JP6165752B2 - アデノ随伴ウイルスの産生のための細胞株 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１１年１０月２８日に出願された米国仮出願第６１／５５２，４９２号の利益を主張する。この出願の全内容は、参照することにより完全に本明細書の一部をなすものとする。

本発明は、動物成分を含まない懸濁条件で成長するＨＥＫ２９３細胞株に関する。この細胞株は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の迅速かつスケーラブルな産生にとって理想的であり、ＡＡＶの全ての血清型およびキメラの産生を支持する。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、インビボでの毒性および炎症が皆無かそれに近い、形質導入および長期遺伝子発現を実証している。ＡＡＶのこれらの独特な特性により、遺伝子治療への適用のための最有力なベクター候補として認識されている。ＡＡＶを利用するいくつかの第Ｉ相および第ＩＩ相の臨床試験が世界中で実施されている（Ａｕｃｏｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２６：７３（２００８）；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：８５８（２００８））。しかし、多くの前臨床研究および成功した臨床試験は、ヒト遺伝子治療のためのｒＡＡＶの使用を支持するために取り組む必要があるだろう多数の難題を明らかにしている（Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：８５８（２００８））。１つの主要な難題は、拡大する臨床的ニーズに必要な精製されたベクター量を生産するために、医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）に従ったラージスケール製造テクノロジーを確立することである。スケーラブルな産生テクノロジーを生み出すことに成功するには、一緒に用いた場合に野生型ＡＡＶ産生を極めてよく模倣するだろう細胞株、プラスミド、または組換えウイルスベクターなどの試薬を作製することに関してＡＡＶの基本的な生態を理解することに大きくかかっている。

ＡＡＶは、細胞培養における増殖性感染にアデノウイルス（Ａｄ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのヘルパーウイルスとの同時感染を必要とするため、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）ファミリーにおけるディペンドウイルスとして分類されている（Ａｔｃｈｉｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１４９：７５４（１９６５）；Ｂｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１（１９８１））。パルボウイルスは、ＤＮＡ動物ウイルスの最小の部類に入り、もっぱらタンパク質とＤＮＡとで構成される、直径が約２５ｎｍのビリオンである。ＡＡＶゲノムは、４６７９塩基を含有する直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子である（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５（１９８３））。野生型（ｗｔ）ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質および３つのキャプシドタンパク質をそれぞれコードし、かつどちらかの末端が末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接されている２つの遺伝子で構成されている（Ｌｕｓｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４：４０２（１９８０）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５（１９８３））。ＩＴＲは、ゲノム複製およびキャプシドへのパッケージングに必要な、唯一のシス作用性エレメントである。４つの複製タンパク質（Ｒｅｐ７８、６８、５２、および４０）は、多機能であり、転写、ウイルスＤＮＡ複製、および感染した細胞の核内で前もって形成されたウイルスキャプシドへのＤＮＡパッケージングにおいて役割を果たす（Ｃｈｅｊａｎｏｖｓｋｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７３：１２０（１９８９）；Ｋｉｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．２０：３２８２（２００１））。ウイルスキャプシドは、３つのタンパク質Ｖｐ１、Ｖｐ２、およびＶｐ３で、それぞれ１：１：８の比により構成されている。これらのキャプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から産生されるが、異なる翻訳開始部位を利用する。

ＩＴＲは、ゲノム複製およびパッケージングに必要な、唯一のシス作用性エレメントであるため、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、取り出して、機能を喪失することなく別々のプラスミドへクローニングすることができる。その後、プロモーター、およびプロモーターによって作動する関心対象となる遺伝子は、ＩＴＲの間にクローニングすることができる。したがって、ＩＴＲに隣接されている任意の遺伝子は、そのゲノムのサイズが５．０ｋｂ未満である限り、ＡＡＶキャプシドへ効果的にパッケージングすることができる（Ｄｏｎｇら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：８７（２０１０）；Ｇｒｉｅｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：９９３３（２００５）；Ｗｕら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：８０（２０１０））。しかし、ＡＡＶは、それでも複製する能力を欠く。ＡＡＶの独特の特徴の１つは、ＡｄまたはＨＳＶなどのヘルパーウイルスとの同時感染の要求性である。ｒＡＡＶの生成は、以前は、ベクターおよびパッケージング構築物のＡｄ感染細胞へのトランスフェクションを必要とした（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡｄまたはＨＳＶとの同時感染の際、ＡＡＶは、それ自身の複製を促進するためにいくつかのヘルパーウイルス初期遺伝子を利用する。ｒＡＡＶの生成のためのＡｄの産生細胞への感染は、ｒＡＡＶを産生することにおいて効果的であったが、そのことがまた過剰のＡｄ粒子を産生するという結果であった。Ａｄの完全な除去は、ＣｓＣｌ勾配、カラムクロマトグラフィーなどの物理的技術、およびなお存在する可能性があるいかなる残留Ａｄ粒子をも不活性化するための熱変性ステップに頼っている。これらの手順の大部分は、様々な程度で成功しているが、Ａｄ混入の可能性は、望ましくないリスクであり、Ａｄ変性タンパク質の存在は、臨床的使用には容認できない。ｒＡＡＶ産生の発展における著しい改善は、トリプルプラスミドトランスフェクションの導入であった（Ｘｉａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４（１９９８））。この方法は、ｒｅｐおよびｃａｐプラスミドおよびＩＴＲプラスミドのバリエーションを用いたが、Ａｄ感染の使用を排除した。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４、およびＥ２ＡのＡｄタンパク質、ならびにＶＡ ＲＮＡが、ＸＸ６８０と呼ばれる単一のプラスミドへクローニングされた。ＸＸ６８０プラスミド上にＡｄヘルパー遺伝子を供給することは、トランスフェクションされた細胞におけるＡｄ産生を排除し、ｒＡＡＶベクターのみを生じた。トリプルトランスフェクション方法は依然として、ｒＡＡＶを用いた実験を行うほとんどの研究所における標準産生方法である。しかし、この方法は、接着細胞の使用に限定されている。

ｒＡＡＶ産生は過去１０年間で進歩しており、それにより、いくつかの研究所が、接着性ＨＥＫ２９３細胞を用いる産生から離れて、組換えアデノウイルス（Ｇａｏら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：６４４（２００２）；Ｇａｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２３５３（１９９８）；Ｌｉｕら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３９４（２０００）；Ｌｉｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：２９３（１９９９）；Ｔｅｓｓｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３７５（２００１））、単純ヘルペスウイルス（Ｂｏｏｔｈら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：８２９（２００４）；Ｃｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６（１９９９）；Ｈｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：Ｓ１４（２００３）；Ｋａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：２２９（２００９）；Ｔｈｏｍａｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：８６１（２００９））、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）（Ａｓｌａｎｉｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：５０５９（２００９）；Ｃｅｃｃｈｉｎｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：８２３（２００８）；Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１２１７（２００５）；Ｎｅｇｒｅｔｅら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．４３３：７９（２００８）；Ｎｅｇｒｅｔｅら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：９３８（２００７）；Ｕｒａｂｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５（２００２）；Ｕｒａｂｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１８７４（２００６））、および懸濁ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４４：３２（２００７）；Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９：１７１３（２００７）；Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：４１６（２００６））の使用による感染に基づいたテクノロジーなどのスケーラブルなテクノロジーへ向かうことが可能となった。ＰａｒｋらおよびＤｕｒｏｃｈｅｒらは、それぞれ、約１．４×１０^４ｖｇ（ベクターゲノム）／細胞および３×１０^４ｖｇ／細胞が、それらの最適化無血清懸濁ＨＥＫ２９３細胞産生系を用いて生成されたことを実証した。これらの研究に共通しているのは、ベクターの収量が、妨げとなり続け、かつ接着性ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションおよびｒＨＳＶ産生系により生成したｖｇ／細胞より有意に低いという事実である。

塩化セシウム精製（ＣｓＣｌ）は、今なお、ＡＡＶ精製の最も広く用いられている型である（Ｇｒｉｅｇｅｒら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１４１２（２００６）；Ｇｒｉｅｇｅｒら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９（２００５））。ＣｓＣｌ精製を用いる利点は、それの相対的に低い費用、任意のＡＡＶ血清型についての適合性、および空粒子とゲノム含有粒子の分離である。しかし、以下に挙げられるいくつかの欠点のため、この方法を臨床適用に用いることができない。（１）複数回のＣｓＣｌ勾配精製実行の間にウイルス含有画分を同定するのに必要とされるその時間および努力、（２）生じたウイルスが、セシウムに加えて多くの不純物を含有すること、（３）スケールアップすることに関する妨げ、ならびに（４）精製中の多数の開放ステップ（Ｂｒｕｍｅｎｔら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：６７８（２００２）；Ｃｈａｈａｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３９：６１（２００７）；Ｈｅｒｍｅｎｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１８８５（１９９９）；Ｋａｌｕｄｏｖら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１２３５（２００２）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１４：１１５（２００３）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：５５１（２００５））。ＨｅｒｍｅｎｓらおよびＺｏｌｏｔｕｋｉｎらによって行われた実験は、イオジキサノールと呼ばれる密度勾配媒体が、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーを用いるさらなる精製後にＡＡＶ２を単離することにおいて非常に効果的であることを示した（Ｈｅｒｍｅｎｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１８８５（１９９９）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３（１９９９）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８（２００２））。この系の問題は、他のＡＡＶ血清型、およびヘパリン硫酸に対する親和性を欠くキメラキャプシドを精製することができないことであり、それゆえに、ｒＡＡＶの精製をＣｓＣｌに戻した。ＣｓＣｌを用いずに精製することへのいくつかの他の試みがあり、それには、ウイルスキャプシドのエピトープでの操作（Ｋｏｅｒｂｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：３６７（２００７））、および様々な型のクロマトグラフィー（Ｂｒｕｍｅｎｔら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：６７８（２００２）；Ｃｈａｈａｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３９：６１（２００７）；Ｄａｖｉｄｏｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２１：２０９（２００４）；Ｇａｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２０７９（２０００）；Ｈｅｒｍｅｎｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１８８５（１９９９）；Ｋａｌｕｄｏｖら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１２３５（２００２）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１４：１１５（２００３）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３（１９９９）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８（２００２））が挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーの使用は、いくつかのＡＡＶ血清型の精製で成功を示している。ＢｒｕｍｅｎｔらおよびＤａｖｉｄｏｆｆらは、ＡＡＶ血清型２、５、および８を精製するために２つのカラムシステムを用いた（Ｂｒｕｍｅｎｔら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：６７８（２００２）；Ｄａｖｉｄｏｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２１：２０９（２００４））。Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎらは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを利用するイオン交換に加えて、イオジキサノールの使用が、血清型１、２、および５を精製することができることを示した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８（２００２））。これらの方法は、ＡＡＶ精製において極めて有望であるが、特定された血清型へのみ効果的であった。全ての血清型のＡＡＶを精製することができる普遍的な方法が未だ同定されていない。

本発明は、動物成分を含まない懸濁条件下で成長し、かつ迅速で、スケーラブルで、高力価を生じるＡＡＶ産生系において用いることができ、かつＡＡＶの全ての血清型およびキメラに関して機能する、ＨＥＫ２９３細胞株を提供する。

