JP6206916B2 - Intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer and synthesis method thereof - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子及びその合成方法に関する。 The present invention relates to an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer and a synthesis method thereof.
サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）は、細胞から放出され、細胞間情報伝達分子となる低分子量の微量生理活性タンパク質である。体液を通って細胞表面の高親和性受容体などに結合して、細胞の増殖、分化、細胞死又は創傷治癒などの多面的な生物活性を発現させる。特に、免疫、炎症に関係したものが多く知られる。様々な細胞内シグナル伝達経路をへて、細胞のＤＮＡやＲＮＡ変異やタンパク質合成のパターンを変化させ、細胞の働きを変える。 Cytokines are low molecular weight trace bioactive proteins that are released from cells and serve as intercellular signal transduction molecules. It binds to high-affinity receptors on the cell surface through body fluids to express multifaceted biological activities such as cell proliferation, differentiation, cell death or wound healing. In particular, many things related to immunity and inflammation are known. Through various intracellular signal transduction pathways, the cell's DNA and RNA mutations and protein synthesis patterns are changed to change the cell's function.
図１は、マクロファージが刺激を受けた場合に、炎症性サイトカインを産生する様子を示す概略図である。図１に示すように、マクロファージ６１は刺激６２を受けると、インターロイキン６（ＩＬ６）やトゥーモア・ネクロシス・ファクター（ＴＮＦ、腫瘍壊死因子）等の炎症性サイトカイン６３を産生する。炎症性サイトカイン６３が広がると、隣接する細胞を壊死させる。細胞の壊死は線維化（コラーゲン化）を生じさせる（非特許文献１、２）。この現象により心筋梗塞が悪化する様子が報告されている（非特許文献３）。 FIG. 1 is a schematic diagram showing how inflammatory cytokines are produced when macrophages are stimulated. As shown in FIG. 1, macrophages 61 produce inflammatory cytokines 63 such as interleukin 6 (IL6) and tomorne necrosis factor (TNF, tumor necrosis factor) when stimulated 62. When the inflammatory cytokine 63 spreads, adjacent cells are necrotized. Cell necrosis causes fibrosis (collagenization) (Non-patent Documents 1 and 2). It has been reported that myocardial infarction is aggravated by this phenomenon (Non-patent Document 3).
図２は、マクロファージにアポトーシス細胞を近接させて、マクロファージにアポトーシス細胞を認識させた場合に、抗炎症性サイトカインを産生する様子を示す概略図である。
図２に示すように、マクロファージ６１にアポトーシス細胞６５を近接させて、認識させた場合には、マクロファージ６１は刺激を受けても、炎症性サイトカインではなく、インターロイキン１０（ＩＬ１０）やインターフェロン（ＩＮＦ）等の抗炎症性サイトカイン６６を産生する。抗炎症性サイトカインが産生されると、隣接する細胞の炎症を抑制できる。
FIG. 2 is a schematic diagram showing the production of anti-inflammatory cytokines when apoptotic cells are brought close to macrophages and the macrophages recognize apoptotic cells.
As shown in FIG. 2, when apoptotic cells 65 are brought close to macrophages 61 to recognize them, macrophages 61 are not inflammatory cytokines but interleukin 10 (IL10) or interferon (INF) even if stimulated. ) And the like. When an anti-inflammatory cytokine is produced, inflammation of adjacent cells can be suppressed.
しかし、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）とは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされるものであり、アポトーシス細胞は、白血球の一種である好中球であり、炎症を伴わずに細胞死する細胞であるので、自由に操作できず、取り扱いが難しかった。 However, apoptosis is a type of death of cells that make up the body of a multicellular organism, and is actively triggered to keep an individual in a better state. Apoptotic cells are a type of white blood cell. Since these cells are neutrophils that die without inflammation, they cannot be freely manipulated and are difficult to handle.
図３は、アポトーシス細胞膜の一例を示す模式図である。図３に示すように、アポトーシス細胞膜７５は、ヘッドグループ７１と、ヘッドグループ７１に一端側が固定された２本のＣ１４〜１８の長鎖アルキル基７２とからなる分子の２分子膜で構成されている。各分子のヘッドグループ７１は一面側又は他面側に向けて配置されており、２本の長鎖アルキル基２を膜内に向けて配置されている。また、各分子はヘッドグループ７１が面内で一方向とそれに垂直な方向に等間隔で互いに接するように配列されている。 FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of an apoptotic cell membrane. As shown in FIG. 3, apoptotic cell membrane 75 has a head group 71, it is composed of two molecular film of molecules consisting of two C 14 ~ 18 of the long-chain alkyl group 72 whose one end is fixed to the head group 71 ing. The head group 71 of each molecule is arranged toward one side or the other side, and two long-chain alkyl groups 2 are arranged in the film. The molecules are arranged so that the head groups 71 are in contact with each other at equal intervals in one direction and in a direction perpendicular to the head group 71 in the plane.
アポトーシス細胞膜７５を構成する分子のヘッドグループ７１の一つとして、ホスファチジルセリン７３がある。マクロファージ６１は、このホスファチジルセリン７３を認識して、抗炎症性サイトカインを産生させることが分かってきた（非特許文献４）。 One of the molecular head groups 71 constituting the apoptotic cell membrane 75 is phosphatidylserine 73. It has been found that macrophages 61 recognize this phosphatidylserine 73 and produce anti-inflammatory cytokines (Non-patent Document 4).
これに基づき、ヘッドグループ７１と、ヘッドグループ７１に一端側が固定された２本のＣ１４〜１８の長鎖アルキル基７２とからなる分子の２分子膜で構成されてなり、ヘッドグループとしてホスファチジルセリン７３を含むホスファチジルセリン含有リポソーム７７が作成された。 Based on this, the head group 71, one end side is formed by a bimolecular layer of molecules consisting of long-chain alkyl group 72 of two C 14 ~ 18, which is fixed to the head group 71, phosphatidylserine as a head group A phosphatidylserine-containing liposome 77 containing 73 was prepared.
図４は、ホスファチジルセリン含有リポソームの一例を示す模式図である。
ホスファチジルセリン含有リポソーム７７がアポトーシス細胞のバイオミメテック材料として使用できるかが調べられた。Ｌｉｐｉｄ Ｕｐｔａｋｅの材料の種類の依存性の結果を示すグラフから、ホスファチジルセリン含有する場合にＬｉｐｉｄ Ｕｐｔａｋｅの数値が高くなることから、ホスファチジルセリン含有リポソームをアポトーシス細胞のバイオミメテック材料として使用できるとの結果が得られた（非特許文献５）。
FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of a phosphatidylserine-containing liposome.
It was investigated whether phosphatidylserine-containing liposomes 77 could be used as biomimetic materials for apoptotic cells. From the graph showing the results of the dependence of the material type of Lipid Uptake, the value of Lipid Uptake increases when phosphatidylserine is contained, so that the phosphatidylserine-containing liposome can be used as a biomimetic material for apoptotic cells. Was obtained (Non-patent Document 5).
マクロファージにホスファチジルセリン含有リポソームを認識させた場合に、抗炎症性サイトカインを産生させることができ、炎症を抑制できると考えられる。しかし、ホスファチジルセリン含有リポソームは、安定性が悪く、エクストルーダーなどのサイジング機器を用いて大きさの制御が大変であり、その作成も煩雑である等の問題があった。
また、高分子―リポソームナノ複合体組成物も作成されており、それは剤形安定性に優れたものだが（特許文献１）、リポソームを含有する構成により、ホスファチジルセリン含有リポソームと同様の問題がある。
When macrophages are allowed to recognize phosphatidylserine-containing liposomes, anti-inflammatory cytokines can be produced and inflammation can be suppressed. However, phosphatidylserine-containing liposomes have problems such as poor stability, difficult size control using a sizing device such as an extruder, and complicated preparation thereof.
In addition, a polymer-liposome nanocomposite composition has also been prepared, which is excellent in dosage form stability (Patent Document 1), but has the same problems as phosphatidylserine-containing liposomes due to the composition containing liposomes. .
本発明は、マクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料及びその合成方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a biomimetic material and a method for synthesizing the same, which can be recognized by macrophages and can produce an anti-inflammatory cytokine, which has the same effect as apoptotic cells.
本発明者は、上記事情を鑑みて、ホスファチジルセリン以外に保護基を導入したモノマーを合成し、これをポリマーに連結して、ホスファチジルセリンと保護基を導入したポリマー前駆体を合成した上で、前記ポリマー前駆体から保護基を外すことにより、ホスファチジルセリンを有するポリマーを合成できるのではないかという考えに想到した。
実際、市販されているＮ−Ｚ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒを、活性化剤ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅで、Ｏ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅの水酸基と反応させて、側鎖に保護された三価のホスホリルセリン基を有する中間生成物を合成してから、この中間生成物を、活性化剤ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅで、フリーラジカル重合法にて重合したＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒの水酸基と反応させて、側鎖に保護された三価のホスホリルセリン基を有する高分子鎖（細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体）を合成してから、前記前駆体を、酸化剤ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを用いて、三価のリンを五価になるまで酸化した後、脱保護剤Ｐｄ−Ｃにより脱保護して、ホスホリルセリン基を側鎖に有する高分子（細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子）を作成できた。この新たな合成方法において、反応の順番を考慮することにより、ポリマー側鎖に存在する水酸基とＮ−Ｚ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒが有する水酸基をバランスよく反応させることができ、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子として利用可能なホスファチジルセリンを有するポリマーを容易に合成することができることを見出して、本発明を完成した。
本発明は、以下の構成を有する。
In view of the above circumstances, the present inventors synthesized a monomer introduced with a protective group in addition to phosphatidylserine, connected this to a polymer, and synthesized a polymer precursor introduced with phosphatidylserine and a protective group, The inventors have come up with the idea that a polymer having phosphatidylserine can be synthesized by removing the protecting group from the polymer precursor.
In fact, a commercially available NZ-L-serine benzoyl ester is reacted with the hydroxyl group of O-Benzyl N, N, N ′, N′-tetraphosphopropylidamide with the activator imidazole fluoride to protect the side chain. The intermediate product having a trivalent phosphorylserine group thus synthesized was reacted with the hydroxyl group of NIPAAm-HMAAm copolymer polymerized by a free radical polymerization method with an imidazole hydrochloride. After synthesizing a polymer chain having a trivalent phosphorylserine group protected by a side chain (intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer precursor), the precursor is converted into an oxidant tert-butyl hydrol. Peroxide is used to oxidize trivalent phosphorus until it becomes pentavalent, and then deprotects with deprotecting agent Pd-C to induce a macromolecule having a phosphorylserine group in the side chain (induction of intercellular signal transduction molecule production signal Functional polymer). In this new synthesis method, by considering the order of the reaction, the hydroxyl group present in the polymer side chain and the hydroxyl group possessed by NZL-serine benzester can be reacted in a well-balanced manner. The present invention was completed by finding that a polymer having phosphatidylserine usable as a production signal-inducing functional polymer can be easily synthesized.
