクレオチド誘導体であることが好ましい。

（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して２価の連結基を表し、Ｚは、置換基を表す。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）

ＸおよびＹで表される２価の連結基としては、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｘ，Ｙは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基、炭素数１〜４８のアルコキシ基であることが好ましく、Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であることがより好ましい。Ｘ，Ｙはさらにエテニレン基、オキシアルキレン基、例えば−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−または−（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｎ−（ｎは繰り返し数でありｎ＝２，４，８，１２，２４）基などで置換されていてもよい。Ｙとしては、例えば、−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−Ｃ_２Ｈ_４−が挙げられる。

Ｚで表される置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜４８のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基などの炭素数１〜４８のアルコキシ基、フェニル基、ナフチル基などの炭素数６〜４８のアリール基、フェニルオキシ基などの炭素数６〜４８のアリールオキシ基、ベンジル基などの炭素数７〜４８のアリールアルキル基、ベンジルオキシ基などの炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基などが挙げられる。これらのうち、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましく、Ｚはベンジルオキシ基であることがより好ましい。Ｚはさらにジニトロフェニル基、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル基などで置換されていてもよい。また、上述したＹで表される置換との組み合わせで、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。

Ｘ，Ｙを適宜選択することにより、Ｚ−ＱＧとＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、酵素などのアクセスを向上することができる。また、Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、基質ペプチド配列を最適化し、例えば酵素などの親和性を向上することができる。

微生物由来ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）を用いる場合、ＭＴＧが認識可能なＧｌｎ残基は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）として存在することが好ましい。Ｚ−ＱＧは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などよりも分子サイズが小さいため好ましい。式（５）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体において、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基、Ｂが水素原子、ｍ＝０であるヌクレオチド誘導体が、ｄＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰである。また、ヌクレオシド三リン酸誘導体中には、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基とＬｙｓ残基または第一級アミンとが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、ＴＧａｓｅにより、自己架橋する可能性があり、目的のタンパク質−核酸複合体の収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。

また、微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、もしくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、もしくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｌｉｖｅｒ由来のＴＧａｓｅの良基質として、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、またはＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）もしくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。

なお、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドは、Ｎ末端アミノ基がＴＧａｓｅの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドについては、Ｎ末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりＴＧａｓｅの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「Ｎ末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、Ｎ末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来ＴＧａｓｅに関して、ＧＱＱＱＬＧのＮ末端アセチル化による保護（すなわち、Ａｃ−ＧＱＱＱＬＧ）、またＮ末端アミノ酸をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）にする（すなわち、ＤＯＰＡ−ＧＱＱＱＬＧ）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本実施形態においても利用することができる。

Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの調製方法を図２に示す。これは、本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。

まず、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するｄＵＴＰと、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧとを縮合することにより、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを得ることができる。

また、Ｃ末端のカルボキシル基を活性エステル化する上述の方法に加えて、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するペプチドをｄＵＴＰに導入する方法として、アミノ基と反応性の高い官能基をペプチドに導入する方法がある。例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドを調製できれば、これをアミノ化ｄＵＴＰと反応させることにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するｄＵＴＰを調製することができる。ただし、これらの反応性官能基は、基質ペプチドにおいてＴＧａｓｅ認識に影響がない部分に導入する必要がある。したがって、上述のように、Ｇｌｎ残基とは離れたＣ末端のカルボキシル基を活性化する方法は、この目的において最も優れたものの一つである。

Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの同定は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。

ＨＥＲ２タンパク質検出プローブにおいて、高分子担体と融合タンパク質との比率ｎは、１以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが２以上であることが好ましく、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、ＨＥＲ２との結合の効率が低下する場合がある。

また、例えば、以下の方法により、異なる標識酵素を有する複数のＨＥＲ２タンパク質検出プローブを調製することができる。
（１）ＴＧａｓｅの由来を変える。
（２）ＴＧａｓｅの基質特異性を変える。

（１）の方法では、例えば、用いるＴＧａｓｅの種類に応じて、異なる基質ペプチドで修飾されたＵＴＰなどを調製すればよい。

（２）の方法では、例えば、ＴＧａｓｅに、タンパク質工学的にアミノ酸変異を導入して基質特異性を変えればよい。例えば、ＭＴＧを大腸菌で調製し（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４０，Ｉｓｓｕｅ ６，２ Ｍａｙ ２００７，ｐ．１５４３−１５５０，”Ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”参照）、さらに変異体ライブラリを作って耐熱性の向上したＭＴＧを取得することができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３６，Ｉｓｓｕｅｓ ３−４，１０ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８，ｐ．１５６−１６２，”Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｅａｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔｓ”参照）。

