JP6239592B2 - Ｔｅｔｒａｇａｌｎａｃを含む新規なコンジュゲートと、オリゴヌクレオチドの送達方法 - Google Patents

Description

治療を目的としたオリゴヌクレオチドの全身送達に着目した科学的取り組みが進行している。オリゴヌクレオチド送達に注目した３つのアプローチとして、１）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）への封入、２）ポリマーコンジュゲーションおよび３）単一の化学的コンジュゲーションが挙げられる。単一の化学的コンジュゲーションは典型的には、標的化リガンドまたは脂質または可溶化基またはエンドソーム溶解ペプチドもしくは細胞膜透過ペプチド、および／または、オリゴヌクレオチドに結合したこれらの２つまたは４つすべての組み合わせを利用する。リンカーは、コンジュゲートのほか、他の官能基に存在してもよい。単一の化学的コンジュゲートは公知であり、オリゴヌクレオチドの結合は、オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端、両末端あるいは内部で起こる。国際公開第２００５／０４１８５９号パンフレット、国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレットおよび国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットを参照されたい。

かなりの量の文献的証拠から、オリゴヌクレオチド送達の主な障害が細胞取り込みおよびエンドソーム脱出であることという仮説が裏付けられている。送達効率、細胞取り込みおよび／またはエンドソーム脱出を効果的に行うことができる新たな単一の化学的コンジュゲートが依然として求められている。

本明細書に開示されたｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む単一の化学的コンジュゲートは、送達効率、細胞取り込みおよび／またはエンドソーム脱出の促進という驚くべき特性を有する。

一実施形態では、本明細書に開示されたモジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、下記式（Ｉ）の１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：

（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ^１Ｒ^２−または−ＮＲ^１−であり、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは１、２、３または４であり；かつ

による結合は結合点を示す）；任意に、３）同一でもあるいは異なっていてもよい１個または複数個のリンカー；および任意に、４）１個または複数個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。一実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に水素、メチルおよびエチルからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は各々水素である。

一実施形態では、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩ）を有し、式中、Ｘ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｎは、上記で定義した通りである。別の実施形態では、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｘ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｎは、上記で定義した通りである。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ_２−または−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜２４個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ_２−または−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。

上記の実施形態の１つのサブセットでは、リンカーは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡに結合しており；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のＸは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ_２−であり；ｎは１、２または３である。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のＸは−Ｏ−または−ＣＨ_２−であり、ｎは１または２である。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のＸは−Ｏ−であり、ｎは１または２である。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のＸは−ＣＨ_２−であり、ｎは１または２である。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、組成物は、同一でもあるいは異なっていてもよい１〜６個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド、またはより具体的には１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖にリボース環の異なる２’位で結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に異なる３’位末端および／または５’位末端で結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ２個以上のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方にリボース環の異なる２’位、ならびに／または、異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、リンカーは各々独立に表１から選択される。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、リンカーは各々独立に表２から選択される。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤は、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖に結合している。

一実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）下記式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：

３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜１６個のリンカー；および、任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜８個のリンカー；および、任意に、４）１〜４個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡの同じ鎖に結合している。

一実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）式（Ｖ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表２から独立に選択される１〜８個のリンカー；および、任意に、４）１〜４個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡの同じ鎖に結合している。

本明細書に開示されるのは、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；および同一でもあるいは異なっていてもよい、下記式（Ｉ）の１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：

（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ^１Ｒ^２−または−ＮＲ^１−であり、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは１、２、３または４であり；かつ

による結合は結合点を示す）を含む単一の化学的コンジュゲートである。他の官能基、たとえば標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤が任意に存在する。一実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に水素、メチルおよびエチルからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は各々水素である。

一実施形態では、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩ）を有し、式中、Ｘ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｎは、上記で定義した通りである。別の実施形態では、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｘ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｎは、上記で定義した通りである。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは一本鎖ｓｉＲＮＡである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは二本鎖ｓｉＲＮＡである。

本明細書に開示されたｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃを使用すると、モジュール組成物を特定の細胞に誘導することによりオリゴヌレオチドまたはｓｉＲＮＡが効果的に送達され得る。たとえば、標的化リガンドは、標的細胞の表面上の分子と特異的または非特異的に結合し、リガンド−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの取り込みを促進することができる。

リンカーは、各ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃとオリゴヌクレオチドとの間に存在してもよい。リンカーは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドの３’位末端および／もしくは５’位末端でオリゴヌクレオチドに結合している。

一実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）の１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ_２−または−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４であり；かつ

による結合は結合点を示す）；任意に、３）同一でもあるいは異なっていてもよい１個または複数個のリンカー；および任意に、４）１個または複数個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ_２−または−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ_２−または−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。

上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。一実施形態では、リンカーが存在する。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡに結合しており；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合しており、リンカーは、リボース環の異なる２’位でオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合しており、リンカーは、オリゴヌクレオチドの異なる３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ_２−である。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ_２−である。別の実施形態では、ｎは１、２または３である。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−であり、ｎは１または２である。別の実施形態では、Ｘは−ＣＨ_２−であり、ｎは１または２である。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−であり、ｎは１である。なお別の実施形態では、Ｘは−ＣＨ_２−であり、ｎは１である。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは一本鎖である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖である。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、組成物は１〜６個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む。別の実施形態では、組成物は１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む。別の実施形態では、組成物は１〜２個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む。なお別の実施形態では、組成物は１個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位でガイド鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、異なる３’位末端および／または５’位末端でガイド鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位でパッセンジャー鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、異なる３’位末端および／または５’位末端でパッセンジャー鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは同じ鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは異なる鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤は、同じ鎖または異なる鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖であり、任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤は、リンカーを介して同じ鎖または異なる鎖に結合している。一実施形態では、リンカーは各々独立に選択される表１である。別の実施形態では、リンカーは各々独立に選択される表２である。

一実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ_２−または−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。一実施形態では、リンカーが存在する。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ_２−であり、ｎは１、２または３である。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ_２−であり、ｎは１または２である。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）の１〜６個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ_２−であり；ｎは１、２または３である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１８個のリンカー；および任意に、４）１〜６個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。一実施形態では、リンカーが存在する。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ_２−であり、ｎは１または２である。別の実施形態では、リンカーは表１から独立に選択される。別の実施形態では、リンカーは表２から独立に選択される。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ_２−であり；かつ、ｎは１または２である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜８個のリンカー；および任意に、４）１〜４個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。一実施形態では、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ_２−であり、ｎは１または２である。別の実施形態では、リンカーは表１から独立に選択される。別の実施形態では、リンカーは表２から独立に選択される。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）下記式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：

３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜８個のリンカー；および任意に、４）１〜４個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。

別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）式（Ｖ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表２から独立に選択される１〜８個のリンカー；および任意に、４）１〜４個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。

上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは同じ鎖に結合している。

上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは異なる鎖に結合している。

カートゥーン（ｃａｒｔｏｏｎ）により本発明を説明するには、本発明は、オリゴヌクレオチド（［Ｏ_１］［Ｏ_２］［Ｏ_３］．．．．．．［Ｏ_ｎ］）と、１個または複数個のリンカー（Ｌ）と、１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（Ｇ）と、１つまたは複数の任意選択の脂質（Ｘ）、標的化リガンド（Ｘ）および／または可溶化基（Ｘ）とを含むモジュール組成物を特徴とする。

一実施形態では、モジュール組成物は下記式を有し得る。
Ｇ−Ｌ−［Ｏ_１］［Ｏ_２］［Ｏ_３］．．．．．．［Ｏ_ｎ］

別の実施形態では、モジュール組成物は下記式を有し得る。
Ｇ−Ｌ−［Ｏ_１］［Ｏ_２］［Ｏ_３］．．．．．．［Ｏ_ｎ］−Ｘ

末端コンジュゲーションを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含むモジュール組成物の非限定的な例として、下記がある。

内部コンジュゲーションを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含むモジュール組成物の非限定的な例には、下記がある。