The present invention has the following configuration.
（１）細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位を備えた生体適合性高分子であることを特徴とする細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。 (1) An intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer, which is a biocompatible polymer provided with an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site.
（２）前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位がアミノ基とカルボキシル基を備えたキラル炭素を有することを特徴とする（１）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
（３）前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位がホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）であることを特徴とする（１）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
（４）前記ホスホリルセリン基がＬ型であることを特徴とする（３）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
(2) The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to (1), wherein the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional site has a chiral carbon having an amino group and a carboxyl group.
(3) The intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer as described in (1), wherein the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function inducing function is a phosphorylserine group (PhoSer group).
(4) The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to (3), wherein the phosphorylserine group is L-type.
（５）前記生体適合性高分子が合成高分子又は多糖類からなる主鎖を有することを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
（６）前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位が、前記主鎖に対して側鎖又は末端基として結合されていることを特徴とする（５）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
（７）１又は２種類以上の非誘発機能部位が、前記主鎖に対して側鎖として結合されていることを特徴とする（６）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
(5) The intercellular signal transduction molecule production signal inducing function is high in any one of (1) to (4), wherein the biocompatible polymer has a main chain composed of a synthetic polymer or a polysaccharide. molecule.
(6) The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional site is bound to the main chain as a side chain or a terminal group, as described in (5) Inducible functional polymer.
(7) One or more types of non-inducing functional sites are bound as side chains to the main chain, and the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to (6) .
（８）前記非誘発機能部位が水酸基又はＣ１〜Ｃ５のアルキル基であることを特徴とする（７）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
（９）前記合成高分子がポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂肪族ポリエステル、ポリアミノ酸の群から選択されるいずれか一の高分子であることを特徴とする（５）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
（１０）前記多糖類が、アミロース、アミロペクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサンの群から選択されるいずれか一の多糖類であることを特徴とする（５）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子。
(8) the non-induced functional sites hydroxyl or C 1, characterized in that an alkyl group having -C 5 (7) intercellular signaling molecule production signal induced function polymer according to.
(9) The synthetic polymer is poly (acrylamide), poly (methacrylamide), poly (acrylic acid), poly (acrylic acid ester), poly (methacrylic acid), poly (methacrylic acid ester), polyethylene glycol (PEG) The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer as described in (5), which is any one polymer selected from the group consisting of aliphatic polyester and polyamino acid.
(10) The intercellular signal transduction molecule production signal according to (5), wherein the polysaccharide is any one selected from the group consisting of amylose, amylopectin, alginic acid, hyaluronic acid, and chitosan. Inducible functional polymer.
（１１）活性化剤により、第１の保護基を有するホスホロアミダイト化合物と、第２、第３の保護基及び水酸基を有するセリン化合物とを反応させて、前記セリン化合物に前記ホスホロアミダイト化合物を結合して、第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物を合成する工程と、活性化剤により、前記第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物と、合成高分子又は多糖類からなり、水酸基を有する生体適合性高分子とを結合反応させてから、酸化剤により、結合反応生成物のリンを三価から五価に酸化して、第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）を有する生体適合性高分子からなる細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成する工程と、脱保護剤により、前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体の第１〜第３の保護基を脱保護して、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を合成する工程と、を有することを特徴とする細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法。 (11) A phosphoramidite compound having a first protecting group is reacted with a serine compound having second and third protecting groups and a hydroxyl group by an activator, and the phosphoramidite compound is reacted with the serine compound. And a phosphorylserine compound having the first to third protective groups and a synthetic polymer or a polythene compound by a step of synthesizing a phosphorylserine compound having the first to third protective groups and an activator. After binding reaction with a biocompatible polymer having a hydroxyl group, which is composed of a saccharide, the binding reaction product phosphorus is oxidized from trivalent to pentavalent by an oxidizing agent, and the first to third protective groups are formed. A step of synthesizing an intercellular signal transduction molecule-producing signal-inducing functional polymer precursor comprising a biocompatible polymer having a phosphorylserine group (PhoSer group), and a deprotecting agent, the intercellular information transfer Deprotecting the first to third protecting groups of the molecular production signal-inducing functional polymer precursor to synthesize an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer. A method of synthesizing a functional polymer for inducing signaling signals.
（１２）第１及び第２の保護基がベンジル基（ｂｅｎｚｙｌ基）であり、第３の保護基がベンジルオキシカルボニル基（ｂｅｎｚｙｌ ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基）であることを特徴とする（１１）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法。
（１３）前記活性化剤がイミダゾール・ハイドロクロライドであることを特徴とする（１１）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法。
（１４）前記酸化剤がｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅであることを特徴とする（１１）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法。
（１５）前記脱保護剤がＰｄ／Ｃであることを特徴とする（１１）に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法。
(12) The cell according to (11), wherein the first and second protecting groups are a benzyl group (benzyl group), and the third protecting group is a benzyloxycarbonyl group (benzyl oxycarbonyl group). A method for synthesizing functional macromolecules that induce signal transmission between molecules.
(13) The method for synthesizing an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to (11), wherein the activator is imidazole hydrochloride.
(14) The method for synthesizing an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to (11), wherein the oxidizing agent is tert-butyl hydroxide.
(15) The method for synthesizing intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to (11), wherein the deprotecting agent is Pd / C.
（１６）（１）〜（１０）のいずれかに記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が膜状凝集体とされており、膜状凝集体の少なくとも一面で細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位が露出されていることを特徴とする細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜。 (16) The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to any one of (1) to (10) is a membrane aggregate, and the intercellular signal transduction molecule is formed on at least one surface of the membrane aggregate. An intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer membrane, characterized in that a production signal-inducing functional site is exposed.
（１７）（１）〜（１０）のいずれかに記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が水中に一様に分散されていることを特徴とする細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液。 (17) Intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer according to any one of (1) to (10), wherein the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer is uniformly dispersed in water. Functional polymer dispersion.
（１８）（１）〜（１０）のいずれかに記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が疎水性高分子からなる微粒子の表面から林立するように接合されていることを特徴とする細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子。 (18) The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to any one of (1) to (10) is joined so as to stand from the surface of a fine particle composed of a hydrophobic polymer. Intercellular signaling molecules producing signal-inducing functional polymer-conjugated particles.
本発明の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位を備えた生体適合性高分子である構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 Since the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer of the present invention is a biocompatible polymer having an intercellular information transduction molecule production signal inducing function site, the macrophage at the inflamed site is recognized and anti-inflammatory. It can be used as a constituent material of biomimetic materials that can produce sex cytokines and has the same effect as apoptotic cells. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
本発明の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法は、活性化剤により、第１の保護基を有するホスホロアミダイト化合物と、第２、第３の保護基及び水酸基を有するセリン化合物とを反応させて、前記セリン化合物に前記ホスホロアミダイト化合物を結合して、第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物を合成する工程と、活性化剤により、前記第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物と、合成高分子又は多糖類からなり、水酸基を有する生体適合性高分子とを結合反応させてから、酸化剤により、結合反応生成物のリンを三価から五価に酸化して、第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）を有する生体適合性高分子からなる細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成する工程と、脱保護剤により、前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体の第１〜第３の保護基を脱保護して、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を合成する工程と、を有する構成なので、反応順序を考慮して、まず、ホスホロアミダイト化合物とセリン化合物とを反応させて、中間生成物（第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物）を合成してから、次に、この中間生成物と生体適合性高分子とを結合・酸化反応させて、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成してから、最後に、脱保護反応させることにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を容易にかつ確実に合成することができる。
具体的には、まず、活性化剤であるｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅにより、ホスホロアミダイト化合物であるＯ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅを、セリン化合物であるＮ−Ｚ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒと反応させて、中間生成物を合成してから、次に、この中間生成物と生体適合性高分子とを結合・酸化反応させて、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成してから、最後に、脱保護反応させることにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を容易にかつ確実に合成することができる。
この高分子はそのまま、或いは、膜状、液状又は粒子状にして、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料とすることができる。
According to the method for synthesizing a cell-inducing signal transducing molecule production signal-inducing functional polymer of the present invention, a phosphoramidite compound having a first protecting group, a second and a third protecting group, and a serine having a hydroxyl group by an activator A step of reacting a compound with the phosphoramidite compound to bind to the serine compound to synthesize a phosphorylserine compound having first to third protective groups, and an activator, A phosphorylserine compound having 3 protecting groups and a synthetic polymer or polysaccharide, and a biocompatible polymer having a hydroxyl group is subjected to a binding reaction, and then the phosphorus of the binding reaction product is changed from trivalent by an oxidizing agent. Intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer consisting of biocompatible polymer having phosphorylserine group (PhoSer group) having first to third protective groups oxidized to pentavalent An intercellular signal transduction molecule production signal inducing function by deprotecting the first to third protective groups of the intermolecular signal transduction molecule production signal inducing function polymer precursor using a deprotecting agent In view of the reaction sequence, first, a phosphoramidite compound and a serine compound are reacted to produce an intermediate product (phosphorylyl having first to third protecting groups). After synthesizing the serine compound), the intermediate product and the biocompatible polymer are then combined and oxidized to synthesize the intermolecular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer precursor, Finally, by performing a deprotection reaction, an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer can be synthesized easily and reliably.
Specifically, first, the oxidant imidazole hydrochloride is used to convert the phosphoramidite compound O-Benzyl N, N, N ′, N′-tetrapropylpropylphosphodiamite into the serine compound N-Z-L-serine. After reacting with benzyl ester to synthesize an intermediate product, this intermediate product and biocompatible polymer are then bound and oxidized to produce an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer precursor. After synthesizing the body, finally, a deprotection reaction is performed, whereby the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer can be synthesized easily and reliably.
This polymer can be used as it is, or in the form of a membrane, liquid, or particles, which can be recognized by macrophages at the inflammatory site and produce anti-inflammatory cytokines. Can be tech material.
