JP6242001B2

JP6242001B2 - 生体材料の保存方法、生体材料の生産方法、生体材料、移植材料、移植方法および生体材料の保存装置

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Publication number: JP6242001B2
Application number: JP2014049716A
Authority: JP
Inventors: 直之畑山; 宗和内藤; 宗一平井; 正裕伊藤
Original assignee: Sumitomo Seika Chemicals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Seika Chemicals Co Ltd
Priority date: 2014-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2017-12-06
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: JP2015174823A

Description

本発明は、生体材料の保存方法、生体材料の生産方法、生体材料、移植材料、移植方法および生体材料の保存装置に関する。

近年、生体の一部、臓器、細胞等の生体材料の移植治療が一般化し、日本国内においては、年に３００件以上の移植治療が、また、全世界においては、年に７万件以上の移植治療が行われている。しかしながら、前記移植治療の増加に伴い、前記生体材料が不足するという問題が生じている。このため、移植治療を行う病院の近隣の地域からだけでなく、より遠隔の地域からも前記生体材料を輸送する必要がある。これらのことから、前記生体材料の保存方法の開発が求められている。

前記生体材料の保存方法として、摘出前または摘出後に、低温の保存液を用いて前記生体材料を灌流し、さらに灌流後の前記生体材料を低温の保存液に浸漬する方法（単純浸漬法）、前記保存液を持続的に灌流する方法（持続灌流法）、高圧ガス中で保存する方法（高圧気相保存法）等が知られている（特許文献１および２、非特許文献１）。しかしながら、これらの方法による前記生体材料の保存期間は、最大で１８時間であった。このため、移植治療を行う病院の遠隔の地域から、前記生体材料を輸送し、前記移植治療に用いることが困難という問題があった。これらのことから、より保存期間の長い新たな生体材料の保存方法が求められている。

国際公開第２０１０／０４９９９６号特開２０００−０７２６０１号公報

Maathuis MH，et．al．，Transplantation，2007，vol83，pp1289−1298

そこで、本発明は、保存期間の長い新たな生体材料の保存方法を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の生体材料の保存方法は、医療用ガスおよび保存液のエアロゾル雰囲気下で、生体材料を保存する保存工程を含むことを特徴とする。

本発明の生体材料の生産方法は、生産された生体材料を保存する材料保存工程を含み、前記材料保存工程が、前記本発明の保存方法で実施されることを特徴とする。

本発明の生体材料は、前記本発明の生産方法で生産されたことを特徴とする。

本発明の移植材料は、前記本発明の保存方法で保存された生体材料を含むことを特徴とする。

本発明の移植方法は、前記本発明の生体材料および前記本発明の移植材料の少なくとも一方を、動物に移植する移植工程を含むことを特徴とする。

本発明の生体材料の保存装置は、保存室、エアロゾル供給手段および医療用ガス供給手段を含み、前記エアロゾル供給手段により、前記保存室内に保存液のエアロゾルが供給され、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内に医療用ガスが供給されることを特徴とする。

本発明の保存方法によれば、生体材料の長期の保存が可能である。このため、本発明は、臨床医療および臨床研究分野等において極めて有用である。

図１は、実施形態１における本発明の保存装置の透視斜視図である。図２は、実施形態２における本発明の保存装置の透視斜視図である。図３は、比較例１〜８における心臓の保存条件を表す図である。

＜生体材料の保存方法＞
本発明の生体材料の保存方法は、前述のように、医療用ガスおよび保存液のエアロゾル雰囲気下で、生体材料を保存する保存工程を含むことを特徴とする。本発明の保存方法は、前記保存液のエアロゾル雰囲気下で、前記生体材料を保存することが特徴であり、その他の条件および工程は、特に制限されない。本発明の保存方法は、後述する本発明の保存装置を用いることで、簡便に実施することができる。

本発明において、前記保存液のエアロゾルの雰囲気下とは、「気体中に微細な前記保存液の粒子が浮遊している分散状態」をいう。

本発明の保存方法は、前記保存液のエアロゾル雰囲気下で前記生体材料を保存することで、例えば、保存中の前記生体材料の吸水および脱水を十分抑えることができる。これにより、例えば、保存中の前記生体材料の膨張および収縮を抑制でき、前記生体試料の損傷を低減することができる。

また、本発明の保存方法は、前記医療用ガスの雰囲気下で前記生体材料を保存することで、例えば、前記医療用ガスにより、保存中の前記生体材料の代謝が抑制され、これにより、前記生体材料に含まれる細胞を保護できる。このため、本発明の保存方法によれば、例えば、長期間にわたり、前記生体材料の機能を維持させた状態で保存することができる。また、前記医療用ガスは、保存後の前記生体材料からすぐに揮発するため、例えば、移植した場合、移植後、前記医療用ガスによる副作用が抑制される。

また、本発明の保存方法は、前記保存液のエアロゾル雰囲気下で前記生体材料を保存することで、例えば、前記単純浸漬法等に対して、保存後の前記生体材料の浮腫を抑制することができる。また、本発明の保存方法は、前記保存液のエアロゾル雰囲気下で前記生体材料を保存することで、例えば、前記高圧気相保存法に対して、保存後の前記生体材料の乾燥を抑制することができる。これらのことから、本発明の保存方法によれば、従来の保存方法に比べて、例えば、心臓を保存した場合において、４８時間以上という長期の保存が可能である。