これらの例は、説明としてのみ使用する。当業者であれば、所望の要素をパッセンジャー鎖およびガイド鎖に配置するのに種々の並べ替えが存在することを理解するであろう。

オリゴヌクレオチドには、何個のリンカーが、したがって何個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドが結合していてもよい。好ましいリンカー数の範囲は１〜１６である。より好ましいリンカー数の範囲は１〜８、あるいはより詳細には１〜４である。好ましいｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド数の範囲は、１〜８である。より好ましいペプチド数の範囲は１〜８、あるいはより具体的には１〜４である。

２本の鎖は、それぞれｎヌクレオチドおよびｎ’ヌクレオチドを含む。ｎおよびｎ’の数は、同一でもあるいは異なっていてもよい。その数は８〜５０の範囲の整数である。好ましくは、その数は１２〜２８の範囲の整数である。一層好ましくは、その数は１９〜２１の範囲の整数である。

一例を挙げると、リンカー（Ｌ−Ｇおよび／またはＬ−Ｘ）を含むヌクレオチド［Ｏ_ｎ］または［Ｏ_ｎ’］は各々、以下のカートゥーン（ｃａｒｔｏｏｎ）に示した一般的な構造を有する。

各ヌクレオチドでは、１）Ｅ＝酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）；２）修飾されていてもあるいは修飾されていなくもよい塩基＝Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ；３）Ｄはリボース環とリンカーＬとの間の接合点であり、Ｄ＝酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ、Ｓ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）_２）、窒素（Ｎ−Ｒ、式中、Ｒ＝Ｈ、アルキル、Ｌ−ＰもしくはＬ−Ｘ）、炭素（ＣＨ−Ｒ、式中、Ｒ＝Ｈ、アルキル、Ｌ−ＰもしくはＬ−Ｘ））、またはリン（Ｐ（Ｏ）ＲまたはＰ（Ｏ）（ＯＲ）、式中、Ｒ＝アルキル、Ｌ−ＧもしくはＬ−Ｘ）である。好ましくは、Ｄ＝酸素（Ｏ）である。

２個のヌクレオチド［Ｏ_ｎ−１］および［Ｏ_ｎ］または［Ｏ_ｎ’−１］および［Ｏ_ｎ’］は、ホスホジエステル結合またはチオ−ホスホジエステル結合により連結されている。

オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とは、同じ鎖上に位置してもあるいは異なる鎖上に位置してもよい。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とは同じ鎖上にある。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とはパッセンジャー鎖上にある。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とはガイド鎖上にある。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とは異なる鎖上に位置する。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」はパッセンジャー鎖上にあるのに対し、脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基はガイド鎖上にある。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とは異なる鎖上にあるが、二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ末端上にある。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とは異なる鎖上にあり、かつ二本鎖オリゴヌクレオチドの逆末端上にある。

いくつかの実施形態では、上記の実施形態に示した脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基の代わりに同一または異なる性質の別の「Ｇ−Ｌ」を使用してもよい。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」はパッセンジャー鎖あるいはガイド鎖の複数の末端に位置していてもよく、脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基はパッセンジャー鎖およびガイド鎖の残りの末端に位置していてもよい。いくつかの実施形態では、１個の「Ｇ−Ｌ」と２個以上の脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とがオリゴヌクレオチドに存在する。

いくつかの実施形態では、２個以上の「Ｇ−Ｌ」と２個以上の脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とがオリゴヌクレオチドに存在する。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつ複数の「Ｇ−Ｌ」成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化基が存在する場合、そうした複数の「Ｇ−Ｌ」成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化基はすべて二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖に存在しても、あるいは両方の鎖に存在してもよい。

複数の「Ｇ−Ｌ」成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化基が存在する場合、それらはすべて同一でも、あるいは異なっていてもよい。

いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」は内部ヌクレオチド上のみ（すなわちオリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を除く）にある。

別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを細胞に送達する方法を含む。本方法は、（ａ）本明細書に開示されたモジュール組成物を用意または取得すること；（ｂ）細胞をモジュール組成物と接触させること；および（ｃ）モジュール組成物を細胞内に移行させることを含む。

本方法は、たとえばオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを必要とすると判定された被検体を処置するため、インビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができる。前記オリゴヌクレオチドを必要とする被検体は、遺伝子（単数または複数）、たとえば、障害に関連する遺伝子の発現をダウンレギュレートするまたはサイレンシングさせることを必要とする被検体、たとえば、ヒトである。

一態様では、本発明は、１個または複数個の遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、１つまたは複数の細胞を本発明の有効量のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、有効量は、１個または複数個の遺伝子の発現を抑制する量である。この方法は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができる。

本発明の方法および組成物、たとえば、本明細書に記載のモジュール組成物は、当該技術分野において公知のどのようなオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡと共に使用してもよい。さらに、本発明の方法および組成物は、当該技術分野において公知のどのような疾患または障害の処置、どのような被検体、たとえば任意の動物、任意の哺乳動物、たとえば任意のヒトの処置に使用してもよい。さらに当業者であれば、本発明の方法および組成物は、遺伝子（単数または複数）のダウンレギュレーションまたはサイレンシングから恩恵を受けると考えられる任意の疾患の処置に使用することができることも認識するであろう。

本発明の方法および組成物、たとえば、本明細書に記載のモジュール組成物は、本明細書に記載のどのような用量および／もしくは製剤、あるいは当該技術分野において公知のどのような用量または製剤で使用してもよい。当業者であればさらに、本明細書に記載の投与経路に加えて他の投与経路を使用して本発明のモジュール組成物を投与してもよいことも理解するであろう。

オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、二本鎖または一本鎖での非修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾ＲＮＡの例には、非修飾ＲＮＡよりヌクレアーゼ分解に対して抵抗性が高いものがある。さらなる例として、２’糖修飾、塩基修飾、一本鎖オーバーハング、たとえば３’一本鎖オーバーハングの修飾、または、特に一本鎖の場合、１つまたは複数のリン酸基または１つまたは複数のリン酸基のアナログを含む５’修飾を有するものが挙げられる。オリゴヌクレオチドの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンス、ｍｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリ−モルホリノ（ＰＭＯ）またはｓｉＲＮＡである。好ましいオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。別の好ましいオリゴヌレオチドはｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖である。別の好ましいオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのガイド鎖である。

ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスによりｍＲＮＡの配列特異的サイレンシングを誘導する。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む多種多様な生物で起こる。ｓｉＲＮＡを調製および投与するための方法、ならびに遺伝子機能を特異的に不活性化するためのその使用は、公知である。ｓｉＲＮＡは、修飾および非修飾ｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。

ｓｉＲＮＡを被検体に投与するのに使用することができる例示的送達経路は、多く知られている。さらに、ｓｉＲＮＡは、当該技術分野において公知の任意の例示的な方法により製剤化することもできる。ｓｉＲＮＡの製剤および投与の例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。

「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾低分子干渉核酸分子」という表現は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）または遺伝子サイレンシングを介して配列特異的に遺伝子発現またはウイルス複製を阻害またはダウンレギュレートすることができる任意の核酸分子をいう。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のそうした核酸分子またはそうした核酸分子のプールの両方をいうことができる。ｓｉＮＡは、アンチセンス鎖が標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖が標的核酸配列に相当するヌクレオチド配列またはその一部を含む、自己相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子であってもよい。ｓｉＮＡは、アンチセンス領域が別の標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列を含む、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよい。ｓｉＮＡは、２つ以上のループ構造と自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含むステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は標的核酸分子ヌクレオチド配列またはその一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列を含み、かつ環状ポリヌクレオチドはインビボあるいはインビトロでプロセシングを受けてＲＮＡｉを媒介する能力がある活性なｓｉＮＡ分子になることができる。ｓｉＮＡは、標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部と相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドをさらに含んでもよく（たとえば、こうしたｓｉＮＡ分子には、標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列がｓｉＮＡ分子内に存在する必要がない）、一本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸基、たとえば５’−リン酸（たとえば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照）、または５’，３’−二リン酸をさらに含んでもよい。