本発明の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜は、先に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が膜状凝集体とされており、膜状凝集体の少なくとも一面で細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位が露出されている構成なので、前記露出面を炎症部位のマクロファージに近接させることにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer membrane of the present invention is such that the above-described intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer is a membrane-like aggregate, and at least one surface of the membrane-like aggregate is used. Since the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional site is exposed, the macrophage of the intercellular signal transduction molecule production signal induction function is recognized by the macrophage at the inflammation site by bringing the exposed surface close to the macrophage at the inflammation site. It can be used as a biomimetic material that can produce inflammatory cytokines and has the same effect as apoptotic cells. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
本発明の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液は、先に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が、水溶液中に一様に分散されている構成なので、前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液を炎症部位のマクロファージに塗布することにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 The cell-mediated signal transduction molecule production signal-inducing function-induced polymer dispersion of the present invention has a structure in which the cell-cell information transmission molecule production signal-inducing function-inducing functional polymer described above is uniformly dispersed in an aqueous solution. By applying the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function polymer dispersion to the macrophages at the inflammatory site, it is possible to cause the macrophages to recognize the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional site and produce anti-inflammatory cytokines. In addition, it can be used as a biomimetic material that has the same effect as apoptotic cells. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
本発明の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子は、先に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が疎水性高分子からなる微粒子の表面から林立するように接合されている構成なので、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子を炎症部位のマクロファージに滴下することにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer-conjugated particle of the present invention is joined so that the above-mentioned intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer conjugate particle stands from the surface of fine particles made of a hydrophobic polymer. Because of this structure, the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function-inducing functional polymer-conjugated particles are dropped onto the macrophages at the inflamed site so that the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function-inducing functional site is recognized by the macrophages, and anti-inflammatory cytokines Can be produced as a biomimetic material having the same effect as apoptotic cells. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
（本発明の実施形態）
＜細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子＞
図５は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の一例を示す概略図である。
図５に示すように、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１を備えた生体適合性高分子である。
(Embodiment of the present invention)
<Intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer>
FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer that is an embodiment of the present invention.
As shown in FIG. 5, the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 is a biocompatible polymer provided with an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51.
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１がアミノ基とカルボキシル基を備えたキラル炭素を有することが好ましい。前記キラル炭素は、マクロファージに細胞間情報伝達分子産生信号を誘発する機能を有し、前記キラル炭素をマクロファージに近接させることのより、抗炎症性サイトカインを産生させることができる。
正電荷を有するアミノ基と、負電荷を有するカルボキシル基により発生する微視的電場の影響を受けたキラル炭素が、マクロファージに細胞間情報伝達分子産生信号を誘発する。
It is preferable that the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional site 51 has a chiral carbon having an amino group and a carboxyl group. The chiral carbon has a function of inducing an intercellular signal transduction molecule production signal in macrophages, and an anti-inflammatory cytokine can be produced by bringing the chiral carbon close to the macrophages.
A chiral carbon affected by a microscopic electric field generated by a positively charged amino group and a negatively charged carboxyl group induces an intercellular signal transduction molecule production signal in macrophages.
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１がホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）であることが好ましい。前記ホスホリルセリン基は、マクロファージに細胞間情報伝達分子産生信号を誘発する機能を有し、前記ホスホリルセリン基をマクロファージに近接させることのより、抗炎症性サイトカインを産生させることができる。 It is preferable that the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional site 51 is a phosphorylserine group (PhoSer group). The phosphorylserine group has a function of inducing an intercellular signal transduction molecule production signal in macrophages, and an anti-inflammatory cytokine can be produced by bringing the phosphorylserine group close to the macrophages.
ホスホリルセリン基はリン酸エステルであるが、リン酸部分は細胞間情報伝達分子産生信号を誘発する機能を有しないと考えている。
ホスホリルセリン基は、ホスファチジルセリンというリン脂質の官能基として知られている。リン脂質（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）は、構造中にリン酸エステル部位をもつ脂質の総称であり、両親媒性を持ち、脂質二重層を形成して糖脂質やコレステロールと共に細胞膜の主要な構成成分となるほか、生体内でのシグナル伝達にも関わる。そして、リン脂質としては、ホスファチジルコリン（レシチン）がよく知られており、ホスファチジルコリンは、２つの脂肪酸（オレイン酸（Ｏｌｅｏｙｌ）・パルミチン酸（Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ））・グリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）・リン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）・コリン（Ｃｈｏｌｉｎｅ）が複合した構造をもつが、ホスホリルコリン基は、細胞間情報伝達分子産生信号を誘発する機能を有しないためである。
The phosphorylserine group is a phosphate ester, but the phosphate moiety does not have a function of inducing an intercellular signal transduction molecule production signal.
The phosphorylserine group is known as a phospholipid functional group called phosphatidylserine. Phospholipid (Phospholipid) is a general term for lipids that have a phosphate ester moiety in the structure. It has amphipathic properties, forms a lipid bilayer, and becomes a major component of cell membranes together with glycolipids and cholesterol. Also involved in signal transduction in vivo. As phospholipids, phosphatidylcholine (lecithin) is well known, and phosphatidylcholine is composed of two fatty acids (oleic acid, palmitoyl), glycerin, phosphate, choline. This is because (Choline) has a complex structure, but the phosphorylcholine group does not have a function of inducing an intercellular signal transduction molecule production signal.
ホスホリルセリン基としてはＬ型であることが好ましい。Ｌ型は、Ｄ型に比べ、マクロファージに細胞間情報伝達分子産生信号を誘発能が高く、前記ホスホリルセリン基をマクロファージに近接させることのより、抗炎症性サイトカインをより産生させることができる。 The phosphorylserine group is preferably L-type. The L type has a higher ability to induce intercellular signal transduction molecule production signals in macrophages than the D type, and can produce more anti-inflammatory cytokines by bringing the phosphorylserine group close to the macrophages.
生体適合性高分子とは、生体が持つ異物反応（例えば、炎症の惹起や血栓形成などの反応）を起こさず、生体に対して不活性な高分子及び／又は生体内で徐々に分解され、代謝排泄されてしまう高分子を指す。そのため、生体適合性高分子は、医用材料に応用できる。生体適合性高分子としては、合成高分子又は多糖類を挙げることができる。
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、合成高分子又は多糖類からなる主鎖４１を有する生体適合性高分子であることが好ましい。合成高分子又は多糖類からなる主鎖４１を有することにより、ホスホリルセリン基のような細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１を一の生体適合性高分子中に安定に存在させることができ、この生体適合性高分子を膜状、液状又は粒子状に加工して、バイオミメテック材料を容易に製造できる。
The biocompatible polymer does not cause a foreign body reaction (for example, reaction such as inducing inflammation or thrombus formation) that the living body has, and is gradually degraded in the living body and / or in vivo. A macromolecule that is excreted by metabolism. Therefore, the biocompatible polymer can be applied to a medical material. Examples of biocompatible polymers include synthetic polymers and polysaccharides.
The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function polymer 31 is preferably a biocompatible polymer having a main chain 41 made of a synthetic polymer or a polysaccharide. By having a main chain 41 made of a synthetic polymer or a polysaccharide, an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function site 51 such as a phosphorylserine group can be stably present in one biocompatible polymer. This biocompatible polymer can be processed into a film, liquid, or particulate form to easily produce a biomimetic material.
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が、主鎖４１に対して側鎖又は末端基として結合されていることが好ましい。これにより、ホスホリルセリン基のような細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１を一の生体適合性高分子中に安定に存在させることができ、膜状、液状又は粒子状のバイオミメテック材料を容易に製造できる。
図５では、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が、主鎖４１に対して側鎖として結合されている。しかし、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１の結合の態様は、この例に限られるものではない。図６〜９に示す態様としてもよい。
また、図５〜９では、直鎖状高分子を主鎖４１とする構成を示したが、これに限られるものではなく、分岐状高分子を主鎖４１とする構成としてもよい。
It is preferable that the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 is bound to the main chain 41 as a side chain or a terminal group. Thereby, the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional site 51 such as a phosphorylserine group can be stably present in one biocompatible polymer, and the biomimetic material in the form of a film, liquid or particle Can be easily manufactured.
In FIG. 5, the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 is coupled to the main chain 41 as a side chain. However, the mode of binding of the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 is not limited to this example. It is good also as an aspect shown to FIGS.
5 to 9 show the configuration in which the linear polymer is the main chain 41, the invention is not limited to this, and a configuration in which the branched polymer is the main chain 41 may be used.
図６は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の別の一例を示す概略図である。細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が、主鎖４１に対して末端基として結合されている。一端側のみの末端基が細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１とされている。
図７は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の別の一例を示す概略図である。細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が、主鎖４１に対して末端基として結合されている。両端の末端基が細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１とされている。
図８は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の別の一例を示す概略図である。細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が、主鎖４１に対して側鎖及び末端基として結合されている。一端側のみの末端基が細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１とされている。
図９は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の更に別の一例を示す概略図である。細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が、主鎖４１に対して側鎖及び末端基として結合されている。両端の末端基が細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１とされている。
FIG. 6 is a schematic diagram showing another example of the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer according to the embodiment of the present invention. An intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 is bound to the main chain 41 as a terminal group. The terminal group only on one end side is the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51.
FIG. 7 is a schematic diagram showing another example of the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer according to the embodiment of the present invention. An intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 is bound to the main chain 41 as a terminal group. The terminal groups at both ends serve as an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51.
FIG. 8 is a schematic view showing another example of the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to the embodiment of the present invention. An intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 is bound to the main chain 41 as a side chain and a terminal group. The terminal group only on one end side is the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51.
FIG. 9 is a schematic diagram showing still another example of an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer according to an embodiment of the present invention. An intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 is bound to the main chain 41 as a side chain and a terminal group. The terminal groups at both ends serve as an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51.
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、更に、１又は２種類以上の非誘発機能部位５２が、前記主鎖４１に対して側鎖として結合されていることが好ましい。非誘発機能部位５２をスペーサーとして機能することにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１の露出割合を最適にするとともに、高分子としての安定性を高めることができる。更に、膜状、液状又は粒子状のバイオミメテック材料としたときの安定性も高めることができる。また、非誘発機能部位５２の存在は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１における細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１の安定性を高めることができる。また、マクロファージの認識能も高め、マクロファージへの誘発能も高めて、細胞間情報伝達分子をより多く、短時間で産生させることができる。
具体的には、非誘発機能部位５２としては、水酸基又はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のＣ１〜Ｃ５のアルキル基を挙げることができる。
In the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31, it is preferable that one or more types of non-inducing functional sites 52 are further bonded as side chains to the main chain 41. By functioning the non-inducing functional part 52 as a spacer, the exposure ratio of the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional part 51 can be optimized and the stability as a polymer can be enhanced. Furthermore, the stability of the biomimetic material in the form of a film, liquid or particles can also be improved. In addition, the presence of the non-inducing functional site 52 can enhance the stability of the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional site 51 in the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31. In addition, the ability to recognize macrophages and the ability to induce macrophages can be increased, and more intercellular signal transduction molecules can be produced in a shorter time.
Specifically, examples of the non-inducing function site 52 include a hydroxyl group or a C 1 to C 5 alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, and a tert-butyl group.
