JP6159737B2 - 分離方法における、フィブリルセルロースを含む固定相の使用 - Google Patents

Description

本発明は、フィブリルセルロースの新規適用を扱う。本発明は、分離方法において、フィブリルセルロースを含む固定相を使用する方法に関する。とりわけ、本発明は、電気泳動又はクロマトグラフィーに基づく分離方法における、フィブリルセルロースを含む固定相の使用及び使用方法に関する。

化学及び生化学研究において、最も一般的な問題の一つが、成分を互いに分離すること、例えば、より大きな分子をより小さな分子から分離すること、細胞抽出物における巨大分子の分離等である。混合物の成分を分離するための方法は、サイズ、電荷、異なる溶媒における溶解度、親和性及び疎水性相互作用などの成分特性の違いを利用している。

排除クロマトグラフィーとは、その分離が、主に、分子サイズ及び／又は形状及び／又は電荷の違い等の排除効果に基づく技術をいい、これは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を含む。

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、ゲルろ過クロマトグラフィー（GFC）又はゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）とも呼ばれ、多孔性粒子を用いて、固定相が膨張したゲルである場合に、異なるサイズの分子を分離する。通常、これは、タンパク質や工業用ポリマー等の大きな分子又は巨大分子複合体に適用される。一般に、カラムを通してサンプルを移送するために水溶液を使用する場合には、該技術はGFCとして知られるが、有機溶媒が移動相として使用される場合には、GPCの名称となる。SECはまた、ポリマー特性評価にも使用される。

ゲルろ過クロマトグラフィーの主な適用は、タンパク質及び他の水溶性ポリマーの分別であるが、ゲル浸透クロマトグラフィーは、有機可溶性（organic-soluble）ポリマーの分子量分布を分析するために使用される。

SECは、タンパク質、多糖類及び核酸等の合成及び生体ポリマーの精製及び分析に使用される。生物学者及び生化学者は、一般に、低圧下でゲル媒体（medium）（通常、ポリアクリルアミド又はアガロース）とフィルターとを使用する。ポリマー化学者は、高圧下でシリカ又は架橋ポリスチレン媒体のいずれかを使用する。これらの媒体は固定相として知られる。

SECは、ポリマーの分子量及び分子量分布を決定するため、及びサンプルの多分散性についての情報をポリマー化学者に与えるために使用できる。分取SECは、分析的規模でポリマーの分別に使用できる。

固定相粒子の孔径よりも小さな分子は、粒子に入ることができるため、粒子に入ることができないより大きな分子よりも長い経路と長い通過時間とを有する。SECは、特殊なカラムを利用して、天然及び合成のポリマー、生体ポリマー、タンパク質並びにナノ粒子をサイズに基づき分離するクロマトグラフィー技術である。カラムには、イオン及び小さな分子はその内部に受け入れるが、大きな分子は受け入れない、高分子ゲルの半固体ビーズが充填される。溶媒に溶解した分子及びイオンの混合物をカラムの上部に適用すると、より小さな分子（及びイオン）は、大きな分子が利用できるものよりも多量の溶媒にわたって分布する。その結果、大きな分子は、カラムをより速く移動し、このようにして、混合物をその成分へと分離（分別）できる。ゲルの多孔性は、特定のサイズを超えるすべての分子を排除するよう調節できる。

孔径よりも大きな分子は、その細孔に入ることができず、クロマトグラムにおける最初のピークとして共に溶出する。この状態は、完全排除（total exclusion）と呼ばれる。細孔に入ることのできる分子は、分子のサイズ及び形状に応じて、粒子の平均滞留時間を有する。従って、異なる分子は、異なるカラム全通過時間を有する。クロマトグラムのこの部分は、選択的浸透領域（selective permeation region）と呼ばれる。孔径よりも小さな分子は、すべての細孔に入ることができ、カラムにおいて最長の滞留時間を有し、クロマトグラムにおける最後のピークとして共に溶出する。クロマトグラムにおけるこの最後のピークにより、全浸透限界が決定される。

SECの要件の一つは、分析物が固定相の表面と相互作用しないことである。溶出時間の差は、分析物が「見る（see）」容積にのみ基づく。従って、固定相の細孔システムの隅々まで浸透できる小さな分子は、細孔容積全体及び粒子間容積を「見て」、遅れて溶出する（細孔及び粒子間容積がカラムを通過したとき、カラム容積の約80％）。それとは逆に、細孔システムに浸透することのできない非常に大きな分子は、粒子間容積（カラム容積の約35％）だけを「見て」、この移動相の容積がカラムを通過したときに、先に溶出する。SECの基本原理は、異なるサイズの粒子が、異なる速度で固定相を通過して溶出（ろ過）するというものである。これによって、サイズに基づいて、粒子の溶液が分離される。すべての粒子が同時に、又はほぼ同時に、負荷されるならば、同じサイズの粒子が共に溶出するはずである。

サイズ排除カラムはそれぞれ、分離可能な分子量の範囲を有する。排除限界は、この範囲の上端の分子量を定義し、分子が大きすぎて固定相に捕えられなくなるところである。浸透限界は、分離範囲の下端の分子量を定義し、十分に小さなサイズの分子が固定相の細孔に完全に浸透でき、この分子質量を下回るすべての分子が、非常に小さいために、単一のバンドとして溶出するところである。

また、通常、固定相粒子は、理想的に定められない；粒子及び細孔はともにサイズが異なり得る。固定相はまた、望ましくない形で粒子と相互作用し、滞留時間に影響し得、これは、不活性な固定相を使用し、この問題を最小限にするために、通常、細心の注意を払うとしても、である。

電気泳動は、巨大分子をその電荷及びサイズによって分離する方法である。ゲル電気泳動では、電場を使用して、ゲルを通る分子をその電荷に応じて「引く」か、又は「押す」。「電気泳動」とは、ゲルマトリックス中で分子を移動させるために使用される起電力（EMF）をいう。電場を使って、分子（DNA等）をゲル中で移動させることができる。ソートされる分子は、ゲル材料のウェル中へと分注する。ゲルを電気泳動チャンバ中に置き、次いで、電源に接続する。電場をかけることにより、分子は、異なる速度でマトリックス中を移動し、これは、全ての種の質量と電荷の比（charge to mass ratio）（Z）が均一な場合には、主にその質量によって決定され、負電荷の場合はアノードへ、あるいは正電荷の場合にはカソードへと向かう。異なるサイズの分子は、ゲル上に別個のバンドを形成する。

ゲル電気泳動とは、抗対流媒体（anticonvective medium）及び／又は篩媒体（sieving medium）としてゲルを使用することをいい、これは、電気泳動中、固定相とも称し得る。この場合に用語「ゲル」とは、対象の分子を含んでから、次いで、分離するために使用するマトリックスのことをいう。大抵の場合、ゲルは架橋ポリマーであり、その組成及び多孔性は、分析されるべき対象の比重及び組成に基づいて選択される。タンパク質又は小さな核酸を分離する場合には、ゲルは、通常、異なる濃度のアクリルアミド及び架橋剤から構成され、ポリアクリルアミドの異なるサイズのメッシュネットワークを生じる。より大きな核酸を分離する場合、好ましいマトリックスは、精製されたアガロースである。両方の場合において、ゲルは、固体であるが多孔性のマトリックスを形成する。ポリアクリルアミドとは対照的に、アクリルアミドは神経毒であり、中毒を避けるために、適切な安全対策を用いて取り扱わなければならない。

