JP6209566B2 - ハイブリッドユビキチンプロモーターを含む発現ベクター - Google Patents

Description

発明の分野
本発明はハイブリッドユビキチンプロモーターを含む発現ベクターに関する。該プロモーターはとりわけインビボにおける導入遺伝子の高発現および持続発現ならびにエクスビボ遺伝子治療に有用であり、さらにインビトロにおける組換え蛋白発現にも有用である。

発明の背景
ユビキチンは豊富に存在する小型の７６個のアミノ酸の蛋白であり、すべての真核細胞において発現される（Ciechanover et al. 2000; Wilkinson et al., 2000）。該蛋白は異常な、ミスフォールディングされたあるいは短命な蛋白に共有結合し、それらの蛋白はプロテアソームにおいて破壊される運命にある（Ciechanover上記文献）。ユビキチンはヒストンとも結合し、遺伝子発現において役割を果たしている可能性がある（Spencer and Davie, 1999）。そのコーディング配列は進化の過程で著しく保存されており、昆虫からヒトに至るまで同一である。ヒトにおいて少なくとも３つのユビキチン遺伝子があり、ＵｂＡ、ＵｂＢおよびＵｂＣと命名されており、それらはそれぞれ１個、３個または９個の７６アミノ酸のコーディングユニットの正確なダイレクトリピートを含むと思われる（Baker and Board, Nucleic Acids Research, 15:443-463 (1987); Lund et al. 1985; Nenoi, et al. 1996; およびWilborg et al., EMBO J., 4:755-759 (1985)）。ヒトのＵｂＢおよびＵｂＣ遺伝子は配列決定されており、それらのコーディング領域中にイントロンを含まないが、それぞれ５’隣接領域中にイントロンを含むことが示されている（Baker and Board上記文献; Nenoi上記文献）。ＵｂＣプロモーターは、トランスジェニックマウスに導入された場合、およびプラスミドＤＮＡベクター中に含有させられた場合に高レベルの不変的発現を引き起こすことが示されている（Johansen et al., FEBS 267:289-294 (1990); Schopp et al., Nucleic Acids Research, 24:1787-1788 (1996); Wulff et al., 1990）。

ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター（米国特許第５８４９５２２号；米国特許第５１６８０６２号参照）は、導入遺伝子の強力な構成的発現を高レベルで引き起こすことが知られている。しかしながら、遺伝子治療への適用において、ＣＭＶプロモーターを用いて達成される発現レベルは経時的に有意に低下することが示されている。

したがって、遺伝子治療のごとき適用において高発現および持続発現を可能にする改良された調節エレメントを提供する必要があり続けている。

発明の概要
本発明は、１またはそれ以上のユビキチンプロモーター由来のエレメントと１またはそれ以上の強力なエンハンサーとを一緒に用いたハイブリッド調節領域を提供する。さらに本発明は、結合されたコーディング配列の高発現および持続発現を提供するＤＮＡベクターを提供する。