生体適合性の合成高分子としてはポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂肪族ポリエステル、ポリアミノ酸の群から選択されるいずれか一の高分子を挙げることができる。
なお、脂肪族ポリエステルとしては、ポリ乳酸、グリコール酸／Ｌ−ポリ乳酸共重合体、ポリ（カプロラクトン）を挙げることができる。
また、ポリアミノ酸としては、ポリアスパラギン酸やポリグルタミン酸を挙げることができる。
実際、ポリメタクリル酸は、コンタクトレンズの材料に用いられており、生体安全性の高い合成高分子として知られており、ポリ（カプロラクトン）は、水溶性は低いが、生分解性は高い高分子として知られている。
Biocompatible synthetic polymers include poly (acrylamide), poly (methacrylamide), poly (acrylic acid), poly (acrylic ester), poly (methacrylic acid), poly (methacrylic ester), polyethylene glycol (PEG ), An aliphatic polyester, and any one polymer selected from the group of polyamino acids.
Examples of the aliphatic polyester include polylactic acid, glycolic acid / L-polylactic acid copolymer, and poly (caprolactone).
Examples of the polyamino acid include polyaspartic acid and polyglutamic acid.
In fact, polymethacrylic acid is used as a material for contact lenses and is known as a synthetic polymer with high biosafety. Poly (caprolactone) is a polymer with low water solubility but high biodegradability. Known as.
また、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、加水分解によって２分子以上の単糖類を生じる糖類のことであり、多糖類としては、アミロース、アミロペクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサンの群から選択されるいずれか一の多糖類を挙げることができる。 Polysaccharide is a saccharide that generates two or more monosaccharides by hydrolysis, and the polysaccharide is any one selected from the group consisting of amylose, amylopectin, alginic acid, hyaluronic acid, and chitosan. Can be mentioned.
各生体適合性高分子は、各特性に応じて、使用形態を設定することが好ましい。例えば、アミロース、アミロペクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサン等の多糖類又はポリ（アクリルアミド）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の合成高分子のように水溶性が高い材料の場合は、分散液として用いることが好ましく、逆に、ポリ（カプロラクトン）のような水溶性が低い高分子の場合は、膜状又は粒子状として用いることが好ましい。 Each biocompatible polymer is preferably set in a usage form according to each characteristic. For example, in the case of a highly water-soluble material such as polysaccharides such as amylose, amylopectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitosan or synthetic polymers such as poly (acrylamide) and polyethylene glycol (PEG), it can be used as a dispersion. On the contrary, in the case of a polymer having low water solubility such as poly (caprolactone), it is preferably used as a film or particles.
合成高分子及び多糖類は、分子量１万以上であることが好ましい。これにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１を一の生体適合性高分子中に安定に存在させることができる。更に、膜状、液状又は粒子状のバイオミメテック材料としたときの安定性も高めることができる。例えば、より強固で、より安定な膜を形成できる。 The synthetic polymer and polysaccharide preferably have a molecular weight of 10,000 or more. Thereby, the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional site 51 can be stably present in one biocompatible polymer. Furthermore, the stability of the biomimetic material in the form of a film, liquid or particles can also be improved. For example, a stronger and more stable film can be formed.
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１としては、次式（１）で表される高分子を挙げることができる。 Examples of the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 include a polymer represented by the following formula (1).
式（１）において、各側鎖を有するブロックの高分子鎖長を規定するｏ、ｎ、ｍはそれぞれ１以上の自然数である。また、ｍ＞ｏである。例えば、ｏ：ｎ：ｍ＝５：１５：８５であり、このとき、「ｍ−ｏ」は８０である。
このような化学構造を有する部分が備えられていればよい。
また、この化学構造部分に、各ブロックがランダムに配列されて、かつ、各ブロックの高分子鎖長もランダムとされて、連結されていてもよい。
In the formula (1), o, n, and m that define the polymer chain length of the block having each side chain are each a natural number of 1 or more. Also, m> o. For example, o: n: m = 5: 15: 85, and “mo” is 80 at this time.
What is necessary is just to be provided with the part which has such a chemical structure.
Moreover, each block may be arranged at random in this chemical structure part, and the polymer chain length of each block may also be random and connected.
＜細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法＞
次に、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法について説明する。
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法は、第１〜第３の保護基が結合されたホスホリルセリン化合物の合成工程Ｓ１と、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体の合成工程Ｓ２と、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成工程Ｓ３と、を有する。
<Method for synthesizing functional macromolecules that induce signal production of intercellular signaling molecules>
Next, a method for synthesizing an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer as an embodiment of the present invention will be described.
The method for synthesizing an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer according to an embodiment of the present invention includes a synthesis step S1 of a phosphorylserine compound to which first to third protective groups are bound, and production of an intercellular signal transduction molecule. A signal-inducing functional polymer precursor synthesis step S2 and an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer synthesis step S3.
［第１〜第３の保護基が結合されたホスホリルセリン化合物の合成工程Ｓ１］
まず、化学式（２）で表される、ホスホロアミダイト化合物を準備する。
[Synthesis Step S1 of Phosphoryl Serine Compound with First to Third Protecting Groups Attached]
First, a phosphoramidite compound represented by the chemical formula (2) is prepared.
このホスホロアミダイト化合物は、ＰＯ結合を有し、酸素（Ｏ）に第１の保護基Ｘ１が結合され、Ｐに２つのアミノ基が結合されてなる。各アミノ基のＲ１〜Ｒ４は、水素又はＣ１〜Ｃ５のアルキル基であり、互いに同一であっても異なっていてもよい。例えば、ジイソプロピル−アミノ基を挙げることができる。また、第１の保護基Ｘ１としてはベンジル基（ｂｅｎｚｙｌ基：Ｂｎ基）を挙げることができる。
具体的には、ホスホロアミダイト化合物としては、化学式（３）で表されるＯ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅを挙げることができる。
This phosphoramidite compound has a PO bond, wherein the first protecting group X 1 is bonded to oxygen (O), and two amino groups are bonded to P. R 1 to R 4 of each amino group are hydrogen or a C 1 to C 5 alkyl group, and may be the same as or different from each other. For example, a diisopropyl-amino group can be mentioned. Examples of the first protecting group X 1 include a benzyl group (benzoyl group: Bn group).
Specifically, examples of the phosphoramidite compound include O-Benzyl N, N, N, N-tetraisopropyl phosphorodiamide represented by the chemical formula (3).
次に、化学式（４）で表されるセリン化合物を準備する。 Next, a serine compound represented by the chemical formula (4) is prepared.
このセリン化合物は、カルボキシル基の酸素に第２の保護基Ｘ２が結合され、アミノ基のＮに第３の保護基Ｘ３が結合されてなる。 In this serine compound, the second protecting group X 2 is bonded to oxygen of the carboxyl group, and the third protecting group X 3 is bonded to N of the amino group.
第２の保護基Ｘ２としては、ベンジル基（ｂｅｎｚｙｌ基）を挙げることができ、第３の保護基Ｘ３としては、ベンジルオキシカルボニル基（ｂｅｎｚｙｌ ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基：Ｃｂｚ基）を挙げることができる。
具体的には、セリン化合物としては、化学式（５）で表されるベンジルエステル（Ｎ−Ｚ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒ）を挙げることができる。ベンジルエステルは市販品を用いることができる。
Examples of the second protecting group X 2 include a benzyl group (benzyl group), and examples of the third protecting group X 3 include a benzyloxycarbonyl group (benzoyloxycarbonyl group: Cbz group).
Specifically, examples of the serine compound include a benzyl ester (NZL-serine benzyl ester) represented by the chemical formula (5). A commercial item can be used for benzyl ester.
次に、化学反応式（６）に示すように、非プロトン性有機溶媒であるジクロロメタン中、活性化剤ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを用いて、セリン化合物の水酸基にホスホロアミダイト化合物を結合させる。これにより、中間生成物（第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物）を合成できる。 Next, as shown in chemical reaction formula (6), the phosphoramidite compound is bonded to the hydroxyl group of the serine compound using an activator imidazole fluoride in dichloromethane, which is an aprotic organic solvent. Thereby, an intermediate product (a phosphorylserine compound having first to third protective groups) can be synthesized.
［細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体の合成工程Ｓ２］
次に、合成高分子又は多糖類からなり、水酸基を有する、生体適合性高分子を準備する。
例えば、合成高分子としてポリ（アクリルアミド）からなり、水酸基を有する、生体適合性高分子として、化学式（７）で表されるポリ（ヒドロキシメチル）アクリルアミドを挙げることができる。水酸基は、炭素を介在させて結合されることが好ましい。これにより、反応の際の立体障害の影響を低減できる。
[Synthesis Step S2 of Intercellular Signaling Molecules Production Signal Inducing Functional Polymer Precursor]
Next, a biocompatible polymer made of a synthetic polymer or polysaccharide and having a hydroxyl group is prepared.
For example, poly (hydroxymethyl) acrylamide represented by the chemical formula (7) can be given as a biocompatible polymer made of poly (acrylamide) as a synthetic polymer and having a hydroxyl group. The hydroxyl group is preferably bonded via carbon. Thereby, the influence of the steric hindrance at the time of reaction can be reduced.
あるいは、水酸基を有するブロックと、非誘発機能置換基Ｘ４を有するブロックとを有する、化学式（８）で表されるアクリルアミド系コポリマーを挙げることができる。非誘発機能置換基Ｘ４としては、水酸基又はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のＣ１〜Ｃ５のアルキル基を挙げることができる。 Alternatively, an acrylamide copolymer represented by the chemical formula (8) having a block having a hydroxyl group and a block having a non-inducing functional substituent X 4 can be exemplified. Examples of the non-inducing function substituent X 4 include a hydroxyl group or a C 1 to C 5 alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, and a tert-butyl group.
より具体的には、化学式（９）で表されるＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒを挙げることができる。ＮＩＰＡＡｍはＮ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ＡｃｒｙｌＡｍｉｄｅの略であり、ＨＭＡＡｍはＨｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ＡｃｒｙｌＡｍｉｄｅの略である。ＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒは、フリーラジカル重合法にて、ビニル基を有する１又は２以上のモノマーを重合して合成できる。 More specifically, NIPAAm-HMAAm copolymer represented by the chemical formula (9) can be given. NIPAAm is an abbreviation for N-Isopropyl AcrylAmide, and HMAAm is an abbreviation for Hydroxymethyl AcrylAmide. NIPAAm-HMAAm copolymer can be synthesized by polymerizing one or more monomers having a vinyl group by a free radical polymerization method.