本明細書において、「ＴＧａｓｅにより結合する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、Ｌｙｓ残基とＧｌｎ残基とが、ε（γ−グルタミル）リシン結合を形成することにより構成されている。

本実施形態においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基は、第一級アミンであってもよい。本明細書では、Ｌｙｓ残基を例に説明するが、その説明は、特別な場合を除き、第一級アミンにも当てはまる。

ＴＧａｓｅに対し、Ｌｙｓ残基供与体となる基質は、Ｇｌｎ残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとする標識酵素が、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を元来有している場合もあり、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むタグを酵素に付加する場合もある。

ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）は、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、ＭＲＨＫＧＳ（配列番号：２３）、ＭＲＲＫＧＳ（配列番号：２４）、ＭＨＲＫＧＳ（配列番号：２５）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドによるタグ化は、標識酵素を、タンパク質の所望の部位、例えばＣ末端またはＮ末端に連結する目的で用いることができる。ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含む他のペプチドまたはそのアミノ酸配列の例としては、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号：２２）などが挙げられる。

Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加した標識酵素は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれＮ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し（ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端に精製用ペプチドタグを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過クロマトグラフィなどにより行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認するか、Ｎ末端に導入された基質ペプチドについてはＮ末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで行うことができる。

融合タンパク質、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブを用いる際に、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行う場合には、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。その場合は、酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。

超好熱菌由来の酵素は、一般的に有機溶媒や熱に対して高い安定性を示すことが知られているため好ましく（例えば、Ｈ．Ａｔｏｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，ｐ．１６６−１７３（２００５）参照）、さらに、大腸菌を宿主とした大量調製が比較的容易に行うことができる点においても好ましい。大腸菌を宿主として耐熱性酵素を調製する場合、細胞破砕液を高温処理（例えば、８０℃で３０分温置）することで、大腸菌由来の共雑タンパク質のほとんどを沈殿させ、粗精製を容易に行うことができる。

超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない検出を行うことができると考えられる。

また、融合タンパク質、ＨＥＲ２タンパク質検出プローブにおいて、酵素が有機溶媒や熱に対して安定な酵素であってもよい。このような安定性の高い酵素は、自然界からのスクリーニング（例えば、化学と工業，ｖｏｌ．６１（Ｎｏ．６），ｐ．５７１−５７５（２００８）、内山拓，宮崎健太郎，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．５），ｐ．２３４−２３９（２００８）、道久則之，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．１２），ｐ．６６７−６７０（２００８））や、タンパク質工学的手法により安定性を高める技術（例えば、荻野博康，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．１６−２３（２００８）、宮崎健太郎，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．５２−５８（２００８））により得ることができる。これらの手法により、常温菌由来の酵素であっても、有機溶媒耐性や耐熱性を有する酵素へと変換することができる。

トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）としては、種々のものを用いることができる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本実施形態において用いることのできるＴＧａｓｅの好ましい例は、安定性、ハンドリングの容易さ、バルク生産が可能などの点から微生物由来微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。

本実施形態においてＭＴＧを用いた場合、予想されているＭＴＧの触媒反応から、Ｌｙｓ残基を有する標識酵素を含む融合タンパク質と（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡとの連結反応は、ＭＴＧ活性中心であるシステイン（Ｃｙｓ）残基の、（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡのＧｌｎへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こる標識化合物のＬｙｓによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるＭＴＧの脱離、の２段階で進行すると予想される。

本実施形態の好ましい態様においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有する（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡに対する、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を有する融合タンパク質のモル濃度比は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。

ＴＧａｓｅとしてＭＴＧを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、ｐＨ５．５〜８．０、温度４〜５０℃（例えば、室温（例えば、１８℃〜２２℃））の条件で行うことが好ましい。このようにすれば、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である。

＜ＨＥＲ２タンパク質の検出方法＞
本実施形態に係るＨＥＲ２タンパク質の検出方法は、前記ＨＥＲ２タンパク質検出プローブと、対象物中に存在するＨＥＲ２タンパク質とを結合させ、結合しているＨＥＲ２タンパク質検出プローブを、標識酵素により検出する方法である。