リンカー
モジュール組成物のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃとオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡとの間の共有結合は、リンカーを介してもよい。このリンカーは、用途に応じて切断型でもあるいは非切断型でもよい。ある種の実施形態では、切断型リンカーは、エンドソームから細胞質への輸送後にオリゴヌクレオチドを放出するのに使用してもよい。目的のコンジュゲーションまたはカップリング相互作用の性質、または所望の生物学的作用により、どのリンカー基を選ぶかが決定される。リンカー基は、より複雑な構造を得るため組み合わせても、あるいは分岐させてもよい。好適なリンカーとして、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットに記載されているようなものが挙げられる。

一実施形態では、本発明のリンカーを表１に示す。

別の実施形態では、好ましいリンカーを表２に示す。

市販のリンカーは、前記リンカーの組み合わせを含め、ＰｉｅｒｃｅまたはＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎなど様々な供給業者から入手することができる。さらに、リン酸結合を介して結合された市販のリンカーを、リンカーとして独立に使用しても、あるいは前記リンカーと組み合わせて使用してもよい。リンカーはさらに、１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを適合させたより複雑な分岐構造を得るため組み合わせてもよく、そうした一例を下記に図示する。

標的化リガンド
本発明のモジュール組成物は標的化リガンドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この標的化リガンドは、モジュール組成物を特定の細胞に誘導することができる。たとえば、標的化リガンドは、標的細胞の表面上の分子と特異的または非特異的に結合することができる。標的化部分は、標的細胞に対して特異的親和性を有する分子であってもよい。標的化部分は、標的細胞の表面に見られるタンパク質に対する抗体、あるいは標的細胞の表面に見られる分子に対するリガンドまたはリガンドの受容体結合部を含んでもよい。標的化リガンドの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。

標的化リガンドは、抗体、受容体のリガンド結合部、受容体に対するリガンド、アプタマー、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価Ｎ−アシチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク質、フォレート、サイロトロピン、メラノトロピン、界面活性剤プロテインＡ、ムチン、炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フルクトース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタマート、ポリアスパルテート、血漿タンパク質結合を増強する親油性部分、ステロイド、胆汁酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、フォレートならびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群から選択される。

好ましい標的化リガンドは、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３、コレステロール、フォレート、ならびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群から選択される。

脂質
親油性部分、たとえばコレステロールまたは脂肪酸は、核酸などの高度の親水性分子に結合すると、血漿タンパク質結合を実質的に増強し、結果として循環半減期を長くすることができる。さらに、親油基は細胞取り込みを促進することもできる。たとえば、脂質は、特定の血漿タンパク質、たとえばリポタンパク質に結合でき、その結果、対応するリポタンパク質受容体（たとえば、ＬＤＬ受容体またはスカベンジャー受容体ＳＲ−Ｂ１）を発現する特定の組織の取り込みを促進することが示されている。親油性コンジュゲートは、標的送達アプローチと見なすこともでき、その細胞内輸送は、エンドソーム溶解剤との組み合わせによりさらに強力に促進され得る。

血漿タンパク質結合を増強する例示的な親油性部分には、ステロール、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥおよびビオチン等があるが、これに限定されるものではない。脂質の例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。

好ましい脂質はコレステロールである。

可溶化剤
モジュール組成物は、水溶解度の向上、循環半減期の延長および／または細胞取り込みの促進を行うことができる１個または複数個の他の部分／リガンドを含んでもよい。こうしたものとして、天然に存在する物質、たとえばタンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）またはグロブリン）；または炭水化物（たとえば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）を挙げることができる。これらの部分はまた、組換え分子または合成分子、たとえば合成ポリマーまたは合成ポリアミノ酸であってもよい。例として、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、たとえば、ＰＥＧ−０．５Ｋ、ＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、メチル−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、［ｍＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。可溶化剤の例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。

好ましい可溶化基はＰＥＧ０．５Ｋ〜３０Ｋである。

処置の方法
一態様では、本発明は、本発明のモジュール組成物の投与から恩恵を受け得る疾患のリスクがあるまたはそれに罹患した被検体を処置する方法を特徴とする。本方法は、本発明のモジュール組成物の投与を必要とする被検体に本発明のモジュール組成物を投与することにより、被検体を処置することを含む。投与されるオリゴヌクレオチドは、処置対象の疾患によって異なる。具体的な適応症の処置方法に関するさらなる詳細については、国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットを参照されたい。

処方
オリゴヌクレオチド化合物のコンジュゲートを調製するための方法は、多く存在する。その技術は、当業者によく知られているはずである。そうした反応に関する有用な参考文献として、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６がある。他の参考文献としては、国際公開第２００５／０４１８５９号パンフレット；国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレットおよび国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットがある。

本発明について以下の例により詳細に説明するが、以下の例をさらに限定するものと解釈してはならない。本出願に引用されるすべての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、本明細書に明示的に援用する。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡは、広範に発現する遺伝子ＳＳＢ（シェーグレン症候群抗原Ｂ；ＮＭ＿００９２７８．４）を標的とするように設計した。

少なくとも１個の酸素原子、少なくとも１個のリン原子および／または少なくとも１個の窒素原子を含むいくつかの実施形態では、リンカー基は、連結結合点（ＬＡＰ）でオリゴヌクレオチド鎖またはｓｉＲＮＡ鎖（単数または複数）と連結することができ、任意の炭素含有基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リン原子は、オリゴヌクレオチド鎖の接合点としての役割を果たすことができるリンカー基上の末端リン酸基またはホスホロチオエート基の一部を形成する。ある種の実施形態では、窒素原子は、目的のリンカー、エンドソーム溶解単位、細胞膜透過ペプチド、可溶化基、脂質、標的化基または別の目的のリンカー接合点としての役割を果たすことができるリンカー基上の末端エーテル基、エステル基、アミノ基またはアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を形成する。これらの末端リンカー基には、Ｃ_６ヘキシル部分、Ｃ_５第二級ヒドロキシ部分、Ｃ_３チオール部分またはＣ_６チオール部分があるが、これに限定されるものではない。下記に記載するＲＮＡ配列の一例として、Ｃ６ヘキシル：［（ＣＨ_２）_６ＮＨ_２］がある。

ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドおよびｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの調製について、下記の実施例および合成スキームに記載する。下記に記載された化合物および／またはコンジュゲートに使用した具体的なｓｉＲＮＡ配列を表３に示す。

インビトロおよびインビボ活性データ
後述した方法を使用したインビボおよびインビトロデータを表４に示す。

下記のｓｉＲＮＡの記載は説明を目的としたものであることに留意されたい。具体的な配列情報は表３で確認することができる。

実施例１〜２
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物９および１０の合成
以下のスキーム１を用いてＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物９および１０を調製した。

スキーム１

（２Ｓ）−２，６−ビス［ビス（プロプ−２−イン−１−イル）アミノ］ヘキサン酸（化合物１）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ ３口丸底フラスコに、（２Ｓ）−２，６−ジアミノヘキサン酸（５０ｇ、３４２．０３ｍｍｏｌ、１．００当量）をアセトニトリル（１０００ｍＬ）に溶かした溶液を入れ、５０℃に加熱した。これに水酸化カリウム（２２．６ｇ、０．４０２５ｍｏｌ、１．００当量、８５％）を加えた。得られた溶液を３０分間撹拌した。次いで３−ブロモプロプ−１−イン（２９．５ｍＬ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を５０℃で１時間撹拌した。追加の水酸化カリウム（２２．６ｇ、０．４０２５ｍｏｌ、１．００当量）をこの溶液に加え、５０℃で３０分間撹拌した。これに３−ブロモプロプ−１−イン（２９．５ｍＬ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を１時間撹拌した。これに水酸化カリウム（２２．６ｇ、０．４０２５ｍｏｌ、１．００当量）を再度加えた。得られた溶液を５０℃で３０分間撹拌し、続いてさらに３−ブロモプロプ−１−イン（２９．５ｍＬ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を１時間撹拌した。これに水酸化カリウム（２２．６ｇ、０．４０２５ｍｏｌ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を３０分間撹拌した。これに３−ブロモプロプ−１−イン（２９．５ｍＬ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を３時間撹拌した。反応混合物を水／氷浴で２５℃まで冷却した。固体を濾去した。濾液をＨＣｌ（６Ｍ）でｐＨ４に調整した。固体を濾去した。濾液を真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン／メタノール（１００：１〜２５：１）で溶出した。この結果、（２Ｓ）−２，６−ビス［ビス（プロプ−２−イン−１−イル）アミノ］ヘキサン酸（化合物１）を淡黄色の油として得た。
ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：２９７．２，［Ｍ−Ｈ］^{− １}ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：３．６２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，４Ｈ），３．５２−３．４９（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，４Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８８−１．７９（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．５３（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．４３（ｍ，２Ｈ）。