なお、生体適合性高分子としては、化学式（７）に示したポリ（ヒドロキシメチル）アクリルアミドや、化学式（８）又は（９）に示したアクリルアミド系コポリマーに限られるものではなく、水酸基を有する、他の合成高分子又は多糖類を用いてもよい。
他の合成高分子としては、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂肪族ポリエステル、ポリアミノ酸の群から選択されるいずれか一の高分子を挙げることができ、多糖類としては、アミロース、アミロペクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサンを挙げることができる。
The biocompatible polymer is not limited to poly (hydroxymethyl) acrylamide represented by the chemical formula (7) or the acrylamide copolymer represented by the chemical formula (8) or (9), and has a hydroxyl group. Other synthetic polymers or polysaccharides may be used.
Other synthetic polymers include poly (methacrylamide), poly (acrylic acid), poly (acrylic acid ester), poly (methacrylic acid), poly (methacrylic acid ester), polyethylene glycol (PEG), aliphatic polyester, Any one polymer selected from the group of polyamino acids can be mentioned, and examples of the polysaccharide include amylose, amylopectin, alginic acid, hyaluronic acid, and chitosan.
次に、非プロトン性有機溶媒であるジクロロメタン中、活性化剤イミダゾール・ハイドロクロライドを触媒として用いて、化学反応式（６）で得られた中間生成物を「合成高分子又は多糖類からなり、水酸基を有する、生体適合性高分子」とを結合反応させる。
連続して、酸化剤により、結合反応生成物のリンを三価から五価になるまで酸化して、側鎖に保護された五価のホスホリルセリン基を有する高分子鎖からなる、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成する。
例えば、第１〜第３の保護基が結合されたホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）を有する、化学式（１０）で表される細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体が形成される。
Next, in dichloromethane, which is an aprotic organic solvent, using the activator imidazole hydrochloride as a catalyst, the intermediate product obtained by the chemical reaction formula (6) is “consisting of a synthetic polymer or a polysaccharide, A biocompatible polymer having a hydroxyl group is subjected to a binding reaction.
Intercellular information consisting of a polymer chain having a pentavalent phosphorylserine group protected by a side chain by continuously oxidizing the phosphorus of the binding reaction product from trivalent to pentavalent by an oxidizing agent. Synthesis of signaling molecule production signal-inducing functional polymer precursor.
For example, an intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer precursor represented by the chemical formula (10) having a phosphorylserine group (PhoSer group) to which the first to third protecting groups are bound is formed.
［細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成工程Ｓ３］
次に、水素雰囲気、酢酸中で、脱保護剤としてＰｄ／Ｃ触媒を用いて、この細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体の第１の保護基Ｘ１〜第３の保護基Ｘ３を脱離（脱保護）する。
脱離（脱保護）反応時間は、１時間以上とすることが好ましく、１０時間以上とすることがより好ましい。
これにより、ホスホリルセリン基を側鎖に有する生体適合性高分子からなる、化学式（１）で表される細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を合成できる。
[Intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer synthesis step S3]
Next, using a Pd / C catalyst as a deprotecting agent in a hydrogen atmosphere and acetic acid, the first protecting group X 1 to the third protecting group of the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer precursor are used. the desorbed (de-protection) X 3.
The desorption (deprotection) reaction time is preferably 1 hour or longer, more preferably 10 hours or longer.
Thereby, the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer represented by the chemical formula (1) composed of a biocompatible polymer having a phosphorylserine group in the side chain can be synthesized.
＜細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜＞
まず、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜について説明する。
図１０は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜の一例を示す図であって、平面図（ａ）と、（ａ）のＡ−Ａ’線における断面図（ｂ）である。
図１０に示すように、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜１１は、平面視略矩形状の膜状体である。しかし、平面視形状はこれに限られるものではなく、円形状、楕円形状、多角形状等としてもよい。
<Intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer membrane>
First, an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer membrane that is an embodiment of the present invention will be described.
FIG. 10 is a diagram showing an example of an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer membrane according to an embodiment of the present invention, and is a plan view (a) and a cross section taken along the line AA ′ in FIG. FIG.
As shown in FIG. 10, the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer membrane 11 which is an embodiment of the present invention is a membrane-like body having a substantially rectangular shape in plan view. However, the planar view shape is not limited to this, and may be a circular shape, an elliptical shape, a polygonal shape, or the like.
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜１１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が膜状凝集体とされてなる。
細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜１１の一面１１ａには、マクロファージが認識し、抗炎症性サイトカインを産生させる細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が露出されている。なお、図１０では、一面側のみに非誘発機能部位５１が露出されている構成を示したが、これに限られるものではなく、膜状凝集体の両面で非誘発機能部位が露出されている構成としてもよい。この構成により、いずれかの面をマクロファージに近接させることにより、マクロファージに細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜１１を認識させることができ、抗炎症性サイトカインを産生させることができる。
The intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer membrane 11 is formed by forming the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 into a film-like aggregate.
The intercellular signal transduction molecule production signal inducing function-inducing functional polymer membrane 11 is exposed with an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51 that macrophages recognize and produce anti-inflammatory cytokines. In addition, in FIG. 10, although the structure which the non-inducing functional part 51 was exposed only on one surface side was shown, it is not restricted to this, The non-inducing functional part is exposed on both surfaces of a film-like aggregate. It is good also as a structure. With this configuration, by bringing either surface close to the macrophage, the macrophage can recognize the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer membrane 11 and can produce an anti-inflammatory cytokine.
図１１は、図１０（ａ）のＢ部拡大図である。また、図１２は、図１０（ｂ）のＣ部拡大図である。
図１１、１２に示すように、表層である第１層２１は、複数の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が絡み合って形成されている。第１層２１の下層には、同様に複数の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が絡み合って凝集されてなる別の層２２が形成されている（図示略）。下層２２の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が露出されていないが、第１層２１の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が露出されているので、この面を近接させることにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることができる。
FIG. 11 is an enlarged view of a portion B in FIG. FIG. 12 is an enlarged view of part C in FIG.
As shown in FIGS. 11 and 12, the first layer 21, which is the surface layer, is formed by intertwining a plurality of intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymers 31. In the lower layer of the first layer 21, another layer 22 is formed in which a plurality of intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymers 31 are similarly entangled and aggregated (not shown). The intercellular information transfer molecule production signal inducing functional site 51 of the lower layer 22 is not exposed, but the intercellular information transfer molecule production signal inducing functional site 51 of the intercellular information transfer molecule production signal inducing functional polymer 31 of the first layer 21 is exposed. Therefore, by bringing these surfaces close to each other, the macrophage can recognize the intercellular signal transduction molecule production signal induction function site 51 and produce an anti-inflammatory cytokine.
＜細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜の作成方法＞
次に、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜の作成方法について説明する。
まず、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜の作成方法として、エレクトロスピニング法で、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を膜状に凝集させる方法を挙げることができる。
具体的には、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を溶媒に分散させた溶液を作成し、それを注射器に入れた後、注射器の先端と、捕集板とに電界を印加した状態で、注射器から溶液を噴射する。噴射された溶液の溶媒が気化・蒸発され、繊維状の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が捕集板上に凝集して、捕集される。これにより、膜状凝集体の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜が得られる。溶媒中に電解質などを添加してもよい。
<Method for producing functional polymer membrane for inducing intercellular signal transduction molecule production signal>
Next, a method for producing an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer membrane according to an embodiment of the present invention will be described.
First, as a method for producing an intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer membrane according to an embodiment of the present invention, a method of aggregating an intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer membrane into a membrane by electrospinning. Can be mentioned.
Specifically, after creating a solution in which the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function polymer is dispersed in a solvent and placing it in a syringe, an electric field is applied to the tip of the syringe and the collection plate Then, the solution is ejected from the syringe. The solvent of the sprayed solution is vaporized and evaporated, and the fibrous cell-to-cell signal transduction molecule production signal-inducing function polymer is aggregated on the collection plate and collected. Thereby, the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer membrane of the membrane-like aggregate is obtained. An electrolyte or the like may be added to the solvent.
次に、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜の作成方法として、濾過法で、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を膜状に凝集させる方法を挙げることができる。
具体的には、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を溶媒に分散させた溶液を作成し、それをフィルターでろ過する。これにより、フィルター上に、繊維状の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子が凝集して、捕集される。これにより、膜状凝集体の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜が得られる。吸引濾過により、生成速度を速めることができる。
Next, as a method for producing an intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer membrane according to an embodiment of the present invention, a method of aggregating the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function inducing membrane into a membrane by filtration. Can be mentioned.
Specifically, a solution in which a cell-mediated signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer is dispersed in a solvent is prepared, and the solution is filtered with a filter. As a result, the fibrous intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer is aggregated and collected on the filter. Thereby, the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer membrane of the membrane-like aggregate is obtained. The production rate can be increased by suction filtration.
何れの場合も、生成後、乾燥処理することが好ましい。これにより、残留水分等を完全に除去できる。 In any case, it is preferable to dry after the production. Thereby, residual moisture and the like can be completely removed.
＜細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液＞
図１３は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液の一例を示す図である。
図１３に示すように、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液８１は、容器８３中で、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が、水中に一様に分散されて構成されている。本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、主鎖４１と、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１と、非誘発機能部位５２とを備えている。
<Intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer dispersion>
FIG. 13 is a diagram showing an example of an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function polymer dispersion that is an embodiment of the present invention.
As shown in FIG. 13, an intercellular signal transduction molecule production signal inducing function-inducing function polymer dispersion 81 according to an embodiment of the present invention is contained in a container 83 in an intercellular information transduction molecule production signal induction according to an embodiment of the present invention. The functional polymer 31 is configured to be uniformly dispersed in water. The intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention includes a main chain 41, an intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional part 51, and a non-inducing functional part 52.
＜細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子粒子＞
図１４は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子の一例を示す図である。
図１４に示すように、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子９１は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が疎水性高分子からなる微粒子９２の表面から林立するように接合されて構成されている。本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、主鎖４１と、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１と、非誘発機能部位５２とを備えている。微粒子９２の径ｄは１００ｎｍ以上１ｍｍ未満であり、１００ｎｍ以上１００μｍとすることが好ましい。この範囲とすることにより、粒子径のバラツキを少なくできる。微粒子９２の形状は球状とされており、これが好ましいが、これに限られるものではなく、塊状であればよい。
<Intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer particles>
FIG. 14 is a diagram showing an example of an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer conjugate particle according to an embodiment of the present invention.
As shown in FIG. 14, the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer conjugate particle 91 according to the embodiment of the present invention is the same as the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention. They are joined so as to stand from the surface of the fine particles 92 made of a hydrophobic polymer. The intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention includes a main chain 41, an intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional part 51, and a non-inducing functional part 52. The diameter d of the fine particles 92 is 100 nm or more and less than 1 mm, preferably 100 nm or more and 100 μm. By setting this range, the variation in particle diameter can be reduced. The shape of the fine particles 92 is spherical, and this is preferable. However, the shape is not limited to this, and it may be a lump.