電気泳動が完了した後、ゲル中の分子を染色して、これらを可視化させることができる。例えば、このプロセスのために、臭化エチジウム、銀、又はクマシーブリリアントブルー色素を用いてよい。他の方法を用いて、ゲルにおける混合物成分の分離を可視化してもよい。分析物の分子が紫外線下で蛍光を発する場合には、多くの場合GelDocを使って、紫外線条件下でゲルの写真を撮ることができる。分離されるべき分子が、可視化のために加えられた放射線を含む場合、ゲルのオートラジオグラムを記録することができる。

複数のサンプルが、ゲル中の隣接するウェルに負荷されている場合には、それらは、個々のレーンを平行に走る。異なる分子の数に応じて、各レーンは、元の混合物からの成分の分離を1つ以上の別個のバンド（成分あたり1つのバンド）として示す。成分の不完全な分離により、バンドの重なりがもたらされ得、あるいは複数の非分解成分を表す、区別できないスメアがもたらされ得る。

上端から同じ距離で終わる、異なるレーンにおけるバンドは、同じ速度でゲルを通過した分子を含み、これは通常、それらがほぼ同じサイズであることを意味する。既知のサイズの分子の混合物を含む、利用可能な分子量サイズマーカーが存在する。かかるマーカーを、未知のサンプルと平行してゲル中の1つのレーンで走らせれば、その観察されるバンドは、未知のものと、そのサイズを決定するために比較することができる。バンドが移動する距離は、分子のサイズの対数とほぼ反比例する。

ゲル電気泳動は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）又はタンパク質などの生体巨大分子の分離のために、最も一般的に使用される；しかしながら、ゲル電気泳動は、ナノ粒子の分離にも同様に使用できる。ゲルは、電場の適用により生じる熱対流を抑制し、篩媒体として働いて分子の通過を遅らせることができ；ゲルはまた、電気泳動後に染色を適用できるように、終了した分離を単に維持すべく機能し得る。DNAゲル電気泳動は、通常、多くの場合にはPCRを介したDNAの増幅後に、分析的目的のために実施されるが、他の方法、例えば、さらなる特性評価のための質量分析、RFLP、PCR、クローニング、DNAシークエンシング又はサザンブロットなどを使用する前の準備技術として使用されてよい。

ゲル電気泳動は、一般に、法医学、分子生物学、遺伝学、微生物学及び生化学の適用に使用される。結果は、UV光及びゲル画像化装置を用いてゲルを可視化することによって定量的に分析できる。画像は、コンピューター操作されたカメラで記録され、対象のバンド又はスポットの強度が測定され、同じゲルに負荷された基準又はマーカーと比較される。測定及び分析は、多くの場合、専用のソフトウェアで行われる。

実施される分析のタイプに応じて、ゲル電気泳動の結果と併せて、他の技術が実施される場合も多く、広範囲にわたる分野特有の適用が提供される。

SDS-PAGE、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は、成分をその電気泳動移動度（ポリペプチド鎖長又は分子量の関数）に応じて分離するために、特に、法医学、分子生物学、遺伝学及び生化学で広範に使用される技術である。SDSの結合に起因して、単位質量あたり同一の電荷を有するサンプルのSDSゲル電気泳動は、サイズによる分別をもたらす。

2-DE又は2-D電気泳動と略される二次元ゲル電気泳動は、タンパク質を分析するために一般に使用されるゲル電気泳動の形態である。タンパク質の混合物は、2Dゲルにおいて、二次元で、2つの特性により分離される。

温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）及び変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）は、サンプルがアクリルアミドゲルを横断する際に、サンプルを変性させるために温度又は化学勾配のいずれかを使用する電気泳動の形態である。TGGE及びDGGEは、DNA及びRNA等の核酸、並びに（それほど一般的でないが）タンパク質に適用できる。TGGEは、核酸を分離するために、温度による構造変化に依存する。DGGEが元の技術であり、TGGEはその改良版であった。

寒天は、D-ガラクトース及び3,6-アンヒドロ-L-ガラクトースからなる直鎖状かつ非イオン性の多糖類であり、海藻から生産される。アガロースベースの電気泳動ゲルは、一般に、分子生物学の実験室において、様々なサイズのDNAフラグメントの分離を含む方法で使用されており、これはその後ゲルから切り出され、単離され、続いて、様々な目的のために使用される。アガロースの使用には、ゲルをキャスティングする前にアガロース懸濁液を温める必要がある。しかしながら、温めると、DNA検出のためにゲルに加えられるインターカレーティング色素が破壊される。さらに、所望のDNAフラグメントをゲルから単離するには、強いUV光下、色素の存在下にて、これをゲルから機械的に切り出さなければならない。さらに、更なる使用のためにDNAフラグメントをゲルから分離するためには、ゲルを取り除かなければならない。

電気泳動のために先に使用される他のゲルは、デンプンゲルを含む。

ポリアクリルアミドゲルは、特に核酸の分離における電気泳動のために一般に使用される。通常、アクリルアミドモノマー、ビスアクリルアミド等の架橋剤、ゲルバッファー、及びドデシル硫酸ナトリウム（「SDS」）等の変性剤（modifying agent）を含有する保存溶液が調製される。ゲルを製造するためには、保存溶液を、様々な構成要素の最終的な所望濃度に応じた比率で水と混合し、重合反応をなす。

ゲルの分解能は、アガロースゲルの場合、ゲル中のアガロースの含有量によって決定される。一方、ポリアクリルアミドゲルの分解能は、アクリルアミドとビスアクリルアミドとの混合比率によって調節される。

US 2010／0236932号公報では、架橋剤を含むか、又は含まない、アクリルアミド又はN-修飾（N-modified）アクリルアミド、アガロース、バッファー及び光開始剤を含む複合ゲルが提案されている。

ゲル電気泳動の助けを借りた、核酸分析における核酸の検出は、蛍光DNA結合色素が、核酸と永続的に非共有結合し、適切な波長の光で励起後、その結合した形態で、核酸がゲルマトリックス内に位置することが可能という事実に基づく。

臭化エチジウムは、一般に、インターカレーティング色素として使用されるが、神経毒性及び発癌性である。その毒性に起因して、代替となるDNA結合色素、例えば、SYBR Green又はSYBR Gold（Molecular Probes, Inc.）等も使用されているが、その結合特性は、DNAインターカレーションの原理に基づいていないか、あるいはそれだけに基づくわけではない。

電気泳動に使用する色素は、臭化エチジウムの場合には重合前にゲル調製物と混合するか、あるいはゲル電気泳動の完了後に、臭化エチジウム又は別の色素を含む色素水溶液の助けを借りて、ゲルを染色するかのいずれかである。さらに、SYBR Green Iは、ゲルを負荷する前に、核酸を含有するサンプルに加えることができる。

イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質及び他の荷電分子の精製のために一般に使用される方法である。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、正電荷の分子が、負電荷の固体担体（固定相）に引きつけられる。反対に、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、負電荷の分子が、正電荷の固体担体に引きつけられる。