プラスミドＤＮＡのダイヤグラムである。ＵｂはヒトユビキチンＢプロモーター；イントロンはアデノウイルスおよびマウス免疫グロブリン遺伝子イントロンのハイブリッド；ＳＥＡＰは分泌ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼｃＤＮＡ；ｐＡはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ＵｂイントロンはＵＢＢ遺伝子中の内在性イントロン；ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ；ＣＭＶｅｎｈはヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子エンハンサー領域（転写開始部位に対して−５２２から−２１９まで）；ＣＭＶはサイトメガロウイルス即時初期遺伝子エンハンサー−プロモーター（開始部位に対して−５２２から＋７８まで）。 ヒト気道内皮細胞におけるｐＵＢ−ＳＥＡＰおよびｐＵＢＩ−ＳＥＡＰからのＳＥＡＰの発現。Ａ）カチオン性脂質ＧＬ−６７と複合体化（１０．５μＭ ＧＬ−６７：３０μＭ ｐＤＮＡ）したｐＵＢ−ＳＥＡＰ、ｐＵＢＩ−ＳＥＡＰ、あるいはｐＣＦ１−ＳＥＡＰでＣＦＴ−１細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後に組織培養培地を集め、ＳＥＡＰ発現に関してアッセイした。Ｂ）カチオン性脂質ＧＬ−６７と複合体化（１０．５μＭ ＧＬ−６７：３０μＭ ｐＤＮＡ）したｐＵＢ−ＳＥＡＰ、ｐＵＢＩ−ＳＥＡＰ、あるいはｐＣＦ１−ＳＥＡＰでＢＥＡＳ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから２、４および６日後に組織培養培地を集め、ＳＥＡＰ発現に関してアッセイした。１のｐＤＮＡあたりｎ＝４ウェル。データを平均値±標準偏差で示す。 マウス肺におけるｐＵＢＩ−ＣＡＴからのＣＡＴ発現の持続性。Ａ）ｐＵＢＩ−ＣＡＴまたはｐＣＦ１−ＣＡＴと複合体化されたカチオン性脂質ＧＬ−６７ ７５μｌ（０．６：３．６ｍＭ ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ）をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内に滴下した。滴下後異なる日数において肺を集め、肺ホモジネート中のＣＡＴレベルを測定した。Ｂ）ｐＵＢＩ−ＣＡＴまたはｐＣＦ１−ＣＡＴと複合体化されたカチオン性脂質ＧＬ−６２ １００μｌ（０．７５：０．７５ｍＭ ＧＬ−６２：ｐＤＮＡ）をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの尾の静脈に注射した。注射後異なる日数において肺を集め、肺ホモジネート中のＣＡＴレベルを測定した。１つの時点につきｎ＝４マウス。データを平均値±標準偏差で示す。 マウス肺におけるｐＣＵＢＩ−ＣＡＴからのＣＡＴ発現の持続性。Ａ）ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴまたはｐＣＦ１−ＣＡＴと複合体化されたカチオン性脂質ＧＬ−６７ ７５μｌ（０．６：３．６ｍＭ ＧＬ−６２：ｐＤＮＡ）をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内に滴下した。滴下後異なる日数において肺を集め、肺ホモジネート中のＣＡＴレベルを測定した。Ｂ）２６日目に２回目のＧＬ−６７：ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴ複合体をマウスのグループに滴下した。２８日目および８４日目（１回目の滴下から）に肺を集め、ＣＡＴアッセイを行なった。１グループにつきｎ＝４マウス。データを平均値±標準偏差で示す。 マウス肝臓におけるｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰからのＳＥＡＰ発現の持続性。１０μｇのｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰまたはｐＣＦ１−ＳＥＡＰを含有するMirusデリバリー溶液（方法の欄参照）１．９ｍｌを、ベージュ／ＳＣＩＤマウスの尾の静脈に注射した。注射後１、１４、２８、および４２日目に採血し、血清中のＳＥＡＰ活性レベルを測定した。それぞれの線は個々のマウスを示す。 α−ガラクトシダーゼＡベクターのダイヤグラム。ＣＭＶｅｎｈはヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子エンハンサー領域（転写開始部位に対して−５２２から−２１９まで）；ＵｂはヒトユビキチンＢプロモーター；ＵｂイントロンはＵＢＢ遺伝子中の内在性イントロン；ＨＡＧＡはヒトα−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ；ＢＧＨ ｐＡはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ｏｒｉ−ｍｉｎは最小複製開始領域；Ｋａｎ−ｓｙｎは合成の非−ＣｐＧカナマイシン耐性遺伝子。ｐＧＺＡ−ＨＡＧＡは、ＣＭＶプロモーター全体がＣＭＶ−Ｕｂプロモーターの代わりに存在すること以外、同じである。 マウス肺におけるｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡおよびｐＧＺＡ−ＨＡＧＡからのα−ガラクトシダーゼＡ発現の持続性。Ａ）ｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡ、ｐＧＺＡ−ＨＡＧＡまたはｐＣＦＡ−ＨＡＧＡと複合体化されたカチオン性脂質ＧＬ−６７ ７５μｌ（０．６：３．６ｍＭ ＧＬ−６２：ｐＤＮＡ）をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内に滴下した。滴下後異なる日数において肺を集め、肺ホモジネート中のＣＡＴレベルを測定した。Ｂ）ｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡまたはｐＧＺＡ−ＨＡＧＡと複合体化されたカチオン性脂質ＧＬ−６２ １００μｌ（０．６：３．６ｍＭ ＧＬ−６２：ｐＤＮＡ）をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの尾の静脈に注射した。Ａ）およびＢ）の両方について、注射後異なる日数において肺を集め、α−ガラクトシダーゼＡレベルを測定した。１つのグループにつきｎ＝４マウス。データを平均値±標準偏差で示す。 ＣＭＶエンハンサー−ユビキチンＢプロモーターおよびイントロン領域の配列。ＣＭＶエンハンサー領域は転写開始部位に対して−５２２から−２１９まで伸長している。転写因子Ｓｐ１、ＣＲＥＢ／ＡＴＦおよびＮＦ Ｂの結合部位を示す。ＵｂＢプロモーター領域は翻訳ＡＴＧ開始部位に対して−１０９３から開始する。推定上のＴＡＴＡボックスを囲み、ｃａｐ部位の可能性のあるものを黒三角により示す。イントロン領域を小文字で示す。ＵｂＢイントロン中の２つのダイレクトリピートを上線により示す。

発明の詳細な説明
ユビキチンＢプロモーターがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子をドライブするＤＮＡベクターは、低レベルながら持続的な発現を引き起こす。ＣＭＶエンハンサーとユビキチンＢプロモーターが連結されてＣＡＴを発現するハイブリッドを構築した。結果は、ユビキチンＢプロモーター単独よりも有意に高いレベルの持続的発現であった。本発明のハイブリッドユビキチンプロモーターを用いる持続的発現は、肺および肝臓を包含する種々の組織において達成された。

好ましい具体例において、プロモーターがヒトユビキチンＡ、ユビキチンＢまたはユビキチンＣ遺伝子、あるいは他の種のユビキチン遺伝子から単離された発現ベクターを構築する。好ましいエンハンサーはヒトおよびネズミのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー（米国特許第５８４９５２２号；米国特許第５１６８０６２号参照）、伸長因子１−アルファエンハンサー、内皮特異的エンハンサーおよび肝臓特異的エンハンサー、ならびに特に肺における発現をサポートできる他の構成的または誘導可能なエンハンサーエレメントを包含する。

他の好ましい具体例において、プラスミドベクターは完全にあるいは部分的に免疫刺激性ＣｐＧ配列を欠失していてもよい。かかるＣｐＧ欠失プラスミドの製造方法および材料はＰＣＴ公開ＷＯ００／１４２６２に開示されており、その開示を参照により本明細書に一体化させる。