本発明において、前記生体材料の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類動物、ハエ等の非哺乳類動物があげられる。

本発明において、前記生体材料は、特に制限されず、例えば、生体の一部、臓器、細胞等があげられる。前記生体の一部は、特に制限されず、例えば、四肢、指、顔面、骨、筋、毛根、歯、歯根膜等があげられる。前記四肢は、特に制限されず、例えば、上肢、上肢帯、上腕、前腕、手、下肢、下肢帯、大腿、下腿、足等があげられる。前記臓器は、特に制限されず、例えば、眼球、角膜、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胆嚢、食道、胃、小腸、大腸、精巣、卵巣、中枢神経、末梢神経、血管、皮膚等があげられる。前記細胞は、特に制限されず、例えば、精子、卵子、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）細胞、細胞シート、赤血球、白血球、血小板、培養細胞等があげられる。また、前記生体材料は、例えば、前記細胞から培養および／または誘導された生体の一部、臓器、細胞シート、細胞等があげられる。

本発明において、前記保存液は、特に制限されず、例えば、生理的食塩水、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＵＷ）液、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ（ＨＴＫ）液、Ｃｅｌｓｏｉｒ液、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液、細胞外液（輸液）、ＩＧＬ−１液、Ｐｏｌｙｓｏｌ液、Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液等があげられる。前記細胞外液は、特に制限されず、例えば、ラクテックＤ輸液、ヴィーンＦ、ソリューゲンＤ、ソルラクト、ラクトリンゲル等があげられる。

本発明において、前記保存液は、特に制限されず、例えば、前記生体材料の浸透圧より浸透圧が低い、低張液でもよいし、前記生体材料の浸透圧と同じ浸透圧である、等張液でもよいし、前記生体材料の浸透圧より高い浸透圧である、高張液でもよいが、保存工程における前記生体材料への吸水および前記生体材料からの脱水を抑制できることから、好ましくは等張液である。

前記保存液は、その他の成分を含んでもよい。その他の成分は、特に制限されず、例えば、凍結防止剤、グルコース等の糖等があげられる。

本発明において、前記医療用ガスは、特に制限されず、例えば、医療用に製造された任意のガスが使用できる。前記医療用ガスは、例えば、水素、一酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、硫化水素、酸素、オゾン、ヘリウム、キセノン、アルゴン、クリプトン、窒素、亜酸化窒素、空気、メタン、エタン、プロパン、フルオロメタン、ジフルオロメタン、四フッ化炭素、酸化エチレン等があげられる。前記医療用ガスにおいて、爆発の危険性、毒性の危険性および可燃性の危険性が低いことから、前記医療用ガスは、例えば、亜酸化窒素、キセノン、アルゴン、ヘリウム、クリプトン、酸素、二酸化炭素、窒素が好ましい。前記医療用ガスにおいて、前記生体材料のエネルギー消費を抑制し、前記生体材料の機能を維持できることから、前記医療用ガスは、例えば、一酸化炭素、キセノン、硫化水素が好ましい。前記医療用ガスにおいて、前記生体材料の傷害の拡大を抑制でき、前記生体材料の機能を維持できることから、前記医療用ガスは、例えば、一酸化炭素が好ましい。前記医療用ガスにおいて、前記生体材料における細胞の細胞死を抑制でき、前記生体材料の機能を維持できることから、前記医療用ガスは、例えば、一酸化炭素、キセノンが好ましい。前記医療用ガスにおいて、前記生体材料の血管を拡張することで、移植後の前記生体材料における末梢循環が向上し、前記生体材料の生着率を向上できることから、前記医療用ガスは、例えば、一酸化窒素が好ましい。前記医療用ガスにおいて、前記生体材料における活性酸素の発生を抑制し、保存中の前記生体材料の酸化（老化）を抑制できることから、前記医療用ガスは、例えば、水素が好ましい。本発明において、前記医療用ガスは、一種類の医療用ガスを用いてもよいし、二種類以上の医療用ガスを併用してもよい。前記二種類以上の医療用ガスを併用する場合は、例えば、前記二種類以上の医療用ガスを混合した混合ガスとして使用してもよい。

前記混合ガスは、特に制限されず、例えば、一酸化炭素、二酸化炭素、酸素、およびヘリウムを含む混合ガス、酸素および亜酸化窒素を含む混合ガス、酸素およびキセノンを含む混合ガス、酸素およびアルゴンを含む混合ガス、酸素および一酸化窒素を含む混合ガス、酸素および硫化水素を含む混合ガス等があげられる。このように、前記医療用ガスを混合ガスとすることで、例えば、前述の各医療用ガスの効果を相乗的に得ることができる。

前記保存工程において、前記生体材料は、例えば、その一部が、前記雰囲気下にあってもよいし、全体が、前記雰囲気下にあってもよい。前者の場合、例えば、前記雰囲気下にある保存装置内に、前記生体材料を配置する方法があげられる。後者の場合、例えば、前記雰囲気下にある保存装置内に、前記生体材料を吊り下げる方法があげられる。