すべての荷電分子の結合を最適化するために、移動相は、概して、低〜中程度の伝導性の溶液である。固体担体への分子の吸着は、サンプル分子と、担体における官能基との、反対の電荷のイオン性基間のイオン相互作用によって引き起こされる。相互作用の強度は、分子上及び官能基上の電荷の数と位置によって決定される。塩濃度を高めることによって、最も弱いイオン相互作用を有する分子が、最初にカラムから溶出し始める。より強いイオン相互作用を有する分子は、より高い塩濃度を必要とし、勾配において後で溶出する。イオン交換樹脂の結合キャパシティは、一般に極めて高い。これは、プロセス規模のクロマトグラフィーでは非常に重要であるが、分析的規模の分離には重大でない。

概して、移動相バッファーのpHは、荷電分子のpI（等電点）又はpKa（酸解離定数）と、固体担体における荷電基のpKaとの間でなければならない。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーでは、pKa＝1.2を有する固体担体における官能基を用いて、pI＝8.2を有するサンプル分子を、pH＝6.0の移動相バッファー中に流してよい。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、固体担体のpKaが10.3である場合、pI＝6.8を有する分子を、pH＝8.0の移動相バッファー中に流してよい。

例えば、タンパク質サンプルは、それが強く保持されるであろう条件下、カラム上に注入される。次いで、直線的に増加する塩濃度の勾配を適用して、カラムからサンプル成分を溶出させる。直線勾配の使用に代わる方法は、段階勾配（step gradient）を使用することである。これは複雑な装置を必要とせず、適切な塩濃度が、通常は直線勾配実験から知られていれば、異なる画分を溶出するにあたって非常に効率的になり得る。

また、分離に影響を及ぼすべく、pHの変化も使用される。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、移動相バッファーのpHを上げると、分子のプロトン化がより低くなり、このため、正電荷がより低くなる。結果として、タンパク質は、もはや負電荷の固体担体とイオン相互作用を形成することができなくなり、これにより最終的に、分子がカラムから溶出することとなる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、移動相バッファーのpHを下げると、分子のプロトン化がより高くなり、このため、正電荷がより高くなる。結果として、タンパク質は、もはや正電荷の固体担体とイオン相互作用を形成することができなくなり、これにより、分子がカラムから溶出することとなる。

アフィニティークロマトグラフィーは、生化学的な混合物を分離する方法であり、これは、抗原及び抗体間、酵素及び基質間、又はレセプター及びリガンド間等の、特異性の高い相互作用に基づく。通常、不動（固定）相は、多くの場合アガロースのゲルマトリックスである。通常、出発点は、細胞溶解物、増殖培地又は血清などの、溶液中の不明確な分子の混成群である。対象となる分子は、アフィニティ精製プロセスの間に利用できる、周知の定義された特性を有する。プロセス自体は、標的分子が固体又は固定相又は媒体で捕えられる、トラップ（entrapment）と考えることができる。溶液中の他の分子は、この特性を持たないため、捕えられない。次いで、固体媒体を混合物から除去し、洗浄し、溶出として公知のプロセスにて、標的分子をトラップから解放することができる。おそらく、アフィニティークロマトグラフィーの最も一般的な使用は、組み換えタンパク質を精製するためである。固相への結合は、カラムクロマトグラフィーにより達成されてよく、これにより、固体媒体をカラム上に詰め、最初の混合物をカラムに流してセッティング（setting）させ、洗浄バッファーをカラムに流し、続いて、溶出バッファーをカラムに適用し、回収する。あるいは、結合は、バッチ処理を使って、最初の混合物を容器中で固相に添加し、混合し、固相（例えば）を分離し、液相を除去し、洗浄し、再度遠心分離し、溶出バッファーを添加し、再度遠心分離し、かつ溶出液を取り出すことによって、達成されてよい。

ハイブリッド方法が使用される場合もあり、結合をバッチ方法によって行い、次いで、標的分子が結合した固相をカラム上に詰め、洗浄及び溶出をカラムにて行う。

上記2つの方法の利点を組み合わせた第3の方法、拡張吸着流動床（expanded bed adsorption）も開発されている。固相粒子をカラムに入れ、ここに、液相を底部からポンプ送りし、上部から出す。粒子の重力によって、固相が液相とともにカラムから出ないことが保証される。

アフィニティーカラムは、勾配によってイオン強度を変えることにより溶出できる。塩濃度、pH、pI、電荷及びイオン強度はすべて、分離するため、あるいは分離するための勾配を形成するために使用できる。

アフィニティークロマトグラフィーは、核酸精製、無細胞抽出物からのタンパク質精製、及び血液からの精製を含む、多くの適用に使用できる。

手順についての他の使用は、血清からの抗体のアフィニティ精製である。血清が、特定の抗原に対する抗体を含むことが分かっている場合（例えば、血清が、関連する抗原に対して免疫化された生物由来である場合）、その抗原のアフィニティ精製にこれを使用できる。これは、イムノアフィニティークロマトグラフィーとしても知られる。

固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）は、アミノ酸、特にヒスチジンの金属への特異的な配位共有結合に基づく。この技術は、金属イオンに対して親和性を有するタンパク質を、例えば、ヒスチジンを含むタンパク質又はペプチドの精製にはコバルト、ニッケル、銅などの固定化金属イオンを含み、リン酸化タンパク質又はペプチドの精製には鉄、亜鉛又はガリウムなどの固定化金属イオンを含むカラム中に保持させることにより行う。天然に存在するタンパク質の多くは、金属イオンに対する親和性を有さないため、組み換えDNA技術を用いて、かかるタンパク質タグを関連遺伝子に導入することができる。対象のタンパク質を溶出するために使用する方法は、pHを変えること、又はイミダゾール等の競合分子を添加することを含む。

上記に基づき、固定相が、いくつかの分離方法において必要であることが理解できる。該方法において、固定相は、効率的な形で混合物から成分を分離するための手段を提供し、これは、固定相を介して実施されるが、望ましくない形で該成分と相互作用しない。分離方法、特に電気泳動又はクロマトグラフィーに基づく方法で有用な、改善された固定相に対する明確なニーズが存在する。

要約
本発明の態様は、分離方法における、フィブリルセルロースを含む固定相の使用を対象とする。本発明は、電気泳動又はクロマトグラフィーに基づく分離方法における、フィブリルセルロースを含む固定相の使用及び使用方法に関する。前記フィブリルセルロースを含む固定相は、合成及び天然のポリマー、巨大分子、生体分子及びナノ粒子を分離及び／又は分析及び／又は分別（fractionating）するために、前記方法において使用されてよい。

フィブリルセルロースを含む固定相は、ゲル電気泳動マトリックス又は媒体として使用されてよい。従来のゲル電気泳動法に加えて、一次元及び二次元の両方で、温度勾配ゲル電気泳動及び変性勾配ゲル電気泳動、並びにDNAゲル電気泳動を、フィブリルセルロースを含む固定相を用いて実施してよい。DNAゲル電気泳動は、通常、多くの場合にはPCRを介したDNAの増幅後に、分析的目的のために実施されるが、他の方法、例えば、さらなる特性評価のための質量分析、RFLP、PCR、クローニング、DNAシークエンシング又はサザンブロットなどを使用する前の準備技術として使用されてよい。

フィブリルセルロースを含む固定相は、クロマトグラフィーに基づく方法において、固定相として使用されてよく、ここで、該クロマトグラフィー法は、排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーに基づいてよい。