細胞にデリバリーされる好ましい治療遺伝子のうち好ましいものは、因子ＶＩＩａ（米国特許第４７８４９５０号）、因子ＶＩＩＩ（米国特許第４９６５１９９号、米国特許第４８６８１１２号（Ｂ−ドメイン欠失）、および米国特許第５６６１００８号）、および因子ＩＸ（米国特許第４９９４３７１号）を包含する造血因子である。他の好ましい導入遺伝子は、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病；米国特許第５８７９６８０号；米国特許第５２３６８３８号）、アルファ−ガラクトシダーゼ（ファブリー病；米国特許第５４０１６５０号）、酸性アルファ−グルコシダーゼ（ポムペ病；ＷＯ００／１２７４０）、アルファ−ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（シントラー病；米国特許第５３８２５２４号）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ニーマン−ピック病；米国特許第５６８６２４０号）、アルファ−イズロニダーゼ（ＷＯ９３１０２４４Ａ１）を包含するリソソーム貯蔵酵素をコードするものである。他の好ましい導入遺伝子は、のう胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、インスリンおよびアルファ−１−アンチトリプシンに関する遺伝子を包含する。上記刊行物の開示を参照により本明細書に一体化させる。

持続的な遺伝子発現は、遺伝子治療が考えられる多くの遺伝学的疾病ならびにインビトロにおける組換え蛋白発現に必要とされるであろう。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のごときウイルスプロモーターを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクターからの発現はしばしば一時的なものである。我々は、ユビキチンＢプロモーターから発現されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）受容体遺伝子を含有する発現ベクター（ｐＵＢＩ−ＣＡＴ）を構築し、マウス肺におけるそれらの発現持続性を評価した。カチオン性−ｐＤＮＡ複合体をＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内投与し、肺におけるＣＡＴレベルをアッセイした。ｐＵＢＩ−ＣＡＴからのＣＡＴ発現は初めは低かったが、その後増加して、３５日目にはＣＮＶプロモーターを用いたベクター（ｐＣＦ１−ＣＡＴ）からのレベルよりも４〜９倍高いレベルとなった。次いで、我々は、ＣＭＶエンハンサーをＵｂＢプロモーターの５’末端に付加した。このベクター（ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴ）からのＣＡＴ発現は２日目にはｐＣＦ１−ＣＡＴと同等であったが、５８日目にはｐＣＦ１−ＣＡＴからの発現よりも４０倍高くなった。以前の研究は、ｐＤＮＡベクター中の免疫刺激性ＣｐＧモチーフを除去することがそれらの毒性を低下させることを示すものであったので、我々は、ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴのＣｐＧ欠失バージョンも構築し、さらに我々は、ＣｐＧを欠失し、コドンを最適化したｃＤＮＡであってアルファ−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、および因子ＩＸをコードするものを合成し、ｐＣＵＢＩベクターに挿入した。持続性プロモーターとＣｐＧ減少のこの組合せは商業的な生存可能な遺伝子による遺伝子治療に必要な長い持続性と効率を提供することができる。

一定量の遺伝子治療ベクターからの持続的な治療的レベルの遺伝子産物は多くの疾病徴候に望ましいものである。我々は、ヒトユビキチンＢプロモーターを含むｐＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現が非常に安定なものであり得、いくつかの状況において実際に経時的に増大するというユニークな性質を有するものであることをここに示す。ヒトＣＭＶプロモーターの強力なエンハンサーエレメントをＵｂプロモーターに付加した場合、ＣＭＶ−Ｕｂハイブリッドプロモーターからのレポーター遺伝子発現は多く、肺において少なくとも３ヶ月持続した。治療導入遺伝子であるアルファ−ガラクトシダーゼＡの発現もまた、１ヶ月の研究期間中着実にレベルが増加しながら持続した。

エピソームｐＤＮＡからの長期にわたる導入遺伝子発現が維持されうるという知見は、持続的発現に対する主な制限因子がプロモーター活性であるという主張を支持する。核保持エレメント、複製開始点または真核トランスポゾンの使用のごとき細胞におけるｐＤＮＡの安定性を増大させるシステムは、実際に長期にわたる遺伝子発現を促進する（１，２，２７）。しかしながら、インプットｐＤＮＡの最初の大きな損失後に、極端に低いが検出可能なレベルのｐＤＮＡが組織中で数ヶ月にわたり安定に維持されることが示された（３，２８）。大部分の合成ベクターの標的細胞である肺上皮細胞または内皮細胞（カチオン性脂質−ｐＤＮＡに適する）、肝細胞、あるいは骨格筋は十分に分化したものであり、非常に低いターンオーバーを有する（２９）。我々の結果は、トランスダクションされた組織中に存在するｐＤＮＡの残存量が持続的な発現を引き起こすに十分に安定であることを示す。

ユビキチンプロモーターからの持続的転写活性に関する機構は不明であり、我々は、その活性が少なくとも一部には細胞中のユビキチンの正常な機能に関連していると推測できるだけである。ユビキチンは異常なまたはミスフォールディングされた蛋白の除去ならびに遺伝子活性化を引き起こすヒストンの修飾に構成的に必要とされ、それゆえ多くのウイルスプロモーターについて観察されるダウンレギュレーションに付される可能性はない（１２，１４）。またユビキチンは細胞ストレスに応答して誘導され、おそらくカチオン性脂質−ｐＤＮＡ複合体の投与に関連することが知られている細胞壊死およびアポトーシスに応答してアップレギュレーションされる可能性がある。そのことは経時的に発現増加が観察されることから説明できる（２５，３０）。他の可能性は、プロモーターが初期の時点において抑制されうること、あるいは経時的に転写因子がプロモーターに動員されることである。

