JP6147619B2 - 細胞培養装置及び細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。

微生物や動植物の細胞等を培養する細胞培養装置において、培養容器内の流動攪拌やガスの通気及び液体培地の供給を制御して対象細胞を効率的に培養するため、細胞の培養状態のモニタリングが行われる。その際のモニタリング項目としては、培養温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度、細胞濃度のほか、グルコースやグルタミン等のアミノ酸をはじめとする培地成分、乳酸やアミノ酸等の細胞の代謝成分、タンパク質等の細胞生産物などが挙げられる。

ステンレス製やガラス製の培養容器を用いる場合、培養容器上部の天盤や培養容器の壁面に、前記したモニタリング項目のうち、培養温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度に対応する電極型の測定センサを配置して、培養状態をモニタリングする。
また、培地成分や細胞の代謝成分、細胞生産物などについては、培養容器内の細胞培養液の一部を無菌的にサンプリングして、各項目に対応する測定手段によって測定している。

そして、細胞濃度は、一般的には、サンプリングした細胞培養液を用いて細胞数を計数し、又は光学濁度を測定することにより細胞濃度として算出している。なお、前記した電極型の測定センサと同様に、培養容器内に挿入するプローブ型の濁度センサが実用化されており、これによって細胞濃度をモニタリングする場合もある。

電極型の測定センサを用いる場合、細胞の培養に先立ち、培養容器内に設置された状態でオートクレーブ滅菌するか、又は据え置きの培養容器内に蒸気を流通させて測定センサを滅菌処理する必要がある。また、細胞培養液をサンプリングする場合、細胞培養液の抜出し配管を蒸気や火炎、アルコールなどを用いて毎回滅菌処理する必要がある。

このような状況下、近年、細胞培養装置を構築する際の迅速化、サンプリング操作の簡便化、コスト低減等のため、従来のステンレス製やガラス製の培養容器に代わり、プラスチック製の可撓性容器を用いたシングルユースシステムが開発され、実用化されている。

シングルユースシステムでは、予めエチレンオキサイドのガスやガンマ線で滅菌した無菌バッグを用い、当該無菌バッグに滅菌した液体培地と、培養したい細胞と、を添加して培養を行う。なお、このようなシングルユースシステムにおいても無菌バッグ内の細胞培養液を一定の時間間隔をおいて無菌的に微量サンプリングし、外部の分析装置により細胞培養液のｐＨや溶存酸素濃度、二酸化炭素濃度、細胞濃度を計測して培養容器内の細胞の培養状態をモニタリングすることが行われている。

シングルユースシステムにおけるこのようなモニタリング操作はコンタミ（コンタミネーションの略）のリスクを伴うものであり、細胞培養液を損失することから、連続的なモニタリングが必要な場合には必ずしも適当でない。そのため、前記した各種測定センサもシングルユースシステムに適応した計測技術の開発が必要となる。例えば、連続的なモニタリングを必要とする場合には、細胞培養液のｐＨや溶存酸素濃度、二酸化炭素濃度によって蛍光色素の発色効率が変化する蛍光チップを無菌バッグの内部に配置し、無菌バッグの外部から光学的手段によって蛍光を検出してそれらを計測するチップ式の蛍光センサが用いられている。

しかしながら、細胞濃度を濁度によって計測する濁度センサは、前述したように培養容器内に挿入するタイプが主流である。また、濁度センサの殆どは、ステンレス製やガラス製の培養容器に対応したものであるため、シングルユースシステムで使用できる濁度センサの開発や、これを用いた細胞培養装置の開発が望まれている。かかる技術に関する発明が例えば特許文献１〜３に記載されている。

特許文献１には、細胞と培養液とを入れて細胞培養を行うための培養バッグであって、細胞と培養液とを収容するための袋状のバッグ本体と、前記バッグ本体内に配置され、前記バッグ本体内の細胞密度を光学的に検出するための光学センサと、を備えた培養バッグが記載されている。

また、特許文献２には、測定対象としての可撓性容器の厚さを調節する調節装置と、近赤外光を照射する機能及び照射した近赤外光を受光する機能を有する測定部とを備える成分分析装置において、前記可撓性容器の中央部分に対して縁よりの部分を前記可撓性容器の外側部分として、この外側部分の厚さを調節するための第１調節部及び第２調節部が前記調節装置に設けられていること、前記第１調節部の第１測定面が前記可撓性容器の第１面の外側部分に接触し、且つ前記第２調節部の第２測定面が前記可撓性容器の第２面の外側部分に接触することにより、前記可撓性容器の外側部分の厚さが調節されること、並びに、前記第１測定面から前記第２測定面に向けて近赤外光を照射する機能と、この近赤外光を前記第２測定面において受光する機能とが前記測定部に設けられていることを特徴とする成分分析装置が記載されている。

特許文献３には、培養槽の槽壁に設けられる透明部と、前記培養槽内の培養液中に配置される反射鏡と、前記培養槽外に配置され、前記反射鏡に向けて前記透明部を介して光を照射する発光部と、前記培養槽外に配置され、前記反射鏡方向からの光を前記透明部を介して受光する検出用受光部と、を備える、培養液の濁度を培養槽外から測定する濁度測定装置が記載されている。この特許文献３に記載されている装置は、培養槽内に反射鏡を配置し、この反射鏡に向けて培養槽外の発光部から光を照射し、反射鏡で反射した反射光を培養槽外の受光部で検出して濁度を測定する。

特開平３−１０６７７号公報 特開２０１２−１８９３８６号公報 国際公開第２０１２／１２７６５０号パンフレット

前記したように、特許文献１に記載の装置は、培養バッグ本体内に光学センサを配置して細胞密度を検出している。つまり、光学センサに接続した一対の光ファイバが培養バッグの外壁を貫通している。そのため、貫通部の機械的強度が低下し、細胞培養液の揺動や流動攪拌に際してコンタミを生じるリスクが増大する。

