JP6253050B2 - Cancer cell adsorption membrane, cancer cell adsorption device, method for producing cancer cell adsorption device, and cancer cell removal apparatus - Google Patents
Cancer cell adsorption membrane, cancer cell adsorption device, method for producing cancer cell adsorption device, and cancer cell removal apparatus Download PDFInfo
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Description
本発明は、癌細胞吸着膜、癌細胞吸着デバイス、癌細胞吸着デバイスの作成方法及び癌細胞除去装置に関するものである。 The present invention relates to a cancer cell adsorption film, a cancer cell adsorption device, a method for producing a cancer cell adsorption device, and a cancer cell removal apparatus.
近年、ナノ粒子を構成因子とするナノデバイスを構築するため、ナノ粒子を所望の態様で配列させる研究や、タンパク質の配列方法が開発されている。
例えば、φ１０ｎｍ程度の球状タンパク質であるフェリチンを基板上に並べ、この内部に酸化鉄を生成させたのち、前記タンパク質を燃焼除去することでＦｅナノ粒子のドット配列を形成させる方法が開示されている（特許文献１、２）。
ここでは、タンパク質を基板上に並べる工程が重要なステップとされている。
In recent years, in order to construct nanodevices using nanoparticles as constituent factors, research for arranging nanoparticles in a desired manner and methods for arranging proteins have been developed.
For example, a method is disclosed in which ferritin, which is a spherical protein of about φ10 nm, is arranged on a substrate, iron oxide is generated therein, and then the protein is burned off to form a dot array of Fe nanoparticles. (Patent Documents 1 and 2).
Here, the process of arranging proteins on a substrate is an important step.
タンパク質と同様に、ウイルスを基板上に固定することにより、新たな生体応用デバイスを構築できる可能性がある。
高分子多層膜の膜間に荷電ウイルスを挟みこんだ研究が開示されている（非特許文献１）。高分子多層膜は、Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（ＬｂＬ法）により作成されている（非特許文献１、２）。
Like proteins, it is possible to construct a new biological application device by immobilizing a virus on a substrate.
A study in which a charged virus is sandwiched between films of a polymer multilayer film is disclosed (Non-patent Document 1). The polymer multilayer film is prepared by the Layer-by-Layer Assembly method (LbL method) (Non-patent Documents 1 and 2).
しかし、ここで開示されたデバイスは、半導体デバイスへの応用に向けた無機粒子の創製が主な目的となっており、生体応用デバイスへの応用や利用は検討されていない。そのため、下地膜となるＬｂＬ膜を構成する高分子は生体適合性を有さない。細胞培養又は生体応用可能なデバイスを構築した場合に、拒絶反応や免疫反応を生じさせるおそれがある。また、利用されたウイルスが植物に感染するものであり、動物細胞に対しウイルス自体が有する活性を発現せず、有効な細胞培養又は生体応用デバイスとならないという課題があった。 However, the device disclosed here is mainly intended for the creation of inorganic particles for application to semiconductor devices, and its application and use to biological application devices have not been studied. Therefore, the polymer constituting the LbL film serving as the base film does not have biocompatibility. When a device that can be applied to cell culture or biological application is constructed, there is a risk of causing a rejection reaction or an immune reaction. Moreover, the utilized virus infects plants, and the activity of the virus itself is not expressed against animal cells, resulting in a problem that it cannot be an effective cell culture or biological application device.
ＨＶＪ−Ｅは、生理活性を有する代表的なウイルスである。 HVJ-E is a typical virus having physiological activity.
ＨＶＪ−Ｅを、マウスに形成した大腸癌に注入することにより、注入後３週間で癌細胞がほとんど消滅したとの報告がある（非特許文献３〜５）。ＨＶＪ−Ｅレセプター（受容体）を発現した癌細胞は、ＨＶＪ−Ｅのみで細胞死が誘導される。この細胞死誘導のメカニズムは、ウイルスＲＮＡゲノム断片が、細胞内核酸受容体によって認識されて、活性化されるシグナルによる癌細胞選択的な細胞死誘導によるメカニズムである。しかし、癌細胞によっては、また別のシグナル径路が働いて、結果的には癌細胞選択的な細胞死誘導が起こる。一方、正常細胞も受容体を発現しているが、細胞死は誘導されない。 There are reports that HVJ-E was injected into colorectal cancer formed in mice, and cancer cells almost disappeared 3 weeks after the injection (Non-Patent Documents 3 to 5). Cancer cells expressing HVJ-E receptor (receptor) induce cell death only with HVJ-E. This mechanism of cell death induction is a mechanism of cancer cell selective cell death induction by a signal in which a viral RNA genome fragment is recognized and activated by an intracellular nucleic acid receptor. However, depending on the cancer cell, another signal pathway works, resulting in cancer cell selective cell death induction. On the other hand, normal cells also express the receptor, but cell death is not induced.
