JP6152382B2 - 光開裂可能な化合物の使用 - Google Patents

Description

本発明は、１光子又は多光子照射実験における、光開裂性化合物、いわゆる「ケージド化合物」又はその塩の、光開裂性化合物の自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にできる試薬との併用に関する。

光開裂性化合物、いわゆる「ケージド化合物」は、生物学的プロセスの調査の中で非常に有用な化合物である。このような試薬及びその使用は、特に、ヨーロッパ特許公開第１７５７５８５号及び米国特許第６７６５０１４号の明細書、及びＭｏｒｒｉｓｏｎらの論文（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２００２），１，９６０）、Ｍ．Ｃａｎｅｐａｒｉらの論文（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００１），１１２，２９）、Ｍ．Ｃａｎｅｐａｒｉらの論文（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（２００１），５３３，７６５）に記載されている。これらの化合物は、生物学的には不活性であるが、光により開裂し、生物学的に活性な化合物が発現する。これらの化合物は、紫外光又は可視光により迅速に発現する。これらの光開裂性化合物は、向神経活性アミノ酸のような生物学的に活性な化合物を、その活性を必要とする部位に送達するために使用される。１光子又は多光子照射法、好ましくは２光子照射法を使用する光開裂性化合物からの活性化合物の放出は、Ｆｅｄｏｒｙａｋらにより、その論文（Ｃｈｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２００５），２９，３６６４−３６６６）に記載されているように、ニューロンの研究のダイナミックに開発されつつある方法である。多光子照射プロセスにおいて、光化学反応は、２以上の光子の励起によって行われる。これらの方法を使用すると、ニューロンの刺激が、局在的にかつ非常に特異的に行われる。上記文献は、１光子又は２光子照射プロセスを使用することによる光開裂性誘導体からのグルタミン酸及びγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の放出を記載している。全てのケースにおいて、基質として、光開裂性化合物が使用されている。ヨーロッパ特許公開第１７５７５８５号及び米国特許第６７６５０１４号には、光開裂性化合物として使用される７−インドリン化合物が記載されている。これらの文献では、光開裂性化合物は、塩基として又はカチオンとで形成された塩として記載されている。国際特許公開ＷＯ２００８／０９４２２には、ジニトロ誘導体が塩基又はカチオンとの塩として記載されている。

２−アミノ−５−（４−メトキシ−７−ニトロ−２，３−ジヒドロ−インドール−１−イル）−５−オキソ−ペンタン酸（以下、「ＭＮＩ−Ｇｌｕ」と表示する）は、グルタミン酸成分を含有するモノニトロインドリン（ＭＮＩ）誘導体であり、神経系の多光子照射試験用の周知の有用な化合物である。しかし、これらモノニトロインドリン誘導体の量子収率は低く、活性アミノ酸の放出も比較的遅く、その光子吸収の最大値も理想的ではない。４−メトキシ−５，７−ジニトロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドールの構造を基礎とする化合物のようなジニトロインドール誘導体を使用することによって、より高い光子収率が達成される。このような化合物は、例えば、Ｆｅｄｏｒｙａｋら（Ｃｈｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２００５），２９，３６６４−３６６６）、Ｇ．Ｃ．Ｒ．Ｅｌｌｉｓ−Ｄａｖｉｅｓら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｕｎｅ ２０，（２００７），２７（２５） ６６０１−６６０４）及びＧ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕら（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２００５），４（１１），８８７−８９６）によって開示された２−アミノ−５−（４’−メトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１−イル）−５−オキソ−ペンタン酸（以下、「ＤＮＩ−Ｇｌｕ」と表示する）である。これら論文には、生物学的試験は開示されておらず、類似化合物の調製のみが開示されている。ＦｅｄｏｒｙａｋらによるＤＮＩ−Ｇｌｕの調製は、２工程のニトロ化によって行われる。初めに、そのアミノ基及びカルボキシル基が保護された２−アミノ−５−（４−メトキシ−２，３−ジヒドロ−インドール−１−イル）−５−オキソ−ペンタン酸を調製し、ついで、７位でニトロ化する。次の工程において、モノニトロ化誘導体を、５位でニトロ化する。続いて、保護基を除去し、このようにして、ＤＮＩ−Ｇｌｕと名付けられる生成物が得られる。同様の方法が国際特許公開ＷＯ２００８／０９４９２２に記載されている。発明者らによれば、ＤＮＩ−Ｇｌｕの効果的な製法は、第２のニトロ化工程のための保護されていないモノアミノ酸が適切な純度であることを要求する。このように、第２のニトロ基は、第２工程においてのみ導入される。生理溶液におけるＤＮＩ−Ｇｌｕの溶解度は低く、海馬ニューロンの２光子照射試験では、電気信号が発生されないとの知見が得られた。更なる問題は、ＤＮＩ−Ｇｌｕが凍結緩衝剤から分離し、室温に温める際にも溶解されないことであった。これらの問題は、前記国際特許出願によれば、ＤＮＩ−Ｇｌｕの４位にカルボキシ−メトキシ基を挿入することによって解消される。４−カルボキシ−メトキシ−５，７−ジニトロインドリニル−Ｇｌｕ（以下、「ＣＤＮＩ−Ｇｌｕ」と表示する）は、２工程のニトロ化法によって調製される。ＣＤＮＩ−Ｇｌｕは、インドール誘導体に関して収率６．９％で調製される。このように、従来技術によれば、保存中又は生物学的テストの間、適切に安定であるような安定した誘導体が調製されないため、ＤＮＩ誘導体のより高い量子収率を利用することができなかった。このように、これらの試薬は、その工業的製造及びその安定性の維持が解決されないため、工業的規模で調製されていなかった。さらに、易分解性ＤＮＩ誘導体から自発的に形成される生物学的に活性な成分によって生ずるテストにおける干渉の排除に関する解決策が存在しなかった。

試験プロセスにおいて適用可能な公知の光化学的に開裂可能な化合物、いわゆる「ケージド化合物」は塩基の形でのみ使用されるが、それらの内のいくつかは、金属塩としても調製される。これら化合物は不利な特性を有する。取り扱いが困難である塩基の形では、これら化合物は、吸湿性、光感応性であり、不安定である。光開裂性化合物は、多くのケースでは、試験条件下において自発的に加水分解し、放出される活性な化合物が試験を妨げる。生物学的プロセスの間に、向神経活性のアミノ酸及びアミンが迅速に放出されることは公知の事実である。従って、いわゆる「ケージド化合物」は、照射の効果によって迅速に分解する生理学的プロセスの良好なモデルである。しかし、これらの化合物は、さらに、試験の間では、加水分解する傾向がますます強く、従って、アミノ酸又は向神経活性アミンのかなりの量が、測定媒体中、照射前のニューロンの間の細胞間液体中に入る。これは、特に、高い量子収率を有するＤＮＩ化合物について事実である。特定の閾値以上では、これらの化合物は、ニューロンに対して敏感にさせ、試験の誤った結果を与え、より高い濃度では、被試験ニューロンの死滅を生じさせることがある。

このような光開裂性化合物の調製又は上記欠点の排除を可能にするように使用する実験条件を変更することにとって、「ケージド化合物」の開裂が迅速であるが、自発的加水分解によって生ずる化合物が測定を妨げないことが必要であった。

発明の本質
本発明は、１光子又は多光子照射実験における、光開裂性化合物又はその塩の、光開裂性化合物から放出される生物活性化合物を無効にするための試薬との併用に関する。

発明者らは、モノ光子又は多光子照射実験の過程において、生物学的に活性な化合物を無効にする試薬を使用する場合、テストの再現性がかなり良好であり、生物活性化合物の広範囲の選択を検討することを可能にするとの知見を得た。

電位固定テストにおけるケージド化合物及び酵素の添加による細胞の自発的活動性の変化を示す図である（実施例１７において詳述する）。 ＤＮＩ及びＭＮＩタイプの化合物の生物学的効果を比較する図である（実施例１８において詳述する）。 使用する光の波長によるＤＮＩ及びＭＮＩタイプの化合物の生物学的効果を比較する図である。 ニューロンに対する化合物ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−グルタメート及びｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−グルタメートの生物学的効果を比較する図である（実施例２０において詳述する）。 ケージド化合物としてｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡを使用する２光子照射法によるニューロンの神経生物学的実験を示す図である（図５Ａは実験配置を示し、図５Ｂは刺激に対する応答を示し、図５Ｃは刺激の応答に基づく各ポイントにおける受容体密度を示す）。

本発明によれば、１光子及び多光子照射テストにおいて、光開裂性化合物又はその塩及び光開裂性化合物から発生する生物学的に活性な化合物を無効にするための試薬が併用される。

本発明の有利な１具体例によれば、光開裂性化合物は、生物活性化合物として、アミノ酸、向神経活性アミン、神経伝達物質、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメント、ペプチド、脂質、２次シグナル物質、薬剤活性成分又はその候補を放出する。

神経伝達物質は、例えば、グリシン、アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ヒスタミン、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、セロトニン等である。

薬剤活性成分の候補は、生物学的に活性な化合物であろうと考えられ、その化合物の活性が本発明によるプロセスでテストされるような化合物である。このような化合物は、例えば、中枢神経系に作用する化合物である。