本発明は、高力価で、高度に純粋で、かつ強力な量のＡＡＶベクターを効率的に生成する、ＡＡＶベクターについてのスケーラブルな製造プロセスの開発に関する。このプロセスの開発は、動物成分を含まない懸濁条件下で成長するＨＥＫ２９３細胞株の作製を含んだ。

本発明の一態様は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１３２７４として寄託されている単離されたＨＥＫ２９３細胞に関する。

本発明の別の態様は、（ａ）本発明のＨＥＫ２９３細胞にＡＡＶ発現系を供給するステップと、（ｂ）ＡＡＶ粒子が産生される条件下で細胞を培養するステップと、（ｃ）任意選択的に、ＡＡＶ粒子を単離するステップとを含む、ＡＡＶ粒子を産生する方法に関する。

本発明のこれらを始めとする態様は、下記の本発明の説明においてより詳細に示されている。

トリプルトランスフェクションのプラスミド比およびトランスフェクション混合物の体積の最適化を示す図である。（Ａ）ＸＸ６８０、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐヘルパー、およびＴＲプラスミドの様々なプラスミド比を探索して、ｒＡＡＶベクター産生のための最適なプラスミド比を決定した。（Ｂ）様々なトランスフェクション混合物の体積を試験し、２：１のトランスフェクション試薬（化学物質または脂質）対ＤＮＡの比、およびあるインキュベーション時間を用いて、最適なトランスフェクション条件を決定した。トランスフェクション混合物のパーセント体積は、最終細胞培養物の体積のパーセントに関している。 細胞密度トランスフェクション最適化実験および細胞培養年齢のベクター産生への影響を示す図である。（Ａ）１×１０^６生細胞／ｍＬおよび２×１０^６生細胞／ｍＬに、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡ（２：１．５：１ ＸＸ６８０：ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐヘルパー：ＴＲプラスミド）をトランスフェクションした。（Ｂ）最適化パラメーターを用いて、低継代細胞、中程度の継代細胞、および高継代細胞をトランスフェクションして、細胞培養年齢が、トランスフェクション効率およびｒＡＡＶ産生に影響するかどうかを決定した。 銀染色およびネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による、カラムクロマトグラフィー後のＡＡＶの溶出ピーク画分の純度を示す図である。 銀染色およびネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による、カラムクロマトグラフィー後のＡＡＶの溶出ピーク画分の純度を示す図である。 最適化産生条件および精製条件を用いた、一本鎖ｒＡＡＶおよび自己相補的ｒＡＡＶの血清型１〜６、８、および９の産生および精製を示す図である。各血清型について、振盪フラスコ中の１リットルの細胞培養物をトランスフェクションした。ＨｅＬａＲＣ３２細胞を用いて、ｖｇ：ＴＵ比に加えて、各血清型について、細胞溶解物の力価および精製後力価を計算した（方法参照）。（Ａ）精製後の一本鎖血清型１〜６、８、および９の銀染色画像。（Ｂ）自己相補的ｒＡＡＶ１〜６、８、および９のサザンブロット。ベクターゲノムを各血清型キャプシドから単離し、アルカリ性アガロースゲル上に流した。 一本鎖ｒＡＡＶおよび自己相補的ｒＡＡＶの血清型１〜６、８、および９のネガティブ染色ＴＥＭ画像を示す図である。各血清型についての充満キャプシド対空キャプシド比を、ネガティブ染色ＴＥＭ画像に基づいて決定した。 １×１０^１１ｖｇのＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９ ＣＢＡ−Ｌｕｃベクターを注射したマウスのインビボ画像を示す図である。ＣＢＡ−ルシフェラーゼベクターを各マウスに尾静脈注射によって投与した。懸濁ＨＥＫ２９３細胞から生成したＣＢＡ−Ｌｕｃベクターを、不連続な密度勾配／カラムクロマトグラフィーにより精製し、接着性ＨＥＫ２９３細胞から生成したベクターを、ＣｓＣｌ密度勾配によって精製した。マウスを、（Ａ）１週間目、および（Ｂ）１カ月目に画像化した。対照マウスにＰＢＳを注射した。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９の光子範囲を、５×１０^６から１×１０^８までに設定した。ＡＡＶ６を、５×１０^４から１×１０^６までに設定した。曝露時間は、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９について１分であり、ＡＡＶ６について５分であった。 精製後の一本鎖ｒＡＡＶベクターおよび自己相補的ｒＡＡＶベクターの濃度を示す図である。（Ａ）濃縮前のｒＡＡＶベクターおよび（Ｂ）濃縮後のｒＡＡＶベクターのネガティブ染色ＴＥＭ画像。 振盪フラスコおよびウェーブバイオリアクターにおいて成長し、トランスフェクションされた懸濁ＨＥＫ２９３細胞を用いる、ｒＡＡＶベクター産生のスケジュールを示す図である。 懸濁ＨＥＫ２９３培地からｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９の連続的な産生および回収を示す図である。全収量は、全ての時点における培地での収量と１２０時間目の細胞ペレットでの収量との合計を表す。４８時間目の細胞ペレット対照は、本明細書に記載されているように、トランスフェクション後４８時間目の標準回収物からの収量を表す。

本発明は、今から、添付の図面を参照して記載され、本発明の好ましい実施形態が示される。しかし、本発明は、異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に示された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が十分で完全であるように、かつ本発明の範囲を当業者に十分伝えるように提供される。

他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書における本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。

ヌクレオチド配列は、他に具体的な指示がない限り、左から右へ５’から３’方向における一本鎖によってのみ本明細書に提示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、どちらも３７ ＣＦＲ§１．８２２および確立された用法に従って、１文字コードか３文字コードのいずれかにより、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会または（アミノ酸について）により推奨される様式で本明細書に表される。例えば、ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ、９９〜１０２（１９９０年１１月）（米国特許商標庁）を参照。

他に指示されている場合を除き、当業者に知られた標準的方法が、ｒＡＡＶ構築物、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ配列を発現するパッケージングベクター、ならびに一過性および安定的にトランスフェクションされるパッケージング細胞の構築に用いられてもよい。そのような技術は当業者に知られている。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）；ＡＵＳＵＢＥＬら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。

さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に示された任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略し得ることを企図する。

＜定義＞
以下の用語は、本明細書における説明および添付の特許請求の範囲において用いられる。

単数形「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、文脈が明らかに他に指示していない限り、複数形もまた含むことを意図される。

さらに、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値に言及するとき、本明細書で用いられる場合の用語「約」は、特定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を含むことを意味する。

また、本明細書で用いられる場合、「および／または」は、関連した列挙された事項の１つ以上の任意のあらゆる可能な組み合わせ、および、選択（「または」）において解釈される場合、組み合わせの欠如を指し、かつ包含する。

本明細書で用いられる場合、移行句「から本質的になる」は、列挙された材料またはステップ、「および請求項に記載される発明の基本的および新規な特性（複数可）（例えば、ｒＡＡＶ複製）に実質的に影響しない材料またはステップ」を包含すると解釈されるべきである。Ｈｅｒｚに関する５３７ Ｆ．２ｄ ５４９、５５１〜５２、１９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ． ４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）を参照（原文では強調）、ＭＰＥＰ§２１１１．０３も参照。したがって、本明細書で用いられる場合、用語「から本質的になる」は、「を含む」と等価として解釈されるべきではない。

本明細書で用いられる場合、用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科を包含し、それには、自己複製パルボウイルスおよびディペンドウイルスが挙げられる。自律的パルボウイルスには、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ属、Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ属、およびＣｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ属のメンバーが挙げられる。例示的な自律的パルボウイルスには、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。他の自律的パルボウイルスは当業者に知られている。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。

ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含有し、そのＡＡＶには、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ １０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、および表１を参照。

本明細書で用いられる場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および知られていない、または後で発見された任意の他のＡＡＶが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。いくつかの比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４）；Ｍｏｒｉｓら、Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４）；および表１を参照）。

様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに天然のＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は当技術分野において知られている。そのような配列は、文献に、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、およびＡＹ５３０５７９を参照されたい。これらの開示は、ＡＡＶ核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために参照することにより本明細書の一部をなすものとする。例えば、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９（１９９９）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３（１９９７）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９（１９９９）；Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４（２００２）；Ｍｏｒｉｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３３：３７５（２００４）；Ｍｏｒｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３３０：３７５（２００４）；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２２１：２０８（１９９６）；Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５（１９９４）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９（１９９８）；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１（２００８）；Ｓｈａｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１（１９８６）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５（１９８３）；Ｘｉａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４（１９９９）；国際公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号もまた参照。これらの開示は、ＡＡＶ核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために参照することにより本明細書の一部をなすものとする。表１もまた参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ３のＩＴＲ配列の初期の記載は、Ｘｉａｏ，Ｘ．、（１９９６）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」、Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡによって提供されている（この文献は全体として本明細書の一部をなすものとする）。

本明細書で用いられる場合、用語「トロピズム」は、ウイルスの細胞への侵入、任意選択的におよび好ましくは、続いて、細胞におけるウイルスゲノムにより運ばれた配列の発現（例えば、転写、および任意選択的に、翻訳）、例えば、組換えウイルスについて、異種ヌクレオチド配列（複数可）の発現を指す。ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは別の方法で制御される核酸配列について、トランス作用性因子の非存在下で開始され得ないことを当業者は認識しているだろう。ＡＡＶの場合、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルスから、組み込まれていないエピソームから、およびウイルスが細胞内に取り込まれ得る任意の他の形態からであってもよい。

本明細書で用いられる場合、ＡＡＶによる細胞の「形質導入」または「感染」は、ＡＡＶが細胞に侵入して、活動性（すなわち、溶解性）感染を確立することを意味する。本明細書で用いられる場合、ＡＡＶによる細胞の「形質導入」は、ＡＡＶが細胞に侵入して、潜伏感染を確立することを意味する。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。

用語「５’部分」および「３’部分」は、２つ以上のエレメントの間の空間的関係を定義するための相対的な用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、他のセグメントの下流にある、そのポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが、たとえそうである場合があるにしても、必ずしも、そのポリヌクレオチドの３’末端にあることを示すわけではなく、またはさらに、それが、必ずしも、そのポリヌクレオチドの３’側の半分内にあることを示すわけでもない。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、他のセグメントの上流にある、そのポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが、たとえそうである場合があるにしても、必ずしも、そのポリヌクレオチドの５’末端にあることを示すわけではなく、またはさらに、それが、必ずしも、そのポリヌクレオチドの５’側の半分内にあることを示すわけでもない。

本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、他に指示がない限り、ペプチドとタンパク質の両方を包含する。

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、（天然ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドの両方を含む）ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ配列であり得る。

本明細書で用いられる場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然の生物体またはウイルスの他の成分の少なくとも一部、例えば、細胞もしくはウイルスの構造成分（例えば、細胞壁または細胞膜）、またはそのポリヌクレオチドと付随して一般的に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から分離されており、またはそれらを実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも約２０％純粋、例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％純粋であるポリヌクレオチドである。