クロマトグラフィー法において、分離される画分又は成分は、固定相と接触され、移動相は、固定相を通過させてよい。固定相は、分離が行われる容器、好適にはカラムに詰められてよい。好適には、分離及び／又は分析される混合物と、任意選択で少なくとも1つの溶媒とを液体形態で含む移動相が、任意選択で圧力を使用して、固定相を通過する。分子サイズ及び／又は電荷及び／又は親和性及び／又は疎水性に応じて分離される画分が得られてよい。

本発明のさらなる態様は、天然ポリマー、合成ポリマー、巨大分子、生体分子及びナノ粒子から選択される成分を分析及び／又は分離及び／又は分別するための方法であって、フィブリルセルロースを含む固定相をゲル電気泳動マトリックスとして使用し、成分を含む混合物を固定相と接触させ、電場をマトリックスに適用し、それにより成分を分離する、電気泳動を実施する工程を含む方法を対象とする。分離した成分は、マトリックスから取り出されてよい。

本発明のまたさらなる態様は、天然ポリマー、合成ポリマー、巨大分子、生体分子及びナノ粒子から選択される成分を分析及び／又は分離及び／又は分別するための方法であって、成分と任意選択で少なくとも1つの溶媒とを含む混合物を液体形態で含む移動相を、任意選択で圧力を使用して、フィブリルセルロースを含む固定相を通過させ、それにより成分を分離する、クロマトグラフィー法（排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーに基づく）を実施する工程を含む方法を対象とする。分離した成分は、分別されてよい。

本発明はさらに、フィブリルセルロースを含む固定相を含む容器、好適には、フィブリルセルロースを充填した、プレパックされたカラムを対象とする。前記容器又はカラムは、固定相をその中に保持するために、容器又はカラムの一端に配置された少なくとも1つのフィルターをさらに含む。

さらに、本発明は、フィブリルセルロースを含む固定相と試薬を含む、ゲル電気泳動のためのキットを対象とする。

本発明特有の特徴は、添付の特許請求の範囲に示される。

図1は、フィブリルセルロースゲルマトリックス及びアガロースゲルマトリックスを用いて実施したゲル電気泳動を示す。ゲルは臭化エチジウムで染色し、DNAをUV光下で可視化した。 図2は、ゲル電気泳動後、フィブリルセルロースゲルから抽出したDNAサンプルの定量PCR分析結果をグラフで示す。 図3は、2つの培地（1つは1.5 wt％のフィブリルセルロース（fc）を含み、もう1つは含まない）で培養したB. セレウス（B. cereus）計数結果をグラフで示す。 図4は、C. パーフリンジェンス（C. perfringens）希釈系列の定量PCRラン（run）をグラフで示し、1.5 wt％のフィブリルセルロースの有無に関わらず、希釈度とPCR反応との間の強い線形相関を示す。 図5は、1 wt％の天然フィブリルセルロースヒドロゲルを通った、異なる分子量のデキストラン（20 kDa、70 kDa及び250 kDa）の拡散を示す。

定義
特記のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される用語は、当該分野で一般に使用される意味を有する。具体的には、以下の用語は、下記の意味を有する。

用語「固定相」とは、本明細書において、「不動相」又は抗対流媒体（anticonvective medium）及び／又は篩媒体をいう。

用語「移動相」とは、本明細書において、1つ以上の成分を液体形態で含んでよい、液体媒体をいう。通常、移動相は、固定相中を移動させてよい。

本明細書で使用する場合、用語「フィブリルセルロース」とは、すべてのミクロフィブリル化セルロース（MFC）及びナノセルロースを包含すると理解される。さらに、フィブリルセルロースには、広く使用されている類義語が他にいくつかある。例：セルロースナノファイバー、ナノフィブリル化セルロース（nanofibrillated cellulose）（CNF）、ナノフィブリルセルロース（nanofibrillar cellulose）（NFC）、ナノスケールフィブリル化セルロース、ミクロフィブリルセルロース、又はセルロースミクロフィブリル。

特定の微生物によって生産されるフィブリルセルロースにも様々な類義語があり、例えば、細菌セルロース（BC）、微生物セルロース（MC）、バイオセルロース、ナタデココ（NDC）又はココデナタ（coco de nata（CDN））などである。

発明の詳細な説明
驚くべきことに、フィブリルセルロースは、いくつかの分離方法に特に適した固定相を提供するために使用できることが発見された。フィブリルセルロースは、極性溶媒及び水において、安定したゲルを容易に形成する。ゲルの特性は、所望の分離方法と、分離又は分析されるべき化合物とに応じて変わり得る。特に、本発明は、分離方法における、フィブリルセルロースを含む固定相の使用を対象とする。前記分離方法は、好適には、電気泳動又はクロマトグラフィーに基づく。前記クロマトグラフィー法は、好適には、排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーに基づく方法から選択されてよい。前記方法は、天然ポリマー、合成ポリマー、巨大分子、生体分子及びナノ粒子、並びに荷電粒子又は化合物の分析、分離及び分別に特に有用であり、分取クロマトグラフィー法も含む。

電気泳動は、本明細書において、ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、変性勾配ゲル電気泳動、及び二次元ゲル電気泳動及びDNAゲル電気泳動を含む。

排除クロマトグラフィーは、ゲルろ過クロマトグラフィー又はゲル浸透クロマトグラフィーとも称されてよい、サイズ排除クロマトグラフィーを含む。

イオン交換クロマトグラフィーは、本明細書において、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。

アフィニティークロマトグラフィーは、本明細書において、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー及び固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを含む。

フィブリルセルロースは、任意の非動物性セルロース原料から得られる。

用語「セルロース原料」とは、セルロースパルプ、精製パルプ及びフィブリルセルロースの生産に使用できる、任意のセルロース原料源をいう。セルロース原料は、セルロースを含む任意の植物材料、又は任意の微生物セルロースに基づいてよい。

植物材料は木であってよく、該木は、トウヒ、マツ、モミ、カラマツ、ダグラスモミ若しくはツガ等の軟木由来、若しくはカバノキ、アスペン、ポプラ、ハンノキ、ユーカリ若しくはアカシア等の堅木由来、又は軟木及び堅木の混合物由来であり得る。非木質材料は、農業残留物、草又は他の植物性物質、例えば、わら、葉、樹皮、種子、殻、花、野菜又は果実であって、綿、トウモロコシ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、米、亜麻、麻、マニラ麻、サイザル麻、ジュート、ラミー、ケナフ、バガス、竹又は葦に由来するものであり得る。

セルロース原料はまた、細菌発酵プロセス等から、セルロースを生産する微生物由来であってもよい。微生物は、アセトバクター（Acetobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、リゾビウム（Rhizobium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属、好ましくはアセトバクター（Acetobacter）属、より好ましくはアセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）種又はアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus）種であり得る。

用語「セルロースパルプ」とは、化学的、機械的、熱機械的又は化学−熱機械的パルピングプロセスを用いて、任意のセルロース原料から分離したセルロースファイバーをいう。植物由来、特に木のパルプ（軟木又は堅木パルプ、例えば、カバノキのさらしパルプ（bleached birch pulp））であり得るセルロースパルプであって、セルロース分子が上記方法の1つで酸化されるものは、フィブリルセルロースに分解しやすい。