本発明の有利な１具体例は、モノ光子又は多光子照射実験における、一般式（Ｉ）

（ここで、
Ｒ^１は、水素原子、又は電子求引性基、好ましくは、シアノ、ニトロ、カルボキシル又はホルミル基又はハロゲン原子を表し；
Ｒ^２は、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、好ましくは臭素原子；又は未置換の、直鎖又は分枝状、飽和又は不飽和アルコキシ、シクロアルコキシ、好ましくは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ基；又は直鎖又は分枝状の置換アルコキシ、シクロアルコキシ、好ましくは、１又は同一又は異なる２の未置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基、又は未置換アミノ基又は置換アミノ基（好ましくは、ジメチルアミノ−Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ基）を有するＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ基；又は直鎖又は分子状炭素鎖の置換飽和又は不飽和アルコキシ、シクロアルコキシ、好ましくは、１以上のカルボキシル基（好ましくは、マロニルオキシ基）、又は未置換のアミノ基又は１のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基又はシクロアルキル基、又は２の同一又は異なるＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基によって置換されたアミノ基によって置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ基を表し；
Ｒ^３は、水素原子、又は置換又は未置換のアルキル基を表し、又はＲ^２及びＲ^３は、一緒に、未置換のシクロアルキル基を表し；
Ｒ^４は、水素原子、又は置換又は未置換のアルキル基を表し、又はＲ^３及びＲ^４は、一緒に、未置換のシクロアルキル基を表し；
Ｒ^５は、インドリン環の窒素原子に共有結合する生物学的に活性な化合物を表す）で表される化合物又は有機酸又は無機酸とで形成されるその塩と、一般式（Ｉ）の化合物の自発的分解のために発生する生物学的に活性な化合物を無効にする試薬との併用である。

化合物の酸付加塩も使用できる。無機酸、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、臭化水素酸、ホスホン酸；有機酸、例えば、飽和又は不飽和、置換又は未置換の脂肪族カルボン酸［例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、及びステアリン酸、デカン酸、セバシン酸、オロチン酸、パルミチン酸、パモン酸、置換カルボン酸（例えば、ハロゲン化カルボン酸（例えば、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸）又はオキシカルボン酸（例えば、２−オキソ−グルタル酸、ピルビン酸）］、脂肪族ジカルボン酸又は多カルボン酸（例えば、シュウ酸、アジピン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、サリチル酸、アセチルサリチル酸、４−アミノサリチル酸）、脂肪族又は芳香族スルホン酸［例えば、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシ−エタンスルホン酸、シクロヘキシルスルホン酸（シクラミン酸）、ドデシルスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸］、カルボキシル官能基を有する炭水化物（例えば、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルクロン酸）、ヒドロキシ酸（例えば、アスコルビン酸、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸、リンゴ酸）、アミノ酸（例えば、Ｌ−アスパラギン酸）］とで形成される塩、好ましくは、未置換のＣ_１〜Ｃ_４カルボン酸（例えば、酢酸）又は１以上のハロゲン置換基を有する置換Ｃ_１〜Ｃ_４カルボン酸（例えば、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸）とで形成される塩、最も好ましくは、トリフルオロ酢酸とで形成される塩が酸付加塩として使用される。

テストでは、本発明による一般式（Ｉ）で表される化合物の置換基Ｒ^５として、すなわち、インドリン環の窒素原子に共有結合する生物学的に活性な化合物として、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのフラグメント、ホルモン、神経伝達物質、アミノ酸、ペプチド、脂質又は向神経活性アミン、薬剤活性成分又はその候補が使用され、このようにして、一般式（Ｉ）で表される化合物の自発的加水分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にできる試薬も使用される。

本発明によれば、試薬は、使用する「ケージド」化合物の自発的加水分解によって形成される生物学的に活性な化合物を、これら化合物が反応混合物中に蓄積しないように、物理的、化学的又は生物学的方法で分解又は吸収する、「生物学的に活性な化合物を無効にすることができる」試薬と定義される。このような化合物は、例えば、酵素（アミノ酸を、発生される際に、生物学的に不活性な化合物に転化する）、又はアミノ酸を消化する細胞培養物であり、又はイオン性化合物が形成される場合には、自発的に形成される生物学的に活性な化合物の吸収のためにイオン交換樹脂が使用される。生物学的に活性な化合物を「無効にできる」好適な試薬の選択は、「ケージド」化合物の自発的加水分解された化合物の性質に左右される。

「同時投与」とは、本発明によれば、テストの間に、「ケージド」化合物及び反応混合物において一般的に使用される更なる成分に加えて、使用したケージド化合物の自発的分解によって形成された生物学的に活性な化合物を無効にする試薬も、テスト混合物中に、好ましくは、溶解又は懸濁した形又は固状の形で存在することを意味する。

有利な１具体例によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩が、１光子又は多光子照射実験、好ましくは、２光子照射実験において、一般式（Ｉ）［式中、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、水素又は臭素原子、又は直鎖又は分枝状、置換又は未置換のアルコキシ、シクロアルコキシ、好ましくは、未置換アミノ基、又はＣ_１〜Ｃ_６アルキル基又はシクロアルキル基、又は２の同一又は異なるＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基で置換されたアミノ基によって置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ基、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、アミノ酸の酸残基又は一般式（ＩＩ）

（ここで、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、神経伝達物質のアミン残基を表し、Ｘは酸素又はイオウ原子を表す）の基を表す］で表される化合物の自発的分解によって形成されるアミノ酸を無効にする試薬、好ましくは、アミノ酸分解酵素又は物理的、化学的又は生物学的方法でアミノ酸を吸収できる試薬、好ましくは、イオン交換樹脂、神経細胞と同時投与として使用される。

最も有利な１具体例によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物のトリフルオロ酢酸との塩が、１光子又は多光子照射実験、好ましくは、２光子照射実験において、一般式（Ｉ）［式中、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、水素又は臭素原子、又はジメチルアミノ−エトキシ基、ジメチルアミノ−プロポキシ基、ジメチルアミノ−イソプロポキシ基の異性体（−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２及びＯ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）_２基）、ジメチルアミノ−イソブトキシ基（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２）、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンの酸残基又は一般式（ＩＩ）（式中、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンのアミン残基を表し、Ｘは酸素又はイオウ原子を表す）の基を表す］で表される化合物の自発的分解によって形成されるアミノ酸を無効にする試薬、好ましくは、アミノ酸分解酵素又は物理的、化学的又は生物学的方法でアミノ酸を吸収できる試薬、好ましくは、イオン交換樹脂、神経細胞と同時投与として使用される。

さらに、本発明は、改善された１光子又は多光子照射プロセスであって、光開裂可能な化合物を、自発的分解によって発生する生物学的に活性な化合物を無効にする試薬と併用する（同時投与する）プロセスにも関する。

本発明は、また、一般式（Ｉ）で表される化合物及び一般式（Ｉ）で表される化合物の分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にする試薬、及び必要であれば他の補助剤を含んでなる組成物にも関する。

本発明の更なる具体例は、１光子又は多光子照射実験において使用される、一般式（Ｉ）［ここで、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は水素又は臭素原子、又は直鎖又は分枝状、置換又は未置換のアルコキシ又はシクロアルコキシ基、好ましくは、未置換のアミノ基又は1のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基又はシクロアルキル基、又は２の同一又は異なるＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基にて置換されたアミノ基によって置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ基、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、アミノ酸の酸残基、又は一般式（ＩＩ）（式中、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、アミノ酸のアミン残基を表し、Ｘは酸素又はイオウ原子を表す）の基を表す］で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩及びその製法にある。

さらに、本発明の最も有利な１具体例は、一般式（Ｉ）［式中、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、水素又は臭素原子、又はジメチルアミノ−エトキシ基、ジメチルアミノ−プロポキシ基、ジメチルアミノ−イソプロポキシ基の異性体（−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２及びＯ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）_２基）、ジメチルアミノ−イソブトキシ基（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２）、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンの酸残基、又は一般式（ＩＩ）（式中、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンのアミン残基を表し、Ｘは酸素又はイオウ原子を表す）の基を表す］で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩及びその製法に関する。

有利な具体例によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩において、Ｒ^５はアミノ酸の酸残基であるか、又はＲ^５は、一般式（ＩＩ）（式中、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、神経伝達物質又は神経伝達物質とみなされる化合物のアミン残基を表し、Ｘは酸素又はイオウ原子を表す）の基である。

発明者らは、驚くべきことには、一般式（Ｉ）［式中、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、水素又は臭素原子、又は直鎖又は分枝状、置換又は未置換のアルコキシ又はシクロアルコキシ、好ましくは、未置換のアミノ基、又は１のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基又はシクロアルキル基又は２の同一又は異なるＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基にて置換されたアミノ基によって置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ基、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、アミノ酸の酸残基又は一般式（ＩＩ）（ここで、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、神経伝達物質又は神経伝達物質とみなされる化合物のアミン残基を表し、Ｘは酸素又はイオウ原子を表す）の基を表す］で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩が、例えば、ＭＮＩ−Ｇｌｕ又はそのトリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」）との酸付加塩（ＭＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ）よりも、かなり高い量子収率で使用されるとの知見を得た。これらの化合物はより高い量子収率を有するが、実験条件下において、自発的に容易に分解する。驚くべきことには、発生されるアミノ酸又は神経伝達物質は、好適な試薬の添加により、化学的プロセスにおいて無効にされるか、又はイオン交換樹脂を使用することにより、物理的−化学的プロセスにおいて、測定のために使用された媒体から除去される。自発的分解によって形成される化合物も、物理プロセスにより、除去される。