本実施形態に係るＨＥＲ２タンパク質の検出方法は、ＨＥＲ２タンパク質の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。

アフィニティ分子を変えることによって、標的物をＨＥＲ２タンパク質以外のものとすることも可能である。例えば、ＥＧＦＲに対するアフィニティ分子としてＺＥＧＦＲ：１９０７、ＴＮＦに対するアフィニティ分子としてＺＴＮＦα：２やＺＴＮＦα：１８５等が挙げられる。

以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

プロテインＡ変異体−ＢＡＰ融合タンパク質として、Ｚ−ＡＰ−（Ｈｉｓ）_６−ＣＫ−ｔａｇおよびＺＺ−ＡＰ−（Ｈｉｓ）_６−ＣＫ−ｔａｇを候補とし、また発現効率への影響も考慮し、プロテインＡ変異体とＡＰの間に導入するリンカー長として、ＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳを導入することとした。そして、ＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳリンカーを導入する場合は、Ｚ−ＧＳ−ＡＰ−（Ｈｉｓ）_６−ＣＫ−ｔａｇ、ＺＺ−ＧＳ−ＡＰ−（Ｈｉｓ）_６−ＣＫ−ｔａｇと表記することとし、またこれ以降は、−（Ｈｉｓ）_６−ＣＫ−ｔａｇの表記は省略し、ＺＺ−ＡＰ、Ｚ−ＧＳ−ＡＰ、ＺＺ−ＧＳ−ＡＰと表記する。

＜ＺＺ−ＡＰ発現ベクターの構築＞
［遺伝子組み換え用大腸菌ＪＭ１０９株へのＺＺ−ＡＰ遺伝子配列の形質転換］
ｐｅｌ Ｂ−（Ｚ３４２）_２−ＢＡＰ−Ｈｉｓ−ＣＲＫ（ＺＺ−ＡＰ）（１９０５ｂｐ）の遺伝子をｐＵＣｍｉｎｕｓＭＣＳプラスミドにコードした「ｐＵＣｍｉｎｕｓＭＣＳ−ＺＺ−ＡＰ（５１２９ｂｐ）」を、組換え用大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ，ＪＭ１０９株）に形質転換し、グリセロールストックとして−８０℃で保存した（図３）。

［遺伝子組み換えによるＺＺ−ＡＰ発現ベクターの構築］
得られたｐＵＣｍｉｎｕｓＭＣＳ−ＺＺ−ＡＰが形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株のグリセロールストックを、一晩培養を行った後、プラスミド抽出を行った。得られたｐＵＣｍｉｎｕｓＭＣＳ−ＺＺ−ＡＰを、Ｎｄｅ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの２種類の制限酵素で処理した。これをアガロースゲル電気泳動により分離を行い、ＺＺ−ＡＰ遺伝子産物のみを、ゲルカットにより精製した。次に、ｐＥＴ２２ｂ（＋）（５４９３ｂｐ）を同様にＮｄｅ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで処理した後、ＣＩＡＰを用いて脱リン酸化を行った。その後、増幅したＺＺ−ＡＰの遺伝子産物をリガーゼにより挿入し、「ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰ（７２７８ｂｐ）」を得た（図４、配列番号２６）。調製したｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰは、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、グリセロールストックとして−８０℃で保存した。

＜Ｚ−ＡＰ発現ベクターの構築＞
［インバースＰＣＲ法を利用した遺伝子組み換えによるＺ−ＡＰ発現ベクターの構築］
ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰ（７２７８ｂｐ）から、インバースＰＣＲにより、Ｎ末端側から２番目のＺ_３４２配列が除かれるように、Ｆｏｒ．側のプライマーは、ＧＧＧＳ（リンカー）＋ＢＡＰ配列と相補的に、Ｒｅｖ．側のプライマーは、Ｚ_３４２配列のＣ末端側＋Ｇ（リンカー）と相補的になるよう設計を行った（表１）。

ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰが形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株のグリセロールストックを、一晩培養を行った後、プラスミド抽出を行った。得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰから、ｐｒｉｍｅｒ Ｚ−ＡＰ Ｆｏｒとｐｒｉｍｅｒ Ｚ−ＡＰ Ｒｅｖ（表１）を使用して、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰのインバースＰＣＲを行い、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＡＰのＰＣＲ産物を得た。そして、ＯｒｉｇｉｎａｌのｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰを酵素により消化した後、Ｌｙｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｋｉｔを使用して、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＡＰのセルフライゲーションを行い、「ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＡＰ（７０６２ｂｐ）」を調製した（図５、配列番号２７）。調製したｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＡＰは、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、グリセロールストックとして−８０℃で保存した。