用語「フィブリルセルロース」とは、セルロース原料に由来する、分離したセルロースミクロフィブリル（ナノファイバー）又はミクロフィブリル束の集合体をいう。ミクロフィブリルは、通常、高いアスペクト比を有する：長さは1マイクロメートルを超えるが、数平均直径は通常、200 nm未満である。ミクロフィブリル束の直径も、より大きくなり得るが、一般的には1 μm未満である。最小のミクロフィブリルは、通常、直径2〜12 nmである、いわゆるエレメンタリーフィブリル（elementary fibril）に近い。フィブリル又はフィブリル束の寸法は、原料及び分解方法によって決まる。

フィブリルセルロースは、非常に高い保水値、高度な化学的アクセシビリティ（chemical accessibility）、及び水又は他の極性溶媒において安定したゲルを形成する能力を特徴とする。フィブリルセルロース産物は、通常、高度にフィブリル化したセルロースの密なネットワークである。フィブリルセルロースはまた、いくらかのヘミセルロースを含有してもよい；その量は、植物源によって決まる。

フィブリルセルロースを得るために、セルロースパルプ、酸化セルロース原料又は微生物セルロースの機械的分解が、精製機、グラインダー、ホモジナイザー、コロイダー、摩擦グラインダー、超音波発生装置、フリューダイザー、例えば、マイクロフリューダイザー、マクロフリューダイザー又はフリューダイザー型ホモジナイザー等の適切な装置で行われる。好ましくは、機械的に分解したフィブリルセルロースが使用される。

複数の異なるグレードのフィブリルセルロースが、様々な生産技術を用いて開発されている。該グレードは、製造方法、フィブリル化の程度及び化学組成に応じて、異なる特性を有する。該グレードの化学組成もまた様々である。原料源、例えば、堅木（HW）対軟木（SW）パルプによって、異なる多糖類組成が、最終的なフィブリルセルロース産物に存在する。通常、非イオン性又は天然又は中性（neutral）グレードが、より幅広いフィブリル直径を有する一方、化学的に改質（chemically modified）したグレードは、はるかに細い。サイズ分布もまた、改質グレードについては、より狭い。

「フィブリルセルロース」とは、本明細書においては、フィブリルセルロースの1つのグレード、又はフィブリルセルロースの2つ以上の異なるグレードの組み合わせをいう。例えば、ある種の化合物のゲルへの結合、又はいくつかの特定の不純物の結合等を高めるために、フィブリルセルロースの改質したグレードを天然グレードと混合してよい。

本発明の一実施態様によれば、植物由来の天然フィブリルセルロースが、好適にはゲルとして、例えばヒドロゲル（水性ゲル）として、使用されてよい。

フィブリルセルロースは、本明細書においては、任意のセルロース原料から得られるセルロース、セルロースナノファイバー又はナノファイバー束のいずれの化学的又は物理的に改質された誘導体をも包含するものと理解される。化学的改質は、例えば、セルロース分子のカルボキシルメチル化、酸化（TEMPO酸化）、エステル化又はエーテル化反応に基づいてよく、それにより、陰イオン性又は陽イオン性に改質したグレードが得られる。改質はまた、陰イオン性、陽イオン性若しくは非イオン性物質又はこれらの任意の組み合わせを、セルロース表面上に物理的に吸着させることによって実施されてもよい。既記の改質は、セルロースナノファイバー製造の前、後又はその最中に実施できる。特定の改質により、人体で分解可能な材料がもたらされてよい。改質したグレードは、通常、さらしパルプから調製される。改質したグレードでは、ヘミセルロースもセルロース領域とともに改質される。改質は均質でない、すなわち、ある部分が他の部分よりも改質されている可能性が非常に高い。従って、詳細な化学分析は不可能である−改質した生産物は、常に、異なる多糖構造の複雑な混合物である。

化学的に改質したグレード、例えば、陰イオン性及び陽イオン性グレード等は、通常、それらの表面電荷が改質されており、好適には、乾燥粉末又は水性ゲルとして使用されてよい。化学的に改質したグレードは、特定の表面電荷が分離を高める、化合物の分離に特に使用されてよい。従って、この目的のために、分離されるべき化合物のタイプに応じて、適切なフィブリルセルロース、又は異なるフィブリルセルロースの組み合わせが、選択及び設計されてよい。

フィブリルセルロースの乾燥粉末は、当分野で公知の任意の常法を用いて、前記フィブリルセルロースを含む懸濁液又は分散液を噴霧乾燥及び／又は凍結乾燥することにより都合よく製造されてよい。好適には、化学的に改質したグレードを噴霧乾燥し、任意選択で小さなビーズに粒状化する。これらは、極性溶媒、好適には水を用いて、ゲルに戻してよい。

フィブリルセルロースゲル又はヒドロゲルとは、本明細書においては、フィブリルセルロースの分散液をいう。フィブリルセルロースは優れたゲル化能を有し、つまり、これは、水性媒体において、低コンシステンシーですでにヒドロゲルを形成することをいう。

好適には、セルロースパルプ等のセルロース原料は、機械的分解の前に、酸と塩基とで前処理される。前処理は、＋1を超える電荷を有するいかなる正電荷イオンも取り除くために、セルロースパルプを酸処理、好ましくは塩酸での酸処理に供し、それに続いて、＋1の電荷を有する正電荷イオンを含む無機塩基、好ましくはNa^＋イオンが先のイオンに置き換わるNaOHで処理することによりなされる。＋1を超える電荷を有するいかなる正電荷イオンも存在しないことは、ライフサイエンス及び分子生物学での利用に特に有利であり、その場合、＋1を超える電荷を有するイオンとDNAとの複合体の形成を回避することができる。前処理により、最終生産物に優れたゲル化特性及び透明性がもたらされる。前処理したセルロース原料から得られるフィブリルセルロースは、本明細書において、イオン交換フィブリルセルロースと称す。本発明の一実施態様によれば、イオン交換フィブリルセルロースが使用される。

多くの場合、フィブリルセルロースの微生物純粋性（microbial purity）が必須である。従って、フィブリルセルロースは、使用前に、好適にはゲルの形態で、滅菌されてよい。加えて、フィブリル化等の機械的分解の前及び最中には、生産物の微生物汚染を最小にすることが重要である。フィブリル化／機械的分解に先立って、パルプが未だ無菌であるさらし段階の直後に、パルプミルからセルロースパルプを無菌で回収することが有利である。

フィブリルセルロースヒドロゲルは、通常、低濃度で、著しく高い降伏応力及び高いゼロ剪断粘度を有する。従って、すなわち、フィブリルセルロースヒドロゲル中に気泡が生じる場合、それらは長時間そのままであり得る。しかしながら、気泡の浮力は、ゲル上部の気圧を低下させる（例えば、15 mmHg）ことによって、容易に増加させることができ、これにより、ヒドロゲル相中の気体の溶解度が低下し、当初の気泡の容積がそれぞれ増大する。増大した気泡は、上方の気体相へと容易に逃げだす。

フィブリルセルロースを含む固定相は、フィブリルセルロースの1つのグレード、又は天然及び改質グレード（陰イオン性グレード、陽イオン性グレード等）等の異なるグレードの組み合わせを含んでよい。

改質グレード、及び天然又は非イオン性グレードが、ゲル電気泳動法で使用されてよいが、天然グレードが特に適している。

排除クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィー法において、フィブリルセルロースグレードの選択は、分析又は分離される化合物によって決まる。サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、好適には、天然又は非イオン性グレードのフィブリルセルロースが使用される。