化合物ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡから放出されたＬ−グルタミン酸は、好ましくは、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼの添加によって無効にされる。試薬の存在にもかかわらず、測定シグナルは、試薬自体が生理学的効果を持たないため減少せず、シグナル／ノイズの比はかなり良好となる。また、ＤＮＩ−Ｇｌｕ塩基を使用する場合、興奮性シナプス後電位（以下、ＥＰＳＰ）のレベルは、いわゆる「ケージド試薬」以外に、自発的に放出されるグルタミン酸を無効にする試薬も使用されている場合には、コントロールレベルにリセットされる。

ＥＰＳＰの特性を保持することは、ＥＰＳＰの周波数が増大する場合には、細胞の基本的活動性が正常レベルから逸脱し、細胞死を招くため、非常に重要である。電位固定法を使用して測定した、細胞の自発的活動性の変化を図１Ａに示す（図において、曲線ａ）はコントロール（正常な活動性）を示し、ｂ）は、添加した「ケージド」化合物の自発的分解によって生じた条件を示し、曲線ｃ）は、酵素の添加によって条件がコントロールレベルに維持されることを示している）。いくつかの並列実験の結果を図１Ｂに示す（図において、垂直のスケールバーはＥＰＳＰの周波数を示す）。示した実験の場合、潅流溶液へのＤＮＩ−Ｇｌｕの添加のため、ＥＰＳＰの周波数が増大し、ついで、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼの添加後、元に戻る。酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼを使用する場合も、結果は同様である。実施例１７では、並列サンプル８個の実験を行う場合、測定に供されるＤＮＩ−Ｇｌｕが顕著に周波数を増大させるとの事実にもかかわらず、酵素の添加が電位変化の頻度をコントロールレベルに戻すとの知見が示されている。酵素の添加によって、ＥＰＳＰの周波数はコントロールレベルに戻され、実験のシグナル／ノイズ比が増大される。実験が正常な細胞機能を持つ生理学的条件に保持され、このようにして、実験は、より良好にコントロールされ、より良好な再現性を提供する。使用する酵素は細胞機能を変化させず、従って、測定を妨げない。

下記の表において、例として、いくつかの生物学的に活性な化合物、神経伝達物質及び向神経活性アミンが放出される場合に、いずれの酵素が使用できるかを要約する。

当業者であれば、一般的知識及び使用した実験環境に基づき、市販の酵素組成物から好適な酵素を選択することができる。好適な試薬、好ましくは、酵素の選択は、放出される生物学的に活性な物質についての認識を有する当業者の一般的知識の一部である。当業者は、実験に供する細胞、例えば、ニューロンに対して危険でない及びそれらの生理学的状態を変更させない様な試薬を選択する。ＤＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合には、このような試薬は、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸デカルボキシラーゼである。

ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのフラグメントが放出される場合、放出された生物学的に活性な化合物は、酵素ヌクレアーゼ（ＤＮＡヌクレアーゼ又はＲＮＡヌクレアーゼ）の使用により無効にされる。生物学的に活性な化合物として脂質ホルモンを使用する場合、自発的分解により放出される化合物は、例えば、酵素脂肪酸デヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ）の使用により又は脂肪酸を水和する酵素ＮＡＤ^＋キナーゼ、酵素チオリシスＣｏＡにより無効にされる。

ペプチドが放出される場合、ペプチド分解酵素も使用される。２次シグナル化合物が放出される部位には、光開裂性化合物の自発的加水分解の間に発生されるＣａ^２＋イオンはＣａ^２＋キレート化剤の使用によって無効にされる。

或いは、自発的加水分解により放出される生物学的に活性な物質を、物理的又は化学的プロセスによって、部分的に又は完全に吸着する吸着剤を、測定液体中又はその循環系内に配置することができる。

アミノ酸のようなイオン性化合物が放出される場合には、陰イオン又は陽イオン交換樹脂を測定流体中に配置でき、或いは、アミノ酸を吸収するために、流体を、イオン交換樹脂を充填したカラム内を通過させることができる。陰イオン交換樹脂を使用する場合、アミノ酸及び神経伝達物質も吸収される。アミン及びアミノ酸の吸収用には、好ましくは、スルホン酸基を含有する酸性イオン交換樹脂が使用され、一方、カルボキシル基を含有する化合物の吸収には、塩基性イオン交換樹脂が使用される。好適なイオン交換樹脂の選択は、分離される化合物の特性に左右されるが、選択は、当業者の知識の一部である。同様に、固相抽出も使用できる。固相抽出用の吸着剤は、イオン交換樹脂の使用と同様に使用されるが、これらの吸着剤の中から、ステロイドのような無極性化合物の吸着用に好適なタイプを見出すことができる。

自発的に放出される生物学的に活性な成分は、生物学的プロセスによって、測定媒体から除去される。生物学的に活性な化合物を同化できる細胞又はその組織が試薬として使用され、測定流体の流れ中に又は測定セル内に配置される場合には、自発的に放出される生物学的に活性な化合物の濃度の増大を回避できる。例えば、海馬細胞が検討され、グルタミン酸が放出される場合、測定流体を、測定セルの入口以前に、海馬細胞集団を通過させ、これにより、これら細胞が測定流体中で形成されたグルタミン酸を吸収及び同化する。このようにして、測定流体において、グルタミン酸の量は増大されない。活性化合物の同化を助けるタンパク質をますます発現する一般的に変性された細胞株が配置される場合には、効果が改善される。

当業者であれば、上述の方法及び公知の試薬から、自発的分解の生物学的に活性な化合物を無効にするための公的な方法及び好適な補助剤を容易に選択できる。

特に、本発明によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物において、電子吸引基とは、シアノ、ニトロ、カルボキシル、ホルミル基又はハロゲン原子であり；飽和アルキル基とは、直鎖又は分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、例えば、メチル、エチル、イソプロピル又は３級ブチル基である。不飽和アルキル基とは、１以上の孤立した又は共役した二重又は三重結合を含有する直鎖又は分枝状、置換又は未置換の炭素鎖である。アルキル基は、ハロゲン原子、カルボキシル基、１級、２級又は３級アミノ基のような置換基を有することができる。ハロゲン原子は、例えば、ヨウ素、塩素、臭素又はフッ素原子である。アルコキシ基としては、式
アルキル−Ｏ−
（ここで、アルキルは上記の定義のとおりである）で表される基である。このようなアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、２−オキシマロン酸、３−ジメチルアミノプロポキシ、２−ジメチルアミノエトキシ、２−ジメチルアミノ−１−メチル−エトキシ、４−ジメチルアミノブトキシ、３−ジメチルアミノ−１−メチル−プロポキシ基である。本発明によれば、シクロアルキル基は、非芳香族環又はシクロプロピル、シクロペンチル又はシクロヘキシル基のような環を形成する炭素原子である。シクロアルコキシ基は、シクロアルキル基がエーテルタイプの酸素原子により化合物の他の部分に結合しているような基である。シクロアルキル基又はシクロアルコキシ基は、例えば、ハロゲン原子（例えば、Ｉ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ）、シアノ基、置換又は未置換のアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシにて、又は１〜３のヘテロ原子（ヘテロ原子は、独立して、酸素、イオウ又は窒素である）を含む５〜７員の複素環にて置換される。好ましくは、複素環は飽和であり、２のヘテロ原子を含み、さらに好ましくは、複素環化合物は、モルホリニル又はピペラジニル基である。化合物が置換アミノ基を含有する場合、これらの置換基は、アルキル、シクロアルキル又はシクロアルコキシ基である。本発明によれば、アリール基は、フェニル、ナフタレニルのような単環式又は多環式芳香族基であり、ヘテロアリール基は、ピリジニル基のようなヘテロ原子を含有する孤立した又は共役した環状芳香族基である。本発明によれば、アミノ酸残基としては、天然のアミノ酸又はその誘導体の酸残基である。好ましくは、天然のアミノ酸は、リシン、アラニン、プロリンのような必須アミノ酸及びヒトの器官において又は動物において、例えば、伝導において、役割を有する他のアミノ酸、例えば、γ−アミノ酪酸又はその誘導体である。好適な具体例では、アミノ酸残基は、光照射により光開裂性化合物から分裂する向神経活性アミノ酸の酸残基である。このような化合物は、グルタミン酸の酸残基、４−アミノ−４−カルボキシ−１−オキソ−ブチ−１−イル基、又γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の酸残基、１−オキソ−４−アミノ−ブチル基である。

神経伝達物質のアミン残基は、神経伝達物質のアミノ基の水素原子の１を除去することによって誘導される。例えば、ドーパミンのアミン残基は、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−エチル−アミノ基であり、アドレナリン及びノルアドレナリンのアミン残基は、（Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−エチル−アミノ基であり、ヒスタミンのアミン残基は、２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−エチルアミノ基である。

神経伝達物質とみなされる化合物は、向神経活性効果を有することが期待される少なくとも１のアミノ基を含有する新規又は公知の化合物である。このような化合物は、本発明による方法により、薬剤研究の特定の段階においてテストされる。

