JP6165876B2 - レスベラトロール生合成イネ及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子が発現可能に挿入されて、高濃度のレスベラトロールを生合成するイネ及びこれより生産される米に関する。また、本発明は、天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に挿入されて、高濃度のレスベラトロールを生合成するイネから得られる米を含む代謝性疾患の予防及び改善のための健康機能食品組成物、動物飼料組成物及び薬学的組成物に関する。

近年、韓国では経済成長と食生活の西欧化により、飲食物から得られる脂肪分の摂取量が増加しており、運動不足などによる肥満、糖尿病、高脂血症、高コレステロール症及び動脈硬化症などの代謝性疾患が増加する傾向にある。

肥満は、一般的に過剰な体脂肪を有する状態を意味するものであり、体脂肪の体重全体に占める割合が男性の場合２５％、女性の場合３０％以上である時、肥満と見なされる。肥満は糖尿病、高血圧、高脂血症などの多くの成人病を誘発する直接又は間接的な原因であることが知られている。

糖尿病は、インスリンの分泌量が不足したり、正常な機能が行われないなどの代謝性疾患の一種で（ＤｅＦｒｏｎｚｏ、１９８８）、血中のブドウ糖の濃度が高くなる高血糖を特徴とし、高血糖により様々な症状及び徴候が現れ、尿の中にブドウ糖が排出される疾患である。近年、肥満率は、特に腹部肥満の増加により、糖尿病の発生率が爆発的に増加する傾向にある。

前記のような代謝性疾患に対する適切な治療がなされないと、身体に様々な病的症状が現れるが、代表的なものとしては、腎機能障害、神経障害、脳血管障害に起因する脳卒中、腎臓、心臓疾患や糖尿病性足部潰瘍、及び心血管疾患の危険が高まることが挙げられる。このような合併症は生活の質を低下させ、究極的には患者の寿命を短縮させる。現在、代謝性疾患を治療する方法としては、生活習慣の矯正（食餌療法、運動療法）及び薬物療法などが行われている。しかし、食餌療法や運動療法は、厳格な管理及び実施が困難であり、その治療効果においても限界がある。したがって、一般的に実生活に容易に適用できる代謝性疾患の治療のための食品などの開発が切実に求められている。

一方、レスベラトロール合成酵素遺伝子（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＲＳ）の産物であるレスベラトロールは、紫外線（ＵＶ）、病原菌、創傷などの外部刺激による環境的ストレスによって生じる一種の防御物質のひとつであるファイトアレキシン（Ｄｅｒｃｋｓ ａｎｄ Ｃｒｅａｓｙ、１９８９）の産物で、１分子のクマロイル-ＣｏＡ（ｃｏｕｍａｒｏｙｌ-ＣｏＡ）と３分子のマロニル-ＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ-ＣｏＡ）を用いて、レスベラトロールの合成酵素遺伝子（ＲＳ）の触媒作用によって生合成される（非特許文献１）。

レスベラトロールは、ブドウ、桑の実、ラッカセイ、ユリなど約７２種以上の植物からは発見されているが、イネ、トウモロコシ、小麦などのほとんどの主穀作物と果菜類では全く生合成されない。

また、レスベラトロールは、前記の薬理活性効果意外にも寿命延長に関連するタンパク質であるｓｉｒ２を活性化させる物質として知られている。ｓｉｒ２タンパク質は、低カロリー条件においてＮＡＤ＋によって活性化され、細胞の寿命を延長させる寿命延長関連タンパク質のひとつであるが、Ｋｏｎｒａｄら（２００３）の報告によると、ｓｉｒ２タンパク質は、カロリーを制限した場合においてのみＮＡＤ+によって唯一活性化されるが、レスベラトロールを添加した条件においても 低カロリー条件と同様にｓｉｒ２タンパク質が活性化し、酵母を用いた実験でレスベラトロールを添加した際には、酵母の寿命が平均で７０％増加したという実験結果が発表されている。

このような生理活性を有するレスベラトロールは、７２種以上の植物体において合成され、松などの木本類では常時生産されるが、草本類ではファトアレキシン活性により、創傷、オゾンによる損傷、紫外線（ＵＶ）、病害虫感染などの外部ストレスによる自己防御物質として生合成される。レスベラトロールの生合成に最も優れている植物は、ブドウとラッカセイである（Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、１９９０）。

赤ワインにはレスベラトロールが含まれており、「フレンチパラドックス」（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐａｒａｄｏｘ）と言われる、赤ワインの摂取と心血管疾患の発生率には、負の相関関係が見られる（Wu ら、２００１）という報告は、赤ワインが全世界的に関心を集める契機となった。

よって、レスベラトロールの含有量を人為的に増進させるために、栽培時のブドウに人為的に菌株を接種したり、収穫後のブドウとラッカセイの種子に超音波洗浄処理や、ＵＶ照射などを施すことによって、レスベラトロールの含有量を増進させる研究などが試みられている。

また、ブドウとラッカセイから分離したレスベラトロール合成酵素遺伝子を生命工学的手法を用いて挿入させることによって、レスベラトロール生合成作物を開発しようとする研究が試みられている。ブドウのレスベラトロール合成酵素遺伝子を用いた形質転換キウイ植物体の葉から１８２μｇ/ｇのピセイド（レスベラトロール配糖体）が生産され（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２０００）、ラッカセイのレスベラトロール合成酵素遺伝子を用いた形質転換タバコの懸濁培養細胞から５０ｎｇ/ｇのレスベラトロールが生産されたことが報告されている（Ｈａｉｎら、１９９０）。

Ｐ. Ｓｔａｒｋ-Ｌｏｒｅｎｚｅｎらは、ブドウ由来のスチルベン（レスベラトロール）合成遺伝子をイネに挿入することによって、稲熱病に対する抵抗性を持つことを報告した（非特許文献２）。

また、本発明者らは、先にラッカセイのレスベラトロール合成酵素遺伝子をイネに挿入して生産した米について開示している（特許文献１）。しかし、これは単にレスベラトロールが含まれることを確認したにすぎず、これによって代謝性疾患に対する改善効果があることを証明するには及ばなかった。

韓国公開出願第10-2008-0012483号

Rolfs and Kindl, 1984；Halton and Cornish, 1995 Plant Cell Reports（1997）16；668-673）

本発明者らは、ラッカセイのレスベラトロール合成酵素遺伝子を天然型イネの１２番目の染色体に挿入して、高濃度のレスベラトロールを生合成するイネ、形質転換イネを開発し、当該イネから生産した米を摂取した場合に、同量のレスベラトロールを摂取した時よりも代謝性疾患の改善効果が優れていることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の１つの目的は、天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に挿入されて、レスベラトロールを生合成するイネを提供することである。

また、本発明の他の目的は、本発明のイネから得られる米を提供することである。

さらに、本発明の他の目的は、本発明の米を含む代謝性疾患の予防及び改善のための健康機能食品組成物を提供することである

さらに、本発明の他の目的は、本発明の米を含む代謝性疾患の予防又は改善のための動物飼料組成物を提供することである。

さらに、本発明の他の目的は、本発明の米を含む代謝性疾患の予防又は改善のための薬学的組成物を提供することである。

本発明のレスベラトロール合成酵素遺伝子を挿入した高濃度のレスベラトロールを含有するイネから生産される米は、単純に同量のレスベラトロールを摂取した時よりもはるかに優れた効果を有する。また、別途にレスベラトロールを分離・抽出する過程なしで直ちに食品として使用できる米という形で生産されることによって、代謝性疾患の予防又は改善のための食品、飼料及び医薬品として広く利用することができる。