イオン交換クロマトグラフィーにおいて、陰イオン性又は陽イオン性グレード等の改質グレードが好適であってよい。改質グレードは、従来のイオン交換樹脂と同様の方法で分離又は分析した後、再生され、その後、再利用されてよい。

固定相は、フィブリルセルロースをゲルとして、好ましくはヒドロゲルとして含んでよく、あるいはまた乾燥粉末として含んでもよく、乾燥粉末は、極性溶媒又はその混合物と接触させることにより、使用前にゲルにもどされてよく、好適には水との接触によりヒドロゲルが得られる。特に好適には、陰イオン性及び陽イオン性グレード等の改質グレードは、乾燥粉末として提供される。天然及び非イオン性グレードは、好適には、ヒドロゲルなどのゲルとして提供される。

固定相におけるフィブリルセルロースの数平均フィブリル直径（number average fibril diameter）は、分離方法の要件に従って選択されるため、適切な固定相は、例えば、クロマトグラフィーの要件、所望の分解能、分離する化合物の特性等を考慮して、それぞれの特定の方法のために設計されてよい。フィブリルセルロースの数平均フィブリル直径は、1〜1000 nmの範囲、好適には1〜200 nmの範囲であってよく、一実施態様によれば、天然グレードの数平均フィブリル直径は、1〜100 nmであり、化学的に改質したグレードでは、1〜20 nmである。

固定相は、少なくとも1つのグレードのフィブリルセルロースを0.05〜100 wt％含んでよい。固定相は、任意選択で添加物を含んでよい。

好適には、ゲル電気泳動において、フィブリルセルロースを0.05〜20 wt％、好適には0.1〜3 wt％、一実施態様によれば0.5〜1.5 wt％含むゲルが、固定相として使用される。好適には、フィブリルセルロースは、天然又は非イオン性フィブリルセルロースである。固定相は、任意選択で、色素、マーカー、活性炭等の添加物を含んでよい。ゲルは、すぐに使えるキャストされたゲルであってよく、これは、さらに滅菌され、滅菌パッケージで包装されてよく、あるいはヒドロゲルとして、ゲルの適用のために使用できるシリンジに包装されてよい。ゲルはまた、アガロース又はポリアクリルアミドゲル等の従来のゲルと組み合わせて、例えば、前記ゲルの一部（section）として使用されてよい。ゲルはまた、使用前に水でもどすことができる乾燥メンブレンの形態であってもよい。カルボキシメチル化フィブリルセルロース等の陰イオン性グレードが、乾燥メンブレンのために使用されてよい。

ゲル電気泳動を実施後、分離した化合物は、例えばピペット操作などによって、容易に取り出すことができ、その後、適切な再処理、精製等が行われ得る。フィブリルセルロースを含む固定相は、当分野で公知の任意のゲル電気泳動適用に使用されてよい。特に好適には、フィブリルセルロースを含む固定相は、法医学、分子生物学、遺伝学、微生物学及び生化学の分野での適用に使用されてよい。

さらに、フィブリルセルロースを含む固定相は、ゲル電気泳動キットに組み込まれてよく、該キットは、ゲル電気泳動を実施するのに必要な試薬と、予めキャストされたゲルとしてフィブリルセルロースを含む固定相、又はヒドロゲルとして、好適にはシリンジなどのディスペンサーにて提供されるフィブリルセルロースを含む固定相とを含む。

排除クロマトグラフィーにおいて、乾燥した粉末若しくはビーズ、又はゲルであって、フィブリルセルロースを0.05〜50 wt％、好適には1〜30 wt％、一実施態様によれば2〜20 wt％含むものを、固定相として使用してよい。乾燥した粉末又はビーズの形態である固定相は、使用前に、これを極性溶媒又はその混合物、好適には水と接触させることによってゲルに戻してよい。固定相は、任意選択で、色素、マーカー、活性炭等の添加物を含んでよい。フィブリルセルロースを含む乾燥した粉末若しくはビーズ、又はヒドロゲルは、カラムなどの容器であって、その中にフィブリルセルロースを保持するために、好ましくはカラムの反対側（底部）にて、その中に配置される少なくとも1つのフィルターを有するものに容易に包装されてよい。従って、滅菌されていてもよい、すぐに使えるプレパックされたカラムが、エンドユーザーに提供されてよい。フィブリルセルロースを含む固定相は、当分野で公知の任意の排除クロマトグラフィー適用に使用されてよい。

イオン交換クロマトグラフィーにおいて、乾燥した粉末若しくはビーズ、又はゲルであって、フィブリルセルロースを0.05〜50 wt％、好適には〜30 wt％、一実施態様によれば2〜20 wt％含むものを、固定相として使用してよい。乾燥した粉末又はビーズは、使用前に、これを極性溶媒又はその混合物、好ましくは水と接触させることによってゲルに戻してよい。固定相は、任意選択で、色素、マーカー、活性炭等の添加物を含んでよい。フィブリルセルロースを含む乾燥した粉末若しくはビーズ、又はヒドロゲルは、カラムなどの容器であって、その中にフィブリルセルロースを保持するために、好ましくはカラムの反対側（底部）にて、その中に配置される少なくとも1つのフィルターを有するものに容易に包装されてよい。従って、滅菌されていてもよい、すぐに使えるプレパックされたカラムが、エンドユーザーに提供されてよい。フィブリルセルロースを含む固定相は、当分野で公知の任意のイオン交換クロマトグラフィー適用（荷電粒子、荷電イオン又は荷電化合物を混合物から分離するための大規模適用を含む）に使用されてよい。

アフィニティークロマトグラフィーに基づく適用において、乾燥した粉末若しくはビーズ若しくはエレメント（elements）、又はゲルであって、フィブリルセルロースを0.05〜50 wt％、好適には1〜30 wt％、一実施態様によれば2〜20 wt％含むものを、固定相として使用してよい。乾燥した粉末又はビーズ又はエレメントの形態である固定相は、使用前に、これを極性溶媒又はその混合物、好適には水と接触させることによってゲルに戻してよい。固定相は、任意選択で、色素、マーカー、活性炭等の添加物を含んでよい。フィブリルセルロースを含む乾燥した粉末若しくはビーズ、又はヒドロゲルは、カラムなどの容器であって、その中にフィブリルセルロースを保持するために、好ましくはカラムの反対側（底部）にて、その中に配置される少なくとも1つのフィルターを有するものに容易に包装されてよい。従って、滅菌されていてもよい、すぐに使えるプレパックされたカラムが、エンドユーザーに提供されてよい。フィブリルセルロースを含む固定相は、当分野で公知の任意のアフィニティークロマトグラフィー適用に使用されてよい。

エレメントは、ゲルをキャスティングし、それを乾燥することによって、あるいはフィブリルセルロースゲルを有機溶媒へと押し出すことによって得られてよい。

フィブリルセルロースを含むヒドロゲルは、非常に容易に分散でき、又は例えばシリンジを用いて、カラムに注入できる。

フィブリルセルロースを含む固定相は、より大きな産業規模での分離方法において、プロセス規模での適用において、特にタンパク質を分離するための酪農産業の分野において、炭水化物並びに他の合成及び天然のポリマー、生体分子、巨大分子及びナノ粒子の分離及び分別において、並びに液体及び混合物の精製方法において、荷電粒子、金属イオンなどの荷電イオン、又は荷電化合物の分離が望まれる場合、好適に使用されてよい。