本発明の有利な１具体例によれば、ジニトロ化合物のトリフルオロ酢酸塩が使用される。ジニトロ化合物又は塩の使用は、発明者らの実験（実施例１８）の結果に従って、図２に示すように、ＤＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合、照射によって生ずる興奮性シナプス後電位（以下、ＥＰＳＰ）が、ＭＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合よりも有意に高いため、試験の観点から、より好ましい。これらのテスト結果を図２Ａに示す（図において、水平のスケールバーは時間単位５０分を表し、垂直のスケールバーは電位２ｍＶを表す）。図２Ｂは、光開裂の応答としてのＣａ^２＋過渡信号も、ＤＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合、ＭＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合よりも有意に高いことを示している。ジニトロ化合物を使用することによる他の利点は、これらが、使用する光の波長とは無関係に、対応するモノニトロ誘導体よりも高いＥＰＳＰ及びＣａ^２＋過渡信号を与えることである。使用する光の波長に応じた信号の大きさを図３に示す（図３Ａ−ＥＰＳＰ；図３Ｂ−Ｃａ^２＋過渡信号）。

一般式（Ｉ）で表される化合物をトリフルオロ酢酸塩の形で使用できるとの事実は、当業者であれば、塩の形からトリフルオロ酢酸のような酸化合物の放出はテストを妨げることが予測されるため、驚くべきことである。

本発明の最も有利な具体例によれば、ＤＮＩ誘導体のＴＦＡ塩を、自発的に放出される生物学的に活性な化合物を無効にする試薬とともに、測定流体に添加するようにして、「ケージド」化合物として使用する。

本発明の他の態様は、１光子又は多光子テスト、好ましくは、２光子照射テスト法であって、光開裂性化合物、好ましくは、一般式（Ｉ）による化合物を測定流体に溶解し、自発的分解から生ずる生物学的に活性な化合物を無効にする試薬を添加し、ついで、サンプルの天然の流体をこの溶液に変更し、このサンプルを使用して、現状水準の装置を使用する公知の方法に従ってテストを行うことを特徴とする方法にある。

測定流体としては、リンゲル溶液又はＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）、又は好適な組成を有する他の溶液が使用される。測定流体の選択は、当業者の知識の一部である。

特に、神経細胞及び形成される生物活性アミノ酸の観察の場合には、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）及び自発的分解によって形成されるアミノ酸を無効にする算定された量の試薬に溶解する。試薬は、好ましくは、酵素である。

必要な試薬の量は、光開裂性化合物に応じて容易に算定され、試薬は下記のとおりである。

光開裂性化合物を、テストにおいて使用される量で、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）に溶解する。ＡＣＳＦの組成は下記のとおりである。

得られた溶液を、開始時及び４８時間後の時点でサンプリングする。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、例えば、ＤＮＩ誘導体の場合には、ＤＮＩ誘導体の分解生成物である４−メトキシ−５，７−ジニトロインドリンの増加から、活性成分の量を測定する。発明者らは、通常の１光子又は多光子テストの間のアミノ酸放出の量を算定し、ついで、酵素生成物の活性度を知った後、このような自発的分解によって形成されるアミノ酸を脱活性化できる量の酵素を測定流体に添加する。

本発明の更なる態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩及び一般式（Ｉ）で表される化合物の自発的分解による生物学的に活性な化合物を無効にする試薬、及びさらに、必要であれば、補助剤を含んでなる組成物である。有用な補助剤は、医薬品工業において一般的に使用されるような不活性化合物である。これら補助剤のタイプ、特性及び使用は、特に、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（５版、Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ Ｒｏｗｅ、Ｐａｕｌ Ｊ Ｓｈｅｓｋｅｙ及びＳｉａｎ Ｃ Ｏｗｅｎ編、２００６年発行）に示されている。

当業者は、医薬品工業において一般的に使用される方法に従って、この組成物を調製できる。このような方法は、特に、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ ＨＡＮＤＢＯＯＫ（ＳＨＡＹＮＥ ＣＯＸ ＧＡＤ，ＰＨ．Ｄ．，Ｄ．Ａ．Ｂ．Ｔ．；２００８年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行）に示されている。

発明者らは、成分を、プレミックスとして、測定媒体、特に人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）の溶液に溶解する場合には、テストを有意により容易に実施できるとの知見を得た。この場合、測定時間は、２つの化合物を測定及び溶解することが必要でないため、短くなる。さらに、プレミックスの使用の利点は、「ケージド」化合物及び試薬の割合が一定であり、従って、並列テストの偏差が低減されることである。さらに、より多くの量が測定されるため、テストの精度が増大する。上述のように、テストの間に発生する生物学的に活性な化合物を無効にする試薬の不存在は、テスト結果を歪め、感作又は細胞死さえ生じ、このようにして、テストが不可能になる。

本発明によれば、用語「プレミックス」は、光化学的に開裂可能な成分及びその自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にする試薬を一緒に又は別個に含有する混合物（混合物は、他の補助剤と混合して使用される）を意味する。プレミックスは、ケージド化合物のみ又はその分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にする試薬のみと補助剤との混合物であるか、又は光化学的に活性な化合物を試薬と一緒に含有する混合物のいずれかである。プレミックスは、固状又は液状、好ましくは、固状で調製される。プレミックスは、光化学的に開裂可能な化合物及び自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物、例えば、アミノ酸を無効にする試薬以外に、追加の、ただし、少なくとも１の補助剤を含有する粉末状の混合物でもよい。このような補助剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム、グルコール、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）二ナトリウム塩のような有機又は無機の化合物である。

プレミックスは、上述の測定及び算定に基づく割合で、光化学的に活性な成分及び試薬を補助剤と混合し、混合物を均質化することによって調製される。混合は、必要であれば、窒素雰囲気下において、乾燥した場所で行われる。混合物を、必要であれば、−２０℃において凍結保存する。

プレミックスが粉末状混合物である場合、プレミックスは錠剤として圧縮されるか、又はカプセルに充填され、或いは各種の形状の単位用量として製剤される。光化学的に活性な化合物及び試薬を別個に処方し、得られた粉末状の混合物を単位用量に製剤できる。

本発明の他の態様は、光化学的に活性な成分及び試薬を別個に処方し、共通の包装ニットに入れたキットである。

本発明の他の具体例は、１光子又は多光子照射実験において使用される一般式（Ｉ）［式中、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、水素又は臭素原子、又は直鎖又は分枝状、置換又は未置換のアルコキシ、シクロアルコキシ、好ましくは、未置換のアミノ基又は１のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基又はシクロアルキル基、又は２の同一又は異なるＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基にて置換されたアミノ基によって置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ基、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、アミノ酸の酸残基又は一般式（ＩＩ）（式中、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、アミノ酸のアミン残基を表し及びＸは酸素又はイオウ原子を表す）の基である］で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩である。

これらの化合物の各々は、２光子照射プロセスにおいて開裂可能である。２光子照射プロセスは、神経伝達物質が、非常に小さい体積においても、受容体の近傍でフリーであることを許容するため、１光子プロセスに対して利点を有する。小さい励起体積の他の利点は、レーザービームが、樹状突起を破壊しないか、破壊しても非常にわずかであることである。他の利点は、２光子プロセスの場合、使用するレーザービームの周波数は、１光子励起（照射のために紫外線範囲の光を使用する）に対して、赤外線範囲に近いことにある。２光子励起と２光子画像プロセスとを組み合わせることにより、いくつかの脳プロセスが、最も少ない副作用で、組織の深部においてモデル化される。

２光子照射プロセスを使用する場合、測定の間、励起の位置が非常に正確にセットされ、このようにして、ニューロンの神経生物学的実験が可能になる。図５Ａに示す実験準備の場合、樹状突起に沿って２０の照射ポイントを配置し、ついで、実施例１６に記載するプロセスに従って（ただし、「ケージド」化合物として、ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ塩（２．５ｍＭ）を使用した）実験を行った。各ポイントにおける刺激によって生じた応答を測定し、それらを、いくつかの実例曲線で示した。これらの曲線は図５Ｂに見ることができる。これらの実験を数回繰り返すことによって、受容体密度が細胞体に沿って異なっていることが示された。いくつかの実験の刺激の結果として、信号の平均は、図５Ｃに証明されているように、差異を示す。驚くべきことには、「ケージド」化合物のＴＦＡ塩を使用することにより、受容体密度及びニューロンの神経生物学的構造の実験が可能になる。

本発明の最も有利な具体例は、一般式（Ｉ）［ここで、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、水素又は臭素原子、又はジメチルアミノ−エトキシ基、ジメチルアミノ−プロポキシ、ジメチルアミノイソプロポキシ基の異性体（−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２基及びＯ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２基）、ジメチルアミノイソブトキシ基（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２）、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、Ｌ−グルタル酸、ＧＡＢＡ又はグリシンの酸残基、又は一般式（ＩＩ）（ここで、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンのアミン残基を表し、及びＸは酸素又はイオウ原子を表す）の基を表す］で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩及びその製法に係る。

有利な具体例によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩において、Ｒ^５はアミノ酸の酸残基であるか、又はＲ^５は、一般式（ＩＩ）（ここで、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、神経伝達物質又は神経伝達物質とみなされる化合物のアミン残基を表し及びＸは酸素又はイオウ原子を表す）の基である。