＜Ｚ−ＧＳ−ＡＰ発現ベクターの構築＞
［インバースＰＣＲ法を利用した遺伝子組み換えによるＺ−ＧＳ−ＡＰ発現ベクターの構築］
ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰ（７２７８ｂｐ）から、インバースＰＣＲにより、Ｎ末端側から２番目のＺ_３４２配列が除かれ、追加のＧＳリンカーを導入できるように、Ｆｏｒ．側のプライマーは、Ｓ挿入部＋ＧＧＧＧＳ（リンカー）＋ＢＡＰ配列と相補的に設計し、Ｒｅｖ．側のプライマーは、１番目のＺ_３４２配列のＣ末端側＋ＧＧＧＳ（リンカー）＋Ｇ挿入部と相補的になるよう設計を行った（表２）。

ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰから、ｐｒｉｍｅｒ Ｚ−ＧＳ−ＡＰ Ｆｏｒとｐｒｉｍｅｒ Ｚ−ＧＳ−ＡＰ Ｒｅｖを使用して、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰのインバースＰＣＲを行い、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＧＳ−ＡＰのＰＣＲ産物を得た。そして、ＯｒｉｇｉｎａｌのｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰを酵素により消化した後、Ｌｙｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｋｉｔを使用して、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＡＰのＰＣＲ産物をセルフライゲーションさせ、「ｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＧＳ−ＡＰ（７０８０ｂｐ）」を調製した（図６、配列番号２８）。調製したｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｚ−ＧＳ−ＡＰは、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、グリセロールストックとして−８０℃で保存した。

＜ＺＺ−ＧＳ−ＡＰ発現ベクターの構築＞
［インバースＰＣＲ法を利用した遺伝子組み換えによるＺＺ−ＧＳ−ＡＰ発現ベクターの構築］
ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰ（７２７８ｂｐ）から、インバースＰＣＲにより、追加のＧＳリンカーを導入できるように、Ｆｏｒ．側のプライマーは、ＳＧＳ挿入部＋ＧＧＧＧＳ（リンカー）＋ＢＡＰ配列と相補的に設計し、Ｒｅｖ．側のプライマーは、２番目のＺ_３４２配列のＣ末端側＋ＧＧＧ挿入部と相補的になるよう設計を行った（表３）。

ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰから、ｐｒｉｍｅｒ ＺＺ−ＧＳ−ＡＰ Ｆｏｒとｐｒｉｍｅｒ ＺＺ−ＧＳ−ＡＰ Ｒｅｖを使用して、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰのインバースＰＣＲを行い、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＧＳ−ＡＰのＰＣＲ産物を得た。そして、ＯｒｉｇｉｎａｌのｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰを酵素により消化した後、Ｌｙｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｋｉｔを使用して、ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＡＰのＰＣＲ産物をセルフライゲーションさせ、「ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＧＳ−ＡＰ（７２９６ｂｐ）」を調製した（図７、配列番号２９）。調製したｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＺＺ−ＧＳ−ＡＰは、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、グリセロールストックとして−８０℃で保存した。

各段階におけるＰＣＲは、サーマルサイクラーを用い、表４，５に示す組成および反応条件のもと反応を行った。各種制限酵素処理、リン酸化、脱リン酸化、ライゲーションは、ＴａＫａＲａのカタログで推奨されている緩衝液、反応温度、反応時間で行った。表６，７にそれぞれの典型的な反応条件を示す。また、各種プラスミドベクターを、組換え用大腸菌ＪＭ１０９株および発現用大腸菌（Escherichia coli，ＢＬ２１株）へ形質転換する際は、それぞれのコンピテントセルに各種プラスミドベクター０．３０μＬから０．６０μＬを添加し、サーマルサイクラーにより、表８の温度プログラムで熱処理を加えることで行った。