レスベラトロール合成酵素遺伝子をイネに形質転換することのできるイネ形質転換用ベクターであるｐＳＢ２２２０ベクターの概略図である。 本発明のレスベラトロール生合成形質転換イネに導入したＴ-ＤＮＡの挿入位置の周辺部分と、本発明で使用したドンジンイネに類似、且つ配列解析が完了しているジャポニカイネである日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のＮＣＢＩ（米国国立生物工学情報センター）に開示された配列データを比較分析した結果を示した総合模式図である。具体的には緑色で示した核酸配列は、イネの挿入部周辺のイネのゲノム配列であって、ＮＣＢIに開示された日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の配列を基準にすると、イネ（Ｏｒｉｚａ ｓａｔｉｖａ）の１２番目の染色体の３３０８７２番塩基の位置で一つ目のＴ-ＤＮＡの挿入が開始され、引き続き逆方向に二つ目のＴ-ＤＮＡが挿入され、３３０９０７番塩基位置で挿入が終了した。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネから得た米が、血糖に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＣＴＬは対照群、ＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは本発明の形質転換イネを意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロール生合成形質転換イネから得た米が、血中脂質代謝に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＣＴＬは対照群、ＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは本発明の形質転換イネを意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネから得た米が、体重変化と総脂肪量に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＣＴＬは対照群、ＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは本発明の形質転換イネを意味する。また、ＣＴ（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）はコンピュータ断層撮影を意味し、ＴＦ（Ｔｏｔａｌ ｆａｔ）は総脂肪、ＳＦ（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆａｔ）は皮下脂肪、ＶＦ（Ｖｉｓｃｅｒａｌ ｆａｔ）は内臓脂肪を意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネ及び比較群形質転換イネが血糖に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは比較群形質転換イネ、ＨＦＤは高脂肪飼料を意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネ及び比較群形質転換イネが血中脂質代謝に及ぼす効能、特に、血中の総コレステロール量に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは比較群形質転換イネ、ＨＦＤは高脂肪飼料を意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおける、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネ及び比較群形質転換イネが血中脂質代謝に及ぼす効能、特に、血中中性脂肪量に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは比較群形質転換イネ、ＨＦＤは高脂肪飼料を意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネ及び比較群形質転換イネの血中脂質代謝に及ぼす効果、特に、血中のＨＤＬの量に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは比較群形質転換イネ、ＨＦＤは高脂肪飼料を意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネ及び比較群形質転換イネが血中脂質代謝に及ぼす効能、特に血中ＬＤＬの量に及ぼす効果を確認する図面である。図面でＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは比較群形質転換イネ、ＨＦＤは高脂肪飼料を意味する。 代謝性疾患が誘導された動物モデルにおいて、本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネ及び比較群形質転換イネが体重の変化に及ぼす効能を確認する図面である。図面でＤＪはドンジンイネ、ｒｅｓはレスベラトロール、ＧＭＯは比較群形質転換イネ、ＨＦＤは高脂肪飼料を意味する。 本発明のレスベラトロール生合成形質転換イネの田植えの時期に応じた出穂期（図１１のＡ）と積算温度（図１１のＢ）を分析した図面である。 本発明のレスベラトロール生合成形質転換イネの田植え時期に応じた米の量及びレスベラトロールの含有量を分析した図である。 本発明のレスベラトロール生合成イネの栽培環境に応じた種子内のレスベラトロール含有量を測定した図である。具体的には、温度上昇（図１３のＡ）及び田植えの時期（図１３のＢ）に応じたレスベラトロールの含有量を測定した図である。

前記目的を達成するための一態様として、本発明は天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に挿入されて、レスベラトロールを生合成するイネを提供する。

本発明の用語「イネ」とは、世界半分以上の人口の主食資源であり、特にアジアで食用作物として栽培されている作物である。イネ属植物の中でも、穀物として栽培されるものを意味し、イネ属には２０〜３０種の野生種があるが、このうち栽培種はオリザサテイバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）とオリザグラベリマ（Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）の二種のみが知られてる。本発明では、イネは天然型イネ又は形質転換されたイネであってもよいが、好ましくは、わが国（韓国）で開発されて普及した普及種のドンジンイネ又はドンジンイネの形質転換イネであってもよい。

本発明における用語 「形質転換」とは、ＤＮＡ塩基配列上の挿入、欠失又は置換などの変異によって特定の形質が発生したり、消失したり、調節される全ての行為を意味し、特に本発明では外部から与えられたＤＮＡによって生物の遺伝的性質が変化することを意味する。本発明における用語 「形質転換イネ」とは、形質転換されて製造されたイネが、天然型イネに比べてＤＮＡ塩基配列上の変異が発生したイネを意味し、遺伝子組換え技術を用いて、特定の遺伝子の挿入、変形又は活性の変化が誘発されて生成された遺伝子組換え体を含む。

本発明の用語「レスベラトロール」とは、植物がカビや害虫などの悪環境に置かれた際に生成される強力な抗酸化性を有するポリフェノール系物質であり、ブドウの皮、ブドウの種、ラッカセイなどに大量に含まれていることが知られている。レスベラトロールがヒトに及ぼす影響については数多くの研究が行われており、これまで、抗がん、抗ウイルス、神経保護、抗老化、抗炎症、寿命延長などの効果が知られている。レスベラトロールは、シス（ｃｉｓ）形とトランス（ｔｒａｎｓ）形があるが、トランスレスベラトロールのみが薬効があるものと推定されている。

本発明の用語「レスベラトロール合成酵素遺伝子」とは、レスベラトロールを合成する機能を有する酵素をコードする遺伝子（核酸配列）を意味する。最終的にレスベラトロールを合成する機能を持つすべての酵素が含まれ、基質は制限されない。本発明におけるレスベラトロール合成酵素遺伝子は、好ましくはラッカセイ由来であってもよく、配列番号１で構成されてもよい。

本発明のレスベラトロールを生合成するイネは天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が挿入されたものであってもよく、例えば、１２番目の染色体に２コピーのレスベラトロール合成酵素遺伝子が連続的に発現可能に挿入されたものであってもよく、特に該２コピーのレスベラトロール合成酵素遺伝子が互いに向かい合う方向に挿入されたものであってもよい。

また、本発明のレスベラトロールを生合成するイネは、レスベラトロール合成酵素遺伝子が、天然型イネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列領域に挿入されたものであってもよく、特にレスベラトロール合成酵素遺伝子が天然型イネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列領域において、配列番号７の５７２番塩基の後に挿入されたものであってもよい。

また、本発明のレスベラトロールを生合成するイネは、レスベラトロール合成酵素遺伝子が、天然型ドンジンイネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列領域に挿入されたものであってもよく、特に配列番号７の５７２番塩基の後に挿入されたものであってもよい。本発明の配列番号７に該当するレスベラトロール合成酵素遺伝子が挿入される領域は、イネの染色体に自然に又は人為的に起こる様々な変化によって異なってもよい。よって、本発明では、レスベラトロール合成酵素遺伝子が挿入される領域は、レスベラトロール合成酵素遺伝子の発現を促進するものであれば、配列番号７の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものであってもよく、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するものであってもよい。

本発明のレスベラトロールを生合成するイネは、本発明のレスベラトロールを生合成する効果を維持する限り、本発明のイネを用いた特定の育種環境のための特性、特定の発現型の付加、又は削除などのための変異種、交配種だけでなく、育種研究界において一般的に用いられる各種の突然変異誘導法によって変異したランダムな突然変異種も含まれる。