特許文献２に記載の装置は、所謂１次元の扁平型の無菌バッグである。従って、これを細胞培養に適用した場合、近赤外光の光路に気相が含まれることになるため、濁度を正確に測定することができない。

特許文献３に記載の装置は、ステンレス製やガラス製の培養槽での使用が想定されており、前記した反射鏡を培養槽内に設置されたバッフルプレートなどの機器や配管、電極部材のほか、専用の支持部材に設置する旨が記載されている。しかしながら、シングルユースの無菌バッグでは、当該無菌バッグ内にこれらの支持部材を配置することはできず、反射鏡の取り付けが困難であるという問題がある。また、特許文献３に記載の発明は、構造上、培養槽と反射鏡との間の細胞培養液が攪拌され難いという問題がある。そのため、細胞培養液中の細胞断片や細胞内タンパク質等の付着物が反射鏡の表面に汚れとして付着し、濁度を正確に測定することが困難となるという問題がある。

なお、特許文献３には、扁平な無菌バッグを揺動して攪拌する１次元型のシングルユース培養槽（透明な横広のバッグ）についても、その技術的思想が適用可能であると記載されている。具体的には、横広のバッグの底壁に設けた透明部の内側に、反射鏡を該バッグの内面に接着剤等で固着された支持部材を介し固定して配置するなどすることにより、濁度を測定することができる旨記載されている。しかしながら、この方式においても前記と同様、反射鏡と無菌バッグの槽壁との間の細胞培養液が攪拌され難いという問題がある。従って、細胞培養液中の細胞断片や細胞内タンパク質等の付着物が反射鏡の表面に汚れとして付着し、濁度を正確に測定することが困難となるという問題がある。

本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、外部から無菌バッグ内に濁度センサを挿入することなしに細胞培養液の濁度を連続的且つ正確に測定し、細胞を培養することのできる細胞培養装置及び細胞培養方法を提供することを課題とする。

本発明に係る細胞培養装置は、内部に細胞培養液が充填されて細胞を培養する光透過性と可撓性を有する無菌バッグの所定の部位が入る凹部と、前記凹部に入れられた前記所定の部位における前記無菌バッグの一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液に光を照射する光照射部、及び、前記所定の部位における前記無菌バッグの他の一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液を透過した光を受光する光受光部を有し、前記光照射部、前記無菌バッグの一部、前記無菌バッグの他の一部及び前記光受光部をこの順に光学的に一直線に配置した光路を有する濁度センサ部と、を備えるとともに、前記凹部は、互いに対向する一方の対向面と他方の対向面とを有して、前記対向面同士の間が前記光路の一部をなし、前記一方の対向面と前記他方の対向面とのうちの少なくとも一方の面が階段状に形成されていることを特徴とする。
本発明に係る細胞培養装置は、光照射部、光受光部、第１光路変換部、第２光路変換部、及び、凹部を含んでなり、前記光照射部、前記第１光路変換部、前記凹部、前記第２光路変換部、及び、前記光受光部をこの順に光学的に一直線に配置した光路を形成して、無菌バッグ内の細胞培養液の濁度を測定する濁度センサ部を有し、前記濁度センサ部は、前記光照射部と前記光受光部とを含んでなる本体部と、前記第１光路変換部と前記第２光路変換部と前記凹部とを含んでなる光路変換ユニットとを備え、前記光路変換ユニットは、前記本体部とは光軸の位置決め部材を介して着脱可能であり、前記凹部は、互いに対向する一方の対向面と他方の対向面とを有して、前記第１光路変換部と前記第２光路変換部とが前記一方の対向面と前記他方の対向面の対向面の間を介して向き合い、前記一方の対向面と前記他方の対向面とのうちの少なくとも一方の面が階段状に形成されており、濁度の測定時、前記光路変換ユニットは、前記無菌バッグ中に配され、かつ、前記光軸の位置決め部材を介して前記無菌バッグのフィルムを挟み込むように前記本体部に装着されることで、前記光路における前記光照射部と前記第１光路変換部との間に前記フィルムが介挿され、かつ、前記第２光路変換部と前記光受光部との間にも前記フィルムが介挿され、かつ、前記凹部の前記一方の対向面と前記他方の対向面の間に前記細胞培養液が満たされていることを特徴とする。

本発明に係る細胞培養方法は、内部に細胞培養液が充填されて細胞を培養する光透過性と可撓性を有する無菌バッグの所定の部位が入る凹部と、前記凹部に入れられた前記所定の部位における前記無菌バッグの一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液に光を照射する光照射部、及び、前記所定の部位における前記無菌バッグの他の一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液を透過した光を受光する光受光部を有し、前記光照射部、前記無菌バッグの一部、前記無菌バッグの他の一部及び前記光受光部をこの順に光学的に一直線に配置した光路を有する濁度センサ部と、を装置内の所定の位置にセットするセット工程と、前記無菌バッグの内部に細胞培養液及び細胞を添加して培養する培養工程と、を含み、前記培養工程において、前記濁度センサ部の前記光照射部から前記細胞培養液に光を照射し、前記細胞培養液を透過した前記光を前記光受光部が受光して前記細胞培養液の濁度を測定するものであり、前記凹部は、互いに対向する一方の対向面と他方の対向面とを有して、前記対向面同士の間が前記光路の一部をなし、前記一方の対向面と前記他方の対向面とのうちの少なくとも一方の面が階段状に形成されていることを特徴とする。

本発明によれば、外部から無菌バッグ内に濁度センサを挿入することなしに細胞培養液の濁度を連続的且つ正確に測定し、細胞を培養することのできる細胞培養装置及び細胞培養方法を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の基本概念を示す概略構成図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養装置に用いられる濁度センサ部の具体的態様を示す概略構成図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養装置に用いられる濁度センサ部の具体的態様を示す概略構成図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養装置に用いられる濁度センサ部の具体的態様を示す概略構成図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養装置に用いられる濁度センサ部の他の具体的態様を示す概略構成図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養装置に用いられる濁度センサ部の他の具体的態様を示す概略構成図である。 光路の変形例を示す概略構成図である。 光路の他の変形例を示す斜視図である。