２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート（化合物３）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ ３口丸底フラスコに、２−（２−ヒドロキシエトキシ）エタン−１−オール（化合物２、４２．４ｇ、３９９．５５ｍｍｏｌ、１．００当量）をジクロロメタン（１０００ｍＬ）に溶かした溶液およびトリエチルアミン（２７．９ｇ、２７５．７２ｍｍｏｌ、０．２５当量）を入れた。上記にｐ−トルエンスルホニルクロリド（１９．１ｇ、１００．１８ｍｍｏｌ、０．５０当量）を加えた。２５℃で１時間撹拌後、得られた混合物を１×５００ｍＬのカリウムヒドロスルファート水溶液（１Ｍ）および１×５００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液（５％）でそれぞれで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン／メタノール（１００：１）で溶出した。この結果、２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート（化合物３）を無色油として得た。

２−（２−アジドエトキシ）エタン−１−オール（化合物４）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した５００ｍＬ 丸底フラスコに、２−（２−［［（４−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート（化合物３、５０ｇ、１９２．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）に溶かした溶液を入れた。これに続いてアジ化ナトリウム（１８．７９ｇ、２８９．０３ｍｍｏｌ、１．５０当量）を２５℃で加えた。得られた溶液を油浴にて１００℃で５時間撹拌した。反応混合物を冷却し、濾過した。濾液を真空下で濃縮した。残液を１０００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、１×５００ｍＬの水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン／メタノール（８０：１）で溶出した。この結果、２−（２−アジドエトキシ）エタン−１−オール（化合物４）を無色油として得た。
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：３．４２−３．４５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６３−３．６５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７１−３．７４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７１−３．７９（ｍ，２Ｈ）。

（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２，４，５−トリイルトリアセテート（化合物６）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ ３口丸底フラスコに、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アミノ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２，４，５−トリオールヒドロクロリド（化合物５、１２０ｇ、５５６．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）をピリジン（１２００ｍＬ）に溶かした溶液を入れた。これに続いて酢酸無水物（３４１．６ｇ、３．３５ｍｏｌ、６．００当量）を０℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を一晩２５℃で撹拌した。次いで８０００ｍＬの水／氷を加えて反応をクエンチした。この固体を濾過により集めた。この結果、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２，４，５−トリイルトリアセテート（化合物６）を白色固体として得た。

（３ａＲ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−５−（アセトキシメチル）−２−メチル−５，６，７，７ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピラノ［３，２−ｄ］オキサゾール−６，７−ジイルジアセテート（化合物７）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ 丸底フラスコに、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２，４，５−トリイルトリアセテート（化合物６、３０ｇ、７７．０５ｍｍｏｌ、１．００当量）をジクロロメタン（１５００ｍＬ）に溶かした溶液を入れ、次いで鉄（ＩＩＩ）クロリド（３０ｇ、１８４．９５ｍｍｏｌ、２．４０当量）を加えた。得られた混合物を２５℃で２時間撹拌した。次いで１０００ｍＬの水／氷を加えて反応をクエンチした。有機層を１×１０００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液および１×１０００ｍＬの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。この結果、（３ａＲ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−５−（アセトキシメチル）−２−メチル−５，６，７，７ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピラノ［３，２−ｄ］オキサゾール−６，７−ジイルジアセテート（化合物７）を黄色油として得た。
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：２．０３（ｓ，９Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），３．９７−４．２７（ｍ，４Ｈ），４．９０−４．９３（ｍ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），５．４５−５．４７（ｔ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．９８−６．００（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）。

（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（化合物８）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した５００ｍＬ 丸底フラスコに、（３ａＲ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−５−（アセトキシメチル）−２−メチル−５，６，７，７ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピラノ［３，２−ｄ］オキサゾール−６，７−ジイルジアセテート（化合物７、４０ｇ、１２１．４７ｍｍｏｌ、１．００当量）を１，２−ジクロロエタン（２００ｍＬ）に溶かした溶液、２−（２−アジドエトキシ）エタン−１−オール（化合物４、２３．８９ｇ、１８２．１８ｍｍｏｌ、１．５０当量）を入れた。上記に数個の４Ａゼオライトを加えた。得られた混合物を２５℃で１時間撹拌した。次いでトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１０．８ｍＬ、０．５０当量）を加えた。２５℃で一晩撹拌後、反応混合物を５００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、１×５００ｍＬの水、１×５００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液および１×５００ｍＬの水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン／メタノール（１００：１）で溶出した。この結果、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（化合物８）を無色油として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６１．１，［Ｍ＋Ｈ］^＋
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，ｐｐｍ）５．７８（ｄ，Ｊ＝８．９０Ｈｚ，１Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１９−４．１２（ｍ，２Ｈ），４．１１−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９８−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．８２−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．６３（ｍ，４Ｈ），３．４９−３．３８（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ）。

（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物９、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃアセテート）（Ｅｘ．１）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２５０ｍＬ 丸底フラスコに、（２Ｓ）−２，６−ビス［ビス（プロプ−２−イン−１−イル）アミノ］ヘキサン酸（化合物１、１．０ｇ、１．０当量）、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（化合物８、９．２６ｇ、６．０当量）、無水ＴＨＦ５０ｍＬ、ＣｕＢｒ^．ＳＭｅ_２（０．１３８ｇ、０．２０当量）、および無水ＤＢＵ（１．５ｍｌ、３．０当量）をそれぞれ順番に仕込んだ。得られた溶液を室温で１６時間撹拌し、酢酸（０．７５ｍＬ、４．０当量）でクエンチし、ＭＰ−ＴＭＴ樹脂（Ｐａｒｔ Ｎｏ：８０１４７２、Ｂｉｏｔａｇｅ製）（９ｇ）で処理し、室温で１６時間熟成させ、濾過し、濾液を濃縮して泡状固体とした。次いでこの固体をＣＨ_２Ｃｌ_２（１４０ｍＬ）に溶解させ、ＡｃＯＨ／ＮａＣｌ溶液（１４０ｍＬ）で洗浄した。ＡｃＯＨ／ＮａＣｌ溶液は、１ｍＬ ＡｃＯＨおよび１００ｍＬ ２０％ＮａＣｌ溶液で調製した。下層の有機層を濃縮し、ＳｉＯ_２カラム（２２０ｇ）で精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨで溶出した。この結果、（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物９）を白色固体として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１３９．５，［Ｍ＋Ｈ］^＋