同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然の生物体またはウイルスの他の成分の少なくとも一部、例えば、細胞もしくはウイルスの構造成分（例えば、細胞壁または細胞膜）、またはそのポリペプチドと付随して一般的に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から分離されており、またはそれらを実質的に含まないポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、単離されたポリペプチドは、少なくとも約２０％純粋、例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％純粋であるポリペプチドである。

「治療用ポリペプチド」は、細胞または対象におけるタンパク質の欠如または欠陥に起因する症状を軽減し得、または低下させ得るポリペプチドである。あるいは、「治療用ポリペプチド」は、別の形で対象に利益、例えば、抗癌効果または移植片生着性の向上を与えるポリペプチドである。

本明細書で用いられる場合、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用されるような用語「改変された」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせにより野生型配列と異なる配列を指す。

本明細書で用いられる場合、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法的に同等の語句）は、ウイルスベクターが、出発材料における他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。

用語「処置する」、「処置すること」、または「の処置」（およびそれらの文法的変形）は、対象の状態の重症度が、低下し、少なくとも部分的に改善もしくは安定化すること、および／または少なくとも１つの臨床症状においていくらかの軽減、緩和、減少、もしくは安定化が達成され、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延があることを意味する。

用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」（およびそれらの文法的語尾変化）は、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状（複数可）の発生の予防および／もしくは遅延、ならびに／または本発明の方法の非存在下で生じるであろうことと比較した、疾患、障害、および／もしくは臨床症状（複数可）の発生の重症度の低下を指す。予防は完全、例えば、疾患、障害、および／または臨床症状（複数可）の全ての欠如であり得る。予防はまた、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状（複数可）の存在ならびに／または発生の重症度が本発明の非存在下で生じるであろうことより低いような、部分的でもあり得る。

本明細書で用いられる場合、「処置有効」量は、対象にいくらかの向上または利益を与えるのに十分である量である。もう一つの意味として言えば、「処置有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和、減少、または安定化を与えるだろう量である。治療効果は、いくらかの利益が対象に与えられる限り、完全または治癒的である必要はないことを当業者は認識するだろう。

本明細書で用いられる場合、「予防有効」量は、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生を予防し、および／もしくは遅らせるのに十分であり、ならびに／または本発明の方法の非存在下で生じるであろうことと比較して、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生の重症度を低下させ、および／もしくは遅らせるのに十分である量である。予防のレベルは、いくらかの利益が対象に与えられる限り、完全である必要はないことを当業者は認識しているだろう。

用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書において交換可能に用いられ、ウイルスにおいて天然に存在しない配列を指す。一般的に、異種核酸は、（例えば、細胞または対象への送達のための）関心対象となるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームまたは非翻訳ＲＮＡを含む。

本明細書で用いられる場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」、または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達媒体として機能するウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指し、それは、ビリオン内にパッケージングされるベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む。あるいは、いくつかの文脈において、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡのみを指すように用いられる場合がある。

本発明のウイルスベクターはさらに、国際公開ＷＯ０１／９２５５１（その開示は参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする）に記載されているように、二重鎖ＡＡＶ粒子であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、二本鎖（二重鎖）ゲノムをウイルスキャプシドへパッケージングすることができる。

「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般的に、ウイルスを生成するのにシスに１４５塩基のＩＴＲのみを必要とする。全ての他のウイルス配列は、必要ではなく、トランスに供給されてもよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、１つまたは複数のＩＴＲ配列を保持するのみであるため、ベクターにより効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大にする。構造的タンパク質および非構造的タンパク質をコードする配列は、トランスに（例えば、プラスミドなどのベクターから、またはその配列をパッケージング細胞へ安定的に組み込むことにより）供給されてもよい。本発明の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列）、任意選択的に２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、そのＩＴＲは、典型的には、ベクターゲノムの５’末端および３’末端にあり、異種核酸に隣接するが、それに接触している必要はない。ＩＴＲは、同じ、または互いに異なり得る。

「ＡＡＶ発現系」は、適切な宿主細胞に導入された場合、ｒＡＡＶの産生を支持するのに十分である１つまたは複数のポリヌクレオチドの系である。ＡＡＶ発現系は、典型的には、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードするポリヌクレオチド、ヘルパー遺伝子、およびｒＡＡＶゲノムを含む。ＡＡＶ発現系の１つの例は、トリプルトランスフェクション方法である。

用語「末端反復」または「ＴＲ」は、任意のウイルス末端反復、またはヘアピン構造を形成し、かつ末端逆位配列として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を媒介する）合成配列を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲまたは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得る。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のＩＴＲなどの非ＡＡＶ ＩＴＲ配列、またはＳＶ４０複製開始点としての役割を果たすＳＶ４０ヘアピンを、ＩＴＲとして用いることができ、それらはさらに、切り詰め、置換、欠失、挿入、および／または付加によって改変することができる。さらに、ＩＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載されているように、「二重Ｄ配列」などの部分的または完全な合成であり得る。

ＡＡＶゲノムは、それらの５’末端および３’末端の両方においてパリンドローム配列を有する。その配列のパリンドロームの性質は、相補性塩基対の間の水素結合の形成により安定化されるヘアピン構造の形成をもたらす。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」の形をとると考えられている。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章および７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。

「ＡＡＶ末端逆位配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、任意のＡＡＶ由来であってもよく、そのＡＡＶには、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または、現在知られているか、後に発見される他の任意のＡＡＶが挙げられるが、それらに限定されない（例えば、表１参照）。ＡＡＶ ＩＴＲは、末端反復が所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなどを媒介する限り、天然の末端反復配列を有する必要はない（例えば、天然ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、切り詰め、および／またはミスセンス変異によって変化してもよい）。

本発明のウイルスベクターはさらに、国際公開ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９（２０００）に記載されているように、「標的にされる」ウイルスベクター（例えば、定方向トロピズムを有する）および／または「ハイブリッド」ＡＡＶ（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスキャプシドが、異なるＡＡＶまたは他のパルボウイルス由来である）であり得る。他の実施形態において、ウイルスベクターは、「キメラ」ＡＡＶである（すなわち、キャプシドタンパク質が、２つ以上の血清型由来であり、および／またはキャプシドタンパク質が、２つ以上の血清型由来の配列を含有するように改変されている）。

さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失、および／または置換を含む他の改変を含有することができる。

用語「鋳型」または「基質」は、複製されてＡＡＶウイルスＤＮＡを産生し得るポリヌクレオチド配列を指すように本明細書において用いられる。ベクター産生を目的として、鋳型は、典型的には、より大きいヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれ、そのより大きいヌクレオチド配列または構築物には、プラスミド、裸のＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスのベクターなど）が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、鋳型は、パッケージング細胞の染色体へ安定的に組み入れられてもよい。

本明細書で用いられる場合、ＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新しいウイルス粒子の産生を媒介するＡＡＶ非構造タンパク質をコードする核酸配列を示す。ＡＡＶ複製遺伝子およびＡＡＶ複製タンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章および７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。

「Ｒｅｐコード配列」は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の全部をコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関して、Ｒｅｐコード配列は、全ての４つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードする必要はなく、実際、ＡＡＶ５だけは、スプライシングされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質を発現すると考えられている。代表的な実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、ウイルスゲノム複製および新しいビリオンへのパッケージングに必要である少なくともそれらの複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般的に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８、ならびにＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに他の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８とＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８とＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２タンパク質、またはＲｅｐ７８とＲｅｐ４０タンパク質をコードする。

本明細書で用いられる場合、用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。大きなＲｅｐタンパク質は、野生型でも合成のいずれでもよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、任意のＡＡＶ由来であってもよく、そのＡＡＶには、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１３、または、現在知られているか、後に発見される他の任意のＡＡＶが挙げられるが、それらに限定されない（例えば、表１参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、切り詰め、および／またはミスセンス変異によって変化してもよい。

複製タンパク質が同じポリヌクレオチドによってコードされる必要がないことは、当業者はさらに認識しているだろう。例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーターは、不活性化されてもよく、大きなＲｅｐタンパク質（複数可）は１つのポリヌクレオチドから発現して、小さなＲｅｐタンパク質（複数可）は異なるポリヌクレオチドから発現してもよい。しかしながら、典型的には、単一の構築物から複製タンパク質を発現することはより便利であろう。いくつかの系において、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は細胞によって認識されない場合があり、それゆえに、大きなＲｅｐタンパク質および小さなＲｅｐタンパク質を別々の発現カセットから発現する必要がある。他の場合において、大きなＲｅｐタンパク質および小さなＲｅｐタンパク質を別々に、すなわち、別々の転写および／または翻訳調節エレメントの調節下で、発現することが望ましい場合がある。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きなＲｅｐタンパク質の比率を減少させるために、大きなＲｅｐタンパク質の発現を調節することが望ましい場合がある。昆虫細胞の場合、細胞に対する毒性を避けるために大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方制御することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５（２００２）参照）。

本明細書で用いられる場合、ＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能的ＡＡＶキャプシドを形成する（すなわち、ＤＮＡをパッケージングして、標的細胞に感染することができる）構造タンパク質をコードする。典型的には、ｃａｐコード配列は、ＡＡＶキャプシドサブユニットの全部をコードするものであるが、機能的キャプシドが産生される限り、キャプシドサブユニットの全部より少ないサブユニットが、コードされてもよい。必ずしもそうではないが、典型的には、キャップコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。ＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２巻、６９章および７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に、より詳細に記載されている。

本明細書で用いられる場合、用語「動物成分を含まない」は、血清、酵素、糖質、核酸、タンパク質、抗体、細胞外マトリックスなどを含む動物または動物細胞から抽出または精製された任意の産物を含有しない培地または他の組成物を指す。

＜懸濁ＨＥＫ２９３細胞株＞
高力価で高度に純粋なｒＡＡＶを産生するためのスケーラブルな製造技術を生み出そうとする努力において、動物成分を含まない懸濁条件下で成長するＨＥＫ２９３細胞株を開発した。この細胞株を、認定されたマスターセルバンクから開発した。動物成分を含まない懸濁条件での成長への適応後、懸濁ＨＥＫ２９３細胞株は、効率的トランスフェクションおよびｒＡＡＶ産生の能力を維持した。

したがって、本発明の一態様は、ブダペスト条約により、２０１２年１０月２３日にＡＴＣＣ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、２０１０８に寄託された（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１３２７４）、単離されたＨＥＫ２９３細胞に関する。

一実施形態において、細胞株は、１０ｍｌ（例えば、振盪フラスコ内において）から１０Ｌまで、５０Ｌまで、１００Ｌまでの、またはそれを超える（例えば、バイオリアクター内において）任意の体積の培地において培養するのに適している。細胞株は、ＡＡＶの全ての血清型、キメラ、およびハイブリッド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ならびにそれらの任意のキメラおよび／またはハイブリッド、例えば、ＡＡＶ１−１３ ２．５、２ｉ８、９．４５、および他のキメラキャプシドまたはハイブリッドキャプシドの産生に適している。