例えばタンパク質若しくは炭水化物の画分又は残留物などを含む、使用済みの固定相は、例えばドレーン（draining）により、プロセス装置から容易に取り出されてよく、特に分離方法において非病原性及び非毒性の成分が使用された場合には、動物の餌における成分等のさらなる使用のためにこれを実施（conducted）してよい。

固定相の作動範囲のpHは、フィブリルセルロースの適切に改質したグレードを選択することによって、調節されてよい。

拡散速度は、化学的に改質したフィブリルセルロースの適切なグレード又はフィブリルセルロースの組み合わせ、フィブリルセルロースの適切な数平均フィブリルサイズ範囲、固定相を通して移動相を動かすために使用される適切な力、例えば、圧力、重力、起電力等を選択することによって調節されてよい。

ゲル電気泳動、排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーに基づく分離方法における、フィブリルセルロースを含む固定相の使用は、いくつかの有益な効果をもたらす。フィブリルセルロースは重合生産物ではないので、神経毒性アクリルアミド等のモノマー残留物が生産物中に残らない。核酸分析及び単離に関しては、分離方法においてフィブリルセルロースを含む固定相を使用することにより、潜在的な計数及び検出上の問題のリスクを回避できるか、又は少なくとも著しく低減できる。

フィブリルセルロースを含む固定相は、非毒性生産物であり、製造しやすく、扱いやすく、エンドユーザーによる特定の予防策を必要としない。好適には、ヒドロゲルは、カラムに注入されてよく、プレート及びウェルに注入又はキャスティング又は広げられてよく、かつ分注又はピペット操作されてよい。実施例からわかるように、これは、悪影響をもたらさず、DNA単離又はPCR分析を妨げず、事実、フィブリルセルロースの使用によって、DNA単離の収量が向上する。

分離後に固定相中に残る材料は、水で希釈した後、デカント又は遠心分離することにより、容易に取り出され、又は単離されてよく、あるいはまた、フィブリルセルロースは、例えばセルロース酵素で、酵素的に分解されてよい。

ゲル電気泳動の場合、分離手順の後に得られた、所望の成分を含むバンドは、容易かつ確実にシリンジで吸引（drawn）することができ、成分をヒドロゲルから単離できる。

以下の実施例は、上述の本発明の実施態様を例証するものであり、これらは、決して本発明を限定することを意味しない。

実施例
フィブリルセルロースサンプル：高度に精製されたカバノキさらしパルプを高圧ホモジナイゼーション（5回の連続サイクル）し、それに続いてオートクレーブ滅菌することにより、天然フィブリルセルロースを生産した。流動化後、フィブリルセルロースは、低濃度のヒドロゲル（1.8 wt％）であった。イオン交換した天然フィブリルセルロースは、同様の方法で得たが、高い原子価の陽イオンを取り除くために、フィブリル化の前にさらに酸−塩基処理（先のセクションに記載した方法）に供した。高圧ホモジナイゼーション（15回の連続サイクル）後、イオン交換したフィブリルセルロースは、他のサンプルと比較して低い濁度を有する、強固なヒドロゲルを形成する。必要に応じて、フィブリルセルロースをオートクレーブ滅菌した。透明な陰イオン性フィブリルセルロースは、化学的に改質したセルロースパルプ（TEMPO酸化セルロースパルプ）の同様のホモジナイゼーションプロセスにより、ヒドロゲル（0.9 wt％）として得た。

実施例1
フィブリルセルロースに基づく電気泳動ゲルマトリックスの使用
通常の研究室プラクティスに従って、1.5重量％のアガロースを含有するアガロースゲルを調製し、その後、約3 cm×5 cmのゲルスライス2つを、ゲルの中心部分から切って取り除いた。これら2つの穴を、1.5重量％の天然フィブリルセルロースを含有するフィブリルセルロースヒドロゲルで満たし、電気泳動のために、ゲルシステム全体を1×TAEバッファーに浸した。フィブリルセルロースのタイプ及びグレードの選択、並びにフィブリルセルロースヒドロゲルの混合は、ヒドロゲルの濁度、外観及び分離能に影響を及ぼす。ゲル濁度の上昇を引き起こし得る、ゲル中のいかなる気泡も回避するために、好ましくは、混合は慎重に行われる。

大腸菌遺伝子の完全な16S遺伝子（推定MW：約1.4 kb）、及び分類学的に重要な、より小さなC. パーフリンジェンス（C. perfringens）のS16フラグメント（推定分子量：約0.6 kb）をゲルに負荷した。電気泳動を行い、DNAをUV光下で可視化する臭化エチジウムでゲルを染色した。（A）16S遺伝子全体、（B）16Sフラグメント及び（C）16Sフラグメントの二量体（すなわち、16Sフラグメントの二量体）。ラダーは、分子量マーカーである。

より小さな16Sフラグメントは2つのバンドを含み、小さい方が実際のフラグメントであり、分子量の高いフラグメントはその二量体である。臭化エチジウムで染色したDNAフラグメントが、フィブリルセルロースマトリックス内部を明らかに移動するまで、120ボルトでゲルを流し、その後ゲルの流れを止めて、撮影した（図1参照）。

染色したゲルは、フィブリルセルロースマトリックスがアガロースと同様に作用し、DNAフラグメントをその分子量に基づいて分離可能であることを実証する。DNAバンドは、フィブリルセルロースにおいて若干不鮮明（little fainter）であり、これは、使用したフィブリルセルロース材料の透明性が低いことが原因である可能性が高い。さらに、移動速度（migration rate）は、フィブリルセルロースゲルにおいて、より高く、これは、より濃縮されたゲル混合物を使用することによって、同様の移動速度を得ることができることを意味する。

次の手順は、DNAフラグメントをゲルから単離することであった。アガロースでは、ゲル材料の機械的な切り取りを必要とする。フィブリルセルロースでは、単にピペットで、DNAフラグメントをゲルから取り出した。これは明らかに、より速くかつ容易である。その後、フィブリルセルロースゲルから抽出したDNAサンプルの定量PCR分析を、ユニバーサルプライマー及びSybergreen Iケミストリを用いて、上述のように実施した（図2参照）。データは、ほぼ同一のシグナルが、ライン4及び9と、ライン5及び10から得られたことを示し、これにより、抽出したDNAフラグメントについて、良好な再現性が示される。

実施例2
フィブリルセルロース担体からの微生物の計数
バチルス・セレウス（Bacillus cereus）細菌を、2つの異なる培地（1つは1.5 wt％の天然フィブリルセルロースを含み、もう1つは含まない）で培養し、フィブリルセルロースが、より高い微生物細胞数を提供できるかを測定した。本実験（trial）ではPCRに基づく計数を使用し、フィブリルセルロースの、PCR検出との相互作用の好例が得られた。

