JP6150161B2 - 高血圧検出試薬 - Google Patents

Description

本発明は、高血圧及びメタボリック症候群の診断補助法及びその検出試薬に関する。更に、治療の用具、医薬品を含む。

従来、高血圧の診断は器具による血圧の物理的な測定であった。又、高血圧に伴う組織障害を簡便に見る方法は無かったので、血管組織がどの程度傷んでいるかは不明だった。従って、現状は、高血圧に伴う血管の組織障害が起こっているか否かに関わらず、高血圧なら一律に降圧剤を漫然と投与しがちである。又、降圧剤には、長年の投与が腎臓の微細血管に悪影響を指摘されるものもある。

高血圧者は血管の組織障害が起こっていると考えられながらも、これまで、その検出方法は無かった。組織の障害が診断できれば、より一層、治療薬開発での効果の指標や高血圧治療の経緯観察の指標として役立つ。

課題が解決するための手段

本願発明は、タイプＩＶコラーゲン、その構成領域、もしくはその構成ペプチドを用いることで、高血圧のみならずメタボリック症候群による組織障害を検出できる方法と試薬、更には治療補助方法、治療薬を提供するものである。
タイプＩＶコラーゲンは生体組織基底膜の主要成分でα鎖３本から構成される。α鎖はα１鎖からα６鎖までの６種類があり、組織によりα鎖の種類や量に偏りがある。α１鎖、α２鎖は全身に分布するが、腎糸球体基底膜はα３鎖からα６鎖が富む。生体組織からタイプＩＶコラーゲンを取り出すには、存在量の多さが知られる胎盤、腎臓糸球体基底膜、眼球が出発材料となる。
タイプＩＶコラーゲンの構成領域はＮ端の７Ｓ、中央部らせん領域、Ｃ端のＮＣ１の三領域に分けられる。タイプＩＶコラーゲンを構成するアミノ酸配列は、動物種が異なってもα鎖が同じなら類似している。一方、同じ動物種でも、α鎖が異なればアミノ酸配列は大きく異なる。例えばα３鎖とα１鎖のように、異なるα鎖の同じ配列順序を用いてそれぞれ２０残基の合成ペプチドを作製し比較すると、多くの場合はいくつかのアミノ酸が異なっている。

タイプＩＶコラーゲンと疾患の係わりについて。
稀な腎炎である抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎では、タイプＩＶコラーゲンのＮＣ１領域（ＮＣ１）に対する抗体（抗ＮＣ１抗体）が血液中で増加するとして、その測定が有用として臨床の場で用いられている。一方、本願発明者は健常者や尿アルブミン高値者の血清もしくは尿に抗ＮＣ１抗体が高頻度に存在することを指摘した（細胞３５：１５０−１５４，２００３）。しかし、本願発明者に限らず血清で高値を示した例がどのような疾患に関わっているのかは未解明であった。その後、本願発明者は、腎炎一般の尿中に抗ＮＣ１抗体が存在すること（医学と薬学５１：５６７−５７２，２００４）、及び、α５鎖が腎炎患者尿中のＩｇＧと反応することを合成ペプチドで示した（医学と薬学５７：６０５−６１３，２００７）。

今回、更に本願発明者は以下の各事実を発見した。
その実験には次のタイプＩＶコラーゲンを用いる。タイプＩＶコラーゲンの出発材料には胎盤もしくは腎臓皮質を用い、構成領域として三本鎖らせん領域もしくはＮＣ１領域を用いる。α鎖を代表してα１鎖とα５鎖を用い、その合成ペプチド鎖ｙｐ１２、ｙｐ０８他を用いた。
測定の結果で明らかになった一つは、尿と血液の抗ＮＣ１抗体は抗原ＮＣ１の由来組織が異なっていたことである。ヒト及びラットの抗ＮＣ１抗体を測定すると血中の抗ＮＣ１抗体と尿中の抗ＮＣ１抗体は相関しない。
腎炎患者の尿中のＩｇＧはα５鎖ＮＣ１に反応し、高血圧患者の血中のＩｇＧはα１鎖、α２鎖のＮＣ１に反応した。α５鎖は腎臓で富み、α１鎖、α２鎖は血管や皮膚の基底膜を始め全身の基底膜に分布する。腎炎では腎臓の濾過機能を担う糸球体、尿細管、ボウマン嚢の基底膜に障害が起きて、障害腎組織基底膜中のＮＣ１が抗原となって尿中に抗ＮＣ１抗体を産生するものと考える。又、高血圧患者やメタボリック症候群では、脳その他の微小血管や組織の基底膜に障害が生じて、障害基底膜中のＮＣ１が抗原となり、血液中に抗ＮＣ１抗体を産生させるものと考える。実際、初期の高血圧患者やメタボリック症候群では、尿中に抗ＮＣ１抗体は検出されなかった。

各α鎖由来のペプチドに対する抗体。
詳細な検討をするために実験動物、ここではラットを用いた。ＷＫＹ及びＷＫＹから派生した３系統である。高血圧を生じる高血圧ラット（ＳＨＲ）、異常な高血圧で脳卒中を生じる脳卒中ラット（ＳＨＲｓｐ）、及びメタボリック症候群ラット（ＳＨＲｃｐ）である。
尿中の抗ＮＣ１抗体は、α５鎖ＮＣ１由来の複数のペプチド鎖（２０残基）−ｙｐ０５、ｙｐ０８、ｙｐ１２−に対する抗体（抗ｙｐ０５抗体、抗ｙｐ０８抗体、抗ｙｐ１２抗体）と相関する。逆に血中の抗ＮＣ１抗体は、ｙｐ０５抗体、ｙｐ０８抗体と相関しない。従って、尿中の抗ＮＣ１抗体は抗α５鎖ＮＣ１抗体を含み、血中の抗ＮＣ１抗体は抗α５鎖ＮＣ１抗体を含まないことになる。血中に抗ＮＣ１抗体が検出された場合、高血圧で、特に遺伝性高血圧で、加えて脳卒中家系なら、免疫抑制剤を微量から用いる。その結果、血中の抗ＮＣ１抗体が低下するなら、治療効果を判定できる。