この細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子９１は、本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１の一端に疎水性高分子を接合したものを複数用意し、それらの疎水性高分子側で束ねた後、疎水性高分子部分を塊状の微粒子とすることにより、容易に作成することができる。 A plurality of intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer conjugate particles 91 are prepared by joining a hydrophobic polymer to one end of the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 according to an embodiment of the present invention. And after bundling by the hydrophobic polymer side, it can produce easily by making a hydrophobic polymer part into a block-shaped fine particle.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１を備えた生体適合性高分子である構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 Since the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention is a biocompatible polymer provided with the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function site 51, the macrophage at the inflamed site is used. It can be recognized and used as a constituent material of a biomimetic material that can produce an anti-inflammatory cytokine and has the same effect as an apoptotic cell. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１がアミノ基とカルボキシル基を備えたキラル炭素を有する構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることができる。 Since the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the intercellular information transmission molecule production signal induction functional site 51 has a chiral carbon having an amino group and a carboxyl group, Of macrophages can produce anti-inflammatory cytokines.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１がホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）である構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることができる。 The intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention has a structure in which the intercellular information transmission molecule production signal induction functional site 51 is a phosphorylserine group (PhoSer group). Recognize to produce anti-inflammatory cytokines.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、前記ホスホリルセリン基がＬ型である構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインをより多く産生させることができる。 Since the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention has a structure in which the phosphorylserine group is L-type, macrophages at the inflammatory site are recognized and more anti-inflammatory cytokines are produced. Can be made.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、前記生体適合性高分子が合成高分子又は多糖類からなる主鎖４１を有する構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料として容易に、かつ、安定して利用できる。 The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention is recognized by macrophages at the inflammatory site because the biocompatible polymer has a main chain 41 made of a synthetic polymer or a polysaccharide. Therefore, it can be used easily and stably as a constituent material of biomimetics material that can produce anti-inflammatory cytokines and has the same effect as apoptotic cells.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位５１が、主鎖４１に対して側鎖又は末端基として結合されている構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料として容易に、かつ、安定して利用できる。 In the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention, the intercellular signal transduction molecule production signal induction functional site 51 is bonded to the main chain 41 as a side chain or a terminal group. Because of its structure, it can be recognized easily by macrophages in the inflammatory site and produce anti-inflammatory cytokines. It has the same effect as apoptotic cells and can be used easily and stably as a constituent material of biomimetics. it can.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、１又は２種類以上の非誘発機能部位５２が、主鎖４１に対して側鎖として結合されている構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料としてより容易に、かつ、より安定して利用できる。 Since the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which one or two or more types of non-inducing functional sites 52 are bonded to the main chain 41 as side chains, It can be recognized by macrophages in the inflammatory site and can produce anti-inflammatory cytokines, and can be used more easily and more stably as a constituent material of biomimetic materials that has the same effect as apoptotic cells. .
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、非誘発機能部位５２が水酸基又はＣ１〜Ｃ５のアルキル基である構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料としてより容易に、かつ、より安定して利用できる。 Intercellular signaling molecule production signal induced function polymer 31 is an embodiment of the present invention, the non-induced functional portion 52 is configured an alkyl group having a hydroxyl group or a C 1 -C 5, to recognize the macrophage inflammatory sites It can be used more easily and more stably as a constituent material of biomimetic materials that can produce anti-inflammatory cytokines and has the same effect as apoptotic cells.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、前記合成高分子が、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂肪族ポリエステル、ポリアミノ酸の群から選択されるいずれか一の高分子である構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料としてより容易に、より安定して、かつ、生体に異物として認識されないように利用できる。 The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention is such that the synthetic polymer is poly (acrylamide), poly (methacrylamide), poly (acrylic acid), poly (acrylic acid ester). , Poly (methacrylic acid), poly (methacrylic acid ester), polyethylene glycol (PEG), aliphatic polyester, and polyamino acid, so that the macrophage at the site of inflammation is recognized. As a constituent material of biomimetic materials that can produce anti-inflammatory cytokines and have the same effect as apoptotic cells, so that it is not easily recognized as a foreign substance by the living body Available.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１は、前記多糖類が、アミロース、アミロペクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサンの群から選択されるいずれか一の多糖類である構成なので、炎症部位のマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料の構成材料としてより容易に、より安定して、かつ、生体に異物として認識されないように利用できる。 In the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention, the polysaccharide is any one selected from the group consisting of amylose, amylopectin, alginic acid, hyaluronic acid, and chitosan. Since it is a composition, it can be recognized by macrophages at the inflammatory site and can produce anti-inflammatory cytokines, and it has the same effect as apoptotic cells, making it easier and more stable as a constituent material of biomimetics material, And it can utilize so that it may not be recognized as a foreign material by a biological body.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１の合成方法は、酸素に第１の保護基が結合されたホスホロアミダイト化合物と、カルボキシル基の酸素に第２の保護基が結合され、アミノ基のＮに第３の保護基が結合された、水酸基を有するセリン化合物と、を反応させて、前記水酸基のＨを前記ホスホロアミダイト化合物で置換して、第１〜第３の保護基が結合されたホスホリルセリン化合物を合成する工程Ｓ１と、前記第１〜第３の保護基が結合されたホスホリルセリン化合物を、合成高分子又は多糖類からなり、水酸基を有する生体適合性高分子と反応させて、前記水酸基のＨを前記第１〜第３の保護基が結合されたホスホリルセリン化合物で置換して、第１〜第３の保護基が結合されたホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）を有する細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成する工程Ｓ２と、前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を酸化して、第１〜第３の保護基を脱離して、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を合成する工程Ｓ３と、を有する構成なので、反応順序を考慮して、まず、活性化剤であるｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅにより、ホスホロアミダイト化合物であるＯ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅとセリン化合物であるＮ−Ｚ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒとを反応させて、中間生成物（第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物）を合成してから、次に、この中間生成物と生体適合性高分子とを結合・酸化反応させて、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成してから、最後に、脱保護反応させることにより、水酸基をバランスよく反応させることができ、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を容易にかつ確実に合成することができる。 The method for synthesizing an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to an embodiment of the present invention includes a phosphoramidite compound in which a first protecting group is bound to oxygen, and a second protection to the carboxyl group oxygen. And a serine compound having a hydroxyl group, in which a third protecting group is bonded to N of the amino group, and replacing the H of the hydroxyl group with the phosphoramidite compound. A step S1 for synthesizing a phosphorylserine compound to which a third protecting group is bound, and a phosphorylserine compound to which the first to third protecting groups are bound are made of a synthetic polymer or a polysaccharide and have a hydroxyl group. A phosphorylserine group to which the first to third protective groups are bonded by reacting with a compatible polymer, replacing H of the hydroxyl group with a phosphorylserine compound to which the first to third protective groups are bonded; ( step S2 of synthesizing an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer precursor having a hoSer group), oxidizing the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer precursor, Step S3 for synthesizing the cell-mediated signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer by detaching the protecting group. Considering the reaction sequence, first, imidazole hydrochloride, an activator, is used to obtain phosphoro Amidite compound O-Benzyl N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphodiamidite and serine compound NZ-L-serine benzoyl ester are reacted to produce an intermediate product (first to third protections). A phosphorylserine compound having a group), The product and biocompatible polymer are combined and oxidized to synthesize an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer precursor, and finally, deprotection is performed to balance the hydroxyl groups. It can be made to react, and an intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer can be synthesized easily and reliably.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１の合成方法は、第１及び第２の保護基がベンジル基（ｂｅｎｚｙｌ基）であり、第３の保護基がベンジルオキシカルボニル基（ｂｅｎｚｙｌ ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ基）である構成なので、水酸基をバランスよく反応させることができ、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を容易にかつ確実に合成できる。 In the method for synthesizing an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to an embodiment of the present invention, the first and second protecting groups are benzyl groups (benzyl groups), and the third protecting group is benzyloxy. Since it is a structure which is a carbonyl group (benzoyloxycarbonyl group), the hydroxyl group can be reacted in a well-balanced manner, and an intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer can be synthesized easily and reliably.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１の合成方法は、前記活性化剤がイミダゾール・ハイドロクロライドである構成なので、水酸基をバランスよく反応させることができる。 In the method for synthesizing the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention, since the activator is imidazole hydrochloride, the hydroxyl groups can be reacted in a balanced manner.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１の合成方法は、前記酸化剤がｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅである構成なので、結合反応生成物のリンを三価から五価に効率よく酸化することができる。 In the method for synthesizing the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention, since the oxidant is tert-butyl hydroxide, the binding reaction product phosphorus is changed from trivalent to pentavalent. It can be oxidized efficiently.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１の合成方法は、前記脱保護剤がＰｄ／Ｃである構成なので、第１〜第３の保護基を効率よく脱離することができる。 In the method for synthesizing the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer 31 according to the embodiment of the present invention, since the deprotecting agent is Pd / C, the first to third protecting groups are efficiently removed. can do.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜１１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が膜状凝集体とされており、膜状凝集体の少なくとも一面１１ａで細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位が露出されている構成なので、前記露出面を炎症部位のマクロファージに近接させることにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer membrane 11 according to the embodiment of the present invention is such that the intercellular signal transduction molecule production signal inducing function-inducing functional polymer 31 is a film-like aggregate, Since the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional site is exposed on one surface 11a, the macrophage is made to recognize the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional site by bringing the exposed surface close to the macrophage in the inflamed site. Thus, it can be used as a biomimetic material that can produce anti-inflammatory cytokines and has the same effect as apoptotic cells. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液８１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が、水８２中に一様に分散されている構成なので、前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液を炎症部位のマクロファージに塗布することにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 The intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer dispersion 81 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the intercellular information transmission molecule production signal induction functional polymer 31 is uniformly dispersed in the water 82. , By applying the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function-induced polymer dispersion to macrophages in the inflammatory site, the macrophage is recognized by the macrophages in the inflammatory site, and anti-inflammatory cytokines are produced. It can be used as a biomimetic material that has the same effect as an apoptotic cell. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子９１は、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子３１が疎水性高分子からなるナノ粒子９２の表面から林立するように接合されている構成なので、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子を炎症部位のマクロファージに滴下することにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることが可能な、アポトーシス細胞と同様な効果を奏する、バイオミメテック材料として利用できる。これにより、心筋梗塞などの炎症を抑制できる。 The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function-inducing functional polymer conjugate particle 91 according to the embodiment of the present invention stands from the surface of the nanoparticle 92 in which the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function polymer 31 is made of a hydrophobic polymer. So that the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing function-inducing functional polymer-conjugated particles are dropped onto macrophages in the inflammatory site, causing the macrophage to recognize the intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional site, It can be used as a biomimetic material that can produce anti-inflammatory cytokines and has the same effect as apoptotic cells. Thereby, inflammation, such as myocardial infarction, can be suppressed.