癌細胞のＨＶＪ−Ｅレセプターに吸着したＨＶＪ−Ｅは癌細胞の細胞死を誘導するが、ＨＶＪ−Ｅレセプターのない癌細胞に対しては、細胞死（アポトーシス）を誘導しない。つまり、癌細胞がＨＶＪ−Ｅレセプターを発現するかしないか、ＨＶＪ−Ｅレセプターを有するか有さないかが、抗癌作用を活性化するかしないかを決定し、その癌細胞が選択的に細胞死へ誘導するか否かを決定する。 HVJ-E adsorbed to the HVJ-E receptor of cancer cells induces cell death of cancer cells, but does not induce cell death (apoptosis) against cancer cells without HVJ-E receptor. That is, it is determined whether a cancer cell expresses HVJ-E receptor, has HVJ-E receptor, or does not activate anticancer action, and the cancer cell is selectively selected as a cell. Decide whether to induce death.
しかし、ＨＶＪ−Ｅを初めとして、高分子積層膜上に生理活性を有するウイルスを固定した例は報告されていなかった。 However, no examples have been reported in which a virus having physiological activity is immobilized on a polymer laminated film such as HVJ-E.
本発明は、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させるといった生理活性能を有するウイルスを固定した癌細胞吸着膜、癌細胞吸着デバイス、癌細胞吸着デバイスの作成方法及び癌細胞除去装置を提供することを課題とする。 The present invention relates to a cancer cell adsorption membrane, a cancer cell adsorption device, which can adsorb and remove cancer cells, selectively kill the cancer cells, or immobilize a virus having a physiological activity such as activating cells of the immune system, It is an object of the present invention to provide a method for producing a cancer cell adsorption device and a cancer cell removal device.
本発明者は、上記事情を鑑みて、試行錯誤を繰り返すことにより、異なる電荷で荷電した高分子を交互に積層した高分子膜を用いれば、その膜上に多数の癌細胞吸着ウイルスを固定させることができ、癌細胞吸着ウイルスに癌細胞を吸着させることにより、癌細胞吸着膜として用いることができ、これを用いることにより、癌細胞吸着デバイス及び癌細胞除去装置を提供できることを見出した。
具体的には、癌細胞吸着ウイルスであるＨＶＪ−Ｅを高密度に配列・固定した面を形成し、レセプターを備えた癌細胞を含む血液を、前記面上を流通させることにより、前記面に固定されたＨＶＪ−Ｅで、血液中から癌細胞を吸着・除去できる可能性を見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下の構成を有する。
In view of the above circumstances, the present inventor fixes a number of cancer cell-adsorbing viruses on the membrane by repeating trial and error and using a polymer membrane in which polymers charged with different charges are alternately stacked. It was found that by adsorbing cancer cells to a cancer cell-adsorbing virus, it can be used as a cancer cell-adsorbing membrane, and by using this, a cancer cell-adsorbing device and a cancer cell removing device can be provided.
Specifically, a surface on which HVJ-E, which is a cancer cell-adsorbing virus, is arranged and fixed at a high density is formed, and blood containing cancer cells provided with a receptor is circulated on the surface to thereby form the surface. The possibility of adsorbing and removing cancer cells from the blood with the fixed HVJ-E was found, and the present invention was completed.
The present invention has the following configuration.
（１）２種以上の生体適合性高分子が積層された高分子積層膜と、前記高分子積層膜の一面に固定され、生理活性を具備した癌細胞吸着ウイルスと、を有することを特徴とする癌細胞吸着膜。 (1) A polymer laminated film in which two or more kinds of biocompatible polymers are laminated, and a cancer cell-adsorbing virus fixed on one surface of the polymer laminated film and having physiological activity, Cancer cell adsorption membrane.