（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物１０、ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ）（Ｅｘ．２）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２５０ｍＬ 丸底フラスコに、（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物９、６．９ｇ、１．０当量）、Ｎａ_２ＣＯ_３（６．８３ｇ、２０当量）、水（５６ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３２ｍＬ）をそれぞれ順番に仕込んだ。反応を室温で１６時間熟成させ、濃縮して残渣を得、水（５０ｍＬ）に再溶解させ、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｃ１８ ｇｏｌｄ逆相カラム（４１５ｇ）で精製し、水／ＭｅＣＮで溶出した。真空下で濃縮後、生成物を最小量の水に溶解させ、凍結乾燥して（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物１０）を白色固体として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６５７［Ｍ＋Ｎａ］^＋
１ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：８．０５（ｓ，２Ｈ），７．９１（ｓ，２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），４．５７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），４．４５−４．４１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ），３．９９−３．８２（ｍ，２８Ｈ），３．８０−３．６１（ｍ，２８Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｂｒｏａｄ ｓ，２Ｈ），１．９９（ｓ，６Ｈ），１．９８（ｓ，６Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），１．２９（ｍ，２Ｈ）。

実施例３〜５
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物１７ａ、１７ｂおよび１７ｃの合成
以下のスキーム２を用いてＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物１７ａ、１７ｂおよび１７ｃを調製した。

スキーム２

化合物１３の合成
５−クロロ−１−ペンタノール（３．０ｇ、２４．４７ｍｍｏｌ）化合物１１をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶かした溶液にアジ化ナトリウム（１．９０９ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）化合物１２を加えた。６０℃で一晩撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：３）により精製して生成物化合物１３を透明な液体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ３．６２（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．６３−１．５３（ｍ，４Ｈ），１．４５−１．４０（ｍ，２Ｈ）。

化合物１５の合成
化合物１３（０．７９６ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）およびＤ−ガラクトサミンペンタアセテート（２．００ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）化合物１４を２０ｍＬ ＤＣＭに懸濁し、続いてトリフルオロメタンスルホン酸（０．１５４ｇ、１．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩還流させた。ＬＣ−ＭＳにより、ＳＭの変換が終了したことを確認し、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を、３０分かけて１００／０〜９０／１０のＩＳＣＯ ＤＣＭ／ＭｅＯＨにより精製して化合物１５を白色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：１．９７（６Ｈ，ｓ），２．０２（６Ｈ，ｓ），２．０６（６Ｈ，ｓ），２．１５（６Ｈ，ｓ），３．２８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８９Ｈｚ），３．５０（３Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝９．６３，６．６６Ｈｚ），３．６８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．９８Ｈｚ），３．９４−３．９２（７Ｈ，ｍ），４．１６−４．１５（５Ｈ，ｍ），４．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３４Ｈｚ），５．３１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１６，３．４８Ｈｚ），５．４０−５．３８（５Ｈ，ｍ）。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃ_１９Ｈ_３１Ｎ_４Ｏ_９，４５９．２；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：４５９．４。

化合物１６の合成。
Ｌｙｓ−アルキン化合物１（１３０ｍｇ、０．４３６ｍｍｏｌ）およびＧａｌＮＡｃアジド６（９９９ｍｇ、２．１７８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ、脱気処理）に溶解させた。反応混合物に臭化銅（Ｉ）−ジメチルスルフィド錯体（１７．９１ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を一度に加え、ＴＨＦ溶液を４０℃で一晩撹拌した。反応の色がＣｕ^２＋を示す青／緑に変化し、反応混合物に、新鮮なアスコルビン酸ナトリウム３７ｍｇを含む０．２ｍＬの水を加え、一晩反応させた。反応を濃縮し、２０分かけてＲＰ ＨＰＬＣ ５〜６０ ＭｅＣＮ（０．５％ＴＦＡ）／水（０．５％ＴＦＡ）により精製した。集めた画分を合わせて、凍結乾燥して化合物８を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋：Ｃ_９４Ｈ_１４５Ｎ_１８Ｏ_３８，１３４．０，ｍ／ｚ＝７１１．３；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：７１１．９。

化合物１７ａ（Ｅｘ．３）の合成
保護されたＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物８（３００ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）を含む０℃のＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１／１ ５ｍＬに、ナトリウムメトキシド（９１ｍｇ、１．６８８ｍｍｏｌ）を加えた。反応を１時間撹拌し、２ｍＬの水を加えてクエンチした。揮発性の溶媒を除去し、反応混合物を、水を用いてＰ４バイオゲルにより精製し、集めた画分を合わせて、凍結乾燥して化合物９を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋：Ｃ_７０Ｈ_１２１Ｎ_１８Ｏ_２６，１６２９．９，ｍ／ｚ＝５４３．３；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：５４３．８；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋：Ｃ_７０Ｈ_１２０Ｎ_１８Ｏ_２６，１６２８．９，ｍ／ｚ＝８１４．５；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：８１４．９。

化合物１７ｂおよび１７ｃ（Ｅｘ．４およびＥｘ．５）の合成
下記構造を有する化合物１７ｂおよび１７ｃの合成を、適切なアジド供給源を用いて化合物１７ａに使用したのと類似の方法で達成した。

実施例６
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドのコンジュゲーションのスキーム
下記スキーム３は、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの調製に使用することができる一般的なスキームを示す。

スキーム３

一般的なスキーム３を用いて、コンジュゲート１０−１、１０−２、１０−３、１０ａ−１、１７ａ−１、１７ｂ−１、１７ｃ−１を得ることができる。予め形成したｓｉＲＮＡ二本鎖または一本鎖にカップリング手順を行い、続いてアニーリングを行えばよい。あるいは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１１，２２，ｐｐ．１７２３−８に概説されたプロトコルを利用してもよい。

実施例７
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃアセテート化合物９を介したＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１０−１の合成
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃアセテート（化合物９、５８．７ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶かした溶液に、ＤＩＰＥＡ（２．２ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１０．４４ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、ｓｉＲＮＡ（５１）（０．０１４ｍｍｏｌ）を水（１．５ｍｌ）およびアセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶かした溶液にシリンジポンプにより２０分かけて移し、３０分間撹拌してから１．５ｍＬまで真空下で濃縮した。次いで炭酸ナトリウム（２１８ｍｇ、２．０５９ｍｍｏｌ）、続いて ＭｅＯＨ（０．５０ｍｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１６時間撹拌し、濃縮し、透析により精製し、凍結乾燥してｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１０−１を得た。

実施例８
３’５’ビスＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート一本鎖１８の合成
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ酸化合物１０（４１．２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２００ｕＬ）に溶かした溶液に、ＨＡＴＵ（９．６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１７．６ｕＬ、０．１２６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１５分間撹拌し、ジアミノ−ｓｉＲＮＡ（１８．８ｍｇ、２．５２ｕｍｏｌ）を水（４０ｕＬ）およびＤＭＳＯ（３６０ｕＬ）に溶かした溶液に移し、３０分間撹拌した。混合物を水（１．５ｍＬ）で希釈し、１００ｍＭ ＴＥＡＡを含む０〜３０％ＣＨ_３ＣＮ／水のグラジエントによりＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）を用いて精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物１８を得た。

実施例９
３’５’ビスＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ二本鎖コンジュゲート１９−１の合成
下記スキーム４を用いてＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１９−１を調製した。

スキーム４

３’５’ビスｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１８（１３．７ｍｇ、１．２９ｕｍｏｌ）を水（２００ｕＬ）に溶かした溶液を、ガイドｓｉＲＮＡ（９．３ｍｇ、１．３５ｕｍｏｌ）を水（１００ｕＬ）に溶解させた溶液に加え、９０Ｃで１分間加熱した。得られた溶液を冷却し、凍結乾燥して二本鎖１９−１を得た。

実施例１０
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物２４の合成
以下のスキーム５を用いてｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物２４を調製した。

スキーム５

化合物２２の合成
Ｎ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパン（化合物２０、１１５ｍｇ、０．６６０ｍｍｏｌ）を１：１ ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＣＮ（１ｍＬ）に溶かした０℃の溶液に、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（化合物２１、１８５ｍｇ、０．６９５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。混合物を１時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２により精製して生成物化合物２２を得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃ_１５Ｈ_２４Ｎ_３Ｏ_５，３２６．２；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：３２６．３。