前記保存工程において、前記保存液のエアロゾルの供給方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記供給方法は、例えば、超音波式、液体噴霧式、ノズル噴霧式、スチーム式、気化式、遠心式およびこれらを組合せた方法等があげられ、供給時の熱の発生による前記生体材料の加熱を抑制できることから、超音波式が好ましい。

前記保存工程において、前記保存液のエアロゾルの粒子径は、特に制限されず、その下限は、例えば、１ｎｍであり、その上限は、例えば、１ｍｍであり、好ましくは１００μｍであり、より好ましくは１０μｍであり、その範囲は、例えば、１ｎｍ〜１ｍｍの範囲であり、好ましくは１ｎｍ〜１００μｍの範囲であり、より好ましくは１ｎｍ〜１０μｍの範囲である。前記保存液のエアロゾルの粒子径は、単位体積あたりの前記保存液のエアロゾルの粒子数を増加させることができ、これにより、例えば、前記生体試料の乾燥による前記生体試料に含まれる細胞の壊死および収縮による傷害を抑制でき、且つ保存中の前記生体試料の温度変化を抑制できることから、１００μｍ以下が好ましい。

前記保存工程において、前記エアロゾルを構成する保存液の濃度（溶質の重量／溶液の重量）は、特に制限されず、その下限は、例えば、３ｇ／ｋｇであり、好ましくは７．８ｇ／ｋｇであり、より好ましくは８ｇ／ｋｇであり、その上限は、例えば、１２ｇ／ｋｇであり、好ましくは９．８ｇ／ｋｇであり、より好ましくは９ｇ／ｋｇであり、その範囲は、例えば、３〜１２ｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは７．８〜１２ｇ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは８〜９．８ｇ／ｋｇの範囲であり、さらに好ましくは８〜９ｇ／ｋｇの範囲である。

前記保存工程において、保存時の温度は、特に制限されず、その下限は、例えば、−２０℃であり、好ましくは−２℃であり、その上限は、例えば、３７℃であり、好ましくは４℃であり、その範囲は、例えば、−２０〜３７℃の範囲であり、好ましくは−２〜４℃の範囲である。

前記保存工程において、保存時の前記医療用ガスの分圧は、特に制限されず、例えば、０．０１〜０．７ＭＰａの範囲であり、好ましくは０．０７〜０．３５ＭＰａの範囲である。前記医療用ガスの分圧は、一種類の前記医療用ガスの分圧でもよいし、二種類以上の前記医療用ガスの合計の分圧でもよい。前記医療用ガスが、一酸化炭素である場合、前記一酸化炭素の分圧は、例えば、０．０１〜０．７ＭＰａの範囲であり、好ましくは０．０７〜０．３５ＭＰａの範囲である。前記医療用ガスが、酸素である場合、前記酸素の分圧は、例えば、０．０１〜０．７ＭＰａの範囲であり、好ましくは０．０７〜０．３５ＭＰａの範囲である。

前記保存工程において、前記生体材料を保存する保存期間は、特に制限されず、前記生体材料の種類によって、適宜決定できる。前記保存期間は、特に制限されず、前記生体材料を生産した時間を基準として、例えば、１年以下であり、好ましくは２４時間以下である。前記生体材料が、前記生体の一部である場合、前記生体の一部を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、１６８時間以下であり、好ましくは７２時間以下である。前記生体材料が、前記臓器である場合、前記臓器を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、１２０時間以下であり、好ましくは２４時間以下である。前記臓器が、前記心臓である場合、前記心臓を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、７２時間以下であり、好ましくは２４時間以下である。前記臓器が、前記肺である場合、前記肺を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、９６時間以下であり、好ましくは４８時間以下である。前記臓器が、前記腎臓である場合、前記腎臓を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、９６時間以下であり、好ましくは４８時間以下である。前記臓器が、前記肝臓である場合、前記肝臓を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、９６時間以下であり、好ましくは４８時間以下である。前記臓器が、角膜である場合、前記角膜を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、１２０時間以下であり、好ましくは７２時間以下である。前記生体材料が、前記細胞である場合、前記細胞を生産した時間を基準として、前記保存期間は、例えば、１年以下であり、好ましくは半年以下であり、より好ましくは３ヶ月以下である。

以下に、本発明の保存方法について、例をあげて説明するが、本発明は、以下の実施形態には制限されない。具体的には、本実施形態は、前記医療用ガスである一酸化炭素と酸素との混合ガス、前記保存液である細胞外液、および前記生体材料である心臓を使用し、前記保存工程において、前記混合ガスおよび前記細胞外液のエアロゾルの雰囲気下に、前記心臓を吊り下げた状態で、所定の保存期間、前記心臓を保存する例である。

まず、心臓を摘出し、前記保存液により前記心臓内の血液を除くことで、保存前の心臓を準備する。つぎに、前記保存前の心臓を、前記混合ガスと超音波式により供給された前記細胞外液のエアロゾルの雰囲気下に、生体材料吊り下げ手段を用いて吊り下げ、暴露させる。そして、この状態で所定の保存期間、前記保存前の心臓を保存する。

