JP6174149B2

JP6174149B2 - セバシン酸を調製するための方法

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Publication number: JP6174149B2
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Inventors: ピアテジ，アンドレア; バルデニウス，カイ−ウーヴェ; ディトリッヒ，クラウス; キンドラー，アロイス; ツァヤクツコウスキー−フィッシャー，マルタ; ベーリング，ラルフ; レーフィンガー，アルヴィン
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Description

本発明は、セバシン酸を調製するための新規方法に関する。特に、本発明は、リノール酸から開始し、該リノール酸を10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸へとヒドロキシル化してからさらにセバシン酸へと変換する、セバシン酸の化学酵素的製造に関する。

セバシン酸は現在、圧力下かつ高温下でのリシノレイン酸(12-ヒドロキシ-9-cis-オクタデセン酸)のアルカリ開裂により、ヒマシ油から製造されている。

セバシン酸およびその誘導体は、生分解性高分子、可塑剤、潤滑油、作動油、ロウソクおよび化粧品の重要な成分である。

不飽和脂肪酸の微生物酸化に関する概要は、次の刊行物：Hou C. T.(1995) Adv. Appl. Microbiol., 41, 1-23に記載されている。

シュードモナス調製物によるリノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸への酵素的水和は、収率が57％であるとSchroepfer G.J.ら((1970) J. Biol. Chem., 245, 3798-3801)により記載されている。

US 4,582,804中でLitchfieldおよびPierceは、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)の細胞がリノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸への収率22％での水和を触媒することを開示している。

Houにより、フラボバクテリウム(Flavobacterium)DS5酵素系による、リノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸への収率55％での水和が報告されている(Hou C.T. (1994) J. Am. Oil Chem. Soc., 71, 975-978)。

ヒツジ第一胃由来のエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)の菌株を使用した、収率22％での同様の変換も示されている(Hudson J.A.ら(1998) FEMS Microbiology Letters, 169, 277-282)。

Demirらによる報告には、抗癌性、脂肪低減性および高血圧抑制性を有する化合物であるcis-9,trans-11-オクタデカジエン酸(CLA)へのリノール酸の化学酵素的変換が記載されている。リノール酸はラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)により10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸へと変換され、次いでマイクロ波照射下でのヨウ素による処理によりCLAが高収率で製造される(Demir A.S.ら(2010) J. Agric. Food Chem., 58, 1646-1652)。

多数の報告書に不飽和脂肪酸の水和のための全微生物体または細胞抽出物の使用が記載されているものの、詳細に特徴付けられた酵素は2009年まで存在しなかった。Beversらは、エリザベスキンギア・メニンゴセプティカ(Elizabethkingia meningoseptica)由来のオレイン酸ヒドラターゼ(EC 4.2.1.53)の単離、大腸菌(E. coli)における組換え発現および特徴付けについて初めて記載した(Bevers L.E.ら(2009) J. Bacteriol., 191, 5010-5012)。

化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)由来のヒドラターゼを使用することによるヒドロキシ脂肪酸の製造のための方法は、WO2008／119735に記載されている。

近年の報告により、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)由来およびリジニバチルス・フシホルミス(Lysinibacillus fusiformis)由来のオレイン酸ヒドラターゼは、オレイン酸と比較すると比活性が低下するものの、リノール酸を水和できることが示された(Young-Chul Jooら(2012) J. Biotechnol., 158, 17-23 およびBi-Na Kimら(2011) Appl. Microbiol. Biotechnol., オンライン)。

US 4,582,804 WO 2008／119735

Hou C. T.(1995) Adv. Appl. Microbiol., 41, 1-23 Schroepfer G.J.ら((1970) J. Biol. Chem., 245, 3798-3801) Hou C.T. (1994) J. Am. Oil Chem. Soc., 71, 975-978 Hudson J.A.ら(1998) FEMS Microbiology Letters, 169, 277-282 Demir A.S.ら(2010) J. Agric. Food Chem., 58, 1646-1652 Bevers L.E.ら(2009) J. Bacteriol., 191, 5010-5012 Young-Chul Jooら(2012) J. Biotechnol., 158, 17-23 Bi-Na Kimら(2011) Appl. Microbiol. Biotechnol., オンライン