〔細胞培養装置〕
以下、適宜図面を参照して本発明の一実施形態について詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の基本概念を示す概略構成図である。
図１に示すように、細胞培養装置１は、無菌バッグ２と、濁度センサ部３と、を備えている。かかる細胞培養装置１は、医薬品や健康食品等の主原料となる物質を生産する微生物や動植物の細胞を培養する際に適用することができる。

前記した無菌バッグ２は、装置内の所定の位置にセットされ、光透過性と可撓性を有し、内部で細胞培養液４を培養するものである。このような無菌バッグ２としては、例えば、エチレン・ビニル・アセテートやエチル・ビニル・アルコールの多層フィルムで構成された各社市販の医薬品包装用途のシングルユースバッグを用いることができる。なお、無菌バッグ２は、予めガンマ線やエチレンオキサイドガスによって滅菌されているバッグであれば、市販品でなくても好適に用いることができる。

ここで、本明細書において、細胞培養液４とは、細胞の培養を行っている培養液や、細胞を培養する所定の工程を終えた培養液をいう。つまり、培養した細胞を含む培養液をいう。なお、本明細書においては、細胞を添加する（植える、まき込む）前の培養に供する培地を液体培地という。

本実施形態において培養対象となる細胞５としては、例えば、動物細胞、植物細胞、光合成細菌、微細藻類、ラン藻類、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類等を挙げることができる。特に、抗体や酵素等のタンパク質を生産する動物細胞を好適に挙げることができる。従って、細胞培養に用いる液体培地は、培養対象となる細胞に適した任意のものを用いることができ、特定の液体培地に限定されないことはいうまでもない。

本実施形態において細胞５を培養することにより生産される対象物質としては、例えば、抗体や酵素等のタンパク質、低分子化合物、高分子化合物等の生理活性物質、ウイルス、β−カロテンやアスタキサンチン等のカロチノイド、クロロフィルやバクテリオクロロフィル等の色素、食品、飲料、化粧品などの着色等に使用されるフィコシアニン等のフィコビリンタンパク質、脂肪酸等の生理活性物質などを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

また、前記した濁度センサ部３は、光照射部３１と、光受光部３２と、を有している。
光照射部３１は、無菌バッグ２の一部２ａを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４に光を照射する。なお、この光照射部３１は制御部６１と接続されている。当該制御部６１は、光照射部３１の光源の発光量を制御する。

光受光部３２は、無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４を透過した光を受光する。なお、この光受光部３２は、演算部６２と接続されている。そして、この演算部６２は、図４、図６を参照して後述するように、培養制御装置７を介して攪拌機構７１、温度調節機構（図示せず）、ガス通気機構７２、及び液体培地の培地成分の自動添加機構（図示せず）と接続されている。演算部６２は、光受光部３２にて測定された測定値から細胞培養液４中の細胞５の濃度を算出し、その算出結果に基づいて、培養制御装置７がこれらを動作させて細胞培養液４の攪拌翼７１ａの回転速度の調節、細胞培養液４の温度の調節、通気スパージャ７２ａからのガス通気量の調節及び液体培地の培地成分の調節のうちの少なくとも一つを制御する。なお、前記した制御部６１と演算部６２は、濁度検出器６に含まれている。

図１に示す細胞培養装置１では、光照射部３１と、光受光部３２と、を対向配置しており、光照射部３１から照射された光が無菌バッグ２の一部２ａを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４に入射される。そして、細胞培養液４を透過した光は無菌バッグ２の他の一部２ｂを介してそのまま直進し、光受光部３２にて受光される。つまり、濁度センサ部３は、光照射部３１、無菌バッグ２の一部２ａ、無菌バッグ２の他の一部２ｂ及び光受光部３２を光学的に一直線に配置している。なお、本明細書において、「光学的に一直線に配置している」とは、文字通り前記した各構成が一直線となるように配置している場合のみならず、構造的に前記した各構成が直線的に配置されていない場合であっても、後記するように、鏡面や直角プリズム、ペンタプリズムなどの光路を変換する部材を用いることにより、光照射部３１から照射された光が無菌バッグ２の一部２ａと無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して光受光部３２で受光できるように配置されている場合も含むことを意味している。

このようにすると、光照射部３１と光受光部３２は、無菌バッグ２を挟み込んで細胞培養液４の濁度を測定し易くするため、例えば、それぞれ無菌バッグ２に当接する面を平坦にするか、無菌バッグ２に当接する面に透明平板（図示せず）を備えるようにするとよい。互いに対向する当接面の間隔、すなわち細胞培養液４を透過する光の光路長の適正範囲は、光照射部３１から照射する光の波長、培養する細胞５の濃度、及び光受光部３２の検出感度によって異なるが、通常、１〜１００ｍｍ、好ましくは５〜５０ｍｍとするのが望ましい。なお、このような透明平板としては、例えば、アクリル板、ガラス板、ポリカーボネート板などを用いることができる。これらの板材は透明性が高いだけでなく、強度も高いので好適である。

光照射部３１の光源（図示せず）としては、各種の人工光源を用いることができる。例えば、白熱灯やハロゲン光などの連続スペクトル波長の光源、又は半導体レーザやＬＥＤなどの特定波長光を含む光源を用いることができる。光源の発光量は、光照射部３１と接続されている制御部６１によって制御される。

なお、光照射部３１の発光する光の波長の選定に当たっては、一般的に波長の短い領域ほど光散乱が大きいので、濁度の検出感度も増大するため好ましい。しかしながら、細胞や培地が特定の波長領域に吸収帯を有する色素等を有する場合、光照射部３１の発光する光としては、この吸収帯と異なる波長の光を照射するのが好ましい。なお、４００ｎｍより短波長の紫外光領域では、細胞に含有されるタンパク質や脂質等の吸収があるので好ましくない。また、８００ｎｍより長波長の赤外光の領域では、散乱による濁度が低下するので、検出感度の点で好ましくない。光照射部３１の発光する光の波長としては、例えば、５５０ｎｍから８００ｎｍの波長を選定することが好ましい。なお、この波長領域における細胞培養液４の吸収スペクトルが比較的平坦な特性を示す場合は、広い波長領域に発光する光源を用いることができる。その一方で、この波長領域における細胞培養液４の吸収スペクトルが平坦な吸収特性を示さない場合は、吸収ピーク及び吸収帯の無い波長領域における、特定波長の光を選定することが好ましい。光照射部３１の光源として、例えば、白色光源を用いる場合は、光学フィルタ等を用いて特定波長の光を照射するように構成してもよい。