特定の実施形態において、細胞株は、精製前の細胞あたり少なくとも約４×１０^４個のベクターゲノム含有粒子、例えば、精製前の細胞あたり少なくとも約１×１０^５個のベクターゲノム含有粒子を提供するＡＡＶ産生方法において用いることができる。他の実施形態において、細胞株は、１リットルの細胞培養物あたり少なくとも約１×１０^１２個の精製されたベクターゲノム含有粒子、例えば、１リットルの細胞培養物あたり少なくとも約１×１０^１３個または１×１０^１４個の精製されたベクターゲノム含有粒子を提供するＡＡＶ産生方法において用いることができる。

＜ウイルスベクターを産生する方法＞
本発明はさらに、ウイルスベクターを産生する方法を提供する。一態様において、本発明は、（ａ）本発明のＨＥＫ２９３細胞にＡＡＶ発現系を供給するステップと、（ｂ）ＡＡＶ粒子が産生される条件下で前記細胞を培養するステップと、（ｃ）任意選択的にＡＡＶ粒子を単離するステップとを含む、ＡＡＶ粒子を産生する方法に関する。一実施形態において、細胞は懸濁状態で培養される。別の実施形態において、細胞は、動物成分を含まない条件で培養される。動物成分を含まない培地は、ＨＥＫ２９３細胞に適合する任意の、動物成分も含まない培地（例えば、無血清培地）であり得る。例として、非限定的に、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ２９３（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＣ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＰｒｏ２９３−Ｓ（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。

ＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶ鋳型の複製およびＡＡＶキャプシドへのキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）、ならびにアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これらのＩＴＲ配列は、異種核酸配列の５’側および３’側に位置するが、それに直接、接触している必要はない。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、国際公開ＷＯ０１／９２５５１に記載されているように、二重鎖ＡＡＶベクターを作製するためにＲｅｐによって分離されないＩＴＲを含む。

ＡＡＶ鋳型ならびにＡＡＶのｒｅｐ配列およびｃａｐ配列は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージングされたＡＡＶ鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で産生されるような条件下で提供される。この方法は、培養物からウイルスベクターを収集するステップをさらに含むことができる。一実施形態において、ウイルスベクターは、例えば、細胞を培地から、例えば細胞をペレット化することにより、取り出した後、細胞を溶解することにより収集することができる。別の実施形態において、ウイルスベクターは、例えば、細胞から分泌されるベクターを単離するために、細胞が培養される培地から収集することができる。培地の一部または全部は、例えば、トランスフェクションから約４８時間後に開始して、１回、または１回より多く、例えば、ｒＡＡＶの収集のための培養ステップ中に一定間隔（細胞生存率およびベクター産生に適合する１２時間ごと、１８時間ごと、２４時間ごと、もしくは３６時間ごと、またはより長い延長した時間ごとなど）で、培養物から取り出すことができる。培地の取り出し後、追加の栄養補助剤を含む、または含まない新鮮な培地を培養物へ加えることができる。一実施形態において、細胞は、培地が細胞の上を絶えず流れ、かつ分泌されたｒＡＡＶの単離のために収集されるような灌流システムで培養することができる。ｒＡＡＶの培地からの収集は、トランスフェクションされた細胞が生き残っている間、例えば、トランスフェクション後４８時間、７２時間、９６時間、もしくは１２０時間、またはそれを超えて継続することができる。特定の実施形態において、分泌されたｒＡＡＶの収集は、産生細胞に結合せず、または緩くのみ結合するＡＡＶの血清型（ＡＡＶ８またはＡＡＶ９など）に関して実行される。他の実施形態において、分泌されたｒＡＡＶの収集は、それらが産生される細胞に結合しないように改変されている、ヘパリン結合性血清型のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）に関して実行される。適切な改変、およびｒＡＡＶ収集技術の例は、米国特許出願公開第２００９／０２７５１０７号に開示されており、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。

ＡＡＶ複製およびキャプシド配列は、当技術分野において知られた任意の方法によって供給され得る。最新プロトコールは、典型的には、単一のプラスミド上にＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に供給される必要はないが、そのようにすることが便利な場合がある。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって供給され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって供給され得る（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域へ挿入される）。ＥＢＶベクターもまた、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を発現するために用いられてもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続的な細胞分裂を通して高コピー数を維持する（すなわち、「ＥＢＶに基づいた核エピソーム」と名付けられた、染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７（１９９２）参照）ことである。

さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞に安定的に組み入れられてもよい。

典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲに隣接されていない。

ＡＡＶ鋳型は、当技術分野において知られた任意の方法を用いて細胞へ供給することができる。例えば、鋳型は、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失アデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域へ挿入される）。別の例証として、Ｐａｌｏｍｂｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５０２５（１９９８）は、ＡＡＶ ＴＲに隣接されたレポーター遺伝子を有するバキュロウイルスベクターを記載する。ＥＢＶベクターもまた、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上で記載されているように、鋳型を送達するために用いられてもよい。

別の代表的な実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、複製するｒＡＡＶウイルスによって供給される。さらに他の実施形態において、ＡＡＶ鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み込まれる。

ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が、細胞へ供給され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野において知られている。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって供給される。あるいは、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５（１９９７）、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および米国特許第６，０９３，５７０号によって記載されているように効率的なＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子の全部を有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして供給され得る。

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または安定的な染色体外エレメントとして維持されたヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって供給され得る。一般的に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされ得ず、例えば、ＴＲに隣接されていない。

ＡＡＶ複製およびキャプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を単一のヘルパー構築物上に供給することが有利であり得ることは、当業者は認識しているだろう。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物でもウイルス構築物でもよい。一つの非限定的例証として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。

一つの特定の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターはＡＡＶ鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはＡＡＶ鋳型は、そのアデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａ領域またはＥ３領域）に挿入することができる。

さらなる実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ＡＡＶ鋳型は、プラスミド鋳型として供給され得る。

別の例証的な実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給され、ＡＡＶ鋳型は、プロウイルスとして細胞に組み込まれる。あるいは、ＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づいた核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって供給される。

さらなる例示的な実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって供給される。ＡＡＶ鋳型は、別個の複製ウイルスベクターとして供給され得る。例えば、ＡＡＶ鋳型は、ＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって供給され得る。

前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’のシス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在するなら、ＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスバックボーン内に埋め込まれており、これらの配列がアデノウイルスキャプシドにパッケージングされ得るように、５’および３’のシス配列に隣接されている。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、一般的に、これらの配列がＡＡＶビリオンにパッケージングされないようにＴＲに隣接されていない。

Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４（２００１）は、アデノウイルスとＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子との両方を含むキメラヘルパーを記載する。

ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして用いられてもよい。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、有利なことには、スケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを促進し得る。ＡＡＶ−２のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６（１９９９）およびＷＯ００／１７３７７）。

ヘルパーウイルスの混入がないＡＡＶベクターストックは、当技術分野において知られた任意の方法によって得られ得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３（１９９９））。欠失した複製欠損ヘルパーウイルスは、いかなる混入するヘルパーウイルスも複製能を有しないように、用いることができる。さらなる代替として、アデノウイルス初期遺伝子発現のみがＡＡＶのパッケージングを媒介するために必要とされるため、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが用いられてもよい。後期遺伝子発現について不完全であるアデノウイルス変異体は当技術分野において知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

代表的な実施形態において、本発明の方法は、完全にスケーラブルであり、したがって、それは、任意の所望の体積の培地において、例えば、１０ｍｌ（例えば、振盪フラスコ内において）から１０Ｌまで、５０Ｌまで、１００Ｌまで、またはそれを超えて（例えば、ウェーブバイオリアクターシステムおよび撹拌タンクなどのバイオリアクター内において）、実行することができる。

この方法は、ＡＡＶの全ての血清型およびキメラ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびそれらの任意のキメラの産生に適している。

特定の実施形態において、方法は、精製前の細胞あたり少なくとも約１×１０^４個のベクターゲノム含有粒子、例えば、精製前の細胞あたり少なくとも約２×１０^４個、３×１０^４個、４×１０^４個、５×１０^４個、６×１０^４個、７×１０^４個、８×１０^４個、９×１０^４個、もしくは１×１０^５個の、またはそれを超えるベクターゲノム含有粒子を提供する。他の実施形態において、方法は、１リットルの細胞培養物あたり少なくとも約１×１０^１２個の精製されたベクターゲノム含有粒子、例えば、１リットルの細胞培養物あたり少なくとも約５×１０^１２個、１×１０^１３個、５×１０^１３個、または１×１０^１４個の、またはそれを超える精製されたベクターゲノム含有粒子を提供する。

＜組換えウイルスベクター＞
本発明により産生されたウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの核酸の細胞への送達に有用である。特に、ウイルスベクターは、有利には、哺乳動物を含む動物の細胞に核酸を送達し、または移入するために用いることができる。

関心対象となる任意の異種核酸配列（複数可）が、本発明により産生されたウイルスベクターにおいて送達され得る。関心対象となる核酸には、レポーター、治療用（例えば、医学的用途または獣医学的用途のため）、免疫原性（例えば、ワクチンのため）、または診断用のポリペプチドまたはＲＮＡを含む、ポリペプチドまたはＲＮＡをコードする核酸が挙げられる。

さらなる代替として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞において望ましく産生される任意のポリペプチドまたはＲＮＡをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞に導入され得、発現した遺伝子産物がそこから単離され得る。

関心対象となる異種核酸（複数可）は、適切な調節配列と作動可能に関連づけられ得ることは当業者によって理解されているだろう。例えば、異種核酸は、転写／翻訳調節シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどの発現調節エレメントと作動可能に関連づけることができる。

様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、望まれるレベルおよび組織特異的発現に依存して用い得ることは、当業者は認識しているだろう。プロモーター／エンハンサーは、望まれる発現のパターンに依存して、構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、本来のもの、または外来であり得、天然または合成の配列であり得る。外来により、転写開始領域が、その転写開始領域を導入されている野生型宿主において見出されないことが意図される。

特定の実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または処置される対象にとって本来であり得る。代表的な実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にとって本来であり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般的に、それが、関心対象となる標的細胞（複数可）において機能するように選択される。さらに、特定の実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的でも誘導性でもよい。

誘導性発現調節エレメントは、典型的には、異種核酸配列（複数可）の発現に対して制御を与えることが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または組織優先的プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、それらには、（心臓、骨格、および／または平滑筋に特異的または優先的を含む）筋肉に特異的または優先的、（脳に特異的または優先的を含む）神経組織に特異的または優先的、（網膜特異的および角膜特異的を含む）眼に特異的または優先的、肝臓に特異的または優先的、骨髄に特異的または優先的、膵臓に特異的または優先的、脾臓に特異的または優先的、および肺に特異的または優先的なプロモーター／エンハンサーエレメントが挙げられる。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。

異種核酸配列（複数可）が、標的細胞において転写され、その後、翻訳される実施形態において、特異的な開始シグナルが、一般的に、挿入されるタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得る、これらの外因性翻訳調節配列は、様々な起源、天然と合成のどちらでもあり得る。

本発明により産生されるウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範囲の細胞へ異種核酸を送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、インビトロでポリペプチドを産生するために、またはエクスビボの遺伝子治療のために、インビトロで関心対象となる核酸を細胞に送達するために用いることができる。ウイルスベクターは、追加として、例えば、免疫原性または治療用のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを発現させるために、核酸を、それを必要としている対象に送達する方法において有用である。この様式において、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡは、対象においてインビボで産生され得る。対象は、その対象がそのポリペプチドを欠損しているため、そのポリペプチドを必要とし得る。さらに、方法は、対象におけるポリペプチドまたは機能性ＲＮＡの産生がいくらかの有益な効果を分け与える可能性があるため、実施することができる。