前記保存時の前記細胞外液のエアロゾルの粒子径は、例えば、１ｎｍ〜１ｍｍの範囲であり、好ましくは１ｎｍ〜１００μｍの範囲であり、より好ましくは１ｎｍ〜１０μｍの範囲である。

前記保存時の温度は、例えば、−２０〜３７℃の範囲であり、好ましくは−２〜４℃の範囲である。前記保存期間は、例えば、７２時間以下であり、好ましくは２４時間以下である。

このようにして、前記心臓を保存できる。

＜生体材料の生産方法＞
本発明の生体材料の生産方法は、前述のように、生産された生体材料を保存する材料保存工程を含み、前記材料保存工程が、前記本発明の保存方法で実施されることを特徴とする。本発明の生産方法は、前記材料保存工程が、前記本発明の保存方法で実施されることが特徴であり、その他の条件および工程は、特に制限されない。本発明の生産方法によれば、後述する本発明の生体材料を生産できる。なお、本発明の生産方法は、前記本発明の保存方法の説明を援用できる。

前記材料保存工程において、前記生産された生体材料は、特に制限されず、例えば、前記生体材料の例示を援用できる。

前記材料保存工程において、生産された生体材料の提供方法は、特に制限されない。前記生産された生体材料の提供方法は、例えば、外科的手法等の医学的手法により前記生体材料を生産する方法、前記細胞を培養および／または誘導し、前記生体材料とすることで生産する方法、事故または犯罪事件により発生した前記生体材料を回収する方法等があげられる。

前記医学的手法による生産方法は、特に制限されず、前記生産された生体材料に応じて、適宜決定できる。前記医学的手法による生産方法は、例えば、下記参考文献１を参照できる。前記医学的手法によりラット心臓を生産する場合、例えば、下記参考文献２を参照できる。
参考文献１：「臓器移植実験マニュアルラット・マウスを用いた移植、虚血再灌流障害モデル」、(株)秀潤社、監修:野澤眞澄、編集:田中弥生、1999年
参考文献２：Naoyuki Hatayama et．al．，Cell Transplantation，2012，Vol．21，pp．609−615

前記細胞を培養および／または誘導し、生産する方法は、特に制限されず、前記生産された生体材料に応じて、適宜決定できる。

＜生体材料＞
本発明の生体材料は、前述のように、前記本発明の生産方法で生産されたことを特徴とする。本発明の生体材料は、前記本発明の生産方法で生産されたことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の生体材料は、例えば、後述する本発明の移植方法に使用できる。なお、本発明の生体材料は、前記本発明の保存方法および生産方法の説明を援用できる。

本発明の生体材料は、前記保存液のエアロゾル雰囲気下で前記生体材料を保存するため、例えば、前記保存液に浸漬する方法に対して、前記保存後の生体材料に含まれる保存液の量が少ない。また、本発明の生体材料は、前記保存液のエアロゾル雰囲気下で前記生体材料を保存するため、例えば、前記高圧ガス中で保存する方法に対して、前記保存後の生体材料に含まれる保存液の量が多い。

＜移植材料＞
本発明の移植材料は、前述のように、前記本発明の保存方法で保存された生体材料を含むことを特徴とする。本発明の移植材料は、前記本発明の保存方法で保存された生体材料を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の移植材料は、例えば、後述する本発明の移植方法に使用できる。なお、本発明の移植材料は、前記本発明の保存方法、生産方法等の説明を援用できる。

＜移植方法＞
本発明の移植方法は、前述のように、前記本発明の生体材料および前記本発明の移植材料の少なくとも一方（以下、「保存後の生体材料」という。）を、動物に移植する移植工程を含むことを特徴とする。本発明の移植方法は、前記保存後の生体材料を使用することが特徴であり、その他の条件および工程は特に制限されない。なお、本発明の移植方法は、前記本発明の保存方法、生産方法等の説明を援用できる。

前記移植工程において、前記動物は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類動物、ハエ等の非哺乳類動物があげられる。前記移植工程において、前記動物の種類と前記保存後の生体材料の由来とは、同じであってもよいし、異なってもよい。

本発明の移植方法は、さらに前記移植工程に先立って、前記保存後の生体材料を洗浄液により洗浄する洗浄工程を含み、前記移植工程は、前記洗浄後の生体材料を前記動物に移植する工程であってもよい。前記洗浄工程は、前記保存後の生体材料を洗浄液により洗浄することで、例えば、前記保存後の生体材料に含まれる保存液の量を低減する工程である。本発明の移植方法は、前記洗浄工程を含むことで、例えば、前記保存後の生体材料を移植した場合に、移植された動物への保存液による副作用をより一層低減できる。

前記洗浄液は、特に制限されず、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液等があげられる。

前記移植工程おいて、前記保存後の生体材料の移植方法は、特に制限されず、前記保存後の生体材料に応じて、適宜決定できる。前記移植方法は、例えば、前記参考文献１を参照できる。前記保存後の生体材料が、保存後のラットの心臓である場合、例えば、前記参考文献２を参照できる。