＜（１）ＺＺ−ＡＰの発現＞
［ＺＺ−ＡＰの発現］
ＺＺ−ＡＰは、大腸菌ＢＬ２１株を用いて発現させた。まず、ＺＺ−ＡＰ遺伝子をコードしたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換し、グリセロールストックとした。そして、形質転換体をＡｎｐｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｍｇ／Ｌ）を含む１ＬのＬＢ培地中にて大量培養を行い、約２時間後、ＯＤ_６００＝０．６となったところで、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるよう添加し、一晩２７℃で培養してＺＺ−ＡＰの発現を行った（配列番号３０）。

［菌体の回収および洗浄］
得られた菌体を、遠心分離により集菌し、ショ糖ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％（ｗ／ｗ）ショ糖）にて２度洗浄を行った。その後、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ショ糖ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を用いて再懸濁させた。そして、液体窒素で凍結後、ディープフリーザで一日保存した。

［大腸菌の超音波破砕］
凍結させた大腸菌溶液を解凍し、その後、超音波処理により大腸菌を破砕した。遠心分離後、得られた無細胞抽出液を、０．４５μｍフィルタおよび０．２２μｍのフィルタを用いて濾過した。

［Ｎｉ−ＮＴＡカラムを利用したタンパク質精製］
Ｈｉｓ−ｔａｇを利用して、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ（５ｍＬ ｖｏｌｕｍｅ）により精製を行った。まず、Ｎｉ−ＮＴＡ−平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ イミダゾール）で平衡化したカラムに、タンパク質溶液を流し、再度平衡化ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、Ｎｉ−ＮＴＡ−溶出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール）を用いて、目的組み換えタンパク質の溶出を行った。精製後のタンパク質溶液は、ＰＤ−１０カラムを用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッファ交換を行った。

Ｎｉ−ＮＴＡカラム精製では、精製度が不十分であることが考えられたため、さらなるカラムによる精製を検討した。ＡＰのｐＩは４．５であることから、通常中性のｐＨでは、負電荷を帯びていると考えられるため、ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ｃｏｌｕｍｎを用いて精製を行った。

［弱アニオン交換カラムを利用したタンパク質精製］
ＤＥＡＥ−平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で平衡化したカラムに、タンパク質溶液を流した。また、この際、ＤＥＡＥカラムに固定されずに溶出した溶液を残しておいた。再度平衡化ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ＤＥＡＥ−溶出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）を使用し、ＮａＣｌ濃度を緩やかに変化させるグラジエント溶出（ＮａＣｌ濃度：０Ｍ→０．７５Ｍ）により、目的タンパク質の溶出を行った。精製後のタンパク質溶液は、限外濾過（３０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ）により濃縮した後、ＰＤ−１０カラムを使用して、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッファ交換を行った。発現および精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用し行った。

［ＢＣＡ ａｓｓａｙによる濃度算出］
アルカリ条件下でタンパク質は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元する作用がある。これを利用してＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄとＣｕ（Ｉ）の錯体に由来する５６２ｎｍの吸収波長から、タンパク質濃度の算出を行った。以後、特に述べない限り、タンパク質濃度の測定はＢＣＡ ａｓｓａｙを利用して行っている。

＜（２）Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰの発現と酵素活性評価＞
ＢＡＰに対し、ＧＳリンカーをはさみＺ_３４２が１つまたは２つ導入されたＺ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰの組換え体を発現し（配列番号３１，３２）、硫安分画、Ｎｉ−ＮＴＡカラム、カチオン交換カラムによる精製を行った。

［Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰの発現］
Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰは、形質転換した大腸菌ＢＬ２１株のグリセロールストックを使用し、この形質転換体をＡｎｐｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｍｇ／Ｌ）を含む１ＬのＬＢ培地中にて大量培養を行った。約２時間後、ＯＤ_６００＝０．６となったところで、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるよう添加し、一晩１５℃で培養し、目的タンパク質の発現を行った。

［菌体の回収および洗浄］
得られた菌体を、遠心分離により集菌し、ＴＢＳにて２度洗浄を行った。その後、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３錠／３０ｍＬのｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ）を用いて再懸濁させた。そして、液体窒素で凍結後、ディープフリーザで一日保存した。

［大腸菌の超音波破砕］
凍結させた大腸菌溶液を解凍し、その後、超音波処理により大腸菌を破砕した。遠心分離後、得られた無細胞抽出液を、０．４５μｍフィルタおよび０．２２μｍのフィルタを用いて濾過した。