本発明の突然変異誘導法とは電磁気派、素粒子、Ｘ-線（Ｘ-ｒａｙ）、γ 線（γ-ｒａｄｉａｔｉｏｎ）、α線、β線、紫外線などの放射線系列；挿入性物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ；アクリジンオレンジ（ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇ）、プロフラビン（ｐｒｏｆｌａｖｉｎ）、アクリフラビン（ａｃｒｉｆｌａｖｉｎなど）、塩基類似物（ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅ；５'-ブロモウラシル 、２'-アミノプリンなど）、ＤＮＡ修飾物質（ＤＮＡ ｍｏｄｉｆｕｉｎｇ ａｇｅｎｔ；亜硝酸、ヒドロキシアミン（ＮＨ_２ＯＨ）、アルキル化剤（ＭＭＳ、ＥＭＳ、アジ化ナトリウム）など）などの化学的突然変異誘発系列などを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明のイネは、受託番号ＫＣＴＣ１２５２９ＢＰであるイネであってもよい。

本発明のイネは、好ましくは完熟時に、約２．３〜５μｇ/ｇ（玄米）又は約１．８〜４．１μｇ/ｇ（白米）のレスベラトロールを含有するものであってもよい。

本発明の用語「ピセイド」とは、レスベラトロールの配糖体であって、漢方薬に使用される虎杖根（コジョウコン、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｒｏｏｔ）の主成分として知られている。

本発明のイネは、好ましくは完熟時に、１．０〜６．５μｇ/ｇ（白米）のピセイドを含有するものであってもよい。

本発明の具体的な一実施例では、ラッカセイ由来のレスベラトロール合成酵素遺伝子を分離してイネに挿入し、該遺伝子の配列は配列番号１と同様であった。本発明で高濃度のレスベラトロールを生合成することが確認された形質転換イネの種子の場合には、そのレスベラトロール合成酵素遺伝子がイネの１２番目の染色体に挿入されたことを確認した。具体的には、イネ（Ｏｒｉｚａ ｓａｔｉｖａ）の１２番目の染色体の同じ位置に、互いに向かい合う方向に二つのＴ-ＤＮＡが挿入されたことを確認した。特に、Ｔ-ＤＮＡが挿入された位置の周辺の配列と、配列解析が完了しているジャポニカイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｊａｐｏｎｉｃａ）である日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のＮＣＢＩに開示された配列のデータを比較分析した結果、３３０８７２番塩基の位置で一つ目のＴ-ＤＮＡの挿入が開始され、引き続き逆方向に二つ目のＴ-ＤＮＡが挿入されたことを確認した。このような挿入構造を有する本発明の形質転換イネは、既存の形質転換イネよりも優れたレスベラトロールの生合成能を有することが可能となった。前記形質転換イネの種子をレスベラトール強化イネ（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ-ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｒｉｃｅ）と命名し、２０１３年１２月５日付で韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１２５２９ＢＰで寄託した。

ただし、本発明で解析した塩基位置は、数十万個又は数百万個の塩基を解析する染色体解析過程で起こりうる誤差又はエラーにより、ある程度変動することがあり、解析方法によって異なって解析される場合もありうる。しかし、これは実質的な変異位置の変更ではなく、単に解析方法の誤差に過ぎないため、本発明の本質には影響を及ぼすものではない。本発明のレスベラトロール合成酵素遺伝子の挿入塩基の位置は、今後の解析方法が発展したり、又は塩基配列解析上の変化等によって異なって解析される場合もあるが、これは韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１２５２９ＢＰで寄託された本発明の種子に準じて解析又は再解釈するこができる。

さらに、本発明で製造したレスベラトロール生合成形質転換イネは、レスベラトロール合成酵素遺伝子がドンジンイネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列領域に挿入されていることが確認され、特にレスベラトロール合成酵素遺伝子がドンジンイネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列領域で配列番号７の５７２番塩基の後に挿入されていることを確認した。前記遺伝子の挿入位置をＮＣＢＩ ｂｌａｓｔを利用して分析した結果、本発明のドンジンイネと同じ系列のジャポニカイネの塩基配列を解析したＮＣＢＩの受託番号. ＮＣ_００８４０５の１２番目の染色体内であることが確認された。

具体的には、前記ＮＣ_００８４０５の３３０８７２番塩基の位置に挿入されていることが確認された。ただし、生長や交配などの過程で生じる変異等によって、前記塩基の位置に該当する番号は異なることがあるので、基本的に挿入される位置が同等であれば、本発明の範囲を逸脱するものではないと言える。

本発明の具体的な一実施例では、本発明の形質転換イネの玄米種子に含まれているレスベラトロールとピセイドを分析した結果、高濃度のレスベラトロール及びピセイドを含有することを確認した。具体的には、白米を基準として、レスベラトロールが約１．８〜４．１μｇ/ｇ、ピセイドが１．０〜６．５μｇ/ｇ含まれることを確認し（表３）、玄米の状態では、レスベラトロールが２．３〜５μｇ/ｇ含まれることを確認した（図１３）。一方、ピセイドが主にイネ種子の皮の部分に多く存在することを考慮すると、玄米の状態でははるかに増加した状態であることが予測される。

また、本発明の一態様として、天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に挿入されて、高濃度のレスベラトロールを生合成するイネから得られる米を提供する。特に、本発明のイネから得られる米を提供する。

本発明の用語「ドンジンイネ」とは、耐病・良質・多収性の新品種の育成を目標として、１９７５年に韓国国内での金南風（Ｇｅｕｍｎａｍｐｕｎｇ）と疾病に対して抵抗性が強い洛東イネ（Ｎａｇｄｏｎｇｂｙｅｏ）とサドミノリ（Ｓａｄｏｍｉｎｏｒｉ）を三元交配して作った品種である。１９８１年に韓国国内で奨励品種に決定され、ドンジンイネと命名されて普及した。

本発明の用語「米」とは、イネの種子を意味する。これは、種子の場合、未搗精、半搗精（玄米）、全搗精（白米）の 状態を問わず、いずれの状態も含まれる。

さらに、本発明の他の一態様として、天然型イネのレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に挿入されて、高濃度のレスベラトロールを生合成するイネから得られる米を含む代謝性疾患の予防及び改善のための健康機能食品組成物を提供する。特に、本発明のイネから得られる米を含む代謝性疾患の予防及び改善のための健康機能食品組成物を提供する。本発明の食品組成物が適用可能な代謝性疾患は、肥満、糖尿病、高脂血症、高コレステロール症、動脈硬化、及びその他の心血管系疾患などが全て含まれる。本発明の代謝性疾患は、糖尿病又は肥満であることが好ましい。

本発明の用語「健康機能食品」とは、健康機能食品に関する法律第６７２７号に基づき、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して製造及び加工した食品を意味する。「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり、生理学的適用などの保健用途として有効な効果を得る目的で摂取することを意味する。

本発明の代謝性疾患の予防及び改善のための健康機能食品組成物には、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセル又は液剤などの形態が含まれ、本発明の組成物を添加することができる食品としては、例えば、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品などの各種食品類が挙げられる。

本発明の代謝性疾患の予防及び改善のための健康機能食品組成物に含まれる必須成分としては、前記レスベラトロールを生合成するイネから得られる米を含む代謝性疾患を予防及び改善する活性を有する組成物又はその有効成分、又はその薬剤学的に許容可能な塩を含有すること以外には、特に他の成分は限定されることなく、通常の食品のように、様々な生薬エキス、食品補助添加剤、又は天然炭水化物などを追加成分として含有しうる。

また、前述のとおり、食品補助添加剤をさらに添加することもできるため、食品補助添加剤は、当業界に通常の食品補助添加剤、例えば香味剤、風味剤、着色剤、充填剤、安定剤などを含んでいる。

前記天然炭水化物の例としては、ブドウ糖、果糖などの単糖類；マルトース、スクロースなどのニ糖類；デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。前述以外の香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオシドＡ、グリチルリチンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。

前記以外には、本発明の代謝性疾患の予防又は改善のための健康機能食品組成物として、各種栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他、天然果汁ジュースと果汁ジュース飲料及び野菜飲料を製造するための果肉が含まれてもよい。これらの成分は、単独で又は組み合わせて使用することができる。