（２）前記高分子積層膜が、正電荷を有する生体適合性高分子の膜と、負電荷を有する生体適合性高分子の膜とが交互に積層されていることを特徴とする（１）に記載の癌細胞吸着膜。
（３）前記正電荷を有する生体適合性高分子が、ポリ−Ｌ−リシン、キトサン、グリコールキトサン、ポリアルギニンの群から選択されるいずれか一の高分子であることを特徴とする（２）に記載の癌細胞吸着膜。
（４）前記負電荷を有する生体適合性高分子が、アルギン酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸の群から選択されるいずれか一の高分子であることを特徴とする生体適合性高分子であることを特徴とする（２）又は（３）に記載の癌細胞吸着膜。
(2) The polymer laminated film is characterized in that a biocompatible polymer film having a positive charge and a biocompatible polymer film having a negative charge are alternately laminated (1) The cancer cell-adsorbing membrane according to 1.
(3) The biocompatible polymer having a positive charge is any one polymer selected from the group consisting of poly-L-lysine, chitosan, glycol chitosan, and polyarginine (2) The cancer cell-adsorbing membrane according to 1.
(4) The biocompatible polymer having a negative charge is any one selected from the group consisting of alginic acid, hyaluronic acid, and dextran sulfate. The cancer cell-adsorbing membrane according to (2) or (3), which is characterized.
（５）前記高分子積層膜の層数が、４層以上であることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかに記載の癌細胞吸着膜。
（６）前記癌細胞吸着ウイルスが、空間部を覆うエンベロープ膜と、前記空間部内に離散されたＲＮＡ断片と、前記エンベロープ膜の外膜面に林立するように形成されたタンパク質と、を有しており、前記タンパク質が、癌細胞のレセプターの吸着可能な第１のタンパク質を有することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の癌細胞吸着膜。
(5) The cancer cell-adsorbing film according to any one of (2) to (4), wherein the number of layers of the polymer laminated film is 4 or more.
(6) The cancer cell-adsorbing virus has an envelope membrane covering the space portion, an RNA fragment discrete in the space portion, and a protein formed to stand on the outer membrane surface of the envelope membrane. The cancer cell-adsorbing membrane according to any one of (1) to (5), wherein the protein has a first protein capable of adsorbing a receptor of a cancer cell.
（７）前記第１のタンパク質がＨＮタンパク質であり、前記エンベロープ膜が脂質二分子膜であることを特徴とする（６）に記載の癌細胞吸着膜。
（８）前記癌細胞吸着ウイルスが、不活性化センダイウイルス（ＨＶＪ−Ｅ）であることを特徴とする（７）に記載の癌細胞吸着膜。
(7) The cancer cell-adsorbing membrane according to (6), wherein the first protein is an HN protein and the envelope membrane is a lipid bilayer membrane.
(8) The cancer cell-adsorbing membrane according to (7), wherein the cancer cell-adsorbing virus is an inactivated Sendai virus (HVJ-E).
（９）基材と、前記基材の一面に形成された膜とを有し、前記膜が（１）〜（８）のいずれかに記載の癌細胞吸着膜であることを特徴とする癌細胞吸着デバイス。
（１０）Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（ＬＢＬ法）を用いた高分子積層膜作成工程と、湿式成膜法を用いた癌細胞吸着ウイルス固定工程とを有することを特徴とする癌細胞吸着デバイスの作成方法。
（１１）癌細胞吸着ウイルス固定工程が、癌細胞吸着ウイルス濃度を１２０ＨＡＵ／ｍＬ以上とした分散溶液に高分子積層膜を浸漬してから、引き上げ・乾燥して、前記高分子積層膜の一面に癌細胞吸着ウイルスを固定する工程であることを特徴とする（１０）に記載の癌細胞吸着デバイスの作成方法。
(9) A cancer comprising a substrate and a film formed on one surface of the substrate, wherein the film is the cancer cell-adsorbing film according to any one of (1) to (8). Cell adsorption device.
(10) A cancer cell adsorption device comprising a polymer laminated film preparation step using a Layer-by-Layer Assembly method (LBL method) and a cancer cell adsorption virus fixing step using a wet film formation method How to create
(11) In the cancer cell-adsorbing virus fixing step, the polymer laminated film is immersed in a dispersion solution having a cancer cell-adsorbing virus concentration of 120 HAU / mL or more, and then pulled up and dried to form one surface of the polymer laminated film. The method for producing a cancer cell adsorption device according to (10), which is a step of fixing a cancer cell adsorption virus.