ウイルスベクターはまた、培養細胞において、または対象において（例えば、スクリーニング方法と関連して、例えば、ポリペプチドを産生するために、または機能性ＲＮＡの対象への効果を観察するために、対象をバイオリアクターとして用いて）、関心対象となるポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを産生するために用いることができる。

本発明を記載してきたが、同じことが、以下の実施例においてより詳細に説明される。実施例は、例証を目的としてのみ本明細書に含まれ、本発明を限定することを意図するものではない。

［材料および方法］
〔接着性ＨＥＫ２９３細胞の認定マスターセルバンクからの懸濁ＨＥＫ２９３細胞の誘導。〕親ＨＥＫ２９３マスターセルバンク（ＭＣＢ）からの懸濁細胞株の誘導を、クラス１０，０００のクリーンルーム設備において実施した。懸濁細胞株の誘導を、まず、ウシ血清を含有する培地から細胞を離脱させること、およびその後、ＨＥＫ２９３細胞と適合性の無血清の懸濁培地に細胞を適応させることを含む２段階プロセスで実行した。懸濁細胞株を以下の通り作製した。まず、認定マスターセルバンク（ＭＣＢ）のバイアルを解凍し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ培地における培養へ入れ、細胞を凍結／解凍サイクルから回復させるように数日間、培養した。組織培地中のＦＢＳの量を１０％から２．５％まで徐々に低下させながら、ＭＣＢ細胞を、４週間にわたって、培養し、継代した。その後、細胞を、ＤＭＥＭ ２．５％ＦＢＳから無血清懸濁培地へ移し、振盪フラスコ内で成長させた。その後、細胞を、それらの成長率および生存率をモニターしながら、無血清培地においてさらに３週間、培養した。その後、適応した細胞を増殖し、凍結した。続いて、このセルバンクからのいくつかのバイアルを解凍し、ｒＡＡＶベクターを生成するための振盪フラスコおよびウェーブバイオリアクターシステムを用いるスケーラブルな製造プロセスを生み出すプロセス開発研究中に用いた。懸濁ＨＥＫ２９３細胞を、振盪フラスコおよびウェーブバイオリアクターバッグにおいて成長と高いトランスフェクション効率の両方を支持する無血清懸濁培地中で成長させた。Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｓｈａｋｅｒ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＡＴＲ）を、（細胞培養体積に基づいた）特定のｒｐｍ振盪速度、８０％湿度、および５％ＣＯ_２における細胞の維持およびｒＡＡＶベクターの生成に用いた。

〔懸濁ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション。〕トランスフェクションの日に、細胞を、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてカウントし、トランスフェクションのために希釈した。トランスフェクション混合物を混合するために、以下の試薬を、この順番でコニカルチューブに加えた。プラスミドＤＮＡ、ＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）またはＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）、または他の無血清適合性トランスフェクション培地、およびその後、プラスミドＤＮＡに対する特定の比率でのトランスフェクション試薬。ｐＸＲシリーズのヘルパープラスミドを、これらの研究に用いて、複数のｒＡＡＶ血清型のベクターを作製した（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１（２００２））。室温でインキュベートする前に、混合物を反転させて混合した。その後、トランスフェクション混合物をフラスコにピペッティングし、振盪機／インキュベーターに戻した。全ての最適化研究を３０ｍＬの培養体積で実行し、続いて、より大きい培養体積で確認した。トランスフェクションから４８時間後、細胞を回収した。

〔ウェーブバイオリアクターシステムを用いるｒＡＡＶの産生。〕トランスフェクションの２日前にウェーブバッグに播種した。ウェーブバックの播種から２日後、細胞培養物をカウントし、その後、その細胞培養物を、トランスフェクション前に増殖／希釈した。その後、ウェーブバイオリアクター細胞培養物をトランスフェクションした。トランスフェクションから少なくとも４８時間後、ウェーブバイオリアクターバッグから細胞培養物を回収した。

〔フローサイトメトリーを用いるトランスフェクション効率／ＧＦＰ発現の分析。〕トランスフェクションから約２４時間後、１ｍＬの細胞培養物を、各フラスコまたはウェーブバイオリアクターバッグから取り出し、加えて、トランスフェクションされていない対照も同様にした。試料を、Ｄａｋｏ Ｃｙａｎフローサイトメーターを用いて分析した。

〔振盪フラスコおよびウェーブバイオリアクターバッグからの懸濁細胞の回収。〕トランスフェクションから４８時間後、細胞培養物を、振盪フラスコから注ぐか、またはウェーブバイオリアクターバッグからポンプでくみ上げるかのいずれかにより、５００ｍＬポリプロピレンコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へ収集した。その後、細胞培養物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心機およびＨ６０００Ａローターを用いて６５５×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を捨て、細胞を、１×ＰＢＳ中に再懸濁し、５０ｍＬコニカルチューブへ移し、６５５×ｇで１０分間、遠心分離した。この時点で、ペレットをＮＬＴ−６０℃で保存するか、または精製を通して継続させるかのいずれもできた。

〔ｑＰＣＲを用いる細胞溶解物からのｒＡＡＶの力価決定。〕１０ｍＬの細胞培養物を取り出し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心機およびＨ６０００Ａローターを用いて６５５×ｇで１０分間、遠心分離した。細胞ペレットから上清をデカントした。その後、細胞ペレットを５ｍＬのＤＮアーゼ緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ_２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）中に再懸濁し、続いて、細胞を効率的に溶解するために超音波処理を行った。その後、３００μＬを取り出し、１．５ｍＬのマイクロチューブへ入れた。その後、１４０ユニットのＤＮアーゼＩを各試料に加え、３７℃で１時間、インキュベートした。ＤＮアーゼ消化の有効性を決定するために、４〜５μｇのＴＲｅＧＦＰプラスミドを、ＤＮアーゼの添加ありおよび添加なしのトランスフェクションされていない細胞溶解物へスパイクした。その後、５０μＬのＥＤＴＡ／サルコシル溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を各チューブへ加え、７０℃で２０分間、インキュベートした。その後、５０μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、５５℃で少なくとも２時間、インキュベートした。その後、試料を１５分間、煮沸して、プロテイナーゼＫを不活性化した。ｑＰＣＲにより分析するために、アリコートを各試料から取り出した。どれくらいの量のｒＡＡＶベクターが細胞あたり生成されたかを効果的に決定するために、２つのｑＰＣＲ反応を実行した。１つのｑＰＣＲ反応を、プラスミドＸＸ６８０、ｐＸＲ２、およびＴＲｅＧＦＰのバックボーン上の相同配列に結合するように設計された１セットのプライマーを用いて設定した。第２のｑＰＣＲ反応を、ｅＧＦＰ遺伝子内の領域を結合して増幅する１セットのプライマーを用いて設定した。ｑＰＣＲを、Ｓｙｂｒグリーン試薬およびＲｏｃｈｅ製のＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて行った。試料を、９５℃で１０分間、変性させ、続いて、４５サイクル（９０℃で１０秒間、６２℃で１０秒間、および７２℃で１０秒間）行い、融解曲線分析を行った（１サイクル、９９℃で３０秒間、６５℃で１分間連続）。

〔粗溶解物からのｒＡＡＶの精製。〕各細胞ペレットを、１０ｍＬの最終体積に調整した。ペレットを短時間、ボルテックスし、３０％収率で、１秒間オン、１秒間オフのバーストで４分間、超音波処理した。超音波処理後、５５０ＵのＤＮアーゼを加えて、３７℃で４５分間、インキュベートした。その後、ペレットを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｂ遠心機およびＨＳ−４ローターを用いて９４００×ｇで遠心分離して、細胞片をペレット化し、清澄化された溶解物を、Ｔｙｐｅ７０Ｔｉ遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ ３６１６２５）に移した。ｒＡＡＶの単離のための懸濁ＨＥＫ２９３細胞の回収および溶解に関して、当業者は、微少溶液操作などの機械的方法または界面活性剤などの化学的方法などを、続いて、深層濾過または接線流濾過（ＴＦＦ）を用いる清澄化ステップを用いることができる。

〔ＡＡＶベクター精製。〕清澄化ＡＡＶ溶解物を、当業者が知っているだろうし、かつ以下の原稿（Ａｌｌａｙら、Ｄａｖｉｄｏｆｆら、Ｋａｌｕｄｏｖら、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｚｏｌｏｔｕｋｉｎらなど）に記載されているように、カラムクロマトグラフィー方法によって精製した。

〔ドットブロットを用いるｒＡＡＶの力価決定。〕１００μＬのＤＮアーゼ緩衝液（１４０ユニットのＤＮアーゼ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。１〜３μＬまたは段階希釈のウイルスを各ウェルに加え、３７℃で３０分間、インキュベートした。その後、試料に、１５μＬサルコシル／ＥＤＴＡ溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を追加し、７０℃に２０分間、置いた。次に、１５μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、５０℃で少なくとも２時間、インキュベートした。１２５μＬのＮａＯＨ緩衝液（８０ｍＭのＮａＯＨ、４ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を各ウェルに加えた。一連の導入遺伝子特異的標準を、希釈系列により作製した。その後、ＮａＯＨ緩衝液を加え、インキュベートした。ナイロン膜を、室温で０．４ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中でインキュベートし、その後、ドットブロット装置上に設置した。ＮａＯＨ緩衝液中での１０〜１５分間のインキュベーション後、試料および標準を、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ ＰｌｕｓＲハイブリダイゼーション転写膜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上のドットブロット装置内にロードした。その後、試料を、減圧を用いて膜へアプライした。ナイロン膜を、０．４ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に浸漬し、その後、ＵＶ ｓｔｒａｔａ ｌｉｎｋｅｒ １８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を６００ ｕｊｏｕｌｓｘ１００で用いて架橋させた。その後、膜を、ＣＨＵＲＣＨ緩衝液（１％ＢＳＡ、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．５）中、プレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション後、膜を、^３２Ｐ−ＣＴＰ標識導入遺伝子プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット）と一晩、ハイブリダイズさせた。次の日、膜を、低ストリンジェンシーＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）および高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄した。その後、それをホスフォイメージャースクリーン上に露光させ、ＳＴＯＲＭ８４０スキャナ（ＧＥ）を用いてデンシトメトリーについて分析した。

〔銀染色方法を用いるｒＡＡＶベクター純度の分析。〕精製されたベクターからの試料を、ＮｕＰａｇｅ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードし、１×ＮｕＰａｇｅランニング緩衝液を用いて流した。典型的には、ウェルあたり１×１０^１０個の粒子をロードした。ゲルを、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ銀染色キット＃ＬＣ６１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。