塩基及び他の塩基と比べて、これらトリフルオロ酢酸塩の利点は、これらは、より安定であり、光感受性及び吸湿性が低く、これらの調製及び精製が容易であることである。発明者らのテストでは、一般式（Ｉ）で表される化合物の塩は、塩基よりも吸湿性が低いことが証明された。発明者らは、２５℃、相対湿度５０％において、ＭＮＩ−Ｇｌｕ塩基及びその塩酸及びトリフルオロ酢酸との塩について、質量増加を測定した。７２時間の保存後、塩基の質量は２０％増加し、ＨＣｌ塩の質量は１３．６％増加したのに対して、トリフルオロ酢酸塩の質量の増加はわずか４％であった。

塩の更なる利点は、これらが調製及び精製が容易であり、塩基又は他の塩よりも安定であることである。

本発明の最も有利な具体例によれば、ジニトロ−インドリン誘導体（ケージド化合物）の新規のＴＦＡ塩は、当分野で公知の同様の誘導体とは異なり、そのより良好な溶解性及び安定性のため、測定流体への好適な酵素の添加と共に、これら化合物が２光子照射実験において使用されることを可能にする。このようにして、有意により高い量子収率が発揮される（この特性はＤＮＩ誘導体を特徴付けるものである）。

発明者らは、驚くべきことには、一般式（Ｉ）（ここで、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、未置換のアミノ基で、又は１のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基又はシクロアルキル基、又は２の同一又は異なるＣ_１〜Ｃ_６アルキル基で置換されたアミノ基で置換されたＣ_１〜Ｃ_６アルコキシ基を表す）で表される化合物が、非常に有利な特性を有するとの知見を得た。

当分野で公知のジニトロ−インドリンタイプのケージド化合物とは異なり、これらの化合物は、驚くべきことには、これら化合物が測定流体に溶解性であるため、ケージド化合物の開裂後、溶液中に残る。この事実は、これら化合物が測定液体の変化によって完全に除去され、これによって、以降の測定を乱さないことを裏付けている。

本発明の他の態様は、一般式（Ｉ）［式中、Ｒ^１はニトロ基を表し；Ｒ^２は、水素又は臭素原子、又は直鎖又は分枝状、置換又は未置換のアルコキシ、シクロアルコキシ、好ましくは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ基（ここで、置換基は、未置換のアミノ基、又は１のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基又はシクロアルキル基、又は２の同一又は異なるＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基で置換されたアミノ基である）、又は置換又は未置換のアリール基を表し；Ｒ^３及びＲ^４は水素原子を表し；Ｒ^５は、アミノ酸の酸残基又は一般式（ＩＩ）（式中、窒素原子及び結合する置換基Ｒ^６及びＲ^７は、一緒に、アミノ酸のアミン残基を表し、及びＸは酸素又はイオウ原子を表す）の基である］で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩を調製する方法であって、トリフルオロ酢酸又はその溶液を、一般式（Ｉ）で表される化合物の溶液に添加し、形成された塩を分離することを含んでなる方法にある。本発明の好適な１具体例によれば、トリフルオロ酢酸又はその溶液を、一般式（Ｉ）で表される化合物の調製の反応混合物に添加し、この溶液から塩を分離する。塩の分離は、蒸発した反応混合物の濾過又は抽出によって行われる。混合物に塩を沈殿させるような溶液を添加して、塩を溶液から分離することができるが、混合物を冷却することによって生成物を分離することもできる。

粗製の塩を、必要であれば、再結晶又は塩基形に転化できる。この製法の利点は、生成物の調製の間に、クロマトグラフィー精製が必要ないことである。

本発明の利点は、１光子又は多光子励起テストの過程で、自発的に形成されるアミノ酸（テストを妨げる）を無効にできることである。
テスト対象の神経細胞が、加水分解生成物の濃度像体の誘拐な影響から保護される。
本発明による一般式（Ｉ）で表される化合物及び自発的に形成されるアミノ酸を無効にする試薬を含有する組成物は、より小さい偏差で一連のテストを行うことを可能にし、測定を容易にする。

一般式（Ｉ）で表される化合物のトリフルオロ酢酸との塩は、容易に調製、精製され、対応する塩基又は多の塩よりも安定である。

本発明を下記に実施例によって詳述するが、本発明の範囲は、これら実施例に限定されない。

２−アミノ−５−（４’−メトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−５−オキソ−ペンタン酸のトリフルオロ酢酸塩（ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ）の調製法
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１．８ｍｌに、０℃において、２−（ベンジル−オキシ−カルボニル−アミノ）−５−（４’−メトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−５−オキソ−ペンタン酸３級ブチルエステル０．１ｇ（０．１９ミリモル）を溶解し、室温において９２時間撹拌した。ついで、メタノール２ｍｌを２回添加し、混合物を蒸発させた。オイル状残渣にジエチルエーテル５ｍｌを添加し、沈殿した結晶を濾取し、デシケーター内で乾燥した。このようにして、生成物は、褐色、固状の題記化合物０．０５ｇであった。
収率は５４％であり、純度は９９．８％（ＨＰＬＣ）であった。ＬＣ−ＭＳ：３６８、融点：１４６〜１４８℃。空気中の水分により、結晶性の生成物は、室温において、結晶水を吸収した
このようにして生成された生成物の元素分析は下記のとおりである。

ＮＭＲスペクトル：

４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−エトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンの２トリフルオロ酢酸塩（ＤＭＥＤ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）の調製法
トルエン及びメタノールの３：１混合物２００ｍｌに、ナトリウムメチラート６．６ｇ（０．１２３モル）を溶解し、６０℃において、この溶液に、４−ヒドロキシインドール１５ｇ（０．１１２５モル）のトルエン−メタノール３：２混合物（２５０ｍｌ）溶液を１滴ずつ添加し、混合物を、室温において１時間撹拌した。ついで、ジメチル−アミノ−エチル−クロリド１４．５ｇ（０．１３５モル）を、６０℃において、トルエン１４．５ｍｌに溶解し、この温度において、さらに５時間撹拌した。この間に、４−ヒドロキシ−インドールは完全に転化した。ついで、反応混合物に酢酸エチル３００ｍｌを添加し、混合物を、Ｐｅｒｌｉｔｅを介して濾過した。溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液にて抽出し、分離に続いて、水１５０ｍｌにて３回抽出し、硫酸マグネシウムにて乾燥し、ついで、蒸発させた。このようにして得られた生成物は、４−ジメチルアミノ−エトキシ−インドール（ＤＭＥＯ−インドール）の淡褐色のオイル１０．８２ｇ（５１％）であった。
上記反応工程において得られた生成物ＤＭＥＯ−インドール１０．８２ｇ（５２．９ミリモル）を酢酸５０ｍｌに溶解し、ついで、温度１０〜１５℃において、シアノ水素化ホウ素ナトリウム３．３２ｇ（５２．９ミリモル）を少量ずつ添加した。冷却を停止し、反応混合物を２０℃まで加温させ、ついで、室温において３時間撹拌した。反応の完了を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にてチェックした。撹拌下で、反応混合物を１０℃に冷却した。混合物のｐＨを、２０％水酸化ナトリウム溶液１５０ｍｌの添加によって、ｐＨ８に調整し、ついで、混合物を、酢酸エチル１５０ｍｌで３回抽出した。未精製の有機相を硫酸マグネシウムにて乾燥し、濾過し、蒸発させた。このようにして得られた淡褐色のオイル８．５ｇ（７９％）は、４−ジメチルアミノ−エトキシ−２，３−ヒドロ−インドール（ＤＭＥＯ−インドリン）であった。
酢酸エチル５０ｍｌに、４−（３級ブトキシカルボニル−アミノ）−ブタン酸（ＢＯＣ−ＧＡＢＡ）３．３９ｇ（１６．７ミリモル）を溶解し、混合物に、ジイソプロピル−エチルアミン４．８ｍｌを添加し、ついで、１５℃に冷却し、Ｎ−エチル−ジメチル−アミノ−プロピル−カルボジイミド３．８ｍｌ（２１．４ミリモル）を添加した。反応温度を２０℃に上昇させ、ついで、ＤＭＥＯ−インドリン３．０ｇ（２３．０ミリモル）の酢酸エチル（７０ｍｌ）溶液を、溶液に１滴ずつ添加した。添加に続いて、反応混合物を２０℃において１時間撹拌した。反応が充分に完了した。混合物のｐＨを、１Ｍ塩酸２５ｍｌの添加によってｐＨ４に調整し、混合物を分離し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌで洗浄した。
有機相を硫酸マグネシウムにて乾燥し、濾過し、蒸発させた。得られた粗製生成物をエタノールから再結晶した。このようにして得られた生成物は、白色結晶の４−３級ブトキシカルボニル−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−エトキシ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタン（ＤＭＥＯ−Ｉ−Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ）４．７ｇ（８５％）であった。
撹拌下で、ＤＭＥＯ−Ｉ−Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ４．７ｇをトリフルオロ酢酸１５ｍｌに添加し、撹拌をさらに１時間続けた。混合物を蒸発し、ついで、メタノール１０ｍｌの添加及び蒸発を３回行い、ＴＦＡを完全に除去した。このようにして得られたオイル７．６３ｇは、４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−エトキシ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンの２トリフルオロ酢酸塩（ＤＭＥＯ−Ｉ−Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）であった。
撹拌下で、ＤＭＥＯ−Ｉ−Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ４ｇ（７．７ミリモル）をトリフルオロ酢酸４００ｍｌに溶解し、ついで、硝酸ナトリウム１９．６３ｇ（２３０ミリモル）を、１０℃において、少量ずつ添加した。反応混合物を２０℃まで加温させた。この温度において、さらに１時間撹拌した。反応の完了をＨＰＬＣ法にてチェックした。
反応混合物に、ジクロロメタン８００ｍｌを添加し、沈殿した無機塩（秤量したところ３０ｇ）を濾去し、濾液を蒸発させ、ジオキサン３０ｍｌに溶解し、分離した無機塩を濾過し、溶液を蒸発させた。このようにして得られた褐色のオイルを、分取ＨＰＬＣによって精製した。使用した溶離剤は、ＴＦＡ０．１％を含有する水性アセトニトリルであり、該溶離剤により、生成物はＴＦＡ塩の形で保持される。生成物は、４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−エトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンの黄色結晶性２トリフルオロ酢酸塩（ＤＭＥＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）・２Ｈ_２Ｏ０．４３ｇであった。