Ｕｂプロモーター中の潜在的な転写因子結合部位の検索によりＣＥＢＰ／Ｂ、ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ−２、Ｓｐ１および他のものに関して可能性のある部位が見出されたが、このプロモーターに関連する実際の因子はさらなる分析が必要であろう。ＣＭＶ−Ｕｂハイブリッド中に使用されるＣＭＶエンハンサー領域は複数のＳｐ１、ＣＲＥＢおよびＮＦｋＢ部位を付加し、転写活性の有意な増加に貢献する（３１）。しかしながら、ＣＭＶとは異なり、ＣＭＶ−Ｕｂハイブリッドは経時的にダウンレギュレーションされない。ＣＭＶ−Ｕｂ中に使用されるＣＭＶエンハンサー配列は、細胞のＧｆｉレプレッサーのごときいくつかの既知のレプレッサー結合部位を回避するが、ＹＹ１に関する部位をやはり含んでおり、その部位はレプレッサーとして機能しうる（３２，３３）。Ｕｂプロモーターと伴わない単独のＣＭＶ配列もまたそれ自体持続的発現を引き起こさなかった（データ示さず）。とにかく、ハイブリッドプロモーターのＵｂ部分に関与する因子のアレイはＣＭＶの正常な不活性化に打ち勝って活性を維持したように思われる。

アルファ−ガラクトシダーゼＡを用いたここに示す結果は、プラスミド中のＣｐＧモチーフの除去が経時的にＣＭＶの不活性化にも影響することを示唆する。未修飾ＣＭＶプロモーターを含むがＣｐＧ減少骨格を含むｐＧＺＡ−ＨＡＧＡベクターは、ＩＮデリバリー後においてその非−ＣｐＧ減少カウンターパートよりも有意に持続的であった（図７Ａ）。そのベクターはＩＶデリバリー後にはあまり持続的でなかったが、発現減少は非−ＣｐＧベクターにおいて通常観察されるよりもずっと少なかった。この効果に存する機構は不明であるが、免疫刺激性ＣｐＧモチーフは、カチオン性脂質−ｐＤＮＡ複合体に関連した炎症応答において主な役割を果たし、結果的にｐＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現を抑制することが示されている（３４，３５）。発現の損失は、プロモーター活性の直接的抑制によりあるいは免疫刺激性ＣｐＧモチーフに対するＣＴＬ応答によるトランスフェクション細胞の除去（３６）により引き起こされた可能性がある。よって、免疫刺激性ＣｐＧモチーフの含量を減少させ、本質的により持続性のあるＣＭＶ−Ｕｂプロモーターを含ませることによりこの負の効果を減じることにより、両方の正の因子の混成物である発現プロファイルが期待でき、データがこの推測を支持すると思われる。

これらのベクターの改善された品質にもかかわらず、ＩＶまたはＩＮデリバリー後に達成されうるアルファ−ガラクトシダーゼＡのレベルはやはり治療に必要なレベルよりも低かった（２３）。この問題に対する１の進行中のアプローチは、現在のカチオン性脂質−ｐＤＮＡよりも能力のある遺伝子導入ビヒクルを開発することである。しかしながら、アルファ−ガラクトシダーゼＡの持続的かつ着実に増加するレベルが観察されたので（図７）、ベクターの複数回の再投与により全体としてレベルが上昇する可能性がある。繰り返し投与は１回投与により達成されうる発現レベルよりも有意に高い発現レベルを達成するであろうと予想される。この可能性につき現在検討中である。

ＣＭＶ−ユビキチンハイブリッドプロモーターは、持続的な遺伝子発現を必要とするインビトロまたはインビボでの適用に有用であろう。遺伝子治療の観点から、適用される疾病としてはのう胞性線維症およびアルファ−１−アンチトリプシン欠損症のごとき肺疾患ならびに血友病、尿素サイクル疾患、家族性高コレステロール血症、フェニルケトン尿症およびリソソーム貯蔵疾患の家族のような先天性遺伝疾患等が挙げられる。特定の疾病には、肺または肝臓は血流中への蛋白の分泌のための貯蔵器官として潜在的に役立つ可能性がある。このような場合に必然的に、血中において十分な治療レベルを達成し、そして標的器官によって取り込まれるためにはかなり持続した発現を必要とする。ＣＭＶ−ユビキチンハイブリッドプロモーターはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター）であるという観点からも、そして筋肉または脳のごとき他の組織中においても有用なものである。合成遺伝子デリバリーベクターに着手することに対しては依然として重大な制限因子があるが、ＣＭＶ−ユビキチンハイブリッドプロモーターからの持続的な遺伝子発現を生じさせる能力は実際的かつ有効な遺伝子治療に重要な構成要素を提供するであろう。

培養されたヒト気道上皮細胞におけるユビキチンプロモーターからの導入遺伝子発現
これらの研究に使用したｐＤＮＡベクターを図１に示す。ｐＵＢ−ＳＥＡＰプラスミドは、ヒトユビキチンＢ（Ｕｂ）プロモーターの転写制御下にある分泌形態のヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ｃＤＮＡを含み、Ｕｂプロモーター配列のすぐ下流にイントロン（アデノウイルスおよびマウス免疫グロブリン遺伝子イントロンのハイブリッド）を含む。プラスミドｐＵＢＩ−ＳＥＡＰは、それがハイブリッドイントロンのかわりにユビキチンＢイントロンを含むこと以外はｐＵＢ−ＳＥＡＰと同じである。対照プラスミドｐＣＦ１−ＳＥＡＰはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期エンハンサーおよびプロモーター配列を含む。