化合物２３の合成
マレイミド化合物２２（５６ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍｌ）に溶かした溶液に、４Ｍ ＨＣｌ（１ｍｌ、４．００ｍｍｏｌ）をジオキサンに溶かした溶液を加えた。混合物を１時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２で共沸し（２×）、真空下で乾燥させて生成物化合物２３を得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_３，２２６．１；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：２２６．３。

ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃマレイミド化合物２４（Ｅｘ．１０）の合成
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ酸化合物１０（１００ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５００ｕＬ）に溶かした溶液に、ＨＡＴＵ（３４．９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ_３Ｎ（４２．６ｕＬ、０．３０６ｍｍｏｌ）およびＮ−（３−アミノプロピル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミドヒドロクロリド（１６．０ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１．５時間撹拌し、ＴＦＡで酸性化し、０．１％ＴＦＡを含む逆相０〜５０％ＣＨ_３ＣＮ／水により精製した。画分を凍結乾燥して化合物２４を得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋：Ｃ_７６Ｈ_１２５Ｎ_２１Ｏ_３２，１８４３．８，ｍ／ｚ＝９２１．９；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：９２２．７。

実施例１１
化合物２６の合成
下記スキーム６を用いて化合物２６を調製した。

スキーム６

２’−３，１７プロパルギルｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ２５、３３ｍｇ、４．４９ｕｍｏｌ）およびＰＥＧ９ ＳＰＤＰアジド（２６ｍｇ、３６ｕｍｏｌ、市販のＰＥＧ−アジドおよびピリジルジスルフィド試薬から調製）を３：１ ＤＭＡ／水（１ｍＬ）に溶かした脱気した溶液に、臭化銅（Ｉ）−ジメチルスルフィド錯体（１．８ｍｇ、９．０ｕｍｏｌ）を含む脱気した溶液を加えた。混合物を室温で７２時間撹拌し、水（２ｍＬ）で希釈し、０．４５ｕＭ シリンジフィルターを用いて濾過し、透析により濃縮した。濃縮混合物を、１００ｍＭ ＴＥＡＡを含む０〜５０％ＣＨ_３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）により精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物２６を得た。

実施例１２〜１３
化合物２７および２８の合成
下記スキーム７を用いて化合物２７および２８を調製した。

スキーム７

化合物２７（Ｅｘ．１２）の合成
２’−３，１７ｃｌｉｃｋ ＰＥＧ９ ＳＰＤＰコンジュゲート２６（１３．２ｍｇ、１．５０μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶かした溶液に、ＴＣＥＰヒドロクロリド（９．１５ｍｇ、３２．２ｕｍｏｌ）を水（０．５ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで１００ｍＭ ＴＥＡＡを含む５〜４０％ＣＨ_３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）により精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物２７を得た。

化合物２８（Ｅｘ．１３）の合成
２’−３，１７−ｃｌｉｃｋ ＰＥＧ９ＳＨ２７（３ｍｇ、０．３５μｍｏｌ）をｐＨ６．０ 酢酸塩緩衝液（１００ｕＬ）に溶かした溶液に、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃマレイミド（５．１ｍｇ、２．７７μｍｏｌ）をｐＨ６．０ 酢酸塩緩衝液（１００ｕＬ）に溶解させた溶液を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで１００ｍＭ ＴＥＡＡを含む５〜４０％ＣＨ_３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）により精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物２８を得た。

実施例１４
２’−３，１７ビスＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ二本鎖コンジュゲート２９の合成
コンジュゲート１９に関して詳述した手順を二本鎖２８に用いてコンジュゲート２９を作製した。

実施例１５
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃチオール化合物３１の合成
下記スキーム８を用いて化合物３１を調製した。

スキーム８

ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ酸化合物１０（５４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（５００μｌ）に溶かした溶液に、シスタミンジヒドロクロリド３０（１４．９ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１２．７ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、ＨＯＡＴ（１０．２ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５７．７μｌ、０．３３０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１８時間撹拌し、次いでＤＴＴ（５０．９ｍｇ、０．３３０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１００μｌ）に溶かした溶液を加えた。混合物を室温で０．５時間撹拌し、ＴＦＡで酸性化し、０．１％ＴＦＡを含む逆相０〜３０％ＣＨ_３ＣＮ／水により精製した。画分を凍結乾燥して化合物３１を得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋：Ｃ_６８Ｈ_１１５Ｎ_１９Ｏ_２９Ｓ，１６９５．８，ｍ／ｚ＝８４７．９；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：８４８．０。

実施例１６〜１８
コンジュゲート３５〜３７の合成
下記スキーム９を用いてコンジュゲート３５〜３７を調製した。

スキーム９

化合物３３の合成
２’−ｃｌｉｃｋ１５ＧＳ化合物３２（１３０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）および（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２−アジドエチル）カルバメート（２９．１ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を３：１ ＤＭＡ／水（２ｍＬ）に溶かした脱気した溶液に、臭化銅（Ｉ）−ジメチルスルフィド錯体（９．７２ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を脱気ＤＭＳＯ（０．３２ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。混合物を４５℃で２時間撹拌し、室温まで冷却し、ｐＨ８ ＥＤＴＡ（０．５Ｍ、２ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。１５分間撹拌し、１００ｍＭ ＴＥＡＡを含む０〜４５％ＣＨ_３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、３０×１５０ｍｍ）で精製した。画分を透析により濃縮した。水（３ｍＬ）中の合わせた材料に、ピペリジン（９３６μＬ、１．８９１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を４℃で１８時間保管し、水（１０ｍＬ）で希釈し、シリンジフィルターを通して固体を濾別した。ｐＨ８ ＥＤＴＡ（０．５ Ｍ、２ｍＬ）を加え、透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物３３を得た。

化合物３４の合成
２’−１５ｃｌｉｃｋ Ｃ２ ＮＨ２ ＧＳ化合物３３（４３．６ｍｇ、６．２６μｍｏｌ）を２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３溶液（２０００μｌ）およびホルムアミド（１０００ｕＬ）に溶かした溶液に、Ｎ−スクシニミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（１７．９ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２９８ｕＬ）に溶解させた溶液を加えた。混合物を１０℃で１５分間撹拌し、水（１０ｍＬ）およびホルムアミド（１ｍＬ）で希釈し、透析により濃縮した。２Ｍ ＴＥＡＡ（２００ｕＬ）を加え、１００ｍＭ ＴＥＡＡを含む５〜４０％ＣＨ_３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）で精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物３４を得た。

２’−１５ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート３５（Ｅｘ．１６）の合成
２’−１５ｃｌｉｃｋ Ｃ２ ＮＨ２ ＮＨＳ ＳＰＤＰ ＧＳ化合物３４（１３ｍｇ、１．８２μｍｏｌ）を１：１ ホルムアミド／水（２００μｌ）に溶かした溶液に、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ ＳＨ（４．６２ｍｇ、２．７２μｍｏｌ）をホルムアミド（２００ｕＬ）に溶かした溶液を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌し、２Ｍ ＴＥＡＡ（５０ｕＬ）を加え、１００ｍＭ ＴＥＡＡを含む２〜３５％ＣＨ_３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）で精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥した。得られた固体を、２〜３０％（溶媒Ａ：４０ｍＭ Ｅｔ３Ｎを含む６０：４０ ＴＦＥ／水、溶媒Ｂ：４０ｍＭ Ｅｔ３Ｎ、１Ｍ グアニジンＨＣｌを含む６０：４０ ＴＦＥ／水）のグラジエントを用いてＰｒｏｔｅｏｍｉｘ ＳＡＸ−ＮＰ１０カラム（２２．１×５０ｍｍ）で精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥してコンジュゲート３５を得た。

コンジュゲート３６および３７（Ｅｘ．１７およびＥｘ．１８）の合成
コンジュゲート１９−１に関して詳述した手順を二本鎖コンジュゲート３５および適切なパッセンジャー鎖に使用して、それぞれコンジュゲート３６および３７を調製した。