光照射部３１からの光を受光する光受光部３２の受光素子としては、前記した各光源が発する特定の波長の光に感度を有し、光信号を電気信号に変換し、受光した光量を定量数値的に出力できるものであれば好適に用いることができる。一般的には、受光素子として、フォトダイオード、フォトトランジスタ等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。

このような光照射部３１と光受光部３２を構成した場合、細胞培養液４に懸濁浮遊する細胞５による光散乱によって透過光量が減衰する。そして、このときの光の減衰量は細胞濃度と一定の相関を示す。ここで、光受光部３２は演算部６２と接続されている。光受光部３２は、受光した光量から濁度を計算し、演算部６２にその計算結果を送信する。演算部６２に予め細胞濃度と濁度との相関係数を入力しておくことにより、当該演算部６２にて細胞濃度を算出することができる。なお、前記した相関等は、培養する細胞５によって種々異なるので、事前実験を行ったり、文献を調査したりするなどして適宜設定するのが好ましい。

ここで、培養に伴って細胞５が増殖すると、細胞培養液４には死滅した細胞断片や、細胞内容物であるタンパク質及び脂質などが蓄積し、無菌バッグ２の内壁に付着する。これらが光照射部３１と、光受光部３２と間の光路に付着すると、透過光量が減衰して見掛けの濁度が増大する。その結果、細胞濃度が実際より大きな数値として算出される。また、細胞培養液４の流動が小さく滞留する領域では、細胞濃度は槽内の平均的な数値と異なる。従って、これらの影響を低減するため、無菌バッグ２の内部に攪拌機構７１を設け、当該攪拌機構７１によって細胞培養液４の流動性が高くなる位置に濁度センサ部３（光照射部３１と光受光部３２）を設けるのが好ましい。なお、図１に示す攪拌機構７１は、軸部材に複数の翼を設けた攪拌翼７１ａを例示している。攪拌機構７１としてはこの他にもマグネチックスターラーなどを用いることもできる。なお、マグネチックスターラーなどの無菌バッグ２と直接接触するものを用いる場合は、無菌バッグ２が破損しないようにフッ素樹脂部材等にて当接する部分を補強するのが好ましい。

前記したように、この細胞培養装置１は、細胞培養液４を攪拌するための攪拌翼７１ａや、揺動機構（図示せず）を備えていてもよいが、細胞５にとって攪拌が好ましくない場合はこれらの機構を備えていなくてもよい。これらの機構の適用は任意である。攪拌翼７１ａや揺動機構を動作させる場合は、演算部６２が前記した光受光部３２によって測定された測定値から細胞培養液４中の細胞５の濃度を算出し、その算出結果に基づいて攪拌速度や揺動速度の調節を行うようにすると、培養を好適に継続できるので好ましい。

また、この演算部６２は、攪拌速度の調節の他にも、前記した算出結果に基づいて細胞培養液４の温度の調節やガス通気量の調節、液体培地の培地成分の調節などを行うようにすると、培養をより好適に継続できるためさらに好ましい。

以上、図１を参照して本実施形態に係る細胞培養装置１の基本概念を説明した。
かかる細胞培養装置１によれば、前述したように、無菌バッグ２の一部２ａを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４に光を照射する光照射部３１、及び、無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４を透過した光を受光する光受光部３２を有し、光照射部３１、無菌バッグ２の一部２ａ、無菌バッグ２の他の一部２ｂ及び光受光部３２を光学的に一直線に配置した濁度センサ部３と、を備えている。細胞培養装置１は、無菌バッグ２の外部に設けられた濁度センサ部３を用いて細胞培養液４の濁度を測定するので、細胞培養液４の濁度を測定するにあたり、濁度センサ部３を無菌バッグ２の外部から内部へ挿入する必要がなく、細胞培養液４をサンプリングする必要もない。従って、細胞培養装置１によれば、細胞培養液４の濁度を測定する際のコンタミの発生リスクを無くすことができる。

また、濁度センサ部３の光照射部３１と光受光部３２とを、細胞培養液４の流動性の高い位置に配置した場合、細胞断片や細胞内容物が蓄積し難いため、透過光量が減衰して見掛けの濁度が増大するという事態を低減させることができる。そのため、長期間の培養に際して安定して培養細胞の濁度の測定が可能となる。特に、光透過性と可撓性を有する無菌バッグ２を用いる１次元の扁平型、３次元の円筒型のシングルユース培養槽２１において、細胞培養液４の濁度を精度よく測定することができる。また、測定した細胞培養液４の濁度に基づいて、細胞培養液４中の細胞濃度を連続的に測定することができるため、細胞５の培養状態に応じて、細胞培養液４の攪拌速度や温度、細胞培養液４中への溶存酸素の供給、及び培地の供給を効率的に制御することができる。そのため、高収率の培養が可能となり、目的の培養生産物の生産収量の向上を図ることができる。

また、本実施形態に係る細胞培養装置１によれば、光透過性と可撓性を有する無菌バッグ２を、光照射部３１と光受光部３２とで挟み込むようにして光学的な濁度を計測するため、シングルユースの無菌バッグ２内に部材を設置してこれに反射鏡などを設ける必要が無い。つまり、細胞培養装置１の簡便化、低コスト化を図ることができる。