＜生体材料の保存装置＞
本発明の生体材料の保存装置は、前述のように、保存室、エアロゾル供給手段および医療用ガス供給手段を含み、前記エアロゾル供給手段により、前記保存室内に保存液のエアロゾルが供給され、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内に医療用ガスが供給されることを特徴とする。本発明の保存装置は、前記エアロゾル供給手段を含み、これにより前記保存室内に保存液のエアロゾルが供給されることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の保存装置によれば、例えば、前記本発明の保存方法等を簡便に行うことができる。なお、本発明の保存装置は、前記本発明の保存方法、生産方法等の説明を援用できる。

以下、本発明の保存装置について、図面を参照して、例を挙げて詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の例に限定および制限されない。また、図面においては、説明の便宜上、各部の構造は適宜簡略化して示す場合があり、各部の寸法比等は、実際とは異なり、模式的に示す場合がある。

（実施形態１）
図１は、本実施形態の保存装置の透視斜視図である。図１において、実線は、本実施形態の各部の外側形状を表し、破線は、保存室１および医療用ガス供給手段３の保存室１内側の形状を示す。図１に示すように、本実施形態の保存装置１０は、保存室１、エアロゾル供給手段２および医療用ガス供給手段３を主要な構成として含む。保存室１は、保存容器４および蓋５を含み、蓋５は、保存容器４の上部に着脱可能に設置されている。図１に示すように、本実施形態において、エアロゾル供給手段２は、保存室１内に設置され、医療用ガス供給手段３は、保存室１内に医療用ガスを供給可能なように蓋５に接続されている。なお、エアロゾル供給手段２から出ている雲状の記載は、エアロゾル供給手段２から前記保存液のエアロゾルが供給されている状態を模式的に示したものであり、本発明を何ら制限しない。

保存室１は、本実施形態の保存容器４および蓋５のように、着脱可能な分離型の形態でもよいし、保存容器４に開閉可能な扉が設置された一体型の形態でもよいが、耐圧性および密閉性を向上できることから、前者が好ましい。保存室１の容積は、特に制限されず、保存する前記生体材料の大きさに応じ、適宜決定できる。保存室１の材質は、特に制限されず、例えば、保存室１内の前記医療用ガスの分圧に応じて、適宜決定できる。保存室１の材質は、例えば、耐圧性の材質があげられる。

エアロゾル供給手段２は、例えば、保存室１内に前記保存液のエアロゾルを供給する。エアロゾル供給手段２は、特に制限されず、例えば、保存室１内に設置されるエアロゾル発生装置であってもよいし、保存室１外に設置されるエアロゾル発生装置と保存室１とを接続する保存室１に形成されたエアロゾル供給用接続部であってもよい。後者の場合、前記エアロゾル発生装置と前記エアロゾル供給用接続部とは、一体として形成されていてもよいし、着脱可能に形成されていてもよい。また、前記エアロゾル供給用接続部は、保存室１に前記保存液のエアロゾルを供給可能に接続されていればよく、例えば、保存容器４に接続されていてもよいし、蓋５に接続されていてもよい。前記エアロゾル発生装置は、例えば、超音波式、液体噴霧式、ノズル噴霧式、スチーム式、気化式、遠心式およびこれらを組合せた方法のエアロゾル発生装置があげられ、供給時の熱の発生による前記生体材料の加熱を抑制できることから、超音波式のエアロゾル発生装置が好ましい。前記超音波式のエアロゾル発生装置は、特に制限されず、例えば、超音波振動子を前記保存液に浸漬した装置等があげられる。

医療用ガス供給手段３は、例えば、保存室１内に医療用ガスを供給する。医療用ガス供給手段３は、特に制限されず、保存室１内に設置される医療用ガス供給装置であってもよいし、保存室１外に設置される医療用ガス供給装置と保存室１とを接続する保存室１に形成された医療用ガス供給用接続部であってもよい。後者の場合、前記医療用ガス供給装置と前記医療用ガス供給用接続部とは、一体として形成されていてもよいし、着脱可能に形成されていてもよい。本実施形態において、医療用ガス供給手段３は、蓋５に接続されているが、これに制限されない。医療用ガス供給手段３は、保存室１内に前記医療用ガスを供給可能に接続されていればよく、例えば、保存容器４に接続されていてもよい。前記医療用ガス供給装置は、特に制限されず、例えば、医療用ガスボンベ、固相ガス、液相ガス、ガスハイドレード等があげられる。

本実施形態において、前記生体材料を保存する領域は、特に制限されず、保存室１内の任意の場所で保存できる。前記生体材料は、例えば、保存容器４内の底面に配置し、保存することができる。