本発明の実施形態である細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子及びその合成方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer and the synthesis method thereof according to the embodiment of the present invention are not limited to the above embodiment, and various modifications can be made within the scope of the technical idea of the present invention. Can be implemented. Specific examples of this embodiment are shown in the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
＜Ｏ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅの合成＞
以下に示すように、Ｋｉｎｇらの合成方法（非特許文献６）を用いて、Ｏ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅを合成した。
Example 1
<Synthesis of O-Benzyl N, N, N ', N'-tetraisopropyl phosphodiamidite>
As shown below, O-Benzyl N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphodiamidite was synthesized using the method of King et al. (Non-patent Document 6).
まず、窒素フロー下の二口フラスコ（３００ｍＬ）に回転子、ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ ４９ｍＬ、ｈｅｘａｎｅ １４０ｍＬを入れてから、マグネティックスターラーを用いて撹拌した。
次に、氷冷下、この溶液に、ｐｈｏｓｐｈｏｌｕｓ ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｈｅｘａｎｅ溶液（５ｍＬ／１０ｍＬ）を、等圧滴下ロートにて、１ｍＬ／ｍｉｎの滴下速度で滴下した。
次に、この溶液を３時間室温で撹拌してから、８０℃で２２時間還流して、ｂｉｓ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅを合成した。
次の化学反応式（１１）は、ｂｉｓ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅの合成スキームを示す式である。
First, a rotor, diisopropylamine 49 mL, and hexane 140 mL were placed in a two-necked flask (300 mL) under a nitrogen flow, and then stirred using a magnetic stirrer.
Next, a phosphorous trichloride / hexane solution (5 mL / 10 mL) was added dropwise to the solution under ice cooling at a dropping rate of 1 mL / min with an isobaric dropping funnel.
Next, this solution was stirred at room temperature for 3 hours and then refluxed at 80 ° C. for 22 hours to synthesize bis (diisopropylamino) chlorophosphine.
The following chemical reaction formula (11) is a formula showing a synthesis scheme of bis (diisopropylamino) chlorophosphine.
還流後、再び、反応容器を氷冷し、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＴＥＡ）を２４ｍＬ加えてから、等圧滴下漏斗でＴＥＡ／ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ溶液（８ｍＬ／６ｍＬ）を滴下速度１ｍＬ／ｍｉｎで滴下して、氷冷下で２５分撹拌し、更に、室温で３５分撹拌した。 After refluxing, the reaction vessel is cooled again with ice, 24 mL of triethylamine (TEA) is added, and then TEA / benzyl alcohol solution (8 mL / 6 mL) is added dropwise at a dropping rate of 1 mL / min with an isobaric dropping funnel. The mixture was stirred at the bottom for 25 minutes, and further stirred at room temperature for 35 minutes.
次に、反応後の溶液中に存在する析出物をろ過により除去した。
更に、ロータリーエバポレーターで液体成分をある溶媒を完全に除去した。これにより、得られた残留物に２０ｍＬのｈｅｘａｎｅを加えて残留物を溶解させた。
Next, precipitates present in the solution after the reaction were removed by filtration.
Further, the solvent was completely removed from the liquid component by a rotary evaporator. Thereby, 20 mL of hexane was added to the obtained residue to dissolve the residue.
次に、この溶液を分液ロートに移してから、８０ｍＬのａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅにて分液抽出操作を行い、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ層を廃棄した。
次に、同様の操作を６０ｍＬのａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅで２回行い、ｈｅｘａｎｅ層から不純物を除去した。
Next, this solution was transferred to a separatory funnel, and then a liquid separation extraction operation was performed with 80 mL of acetone, and the acetone layer was discarded.
Next, the same operation was performed twice with 60 mL of acetone to remove impurities from the hexane layer.
次に、分液抽出操作により精製した溶液をロータリーエバポレーターにかけ、溶媒であるｈｅｘａｎｅを完全に除去した。これにより、Ｏ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅを得た。
次の化学反応式（１２）は、ｂｉｓ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅからＯ−Ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅの合成スキームを示す式である。
Next, the solution purified by the liquid separation extraction operation was applied to a rotary evaporator to completely remove hexane as a solvent. As a result, O-Benzyl N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphorodiamide was obtained.
The following chemical reaction formula (12) is a formula showing a synthesis scheme of O-Benzyl N, N, N ′, N′-tetraphosphoprophodium phosphomidite from bis (diisopropylamino) chlorophosphine.
＜ＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒの合成＞
まず、１００ｍＬナスフラスコに回転子を入れ、エタノール５０ｍＬを注ぎ、モノマーとして再結晶にて精製したＮＩＰＡＡｍ９．０５ｇとＨＭＡＡｍ２．０２ｇを入れ、重合開始剤としてａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＡＩＢＮ）２０ｍｇを混和した。
<Synthesis of NIPAAm-HMAAm copolymer>
First, a rotor was placed in a 100 mL eggplant flask, 50 mL of ethanol was poured, NIPAAm 9.05 g purified by recrystallization and 2.02 g of HMAAm were added as monomers, and 20 mg of azobisisobutyronitrile (AIBN) was mixed as a polymerization initiator.
次に、本溶液を３０分間、乾燥窒素でバブリングした後、７０℃にて２０時間撹拌した。
次に、ジエチルエーテルを貧溶媒とした再沈殿法にて精製した。
次に、真空ポンプで乾燥した。
以上のようにして、ＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒを合成した。
次の化学反応式（１３）は、以上のフリーラジカル重合法によるＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒの合成スキームを示す式である。
Next, this solution was bubbled with dry nitrogen for 30 minutes and then stirred at 70 ° C. for 20 hours.
Next, purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether as a poor solvent.
Next, it was dried with a vacuum pump.
NIPAAm-HMAAm copolymer was synthesized as described above.
The following chemical reaction formula (13) is a formula showing a synthesis scheme of NIPAAm-HMAAm copolymer by the above free radical polymerization method.
＜高分子反応による保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体の合成＞
まず、窒素フロー、氷冷下の１００ｍＬ二口フラスコに回転子を入れ、Ｎ−Ｚ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒ（市販品）２．１９５ｇ、ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ ３０ｍＬを入れ、Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅ／ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ溶液（２．５０５ｇ／１５ｍＬ）を加えた。
次に、氷冷下でｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを２００ｍｇ加え、 室温で２１時間撹拌して、反応中間体を得た。
次の化学反応式（１４）は、この反応中間体の合成スキームを示す式である。
<Synthesis of a terpolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain by a polymer reaction>
First, a rotator was placed in a 100 mL two-necked flask under nitrogen flow and ice cooling, and 2.195 g of NZL-serine benzoyl ester (commercial product) and 30 mL of dichloromethane were added, and O-benzyl N, N, N ′ , N′-tetrapropylpropylphosphodiamidite / dichloromethane solution (2.505 g / 15 mL) was added.
Next, 200 mg of imidazole hydrochloride was added under ice cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 21 hours to obtain a reaction intermediate.
The following chemical reaction formula (14) is a formula showing a synthesis scheme of this reaction intermediate.
次に、窒素雰囲気下にて、反応中間体に、ＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ２．５ｇとｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（６５２ｍｇ）を加え、以後４５分毎にｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（６５２ｍｇ）を加えた後１５０分撹拌した。 Next, under a nitrogen atmosphere, 2.5 g of NIPAAm-HMAAm copolymer and imidazole hydrocarbon (652 mg) were added to the reaction intermediate, and thereafter imidazole hydrochloride (652 mg) was added every 45 minutes, followed by stirring for 150 minutes.
次に、溶液を氷冷し、ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを２ｍＬ加え、２時間撹拌した後、１０ｗｔ％ＮａＨＳＯ３水溶液（２０ｍＬ）と５ｗｔ％ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）でリンの酸化反応をクエンチングした。 Next, the solution was ice-cooled, 2 mL of tert-butyl hydroxide was added, and the mixture was stirred for 2 hours, and then the oxidation reaction of phosphorus was quenched with 10 wt% NaHSO 3 aqueous solution (20 mL) and 5 wt% NaHCO 3 aqueous solution (20 mL).
次に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒をすべて除き、残った固体成分をＤＭＦに溶解させ、ジエチルエーテルと熱水を貧溶媒とした再沈殿をそれぞれ２回行い、真空ポンプで乾燥した。
以上の工程により、「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」を得た。
次の化学反応式（１５）は、「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」の合成スキームを示す式である。
Next, all of the solvent was removed using a rotary evaporator, the remaining solid component was dissolved in DMF, reprecipitation was performed twice using diethyl ether and hot water as poor solvents, and dried with a vacuum pump.
Through the above steps, a “ternary copolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain” was obtained.
The following chemical reaction formula (15) is a formula showing a synthesis scheme of “a ternary copolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain”.
＜「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」の脱保護＞
まず、「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」２．５ｇを氷酢酸５０ｍＬに溶解させてから、パラジウム炭素触媒１００ｍｇを分散させ、回転子とともに耐圧反応容器に入れてから、２気圧の水素雰囲気下で４８時間激しく撹拌した。
次に、パラジウム炭素触媒と溶液を遠心分離操作にて分け、液相をジエチルエーテルに滴下して再沈殿法にて精製した。
以上の工程により、酸化剤を用いて三価のリンを五価になるまで酸化した後、脱保護して、ホスホリルコリン基を側鎖に有する高分子を合成した。
次の化学反応式（１６）は、「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」の脱保護反応スキームを示す式である。
<Deprotection of “Ternary Copolymer Having Protected Phosphoryl Serine Group in Side Chain”>
First, 2.5 g of “terpolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain” is dissolved in 50 mL of glacial acetic acid, and then 100 mg of palladium carbon catalyst is dispersed, and placed in a pressure-resistant reaction vessel together with a rotor. And vigorously stirred for 48 hours under a hydrogen atmosphere of 2 atm.
Next, the palladium carbon catalyst and the solution were separated by centrifugation, and the liquid phase was dropped into diethyl ether and purified by a reprecipitation method.
Through the above-described steps, trivalent phosphorus was oxidized to pentavalent using an oxidizing agent and then deprotected to synthesize a polymer having a phosphorylcholine group in the side chain.
The following chemical reaction formula (16) is a formula showing a deprotection reaction scheme of “a terpolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain”.