［硫安沈殿を利用した目的タンパク質の粗分画］
硫安沈殿を利用して、発現した組換えタンパク質の粗分画を行った。まず、４０％飽和となるように、粉末の硫安を少しずつ加えた。３０分間静置した後に、遠心を行い、目的タンパク質を含む上清を得た。同様に、硫安を６０％飽和とし、目的タンパク質を沈殿させ、濃縮操作を行った。この沈殿物を、１×ＴＢＳを用いて懸濁させ、その後、ＰＤ−１０カラムを用いて１×ＴＢＳにバッファ交換を行った。

［Ｎｉ−ＮＴＡカラムを利用したタンパク質精製］
Ｈｉｓ−ｔａｇを利用して、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ（１ｍＬ ｖｏｌｕｍｅ）により精製を行った。まず、Ｎｉ−ＮＴＡ−平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭ イミダゾール）で平衡化したカラムに、タンパク質溶液を流し、再度平衡化ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、Ｎｉ−ＮＴＡ−溶出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール）を用いて、目的組み換えタンパク質の溶出を行った。精製後のタンパク質溶液は、ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ（商標） Ｇ−２５カラムを用いて５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）にバッファ交換した。

［カチオン交換カラムを利用したタンパク質精製］
Ｚに由来するタンパク質の正電荷を利用して、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により精製を行った。まず、ＳＰ−平衡化ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５））で平衡化させたカラムに、タンパク質溶液を流し、再度平衡化ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ＳＰ−溶出ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）を使用し、ＮａＣｌ濃度を緩やかに変化させるグラジエント溶出により、目的タンパク質の溶出を行った。精製後のタンパク質溶液は、ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ（商標） Ｇ−２５カラムを用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にバッファ交換を行い、３０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆの限外濾過カラムを使用して濃縮した。

調製したタンパク質の精製度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。結果を、図８に示す。ＺＺ−ＧＳ−ＡＰに関しては部分的に切断された夾雑タンパク質の存在が示唆されたものの、目的の組換えタンパク質である融合タンパク質Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰが得られた。

また、基質溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ｐ−Ｎｉｔｒｏ Ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）１ｍＬに対し、１μＭの各種ＢＡＰ溶液１０μＬを加え、十分に撹拌した後、４１０ｎｍの吸収の時間変化を測定した。得られた傾きを初期活性として、各種ＢＡＰの酵素活性の比較を行った。Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰの酵素活性を測定した結果を、図９に示す。図９からわかるように、遺伝子工学的にＡＰに対してＺを１つ導入しても（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）酵素活性に影響を与えず、アルカリホスファターゼ活性の低下は見られないが、Ｚを２つ導入すると（ＺＺ−ＧＳ−ＡＰ）酵素活性が若干低下した。これは、電気泳動結果でわかるように不純物が含まれるために比活性が低めに測定されたためと考えられる。

＜（３）ＦＩＴＣ標識Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰの細胞免疲蛍光染色によるＨＥＲ２結合能力評価＞
Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰに対して蛍光基を標識する手法として、Ｚ３４２の機能に影響を与えないように、Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰに導入されているＫ−ｔａｇを利用して、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）により部位特異的に蛍光基を架橋する手法を選択し、選抜した基質配列に蛍光基を導入したＦＩＴＣ−ＳＳＹＡＬＱＭＲを使用した。調製したＦＩＴＣ標識Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰのＦＩＴＣラベル量は、それぞれＡＰ二量体に対し２．２個、３．２個であつた。細胞の免疫蛍光染色実験では、陽性細胞としてＳＫ−ＢＲ−３細胞株（ＨＥＲ２発現量３＋相当）を使用し、陰性細胞としてＨｅＬａ細胞株（ＨＥＲ２発現量０相当）を使用した。ＨｅＬａ細胞とＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して、８３．３ｎＭとなるように調製したＦＩＴＣ標識Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰ溶液を３００μＬずつ滴下し、３７℃で１時間静置した。ホルマリンによる固定処理、ＤＡＰＩによる核染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いてＨＥＲ２に対する免疫蛍光染色の観察を行った。図１０に結果を示す。ＨＥＲ２陽性のＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してのみ緑色の蛍光が観察され、Ｚ−ＧＳ−ＡＰ、ＺＺ−ＧＳ−ＡＰ共にＨＥＲ２を特異的に染色可能であることがわかった。