（実施形態２）
本実施形態の保存装置は、さらに、生体材料吊り下げ手段６および圧力制御手段７を含む。図２は、本実施形態の保存装置の透視斜視図である。図２において、実線は、本実施形態の各部の外側形状を表し、破線は、保存室１ならびに医療用ガス供給手段３および圧力制御手段７の保存室１内側の形状を示し図１と同一部分には、同一の符号を付している。図２に示すように、本実施形態の保存装置２０は、さらに生体材料吊り下げ手段６および圧力制御手段７を含み、生体材料吊り下げ手段６は、保存室１内に設置され、圧力制御手段７は、保存室１内の圧力を制御可能に蓋５に接続されている。本実施形態において、保存装置２０は、生体材料吊り下げ手段６および圧力制御手段７を含むが、保存装置２０は、これに限定されず、生体材料吊り下げ手段６および圧力制御手段７のいずれか一方のみを含んでもよい。この点を除いて、本実施形態の保存装置２０は、図１に示す保存装置１０と同様の構成を有する。本実施形態の保存装置２０は、生体材料吊り下げ手段６を備えることで、例えば、保存時の前記生体材料と、保存室１内の医療用ガスおよび保存液のエアロゾルとの接触面積を増加させることができる。このため、本実施形態の保存装置２０によれば、例えば、保存中の前記生体材料の吸水および脱水による損傷を低減することができ、これにより前記生体材料を、より長期間にわたり、機能を維持させた状態で保存できる。また、本実施形態の保存装置２０は、圧力制御手段７を備えることで、例えば、保存中の保存室１内の圧力を一定に制御することができる。このため、保存中の前記生体材料の圧力の変動による損傷を低減することができ、これにより前記生体材料を、より長期間にわたり、機能を維持させた状態で保存できる。

生体材料吊り下げ手段６は、例えば、保存室１内に、前記生体材料を吊り下げる。生体材料吊り下げ手段６に、前記生体材料を吊り下げる方法は、特に制限されず、例えば、前記生体材料を直接的に吊り下げてもよいし、間接的に吊り下げてもよい。後者の場合、例えば、ネット、試料用メッシュ容器、医療用糸、メッシュネット等を用い、前記ネット等を介して、前記生体材料を生体材料吊り下げ手段６に吊り下げる方法があげられる。生体材料吊り下げ手段６は、前記生体材料を吊り下げられればよく、公知の吊り下げ器具を使用することができる。生体材料吊り下げ手段６は、特に制限されず、例えば、フック等があげられる。

圧力制御手段７は、例えば、保存室１内の圧力を調整する。圧力制御手段７は、特に制限されず、例えば、背圧弁、減圧弁、制御弁、安全弁、圧力制御弁、逆止弁、遮断弁、流路変更弁、流量調整弁、リーク弁等があげられる。本実施形態において、圧力制御手段７は、蓋５に接続されているが、これに制限されない。圧力制御手段７は、保存室１内の圧力を制御可能に接続されていればよく、例えば、保存容器４に接続されていてもよい。

本発明の保存装置は、さらに、エアロゾル供給制御手段を備え、前記エアロゾル供給制御手段により、エアロゾル供給手段２のエアロゾル供給量および供給時間の少なくとも一方を制御してもよい。前記エアロゾル供給制御手段は、特に制限されず、例えば、タイマー、電源スイッチ、コントローラー等があげられる。

本発明の保存装置は、さらに、保冷手段を備え、前記保冷手段により、保存室１を保冷してもよい。前記保冷手段は、保冷室１を所定温度に保冷できればよく、保冷方法は特に制限されない。前記保冷方法は、例えば、保冷庫内に前記保存室１を配置する方法、冷媒に保冷室１を浸漬する方法等があげられる。前記保冷庫は、特に制限されず、例えば、冷蔵庫等があげられる。前記所定温度は、例えば、前述の保存時の温度があげられる。

本発明の保存装置は、この他に、保存室１内を観察できる観察窓、保存室１内の圧力を検出する圧力検出手段等を備えてもよい。

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。

［実施例１］
一酸化炭素および酸素の混合ガス、ならびに細胞外液のエアロゾルの雰囲気下で、ラットの心臓を４８時間保存し、保存後の心臓が機能することを確認した。

（１）保存用のラット心臓の調製
６週齢のＬＥＷ／ＳｓＮＳｌｃ雄ラット（ｎ＝５）に、５０ｍｇ／ｋｇ（薬剤／体重）となるようペントバルビタール（共立製薬社製）を投与し、深麻酔を行った。つぎに、前記ラットから心臓を摘出した。さらに、前記心臓の大動脈および肺動脈を切開後、保存液である５％グルコースを含む細胞外液（商品名：ラクテックＤ輸液、大塚製薬社製）を注入して血液を除き、これを保存前の心臓とした。そして、前記保存前の心臓の重量を測定した。

（２）ラット心臓の保存
保存装置は、前記図２の保存装置を用いた。前記保存装置は、予め前記エアロゾル供給手段により前記保存室内に前記保存液のエアロゾルを供給し、且つ４℃の冷蔵庫内で保冷した。つぎに、前記保存前の心臓を前記保存容器内の前記生体材料吊り下げ手段に吊り下げた。さらに、前記保存容器を前記蓋により密閉し、前記４℃の冷蔵庫内で４８時間保存した。また、前記保存中は、前記エアロゾル供給手段により前記保存室内にエアロゾルを供給し、且つ、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧（ＰＣＯ）が、０．１５ＭＰａ、酸素の分圧（ＰＯ_２）が、０．２ＭＰａとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、１００％であった。