実験で使用した増殖培地は、標準的なトリプシンソイブロスであり、製造者の指示に従って調製し、滅菌のためにオートクレーブした。培養培地は、オートクレーブの前に2つの部分に分け、そのうちの1つに1.5 wt％のフィブリルセルロースを加えた。B. セレウスの少量の接種材料を37℃で一晩増殖させて、密な微生物培養物とし、これを両方の培養培地の接種に使用し、約千倍希釈を接種に使用した。両方の試験培地を、接種後0時間及び24時間にてサンプリングした。0.1 mlの培養サンプルをPCRに基づく微生物計数に使用した。計数方法は、Ruminolyzeプロトコルに基づいており、微生物サンプルを最初に洗浄バッファーに希釈し、遠心分離（10分間、18000×g）によって微生物細胞をペレット化する。酵素的及び機械的の両方により微生物細胞を溶解して、それらのDNA内容物を取り出すために、上清を捨て、ペレットを酵素溶解バッファーに懸濁した後、ガラスビーズで強く攪拌（beaten）する。取り出したDNAを、フェノールクロロホルム抽出で精製し、次いで、エタノールで沈殿し、最後に、DNA保存バッファーに溶解する。B. セレウス計数は、2つのB. セレウス選択的DNAプライマー、及びSybergreen Iケミストリを用いて実施した。結果を図3に示す。

従って、増殖培地（TSB）及びフィブリルセルロース（fc）における、インキュベーション開始時（0時間）及び一晩インキュベーション後のバチルス・セレウス細胞数を定量PCRにより分析した。この実験により、少数のB. セレウス細胞（約10⁵細胞／ml）がフィブリルセルロースの存在下で検出できることが示され、これは、フィブリルセルロースが、PCRアッセイの感度に対し何の影響も及ぼさないことを示す。さらに、24時間のサンプルは、0時間のサンプルよりも高い細胞数を示す。これは、PCRのダイナミックレンジが、フィブリルセルロースの存在により妨げられず、最大スピードで作動させる場合、言い換えれば、多量の鋳型DNAが存在する場合でも、フィブリルセルロースはPCR反応を妨害しないことを意味する。図3は、フィブリルセルロースの存在下、0時間及び24時間の両方のサンプリングポイントで、より多くの細胞がカウントされることも示す。これは、フィブリルセルロースが、DNAの単離を助け、B. セレウス計数のために、より高いDNA収量をもたらすことを示唆する。これはまた、フィブリルセルロースがPCRプロトコルを改善さえすることも示唆する。

同様の実験を他の細菌種、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）及びデスルホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulficans）でも実施した。結果は、B. セレウスでの発見と同様であり、フィブリルセルロースがDNA単離又はPCR手順を阻害しないという主張を裏付けるものである。

実施例3
フィブリルセルロースの存在下での微生物定量化
密なクロストリジウム・パーフリンジェンス培養物（約10⁹細胞／ml）の希釈系列（10倍、100倍及び1000倍希釈）を、1.5 wt％の天然フィブリルセルロースの存在下及び非存在下にて調製した。希釈した微生物サンプルを、溶解バッファー及びガラスビーズに懸濁し、微生物DNA単離方法（上記実施例2に記載のとおり）を施した。DNAを単離後、DNAサンプルを、C. パーフリンジェンス特異的プライマー及びSybergreen Iケミストリを用いたPCRに基づく計数に使用した。PCR定量化の結果を図4にグラフで示す。データは、フィブリルセルロースからなんら妨害されることなく、PCRの結果と算出される希釈度との間に強い線形相関を示し、すなわち、1.5 wt％のフィブリルセルロースの有無に関わらず、希釈度とPCR反応との間に強い線形相関を示す。

実施例4
フィブリルセルロースヒドロゲルによるデキストランの拡散
フィブリルセルロースヒドロゲルの拡散特性を、異なる分子量のデキストランで、以下のように実証した：

Transwell（商標）フィルターウェルプレート（フィルター孔径0.4 μm）の頂端部のコンパートメント（apical compartment）に、フィルターあたり、400 μlの透明又は不透明なフィブリルセルロースヒドロゲル（1 wt％の天然フィブリルセルロース）を置いた（plant）。1 mlのPBSを基底側（basolateral side）に添加し、100 μl（25 μg）の蛍光標識デキストランをヒドロゲルの上部に添加した（MW：20 k、70 k及び250 k）。プレートをしっかりと固定し、ウェルプレートロッカー上に静置した。100 μlのサンプルを基底側から採取し、等量をPBSで置き換えた。最初のサンプルは、15分間隔で採取し、他のサンプルは、30分〜2時間の範囲の異なる時点で採取し、最後のサンプルは24時間で採取した。全部で168のサンプルを採取した。それぞれ励起波長490 nm、発光波長520 nmで、標的プレート（OptiPlate（商標）−96F）を測定した。

1％の天然フィブリルセルロースゲルを通った、異なる分子量のデキストランの拡散を図5に示す。モデル化合物の拡散は、一定の速度で起こり、化合物の分子量（サイズ）に大きく依存する。CNFヒドロゲルにおいては、そのゲル構造は細胞懸濁液を安定化させるのに十分なほど硬いが、分子は効果的に拡散可能であることが明らかである。

化合物の拡散は、分子（タンパク質）のサイズの関数として、又はヒドロゲル濃度として制御できる。

本発明は、本発明を実施するのに現在好ましい形態を含めて、特定の実施例について記載されているが、当業者は、上述の実施態様には、本発明の精神及び範囲内で、多くの変形及び順序があることを理解するであろう。本発明が、その適用において、本明細書に記載の成分の配置及び構成の詳細に限定されないことが、理解されるべきである。上記の変形及び変更は、本発明の範囲内にある。

Claims (15)

1. 分離方法における、植物材料由来のナノフィブリルセルロースをゲルとして含む固定相の使用。
2. 分離方法が、電気泳動又はクロマトグラフィーに基づく方法から選択される、請求項１に記載の使用。
3. 電気泳動に基づく方法が、ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、変性勾配ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動及びDNAゲル電気泳動から選択される、請求項２に記載の使用。
4. クロマトグラフィーに基づく方法が、排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択される、請求項２に記載の使用。
5. ナノフィブリルセルロースが、機械的に分解されたナノフィブリルセルロースである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. ナノフィブリルセルロースを含む固定相が、乾燥した粉末、ビーズ、エレメント、又はゲル、好ましくはヒドロゲルの形態である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 固定相におけるナノフィブリルセルロースの量が、0.05〜100 wt％、好ましくは0.05〜50 wt％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. 合成ポリマー、天然ポリマー、巨大分子、生体分子、ナノ粒子、荷電粒子、荷電イオン、荷電化合物、及びそれらの組み合わせから選択される成分を混合物から分離するための方法であって、植物材料由来のナノフィブリルセルロースをゲルとして含む固定相を使用する、電気泳動法又はクロマトグラフィー法を実施する工程を含む、方法。
9. 電気泳動法が、ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、変性勾配ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動及びDNAゲル電気泳動から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 電気泳動法が、固定相上又は固定相中に混合物を分注する工程と、該固定相に電場をかけることによって成分を分離する工程とを含む、請求項９に記載の方法。
11. クロマトグラフィー法が、排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択される、請求項８に記載の方法。
12. クロマトグラフィー法が、固定相に、少なくとも1つの液体を含む移動相を通過させる
    工程であって、混合物が、固定相中又は固定相上に分散されるか、又は移動相に混合されており、それによって成分を分離する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 圧力又は重力が使用される、請求項１２に記載の方法。
14. ゲル形態のナノフィブリルセルロースを含む固定相を含む容器又はディスペンサーであって、該ナノフィブリルセルロースが植物材料に由来する、容器又はディスペンサー。
15. 植物材料由来のナノフィブリルセルロースをゲルとして含む固定相と、試薬とを含む、電気泳動キット。