本発明の具体的な一実施例によれば、長期間にわたる高脂肪の食餌方法によって代謝性疾患が誘導された動物モデル（マウス）に本発明のレスベラトロールが高濃度に含まれた形質転換イネから得た米又はドンジンイネの種子を使用して製作した飼料を１２週間給与した。

まず、実験動物の飼料において、炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与え、その後血糖を測定した。形質転換イネで作製した飼料を摂取したマウスの場合には、８週目から血糖が下がり始め、１２週目には血糖が２２．０％が低下しているのが確認されたのに対して、他の対照群はほとんど血糖に変化がないか、むしろ上昇しているのが確認された。さらに、形質転換イネで作製した飼料と同量のレスベラトロールを含んだ一般の飼料（Ｒｅｓｖ）を摂取した場合にも、ほとんど差がないことを確認することで、形質転換イネによる血糖降下現象は、単なるレスベラトロールの含有を超越する優れた効果があることを確認することができた（図２）。

次に、実験動物の飼料において、炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与え、その後血中の総コレステロール量、血中の総中性脂肪量、血中ＬＤＬコレステロール量及び血中のＨＤＬコレステロール量を測定した。形質転換イネで作製した飼料を摂取したマウスの場合には、総コレステロール量を２７．０％、血中の総中性脂肪量を３７．４％、血中ＬＤＬコレステロール量を５９．６％減少させる効果があると同時に、代謝性疾患の予防に作用する血中のＨＤＬコレステロールは１４．８％増加させることが確認された。一方、他の対照群では形質転換イネで作製した飼料を摂取した群に比べて効果がないか又は低く、且つ形質転換イネで作製した飼料と同量のレスベラトロールを含んだ一般の飼料（Ｒｅｓｖ）を摂取した場合に比べて、形質転換イネで作製した飼料を摂取した群が優れた血中脂質改善効果があることが確認された。これは、形質転換イネによる血中脂質改善効果が、単なるレスベラトロールの含有を超越する優れたものであることを確認するものである（図３）。

さらに、実験動物の飼料において、炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与え、その後体重の変化と総脂肪量を測定した。形質転換イネで作製した飼料を摂取したマウスの場合には、体重量が２４．７％減少することを確認した。同時に、インビボマイクロＣＴを用いて脂肪量を測定した結果、総体脂肪２１．５５％（対照群２５．４３％）、腹部の脂肪１６．３３％（対照群２０．０２％）、皮下脂肪３．１％（対照群３．８３％）で対照群に比べて総脂肪量が顕著に減少することが確認された。これは、形質転換イネによる体重と体脂肪の減少が、単なるレスベラトロールの含有を超越する優れた効果であることを示唆するものである。

一方、本発明者らは、前記形質転換イネとの比較のために、同じレスベラトロール合成酵素遺伝子が天然型イネの他の染色体である４番目の染色体に挿入された比較群形質転換イネを作製して、本発明の形質転換イネの優れた効能を確認しようと試みた。その結果、比較群形質転換イネは、レスベラトロール合成酵素遺伝子が挿入されているにもかかわらず、同量のレスベラトロールを添加した天然型イネと有意な差を示さないことを確認することにより、本発明の形質転換イネが血糖降下、血中脂質の改善、体重と体脂肪の減少などの効果において優れたものであることを間接的に確認することができた。

さらに、本発明の他の一態様として、天然型イネのレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に挿入されて、高濃度のレスベラトロールを生合成するイネから得られる米を含む代謝性疾患の予防及び改善のための動物飼料組成物を提供する。特に、本発明のイネから得られる米を含む代謝性疾患の予防及び改善のための動物飼料組成物を提供する。

本発明の用語「動物」とは、畜産法第２条第１号及び同法施行規則第２条の各号で定義されている、野生習性が馴化して飼育に適した動物を意味し、該動物としては牛、馬、ラバ、ロバ、羊、山羊、綿羊、鹿、豚、兎、犬、猫、家禽類などであってもよい。

本発明の用語「飼料」とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、若しくはこれに適切な任意の天然又は人工飼料、一食分の食餌、又は該一食分の食餌の成分を意味する。一態様として、本発明のレスベラトロール高含有の米を含む動物飼料用組成物には、濃厚飼料、粗飼料及び/又は特殊飼料が含まれる。

濃厚飼料としては、小麦、オート麦、トウモロコシなどの穀類を含む種子果実類、穀物を精製して得られる副産物であり、米糠、ふすま、大麦粕などをはじめとする、糠類、大豆、菜種、ゴマ、亜麻仁ココヤシなどを採油して得られる副産物である油粕類とサツマイモ、ジャガイモなどからデンプンを除いた残りのデンプン粕の主成分が残存デンプン質類などの粕類、魚粉、魚粗粕、魚類から得た液状物を濃縮させたものであるフィッシュソリュブル（ｆｉｓｈ ｓｏｌｕｂｌｅ）、肉粉、血粉、羽毛粉、脱脂粉乳、牛乳からチーズ、又はスキムミルクからカゼインを製造する際の残液であるホエイ（ｗｈｅｙ）を乾燥した乾燥ホエイなどの動物質の飼料、酵母、クロレラ、海藻類などがある。

粗飼料としては野草、牧草、青刈りなどの生草飼料、飼料用のカブ、飼料用の砂糖大根（ビート）、カブの一種であるルタバガ（スウェーデンカブ）などの根菜類、生草、青刈り作物、穀実などをサイロに詰めておき乳酸発酵させた保存飼料のサイレージ（ｓｉｌａｇｅ）、野草、牧草を刈って乾燥させた乾草、種畜用の作物のわら、マメ科植物の葉などがある。特殊飼料には、カキ（牡蠣）の殻、岩塩などの鉱物飼料、尿素やその誘導体であるジウレイドイソブタンなどの尿素飼料、天然飼料の原料のみを配合した際に不足しがちな成分を補ったり、飼料の貯蔵性を高めるために配合飼料に微量に添加する飼料添加物などがある。

さらに、本発明の他の一態様として、天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に挿入された高濃度のレスベラトロール生合成イネから得られる米を含む代謝性疾患の予防又は改善のための薬学的組成物を提供する。特に、本発明のイネから得られる米を含む代謝性疾患の予防又は改善のための薬学的組成物を提供する。

本発明の薬学的組成物に含まれるレスベラトロールを含有する米はイネから得られる何加工が加えられていない米そのものだけでなく、米の有効成分を活性化するための加工が施された状態、米の抽出物、分画物などの前記米から製造されるすべての形態の物質を含むことができる。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。

本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速放出、持続放出又は遅延放出が提供できるように、当業界に公知となっている方法を用いて薬学的製剤に製造することができる。製剤の製造においては、活性成分を担体と共に混合又は希釈したり、容器形態の担体内に封入させることが好ましい。

したがって、本発明の薬学的組成物は、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌した注射用液の形態に製剤化して使用することができ、通常組成物の製造に使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよい。

本発明の組成物に含むことのできる担体は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。製剤化する際には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混合して製造される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。

経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、一般的に使用される単純な希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを含むことができる。

非経口投与のための製剤としては、無菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、マクロゴールなどを使用してもよい

以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は単に、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例１．レスベラトロール合成酵素遺伝子の分離及び塩基配列の解析
本発明のレスベラトロール合成酵素遺伝子を利用して、レスベラトロールを高濃度で生合成するイネを開発するために、レスベラトロールを高濃度で生合成するラッカセイのレスベラトロール合成酵素遺伝子を分離した。