我々は、肺の徴候に関してウイルスにより媒介されない遺伝子デリバリーに興味があったので、まず肺上皮細胞におけるＵｂプロモーターからの発現を測定した。ＣＦヒト気道上皮細胞系であるＣＦＴ１細胞をｐＵＢ−ＳＥＡＰ、ｐＵＢＩ−ＳＥＡＰ、またはｐＣＦ１−ＳＥＡＰでトランスフェクションし、２日後に培地中のＳＥＡＰレベルをアッセイした（図２Ａ）。ｐＵＢ−ＳＥＡＰからの発現は、ＣＭＶプロモーターを含むｐＣＦ１−ＳＥＡＰからの発現よりもずっと低かった。ｐＵＢＩ−ＳＥＡＰからの発現もまたｐＣＦ１−ＳＥＡＰからの発現よりも低かったが、ｐＵＢ−ＳＥＡＰと比較すると約５倍高く、ユビキチン遺伝子それ自身のイントロンを用いた発現の有益な効果が示された。ヒト気管支上皮細胞であるＢＥＡＳ細胞中にも構築物を導入し、ＳＥＡＰ発現を６日間測定した（図２Ｂ）。ＣＦＴ１細胞において観察されたように、トランスフェクション２日目におけるｐＣＦ１−ＳＥＡＰからのＳＥＡＰ発現はｐＵＢ−ＳＥＡＰまたはｐＵＢＩ−ＳＥＡＰからの発現よりも有意に高かった。しかしながら、トランスフェクション６日目までにはｐＣＦ１−ＳＥＡＰからの発現は著しく低下し、一方でｐＵＢＩ−ＳＥＡＰからの発現はさらに一定となった。各ウェルの細胞数および集密性は同等であり、ｐＵＢＩ−ＳＥＡＰを導入された細胞と比較してｐＣＦ１−ＳＥＡＰでトランスフェクションされた細胞における毒性増加は明らかでなかった。これらのインビトロでの結果は、ＣＭＶプロモーターを含むベクターと比較した場合に、ユビキチンプロモーターを担持するｐＤＮＡベクターは低いがより安定した導入遺伝子発現を提供したことを示唆するものであった。

マウス肺におけるｐＵＢＩ−ＣＡＴからの導入遺伝子発現の持続性
上で観察されたプロファイルがインビボにおいても実現されるかどうかを調べるために、我々は、マウス肺におけるｐＵＢＩ−ＣＡＴからのＣＡＴ発現のレベルおよび期間を測定した。ＣＭＶプロモーターを含むプラスミドｐＣＦ１−ＣＡＴと発現プロファイルを比較した。ｐＤＮＡをカチオン性脂質ＧＬ−６７と複合体化させ、次いで、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内に滴下した。免疫欠損マウスを用いて、プロモーター持続性をアッセイする際のEscherichia coliのｐＣＡＴ酵素に対する免疫応答の厄介さを回避した。すでに観察されている結果（２４）と矛盾せずに、滴下後２日目においてｐＣＦ１−ＣＡＴからの発現は初めは高かったが、その後最初の２１日のうちに１００倍低下した（図３Ａ）。対照的に、２日目にはｐＵＢＩ−ＣＡＴからの発現は非常に低かったが、その後経時的に着実に増加し、３５日目までにこの時点におけるｐＣＦ１−ＣＡＴからのＣＡＴレベルよりも約８〜１０倍高くなった。ｐＵＢＩ−ＣＡＴベクターを静脈注射した場合、ＣＡＴ発現はやはり最初な極端に低く、注射１日後にはほとんど検出不可能レベルであった（図３Ｂ）。しかしながら、３５日までに発現は２ｌｏｇ倍増加し、この時点においてｐＣＦ１−ＣＡＴからのＣＡＴレベルよりも３〜４倍高かった。それゆえ、導入遺伝子がユビキチンプロモーターの制御下にある場合にはインビボにおいて肺上皮細胞および内皮細胞の両方において非常に持続性のある導入遺伝子発現が達成された。

マウス肺におけるｐＣＵＢＩ−ＣＡＴからの導入遺伝子発現の持続性
有意に延長されたけれども、ｐＵＢＩ−ＣＡＴからの導入遺伝子発現レベルは実用的なものとしては低すぎるようである。導入遺伝子発現の絶対的なレベルを上昇させるために、我々は、ヒトＣＭＶエンハンサーの一部分をユビキチンＢプロモーター配列の５’側に隣接して付加してｐＣＵＢＩ−ＣＡＴを得た（図１）。インビボでの研究用に、カチオン性脂質−ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴ複合体をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに滴下し、肺におけるＣＡＴ発現レベルを８４日目まで測定した（図４Ａ）。ｐＣＦ１−ＣＡＴよりも低かったが、ＣＭＶエンハンサーを欠くｐＵＢＩ−ＣＡＴと比較した場合、ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴからのＣＡＴ初期の発現は有意に増加した（約２ｌｏｇ倍）（図３参照）。すでに観察されているように、ｐＣＦ１−ＣＡＴからのＣＡＴ発現は最初の２〜３週間で急激に低下し、８４日目には残存ＣＡＴ発現は無視できるものであった。対照的に、ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴからのＣＡＴ発現はこの期間中ほとんど一定であり、８４日目において２日目のＣＡＴレベルの約５０％を維持していた。マウスのグループに２回目のｐＣＵＢＩ−ＣＡＴを与えて、再投与により発現レベルが改善されうるかどうかを調べた（図４Ｂ）。２６日目に２回目の投与を受けたマウスからの２８日目におけるＣＡＴ発現は、１回投与されたマウスよりも約２倍上回っており、この違いは８４日目まで続いた。８４日目における再投与されたマウスからのＣＡＴレベルは２日目のレベルのほぼ１００％であった。これらの結果は、ＣＭＶ−Ｕｂハイブリッドプロモーターは豊富で本質的に減少しない発現を少なくとも１２週間にわたり提供することができ、再投与により増加した高レベルの持続した発現が提供されうることを示すものである。