（１２）液導入開口部と、液排出開口部と、前記２つの開口部に連通され、液の流路となる空間部を有し、前記空間部内に、（１）〜（８）のいずれかに記載の癌細胞吸着膜が形成されていることを特徴とする癌細胞除去装置。 (12) A liquid introduction opening, a liquid discharge opening, and a space that is communicated with the two openings and serves as a liquid flow path, and any one of (1) to (8) is provided in the space. A cancer cell removing device, wherein the cancer cell adsorbing film according to claim 1 is formed.
本発明の癌細胞吸着膜は、２種以上の生体適合性高分子が積層された高分子積層膜と、前記高分子積層膜の一面に固定され、生理活性を具備した癌細胞吸着ウイルスと、を有する構成なので、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有する癌細胞吸着ウイルスを固定した膜とすることができる。 The cancer cell-adsorbing membrane of the present invention includes a polymer laminated membrane in which two or more kinds of biocompatible polymers are laminated, a cancer cell-adsorbing virus fixed on one surface of the polymer laminated membrane and having physiological activity, Therefore, the cancer cells can be adsorbed / removed, and the cancer cells can be selectively killed, or can be formed as a membrane on which a cancer cell-adsorbing virus having physiological activity to activate cells of the immune system is fixed.
本発明の癌細胞吸着デバイスは、基材と、前記基材の一面に形成された膜とを有し、前記膜が先に記載の癌細胞吸着膜である構成なので、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有するようにできる。 The cancer cell adsorption device of the present invention has a base material and a film formed on one surface of the base material, and the film is the cancer cell adsorption film described above, so that cancer cells are adsorbed and removed. It can have a physiological activity to selectively kill cancer cells or to activate cells of the immune system.
本発明の癌細胞吸着デバイスの作成方法は、Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（ＬｂＬ法）を用いた高分子積層膜作成工程と、湿式成膜法を用いた癌細胞吸着ウイルス固定工程とを有する構成なので、癌細胞吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有する癌細胞吸着デバイスを容易に、かつ、短時間で作成できる。 The method for producing a cancer cell adsorption device of the present invention comprises a polymer laminated film production step using a Layer-by-Layer Assembly method (LbL method) and a cancer cell adsorption virus immobilization step using a wet film formation method. With this configuration, cancer cell adsorption devices that can adsorb and remove cancer cells, selectively kill cancer cells, or have physiological activity to activate cells of the immune system can be easily produced in a short time.
本発明の癌細胞除去装置は、液導入開口部と、液排出開口部と、前記２つの開口部に連通され、液の流路となる空間部を有し、前記空間部内に、先に記載の癌細胞吸着膜が形成されている構成なので、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有するようにできる。 The cancer cell removal device of the present invention has a liquid introduction opening, a liquid discharge opening, and a space that is communicated with the two openings and serves as a liquid flow path. Therefore, the cancer cells can be adsorbed / removed to selectively kill the cancer cells or have a physiological activity to activate the cells of the immune system.
（本発明の第１の実施形態）
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である癌細胞吸着膜、癌細胞吸着デバイス、癌細胞吸着デバイスの作成方法及び癌細胞除去装置について説明する。
(First embodiment of the present invention)
Hereinafter, a cancer cell adsorption film, a cancer cell adsorption device, a method for producing a cancer cell adsorption device, and a cancer cell removal apparatus according to embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
＜癌細胞除去装置＞
図１は、本発明の第１の実施形態である癌細胞除去装置の一例を示す模式図であって、正面図（ａ）と、（ａ）におけるＡ−Ａ’線における断面図（ｂ）である。
図１に示すように、本発明の実施形態である癌細胞除去装置５１は、液導入開口部５１ａと、液排出開口部５１ｂと、前記２つの開口部に連通され、液の流路となる空間部３５ｃと、空間部３５ｃ内に配置した癌細胞吸着デバイス４１とからなる。
前記液としては、血液を用いることができる。
<Cancer cell removal device>
Drawing 1 is a mimetic diagram showing an example of a cancer cell removal device which is the 1st embodiment of the present invention, and is a front view (a) and a sectional view in an AA 'line in (a) (b). It is.
As shown in FIG. 1, a cancer cell removing apparatus 51 according to an embodiment of the present invention communicates with a liquid introduction opening 51a, a liquid discharge opening 51b, and the two openings to form a liquid flow path. It consists of the space part 35c and the cancer cell adsorption | suction device 41 arrange | positioned in the space part 35c.
As the liquid, blood can be used.