４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−イソプロポキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンの２トリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）の調製法
原料物質としてヒドロキシインドールを使用して、ＤＭＥＯ−Ｉ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡの調製法に従って、４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−イソプロポキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンの化合物（ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）を調製した。
アセトニトリル３５ｍｌに、ｉＤＭＰＯ−Ｉ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ３．５ｇ（６．５４ミリモル）を溶解し、ついで、１０℃において、ニトロニウムテトラフルオロボラート１．７３ｇ（１３．５モル）を添加し、混合物を２０℃に加温させた。この温度において、混合物を３時間撹拌した。反応をＨＰＬＣにてチェックした。反応混合物に、炭酸水素ナトリウム２０ｇを添加し、０．５時間撹拌し、ついで、硫酸マグネシウム２０ｇとともに、さらに０．５時間撹拌し、濾過し、蒸発させた。得られた生成物は、粗製の褐色オイル５．５２ｇであり、ＨＰＬＣ（溶離剤：ＴＦＡ０．１％を含有する水性アセトニトリル）によって精製した。このようにして得られた黄色がかった褐色のワックス様オイル０．６０００ｇは、４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−イソプロポキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンの２トリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）であった。

（Ｓ）４−アミノ−５−（４’−メトキシ−７’−ニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−５−オキソ−ペンタン酸のトリフルオロ酢酸塩（ＭＮＩ−Ｕｌｇ・ＴＦＡ）の調製法
使用した方法は、ＤＭＥＯ−ＭＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡの調製と類似の方法である（原料物質として、メトキシ−インドリンを使用する）。Ｌ−グルタミン酸をカップリングするために、Ｎ−［（１，１−ジメチル−エトキシ）カルボニル］−５−（１，１−ジメチル−エチル）エステルを使用した。得られた黄色結晶は、（Ｓ）４−アミノ−５−（４’−メトキシ−７’−ニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−５−オキソ−ペンタン酸のトリフルオロ酢酸塩（ＭＮＩ−Ｕｌｇ・ＴＦＡ・Ｈ_２Ｏ）であった。

２−アミノ−１−（７’−ニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）
−１−オキソ−エタンのトリフルオロ酢酸塩（ＭＮＩ−Ｇｌｙ・ＴＦＡ）の調製法
使用した方法は、ＤＭＥＯ−ＭＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡの調製と類似の方法である（原料物質として、メトキシ−インドリンを使用する）。カップリングのために、Ｎ−［（１，１−ジメチル−エトキシ）カルボニル］グリシンを使用した。
このようにして得られた黄色結晶性生成物は、２−アミノ−１−（７’−ニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−エタンのトリフルオロ酢酸塩（ＭＮＩ−Ｇｌｙ・ＴＦＡ）であった。

ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの自発的加水分解
この実験のために、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を使用した。その組成を下記の表に示す。

ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ０．０６ｍｇ／ｍｌを含有するＡＣＦＳ溶液１０ｍｌを、３２℃において保存した。保存の開始時及び４８時間後の時点で溶液をサンプル抽出し、ＬＣＭＳ法を使用することによって、加水分解生成物から、４−メトキシ−５，７−ジニトロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドールを同定した。２４０におけるその分子量ピークによって化合物を同定した。４８時間後に抽出したサンプルをＨＰＬＣ装置で測定した。補正なしで、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの４６．７％が加水分解された。

グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼを使用する、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの自発的加水分解から形成されたグルタミン酸の無効化
酵素の必要量の算定：
実施例６の結果は、グルタミン酸の形成速度が、ＡＣＳＦ（通常、多光子又は２光子照射実験で使用される）１２ｍｌ中で１μモル／分であることを示している。
ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ１３．５ｍｇを含有するＡＣＳＦ溶液１２ｍｌ中で形成されるグルタミン酸のα−ケトグルタル酸への転化のためには、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ． Ｎｏ．：Ｇ８２５５）１単位が必要である。このため、テスト前に、ＡＣＳＦ溶液に、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ１単位を添加した。

グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｇ２６２６）及びＮＡＤＰ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレトチドホスフェート：Ｓｉｇｍａ Ｎ５７５５）を使用する、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの自発的加水分解から形成されたグルタミン酸の無効化
酵素の必要量の算定：
実施例６の結果は、グルタミン酸の形成速度が、ＡＣＳＦ（通常、多光子又は２光子照射実験で使用される）１２ｍｌ中で１μモル／分であることを示している。
実施例７に従い、ただし、酵素グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼの代わりに、酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＰ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレトチドホスフェート）を使用して操作した。
ＡＣＳＦ溶液１２ｍｌに、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡを、溶液におけるＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの濃度が２．５ｍＭとなる量で添加し、この溶液に、酵素Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ２単位（２．１μｌ）及びＮＡＤＰストック溶液（ＮＡＤＰ２００ｍＭ）１２μｌを添加した。

ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ、Ｌ−グルタミン酸及び酵素デヒドロゲナーゼ及びβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレトチドホスフェート（ＮＡＤＰ）を含有する組成物
乾燥条件下、窒素雰囲気において、ガラス容器に、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ１４．５ｍｇを量り入れ、ついで、ＮＡＤＰ１．８ｍｇ及び酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼ１単位（２．１μｌグリセリン含有溶液）を、グリセリンを含有する溶液が、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡと全く触れないか又は触れたとしても極めてわずかに触れるのみであるようにガラスの壁の上に層を形成するように添加した。窒素下において、容器を閉じた。組成物を冷凍庫で保存した。生成物をこのような形で使用した。

２−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−イソブトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−５−オキソ−ペンタン酸の２トリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡ）の調製法
トルエン及びメタノールの３：１混合物１６０ｍｌに、ナトリウムメチレート１８．９ｇ（２２５ミリモル）を溶解し、ついで、この溶液に、６０℃において、４−ヒドロインドール２０ｇ（１５ミリモル）のトルエン及びメタノールの３：２混合物（２００ｍｌ）溶液を１滴ずつ添加し、混合物を、この温度において、３０分間撹拌した。ついで、この溶液に、６０℃において、ジメトル−アミノ−イソブチル−クロリド５０ｇ（３７５ミリモル）の５０％キシレン溶液を１滴ずつ添加し、この温度において、さらに２５時間撹拌した。この間に、原料化合物が完全に転化した。混合物を１５℃に冷却し、ついで、反応混合物に、酢酸エチル３００ｍｌを添加し、ついで、混合物を、Ｐｅｒｌｉｔｅを介して濾過した。溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液にて抽出し、分離に続いて、水１５０ｍｌにて３回抽出し、硫酸マグネシウムにて乾燥し、蒸発させた。このようにして得られた生成物は、淡褐色結晶（ｉＤＭＢＯ−インドール）２４．７ｇ（８６％）であった。
上記反応工程において得られたｉＤＭＢＯ−インドール２４ｇ（１０３．９ミリモル）を酢酸エチル１３０ｍｌに溶解し、ついで、温度１０℃において、シアノ水素化ホウ素ナトリウム６．４６ｇ（１０３．９ミリモル）を少量ずつ添加し、さらに３時間反応させた。反応の完了を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にてチェックした。原料化合物の消失後、撹拌下にて、反応混合物を１０℃に冷却した。混合物のｐＨを、２０％水酸化ナトリウム溶液３００ｍｌの添加によって、ｐＨ８に調整し、ついで混合物をジクロロメタン１５０ｍｌにて３回抽出し、硫酸マグネシウムにて乾燥し、濾過し、蒸発させた。
このようにして得られた淡褐色のオイル１９．２ｇは、４−ジメチルアミノ−イソブトキシ−２，３−ジヒドロ−インドール（ｉＤＭＢＯ−インドリン）であった。
酢酸エチル６０ｍｌに、ＢＯＣ−Ｇｌｕ−（ＯＨ）−ＯｔＢｕ７．２８ｇ（２４ミリモル）を溶解し、混合物に、ジイソプロピル−エチルアミン４．３ｍｌを添加し、１５℃に冷却し、Ｎ−エチル−ジメチル−アミノ−プロピル−カルボジイミド４ｍｌ（２２ミリモル）を添加した。反応混合物を２０℃に加温させ、この溶液に、ｉＤＭＢＯ−インドリン５．０ｇ（２１．０ミリモル）の酢酸エチル（６０ｍｌ）溶液を１滴ずつ添加した。添加に続いて、反応の完了（ＨＰＬＣにてチェック）後、反応混合物を２０℃において１時間撹拌した。混合物を１０℃に冷却し、混合物のｐＨを、１Ｍ塩酸３０ｍｌの添加によって、ｐＨ４に調整し、ついで、混合物を分離し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌにて洗浄してｐＨ８とし、分離した。有機相を硫酸マグネシウムにて乾燥し、濾過し、蒸発させた。
得られた生成物は淡褐色の油性結晶（ｉＤＭＢＯ−Ｉ−ＢＯＣ−Ｇｌｕ）１０．５ｇであった。
アセトニトリル５０ｍｌに、ｉＤＭＰＯ−Ｉ−ＢＯＣ−Ｇｌｕ５ｇ（９．６２ミリモル）を溶解し、ついで、１０℃において、ニトロニウムテトラフルオロボラート３．８ｇ（２８．８モル）を添加した。混合物を、２６℃において、さらに１７時間撹拌し、さらに、ニトロニウムテトラフルオロボラート０．６９ｇ（０．００４８１モル）を添加して、反応を完了させた。このようにして、反応が完全に終了した。反応混合物に、炭酸水素ナトリウム９.８７ｇ及びアセトニトリル５０ｍｌを添加し、硫酸マグネシウムにて乾燥し、蒸発させた。生成物をＨＰＬＣにて精製した。使用した溶離剤は、生成物のトリフルオロ酢酸塩の形成を確かなものとするために、トリフルオロ酢酸を含有するものであり、精製後、ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡ０．６ｇが得られた。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡ）