（濁度センサ部の具体的態様）
次に、図２〜図４を参照して、前記した基本概念を適用した細胞培養装置１の具体的な構成について説明する。なお、既に説明した構成については同一の符号を付し、その説明を省略する。
図２〜図４は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置１に用いられる濁度センサ部３の具体的態様を示す概略構成図である。
図２に示すように、この濁度センサ部３の光照射部３１は第１光路変換部３３を備えるとともに、光受光部３２は第２光路変換部３４を備えている。

第１光路変換部３３は、光源からの光の光路を９０度変換して光を細胞培養液４に照射させる部材である。そして、第２光路変換部３４は、第１光路変換部３３によって光路が変換され、細胞培養液４を透過した光の光路をさらに９０度変換して光受光部３２で受光させる部材である。すなわち、濁度センサ部３は、光照射部３１、無菌バッグ２の一部２ａ、無菌バッグ２の他の一部２ｂ及び光受光部３２を光学的に一直線に配置している。第１光路変換部３３及び第２光路変換部３４としては、例えば鏡面、又は直角プリズム、ペンタプリズム等を好適に用いることができる。

図２に示すように、第１光路変換部３３と第２光路変換部３４の間には、その光路上に、互いに対向する一対の対向面を有する凹部が設けられている。この実施形態においては、細胞培養液４を培養している無菌バッグ２の一部２ａをそのまま当該凹部内に入るようにする（挟み込むようにする）。つまり、図３に示すように、第１光路変換部３３に無菌バッグ２の一部２ａを近接させ、第２光路変換部３４に無菌バッグ２の他の一部２ｂを近接させてセットする。培養工程の開始に当たり無菌バッグ２内に、所定量の液体培地と細胞５を添加した細胞培養液４を充填することによって、無菌バッグ２の一部２ａと他の一部２ｂとを、前記した第１光路変換部３３と第２光路変換部３４との間に設けられた凹部の内面に密接させることができる。このようにすると、前記した基本概念にて説明したように、光照射部３１は、無菌バッグ２の一部２ａを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４に光を照射することができるとともに、光受光部３２は無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４を透過した光を受光することができる。そのため、外部から無菌バッグ２内に濁度センサを挿入することなしに細胞培養液４の濁度を連続的且つ正確に測定し、細胞５を培養することができる。また、細胞培養液４を無菌バッグ２外に取り出すことなく（サンプリングすることなく）、無菌バッグ２内の細胞培養液４の濁度を測定することが可能となる。よって、コンタミ等のおそれを無くすことができる。

細胞培養装置１の具体的態様について説明を続ける。図２に示すように、この細胞培養装置１では、制御部６１によって光源の発光量が制御された光照射部３１は、図中、上方に向けて光を照射する。照射された光は光学レンズ３５を介して第１光路変換部３３に入射される。なお、光学レンズ３５は目的に応じて光を集束させたり、拡散させたりする役割を有する。光学レンズ３５は任意に設けられるものであり、これを設ける必要がない場合は設けなくてもよい。なお、図２において図示はしないが、光の光路を好適に得るため、例えば、濁度センサ部３内の光路となる部分を空洞部としたり、光ファイバや光導波路などを用いるなどしたりして、光路を形成することも可能である。

そして、第１光路変換部３３に入射された光は、当該第１光路変換部３３によって全反射され、光路が９０度変換される。図２では、光路はこの第１光路変換部３３によって右方向に変換されている。第１光路変換部３３に直角プリズムやペンタプリズムを用いる場合は、全反射面の少なくとも背面部に空間部を設け、プリズムを構成する部材との屈折率の差による全反射の効率を高めておくことが好ましい。また、アルミや金属膜をコーティングして増反射能を有するようにしておくこともできる。第１光路変換部３３によって光路が変換された光は、隣接する一方の対向面から出射し、他方の対向面に入射する。他方の対向面に入射した光は、第２光路変換部３４によって全反射され、光路が９０度変換される。図２では、光路はこの第２光路変換部３４によって下方向に変換されている。このときの第２光路変換部３４についても第１光路変換部３３と同様の構成とすることが好ましい。第２光路変換部３４によって光路が変換された光は光学レンズ３５を介して光受光部３２にて受光される。光を受光した光受光部３２は光信号を電気信号に変換し、受光した光量を濁度検出器６の演算部６２に定量数値的に出力する。

前記したようにして光路を変換する第１光路変換部３３と第２光路変換部３４とは、光軸を正確に位置合わせする必要がある。図２では第１光路変換部３３と第２光路変換部３４とを区別して図示しているが、両者は光軸を正確に位置合わせする必要があるので、これらを透明樹脂等で一つのユニットとして一体成形するのが好ましい。

図２に示した濁度センサ部３を用いる場合、図４に示すように、装置内の所定の位置に無菌バッグ２をセットするとともに、装置内の所定の位置に当該濁度センサ部３をセットし、然る後、無菌バッグ２内に液体培地と細胞５を添加する。なお、濁度センサ部３の取り付け位置は、細胞培養液４の流動性の高い位置とするのが好ましい。図４に示す例であれば、攪拌翼７１ａの回転半径上とするのが好ましい。また、無菌バッグ２の容積を培養槽２１の容積よりも若干大きくしておくと、液体培地を添加した際に濁度センサ部３の凹部内を無菌バッグ２が密着することになる。従って、細胞培養液４の測定に当たって光路上に気相が含まれることがなくなり、濁度をより正確に測定することができるようになる。

そして、図４に示すように、当該濁度センサ部３を用いた細胞培養装置１の演算部６２は、濁度センサ部３の光受光部３２にて測定された測定値から細胞培養液４中の細胞５の濃度を算出する。細胞培養装置１は、その算出結果に基づいて攪拌機構７１、温度調節機構（図示せず）、ガス通気機構７２、及び液体培地の培地成分の自動添加機構（図示せず）のうちの少なくとも一つを制御する。これらの機構の制御は、例えば、培養制御装置７にて行うのが好ましい。培養制御装置７は、予め組み込まれたプログラムによる計算結果に応じて図４に示すように、攪拌機構７１及びガス通気機構７２に制御信号を伝送して、攪拌翼７１ａの攪拌回転数及び通気スパージャ７２ａからのガスの通気量を制御する。このようにすると、細胞培養により細胞５が増殖するのに応じて、適正な流動攪拌と溶存酸素、及び溶存二酸化炭素濃度を維持することができ、効率的な培養を行うことができる。なお、図では省略しているが、培養槽２１は恒温水を循環するジャッケットやペルティエ素子を備えた温度調節機構を有しており、培養制御装置７は温度調節機構（図示せず）を制御して培養温度を調節している。培養制御装置７は一般的なＰＣに培養の制御を行うプログラムを組み込むことにより具現することができる。