＜（４）Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰの無細胞抽出液のＷｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔによるＨＥＲ２特異的結合力評価＞
Ｚ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰがＨＥＲ２特異的に結合しているかどうか、また両者のＨＥＲ２検出能力をＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法により評価した。ネイティブの状態でタンパク質の分画を行うことが可能なＢｌｕｅ−Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（ＢＮ−ＰＡＧＥ）を利用し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＨｅＬａ細胞の無細胞抽出液の泳動を行った。セミドライ式のブロッティングにより、ＢＮ−ＰＡＧＥ後のゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写後、２．０９ｎＭとなるように調製したＺ−ＧＳ−ＡＰおよびＺＺ−ＧＳ−ＡＰによる免疫反応を行った。内在性のＡＰ活性を抑えるため２ｍＭのＬｅｖａｍｉｓｏｌｅを添加した０．０２ｍＭのＥＣＦ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を用いて染色を行った。結果を図１１に示す。実験条件は異なるが、市販のＢｉｏｔｉｎ−Ａｆｆｉｂｏｄｙを使用した実験で確認されるＨＥＲ２と思われる９０ｋＤａ付近のバンドが、Ｚ−ＧＳ−ＡＰ、ＺＺ−ＧＳ−ＡＰでも確認された。非特異的なバンドも確認されないことから両者ともにＨＥＲ２に対して特異的なアフィニティを有していることがわかった。また、Ｚ−ＧＳ−ＡＰの方がＺＺ−ＧＳ−ＡＰよりも検出感度が高いことを示唆する結果が得られ、精製度、比活性も考慮して、以後の実験では標識酵素としてＺ−ＧＳ−ＡＰを選択した。

＜（５）（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡの調製＞
［Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成・精製］
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中にて、１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は１８〜２２℃程度）で２０時間反応させることによって、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した。一方、５０ｍＭ ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液（Ａｍｂｉｏｎ製）１６μＬと２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）４０μＬ、滅菌水１６μＬとを混合し、１０ｍＭ ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ溶液を８０μＬ調製した。この溶液に対して、上記で調製したＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ溶液を８０μＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑで１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表９に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）によって行った。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。

Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行ったところ、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１９．１分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行ったところ、８４１．４６のピークが確認され、理論分子量の８４２．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成が示された。

［（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡの調製］
ＤＮＡを構成する４つのヌクレオチドのうちｄＴＴＰに関して、「ｄＴＴＰ＋Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ」濃度を一定（０．４ｍＭ）とし、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの濃度比０，１０，４０，８０％と変化させＰＣＲを行うことで、異なる割合でＺ−ＱＧ基が導入された、（Ｘ％Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡ（Ｘ＝０，１０，４０，８０）を調製した。ＦＩＴＣ修飾ｐｒｉｍｅｒを使用し、５’端が蛍光標識された３１０ｂｐ（配列番号３３）、９６０ｂｐ（配列番号３４）の足場ＤＮＡをそれぞれ調製した。アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡの生成を確認した結果、９６０ｂｐの（８０％Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡのみ得られなかった。これは、本来の基質でない修飾ヌクレオチドの割合が高まることで、伸長反応を続けられない配列部位が生じたためと考えられる。

調製した各種（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ、３１０ｂｐ：５２．２ｎＭ、９６０ｂｐ：１６．９ｎＭ）に対し、約３μＭのＺ−ＧＳ−ＡＰを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）中で０．０１Ｕ／ｍＬのＭＴＧ（味の素社製）と混合し、３７℃で１時間架橋反応を行った。約３μＭのＺ−ＧＳ−ＡＰは、（４０％Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡに理論的に取込まれるＺ−ＱＧ基のモル濃度と等しくなるように設定している。アガロースゲル電気泳動で反応の進行を評価した。結果を図１２に示す。この結果より、ＭＴＧ存在下でのみ架橋反応が進行し、高分子量側にバンドがシフトしている様子が確認され、（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡを調製することができた。

＜（６）各種（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのアニオン交換カラムを利用した精製およびＺ−ＧＳ−ＡＰラベル量評価＞
（Ｚ−ＱＧ）_ｎ−ＤＮＡと、Ｚ−ＧＳ−ＡＰ、ＭＴＧはｐＩが異なり表面電荷に差がある。この性質を利用して、アニオン交換カラムであるＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰを用いて精製を行った。Ｑ−溶出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ）を使用し、塩濃度勾配をかけ目的の（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡの溶出を行った。参照実験として、Ｚ−ＧＳ−ＡＰのみをカラムにかけ、Ｚ−ＧＳ−ＡＰのピーク位置の確認を行った。実験で得られたクロマトグラムを図１３，１４に示す。Ｚ−ＱＧ導入量の増大に伴いＺ−ＧＳ−ＡＰに由来する保持時間１１００秒付近のピークが減少し、新たにピークが現れることが確認された。また、新たなピークはＺ−ＱＧ導入量の増大に伴いＺ−ＧＳ−ＡＰ側に移動していることから、Ｚ−ＧＳ−ＡＰのラベル量が増大しＤＮＡの強い負電荷を和らげることで溶出時間が早まったと考えられる。