目的
セバシン酸の需要が増大していることから、リシノレイン酸以外の容易に入手可能な抽出物から開始する、セバシン酸の合成に至る新規経路を提供することを本発明の目的とする。

発明の主題
前記目的は、本発明の特許請求の範囲によれば、第1工程(i)においてオレイン酸ヒドラターゼによって触媒されるリノール酸と水との反応により10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を形成させ、第2工程(ii)において該10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を1-オクテンおよび10-オキソ-デカン酸へと熱分解し、かつ第3工程(iii)において該10-オキソ-デカン酸をセバシン酸へと酸化することによる、セバシン酸を調製するための方法により達成される。

図1は、この酵素的変換のGC分析を示したものである。図1(A)大腸菌(E.coli)TOP10のみと共に室温で一晩インキュベートしたオレイン酸。オレイン酸の保持時間：8.161分。(B)オレイン酸ヒドラターゼを発現している大腸菌(E. coli)TOP10と共に室温で一晩インキュベートしたオレイン酸。10-HSAの保持時間：9.340分。図2(A)10-HOAのGC分析：10-HOAの保持時間：9.971分。(B)10-HOAの典型的なフラグメンテーションパターンを示す、反応生成物のGC-MS分析。図3は、マイクロリアクター中での10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸(10-HOA)の熱開裂のための実験装置の概略図を示したものである。

工程(i)
本発明の方法は、リノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸への変換から開始する。本発明の方法の工程(i)に関しては、化学的に純粋なリノール酸、ならびにリノール酸を主成分として、好ましくは基質の60重量％より多く、より好ましくは70％重量または80重量％より多く含有する該基質を使用することができる。

かかる基質は、グリセロールエステルの形態のリノール酸含量が多い油から、該グリセロールエステルを加水分解しかつ遊離酸またはその塩の形態のリノール酸を回収することにより、調製することができる。かかる油は、例えば、ベニバナ油(78％リノール酸)、グレープシードオイル(73％リノール酸)、ケシ油(70％リノール酸)であり、または大抵好ましいのはヒマワリ油(68％リノール酸)である。

リノール酸をヒマワリ油などの複合油から製造する場合、その脂肪酸調製物は、リノール酸に加えて、本発明の反応の工程(i)を実施する時に存在しうる他の脂肪酸を含有していてもよい。これらの他の脂肪酸は、後の反応工程で、好ましくは工程(ii)の後に、反応から除去することができる。

工程(i)に適した酵素としては、先に記載したような先行技術における多数のオレイン酸ヒドラターゼ、例えばシュードモナス属(Pseudomonas)、ロドコッカス属(Rhodoccocus)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、エンテロコッカス属（Enterococcus）、リジニバチルス属(Lysinibacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ステノトロホモナス属(Stenotrophomonas)、エリザベスキンギア属(Elizabethkingia)の生物に由来するオレイン酸ヒドラターゼがある。

これらの酵素は、リノール酸を10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸に変換することが当分野で知られている。該酵素に加えて、他のオレイン酸ヒドラターゼも、当業者であれば、モデル反応としてオレイン酸の10-ヒドロキシステアリン酸への変換を利用して、または標的化反応としてリノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸への変換を利用して、微生物をスクリーニングすることにより容易に見出すことができる。この反応は試験管アッセイで実施することが可能であり、またそのため、同時に何千もの微生物を短期間でスクリーニングすることができる。

幾つかのオレイン酸ヒドラターゼの配列は公知であるため、他のオレイン酸ヒドラターゼに関して微生物のゲノムをin silicoでスクリーニングし、さらにその陽性集団をオレイン酸の10-ヒドロキシステアリン酸への変換またはリノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸への標的化反応について試験することも可能である。