（濁度センサ部の他の具体的態様）
次に、図５、図６を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置１に用いられる濁度センサ部３の他の具体的態様について説明する。なお、既に説明した構成については同一の符号を付し、その説明を省略する。
図５、図６は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置１に用いられる濁度センサ部３の他の具体的態様を示す概略構成図である。

図５に示すように、当該濁度センサ部３は、図２〜図４を参照して説明した濁度センサ部３と同じ第１光路変換部３３と第２光路変換部３４とを備えている。但し、前述した態様とは、無菌バッグ２を介して濁度を測定する構成や光路の順序が異なる。なお、図５に示すように、濁度センサ部３は、光照射部３１、無菌バッグ２の一部２ａ、無菌バッグ２の他の一部２ｂ及び光受光部３２を光学的に一直線に配置している。

図５に示すように、本実施形態に係る濁度センサ部３では、第１光路変換部３３と第２光路変換部３４とを含んでなる光路変換ユニット３９を無菌バッグ２の内部に配している。そして、光照射部３１と光受光部３２とを含んでなる濁度センサ部３と、制御部６１と演算部６２とを含んでなる濁度検出器６と、を無菌バッグ２の外部に配している。このようにすると、無菌バッグ２内に光路変換ユニット３９を設置するに際し、培養後に廃棄される部材を最小構成とすることができるとともに、プラスチック素材等の低コスト部材とすれば、より一層の低コスト化を図ることができる。

このような構成とすると、図５に示すように、第１光路変換部３３は、無菌バッグ２の一部２ａを介して光照射部３１の光源からの光を入射し、光路を変換して細胞培養液４に光を照射させることができる。
また、第２光路変換部３４は、第１光路変換部３３によって光路が変換されて照射され、細胞培養液４を透過した光を入射し、光路を変換して無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して光受光部３２に受光させることができる。
前記した基本概念にて説明したように、光照射部３１は、無菌バッグ２の一部２ａを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４に光を照射することができるとともに、光受光部３２は無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４を透過した光を受光することができる。そのため、外部から無菌バッグ２内に濁度センサを挿入することなしに細胞培養液４の濁度を連続的且つ正確に測定し、細胞５を培養することができる。また、細胞培養液４を無菌バッグ２外に取り出すことなく（サンプリングすることなく）、無菌バッグ２内の細胞培養液４の濁度を測定することが可能となる。もちろん、無菌バッグ２の内部に配される光路変換ユニット３９は無菌バッグ２と同様の滅菌処理が行われているので、濁度を測定する際にコンタミすることは無い。

なお、この場合において、無菌バッグ２の一部２ａを介した光照射部３１から第１光路変換部３３に入射させる光の光軸の位置決めと、無菌バッグ２の他の一部２ｂを介した第２光路変換部３４から光受光部３２に入射させる光の光軸の位置決めとは、次のようにして行うのが好ましい。例えば、光路変換ユニット３９に設けられた第１磁性部材Ｍ１と、濁度センサ部３に設けられた第２磁性部材Ｍ２と、により吸着固定させるとよい。これらの磁性部材としては、例えば、磁性部材として一般的に用いられる鉄、コバルト、ニッケルと、その合金のほか、金属磁性粉をゴムやプラスチックで成型固化したプラスチック磁性体などを用いることができる。このようにすると、細胞培養液４を攪拌した場合であっても光路変換ユニット３９が分離することなく培養を継続することができる。

また、図５に示す態様とする場合、第２磁性部材を備えた濁度センサ部３は、当該第２磁性部材を有する基台部３６と、光照射部３１及び光受光部３２を有する本体部３７と、に別けられるようにするのが好ましい。このようにすると、第２磁性部材の磁力が弱くなった場合などであっても、光照射部３１と、光受光部３２と、を含む比較的高価な本体部３７はそのまま継続して使用し、安価な基台部３６のみを新しいものに交換すればよいため、結果的に低コスト化を図ることができる。なお、基台部３６と、本体部３７とは、それぞれ位置決め用の特定の嵌合構造を有するようにするのが好ましい。かかる位置決め用の特定の嵌合構造は、それぞれの部材における特定の位置に、対応する形状で設けられた凹部３７ａ及び凸部３６ｂとするとよい。このようにすれば、光照射部３１から第１光路変換部３３に入射させる光の光軸の位置決めと、無菌バッグ２の他の一部２ｂを介した第２光路変換部３４から光受光部３２に入射させる光の光軸の位置決めと、を正確に行うことができる。なお、本発明においては、細胞培養液４の濁度が測定できればよいため、光の幅は２〜４ｍｍとすることができる。従って、光軸が多少ずれたとしても問題なく測定することができる。

そして、図６に示すように、当該濁度センサ部３を用いた細胞培養装置１の演算部６２は培養制御装置７と接続されている。培養制御装置７は、図４に示した細胞培養装置１と同様に、攪拌機構７１、温度調節機構（図示せず）、ガス通気機構７２、及び液体培地の培地成分の自動添加機構（図示せず）のうちの少なくとも一つを制御して細胞５の培養を行うことができる。

（光路の変形例）
次に、図７、図８を参照して、前記した光路の変形例について説明する。なお、既に説明した構成については同一の符号を付し、その説明を省略する。
図７は、光路の変形例を示す概略構成図であり、図８は、光路の他の変形例を示す斜視図である。