（３）保存後の心臓の機能
前記４８時間保存後の心臓を、前記保存容器内の前記生体材料吊り下げ手段から回収し、重量を測定した。そして、前記保存後の心臓について、心機能測定装置（ランゲンドルフ灌流装置、バイオリサーチセンター社製）を用いて、左室圧（ＬＶＰ）を測定した。また、比較例１〜８は、図３および後述する条件において、前記保存前の心臓を、前記４℃の冷蔵庫内で４８時間保存した以外は同様にして、重量および左室圧を測定した。さらに、コントロールとして、前記保存前の心臓を用いた以外は同様にして、左室圧を測定した。

（比較例１）
図３（Ａ）に示すように、比較例１（ｎ＝１２）は、前記保存装置において、前記エアロゾル供給手段に代えて、５０ｍＬの水（ＤＷ）が入ったフラスコを前記保存室内に設置した。また、比較例１は、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧が、０．４ＭＰａ、酸素の分圧が、０．３ＭＰａとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、９６．３％であった。

（比較例２）
図３（Ｂ）に示すように、比較例２（ｎ＝５）は、前記保存装置において、前記エアロゾル供給手段を設置しなかった。また、比較例２は、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧が、０．４ＭＰａ、酸素の分圧が、０．３ＭＰａとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、６１％であった。

（比較例３）
図３（Ｃ）に示すように、比較例３（ｎ＝６）は、前記保存装置において、前記エアロゾル供給手段に代えて、５０ｍＬの水が入ったフラスコを前記保存室内に設置した。また、比較例３は、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧が、０．０５７１ＭＰａ、酸素の分圧が、０．０４２９ＭＰａとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、９６．３３％であった。

（比較例４）
図３（Ｄ）に示すように、比較例４（ｎ＝５）は、前記保存装置において、前記エアロゾル供給手段に代えて、５０ｍＬの水が入ったフラスコを前記保存室内に設置した。また、比較例４は、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の空気の分圧（ＰＡｉｒ）が、０．１ＭＰａとなるように空気を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、９６．１７％であった。

（比較例５）
図３（Ｅ）に示すように、比較例５（ｎ＝５）は、前記保存装置において、前記エアロゾル供給手段および前記生体材料吊り下げ手段に代えて、５０ｍＬのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＵＷ）液が入ったフラスコを前記保存室内に設置した。また、比較例５は、前記フラスコ内のＵＷ液に前記保存前の心臓を浸漬し、さらに、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の空気の分圧が、０．１ＭＰａとなるように空気を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、９６．３３％であった。

（比較例６）
図３（Ｆ）に示すように、比較例６（ｎ＝５）は、前記保存装置を用いず、また、予め４℃で５分間一酸化炭素ガスを用いて泡立てることにより、一酸化炭素を溶解させた５０ｍＬのＵＷ液（ＵＷｗｉｔｈＣＯ）が入ったフラスコを前記冷蔵庫内に設置した。そして、比較例６は、前記フラスコ内のＵＷ液に前記保存前の心臓を浸漬し、０．１ＭＰａの大気圧下で静置した。

（比較例７）
図３（Ｇ）に示すように、比較例７（ｎ＝６）は、前記保存装置において、前記エアロゾル供給手段および前記生体材料吊り下げ手段に代えて、５０ｍＬのＵＷ液が入ったフラスコを前記保存室内に設置した。また、比較例７は、前記フラスコ内のＵＷ液に前記保存前の心臓を浸漬し、さらに、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧が、０．４ＭＰａ、酸素の分圧が、０．３ＭＰａとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、９６．２％であった。

（比較例８）
図３（Ｈ）に示すように、比較例８（ｎ＝５）は、前記保存装置において、前記エアロゾル供給手段および前記生体材料吊り下げ手段に代えて、５０ｍＬの前記５％グルコースを含む細胞外液（ＥＦ）が入ったフラスコを前記保存室内に設置した。また、比較例８は、前記フラスコ内に前記保存前の心臓を浸漬し、さらに、前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内の空気の分圧が、０．１ＭＰａとなるように空気を供給した。また、保存中の前記保存室内の湿度は、１００％であった。

実施例および比較例１〜８の保存前後の心臓の重量を、下記表１に示す。

前記表１に示すように、前記比較例１〜８では、前記保存後の心臓の重量が、前記保存前の心臓の重量に対し、１０％以上変化していた。具体的には、比較例１〜７では、保存中に前記心臓が１０％以上脱水しており、比較例８では、保存中に前記心臓が１０％以上吸水していた。これに対し、前記実施例では、前記保存後の心臓の重量が、前記保存前の心臓の重量に対し、５％未満の変化に抑制され、保存中に前記心臓が、ほとんど脱水および吸水していなかった。