別の方法は、保存領域または相同領域を検出しかつ定方向遺伝子突然変異誘発のための開始点を見出すために既知オレイン酸ヒドラターゼ由来の配列を比較することによる、改善された活性またはより良好な耐熱性もしくは耐溶剤性を有する酵素に至るための、既知オレイン酸ヒドラターゼの遺伝子操作である。

好適な酵素は、EC 4.2.1.53のオレイン酸ヒドラターゼである。このクラスの酵素の代表例は、エリザベスキンギア・メニンゴセプティカ(Elizabethkingia miningoseptica)由来の酵素(Beversら(2009) J.Bacteriol. 191, 5010-5012)である。そのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は配列番号1および2として開示されている。

好適な酵素は、配列番号2、もしくはかかるポリペプチド配列の断片(該断片はオレイン酸ヒドラターゼの酵素活性を有するタンパク質として十分なものとする)を有する酵素、またはオレイン酸ヒドラターゼをコードしかつストリンジェントな条件下で配列番号2をコードするヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むか、もしくは該ヌクレオチド配列の断片(該断片はオレイン酸ヒドラターゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするには十分なものとする)を含む核酸配列を有する酵素である。

本発明はさらに、オレイン酸ヒドラターゼの酵素活性と、配列番号2に示すアミノ酸配列、または配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも75％もしくは80％、好ましくは少なくとも85％、90％もしくは95％、より好ましくは少なくとも95％もしくは97％、および最も好ましくは少なくとも98％もしくは99％同一であるアミノ酸配列とを有する酵素に関する。

酵素の溶解度および発現レベルを改善するために、かかる酵素をN-(またはC)-末端融合パートナー(タンパク質またはペプチド)を用いて組換えにより発現させることができる。改善された溶解度および／または発現レベルのための融合パートナーとして使用される典型的なタンパク質またはタグは、以下のもの：マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ジスルフィド酸化還元酵素／異性化酵素、T7タグ、SETタグ、Nus A、MisticおよびSUMOである。

本発明に関しては、「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションが、特異的ハイブリダイゼーションを確実なものとするには十分にストリンジェントな条件下、in vitroで実施されることを意味する。ストリンジェントなin vitroハイブリダイゼーション条件は当業者には公知であり、また文献中に見出すこともできる(例えばSambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第3版、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY)。「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ある分子が、好ましくはある特定の核酸配列、標的配列にストリンジェントな条件下で結合し、該標的配列が複合混合物(例えば、DNAまたはRNA分子の複合混合物)の一部である場合には、他の配列には結合しないか、または少なくともかなり低い程度に結合するという事実を指す。

ストリンジェントな条件はその環境によって異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション温度が規定イオン強度および規定pH値での特定配列の融解点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmとは、標的配列に相補的な分子の50％が平衡状態で該標的配列にハイブリダイズする温度(規定pH値、規定イオン強度および規定核酸濃度での温度)である。典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がpH 7.0〜8.3で少なくとも約0.01〜1.0 Mのナトリウムイオン濃度(または別の塩の濃度)であり、かつ温度が短い分子(すなわち例えば10〜50個のヌクレオチド)の場合に少なくとも30℃である条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件には、ハイブリッドを不安定化させるホルムアミドなどの薬剤の添加が含まれる場合がある。本明細書中で使用するストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにおいては、互いに少なくとも60％相同であるヌクレオチド配列は、通常、互いにハイブリダイズしたままである。好ましくは、ストリンジェントな条件は、互いに少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約70％、および特に好ましくは少なくとも約75％、またはそれ以上相同である配列が通常は互いにハイブリダイズしたままとなるように選択される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適で非限定的な例は、6 x 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中約45℃でのハイブリダイゼーションと、その後の0.2 x SSC、0.1％ SDS 中50〜65℃での1回またはそれ以上の洗浄工程である。その温度は、例えば、標準的なハイブリダイゼーション条件下では核酸のタイプに応じて、水性緩衝液中0.1〜5 x SSC(pH 7.2)の濃度で42℃〜58℃である。