〔アルカリ性ゲル電気泳動およびサザンブロットを用いる自己相補的ゲノムの分析。〕簡単に述べれば、精製された自己相補的ｒＡＡＶを、２００μＬのＤＮアーゼＩ緩衝液（１４０ユニットのＤＮアーゼ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）に加え、３７℃で６０分間、インキュベートし、続いて、３０μＬのＥＤＴＡ サルコシル／ＥＤＴＡ溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を加えることによりＤＮアーゼを不活性化し、７０℃に２０分間、置いた。その後、２０μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）を試料に加え、５０℃で最低２時間、インキュベートした。フェノール／クロロホルムを、１：１比で加え、続いて、ウイルスベクターＤＮＡのエタノール沈殿を行った。その後、ペレット化ＤＮＡを、変性のためにアルカリ性緩衝液（５０ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁し、１％アルカリ性アガロースゲル上にロードし、２５Ｖで一晩、流した。その後、ゲルを、アルカリ性転写緩衝液（０．４ＭのＮａＯＨ、１ＭのＮａＣｌ）中で平衡化させ、ベクターＤＮＡのＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ ＰｌｕｓＲハイブリダイゼーション転写膜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）への一晩の転写を経てサザンブロットを実施した。その後、膜を、１ＭのＮａＣｌを含む０．５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５を用いて中和し、^３２Ｐ−ＣＴＰ標識導入遺伝子プローブと一晩、ハイブリダイズさせた。前に記載されているように膜を洗浄した後、膜を、ホスフォイメージャースクリーンに露光させ、ＳＴＯＲＭ８４０スキャナを用いて分析した。

〔形質導入アッセイ。〕ＨｅＬａＲＣ−３２細胞（Ｃｈａｄｅｕｆら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２：２６０（２０００））を、２×１０^５細胞／２４ウェルプレートのウェルで蒔き、３７℃で一晩、インキュベートした。細胞は、９０〜１００％のコンフルエンスが観察された。２％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む５０ｍＬのＤＭＥＭをあらかじめ温めておき、アデノウイルス（ｄｌ３０９）を、１０のＭＯＩで加えた。ｄｌ３０９を含有する培地を、９００μＬ分ずつ分注し、一連の１０倍希釈でｒＡＡＶを希釈するために用いた。その後、ｒＡＡＶを４００μＬで蒔き、３７℃で４８時間、インキュベートさせておいた。ｅＧＦＰ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶについて、ＧＦＰ陽性細胞を、蛍光顕微鏡を用いてカウントした。ルシフェラーゼ導入遺伝子を含有するｒＡＡＶについて、培地を細胞から吸引し、１００μＬの受動的溶解緩衝液を加えた。細胞を−８０℃で凍結し、その後、３７℃で解凍して、細胞溶解を助けた。その後、５０μＬの細胞溶解物を、５０μＬのルシフェリンと共に、不透明な９６ウェルプレートへピペッティングした。その後、細胞を、Ｗａｌｌａｃプレートリーダー上で相対光単位について読み取った。

〔濃度アッセイ。〕出発のベクターストックをサンプリングし、ｖｉｖａｓｐｉｎカラム上にロードし、４７０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｈ１０００Ｂ）で、１０分間隔で遠心分離した。いったん所望の体積／濃度が達成されたならば、膜の両側を残余分ですすぎ、その残余分をその後、回収した。予備濃縮および濃縮されたｒＡＡＶの試料を採取して、物理的力価および形質導入単位を決定した。

〔ネガティブ染色されたｒＡＡＶ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）。〕電子顕微鏡法は、ウイルス粒子の直接的可視化を可能にする。精製された透析ｒＡＡＶベクターを、４００メッシュグロー放電炭素グリッド上に、ウイルスの２０μＬの液滴上にグリッドを反転させることにより、置いた。その後、グリッドを、ｄｄＨ_２Ｏの２０μＬ液滴上での反転により、続いて、２％酢酸ウラニルの２０μＬの液滴上での３０秒間のグリッドの反転により、２回洗浄した。グリッドの端にＷｈａｔｍａｎペーパーを優しく当てることにより、グリッドを吸い取り乾燥させる。各ベクターを、Ｚｅｉｓｓ ＥＭ ９１０電子顕微鏡を用いて可視化した。

［懸濁ＨＥＫ２９３細胞株の開発］
この研究の目的は、一過性トランスフェクションテクノロジーおよび哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞を用いて、高力価かつ高度に純粋なｒＡＡＶを産生するためのスケーラブルな製造テクノロジーを生み出すことであった。初めに、本発明者らの認定されたマスターセルバンク由来の接着性ＨＥＫ２９３細胞株を、実施例１に記載されているように、動物成分を含まず、かつ抗生物質を含まない懸濁条件で成長するように適応させた。動物成分を含まない懸濁条件への適応、および適合性の動物成分を含まない懸濁培地の選択後、懸濁ＨＥＫ２９３細胞株は、効率的なトランスフェクションおよびｒＡＡＶ産生についてのそれの能力を維持した。

［トランスフェクション条件の最適化］
一過性トランスフェクションを用いるｒＡＡＶの産生のための主要な必要条件のうちの２つは、３つのプラスミドの最適なプラスミド比、および全ＤＮＡに対するトランスフェクション試薬の比を決定することである。トランスフェクション試薬は、化学物質に基づいたもの（例えば、リン酸カルシウムまたはポリエチレンイミン）、または生物学的／脂質に基づいたもの（例えば、２９３フェクチン、リポフェクタミンなど）であり得る。懸濁ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの日、最初に、１２５ｍＬの振盪フラスコ内で３０ｍＬ体積の無血清培地−１中で成長させた。ＸＸ６８０：Ｒｅｐ／Ｃａｐ：ＴＲｅＧＦＰの様々な比を、１ｍＬの細胞あたり１μｇのＤＮＡについて２：１および４：１のトランスフェクション試薬対ＤＮＡの比を用いて試験し、室温でインキュベートした。図１Ａで示されているように、２：１のトランスフェクション試薬対ＤＮＡ比を用いた、２：１．５：１のプラスミド比が、細胞あたり最も多いベクターゲノム（ｖｇ）を生成した。細胞溶解物からのｖｇ／細胞を、実施例１に記載されているように、ｑＰＣＲ方法を用いて決定した。４：１のトランスフェクション試薬対ＤＮＡ比が、試験された全てのプラスミド比において、最も少ない量のｖｇ／細胞を生成したことは明らかであった。これは、Ｂｅｃｋｍａｎ ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ生存率アナライザーにより検出された、トランスフェクション後のより低い細胞生存率のせいである可能性が最も高く、トランスフェクション試薬で毒性のレベルに達したことを示唆した。さらに、４：１のトランスフェクション試薬対ＤＮＡ比は、トランスフェクション後、より大きい細胞凝集物をもたらした。

いくつかの市販のトランスフェクションプロトコールは、トランスフェクション混合物の体積の重要性、およびどれくらいそれがトランスフェクション効率に影響し得るかを記載している。どれくらいトランスフェクション混合物の体積がこれらの細胞に影響を及ぼすかを決定するために、２％、５％、および１０％のトランスフェクション混合物の体積を選択した。％体積は、振盪フラスコ内の最終細胞培養物体積に基づいている。例えば、最適なトランスフェクション混合物の体積を決定するために３０ｍＬ培養物を用い、１０％トランスフェクション混合物については、２７ｍＬの細胞培養物を振盪フラスコに入れ、トランスフェクション混合物は３ｍＬであった。図１Ｂに示されているように、５％トランスフェクション混合物の体積が、より良い（ＧＦＰフローサイトメトリーに基づく）トランスフェクション効率を生じることが示され、かつ最も多いｖｇ／細胞を生成した。

［細胞密度およびプラスミドＤＮＡ濃度の最適化］
これらの研究を開始する前に、本発明者らは、より良い成長、増加したトランスフェクション効率、および増加したベクター産生／細胞を支持する別の無血清培地（無血清培地−２）を用いることを始めた（表２参照）。懸濁ＨＥＫ２９３細胞を、３０ｍＬの最終細胞培養物体積に達するように、無血清培地−２中に、１×１０^６個および２×１０^６個の生細胞／ｍＬへ希釈した。１μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、および２μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡをこのセットの実験に利用した。図２Ａに示されたデータに基づいて、ｒＡＡＶベクター産生が、１．５μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを用いて、細胞密度がトランスフェクションの時点で１×１０^６個の生細胞／ｍＬである場合、最高であることは明らかであった。

懸濁ＨＥＫ２９３細胞を、いくつかの回数、継代し、低継代細胞、中程度の継代細胞、および高継代細胞が入手できたとき、細胞培養年齢がトランスフェクション効率およびｒＡＡＶ産生に影響するかどうかを決定するために、それらをトランスフェクションした。図２Ｂに示されているように、トランスフェクション効率は、細胞培養年齢に影響されないが、細胞あたりのｒＡＡＶ産生は、時間と共に減少し、開発された懸濁ＨＥＫ２９３細胞クローンは、最高３０〜４０継代を用いられるべきであることを示唆する。

［カラムクロマトグラフィーを用いるｒＡＡＶ血清型の精製］
懸濁ＨＥＫ２９３細胞におけるｒＡＡＶ産生の最適化と共に、もう一つの焦点がＡＡＶ精製であるべきであると決定した。全てのＡＡＶ血清型についての普遍的な精製ストラテジーを開発することが望まれた。以前の研究は、いくつかの異なる血清型の精製が、カラムクロマトグラフィーの使用によって達成され得ることを報告した。したがって、カラムクロマトグラフィーが、結合ステップおよび溶出ステップの間、特定のパラメーターの調節を通して全ての血清型を精製するために用いられ得ることは理にかなっていた。図３に示されているように、高度に純粋な溶出画分が、カラムクロマトグラフィー方法を利用して、収集される。この普遍的なプロトコールを用いて、全てのＡＡＶ血清型およびキメラキャプシドを精製した。

［一本鎖ｒＡＡＶおよび自己相補的ｒＡＡＶの血清型１〜６、８、および９の産生および精製］
実施例１に記載されているように、最適化トランスフェクションパラメーターを用いて、１リットルの培養物体積をトランスフェクションして、ＣＭＶ−ＧＦＰ導入遺伝子カセットをパッケージングする、一本鎖ｒＡＡＶおよび自己相補的ｒＡＡＶの血清型１〜６、８、および９を作製した。表３に示されているように、（ＧＦＰフローサイトメトリーに基づいた）トランスフェクション効率は、全てのトランスフェクションの間でほとんど等価であった。一本鎖ゲノムをパッケージングする血清型の全部が、１×１０^５ｖｇ／細胞の前後、およびそれより上を生成した。ｒＡＡＶ４を除いて、試験された全ての一本鎖ｒＡＡＶ血清型は、精製後、１リットルの細胞培養物から８．２×１０^１２〜３．３×１０^１３個の総ｒＡＡＶを生成し、図４Ａにおける銀染色に描かれているように、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３以外のいかなるタンパク質も相対的に含まなかった。自己相補的ベクタープレップは、それらの一本鎖の対応物より少ない総ベクター含有粒子を生じ、かつ通常、自己相補的（ダイマー）ゲノムと一本鎖（モノマー）ゲノムの両方の様々な濃度で構成されることはよく知られている（ＭｃＣａｒｔｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８（２００１））。この場合もやはりｒＡＡＶ４を除いて、試験された全ての自己相補的ｒＡＡＶ血清型は、精製後、１リットルの細胞培養物から４．０×１０^１２〜１．３×１０^１３個の総ｒＡＡＶを生成した。図４Ｂに示されているように、ｒＡＡＶ粒子は、高い割合の自己相補的ゲノムを効率的にパッケージングした。追加の自己相補的ｒＡＡＶベクターが様々な導入遺伝子カセットで生成されたとき、パッケージングされたゲノムの大部分は自己相補的であり、このことは、これらの結果が自己相補的ＧＦＰカセットだけに限定されるのではないことを示した。