マウス肝臓におけるｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰからの持続的な導入遺伝子発現
肝臓は、ウイルス遺伝子および合成遺伝子両方のデリバリーベクターのためのもう１つの主要標的器官である。肝臓におけるＣＭＶ−ユビキチンハイブリッドプロモーターの発現プロファイルを調べるために、有効に肝細胞をトラスダクションするプロトコル（方法の欄参照）を用いてｐＤＮＡをデリバリーした。１０μｇのｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰまたはｐＣＦ１−ＳＥＡＰをベージュ／ＳＣＩＤマウスの尾の静脈に注射し、注射後１、１４、２８、および４２日目に血清中に分泌されたＳＥＡＰレベルを測定した（図５）。ｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰおよびｐＣＦ１−ＳＥＡＰの両方からの血清中の最初のＳＥＡＰレベルは極端に高かった（１日目において１ｍｇ／ｍｌよりも高かった）。肺において見られたように、ｐＣＦ１−ＳＥＡＰからの発現は最初の２週間のうちに急激に低下し、４２日目には低レベルとなった。ｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰからの発現はずっとゆっくりと低下し、４２日目において有意なレベルのＳＥＡＰが残存していた。４２日目において肝臓におけるＳＥＡＰレベルもまた対応して高かった（１００ｍｇの組織あたり１１９８μｇ ＳＥＡＰ±２０８μｇ）。これらの結果は、ＣＭＶ−Ｕｂハイブリッドプロモーターが肺と同様に肝臓からも持続的な発現を提供できることを示す。

ＣｐＧ減少ＣＭＶ−ユビキチンプロモーターベクターからの導入遺伝子発現の持続性
我々および他の者は、ｐＤＮＡベクター中に存在する免疫刺激性ＣｐＧモチーフが、カチオン性脂質−ｐＤＮＡ複合体のＩＮまたはＩＶデリバリー後に急性炎症応答を誘発することにおいて主要な役割を果たしていることをすでに示している（２５，２６）。ｐＣＵＢＩベクターを全身使用により適したものにするために、我々は、ＣｐＧ減少ベクターであるｐＧＺＣＵＢＩを構築した。該ベクターは未修飾Ｕｂプロモーターおよびイントロンを含むが、カナマイシン耐性を付与する合成非−ＣｐＧ遺伝子から構成されるＣｐＧ減少骨格および最小の複製開始点を含む。このベクター中に、我々はヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡ（ＨＡＧＡ）をコードするｃＤＮＡを挿入した（図６）。ｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡベクターは３０６位にＣｐＧモチーフ（ｐＤＮＡの両方の鎖を数える）を含み、２９２位にＣｐＧモチーフを含む、ＣＭＶプロモーターからアルファ−ガラクトシダーゼＡを発現させるＣｐＧ減少ベクターであるｐＧＺＡ−ＨＡＧＡに匹敵する。対照的に、非−ＣｐＧ減少ＣＭＶプロモーターベクターｐＣＦＡ−ＨＡＧＡは４８２位にＣｐＧモチーフを含む。ｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡ、ｐＧＺＡ−ＨＡＧＡ、またはｐＣＦＡ−ＨＡＧＡのいずれかを含む複合体をヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内滴下（ＩＮ）または静脈注射（ＩＶ）し、肺におけるアルファ−ガラクトシダーゼＡ発現レベルを経時的に測定した（図７）。ＩＮデリバリー後、ｐＣＦＡ−ＨＡＧＡからのアルファ−ガラクトシダーゼＡ発現は急激に減少し、ｐＣＦ１−ＣＡＴからのＣＡＴ発現に関してすでに観察されたのと同様であった（図７Ａ）。しかしながら、ＣｐＧ減少ｐＧＺＡ−ＨＡＧＡからの発現は有意により持続的であり、３５日目までレベルが低下しなかった。ｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡからのアルファ−ガラクトシダーゼＡ発現は滴下後２日目においてｐＧＺＡ−ＨＡＧＡおよびｐＣＦＡ−ＨＡＧＡの両方と同等であったが、その後経時的に着実に増加し、３５日目には発現が２日目の初期レベルの１０倍となった（図７Ａ）。

ＩＶデリバリー後、ｐＧＺＡ−ＨＡＧＡからのアルファ−ガラクトシダーゼＡ発現は２１日目まで低下し、その後、３５日目にわずかに回復した（図７Ｂ）。ｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡからの発現は、初めはｐＧＺＡ−ＨＡＧＡからの発現よりも低かったが、３５日目までの期間中経時的に着実に増加した。まとめて考えると、これらの結果は、ＣＭＶ−Ｕｂプロモーターは持続的なアルファ−ガラクトシダーゼＡ発現を提供し、ｐＤＮＡのＣｐＧ含量を減少させるだけでもアルファ−ガラクトシダーゼＡ発現の維持が改善されることを示すものであった。非−ＣｐＧ減少ベクターｐＣＵＢＩ−ＣＡＴおよびｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰに関して示されたように（図４および図５）、ＣｐＧ減少はＣＭＶ−Ｕｂプロモーターからの持続的発現に必要ではなかった。しかしながら、ＣｐＧ減少およびＣＭＶ−Ｕｂプロモーターの両方がベクターに導入された場合、ＩＮおよびＩＶ両方のデリバリーで３５日目においてアルファ−ガラクトシダーゼＡレベルが持続していただけでなく、初発レベルよりも有意に高かった。