有機溶媒、例えば50％ホルムアミドが上記緩衝液中に存在する場合、標準条件下の温度は約42℃である。好ましくは、DNA：DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば0.1 x SSCおよび20℃〜45℃、好ましくは30℃〜45℃である。好ましくは、DNA：RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば0.1 x SSCおよび30℃〜55℃、好ましくは45℃〜55℃である。前記のハイブリダイゼーション温度は、例えば、ホルムアミドの非存在下で約100塩基対の長さと50％のG／C含量を有する核酸に対して決定されたものである。当業者であれば、上記、または以下のテキスト：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N. Y. (1989), Hames und Higgins (出版社) 1985, Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford；Brown(出版社) 1991, Essential Molecular Biology：A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxfordを利用して所要のハイブリダイゼーション条件を決定する方法を心得ている。

酵素的水和の立体特異性は、本発明の方法にとって重要ではない。従って、工程(i)において製造された10(R)もしくは10(S)-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸または混合物(ラセミ化合物)のいずれかを次の工程(ii)において使用することができる。

リノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸への酵素的変換は、リノール酸および水を含有する反応媒体中で実施することができる。リノール酸を遊離酸(油相)の形で使用する場合、酵素を含む水または緩衝化水含有溶液を第2の液相(水相)とする。迅速な反応のためのエマルションを形成させるには、これら2種の液相を完全に混合すべきである。

しかし、工程(i)は、容易に反応媒体から取り出しかつ再利用しうる固定化酵素を用いて実施することもできる。酵素は一般に、吸着、共有結合、膜封入、ゲル封入および架橋などの種々の方法により固定化することができる。固定化用担体材料の性質は、酵素失活を避けるために最適化すべきである。典型的な担体は、有機材料(天然および非天然)または無機材料のいずれかでありうる。無機材料は通常、圧力に対する良好な耐性を備えており、一方で有機材料は良好な化学的安定性を示す。無機担体は、典型的には酸化ケイ素もしくは酸化アルミニウム、またはそれらの混合物をベースとする多孔質材料である。天然の有機担体は、例えば、セルロース、デンプン、デキストラン、寒天またはキチンのような多糖類である。コラーゲン、ゼラチンまたはアルブミンのようなタンパク質を使用することもできる。合成有機担体としては、ポリ(メタ)アクリラート、ポリアクリルアミド、ビニル-およびアリルポリマー、ポリエステル、ポリアミドが挙げられる。

工程(i)は、リノール酸を含有する有機相に酵素調製物(水相)を添加する2相系で実施することができる。水相／リノール酸相比は幅広く変更することができる。

前記の反応は、追加の溶媒の有無にかかわらず実施することができる。溶媒の選択に関しては、当業者は生成物の収率、反応速度、形成される懸濁液の扱いやすさ、および溶媒のコストで判断する。

有利な溶媒は、リノール酸と混合することが可能であり、化学的に不活性である、すなわち酵素と反応しないかまたは酵素活性を阻害する溶媒である。

生体触媒法において典型的な有機溶媒は、以下のもの：ヘキサン、ヘプタン、ドデカン、ヘキサデカン、エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、トルエン、ジメチルスルホキシド、アセトン、2-ペンタノン、2-ヘプタノンである。工程(i)のための反応温度は使用する酵素の熱安定性によって異なり、また通常は10〜50℃、好ましくは20〜40℃である。しかし、熱安定性が高い酵素を使用する場合、50℃を超える反応温度もまたありうる。

形成された10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸は、反応媒体から従来法、例えば結晶化または抽出により取り出すことができる。