一般的に、培養に伴って細胞濃度が増加するため、細胞培養液４の濁度は大きく変化する。濁度の検出精度は、光照射部３１の発光強度と光受光部３２の受光感度のほか、細胞培養液４を透過して濁度を計測する光路の長さ（光路長）に依存する。細胞濃度が一定であっても、光路長が長いと光受光部３２に到達する透過光強度が小さくなる。従って、培養初期の細胞濃度が低いときは光路長を長くし、培養後期の細胞濃度が高いときは光路長を短くすると、濁度及び細胞濃度の算出精度を高めることができる。

図７に示す例では、濁度及び細胞濃度の算出精度を高めるため、第１光路変換部３３と、第２光路変換部３４と、の間の対向面のうちの少なくとも一方の面が階段状となるようにしている。このようにすると、細胞培養液４を透過する光の光路長を複数設けることができる。なお、図７に示す例においては、対向面の両方を階段状にしている。そして、光照射部３１から照射された光に対して、光学レンズ３５を垂直にシフトさせることにより、第１光路変換部３３に反射される位置を変更するようにしている。また、第２光路変換部３４で反射された光に対して、光学レンズ３５を垂直にシフトさせることにより、光受光部３２での受光が適切に行われるようにしている。光路をこのように構成すると、前記したように、培養初期の細胞濃度が低いときは光路長を長くし、培養後期の細胞濃度が高いときは光路長を短くすることができる。従って、濁度及び細胞濃度の算出精度を高めることができる。なお、これらの光学レンズ３５のシフトは電動モータや圧電素子などのアクチュエータを用いることによって行うことができる。

図８に示す例も第１光路変換部３３と、第２光路変換部３４と、の間の対向面のうちの少なくとも一方の面が階段状となるようにしている点では図７の例と同様である。しかしながら、図８に示す例では、第１光路変換部３３の長さ寸法と第２光路変換部４３の長さ寸法をそれぞれ長くするとともに、光照射部３１と、光受光部３２と、をそれぞれ複数設けている（図８ではそれぞれ３つずつ設けている）点が図７に示す例と異なっている。また、図８に示す例では、紙面上、前後方向に異なる長さの光路長が配置されるようにしている点が図７に示す例と異なっている。このように光路を構成しても前記同様、培養初期の細胞濃度が低いときは光路長を長くし、培養後期の細胞濃度が高いときは光路長を短くすることができる。従って、濁度及び細胞濃度の算出精度を高めることができる。

図７に示す変形例及び図８に示す変形例のいずれによっても、培養に伴って変動する細胞濃度の範囲に応じて、適切な光路長及びそれに対応した光照射部３１と光受光部３２を選択して、濁度の測定を行うことができる。また、全ての光照射部３１と光受光部３２を同時に機能させることによって、異なる光路長で測定した濁度及び算出した細胞濃度の値を得ることができる。また、同時に得られた細胞濃度の平均値を算出することによって、制御の精度を向上することができる。

図８に示す変形例の場合、各光路の光が互いに作用して測定精度を低下させることを防止するため、図８中に示す光導波路３８によって各光路における光を区分するのが好ましい。光導波路３８としては、光ファイバを用いるか、又は同様に屈折率の異なるコアとクラッドの境界面で全反射して光を損失無く伝送する構造を組み込むのが好ましい。この場合の構造素材としては、無機系素材では例えば石英ガラスやシリコンなどを用いることができ、有機系素材では例えば高純度ポリイミド系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリエーテル系樹脂などを用いることができる。なお、光学レンズ３５を適切に選択して並行光を得ることができる場合には、当該光導波路３８は、トンネル状に空洞を形成してなる光導波路３８とすることもできる。

〔細胞培養方法〕
次に、本実施形態に係る細胞培養方法について説明する。
本発明の一実施形態に係る細胞培養方法は、セット工程と、培養工程と、を含んでなる。

（セット工程）
セット工程は、光透過性と可撓性を有する無菌バッグ２と、無菌バッグ２の一部２ａを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４に光を照射する光照射部３１、及び、無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して無菌バッグ２内の細胞培養液４を透過した光を受光する光受光部３２を有し、光照射部３１、無菌バッグ２の一部２ａ、無菌バッグ２の他の一部２ｂ及び光受光部３２を光学的に一直線に配置した濁度センサ部３と、を装置内の所定の位置にセットする工程である。なお、無菌バッグ２や濁度センサ部３については既に詳述しているのでその説明を省略する。

無菌バッグ２は可撓性を有するビニール袋のようなものであるため、液体培地を添加した際に定形性を有さないだけでなく、強度も高いわけではないので、図４や図６に示したように培養槽２１内にセットするのが好ましい。なお、培養槽２１はステンレスやアルミニウムなどの金属製とすると好適である。

（培養工程）
培養工程は、セット工程でセットした無菌バッグ２の内部に細胞培養液４及び細胞５を添加して培養する工程である。
前記したように、細胞５の培養は、細胞５に適した条件で適宜行うことができる。

ここで、本実施形態に係る細胞培養方法は、当該培養工程において、濁度センサ部３の光照射部３１から細胞培養液４に光を照射し、細胞培養液４を透過した光を光受光部３２が受光して細胞培養液４の濁度を測定する。そして、光受光部３２と接続された演算部６２が、光受光部３２にて測定された測定値から細胞培養液４中の細胞５の濃度を算出し、その算出結果に基づいて、培養制御装置７が攪拌機構７１、温度調節機構（図示せず）、ガス通気機構７２、及び液体培地の培地成分の自動添加機構（図示せず）のうちの少なくとも一つを制御する。このようにすると、細胞培養によって細胞５が増殖するのに応じて、適正な流動攪拌と溶存酸素、及び溶存二酸化炭素濃度を維持することができ、効率的な培養を行うことができる。

なお、本実施形態に係る細胞培養方法においても、前記した細胞培養装置１と同じく、光照射部３１及び光受光部３２を、細胞培養液４の流動性の高い位置に設けるのが好ましい。