まず、韓国の農村振興庁で育成したラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）の若いサヤを収穫して、液体窒素を用いて細かく破砕した後、ＴＲＩ試薬（ＭＲＣ、ＵＳＡ）を使用して全ＲＮＡを分離した。ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ ｍＲＮＡ Ｍｉｄｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を用いて全ＲＮＡを得た。

次に、Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、日本）を使用し、正方向・逆方向プライマーを用いてＲＴ-ＰＣＲを行った。ＲＴ-ＰＣＲは、逆転写過程（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）；５０℃、３０分、１サイクル、変性過程（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）；９４℃、２分、１サイクル、変性過程；９４℃、３０秒、アニーリング過程（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）；５７℃、１分、伸長過程（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）；６８℃、１分、３５サイクルを繰り返した。ここで使用した正方向・逆方向プライマーは、下記の通りである。
正方向プライマー
５'-ＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣ-３ '（配列番号２）
逆方向プライマー
５'-ＣＧＴＴＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣ-３ '（配列番号３）

前記ラッカセイのｍＲＮＡから増幅されたレスベラトロール合成ｃＤＮＡを遺伝子運搬体であるｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）にクローニングした後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して塩基配列解析に用いた。塩基配列解析は、ベクターに存在するＴ７とＳＰ６プライマーを使用し、ＬＩ-ＣＯＲ（ＵＳＡ）社のＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ４２００を用いた（配列番号１）。

実施例２．形質転換用ベクターの製作
実施例１で得られたレスベラトロール合成酵素遺伝子をイネに挿入するために形質転換用ベクターを作製した。

具体的には、イネ形質転換用ベクターを製作するために、ｐＣＡＭＢＩＡ ３３００ベクターをバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）にして、植物体全身における発現を誘導するためにユビキチンプロモーターを挿入して、選択マーカーとして除草剤耐性遺伝子ＢＡｒを挿入した。これをｐＳＢ２２ベクターと命名した。

前記実施例１のレスベラトロール合成酵素遺伝子をＢａｍＨ１制限酵素の標的配列を有する正方向プライマー（５'-ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧ-３ '、配列番号４）とＳａｃ１制限酵素の標的配列を有する逆方向プライマー（５'-ＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡ-３'、配列番号５）を用いてＰＣＲ反応を行って増幅した。

ＰＣＲは、初期変性過程；９４℃、２分を行った後、変性過程；９４℃、２０秒、アニーリング過程；６４℃、２０秒、伸長過程；７２℃、５０秒からなるサイクル３５回繰り返して、最後の伸長過程；７２℃、７分を行った。

前記ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨ１とＳａｃ１制限酵素で処理し、ｐＳＢ２２イネ形質転換ベクターに挿入した。挿入して作製したベクターは、ｐＳＢ２２２０と命名し、その構造は、図１に示した。

実施例３．レスベラトロール合成酵素遺伝子形質転換イネの製造
実施例２で製造したイネ形質転換用ベクターのｐＳＢ２２２０をイネに挿入するために、凍結融解（ｆｒｅｅｚｉｎｇ-ｔｈａｗｉｎｇ）法（非特許文献４）を用いて、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ. ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＬＢＡ ４４０４）に挿入した。

前記ｐＳＢ２２２０が挿入された、アグロバクテリウムをＡＢ（Ｋ_２ＨＰＯ_４６ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２ｇ、ＮＨ_４Ｃｌ ２ｇ、ＫＣｌ ０．３ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．６ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０２５ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０５ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｇ、ＤＷ１０ｍｌ）液体培地で２８℃で３日間培養して増殖させた後、１０倍濃縮してイネのカルス感染に用いた。

成熟したイネ種子の玄米を７０％エタノールで１分間、２％ＮａＣｌＯで１時間殺菌した。殺菌後の種子を滅菌水で５回以上洗浄し、２Ｎ６（Ｎ６塩 ３．９５ｇ/Ｌ、スクロース ３０ｇ/Ｌ、カザミノ酸 １ｇ/Ｌ、２,４-Ｄ ２ｍｇ/Ｌ、フィタゲル２ｇ/Ｌ、ｐＨ ５．６〜５．７）培地に入れ、２５℃の暗条件で約３週間培養してカルスを誘導した。

前記で誘導したイネのカルスのうち直径が３〜４ｍｍ程度のものを再度２Ｎ６培地に移し、２５℃の暗条件で４日間培養した。培養されたカルスにアグロバクテリウムを増殖させたＡＢ培地を混合して、２０間感染させた後、２Ｎ６ ＡＳ１００（２Ｎ６、１００ｕＭ アセトシリンゴン）培地に移し、２０℃の暗条件で３日間培養した。混合培養後、カルスを２５０ｍｇ/Ｌ セフォタキシムが添加された滅菌水で５回以上洗浄し、挿入されずに残っているアグロバクテリウムを除去した。

アグロバクテリウムに感染したカルスを２Ｎ６-ＰＴ５（Ｎ６塩 ３．９５ｇ/Ｌ、スクロース ３０ｇ/Ｌ、カザミノ酸 1ｇ/Ｌ、２,４-Ｄ ２ｍｇ/Ｌ、ホスフィノトリシン５ｍｇ/Ｌ、セフォタキシム ２５０ｍｇ/Ｌ 、フィタゲル２ｇ/Ｌ、ｐＨ ５．６〜５．７）培地に移し、２５℃の暗条件で４週間培養し、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）選抜マーカーに対して抵抗性を示して活発に生長するカルスを選抜した。

２Ｎ６-ＰＴ５培地で選抜されたカルスをＮ６-ＢＡ（Ｎ６ 塩 ３．９５ｇ/Ｌ、スクロース ２０ｇ/Ｌ、ソルビトール ３０ｇ/Ｌ、カザミノ酸 ２ｇ/Ｌ、２,４-Ｄ １ｍｇ/Ｌ、ＢＡＰ ０．５ｍｇ/Ｌ ＰＰＴ６ｍｇ/Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ/Ｌ、フィタゲル２ｇ/Ｌ、ｐＨ ５．６〜５．７）培地に移し、２５℃の暗条件で２週間培養して活発に生長するカルスを選抜した。

Ｎ６-ＢＡ培地で選抜されたカルスをＭＳＲ（ＭＳ 塩 ３．９５ｇ/Ｌ、スクロース ４０ｇ/Ｌ、ソルビトール ２０ｍｇ/Ｌ、ｍｙｏ-イノシトール１００ｍｇ/Ｌ、ＮＡＡ ０．１ｍｇ/Ｌ、キネチン ２ｍｇ/Ｌ、 ＰＰＴ ６ｍｇ/Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ/Ｌ、フィタゲル ５ｇ/Ｌ、ｐＨ ５．６〜５．７）培地に移し、２５℃で１６時間の明条件で１か月以上培養して植物体を分化させた。

再分化されたイネはペトリ皿の中で約４〜５ｃｍ程度の大きさになったら、ビン培地に移し照度約２万ルクス、２５℃で１６時間の明条件で２〜３葉まで生育させた。その後、苗をＧＭＯ温室の土壌に移植して種子を収穫した。再分化された当代の植物体をＴ０世代、この植物体から収穫した種子をＴ１世代と仮定して、Ｔ５世代まで進行させた。

実施例４．形質転換イネにおけるレスベラトロール合成酵素遺伝子の挿入有無の確認
４-１．遺伝子の単純挿入有無の確認
実施例３で製造された形質転換イネのレスベラトロール合成酵素遺伝子が挿入されているか否かをＰＣＲをによって確認した。

具体的には、実施例３で製造された形質転換イネ植物からゲノムＤＮＡを分離して、ＰＣＲを行った。前記ｐＳＢ２２２０ベクター製作時に使用した正方向・逆方向プライマー（正方向；５'-ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧ）-３ '、配列番号４、逆方向プライマー；５'-ＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡ-３ '、配列番号５）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。