本発明の反応の次の工程、すなわち工程(ii)に関しては、10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を遊離酸の形で、または10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸のエステル、好ましくは低級アルキルエステル、例えばメチルもしくはエチルエステルの形で使用することができる。

10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸のエステルを前記の反応において使用する場合、工程(i)から回収した10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を、工程(ii)の熱分解に先立って化学的または酵素的手法によりエステル化することができる。エステル化のための好適な方法は、リパーゼによる酵素的変換である。
工程(ii)
この工程(ii)の説明に関しては、「10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸」という用語は、遊離酸である10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸、または10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸のエステル、例えば10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸のメチルもしくはエチルエステルのいずれかを意味するものとする。

10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸の10-オキソ-デカン酸への熱分解はレトロ-エン型の反応である。レトロ-エン転位を選択しかつ競争脱水反応を抑制するためには、10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸の高速蒸発を行うのが最良である。

前記の反応は、400℃超〜800℃、好ましくは500〜600℃の温度で実施することができる。最適な温度範囲は、基質の滞留時間ならびに基質の性質に依存する。10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸のメチルエステルを使用する場合、最良の結果はマイクロリアクター中で600℃の温度と1〜2秒の滞留時間を用いて達成される。遊離酸である10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を前記エステルの代わりに使用する場合、10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸の完全変換はより低い温度、例えば575℃で検出される可能性がある。しかし、脱水に勝るレトロ-エン反応に対する選択性は、10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸のメチルエステルを用いた場合よりも、遊離酸である10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を用いた場合の方が低い。詳細については実施例を比較されたい。

前記の反応は、ミリ-またはマイクロリアクター、例えば径0.1〜3 mmのキャピラリー中で実施することができる。極めて重要な態様は、滞留時間を＜10秒、好ましくは＜1秒としたミリ-またはマイクロエバポレーター中での高加熱速度および高速蒸発である。これらの特徴を維持するためには、当業者に公知のミリ構造または微細構造を有する装置が適している。前記の反応は、溶媒の有無にかかわらず実施することができる。溶媒を使用する場合、該溶媒は99％(w／w)まで添加することができる。使用する溶媒は、熱分解中に使用する温度および条件で反応または分解してはならない。好適な溶媒は、安定なエーテル、例えばTHFまたはジオキサンの群から選択される。THFが工程(ii)に最も好適な溶媒である。

水を前記の反応混合物に添加することもできる。

工程(ii)において形成される10-オキソ-デカン酸は、出発物質である10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸次第で、遊離酸である10-オキソ-デカン酸にも10-オキソ-デカン酸の対応エステルにもなりうる。この工程(ii)の説明に関しては、「10-オキソ-デカン酸」という用語は遊離酸ならびに10-オキソ-デカン酸のエステルを意味するものとする。

10-オキソ-デカン酸は、レトロ-エン転位の二次生成物(1-オクテン)から従来法、例えば蒸留または抽出により分離することができる。出発物質として非純粋リノール酸、例えばヒマワリ油加水分解物を使用する場合、変換されていない脂肪酸(例えばステアリン酸または10-ヒドロキソステアリン酸)は従来法、例えば蒸留、結晶化または抽出により除去することができる。

次の工程である10-オキソ-デカン酸のセバシン酸への酸化に関しては、10-オキソ-デカン酸、1-オクテンおよび場合によっては他の脂肪酸からなる工程(ii)の生成混合物を一般には中間的な精製を行わずに使用することができるし、または10-オキソ-デカン酸を上記手法により精製することができる。共に、メチルエステルまたは遊離脂肪酸を使用することができる。
工程(iii)
工程(iii)に関しては、回収した10-オキソ-デカン酸を遊離酸またはエステルの形で使用することができる。