また、光照射部３１は第１光路変換部３３を備えるとともに、光受光部３２は第２光路変換部３４を備えるのが好ましい。この場合、第１光路変換部３３に無菌バッグ２の一部２ａを近接させ、第２光路変換部３４に無菌バッグ２の他の一部２ｂを近接させて細胞培養液４の濁度を測定するのが好ましい（図２〜図４参照）。
さらに、第１光路変換部３３は、無菌バッグ２の一部２ａを介して光照射部３１の光源からの光を入射し、光路を変換して細胞培養液４に光を照射させることができる。そして、第２光路変換部３４は、第１光路変換部３３によって光路が変換されて照射され、細胞培養液４を透過した光を入射し、光路を変換して無菌バッグ２の他の一部２ｂを介して光受光部３２に受光させて細胞培養液４の濁度を測定することができる（図５、図６参照）。
ここに挙げたこれらの好ましい態様は、細胞培養装置１にて詳述しているのでここでの詳細な説明は省略する。

以上、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置及び細胞培養方法について、詳細に説明したが、本発明の内容は前記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１ 細胞培養装置
２ 無菌バッグ
２ａ 無菌バッグの一部
２ｂ 無菌バッグの他の一部
３ 濁度センサ部
３１ 光照射部
３２ 光受光部
４ 細胞培養液

Claims (6)

1. 内部に細胞培養液が充填されて細胞を培養する光透過性と可撓性を有する無菌バッグの所定の部位が入る凹部と、
   前記凹部に入れられた前記所定の部位における前記無菌バッグの一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液に光を照射する光照射部、及び、前記所定の部位における前記無菌バッグの他の一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液を透過した光を受光する光受光部を有し、前記光照射部、前記無菌バッグの一部、前記無菌バッグの他の一部及び前記光受光部をこの順に光学的に一直線に配置した光路を有する濁度センサ部と、を備えるとともに、
   前記凹部は、互いに対向する一方の対向面と他方の対向面とを有して、前記対向面同士の間が前記光路の一部をなし、
   前記一方の対向面と前記他方の対向面とのうちの少なくとも一方の面が階段状に形成されている
   ことを特徴とする細胞培養装置。
2. 前記光照射部は、光源からの光の光路を変換して前記光を前記細胞培養液に照射させる第１光路変換部を前記凹部の前記一方の対向面に備えるとともに、
   前記光受光部は、前記細胞培養液を透過した前記光の光路をさらに変換して当該光受光部で受光させる第２光路変換部を前記凹部の前記他方の対向面に備え、
   前記凹部に前記無菌バッグの前記所定の部位が入ることで、前記凹部の前記一方の対向面に備わる前記第１光路変換部に前記無菌バッグの一部を近接させ、前記凹部の前記他方の対向面に備わる前記第２光路変換部に前記無菌バッグの他の一部を近接させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 光照射部、光受光部、第１光路変換部、第２光路変換部、及び、凹部を含んでなり、前記光照射部、前記第１光路変換部、前記凹部、前記第２光路変換部、及び、前記光受光部をこの順に光学的に一直線に配置した光路を形成して、無菌バッグ内の細胞培養液の濁度を測定する濁度センサ部を有し、
   前記濁度センサ部は、
   前記光照射部と前記光受光部とを含んでなる本体部と、前記第１光路変換部と前記第２光路変換部と前記凹部とを含んでなる光路変換ユニットとを備え、
   前記光路変換ユニットは、前記本体部とは光軸の位置決め部材を介して着脱可能であり、
   前記凹部は、互いに対向する一方の対向面と他方の対向面とを有して、前記第１光路変換部と前記第２光路変換部とが前記一方の対向面と前記他方の対向面の対向面の間を介して向き合い、
   前記一方の対向面と前記他方の対向面とのうちの少なくとも一方の面が階段状に形成されており、
   濁度の測定時、
   前記光路変換ユニットは、前記無菌バッグ中に配され、かつ、前記光軸の位置決め部材を介して前記無菌バッグのフィルムを挟み込むように前記本体部に装着されることで、前記光路における前記光照射部と前記第１光路変換部との間に前記フィルムが介挿され、かつ、前記第２光路変換部と前記光受光部との間にも前記フィルムが介挿され、かつ、前記凹部の前記一方の対向面と前記他方の対向面の間に前記細胞培養液が満たされている
   ことを特徴とする細胞培養装置。
4. 前記光受光部と接続され、前記光受光部にて測定された測定値から前記細胞培養液中の細胞の濃度を算出し、その算出結果に基づいて、前記細胞培養液の攪拌速度の調節、細胞培養液の温度の調節、ガス通気量の調節及び液体培地の培地成分の調節のうちの少なくとも一つを制御する演算部をさらに備える
   ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
5. 前記光照射部及び前記光受光部を、前記細胞培養液の流動性の高い位置に設けたことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
6. 内部に細胞培養液が充填されて細胞を培養する光透過性と可撓性を有する無菌バッグの所定の部位が入る凹部と、前記凹部に入れられた前記所定の部位における前記無菌バッグの一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液に光を照射する光照射部、及び、前記所定の部位における前記無菌バッグの他の一部を介して前記無菌バッグ内の細胞培養液を透過した光を受光する光受光部を有し、前記光照射部、前記無菌バッグの一部、前記無菌バッグの他の一部及び前記光受光部をこの順に光学的に一直線に配置した光路を有する濁度センサ部と、を装置内の所定の位置にセットするセット工程と、
   前記無菌バッグの内部に細胞培養液及び細胞を添加して培養する培養工程と、を含み、
   前記培養工程において、前記濁度センサ部の前記光照射部から前記細胞培養液に光を照射し、前記細胞培養液を透過した前記光を前記光受光部が受光して前記細胞培養液の濁度を測定するものであり、
   前記凹部は、互いに対向する一方の対向面と他方の対向面とを有して、前記対向面同士の間が前記光路の一部をなし、
   前記一方の対向面と前記他方の対向面とのうちの少なくとも一方の面が階段状に形成されている
   ことを特徴とする細胞培養方法。

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