大部分のＡＡＶ血清型に対して許容的である普遍的な細胞株は見出されていない。しかしながら、ＨｅＬａＲＣ−３２と新しく名付けられた改変ＨｅＬａ細胞株（Ｃｈａｄｅｕｆら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２：２６０（２０００））は、試験された全ての血清型により様々な程度で形質導入することができる。その細胞株は、組み込まれたＡＡＶ２のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有し、アデノウイルス（ｄｌ３０９）での感染で、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接された任意のベクター遺伝子が複製されるだろう。ゲノムコピー数の増加は、関心対象となる遺伝子（この場合、ＧＦＰであり、それはその後、蛍光顕微鏡法を用いて可視化し、カウントすることができる）のより強い発現を誘発するだろう。その後、形質導入単位（ＴＵ）は、希釈、および特定の倍率において、カウントの平均数／フィールドに、ウェルあたりのフィールドの総数を掛けることに基づいて計算される。様々な範囲のｖｇ：ＴＵ比が血清型間に存在することは表３において明らかであり、それは、ＨｅＬａＲＣ−３２細胞の各血清型に対する許容性の範囲による可能性が最も高い。これは、結合および侵入および／または細胞内での輸送のレベルにおいてであり得る。これらの形質導入実験を数回、繰り返し、粒子に対する形質導入比率は一定のままであった。したがって、これ、またはこれに類似したものなどの形質導入アッセイは、特定のｒＡＡＶ血清型プレップが、研究者によって設定された特定の判定基準内にあるかどうかを定性的に決定するためのガイドまたは尺度ツールとして用いることができるのみである。予想通り、自己相補的ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ｒＡＡＶベクターより感染性が高かった。Ａｕｃｏｉｎらに記載されているように、刊行物間の形質導入または感染力データの比較は、感染力を定量化するために用いられる様々なアッセイのため、用心深く行われるべきである（Ａｕｃｏｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２６：７３（２００８））。

一本鎖ｒＡＡＶおよび自己相補的ｒＡＡＶの全体的な純度を確認するために、各血清型を、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて画像化した（図５）。現在の産生テクノロジーのいずれにおいてもｒＡＡＶを産生する場合、多数の空粒子が生成されることはよく知られている。充満粒子から空粒子を効果的に除去する手順を発見することが必要とされる。ネガティブ染色ＴＥＭは、充満粒子に対する空粒子の比率を決定するための２つの方法のうちの１つである。空粒子は、充満粒子とは異なってネガティブ染色剤（２％酢酸ウラニル）を取り込み、それにより、ベクター調製において充満粒子と空粒子の数を定量化することが可能になる。他方は、ＥＬＩＳＡに基づいた方法であり、充満粒子と空粒子の両方を認識するキャプシド特異的抗体を利用する。その後、ｑＰＣＲまたはドットブロット力価を、ＥＬＩＳＡから生じた総粒子力価から引き算し、充満キャプシドに対する空キャプシドの比率を決定する。たいていのＡＡＶ血清型についてのキャプシド抗体は、ＥＬＩＳＡにおける使用について、すでに確立され、かつ特徴づけられている。図５に含まれる表に示されているように、全体的な空粒子に対する充満粒子の比率は、１０以上であり、その精製プロセスが、空粒子を効果的に除去することを示唆した。ネガティブ染色ＴＥＭ画像をまた利用して、ｒＡＡＶ粒子の凝集を防ぐための最終貯蔵溶液の有効性を決定した。最終貯蔵緩衝液が、ｒＡＡＶ粒子の凝集を防ぐ能力があることは明らかであり、その凝集が、インビボで送達された場合のベクターの感染力および伝播に影響する可能性が最も高いだろう。

［接着性ＨＥＫ２９３細胞および懸濁ＨＥＫ２９３細胞から生成されたｒＡＡＶのインビボ比較］
ＡＡＶ６ ＣＢＡ−Ｌｕｃベクター、ＡＡＶ８ ＣＢＡ−Ｌｕｃベクター、およびＡＡＶ９ ＣＢＡ−Ｌｕｃベクターを、接着性ＨＥＫ２９３細胞および懸濁ＨＥＫ２９３細胞を用いて作製した。接着性細胞に産生されるベクターを、ＣｓＣｌ勾配を用いて精製し（Ｇｒｉｅｇｅｒら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１４１２（２００６））、懸濁細胞に産生されるベクターを、本明細書に記載された最適化方法を用いて、精製した。インビボ研究の前に、ベクターを、同じドットブロット上で力価を決定した。ＨｅＬａＲＣ３２細胞を、段階希釈の各ベクターに感染させ、遺伝子発現を、ルシフェラーゼアッセイを用いて定量化した。インビトロ形質導入アッセイに基づいて、血清型の間での形質導入は、精製ストラテジー間でほとんど等価であった。各血清型ＣＢＡ−Ｌｕｃベクターの１×１０^１１総ｖｇを、尾静脈注射により各マウスに注射した。注射から１週間後、および１カ月後、マウスを画像化した（図６）。試験された各血清型ベクターのトロピズムおよび形質導入プロファイルは類似しており、精製方法によって影響されないことは明らかである。

［ウェーブバイオリアクターを用いるｒＡＡＶの産生］
動物成分を含まない懸濁培地を用いる振盪フラスコ内でｒＡＡＶを生成するための産生パラメーターを最適化した。次のステップは、スケーラビリティを決定するために、様々な細胞培養物体積において最適化パラメーターをウェーブバイオリアクターに変換することであった。表４は、異なる血清型ベクターを生成する４．３リットルから１０リットルまでの細胞培養物のサイズの範囲である、いくつかのウェーブバイオリアクター実行を示す。可能であれば、振盪フラスコにおける１リットルの培養物を、ＧＦＰベクターが産生される場合にはトランスフェクション効率を比較するための対照、および、精製後の１リットルの培養物あたりのベクター産生を比較するための対照としての役割を果たすように、トランスフェクションした。トランスフェクション効率は、フラスコとウェーブバイオリアクターバッグの間ではほとんど等価であった。興味深いことに、ＣＭＶ作動型ＧＦＰプラスミドは、ＣＢＡおよびミニＣＢＡプロモーター（ＣＢｈ）作動型ＧＦＰプラスミドより高い割合の、ＧＦＰ発現細胞を一貫して示したが、１リットルの培養物あたりほとんど等価のベクターの収量を生じた。これは、ＣＭＰ ＧＦＰプラスミドとＣＢＡ ＧＦＰプラスミドの間のトランスフェクション効率は類似したが、転写が、ＨＥＫ２９３細胞においてプロモーター間で異なることを示唆している。フラスコにおいて示されたように、たいていのウェーブバイオリアクター実行は、１リットルの培養物あたり１×１０^１３個の精製ｒＡＡＶベクターを生成し、振盪フラスコにおけるトランスフェクションおよびｒＡＡＶ産生についての最適化されたパラメーターが、ウェーブバイオリアクターに変換することを確立した。たいていの１０リットルウェーブバイオリアクター産生実行において、１×１０^１４個より多い精製ｓｃＡＡＶベクターが生成された。スケール差を考慮すれば、１×１０^１４個より多い精製ｓｓＡＡＶは、ウェーブバイオリアクター中１０リットルの培養物体積で生成されるだろう（表４におけるＡＡＶ２およびＡＡＶ９に基づく）。

［ｒＡＡＶの濃縮］
ｒＡＡＶの脳または眼への直接的注射などの特定の前臨床および臨床適用は、ｒＡＡＶの低体積／高度に濃縮された用量を必要とする。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｖｉｖａｓｐｉｎカラムの使用により、表５（ルシフェラーゼベクターの濃縮。濃縮前と濃縮後のベクター力価および感染力（ルシフェラーゼアッセイ）の比較）および表６（ＧＦＰベクターの濃縮。濃縮前と濃縮後のベクター力価および形質導入単位（ＨｅＬａＲＣ３２形質導入アッセイ）の比較）に例証されているように、粒子および感染力の損失がほとんどなく、濃縮されたｒＡＡＶを生じる特定の条件を最適化した。カラムは、ｒＡＡＶ粒子を保持しながら、過剰な液体がフィルターを通過することを可能にする、１００Ｋの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜を利用する。様々な分子量カットオフサイズを試験したが、ｒＡＡＶを保持し、かつ濃縮するのに効果的ではなかった。表５および表６に示されているように、濃縮前のｒＡＡＶの等しい力価は、濃縮されたｒＡＡＶの等しい力価と共に直接、測定された。したがって、形質導入の損失が観察されたならば、濃縮されたｒＡＡＶについての相対的光単位または形質導入単位が、濃縮前のｒＡＡＶより少なかったであろう。いくつかのＡＡＶ血清型を試験した後、力価および活性に有意な損失はなかった。したがって、濃縮されたｒＡＡＶは、濃縮前のｒＡＡＶとほとんど等価の活性を有し、ウイルスが効果的に濃縮されたことが示された。ウイルス力価が変化しなかったことを確認するために、総ｖｇおよびｖｇ／ｍｌを、ドットブロットにより評価した。総ｖｇが同じままであった場合、ｖｇ／ｍｌは体積に関係した。したがって、ｒＡＡＶを保持するのに十分小さい分子量カットオフ濾過システムを利用して、低速遠心分離により体積を取り除くことによりｒＡＡＶベクターを濃縮することは可能である。濃縮前力価および濃縮後力価に相関して、図７Ａおよび７ＢにおけるＴＥＭ画像は、ベクター濃度の増加を示している。最終貯蔵溶液もまた、１×１０^１３ｖｇ／ｍＬの濃度においてｒＡＡＶ粒子凝集を防ぐ能力がある。