10-オキソ-デカン酸中のアルデヒド官能基の、ジカルボン酸であるセバシン酸への酸化は、周知の手順に従って、例えばオキソ-アルデヒドのオキソカルボン酸への酸化と同様に、酸素または空気のような温和な酸化剤を使用し、最高100℃および最高7バールで、触媒を用いずに、または例えばCu、Fe、Co、Mnなどのようなレドックス活性金属により均一に触媒することで、実施することができる(Industrial Organic Chemistry, Wiley-VCH, H.-J. Arpe (出版社), 2007, pp.149)。

工程(i)においてリノール酸供給源として使用する出発物質の純度によっては、またセバシン酸の用途によっては、それ自体は当業者に周知である追加の精製および回収工程を本発明の方法に含めることが必要となる可能性がある。工程(iii)において10-オキソ-デカン酸のエステルを使用する場合、該エステルの加水分解により遊離セバシン酸が生じる。
実施例

オレイン酸ヒドラターゼの発現および特徴付け
コドン使用頻度を大腸菌(E. coli)に最適化した、エリザベスキンギア・メニンゴセプティカ(Elizabethkingia meningoseptica)由来のオレイン酸ヒドラターゼをコードする遺伝子を合成した。以下の製造手順はBeversら(Bevers L.E.ら(2009) J. Bacteriol., 191, 5010-5012)からの抜粋である。

組換え酵素の製造のために、前記遺伝子をpBAD(HisA)ベクター(Invitrogen)にクローニングし、アラビノースによる発現の誘導を可能にした。大腸菌(E. coli)TOP10 one shot (Invitrogen)をpBAD(HisA)-OHで形質転換してから、LB-Agar-Ampプレート上に播種した(37℃で一晩)。単一コロニーを2xYT-Ampに接種してから、37℃でさらに5時間培養した。

タンパク質発現の誘導は、この培養物5 mLを0.2％アラビノース添加2xYT-Amp 500 mLに添加してから37℃でさらに18時間インキュベートすることにより達成した。誘導後、細胞を遠心分離(20’、4000 rpm、4℃)により採集してから、20 mM Tris-HCl(pH 8), 50 mM NaClおよび1mM CaCl2に再懸濁した。

前記の細胞懸濁液を超音波処理(3’, 15’’ オン／オフ周期、4℃で振幅80％)してから、その清澄な上清をこの報告書に記載されている生体触媒的変換の大半に使用した(典型的には、Agilent 2100 Bioanalyzerによれば総タンパク質量40 mg／mL；≒13％オレイン酸ヒドラターゼ)。また、この酵素をNiアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した(Hisタグ精製)。この場合は、前記の誘導細胞を20 mM Tris-HCl(pH8), 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2および10 mMイミダゾールに再懸濁した。精製時の洗浄用緩衝液は20 mMイミダゾールを含有しており、またタンパク質溶出は同一緩衝液中500 mMイミダゾールを用いて達成した。オレイン酸ヒドラターゼを含有する画分を採集してから、20 mM Tris-HCl(pH 8), 50 mM NaClおよび1 mM CaCl2に対して透析した。この酵素原液(5.8 mg／mL)を4℃で保存した。

また、発現されたタンパク質の同一性は、N-末端タンパク質配列決定により確認した。

オレイン酸の10-ヒドロキシ-ステアリン酸(10-HSA)への変換
第1段階として、組換えにより製造した実施例1のオレイン酸ヒドラターゼを、オレイン酸(OA)に対する、10-ヒドロキシステアリン酸(10-HSA)を生み出すその野生型の活性について特徴付けした。オレイン酸ヒドラターゼを発現している細菌を実施例1に記載したように超音波処理してから、その清澄な上清200μL(総タンパク質含量5 mg／mL、≒600μgのオレイン酸ヒドラターゼ)を、20 mM Tris-HCl(pH 8), 50 mM NaClおよび1 mM CaCl2中に10 mMのオレイン酸を含有するエマルションに添加した(最終量2 mL)。