２−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−イソプロポキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−５−オキソ−ペンタン酸の２トリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡ）の調製法
使用した方法は、ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡの調製と類似であり、原料物質として、４−ヒドロキシ−インドールを使用した。アルキル化反応のために、ジメチルアミノ−イソプロピルクロリドを使用した。得られた黄色のオイル生成物８１ｍｇは、２−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−イソプロポキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−５−オキソ−ペンタン酸の２トリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡ）であった。

４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−イソブトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンの２トリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）の調製法
使用した方法は、ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡの調製と類似の方法である。カップリングのために、ジメチルアミノ−イソブチルクロリドを使用した。得られた黄〜褐色のオイル９０ｍｇは、４−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−エトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンのトリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）であった。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・２ＴＦＡ）

２−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−エトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−エタンの２トリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｙ・２ＴＦＡ）の調製法
使用した方法は、ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡの調製と類似の方法である。カップリングのために、Ｎ−３級ブチトキシ−２−アミノ酢酸（ＢＯＣ−ＧＬＹＣＩＮ）を使用した。得られた黄色のオイル１．３ｇは、２−アミノ−１−（４’−ジメチルアミノ−エトキシ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−エタンのトリフルオロ酢酸塩（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｙ・２ＴＦＡ）であった。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｙ・２ＴＦＡ）：

４−アミノ−１−（４’−ブロモ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンのトリフルオロ酢酸塩（Ｂｒ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・ＴＦＡ）の調製法
使用した方法は、ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・２ＴＦＡの調製と類似の方法であり、原料物資として、４−ブロモ−インドールを使用した。得られた黄色の結晶１３０ｍｇは、４−アミノ−１−（４’−ブロモ−５’，７’−ジニトロ−２’，３’−ジヒドロ−インドール−１’−イル）−１−オキソ−ブタンのトリフルオロ酢酸塩（Ｂｒ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・ＴＦＡ）であった。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｂｒ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ・ＴＦＡ）：

Ｂｒ−ＤＮＩ−ＧＡＢＡ ＭＳスペクトル：

Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレトチドホスフェートを含有する組成物を使用する、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの自発的加水分解から形成されるグルタミン酸の無効化
実施例９による組成物を、ＡＣＳＦ溶液１２ｍｌに、実施例８に基づいて算定した量で溶解した。得られた溶液は、１光子又は２光子励起テストにおいて直接使用される。

２光子照射テスト：
生物学的サンプルに関する２光子照射テストにおけるＭＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ及びＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの使用（参考例）
切片標本及び電気生理学的テストの環境：
イソフルラン麻酔、続く迅速な断頭によって、１６〜２０日齢のＷｉｓｔａｒラットから、海馬の急性切片を調製した。方法は、Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ａｃｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９９８，ＸＸＶＩＩＩ，ｓｅｃｔｉｏｎ ２４３）に従うものである。脳の冠状切片（３００μｍ）を、ビブラトームによって切り出し、室温において、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中で保存した。ＡＣＳＦの組成は上述のとおりである。
網状分子層の境界付近のＣＡ１領域における海馬ニューロンを、９００ｎｍ赤外線傾斜照明を使用して可視化した。３２℃において、１２５ Ｋ−グルコネート、２０ ＫＣｌ、１０ ＨＥＰＥＳ、１０ ジＴｒｉｓ−塩 ホスホクレアチン、０．３ Ｎａ−ＧＴＰ、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＮａＣｌ、０．０６ Ｏｒｅｎｇｅ Ｇｒｅｅｎ ＢＡＰＴＡ−１（ＯＧＢ−１）及びビオシチンが充填された（各数値は、単位ｍＭである）ガラス電極（６〜９ＭΩ）により、電流固定記録を行った（ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ｂ、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カルフォルニア、米国）。−５０ｍＶよりも負の静止膜電位を持つ細胞が受容された。記録された細胞を、その電気生理学的特性に従って、非錐体（ｎｏｎｐｙｒａｍｉｄａｌ）細胞として分類された。
２光子結像
フェムト秒レーザー（８３０〜８５０ｎｍ）（Ｍａｉ Ｔａｉ ＨＰ，ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア）を使用する２光子レーザー−走査システム（Ｆｅｍｔｏ２Ｄ、Ｆｅｍｔｏｎｉｃｓ Ｌｔｄ．、ブダペスト）においてホールセル構成を達成した後、１５〜２０分で、２光子結像が開始した。長い樹状突起セグメントを結像するために、マルチラインスキャニング法（Ｆｅｍｔｏｎｉｃｓ）を使用した。各実験の終了時、撮像したニューロンを包含するボリュームの奥行きを横切る一連の画像を測定コントロールとし、リアルタイムデータの獲得及び分析を、ＭＡＴＬＡＢ系プログラム（ＭＥＳ、Ｆｅｍｔｏｎｉｃｓ Ｌｔｄ．、ブダペスト）及びユーザーによって作られたソフトウエアによって行った。
２光子ケージ解除化
ａ）ホールセルモードに達し、介在ニューロンを６０μＭＯＧＢ−１で充満させた後、浴溶液を、ＭＮＩ−Ｇｌｕ−ＴＦＡ（２．５ｍＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を含有するＡＣＳＦに取り換えた。ＭＮＩ−Ｇｌｕ−ＴＦＡの光分解を、７１０〜８３０ｎｍ超高速パルス化レーザー光（Ｍａｉ Ｔａｉ ＨＰ，ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア）によって行った。ケージ解除化レーザービームの強さを、電気光学変調器（モデル３５０−８０ＬＡ、Ｃｏｎｏｐｔｉｃｓ）によって制御した。分散補償を、ケージ解除化の深さ（表面から５０〜８０μｍ）で最大応答が得られるようにセットした。ケージ解除化レーザービームを、ダイクロイックミラー（カスタムレーザーコンバイナ、ｚ７５０ｂｃｍ；Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．、ロッキンガム、米国）にて、結像光学経路に結合させた。色収差を焦点面で補正した。半径方向及び軸方向のビーム（結像及び光化学的刺激）の調整誤差を、それぞれ、１００ｎｍ及び３００ｎｍ以下に維持した。結像の間に、２光子グルタメートケージ解除化期間（この間に、ガルバノメーターは最大１５〜２５の選択された位置にジャンプした（＜６０μ秒ジャンプ時間）が、その後、３Ｄ又は２Ｄ軌道に戻った）をさしはさんだ。ケージ解除化サイトの位置を、取得したバックグラウンド画像に従って、微細に調整した。ケージドグルタメートの光分解を、樹状突起に沿って、「クラスター化」（インプット間の距離０．８±０．１μｍ）パターンで行った。シングルスポットケージ解除化時間及びレーザー強度を、細胞体から同様の距離において高浸透圧性外液の局所適用によって誘発されるｕＥＰＳＰ及びｍＥＰＳＰを再現するようにセットした（振幅；集合形ｇｌｕＥＰＳＰ：０．５６±０．０９ｍＶ、ｍＥＰＳＰｓ：０．５８±０．１、ｕＥＰＳＰ：０．５５±０．１２；露出時間０．２〜０．５ｍ秒／インプット）。マッピングの間のサンプルの小さいドリフト（０．１〜０．２μｍ程度）を、規則通りに取得したバックグラウンド画像に従って手動で補正した。
ｂ）テスト後、続くテストにおいて使用する２．５ｍＭＤＮＩ−Ｇｌｕ−ＴＦＡを含有するＡＣＳＦの交換速度を増大させるため、潅流速度を１０ｍｌ／分にセットした。同一の樹状突起セクションについて同一の装置セッティングでテストを繰り返した。