ＰＣＲは、初期変性過程；９４℃、２分を行った後、変性過程；９４℃、２０秒、アニーリング過程；６４℃、２０秒、伸長過程；７２℃、５０秒からなるサイクル３５回繰り返して、最後の伸長過程；７２℃、７分を行った。

前記ＰＣＲの結果、１．１ ｋｂのレスベラトロール合成酵素遺伝子と思われるバンドが確認されて、形質転換イネのゲノムにレスベラトロール合成酵素遺伝子が安定的に挿入されたことを確認した。

４-２．挿入遺伝子の挿入位置の分析
実施例３で製造された本発明のレスベラトロール生合成形質転換イネにおけるレスベラトロール合成酵素遺伝子のイネゲノム内の位置を確認するために制限酵素処理した後、アダプタを取り付けてＰＣＲを行い、その産物の塩基配列を解析して確認した。

具体的には、前記実施例３で製造された形質転換イネ植物からゲノムＤＮＡを分離し、制限酵素で処理した。ＨａｅＩＩＩ制限酵素により３７℃で４時間反応させた後、アダプター（ｔｃｃｃｔｔｔａｇｔｇａｇｇｇｔａａａｔｔ ｇ）を付着し、ＰＣＲ反応を行った。

ＰＣＲは、初期変性過程；９４℃、２分を行った後、変性過程；９４℃、１分、アニーリング過程；６３℃、３０秒、伸長過程；７２℃、２分で行われたサイクル３５回繰り返し、最後の伸長過程；７２℃、7分を行った。塩基配列解析は、イネに存在するＴ７とＳＰ６プライマーを使用してＬＩ-ＣＯＲ（ＵＳＡ）社のＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ４２００を用いた。

前記のように、レスベラトロール合成酵素遺伝子がイネの１２番目の染色体に挿入されたことが確認されたイネの系統を、本発明の形質転換イネに決定した。

４-３．挿入遺伝子の構造分析及び周辺の塩基配列の解析
実施例３で製造された本発明のレスベラトロール生合成形質転換イネに対する挿入遺伝子のゲノムＤＮＡ上の挿入位置及び挿入周辺の塩基配列を確認するために隣接したＤＮＡの配列解析を行った。本発明の形質転換イネに二つのＴ-ＤＮＡが挿入された事実とその周辺の塩基配列及び挿入されたＴ-ＤＮＡの構造を分析した。結論として、二つのＴ-ＤＮＡがイネの染色体の１２番目の同一位置に互いに向かい合う方向に挿入されていることを確認した。

本発明のレスベラトロールの生合成形質転換イネに導入されたＴ-ＤＮＡの挿入位置の周辺部分と、本発明で使用したドンジンイネに類似し、且つ配列解析が完了しているジャポニカイネである日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のＮＣＢＩに開示された配列データを比較分析した結果、ＮＣＢＩに開示された日本晴の配列の１２番目の遺伝子（ＮＣＢＩ受託番号. ＮＣ_００８４０５）の３３０８７２番塩基の位置に一つ目のＴ-ＤＮＡが挿入され、引き続き二つ目のＴ-ＤＮＡが逆方向に連結されて挿入されていることを確認しており、具体的には、１２番目の染色体の３３０８７１番塩基と一つ目のＴ-ＤＮＡの導入開始位置（ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ）が連結されて二つ目のＴ-ＤＮＡの導入開始位置（ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ）は、同じ染色体の３３０９０８番塩基に連結しているのを確認した。結論として、本発明の形質転換イネは、二つのＴ-ＤＮＡが逆方向に連結された単一構造の形態で１２番目の染色体に挿入されていることが確認された（図１ｂ）。

前記解析した周辺の塩基配列は、配列番号７の塩基配列で検索された。具体的には、本発明のレスベラトロール合成酵素遺伝子は、配列番号７の５７２番塩基の後に挿入されたことが確認された。つまり、配列番号７の５７２番塩基と連結され、ニつのＴ-ＤＮＡが連続挿入されて６０９番塩基に連結されていることが分かった。

これは、前記形質転換イネの種子をレスベラトール強化イネ（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ-ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｒｉｃｅ ）と命名し、２０１３年１２月５日付で韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１２５２９ＢＰで寄託された。

実施例５．形質転換イネのレスベラトロール生合成の分析
実施例３で製造された形質転換イネでにおいて、レスベラトロールが実際に生成されるかについてＨＰＬＣ分析によって確認した。

具体的には、Ｔ５世代の形質転換イネの玄米種子を摩砕した後、６００ｍｇの粉末を２ｍＬのチューブに入れて、３０％メタノール６００ｕｌを添加した。これを４５℃で５０分間、１５０ｒｐｍで撹拌して、レスベラトロールが抽出されるようにした。抽出チューブを４℃、１０，０００ｇで５分間遠心分離した後、該上澄液を０．２μｍのメンブレンスフィルターで濾過し、ＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｔｅｒｓ社のＡｌｌｉａｎｃｅ（Ｗａｔｅｒｓ ２６９５、Ｉｒｅｌａｎｄ）とＸＴｅｒｒａ ＲＰ１８、５μｍ ４．６×２５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を用い、溶媒は水とアセトニトリルを勾配条件とした。

勾配条件は、はじめの０〜５分間は、水とアセトニトリルを９０:１０（ｖ/ｖ）で、５〜６５分間は水とアセトニトリルを７０:３０（ｖ/ｖ）を勾配条件として分析を行った。分析は抽出液１０μｌを注入して、流速 １．０ｍｌ/分、ＵＶ３０８ｎｍの波長で測定した。レスベラトロール、レスベラトロールとの配糖体結合物であるピセイド（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ-３-Ｏ-Ｄｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）のピークは、標準物質のＵＶスペクトル、リテンションタイムを基準に推定した。

分析の結果、実施例３によって製造された本発明の形質転換イネは、高濃度のレスベラトロールとピセイドを含むことを確認した。

実施例６．レスベラトロール生合成イネの生育及び収穫条件に応じたレスベラトロールの含有量の変化
実施例６-１．露地栽培条件での田植え時期に応じたイネの生育特性
本発明のレスベラトロール生合成イネの田植えを、露地栽培条件で６月１日、６月１５日、６月３０日に行った結果、田植え後の葉の発育終了までは、６月１日の田植えでは田植え後７５．１日、６月１５日の田植えでは６５．１日、６月３０日の田植えでは５５．１日の期間を要し、この時期の積算温度はそれぞれ１,８８６℃、１，６８８℃、１，４７４℃であった。この際、全開した葉の数は、それぞれ１３．０葉、１１．６葉、１１．２葉で、６月１日に田植えを行った場合、出穂期が一般の中晩生種の品種よりも４〜５日遅れるという傾向を示した（図１１）。

その結果、出穂期は、６月１日に田植えを行った場合は８月２２日、６月１５日に田植え行った場合は８月２７日、６月３０日に田植えを行った場合は８月３１日であり、田植えの時期が遅れた場合には、登熟が完全に行われない可能性が高いという特性を示した。

実施例６-２．高温栽培条件（ビニール温室）での田植え時期に応じたイネ生育の特性
高温条件での本発明のレスベラトロール生合成イネの出穂期は、露地条件の６月１日の田植えに比べ（８月２２日出穂）、温度が上昇するにつれて出穂が早くなり、３．５℃の温度上昇条件で出穂が５日早くなるという結果を示した。

前記表１から確認できるように、６月１５日の田植えでは、露地栽培条件で８月２７日に出穂していたものが２日早くなり、６月３０日の田植えでは、８月３１日に出穂ていたものが１日早くなっていたことから、６月１日に田植えしたものと比べて、温度上昇がイネの生育の短縮に及ぼす影響は、田植えの時期が遅いほど少なくなる傾向を示した。