つぎに、実施例、比較例１〜８およびコントロールの前記保存後の心臓の左室圧を下記表２に示す。

前記表２に示すように、前記比較例１〜８では、前記保存後の心臓の左室圧は、コントロール（保存前の心臓）の左室圧に対して低下していた。特に、比較例２、３および５〜７は、コントロールの左室圧に対して、顕著に左室圧が低下し、さらに、比較例４および比較例８では、左室圧が観察されなかった。これに対し、実施例では、前記保存後の心臓の左室圧は、コントロールと同等の左室圧であった。これらの結果から、比較例１〜７は、保存中に前記心臓が脱水することで乾燥および収縮し、乾燥による前記心臓の細胞の壊死および収縮による傷害が発生し、保存後の心臓の機能が低下または喪失することがわかった。また、比較例８は、保存中に前記心臓が吸水することで膨張し、これにより浮腫による傷害が発生し、保存後の心臓の機能が低下することがわかった。これに対し、本発明の保存方法は、保存中に前記心臓が、ほとんど吸水および脱水せず、膨張および収縮しないため、傷害が抑制され、これにより保存後の心臓においても、保存前の心臓と同等の機能が維持されることがわかった。

本発明の保存方法によれば、生体材料を長期間保存することができる。このため、本発明は、臨床医療および臨床研究分野等において極めて有用である。

１保存室
２エアロゾル供給手段
３医療用ガス供給手段
４保存容器
５蓋
６生体材料吊り下げ手段
７圧力制御手段
１０、２０保存装置

Claims

医療用ガスおよび保存液のエアロゾル雰囲気下で、血管を除く生体材料を保存する保存工程を含むことを特徴とする、生体材料の保存方法。
前記保存液が、生理的食塩水、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＵＷ）液、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ（ＨＴＫ）液、Ｃｅｌｓｏｉｒ液、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液、細胞外液（輸液）、ＩＧＬ−１液、Ｐｏｌｙｓｏｌ液およびＥｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液からなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項１記載の保存方法。
前記保存液のエアロゾルが、超音波式、液体噴霧式、ノズル噴霧式、スチーム式、気化式および遠心式からなる群から選択された少なくとも１つの方法により供給されたエアロゾルを含む、請求項１または２記載の保存方法。
前記医療用ガスが、水素、一酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、硫化水素、酸素、オゾン、ヘリウム、キセノン、アルゴン、クリプトン、窒素、亜酸化窒素、空気、メタン、エタン、プロパン、フルオロメタン、ジフルオロメタン、四フッ化炭素および酸化エチレンからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の保存方法。
前記医療用ガスが、一酸化炭素、二酸化炭素、酸素、およびヘリウムを含む混合ガス、酸素および亜酸化窒素を含む混合ガス、酸素およびキセノンを含む混合ガス、酸素およびアルゴンを含む混合ガス、酸素および一酸化窒素を含む混合ガス、または酸素および硫化水素を含む混合ガスである、請求項１から４のいずれか一項に記載の保存方法。
前記医療用ガスの分圧が、０．０１〜０．７ＭＰａの範囲である、請求項１から５記載の保存方法。
前記一酸化炭素の分圧が、０．０１〜０．７ＭＰａの範囲である、請求項４または５記載の保存方法。
前記酸素の分圧が、０．０１〜０．７ＭＰａの範囲である、請求項４または５記載の保存方法。
前記生体材料が、生体の一部、臓器、および細胞からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１から８のいずれか一項に記載の保存方法。
前記生体の一部が、四肢、指、顔面、骨、筋、毛根、歯および歯根膜からなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項９記載の保存方法。
前記臓器が、眼球、角膜、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胆嚢、食道、胃、小腸、大腸、精巣、卵巣、中枢神経、末梢神経および皮膚からなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項９記載の保存方法。
前記細胞が、精子、卵子、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）細胞、細胞シート、赤血球、白血球、血小板および培養細胞からなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項９記載の保存方法。
生産された生体材料を保存する材料保存工程を含み、
前記材料保存工程が、請求項１から１２のいずれか一項に記載の保存方法で実施されることを特徴とする、生体材料の生産方法。
生体材料を保存する保存工程と、
保存された生体材料を、非ヒト動物に移植する移植工程とを含み、
前記保存工程が、請求項１から１２のいずれか一項に記載の保存方法で実施されることを特徴とする、移植方法。
保存室、エアロゾル供給手段および医療用ガス供給手段を含み、
前記エアロゾル供給手段により、前記保存室の内部空間に保存液のエアロゾルが供給され、
前記医療用ガス供給手段により、前記保存室内に医療用ガスが供給されることを特徴とする、生体材料の保存装置。
前記エアロゾル供給手段が、超音波式、液体噴霧式、ノズル噴霧式、スチーム式、気化式および遠心式からなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項１５記載の保存装置。
さらに、生体材料吊り下げ手段を含み、
前記生体材料吊り下げ手段は、前記保存室内に配置され、
前記生体材料吊り下げ手段により、生体材料が、前記保存室内に吊り下げられる、請求項１５または１６記載の保存装置。
前記エアロゾル供給手段が、前記保存室内に配置されている、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の保存装置。
さらに、エアロゾル供給制御手段を含み、
前記エアロゾル供給制御手段により、前記エアロゾル供給手段のエアロゾル供給量および供給時間の少なくとも一方が制御される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の保存装置。
さらに、圧力制御手段を含み、
前記圧力制御手段により、前記保存室内の圧力が制御される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の保存装置。
さらに、保冷手段を含み、
前記保冷手段により、前記保存室が保冷される、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の保存装置。