陰性対照として、オレイン酸ヒドラターゼを発現していない大腸菌(E. coli)TOP10を超音波処理したその上清(総タンパク質含量5.6 mg／mL、オレイン酸ヒドラターゼ不含)を使用して前記と同一の反応を行った。この反応混合物を室温で一晩攪拌しながらインキュベートした。反応は50μLの3M HClを添加することにより停止させた(最終pH 1〜2)。

この時点で、有機基質(OA)および生成物(10-HSA)を抽出するために、前記反応混合物に4 mLのMTBEを添加した。この反応生成物を、500μLのトリメチルスルホニウムヒドロキシド(TMSH；メタノール中0.1 M)を100μLの生成物溶液に添加(100℃で30’)することにより誘導体化し、その後GCにより分析した。

図1は、この酵素的変換のGC分析を示したものである。

図1(A)大腸菌(E.coli)TOP10のみと共に室温で一晩インキュベートしたオレイン酸。オレイン酸の保持時間：8.161分。(B)オレイン酸ヒドラターゼを発現している大腸菌(E. coli)TOP10と共に室温で一晩インキュベートしたオレイン酸。10-HSAの保持時間：9.340分。

予想通り、TOP10大腸菌(E. coli)細胞において発現されたオレイン酸ヒドラターゼは、オレイン酸を10-HSAへとほぼ完全に(＞95％)変換することが可能であった。超音波処理したオレイン酸ヒドラターゼ不含大腸菌(E. coli)TOP10細胞はオレイン酸を変換しなかった。

リノール酸の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸(10-HOA)への変換
オレイン酸ヒドラターゼを、実施例1に従って大腸菌(E. coli)TOP10(10 L培養物)において発現させた。細胞溶解は、先に記載したように、細胞ペレットを100 mLの20 mM Tris-HCl(pH 8), 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2に再懸濁し、次いで超音波処理することにより達成した。総タンパク質濃度は26 mg／mL(13％オレイン酸ヒドラターゼ)であった。

上清(300〜400 mgのオレイン酸ヒドラターゼ)を、900 mLの20 mM Tris-HCl(pH 8), 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2および14.4 gのリノール酸(≒50 mM)を含有する溶液に添加した。この反応混合物を室温で72時間攪拌した。反応が完了し次第、3M HClを添加することによりpHを1.5に調整した。生成物を次に1LのMTBEで抽出してから、100 gのCelite 535に通して濾過した。蒸留によりMTBEを除去した後、反応生成物10-HOAを高収率で(13.6 g、収率：89％)取得した。GCおよびGC-MS分析用の試料を、400μLのN-トリメチルシリルイミダゾール(TSIM)を100μLの生成物溶液に添加(100℃で30’)することにより調製した。

図2(A)10-HOAのGC分析：10-HOAの保持時間：9.971分。(B)10-HOAの典型的なフラグメンテーションパターンを示す、反応生成物のGC-MS分析。

マイクロリアクター中での10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸(10-HOA)の熱分解
マイクロリアクターを熱分解反応のために使用した。実験装置の概略図を図3に示す。原料はBischoff HPLCポンプを利用して反応器に投与する。該反応器は、800℃まで加熱可能な固体銅ブロックに埋没した、1／16”の内径を有する鋼管である。冷却器(室温のアルミニウムブロック)を通過させた後、生成混合物をフラスコに採取する。この装置を用いれば、1秒未満の滞留時間が実現可能である。さらに、混合物全体が所望の温度まで非常に速く加熱される。

図3は、マイクロリアクター中での10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸(10-HOA)の熱開裂のための実験装置の概略図を示したものである。
a.10-HOAメチルエステル(Me-10-HOA)の熱分解
最初のマイクロリアクター実験では、より容易な操作(すなわち、より良好な蒸発特性)を確保するために、10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸のメチルエステルを反応物として選択した。MTBEおよびTHFを溶媒として試験した。MTBEの場合、大量のジメチル化10-オキソ-デカン酸(メタノールとのアセタール形成)が観察され、この溶媒は反応中に開裂するという結論に至った。従って、THFをさらなる実験のために選択した(開裂生成物は観察されなかった)。水添加(反応物溶液に溶解したほぼ等モル量の水)の影響だけでなく、種々の温度および滞留時間も評価した。結果を表2に要約した。