材料および方法
プラスミドベクター構築物
分泌形態のヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するｐＵＢ−ＳＥＡＰを構築するために、Ｐｆｕポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてヒトユビキチンＢプロモーター（１７）をヒトゲノムＤＮＡ（Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA）から増幅した。増幅された配列はＡＴＧ開始コドンのＡ残基に対してヌクレオチド−１０９３から−７４１までに対応していた。ｐＣＦ１−ＳＥＡＰ中のＣＭＶプロモーター（８）をＰｍｅＩおよびＸｂａＩで切り出し、ＵＢＢプロモーターを含むＰＣＲ生成物に置き換えてｐＵＢ−ＳＥＡＰを得た。ｐＵＢＩ−ＳＥＡＰを構築するために、上記のごとくＰＣＲによりヒトＵＢＢプロモーターおよびイントロンを増幅し、次いで、ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ（Tropix, Bedford, MA）中に挿入し、ユビキチンＡＴＧコドンのかわりにＳＥＡＰの翻訳開始ＡＴＧが来るようにした。ＵＢＢプロモーター−イントロン−ＳＥＡＰフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで末端切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化させ、次いで、ｐＣＦＡ（８）の平滑末端化されたＰｍｅＩおよびＮｏｔＩ部位中に挿入してｐＵＢＩ−ＳＥＡＰを得た。ｐＵＢＩ−ＳＥＡＰと同様のやり方でＵＢＢプロモーターおよびイントロンをＣＡＴの上流に挿入してｐＵＢＩ−ＣＡＴを構築した。

ｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰを構築するために、ＭｆｅＩを用いてｐＵＢＩ−ＳＥＡＰを直鎖状にし、次いで、平滑末端化させた。ｐＣＦＡをＳｐｈＩおよびＮｃｏＩで消化し、平滑末端化させ、次いで、３００ｂｐのＣＭＶエンハンサーフラグメントを精製した。そのＣＭＶエンハンサーフラグメントをｐＵＢＩ−ＳＥＡＰのＭｆｅＩ部位に連結してｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰを得た。ｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰ／ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴのエンハンサー／プロモーター／イントロンの配列を図８に示す。ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴを構築するために、ｐＣＵＢＩ−ＳＥＡＰをＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化し、３．２ｋｂのベクター骨格フラグメントを単離した。ｐＵＢＩ−ＣＡＴをＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化し、ＵＢＢイントロン−ＣＡＴ ｃＤＮＡ−ＢＧＨポリＡを含む１．７ｋｂのフラグメントを単離し、次いで、該３．２ｋｂのフラグメントに連結してｐＣＵＢＩ−ＣＡＴを得た。

ヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡ（ＨＡＧＡ）を発現するｐＣＦＡ−ＨＡＧＡを構築するために、ｐＣＦＡをＮｏｔＩで消化し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化させた。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡ ｃＤＮＡをｐＧＢ８３（G. Barsomian博士から親切にも頂いた）から切り出し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化させ、次いで、ｐＣＦＡの平滑末端化ＮｏｔＩ部位中に連結してｐＣＦＡ−ＨＡＧＡを得た。ＣｐＧ減少ベクターｐＧＺＡ−ＨＡＧＡを構築するために、ｐＧＺＡ−ｓＣＡＴ（以前はｐＧＺＡ−ＣＡＴと称した）（３５）をＮｏｔＩで消化し（ｓＣＡＴ ｃＤＮＡを除去するために）、平滑末端化させ、次いで、ベクター骨格を精製した。このベクター骨格は合成非−ＣｐＧカナマイシン耐性遺伝子および最小複製開始点（３５）を含む。次いで、ｐＧＢ８３からの平滑末端化されたヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡ ｃＤＮＡフラグメント（上記参照）をｐＧＺＡの平滑末端化ＮｏｔＩ部位中に連結してｐＧＺＡ−ＨＡＧＡを得た。

ＣｐＧ減少ベクターｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡを構築するために、ＣＭＶエンハンサー−ＵＢＢプロモーター−ＵＢＢイントロン領域を、ＰＣＲ生成物が５’末端にＭｆｅＩ部位および３’末端にＮｏｔＩ部位を含むことになるＰＣＲプライマーを用いて、ｐＣＵＢＩ−ＣＡＴからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成物をシャトルベクター中にクローン化し、次いで、ＭｆｅＩおよびＮｏｔＩで切り出した。ｐＧＺＡ−ｓＣＡＴをＭｆｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＭＣＶプロモーター−イントロン−ｓＣＡＴ ｃＤＮＡを除去し、次いで、ＰＣＲ生成物を連結してｐＧＺＣＵＢＩを得た。次いで、ｐＧＢ８３からの平滑末端化されたヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡ ｃＤＮＡフラグメント（上記参照）をｐＧＺＣＵＢＩの平滑末端化ＮｏｔＩ部位中に連結してｐＧＺＣＵＢＩ−ＨＡＧＡを得た。

カチオン性脂質およびプラスミドＤＮＡ
カチオン性脂質ＧＬ−６７（Ｎ^４−スペルミンコレステリルカルバメート）およびＧＬ−６２（Ｎ^１−スペルミンコレステリルカルバメート）はすでに記載されている（２４）。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤｐｈＰＥ）、および平均分子量５０００ダルトンのポリエチレングリコールに共有結合したジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ_５０００）をAvanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL)から購入した。記載されたように（２４）、ＧＬ−６７をＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ_５０００（１：２：０．０５ モル：モル）として処方し、ＧＬ−６２をＧＬ−６２：ＤＰｈＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ_５０００（１：１：０．０５ モル：モル）として処方した。