実施例１９〜２６
コンジュゲート３８〜４５（Ｅｘ．１９〜２６）の合成
下記スキーム１０および１１を用いてコンジュゲート３８〜４４を調製した。

スキーム１０

スキーム１１

スキーム１１。ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃをｓｉＲＮＡにコンジュゲートするのに使用した表２の様々なリンカーの例。

ステップ１：パッセンジャー−ＲＮＡおよびリンカー、プロトコルを説明するためプロリンを用いた例
ＦＭＯＣ−ＰＲＯ−ＯＨ（１１．１１ｍｇ、０．０３３μｍｏｌ）を１２０μＬ ＤＭＳＯに溶かした溶液に、ＤＩＰＥＡ（４３．２μｌ、０．２４７μｍｏｌ）、続いてＨＡＴＵ（１０．９６ｍｇ、０．０２９μｍｏｌ）を加えた。この淡黄色の混合物を室温で３０分間撹拌した。次いでこの混合物を、オリゴヌクレオチドパッセンジャー鎖ＴＥＡＡ塩（６０ｍｇ、８．２４μｍｏｌ）を５００μＬの（１０％Ｈ２Ｏ／ＤＭＳＯ）に溶かした溶液に加え、混合物を引き続き室温で１時間撹拌した。反応混合物は、ＬＣ−ＭＳにより所望の生成物を示した。反応混合物にジエチルアミン（４３．０μｌ、０．４１２μｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌し、ＬＣ−ＭＳにより所望の生成物を確認した。反応混合物を、カットオフ分子量３ｋＤａの膜を用いた遠心透析により精製した。このプロセスを、水を用いて３回繰り返した（各回１４ｍＬ）。得られた溶液を濃縮し、凍結し、一晩凍結乾燥して生成物を白色の綿状固体として得た。ＬＣ／ＭＳから生成物［７３８４．９］が確認された。

ステップ２：ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−リンカー−パッセンジャーＲＮＡ
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物１０（５３．２ｍｇ、０．０３３μｍｏｌ）を５３２μＬ ＤＭＳＯに溶かした溶液に、ＤＩＰＥＡ（４２．６μｌ、０．２４４μｍｏｌ）、続いてＨＡＴＵ（１２．３６ｍｇ、０．０３３μｍｏｌ）を加えた。この淡黄色の混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで混合物を、リンカー−オリゴヌクレオチドパッセンジャー鎖を５００μＬのＤＭＳＯに溶かした溶液に加え、混合物を引き続き室温で２時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳにより所望の生成物が示された。反応混合物を、カットオフ分子量３ｋＤａの膜を用いて遠心透析に供した。このプロセスを、水を用いて３回繰り返した（各回１４ｍＬ）。得られた溶液を、ＸＢＲＩＤＧＥ ＰＨＥＮＹＬ、３５分間の、２００μＭ ＴＥＡＡを含む１０〜２７％ＣＨ_３ＣＮを用いてＧｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０２０により精製した。回収溶液を、カットオフ分子量３ｋＤａの膜を用いて遠心透析により濃縮した。得られた濃縮溶液を１．０Ｎ ＮａＣｌで処理し、遠心透析した。このプロセスを、水を用いて５回繰り返した（各回１４ｍＬ）。得られた濃縮溶液（約１．５ｍＬ）を凍結し、一晩凍結乾燥して生成物を白色の綿状固体として得た。ＬＣ／ＭＳから生成物［９００２．５］が確認された。

ステップ３：二本鎖の形成
１．５ｍＬの水中のＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−リンカー−ＲＮＡ（１８．５ｍｇ、２．０５５μｍｏｌ）に、１．５ｍＬの水中のＡｐｏＢガイド鎖（１４．１２ｍｇ、２．０５５μｍｏｌ）と二本鎖を形成させた。撹拌子を用いて混合物を９０℃で５分間加熱した。二本鎖を冷却し、撹拌子を除去した。溶液を２日にわたり凍結乾燥して所望の二本鎖コンジュゲート３８を白色の綿状固体として得た。ＬＣ／ＭＳから生成物［１６０４８］が確認された。

残りのコンジュゲートもすべて、同じ一般的な手順を用いて調製した。

実施例２７〜２９
化合物／コンジュゲート４６〜４８の合成
下記スキーム１２を用いて化合物および／またはコンジュゲート４６〜４８を調製した。

スキーム１２

ＲＮＡ化合物４６（Ｅｘ．２７）の合成
ＳＰＤＰ酸（２．２ｍｇ、１０．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００μＬに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１４．０μｌ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１９．６ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。ＲＮＡ（１５ｍｇ、２．０６μｍｏｌ）を含む２００μＬのＤＭＳＯ：水（９：１）を加え、得られた反応混合物を１時間撹拌し、反応を、３ｍＬ 水を加えてクエンチし、５００μＬになるまで透析し、ホルムアミドにより３ｍＬに希釈し、ＳＡＸ（緩衝液Ａ：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ ＴＥＡ、緩衝液Ｂ：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ ＴＥＡ、１Ｍ ＣｓＣｌ、１５分かけての１００／０〜３５／６５のＡ／Ｂグラジエント）により精製した。集めた画分を合わせて、水に対して透析し、凍結乾燥して化合物４６を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ−Ｈ］⁻：Ｃ_２３４Ｈ_３００Ｆ_８Ｎ_７２Ｏ_１５０Ｐ_２３Ｓ_３，７４８０．１；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：７４８３．０。

コンジュゲート４７（Ｅｘ．２８）の合成
ＲＮＡ化合物４６（２２ｍｇ、２．９μｍｏｌ）およびｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃチオール化合物３１（１０．０ｍｇ、５．９μｍｏｌ）をホルムアミド：ｐＨ＝６．８トリス緩衝液（３：１）４００μＬに溶解させ、１時間撹拌した。反応混合物をＳＡＸ（緩衝液Ａ：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ ＴＥＡ、緩衝液Ｂ：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ ＴＥＡ、１Ｍ ＣｓＣｌ、１５分かけての１００／０〜３５／６５のＡ／Ｂグラジエント）により精製した。集めた画分を合わせて、水に対して透析し、凍結乾燥してコンジュエート４７を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍａｓｓ：［Ｍ−Ｈ］⁻：Ｃ_２９７Ｈ_４１０Ｆ_８Ｎ_９０Ｏ_１７９Ｐ_２３Ｓ_３，９０６３．９；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：９０６６．２。

コンジュゲート４８（Ｅｘ．２９）の合成
コンジュゲート４７（１０．９ｍｇ、１．２０μｍｏｌ）およびガイド鎖（７．８１ｍｇ、１．１４μｍｏｌ）を、ＲＮＡｓｅを含まない水１ｍＬ中で２時間混合した。反応混合物を凍結乾燥して二本鎖コンジュゲート４８を定量的収率で得た。

実施例３０〜３２
化合物／コンジュゲート４９〜５１の合成
下記スキーム１３を用いて化合物および／またはコンジュゲート４９〜５１を調製した。

スキーム１３

ＲＮＡ化合物４９（Ｅｘ．３０）の合成
３３．３ｍｇのｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖を４ｍＬ バイアルに秤量し、次いで１ｍＬ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３を加えて溶解させた。０．８６ｕＬのプロピオン酸無水物を加え、室温で撹拌した。約２時間熟成後、水に対して３回回転透析した。フリットで濾過し、溶液を凍結乾燥により乾燥させて３０．８ｍｇのＲＮＡ化合物４９を得た。

コンジュゲート５０（Ｅｘ．３１）の合成
ステップ１。２．８ｍｇ アジド、２５．７ｍｇ ｓｉＲＮＡ、２５ｍｌ Ｎ２でスパージしたＤＭＳＯおよび４ｍｌ 水を４０ｍＬ バイアルに仕込む。Ｎ_２でスパージする。２．９８ｍＬのＣｕ／リガンド溶液（Ｎ_２でスパージ、２０／１００ｕｍｏｌを含む１０ｍｌ ＤＭＳＯ）を仕込む。スパージしたＮ_２下、室温で撹拌する。