実施例６-３。田植えの時期及び高温条件に応じた米の量の変化
本発明のレスベラトロール生合成イネの田植え時期及び高温条件に応じた米の量の変化を測定した。

前記表２から確認できるように、２０１０年には登熟期に平年に比べて日照時間が不足しており、登熟後期に急激な気温の低下により６月１日に田植えした場合の米の量が５２０ｋｇ/１０ａと最も多かったが、田植えの時期が遅くなるほど収穫量が減少する傾向を示した。

出穂期が比較的早かった６月１日の田植えでは、温度が上がるほど収穫量が急激に減少して、３．５℃の温度上昇の条件では、収穫量が２１７ｋｇ/１０ａと非常に少なかった。

田植えの時期が遅くなるほど温度上昇による収穫量の減少は相対的に少なく、１．４℃の温度上昇条件で米の量は最も多かった。６月１日の田植え時の温度上昇条件で収穫量の減少に最も大きな影響を与える収穫量の構成要素は登熟であって、温度上昇の際に登熟率が急激に減少する傾向を示した。

実施例６-４．田植え時期に応じた収穫量及びレスベラトロール含有量の変化
本発明のレスベラトロール生合成イネの田植え時期に応じたレスベラトロール含有量の変化を測定した。

レスベラトロールの含有量は、田植えの時期が遅くなるほど増加しており、６月１５日の田植え条件で最大の米の収穫量と高いレスベラトロール含有量を示した（図１２）。

実施例６-５．田植えの時期、栽培温度、収穫時期に応じたレスベラトロール及びピセイドの含有量の変化
本発明のレスベラトロール生合成イネの田植え時期、栽培温度、収穫時期に応じたレスベラトロール及びピセイドの種子又は植物体内の含有量の変化を測定した。

前記表３から確認できるように、田植えの時期が遅くなるほど、レスベラトロールの含有量は増加しており、同じ田植え条件では、高温ストレス処理した時、レスベラトロールの含有量が増加した。出穂後４０日目に収穫処理されたグループが全体的にレスベラトロールの含有量が高かった。

また、前記表４から確認できるように、ピセイドはレスベラトロールの配糖体型であって、イネの登熟が進むにつれて、葉に保存されていたピセイドの含有量が徐々に減少する傾向を示した。しかし、田植えの時期が遅くなって、登熟が遅く行われたり、高温条件で登熟が行われた場合、葉にピセイドの含有量が高い傾向を示したが、これは、高温ストレスに伴うファイトアレキシンの効果によるものと判断される。

実施例６-６．栽培環境に応じた種子内のレスベラトロールの含有量の変化
本発明のレスベラトロール生合成イネの栽培環境に応じた種子内（玄米）のレスベラトロールの含有量を測定した。

図１３から確認できるように、登熟期の高温条件に応じて、種子内のレスベラトロールの含有量は増加しており、２℃以上の高温条件では、露地に比べ約２０％以上、レスベラトロールが増量した。

６月１日及び６月１５日の田植え時の高温条件におけるレスベラトロールの増加は、同様の傾向を示したが、６月３０日の田植え栽培時の温度が高くなるほど、レスベラトロールの含有量も急激に増加した。

実施例６-７．実際の地域差による生育特性
本発明のレスベラトロール生合成イネの農業的特性を解明するために、本発明のレスベラトロール生合成イネと形質転換母品種であるドンジンイネを比較品種として、農業的特性を調査した。

具体的には、ドンジン、既存の形質転換イネ（天然型イネの４番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が２コピー向き合う方向に挿入された形質転換イネ）及び本発明のレスベラトロール生合成イネを栽植距離３０×１５ｃｍ、１株当たり苗数が３本ずつの乱塊法３反復で、益山（イクサン）、水原（スウオン）、密陽（ミリャン）など３箇所で隔離包装で栽培し、生育特性と収穫量を調べた。

前記表５から確認できるように、益山と密陽は生育特性と収穫量が、同様の結果を示したが、水原地域で栽培された試験系統は全て益山に比べて出穂が遅延し、穂丈は１２ｃｍ以上短くなり、穂数、１穂当たりの粒数、登熟率が低く、益山地域に比べて米の収穫量の指数はが約１２％程度減少していたが、対照区であるドンジンイネに比べ収穫量指数は益山、水原、密陽すべて同様の傾向値を示した。

また、前記方法により隔離包装で栽培した種子を収穫して 搗精後に白米のレスベラトロールの含有量を分析した。

前記表６から確認できるように、レスベラトロールは、既存の形質転換イネが１．４０μｇ/ｇ合成されたのに比べ、本発明のレスベラトロール生合成イネは２．０１μｇ生合成されたことが確認された。

益山、水原、密陽などの３箇所の地域で栽培されたドンジン、既存の形質転換イネ（天然型イネの４番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子が２コピー向き合う方向に挿入した形質転換イネ）、及び本発明のレスベラトロール合成イネなど３系統の３反復籾試料を搗精して白米に製造した後、ＨＰＬＣを用いてレスベラトロールの含有量を分析した。

前記表７から確認できるように、既存の形質転換イネ、本発明のレスベラトロール合成イネ系統のレスベラトロールの含有量は 益山地域に比べて、２つの系統が両方とも、水源、密陽でそれぞれ約３０％、２５％以上の含有量の増加を示した。これらの結果は、レスベラトロール合成酵素遺伝子のファイトアレキシンの効果により栽培地域の温度差に応じてレスベラトロール合成量が増加したためである。

実施例７．代謝性疾患が誘導された動物モデルにおけるレスベラトロール生合成米の効果測定
本発明のレスベラトロールを高濃度に含む米が代謝性疾患に及ぼす影響を確認するために、長期間の高脂肪食餌方法により、代謝性疾患が誘導された動物モデル（マウス）を用いて確認した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ/６ 近交系マウス（ｉｎｂｒｅｄ ｍｏｕｓｅ）各１５匹に１２週間高脂肪の食事を与え、糖尿病、肥満、高脂血症及び高コレステロール症などの代謝性疾患モデルを確立した。その後、形質転換イネ又はドンジンイネの種子を用いて作製した飼料を実験動物に１２週間給与した。１２週間給与した後、３週間に一回ずつ尾静脈から採血して血糖、コレステロールなどを分析し、代謝性疾患の動物モデルにおけるレスベラトロール生合成米、形質転換イネの効能を確認した。

実施例７-１．血糖の比較測定
前述のとおり、実験動物の飼料において炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与えた後、血糖を測定した（図２）。

図２に示すように、形質転換イネで製造した飼料を摂取したマウスの場合には、８週目から血糖が低下し始めて、１２週目には血糖２２．０％が減少したのに対して、他の対照群はほとんど変化がなかったり、むしろ増加したことが確認された。さらに、形質転換イネで作製した飼料と同量のレスベラトロールを含んだ一般の飼料（Ｒｅｓｖ）を摂取した場合にも、ほとんど差がないことを確認することにより、形質転換イネによる血糖の降下現象は、単なるレスベラトロールの含有を超越する優れた効果があることが分かった。

実施例７-２．血中脂質代謝の比較測定
前述のとおり、実験動物の飼料の炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与えた後、血中の総コレステロールの量、血中の総中性脂肪の量、血中ＬＤＬコレステロールの量及び血中のＨＤＬコレステロールの量を測定した（図３）。

図３に示すように、形質転換イネで製造した飼料を摂取したマウスの場合には、総コレステロール量２７．０％、血中の総中性脂肪量３７．４％、血中ＬＤＬコレステロール量５９．６％を減少させる効果があることを確認すると共に、代謝疾患の予防に作用する血中のＨＤＬコレステロールは１４．８％増加させることを確認した。