［懸濁培地からの連続的なｒＡＡＶ回収］
接着性ＨＥＫ２９３細胞からＡＡＶを回収する最良の時点を決定することにおいて、以前のＡＡＶ産生刊行物に記載されたように、ＡＡＶを細胞培地から回収する最適な時点が、いつであるか、最近、実証された（Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５９（２０１０）；Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５１（２０１０））。ＡＡＶが経時的に（付加的に）培地から収集することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、本明細書に記載された最適化パラメーターを用いてｒＡＡＶ８ ＣＭＶ−ｅＧＦＰベクターおよびｒＡＡＶ９ ＣＭＶ−ｅＧＦＰベクターを産生するために懸濁ＨＥＫ２９３細胞の３０ｍＬの培養物をトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞培養物を、低速遠心分離によってペレット化し、ドットブロットおよびｑＰＣＲによるＤＮアーゼ抵抗性粒子の力価決定のために、培地を除去した。その後、細胞ペレットを新鮮な無血清培地中に再懸濁し、ｒＡＡＶの連続的な成長および産生のために振盪インキュベーターへ戻した。その後、培地試料を２４時間ごとに採取し、培地を４８時間ごとに交換した。１２０時間目の時点で、ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９の力価を、培地および細胞ペレットの両方から決定した。図９に示されているように、ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９を、トランスフェクションから４８時間後、培地から検出し、回収することができ、時間が進むにつれて培地においてベクター量の増加が見出され、培地は交換される。図９において総収量を４８時間目の細胞ペレット対照と比較すると、連続的回収方法が、それぞれ、６．５倍および４．８倍のｒＡＡＶ８９ベクターおよびｒＡＡＶ９ベクターを生じた。これは、スケーラブルな動物成分を含まない系を用いる、トランスフェクション後の多数の時点における懸濁培地から回収された連続的なｒＡＡＶの初めての報告である。その後、このプロセスを、２Ｌの灌流ウェーブバイオリアクターバッグを用いるバイオリアクタースケールに適応させた。１Ｌの細胞培養物をトランスフェクションして、ｒＡＡＶ８ベクターを作製した。蠕動ポンプを用いて、ウェーブバイオリアクターバッグ内の灌流フィルターを通して各時点（４８時間目、７２時間目、９６時間目、１２０時間目、および１４４時間目）に８００ｍＬの細胞培養物を取り出した。その後、８００ｍＬの新鮮な動物成分を含まない懸濁細胞培地をウェーブバッグに戻した。その後、回収された培地を、ＴＦＦ、続いて、清澄化、およびカラムクロマトグラフィー精製を用いて濃縮した。表７は、特定の時点（４８時間目、７２時間目、９６時間目、１２０時間目、および１４４時間目）における培地からの、および１４４時間目の細胞ペレットからの灌流ウェーブバイオリアクターのｒＡＡＶ８ベクター収量を示す。精製された総ｒＡＡＶ８は、４８時間目、７２時間目、９６時間目、１２０時間目、１４４時間目の培地のｒＡＡＶ８収量、および１４４時間目の細胞ペレットのｒＡＡＶ８収量の合計を示す。典型的なｒＡＡＶの４８時間目の収量は、典型的には４８時間目に細胞ペレットから回収した場合のｒＡＡＶ８について達成された収量範囲を表す。表７に示されているように、ｒＡＡＶ８は、灌流ウェーブバイオリアクターバッグを用いて全ての時点で回収することができる。灌流ウェーブバイオリアクターバッグを用いて回収された総ｒＡＡＶ８は、典型的４８時間目の細胞ペレット収量の５〜１０倍の収量をもたらす。これは、スケーラブルな動物成分を含まない産生テクノロジーおよび懸濁細胞を用いた、トランスフェクション後の多数の時点でのバイオリアクターを用いる懸濁培地から回収される連続的なｒＡＡＶの初めての報告である。これは、製造者が、全てのスケールにおいて、動物成分を含まない懸濁培養を利用して、単回のトランスフェクションによって、培地からｒＡＡＶを連続して産生し、回収し、かつ精製することを可能にするだろう。次にこれは、標準産生プロトコール（トランスフェクションから４８〜９６時間後、細胞が回収されるとき、産生プロセスが停止する）より多いｒＡＡＶを等量の投入プラスミドから生成するだろう。１４４時間を超えるために、細胞生存率を増加させること、およびベクター産生を時点間で一貫性を保つことを必要とすることは、当業者によって理解されているだろう。ＡＡＶヘルパー機能および細胞生存率に依存して、当業者は、細胞生存率およびベクター収量などに基づいて産生をオンにしたりオフにしたりする制御可能なシステムを利用するｒＡＡＶの生成のための安定的な細胞株の作製へこれを広げることができる。

ＡＡＶを利用するいくつかの第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験が、遺伝性および後天性疾患について世界中で実施されている（Ａｕｃｏｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２６：７３（２００８）；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：８５８（２００８））。臨床試験の数の増加が、拡大する臨床需要に応える高力価、高度に純粋で強力なＡＡＶの量を効率的に生成することができるスケーラブルな製造テクノロジーを確立する必要性を際立たせている。ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有するパッケージング細胞株、安定的なプロウイルス細胞株、および複数のプラスミドの接着性ＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションを含む、ｒＡＡＶベクター産生へのいくつかのアプローチが探求されている。接着性ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションは、依然として、ｒＡＡＶ産生について最も広く用いられている方法であり、前臨床適用および臨床適用において投与されるｒＡＡＶの大部分を占める。次のステップは、動物成分を含まない懸濁条件で成長する能力があるＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることにより、一過性トランスフェクションテクノロジーをスケーラブルなテクノロジーに適応させることであった。二、三の研究は、懸濁ＨＥＫ２９３細胞を用いるｒＡＡＶ産生を報告しているが（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４４：３２（２００７）；Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９：１７１３（２００７）；Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：４１６（２００６））、ベクター収量（約１．４×１０^４ ｖｇ／細胞および３×１０^４ ｖｇ／細胞）が、懸濁ＨＥＫ２９３細胞一過性トランスフェクションテクノロジーについて障害になったままである。

この開示は、動物成分を含まない懸濁条件で成長することができ、かつバキュロウイルス発現ベクター系より高い細胞あたりのｒＡＡＶ収量で、最近のｒＨＳＶ感染テクノロジーに匹敵する細胞あたりの収量を生じることができるＨＥＫ２９３細胞株を用いる、頑強で、スケーラブルな一過性トランスフェクション製造テクノロジーを詳述する。高トランスフェクション効率（＞７０％）およびｒＡＡＶベクター産生について選択された、接着性ＨＥＫ２９３細胞クローンを、動物成分を含まない懸濁条件での成長に適応させた。いくつかの市販の無血清懸濁培地を、成長および高トランスフェクション効率を支持するものを選択するようにスクリーニングした。最良の成長、高トランスフェクション効率、および高ｒＡＡＶベクター収量を支持する、動物成分を含まない懸濁培地を見出した（表２ならびに図２および図４）。最適な培地を同定することに加えて、いくつかの変数を最適化した。最適化されたパラメーターを利用して、細胞あたり１×１０^５個より多いベクターゲノム含有ｒＡＡＶ、および１リットルの細胞培地から１×１０^１３個より多い精製されたベクターゲノム含有ｒＡＡＶを作製することが可能である。これは、振盪フラスコ内において３０ｍＬから１Ｌまでの細胞培養物、およびウェーブバイオリアクターバッグ内で最高１０Ｌの体積まで確認され（表３参照）、このテクノロジーがスケーラブルであることを例証している。さらに、ｒＡＡＶを、振盪フラスコおよび灌流ウェーブバイオリアクターバッグを用いてトランスフェクション後の様々な時点で、動物成分を含まない懸濁培地から連続して回収することができ、そのことが、等量の細胞培養物体積および投入プラスミドからの全体的なｒＡＡＶ収量を有意に増加させることが示された。

不連続な密度勾配、続いてカラムクロマトグラフィーを用いることにより、細胞溶解物からｒＡＡＶを精製した。不連続な勾配のロード能力を、カラムクロマトグラフィー前に効果的に清澄化する（タンパク質夾雑物の効率的除去）ことができる、溶解物の最大量を決定するように最適化した。カラムクロマトグラフィー緩衝液を、（今まで試験された）全てのＡＡＶ血清型およびキメラキャプシドを効率的に結合し、かつ溶出する普遍的な精製システムを開発するように最適化した。広範なプロセス開発研究を通して、全てのＡＡＶ血清型およびキメラキャプシドの結合および溶出プロファイルに影響することなく、クロマトグラフィー緩衝液の単純な操作により主要および微量のタンパク質夾雑物を除去することが可能であった（図３および図４における参照銀染色）。不連続な密度勾配およびカラムクロマトグラフィーの使用に最も関連している可能性が高いプロセスを通して、有意な量の空粒子が除去され、最終産物において高い割合のゲノム含有ｒＡＡＶを残す（図５）。要約すれば、生成されたｒＡＡＶは、高度に純粋で、空キャプシドに対する充満キャプシドの高い比率を有し、前の産生方法（接着性ＨＥＫ２９３細胞）および精製方法（Ａｕｃｏｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２６：７３（２００８））を用いて生成されたベクターと類似した、感染力に対するゲノムの比率（ＧＦＰ蛍光カウンティングアッセイに基づく）を有する。

ｒＡＡＶの産生のためのいくつかのスケーラブルな系が開発されており、それには、アデノウイルスに基づいた方法、ｒＨＳＶに基づいた方法、ＢＥＶＳに基づいた方法、および一過性トランスフェクションに基づいた方法が挙げられる。比較すると、この懸濁ＨＥＫ２９３細胞を用いるスケーラブルな一過性トランスフェクションテクノロジーは、アデノウイルスに基づいたｒＡＡＶテクノロジーおよびＢＥＶＳに基づいたｒＡＡＶテクノロジーより、細胞あたりのより多いｒＡＡＶおよびより感染性の高いｒＡＡＶを生成し、ｒＨＳＶに基づいた産生テクノロジーに匹敵する収量を生じる。さらに、この系を用いてｒＡＡＶを生成するために費やされる総時間はほんのわずかである（図８）。

前述は本発明を例証するものであり、本発明を限定すると解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物はそれに含まれるべきである。

Claims (16)

1. ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１３２７４として寄託されている、単離されたＨＥＫ２９３細胞。
2. （ａ）請求項１に記載のＨＥＫ２９３細胞にＡＡＶ発現系を供給するステップと、
   （ｂ）ＡＡＶ粒子が産生される条件下で前記細胞を培養するステップと、
   （ｃ）任意選択的に、前記ＡＡＶ粒子を単離するステップと
   を含む、ＡＡＶ粒子を産生する方法。
3. 前記細胞が懸濁状態で培養される、請求項２に記載の方法。
4. 前記細胞が、動物成分を含まない条件で培養される、請求項２または３に記載の方法。
5. ステップ（ｃ）が、前記細胞から前記ＡＡＶ粒子を単離するステップを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ステップ（ｃ）が、前記細胞が培養されている培地から前記ＡＡＶ粒子を単離するステップを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記細胞が振盪フラスコ内で培養される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記細胞がバイオリアクター内で培養される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
9. ＡＡＶの全ての血清型、キメラ、およびハイブリッドを産生することができる、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３、またはＡＡＶ１−１３、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９．４５、および他のキメラキャプシドもしくはハイブリッドキャプシドから構成されるキメラＡＡＶからなる群から選択される、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ＡＡＶ発現系が、導入遺伝子を含む組換えＡＡＶプラスミド、パッケージングｒｅｐ−ｃａｐ含有プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドを含む、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記導入遺伝子が、レポーター遺伝子、治療用遺伝子、免疫原性遺伝子、または診断用遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
13. 精製前の細胞あたり少なくとも４×１０ ^４ 個のベクターゲノム含有粒子を提供する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 精製前の細胞あたり少なくとも１×１０ ^５ 個のベクターゲノム含有粒子を提供する、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. １リットルの細胞培養物あたり少なくとも１×１０ ^１２ 個の精製されたベクターゲノム含有粒子を提供する、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. １リットルの細胞培養物あたり少なくとも１×１０ ^１３ 個の精製されたベクターゲノム含有粒子を提供する、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。