ステップ２。化合物１０および１ｍｌ ＤＭＳＯを仕込む。６ｕＬのＤＩＰＥＡを仕込み、２分間撹拌する。６ｍｇ ＨＢＴＵを仕込み、２分間撹拌する。ステップ１で得られたｓｉＲＮＡ混合物を仕込む。反応が終了しなかったため、前述の試薬の仕込みの半分を繰り返した。反応混合物を蒸発させ、透析し、ＨＰＬＣ精製した（Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｐｈｅｎｙｌ、ＴＥＡＡ／ＡＣＮグラジエント）。蒸発させ、透析し、凍結乾燥してコンジュゲート５０を得た。

コンジュゲート５１（Ｅｘ．３２）の合成
ＧＳ（コンジュゲート５０）１０．６５ｍｇを１ｍｌ 水に溶解させ、ＰＳ（コンジュゲート４９）１０．２０ｍｇを１．１７ｍｌ 水に溶解させる。８．７ｍｇのコンジュゲート４９をコンジュゲート５０のすべてに加えて１：１ 二本鎖を形成した。９０℃に１分間加熱し、１５分にわたり室温まで冷却する。溶液を濾過し、凍結乾燥により乾燥させてコンジュゲート５１を白色固体として得た。

ルシフェラーゼコンストラクトによる、リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした化合物のＲＮＡサイレンシング活性
ウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにｓｉＲＮＡの標的部位を含むルシフェラーゼベクターを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を作製した。この細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ：＃３９０３）に、ＤＭＥＭ １０％血清培地中１ウェル当たり７．５ｅ３細胞の密度で播種した。次いで細胞プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、製造者のプロトコルに従いＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ：＃３１９８５）中のトランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：＃１１６６８−０１９）を用いてコトランスフェクトした被検化合物でプレートを処理した。処理濃度は１０ｎＭ〜０．０３ｐＭの範囲であった。次いで処理プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション処理後、細胞を溶解させ、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｅ２９２０）に従って処理し、ＴＥＣＡＮ ｓａｆｉｒｅ２プレートリーダーで読み取った。

ＨｅｐＧ２細胞における、リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした化合物のＲＮＡサイレンシング活性
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ：ＨＢ−８０６５）をコラーゲンコートプレート（ＢｉｏＣｏａｔ：３５６６４９）に、ＤＭＥＭ １０％血清培地中１ウェル当たり７．５ｅ３細胞の密度で播種した。次いで細胞プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコルに従いＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ：３１９８５）中のトランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１１６６８−０１９）を用いてコトランスフェクトした被検化合物で処理した。処理濃度は１０ｎＭ〜０．０３ｐＭの範囲であった。次いで処理プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション処理後、提供されたプロトコルに従い細胞をＰＬＡ緩衝液（ＡＢ：４４４８５４２）で溶解させた。得られた細胞ライセートを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（ＡＢ：４３６８８１３）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７９００を用いてｑＰＣＲに供した。

ＲＮＡｉ活性のインビボ評価
ＣＤ１雌マウスに２００ｕｌ量で皮下注射により投与した。動物の行動の変化または生理学的変化を観察した。動物を投与から７２時間後にＣＯ２窒息により屠殺し、続いて心臓穿刺により失血させた。肝臓サンプルは中葉の３ｍｍパンチ標本とし、ＲＮＡｌａｔｅｒの入ったチューブに入れて全ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡノックダウン解析を、標準的な手順を用いてＴａｑｍａｎ解析により行った。

選択した化合物／コンジュゲートのインビトロおよびインビボデータの概略は、前に示した表４に示す。

当業者であれば、本発明が本目的を実行し、記載した目的および利点のほか、それに内在する目的および利点を得るように十分に適合されていることを容易に理解するであろう。現時点で好ましい実施形態の代表例である本明細書に記載の方法および組成物は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、その変更および他の使用を想到するであろうが、それらは本発明の精神に包含され、特許請求の範囲の範囲により規定される。

Claims (22)

1. １）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；
   ２）下記式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の、同一でもあるいは異なっていてもよい１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：
   

   

   
   （式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ^１Ｒ^２−または−ＮＲ^１−であり、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは１、２、３または４であり；かつ
   

   

   
   による結合は、前記オリゴヌクレオチドまたは下記リンカーとの結合点を示す）；
   任意に、３）同一でもあるいは異なっていてもよい１個または複数個のリンカー；および
   任意に、４）１個または複数個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み、
   前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、前記オリゴヌクレオチドに直接またはリンカーを介して結合している、モジュール組成物。
2. 請求項１に記載のモジュール組成物であって、
   １）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；
   ２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（ＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ_２−または−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；
   ３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および
   任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む、モジュール組成物。
3. モジュール組成物であって、
   １）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；
   ２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド
   

   

   
   （式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ^１Ｒ^２−または−ＮＲ^１−であり、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは１、２、３または４である）；
   ３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および
   任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み、
   前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、前記ｓｉＲＮＡに直接またはリンカーを介して結合している、モジュール組成物。
4. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、前記ｓｉＲＮＡのリボース環の異なる２’位、ならびに／または、前記ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡに結合しており；かつ前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは任意にリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結合している、モジュール組成物。
5. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、式（ＩＩ）のＸは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ_２−であり；ｎは１、２または３である、モジュール組成物。
6. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記組成物は同一でもあるいは異なっていてもよい１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む、モジュール組成物。
7. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、
   前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
   前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは前記ｓｉＲＮＡのリボース環の異なる２’位で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している、モジュール組成物。
8. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、
   前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
   前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは異なる３’位末端および／または５’位末端で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している、モジュール組成物。
9. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、
   前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
   前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリボース環の異なる２’位、ならびに／または、異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方に結合している、モジュール組成物。
10. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、同一でもあるいは異なっていてもよい、式（ＩＩ）の２〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含み；前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖に結合している、モジュール組成物。
11. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記組成物は、同一でもあるいは異なっていてもよい、式（ＩＩ）の２〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含み；前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは前記ｓｉＲＮＡの異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
12. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
13. 請求項１２に記載のモジュール組成物であって、各リンカーは独立に下記表１から選択される、モジュール組成物
    

    

    
    。
14. 請求項１２に記載のモジュール組成物であって、各リンカーは独立に下記表２から選択される、モジュール組成物
    

    

    
    。
15. 請求項３に記載のモジュール組成物であって、
    前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
    前記任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤はリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖に結合しているモジュール組成物。
16. １）二本鎖ｓｉＲＮＡ；
    ２）下記式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：
    

    

    
    ３）同一でもあるいは異なっていてもよい、下記表１から独立に選択される１〜１６個のリンカー
    

    

    
    ；および
    任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む、モジュール組成物。
17. 請求項１６に記載のモジュール組成物であって、
    １）二本鎖ｓｉＲＮＡ；
    ２）式（Ｖ）の１〜３個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；
    ３）同一でもあるいは異なっていてもよい、下記表１から独立に選択される１〜６個のリンカー
    

    

    
    ；および
    任意に、４）１〜３個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み、
    前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、前記ｓｉＲＮＡのリボース環の異なる２’位、ならびに／または、前記ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡに結合しており；かつ
    前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結合しているモジュール組成物。
18. ２〜３個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む請求項１７に記載のモジュール組成物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
19. 請求項１７に記載のモジュール組成物であって、
    １）二本鎖ｓｉＲＮＡ；
    ２）式（Ｖ）の１〜２個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；
    ３）同一でもあるいは異なっていてもよい、下記表２から独立に選択される１〜４個のリンカー
    

    

    
    ；および
    任意に、４）１〜２個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み、
    前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、前記ｓｉＲＮＡのリボース環の異なる２’位、ならびに／または、前記ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡに結合しており；かつ
    前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結合しているモジュール組成物。
20. ２個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む請求項１９に記載のモジュール組成物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
21. １個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む請求項１９に記載のモジュール組成物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結合している、モジュール組成物。
22. 請求項１に記載のモジュール組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。