アルカリ分解、限外濾過およびカラムクロマトグラフィーによりプラスミドＤＮＡを精製した（２４）。カブトガニ血球溶解物発色アッセイ（Bio Whitaker, Walkersville）により調べたところ、これらの研究に使用した精製ｐＤＮＡはｐＤＮＡ １ｍｇあたり１０μｇ未満のE. Coli染色体ＤＮＡならびにｐＤＮＡ１ｍｇあたり１０エンドトキシン単位未満を含有していた。

インビトロトランスフェクション
のう胞性線維症患者由来の不死化ヒト気管上皮細胞系ＦＣＴ１細胞をJames Yankaskas博士より親切にも提供された（３７）。ヒト気管支上皮細胞系ＢＥＡＳ細胞をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA)から得た。細胞をウェル１個あたり２ｘ１０^５個の密度で２４ウェル組織培養プレートに撒いた。０．５ｍｌのカチオン性脂質ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ（１０．５：３０μＭ）複合体を各ウェルに添加した。トランスフェクションから５時間後に複合体を除去し、新鮮培地と交換した。４８時間後に細胞培地中のＳＥＡＰレベルを測定した。各ｐＤＮＡベクターにつき４つのウェルをトランスフェクションした。

カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体および裸のｐＤＮＡのマウス中への投与
肺内デリバリーのために、すでに記載（２４）されているようにしてＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに７５μｌのカチオン性脂質ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ（０．６：３．６ｍＭ）を鼻腔内滴下した。全身投与には、１００μｌのカチオン性脂質ＧＬ−６２：ｐＤＮＡ（０．７５：０．７５ｍＭまたは１：１ ｍＭ）をマウスの尾の静脈に注射した。肝臓へのｐＤＮＡのデリバリーには、Zhang et alにより記載された迅速大容積プロトコル（３８）を用いて尾の静脈に注射した。簡単に説明すると、１０μｇのプラスミドＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を１：１（ｖ：ｗ）の割合のTrans IT In Vivoポリマー溶液（Mirus Corporation）と混合し、水で体積を２００μｌとし、２〜４秒ボルテックスし、次いで、室温で５分間インキュベーションした。その後、溶液をMirus Delivery Solution中約２ｍｌにまで希釈し、次いで、６〜８秒かけて尾の静脈に注射した。この手順を用いると、ｐＤＮＡは主に肝細胞により取り込まれることが示されている（３８，３９）。注射後１４、２８および４２日目に、マウスを麻酔し、眼窩の後ろから採血した。その後、血清を−８０℃で保存した。

酵素活性
記載されたようにして（８）蛍光酵素活性アッセイを用いて、組織培養細胞の培地中に分泌されたＳＥＡＰレベルを測定した。比色アッセイを用いてマウス血清中のＳＥＡＰレベルをアッセイした。血清をリン酸緩衝化セイライン中１：２００にまで希釈し、次いで、６５℃で２０分加熱して不活性化させた。アルカリ性ホスファターゼ試薬（１５０μｌ）（Sigma Diagnostics, St. Louis, MO）を５０μｌの希釈試料（９６ウェルプレート中）に添加し、室温で１０分インキュベーションし、次いで、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ（Calbiochem, San Diego, CA）を標準として用いた。記載されたようにして（２４）、肺ホモジネートからのＣＡＴ酵素活性を測定した。記載されたようにして（２３）、アルファ−ガラクトシダーゼＡに対するポリクローナル抗体を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により肺中のアルファ−ガラクトシダーゼＡレベルを定量した。この抗体はヒトのアルファ−ガラクトシダーゼＡを特異的に認識し、マウスのアルファ−ガラクトシダーゼＡを認識しない。

上記実施例は非限定的であり、説明のみを目的とする。当業者は、本明細書中の開示を読めば、多くの修飾、付加および改良が可能であることを容易に理解するであろう。かかる修飾、付加および改良は本発明の一部である。本明細書中で引用した各刊行物の開示を、それらに含まれる教示を参照することにより本明細書にあるものとする。

Claims (7)

1. 治療遺伝子をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、ヒトユビキチンＢから単離されたユビキチンプロモーターの５’末端に連結されたＣＭＶエンハンサー、およびユビキチンプロモーターの下流にユビキチンＢイントロンを含む組換え発現ベクター。
2. 発現ベクターが、ネイティブな配列に存在する少なくとも１のＣｐＧ配列をなくすように変化させられているものである請求項１に記載の組換え発現ベクター。
3. 治療遺伝子が因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸからなる群より選択されるものである請求項１または２に記載の組換え発現ベクター。
4. 治療遺伝子がグルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、酸性アルファ−グルコシダーゼ、アルファ−ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼおよびアルファ−イズロニダーゼからなる群より選択されるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え発現ベクター。
5. 治療遺伝子がＣＦＴＲ、ジストロフィンおよびアルファ−１−アンチトリプシンからなる群より選択されるものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え発現ベクター。
6. アルファ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたヒトユビキチンＢから単離されたプロモーターの５’末端に連結されたＣＭＶエンハンサー、およびプロモーターの下流にユビキチンＢイントロンを含む組換え発現ベクター。
7. グルコセレブロシダーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたヒトユビキチンＢから単離されたプロモーターの５’末端に連結されたＣＭＶエンハンサー、およびプロモーターの下流にユビキチンＢイントロンを含む組換え発現ベクター。

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