＜保護されたホスホリルセリン基の導入率の評価＞
次に、化学反応式（１５）で表されるスキームにて得られた「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」の水酸基に対する保護されたホスホリルセリン基の導入率（ｏ／ｍ）、すなわち、ＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒに対する保護されたホスホリルセリン基の導入率（ｏ／ｍ）の評価を行った。
評価法として１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、保護基が有するベンジル基とＮＩＰＡＡｍが有するイソプロピル基の３級炭素に結合しているプロトンのピークの積分値を比較した。
<Evaluation of introduction rate of protected phosphorylserine group>
Next, the introduction rate of the protected phosphorylserine group to the hydroxyl group of the “terpolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain” obtained by the scheme represented by the chemical reaction formula (15) ( o / m), that is, the introduction rate (o / m) of the protected phosphorylserine group with respect to NIPAAm-HMAAm copolymer was evaluated.
As an evaluation method, a 1H-NMR spectrum was measured, and the integrated values of the peaks of protons bonded to the tertiary carbon of the benzyl group of the protecting group and the isopropyl group of NIPAAm were compared.
図１５は、「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
図１５に示すように、７−８ｐｐｍにベンジル基由来のブロードなピークを確認し、反応の有意な進行を示唆するデータが得られた。
また、水酸基に対する導入率（ｏ／ｍ）を算出したところ、２７％であると算出できた。これにより、高分子鎖全体の割合を考えると、約５％が保護されたホスホリルセリン基を有するブロックであると考えられた。
FIG. 15 is a 1 H-NMR spectrum of a “terpolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain”.
As shown in FIG. 15, a broad peak derived from a benzyl group was confirmed at 7-8 ppm, and data suggesting a significant progress of the reaction was obtained.
Moreover, when the introduction rate (o / m) with respect to the hydroxyl group was calculated, it was calculated to be 27%. Thus, when the ratio of the entire polymer chain was considered, it was considered that about 5% was a block having a protected phosphorylserine group.
＜脱保護の評価＞
次に、「保護されたホスホリルセリン基を側鎖に有する３元共重合体」の脱保護の評価を１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び濁度変化により行った。
まず、脱保護した高分子鎖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
図１６は、脱保護した高分子鎖の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図１６では、７−８ｐｐｍに存在したベンジル基由来のピークが消失した。これにより、脱保護の有意な進行を確認した。
<Evaluation of deprotection>
Next, the deprotection of the “terpolymer having a protected phosphorylserine group in the side chain” was evaluated by 1H-NMR spectrum and turbidity change.
First, the 1H-NMR spectrum of the deprotected polymer chain was measured.
FIG. 16 is a 1H-NMR spectrum of a deprotected polymer chain. In FIG. 16, the peak derived from the benzyl group present at 7-8 ppm disappeared. This confirmed a significant progression of deprotection.
次に、反応前のｂａｒｅなＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ（ｂａｒｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）と、保護されたホスホリルセリン基を有するＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ（ｓｅｒｉｎｅ ａｄｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）と、脱保護したホスホリルセリン基を有するＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）の３種の水溶液を作成した。
次に、各水溶液の温度変化による濁度変化を測定した。
Next, bare NIPAAm-HMAAm polymer (bare polymer) before reaction, NIPAAm-HMAAm polymer having a protected phosphorylserine group (NIPAAm-copolymer having a deprotected phosphorylserine group) Three types of aqueous solutions (deprotected polymer) were prepared.
Next, the turbidity change by the temperature change of each aqueous solution was measured.
本高分子の大部分を構成するＮＩＰＡＡｍは、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を有する。ＮＩＰＡＡｍ高分子のＬＣＳＴは、自身が親水性になったときは高温側へ、疎水性になったときは低温側へ変動する。よって、各水溶液の温度変化による濁度変化によって、親疎水性の程度が分かり、それにより、脱保護の程度が分かる。 NIPAAm constituting most of the present polymer has a lower critical solution temperature (LCST). The LCST of the NIPAAm polymer fluctuates to the high temperature side when it becomes hydrophilic and to the low temperature side when it becomes hydrophobic. Therefore, the degree of hydrophilicity / hydrophobicity can be determined from the change in turbidity due to the temperature change of each aqueous solution, and thus the degree of deprotection can be determined.
図１７は、ｂａｒｅ ｐｏｌｙｍｅｒ、ｓｅｒｉｎｅ ａｄｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ及びｄｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒのＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ水溶液の温度変化による濁度変化を示すグラフである。
このグラフは、ＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒの各水溶液のＬＣＳＴの変化を示す。
図１７に示すように、ｂａｒｅ ｐｏｌｙｍｅｒの水溶液は、低温から高温にあげていくと、約４６℃で１００％から０％へ％Ｔ／％ＴＭＡＸが変化した。すなわち、約４６℃で透明な水溶液が濁った。ｂａｒｅ ｐｏｌｙｍｅｒの水溶液のＬＣＳＴは４６℃である。
ｓｅｒｉｎｅ ａｄｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒの水溶液の場合、ＬＣＳＴは４４℃と低温側にシフトし、また、濁度変化の傾きも少しなだらかとなった。
ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒの水溶液のＬＣＳＴは５０℃と高温側にシフトし、濁度変化の傾きもかなりなだらかとなった。
つまりＮＩＰＡＡｍ−ＨＭＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒへ対して保護されたホスホリルセリン基を付加した場合はＬＣＳＴが低温側へシフトし、脱保護することでＬＣＳＴが高温側へシフトした。
これにより、保護基は疎水性が強いことから、反応が有意に進行していることが示唆された。
FIG. 17 is a graph showing changes in turbidity due to temperature changes of NIPAAm-HMAAm polymer aqueous solutions of bare polymer, serine added polymer, and protected polymer.
This graph shows the change of LCST of each aqueous solution of NIPAAm-HMAAm copolymer.
As shown in FIG. 17, in the aqueous solution of bare polymer,% T /% TMAX changed from 100% to 0% at about 46 ° C. when the temperature was increased from low temperature to high temperature. That is, the transparent aqueous solution became cloudy at about 46 ° C. The LCST of an aqueous solution of bare polymer is 46 ° C.
In the case of an aqueous solution of serine added polymer, the LCST shifted to a low temperature side of 44 ° C., and the slope of the turbidity change became slightly gentle.
The LCST of the aqueous solution of protected polymer shifted to a high temperature side of 50 ° C., and the slope of the turbidity change became quite gentle.
That is, when a protected phosphorylserine group was added to NIPAAm-HMAAm copolymer, LCST shifted to a low temperature side, and deprotection shifted LCST to a high temperature side.
As a result, the protective group was strongly hydrophobic, suggesting that the reaction proceeded significantly.
本発明の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子は、高分子内に細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位を有するので、マクロファージに近接させることにより、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位をマクロファージに認識させて、抗炎症性サイトカインを産生させることができ、この高分子自体、及びこの高分子を構成材料とする膜、液及び粒子は、アポトーシス細胞のバイオミメテック材料として利用でき、炎症を速やかに抑制できるので、医薬品製造産業、医薬関連製品産業等において利用可能性がある。 The intercellular signal transduction molecule production signal induction function polymer of the present invention has an intercellular signal transduction molecule production signal induction function site in the polymer. The macrophage can be recognized by the macrophage to produce anti-inflammatory cytokines, and the polymer itself and the membranes, fluids and particles that comprise this polymer can be used as biomimetic materials for apoptotic cells. Inflammation can be quickly suppressed, so that it can be used in the pharmaceutical manufacturing industry, the pharmaceutical-related product industry, and the like.
１１…細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子膜、１１ａ…一面、１１ｂ…他面、２１…第１層、２２…第２層、３１…細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子、４１…主鎖、５１…細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能部位、５２…非誘発機能部位、６１…マクロファージ、６２…刺激、６３…炎症性サイトカイン、６５…アポトーシス細胞、６６…抗炎症性サイトカイン、７１…ヘッドグループ（頭部）、７２…長鎖アルキル鎖、７３…ホスファチジルセリン、７５…アポトーシス細胞膜（２分子膜）、７７…リポソーム、８１…細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子分散液、８２…水（溶媒）、８３…容器、９１…細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子接合粒子、９２…ナノ粒子。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Intercellular signal transduction molecule production signal induction functional polymer film, 11a ... One side, 11b ... Other side, 21 ... First layer, 22 ... Second layer, 31 ... Intercellular information transmission molecule production signal induction functional polymer, DESCRIPTION OF SYMBOLS 41 ... Main chain, 51 ... Intercellular signal transduction molecule production signal induction functional part, 52 ... Non-induction functional part, 61 ... Macrophage, 62 ... Stimulation, 63 ... Inflammatory cytokine, 65 ... Apoptotic cell, 66 ... Anti-inflammatory cytokine , 71 ... head group (head), 72 ... long chain alkyl chain, 73 ... phosphatidylserine, 75 ... apoptotic cell membrane (bimolecular membrane), 77 ... liposome, 81 ... intercellular signal transduction molecule production signal-induced functional polymer dispersion Liquid, 82 ... Water (solvent), 83 ... Container, 91 ... Intercellular signal transduction molecule production signal-inducing functional polymer conjugate particle, 92 ... Nanoparticle.
Claims (9)
ここで、次式において、ｏ、ｎ、ｍは、それぞれ１以上の自然数であり、ｍ＞ｏである。
Here, in the following expression, o, n, and m are each a natural number of 1 or more, and m> o.
活性化剤により、前記第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン化合物と、合成高分子又は多糖類からなり、水酸基を有する生体適合性高分子とを結合反応させてから、酸化剤により、結合反応生成物のリンを三価から五価に酸化して、第１〜第３の保護基を有するホスホリルセリン基（ＰｈｏＳｅｒ基）を有する生体適合性高分子からなる細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体を合成する工程と、
脱保護剤により、前記細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子前駆体の第１〜第３の保護基を脱保護して、細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子を合成する工程と、を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞間情報伝達分子産生信号誘発機能高分子の合成方法。 By reacting the phosphoramidite compound having the first protecting group with the serine compound having the second and third protecting groups and the hydroxyl group by the activator, the phosphoramidite compound is bonded to the serine compound. A step of synthesizing a phosphorylserine compound having first to third protective groups;
After the phosphorylserine compound having the first to third protective groups and a synthetic polymer or polysaccharide, and a biocompatible polymer having a hydroxyl group by a binding reaction with an activating agent, An intercellular signal transduction molecule production signal comprising a biocompatible polymer having a phosphorylserine group (PhoSer group) having a first to a third protecting group by oxidizing phosphorus of a binding reaction product from trivalent to pentavalent Synthesizing a triggering functional polymer precursor;
Deprotecting the first to third protecting groups of the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer precursor with a deprotecting agent, and synthesizing the intercellular signal transduction molecule production signal inducing functional polymer; , and having a, intercellular information methods composite transfer molecule production signal induced function polymer of claim 1.
The intercellular signal transduction molecule production signal induction function polymer according to claim 1 is joined so as to stand from the surface of fine particles made of a hydrophobic polymer. Polymer bonded particles.
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