表2に見られるように、温度は10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸メチルエステルの変換に最も大きな影響を与えるが、一方で滞留時間の変更はわずかな影響しか与えなかった(滞留時間のより大きな変更は反応器の構成の都合上実行不可能であったが、恐らくは変換および選択性により大きな影響を与えるだろう)。500℃では、約25％の10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸メチルエステルしか変換されず(項目1および2)、550℃では既に約40％(項目3〜6)であり、また600℃で本発明者らは十分な変換を得ることができた(項目7および8)。水の添加は選択性に有益な影響を与えると考えられる。最良の結果は600℃かつ滞留時間τ＝1.3秒で得られ、10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸メチルエステルは完全に変換され、レトロ-エン生成物に対する選択性は約75％であり、かつ脱水生成物(リノール酸メチルエステルおよび異性体、項目8)に対する選択性はわずか6.5％あった。

b.10-ヒドロキシオクタデカ-12-エン酸(10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸)の熱分解
10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸メチルエステルの反応物としての使用はリノール酸からセバシン酸へのスキーム全体における1つ余分な工程を意味することになるので、成果を挙げた前記のマイクロリアクター装置を、遊離酸である10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸(THF中10重量％の溶液)を使用して同様に試験した。10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸メチルエステルの熱分解と比較して、より低い温度(575℃、表3中の項目5)で10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸の十分な変換が既に得られた。10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸メチルエステルの場合と同様に、滞留時間は反応に大きくは影響を与えなかった。それにもかかわらず、10-オキソ-デカン酸に対する選択性は有意に低かった(表2中項目8と比較すると48対74％)。副反応としてより多くの脱水が観察され、これは遊離脂肪酸の、そのメチルエステルと比較して不十分な蒸発挙動に起因している可能性がある。

10-オキソ-デカン酸のセバシン酸への酸化
10-オキソ-デカン酸のセバシン酸への酸化は、H.-J. Arpe(Industrial Organic Chemistry, Wiley-VCH, 2007, pp. 149)により記載された通りに実施することができる：アルデヒドを、例えば空気または純酸素のような温和な酸化剤を用いて、液相中最高100℃および7バールで、触媒を用いずに、または例えばCu、Fe、Co、Mnのようなレドックス活性金属により均一に触媒して、酸化する。

Claims

第1工程(i)において、オレイン酸ヒドラターゼによって触媒されるリノール酸と水との反応により10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を形成させ、
第2工程(ii)において、該10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を1-オクテンおよび10-オキソ-デカン酸へと熱分解し、かつ
第3工程(iii)において、該10-オキソ-デカン酸をセバシン酸へと酸化する
ことによる、セバシン酸を調製する方法。
前記オレイン酸ヒドラターゼが配列番号2を有するポリペプチドである、請求項1記載の方法。
工程(i)の後に前記10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸を10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸エステルへとエステル化し、さらにその後該10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸エステルを工程(ii)において熱分解する、請求項1記載の方法。
前記10-ヒドロキシ-12-オクタデセン酸エステルがメチルエステルである、請求項3記載の方法。
前記の工程(ii)における熱分解を400〜800℃、より好ましくは500〜600℃の温度で実施する、請求項1記載の方法。
前記熱分解を、微細構造を有する装置中で実行する、請求項1記載の方法。
前記の工程(ii)における熱分解を、溶媒としてのTHF中で行う、請求項1記載の方法。
工程(iii)における酸化を空気によって行う、請求項1記載の方法。
前記の酸化工程(iii)をレドックス活性金属により触媒する、請求項1記載の方法。