また、他の対照群は、形質転換イネで製造した飼料を摂取した群に比べて効果がないか、又は劣ることを確認し、さらに、形質転換イネで製造した飼料と同量のレスベラトロールを含んだ一般の飼料（Ｒｅｓｖ）を摂取した場合に比べても、形質転換イネで製造した飼料を摂取した群は、優れた血中脂質改善効果があることを確認した。これは、形質転換イネによる血中脂質改善効果が、単なるレスベラトロールの含有を超越する優れた効果があることを確認したものである。

実施例７-３．体重及び体脂肪の比較測定
前述のとおり、実験動物の飼料において、炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与えた後、体重の変化及び総脂肪量を測定した（図４）。

図４に示すように、形質転換イネで製造した飼料を摂取したマウスの場合には、体重が２４．７％減少する効果があることが確認でき、同時にインビボマイクロＣＴを用いて脂肪量を測定した結果、総体脂肪２１．５５％（対照群２５．４３％）、腹部脂肪１６．３３％（対照群２０．０２％）、皮下脂肪３．１％（対照群３．８３％）と、対照群に比べて総脂肪量が顕著に減少することを確認した。

本発明者は、同様のレスベラトロール合成酵素遺伝子が、他の染色体の位置に挿入された形質転換イネと本発明のイネの効能を比較しようと試みた。このため、天然型イネの４番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子を挿入した形質転換イネの効能を確認した。

まず、実施例１〜３に開示された方法により、レスベラトロール合成酵素遺伝子を天然型イネの４番目の染色体に挿入した形質転換イネを製作した。また、実施例４に記載の方法で、レスベラトロール合成酵素遺伝子が４番目の染色体２９，３５８，３４２番塩基に挿入されたことを確認し、これを比較群形質転換イネ命名した。

前記比較群形質転換イネは、１．６０±０．０５μｇ/ｇ（玄米）、又は１．４１±０．０１４μｇ/ｇ（白米）のレスベラトロールを含有しており、３．２１±０．０６μｇ/ｇ（玄米）、又は０．４８±０．０３μｇ/ｇ（白米）のピセイドを含むことを確認したことにより、レスベラトロール合成酵素遺伝子が正常に作用するレスベラトロール生合成イネであることを確認した。
このようにして製造されたさらに別のレスベラトロール生合成イネの効能を、実施例７と同様の方法により代謝性疾患誘導動物で確認した。

比較例１-１．血糖の比較測定
前述のとおり、実験動物の飼料において、炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有イネ比較群形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与えた後、血糖を測定した（図５）。

図５に示すように、比較群形質転換イネを摂取したマウスは、同量のレスベラトロールを含むドンジンイネを摂取した群よりも実験期間の間中、血糖が高い状態であることが確認できる。

即ち、形質転換イネについての実験である図２では、形質転換イネと同量のレスベラトロールを含んだ飼料を摂取した場合よりも、形質転換イネを摂取した場合に、血糖が低下する効果がより優れていることが確認できるのに対して、比較群の形質転換イネにつての実験である図で５は、同量のレスベラトロールを含んだ飼料に比べて同等であるか、むしろ効果が劣ることが確認された。

比較例１-２．血中脂質代謝の比較測定
前述のとおり、実験動物の飼料において、炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有イネの比較群の形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与えた後、血中の総コレステロール量、血中の総中性脂肪量、血中ＬＤＬコレステロール量と血中のＨＤＬコレステロール量を測定した（図６〜図９）。

図６〜図９に示すように、比較群形質転換イネを摂取したマウスは、同量のレスベラトロールを含むドンジンイネを摂取した群に比べ、血中の総コレステロール量、血中の総中性脂肪の量及び血中のＬＤＬコレステロール量にはほとんど差がないか、むしろ高く、効果が劣ることを確認することができる。一方、血中のＨＤＬコレステロール量はやや増加したが、有意差はなかった。

即ち、形質転換イネの実験である図２では、形質転換イネと同量のレスベラトロールを含んだ飼料を摂取した場合よりも、形質転換イネを摂取した場合に、血中の総コレステロール量、血中の総中性脂肪量、血中ＬＤＬコレステロール量を減少させる効果及び血中のＨＤＬコレステロールを増加させる効果があることが確認されたのに対し、比較群形質転換イネについての実験である図６〜図９は、同量のレスベラトロールを含んだ飼料に比べてむしろその効果が劣ることが確認された。

比較例１-３．体重の比較測定
前述のとおり、実験動物の飼料において、炭水化物の部分をドンジンイネとレスベラトロール含有イネ比較群形質転換イネで代替した飼料を、代謝性疾患が誘導されたマウスに与えた後、体重の変化を測定した（図１０）。

図１０に示すように、比較群形質転換イネを摂取したマウス群と同量のレスベラトロールを含んたドンジンイネを摂取した群を比較した時、９週目まではほとんど差を示さなかったが、１２週目に体重が多少減少しているのが確認された。

しかし、形質転換イネにつての実験である図４ａの２４．７％に達する顕著な差と比較した時、比較群形質転換イネの減少効果は６％程度の微弱な程度であることが確認された。

前述の結果をまとめると、天然型イネの１２番目の染色体にレスベラトロール合成酵素遺伝子を挿入した本願発明の形質転換イネが、他の染色体に同じ遺伝子が挿入された形質転換イネに比べて、代謝性疾患の予防又は治療効果に優れていることが確認された。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的なものではないことを理解するべきである。本発明の範囲は前述の詳細な説明ではなく、後述の特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (14)

1. 天然型イネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列の５７２番塩基の後に２コピーのレスベラトロール合成酵素（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子が連続的に発現可能に、互いに向かい合う方向に挿入されて、レスベラトロールを生合成するイネ。
2. 前記レスベラトロール合成酵素遺伝子が、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）由来である、請求項１に記載のイネ。
3. 前記レスベラトロール合成酵素遺伝子が、配列番号１の塩基配列で構成されたものである、請求項１に記載のイネ。
4. 前記イネは、受託番号ＫＣＴＣ１２５２９ＢＰである、請求項１に記載のイネ。
5. 前記イネは、種子完熟時に玄米の場合２〜５．３μｇ/ｇ、白米の場合１．８〜４．１μｇ/ｇのレスベラトロールを含有するものである、請求項１に記載のイネ。
6. ピセイド（ｐｉｃｅｉｄ）をさらに生合成する、請求項１に記載のイネ。
7. 前記イネは、種子完熟時に、白米の場合１．０〜６．５μｇ/ｇのピセイドを含有するものである、請求項６に記載のイネ。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載のイネから得られる米。
9. 天然型イネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列の５７２番塩基の後に２コピーのレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に、互いに向かい合う方向に挿入されて、レスベラトロールを生合成するイネから得られる米を含む、代謝性疾患の予防及び改善のための健康機能食品組成物。
10. 前記天然型イネが、天然型ドンジン米（Ｄｏｎｇｉｎ ｒｉｃｅ）である、請求項９に記載の健康機能食品組成物。
11. 前記レスベラトロールを生合成するイネが、ピセイドをさらに生合成するものである、請求項９に記載の健康機能食品組成物。
12. 前記代謝性疾患が、肥満、糖尿病、高脂血症及び高コレステロール症からなる群から選択される、請求項９に記載の健康機能食品組成物。
13. 天然型イネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列の５７２番塩基の後に２コピーのレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に、互いに向かい合う方向に挿入されて、レスベラトロールを生合成するイネから得られる米を含む、代謝性疾患の予防や改善のための動物飼料組成物。
14. 天然型イネの１２番目の染色体に存在する配列番号７の塩基配列の５７２番塩基の後に２コピーのレスベラトロール合成酵素遺伝子が発現可能に、互いに向かい合う方向に挿入されて、レスベラトロールを生合成するイネから得られる米を含む、代謝性疾患の予防及び改善のための薬学的組成物。