ＤＮＡに対するＺ−ＧＳ−ＡＰ標識数を定量的に評価するため、精製後に得られた（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡに関して、５’末端に修飾されたＦＩＴＣによる蛍光強度と、Ｚ−ＧＳ−ＡＰに由来する酵素活性から、Ｚ−ＧＳ−ＡＰラベル量の定量を行った。結果を図１５，１６に示す。Ｚ−ＧＳ−ＡＰラベル量が増大し、ＤＮＡ鎖長３１０ｂｐでは最大約４０分子、ＤＮＡ鎖長９６０ｂｐでは最大約７７分子のＺ−ＧＳ−ＡＰがラベルされていることがわかった。

＜（７）（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡのシグナル増幅（ＤＮＡ等モル）および多価効果の検討（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ等モル)＞
ここでは、プローブ中の（ａ）酵素数増加によるシグナル増幅、（ｂ）Ｚ_３４２の多価効果による見かけの親和力増大を狙いとした。そこで、調製した（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡが上述の２つの機能を兼ね備えたプローブとなっているかを、ＨＥＲ２−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａタンパク質を用いたＥＬＩＳＡにより評価した。（ａ）の効果を検討するため、ＨＥＲ２タンパク質１００ｎｇを固定化し、ＤＮＡモル濃度０．２５８ｎＭに統一してＥＬＩＳＡを行った。また、（ｂ）の効果を検討するため、ＨＥＲ２タンパク質１００ｎｇ〜０．０２５ｎｇの希釈系列を固定化し、Ｚ−ＧＳ−ＡＰモル濃度を１．０ｎＭに統一してＥＬＩＳＡを行った。図１７の結果より、（ａ）のシグナル増幅の効果に関して、Ｚ−ＱＧ導入量、ＤＮＡ鎖長の増大に応じてシグナルが増幅する結果を得ることができた。また、図１８には３１０ｂｐの（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）_ｎ−ＤＮＡの結果のみ示すが、（ｂ）の多価効果に関しても、低濃度領域でも免疫反応が進行することがわかり、Ｚ−ＧＳ−ＡＰ単体と比較して検出感度が１０倍程度向上した。したがって、両実験の結果より本実施例のプローブの有用性が示される結果となった。

以上のように、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素を基本ユニット（Ｚ−ＧＳ−ＡＰ）とする融合タンパク質をＤＮＡ上に複数提示した新たな分子プローブを用いて、Ｚ−ＧＳ−ＡＰ単体よりも１０倍程度高い検出感度で目的抗原を検出することができた。

Claims (3)

1. 複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体に、リシン（Ｌｙｓ）残基を有する複数の融合タンパク質が結合されて構成されており、
   前記複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体は、下記式（５）のヌクレオシド三リン酸誘導体が複数導入された核酸であり、
   前記融合タンパク質は、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とが融合されたものであり、リシン（Ｌｙｓ）残基を含むタグを有することを特徴とするＨＥＲ２タンパク質検出プローブ。
   （式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−または−（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）
2. トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体に、リシン（Ｌｙｓ）残基を有する複数の融合タンパク質を結合し、
   前記複数のグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する高分子担体は、下記式（５）のヌクレオシド三リン酸誘導体が複数導入された核酸であり、
   前記融合タンパク質は、ＨＥＲ２タンパク質に結合可能なプロテインＡ変異体と標識酵素とが融合されたものであり、リシン（Ｌｙｓ）残基を含むタグを有することを特徴とするＨＥＲ２タンパク質検出プローブの製造方法。
   （式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ−または−（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）
3. ＨＥＲ２タンパク質の検出方法であって、
   請求項１に記載のＨＥＲ２タンパク質検出プローブと、対象物中に存在するＨＥＲ２タンパク質とを結合させ、結合している前記ＨＥＲ２タンパク質検出プローブを、前記標識酵素により検出することを特徴とするＨＥＲ２タンパク質の検出方法。