測定方法は、検出対象が抗原にしろ、抗体にしろ、免疫反応を用いる。検出には発光法を、例えば、アイソトープ、化学発光、生物発光を用いる。発光法を用いないで凝集や光散乱を、あるいは電気泳動、沈降法などでもよい。ヒト測定の一例としてＥＬＩＳＡ法による抗体測定を示す。抗原固相化マイクロプレートに、５０−１００倍に希釈した血清を加えて、反応させて、洗浄後に酵素標識抗ヒト（測定対象動物に合わせる）抗体を加えて反応後、洗浄して酵素基質液を加えて、呈色した濃さを見ながら、５−３０分で反応停止液を加え、直ちに波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。

発明の効果

本発明は、高血圧による組織障害の検出や治療補助方法として有用である。又、動物及びヒトでの測定は、疾患の程度把握、降圧剤や生活習慣病改善剤（抗コレステロール剤、抗脂質剤他）、糖尿病治療薬、薬物評価の指標となる。

測定対象；
ラット４系統（ＷＫＹ、ＳＨＲ、ＳＨＲｓｐ、ＳＨＲｃｐ）♂各５匹の６週齢と２１週齢の血漿、
測定項目；抗タイプＩＶコラーゲンＮＣ１抗体、
測定方法；ＮＣ１（ウシ腎臓由来）を固相化した９６穴のマイクロプレートに→血漿（１００倍希釈）添加→インキュベーション及び洗浄→
酵素標識抗ラットＩｇＧ抗体添加→インキュベーション及び洗浄→
酵素基質液添加→呈色を観察しながら５−３０分後に→
反応停止液（１Ｎ硫酸）添加→直ちに波長４５０ｎｍで吸光度を測定
結果（吸光度の平均、標準偏差）；
６週齢 ＳＨＲｃｐ（０．６５３，０．１２７）、ＳＨＲｓｐ（０．４１２，０．０７１）、ＳＨＲ（０．２６２，０．０３６）、ＷＫＹ（０．２４３，０．０１６）
２１週齢 ＳＨＲｃｐ（０．８２６，０．１１０）、ＳＨＲｓｐ（０．６２９，０．０７１）、ＳＨＲ（０．４７０，０．０３６）、ＷＫＹ（０．５２０，０．０６５）
結論；
１）メタボリック症候群ラット（ＳＨＲｃｐ）は早期より抗ＮＣ１抗体が上昇するので、メタボリック状態に伴う組織障害の指標となる
２）脳卒中ラット（ＳＨＲｓｐ）は早期より抗ＮＣ１抗体が上昇するので、異常高血圧に伴う脳血管はじめ微細血管障害の指標となる

測定対象；ヒト健常者（８６例）及び高血圧患者（１１例）の血清、
測定項目；抗タイプＩＶコラーゲンＮＣ１抗体、
測定方法；実施例１に同じ、ただし酵素標識抗体は抗ヒト抗体を使用
結果（吸光度の平均はＡｖｅ．と表示、標準偏差はＳＤと表示）；
健常者（０．４６７，０．１８６）、高血圧患者（０．６３２，０．４０５）
カットオフ値はＡｖｅ＋２ＳＤとした（０．８３９）
カットオフ値以上は高血圧患者１１例中で４例（３６％）、健常者８６例中で８例であった
結論；高血圧例では血管組織障害の生じている可能性が大きい。

Claims (4)

1. 腎、肺を除いたタイプＩＶコラーゲンの存在する生体組織基底膜の障害を検出するための方法で、ヒト及び／又は動物から採取された血液を試料として、その中に障害生体組織基底膜由来のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域又はそのペプチド、もしくはそれらの抗体が存在するか否かを分析することから成り、障害生体組織基底膜由来のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域又はそのペプチド、もしくはそれらの抗体の測定値に基づき算出されたカットオフ値よりも、前記試料中の障害生体組織基底膜由来のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域又はそのペプチド、もしくはそれらの抗体の測定値が高く存在することにより、その存在することがタイプＩＶコラーゲンの存在する生体組織基底膜の障害が生じていることを示すことからなる方法。
2. タイプＩＶコラーゲンの存在する生体組織基底膜の障害を検出するための方法がヒトに於いては高血圧群を見出すための方法であって、又、非ヒト動物では脳卒中群とメタボリック症候群を見出すための方法であって、ヒト及び／又は動物のそれぞれから採取された血液を試料として、その中の障害生体組織基底膜由来のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域又はそのペプチド、もしくはそれらの抗体の検出値が、障害生体組織基底膜由来のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域又はそのペプチド、もしくはそれらの抗体の検出値に基づき算出されたカットオフ値よりも高いことにより、タイプＩＶコラーゲンの存在する生体組織基底膜の障害が生じていることを示すことからなる方法。
3. 抗ＮＣ１抗体測定を用いて、高血圧群、メタボリック症候群または脳卒中予備群のタイプＩＶコラーゲンＮＣ１領域の障害診断を行うための方法。
4. 抗ＮＣ１抗体測定を用いて、高血圧群から、脳卒中予備群の可能性を識別するための方法。