電圧固定テストにおけるケージド化合物及び酵素の添加による自発的活動性の変化
Ａ．）実施例１６による２光子励起法のテストセットアップを使用することによって、観察する細胞の電位変化を測定した。
実験の開始時に、ＤＮＩ−Ｇｌｕの不存在下で、電位変化のコントロールレベル（ＥＰＳＰ）を測定した。測定した変動を図１Ａに示す。テストに続いて、測定細胞にＤＮＩ−Ｇｌｕ（２．５ｍＭ）を添加した。測定した変動を図１Ｂに示す。ついで、酵素Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ０．１〜０．２単位／ｍｌ及びＮＡＤＰ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）２００μＭを添加した。測定した変動を図１Ｃに示す。これらの図は、自発的応答の頻度がコントロールレベルに復されたことを示している。
Ｂ．）上記Ａ．）に記載の実験を、各ケースにおいて他の細胞を使用して、８回繰り返し実施した。柱状図表は左側にみられる。コントロールレベルの平均を欄ａ．）に示す。ケージド化合物による変化の平均を欄ｂ．）に、酵素の添加後の平均を欄ｃ．）に示す。
テストの結果：

酵素の添加によって、電位変動の頻度がコントロールレベルに低減され、このようにして、１光子又は多光子、好ましくは、２光子実験におけるバックグラウンドノイズが低減されるとの事実により、実験が、より高い精度及び再現性で実行され、細胞死のリスクも低減する。

ケージド化合物の自発的加水分解によって形成されるアミノ酸を無効にする試薬の存在下での生物学的サンプルについての２光子実験におけるＭＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ及びＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの使用
実施例１６に従い、ただし、サンプルチャンバーにおいて、第１の測定では、ＭＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ２．５ｍＭを含有するＡＣＳＦ溶液に、第２の測定では、ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ２．５ｍＭを含有するＡＣＳＦ溶液に、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ０．１〜０．２単位／ｍｌ及びβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート２００μＭを添加して、実験を行った。
実験を数回繰り返し行った。結果を図２に示す。実験によれば、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）は、ＭＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合よりも、ＤＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合に有意に高い。これらの結果を図２Ａに示す。図において、水平スケールバーは単位時間５０ｍ秒を意味し、垂直スケールバーは電圧２ｍＶを意味する。図２Ｂは、Ｃａ^２＋過渡信号も、照射の応答として、ＭＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合よりも、ＤＮＩ−Ｇｌｕを使用する場合に有意に高いことを示している。

ケージド化合物の自発的加水分解によって形成されるアミノ酸を無効にする試薬の存在下での生物学的サンプルについての２光子実験におけるＭＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ及びＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡの使用
実施例１６に従い、ただし、下記の変更を加えて実験を行った：パッチクランプ後、潅流溶液を、ＭＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ２．５ｍＭを含有するＡＣＳＦ溶液及び、又は第２の測定についてＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ２．５ｍＭ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ０．１〜０．２単位／ｍｌ及びβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを含有するＡＣＳＦ溶液に変更した。実験の間、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを濃度５０〜１００μＭに保った。全ての化学剤（ケージド化合物、デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ）を浴に適用した。

ケージド化合物の自発的加水分解によって形成されるアミノ酸を無効にする試薬存在下におけるｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−グルタミン酸及びｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−グルタミン酸の効果の実験
実施例１６に従い、ただし、セルに、カルシウム感受性染料（Ｆｌｕｏ４）及び解剖学用染料（ＡＬＥＸＡ５９４）を充填して、実験を行った。実施例１６に従い、ただし、下記の変更を加えて実験を行った：パッチクランプ後、潅流溶液を、ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−グルタミン酸・２ＴＦＡ２．５ｍＭを含有するＡＣＳＦ溶液及び、又は第２の測定についてｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−グルタミン酸・２ＴＦＡ２．５ｍＭ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ０．１〜０．２単位／ｍｌ及びβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを含有するＡＣＳＦ溶液に変更した。実験の間、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを濃度５０〜１００μＭに保った。全ての化学剤（ケージド化合物、デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ）を浴に適用した。実験の間、ｄＨ_２Ｏの蒸発損失を常時補充した。
実験の結果を図４に以下のように示す：
（Ａ）２光子最大強度を、海馬の錐体細胞の投影顕微鏡画像に刺した。細胞にカルシウム感受性染料（Ｆｌｕｏ４）及び解剖学用染料（ＡＬＥＸＡ５９４）を充填した。白色のフレームは、パネル（Ｃ）において拡大する測定区域を示す。Ｂは、体細胞的に誘発され、導かれた長さ５００ｍ秒−電流インジェクション１００．０及び１２５ｐＡに関する錐体細胞の代表的な細胞応答を示している。波形は、刺激によっては、必ずしも有意に変化せず、毒性は検知されなかった。パネル（Ｃ）は、錐体細胞の樹状突起の２光子顕微鏡画像である。白色の点は、光化学刺激（波長７４０ｎｍ）の局在を表す。赤色の線は、カルシウムの濃度が測定されたカルシウム結像の区域（Ｄ）（カルシウムの変化（左）及び体細胞的に記録されたＥＰＳＰ（右）は、ｉＤＭＰＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ（２．５ｍＭ）の存在を伴う２光子刺激によって引き起こされたものである）を表す。パネル（Ｅ）は、ｉＤＭＢＯ−ＤＮＩ−Ｇｌｕ・ＴＦＡ（２．５ｍＭ）の存在下におけるパネル（Ｄ）と同様のグラフである。黒色の矢先マークは、刺激の時点を表す。結果を、樹状突起において（より平らな曲線）だけでなく、樹状突起棘において（より鋭い曲線）も検知し、刺激の精度を示す。カルシウム信号は、初めに、樹状突起棘（グルタメート受容体が主に局在する）において現れ、ついで、より小さい大きさで樹状突起に拡張し、これは、刺激の局在化及び感受性を示す。

Claims (8)

1. 一般式（Ｉ）
   
   

   

   （ここで、
   Ｒ ^１ はニトロ基を表し；
   Ｒ ^２ は、臭素原子、又はジメチルアミノ−エトキシ基、ジメチルアミノ−プロポキシ基、ジメチルアミノ−イソプロポキシ基の異性体（−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ _３ ）ＣＨ _２ −Ｎ（ＣＨ _３ ） _２ 及び−Ｏ−ＣＨ _２ −ＣＨ（ＣＨ _３ ）−Ｎ（ＣＨ _３ ） _２ ）、ジメチルアミノ−イソブトキシ基（−Ｏ−ＣＨ _２ −ＣＨ（ＣＨ _３ ）−ＣＨ _２ −Ｎ−（ＣＨ _３ ） _２ ）を表し；
   Ｒ ^３ 及びＲ ^４ は、水素原子を表し；
   Ｒ ^５ は、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンの酸残基を表す）
   で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩からなる光開裂性化合物の、１光子又は多光子照射実験における、酵素、生存細胞含有する組織又は細胞培養、固状の吸着剤、帯電した吸着剤、イオン交換樹脂から選ばれる、前記光開裂性化合物の自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にする試薬と一緒の使用。
2. 光開裂性化合物の自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物が、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンであることを特徴とする請求項１記載の使用。
3. 一般式（Ｉ）
   

   

   （ここで、
   Ｒ ^１ はニトロ基を表し；
   Ｒ ^２ は、臭素原子、又はジメチルアミノ−エトキシ基、ジメチルアミノ−プロポキシ基、ジメチルアミノ−イソプロポキシ基の異性体（−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ _３ ）ＣＨ _２ −Ｎ（ＣＨ _３ ） _２ 及び−Ｏ−ＣＨ _２ −ＣＨ（ＣＨ _３ ）−Ｎ（ＣＨ _３ ） _２ ）、ジメチルアミノ−イソブトキシ基（−Ｏ−ＣＨ _２ −ＣＨ（ＣＨ _３ ）−ＣＨ _２ −Ｎ−（ＣＨ _３ ） _２ ）を表し；
   Ｒ ^３ 及びＲ ^４ は、水素原子を表し；
   Ｒ ^５ は、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡＢＡ又はグリシンの酸残基を表す）
   で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩。
4. 請求項３記載の一般式（Ｉ）で表される化合物のトリフルオロ酢酸塩を製造する方法であって、トリフルオロ酢酸又はその溶液を、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する溶液に添加し、塩を分離することを特徴とする製法。
5. トリフルオロ酢酸又はその溶液を、一般式（Ｉ）で表される化合物が調製された反応混合物に添加し、この溶液から塩を分離することを特徴とする請求項４記載の製法。
6. １光子又は多光子照射プロセスを行う方法であって、観察対象の細胞を流体媒体に入れ、請求項３に記載の一般式（Ｉ）の化合物のトリフルオロ酢酸塩からなる光開裂性化合物及び酵素、生存細胞含有する組織又は細胞培養、固状の吸着剤、帯電した吸着剤、イオン交換樹脂から選ばれる、前記光開裂性化合物の自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にする試薬を前記媒体に添加し、サンプルに照射することを特徴とする１光子又は多光子照射プロセスを行う方法。
7. 観察対象の細胞がニューロンであり、光開裂性化合物の自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物を無効にする試薬が酵素であることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 光開裂性化合物の自発的分解によって形成される生物学的に活性な化合物を、測定用セル又はその循環システムに入れた固状のイオン交換樹脂によって吸着することを特徴とする請求項７記載の方法。

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