癌細胞除去装置５１は外形が略筒状の部材３５であり、一端側開口部が液導入開口部５１ａとされ、他端側開口部が液排出開口部５１ｂとされ、筒内が空間部３５ｃとされている。 The cancer cell removing device 51 is a member 35 having a substantially cylindrical outer shape, the opening on one end side is a liquid introduction opening 51a, the opening on the other end is a liquid discharge opening 51b, and the inside of the cylinder is a space 35c. It is said that.
液としては、血液を用いたときは、液導入開口部５１ａと動脈に接合し、液排出開口部５１ｂを静脈に接合し、血液を液導入開口部５１ａから癌細胞除去装置５１の空間部３５ｃ内に導入し、液排出開口部５１ｂから排出することにより、空間部３５ｃ内に配置した癌細胞吸着デバイス３１で、血液中に浮遊する癌細胞を吸着させ、癌細胞を除去してから、癌細胞を含有しない血液を排出することができる。 When blood is used as the liquid, the liquid introduction opening 51a is joined to the artery, the liquid discharge opening 51b is joined to the vein, and the blood is passed from the liquid introduction opening 51a to the space part 35c of the cancer cell removing device 51. The cancer cell adsorbing device 31 arranged in the space 35c is adsorbed to the cancer cell floating in the blood by removing the cancer cell after being introduced into the liquid and discharged from the liquid discharge opening 51b. Blood that does not contain cells can be drained.
＜癌細胞吸着デバイス＞
図２は、本発明の実施形態である癌細胞吸着デバイスの一例を示す模式図であって、正面図（ａ）と、（ａ）におけるＢ−Ｂ’線における断面図（ｂ）である。
図２に示すように、本発明の実施形態である癌細胞吸着デバイス４１は、基材２５と、基材２５の一面２５ａに形成された本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１とからなる。
<Cancer cell adsorption device>
FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a cancer cell adsorption device according to an embodiment of the present invention, which is a front view (a) and a cross-sectional view (b) taken along line BB ′ in (a).
As shown in FIG. 2, a cancer cell adsorption device 41 according to an embodiment of the present invention includes a base material 25 and a cancer cell adsorption film 31 according to an embodiment of the present invention formed on one surface 25a of the base material 25. Become.
基材２５の形状は、板状とされている。しかし、これに限られるものではなく、形状は用途に応じて決定することができる。
基材２５の材料は、高分子膜を付着可能な材料であればよい。例えば、ガラス、金属、Ｓｉ、細胞培養基材等を用いることができる。金属としては、金等を用いることができる。
The base material 25 has a plate shape. However, it is not restricted to this, A shape can be determined according to a use.
The material of the substrate 25 may be any material that can attach a polymer film. For example, glass, metal, Si, cell culture substrate, etc. can be used. Gold or the like can be used as the metal.
＜癌細胞吸着膜＞
図２に示すように、本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、２種以上の生体適合性高分子が積層された高分子積層膜２１と、高分子積層膜２１の一面２１ａに固定され、生理活性を具備した癌細胞吸着ウイルス１１と、を有する。
<Cancer cell adsorption membrane>
As shown in FIG. 2, the cancer cell adsorption film 31 according to the embodiment of the present invention includes a polymer laminated film 21 in which two or more kinds of biocompatible polymers are laminated, and one surface 21 a of the polymer laminated film 21. A cancer cell-adsorbing virus 11 which is fixed and has physiological activity.
高分子積層膜２１は、正電荷を有する生体適合性高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）の膜２２と、負電荷を有する生体適合性高分子（ａｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）の膜２３と、が交互に積層されてなる。つまり、高分子積層膜２１は、異なる電荷を有する高分子の膜２２、２３が交互に積層されている。
生体適合性高分子は、糖鎖を骨格に有する高分子であり、拒絶反応、免疫反応、細胞傷害性が認められないものである。
The polymer laminated film 21 is formed by alternately laminating a biocompatible polymer film 22 having a positive charge and an anionic polymer film 23 having a negative charge. . That is, in the polymer laminated film 21, polymer films 22 and 23 having different charges are alternately laminated.
The biocompatible polymer is a polymer having a sugar chain as a skeleton, and is free from rejection, immune reaction, or cytotoxicity.
正電荷を有する生体適合性高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）としては、次式（１）に示すポリ−Ｌ−リシン（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ：ＰＬＬ）やキトサン、グリコールキトサン、ポリアルギニンなどを代表例とする生体適合性高分子を挙げることができる。式（１）のｎは任意の自然数である。 Typical biocompatible polymers having a positive charge include poly-L-lysine (PLL) represented by the following formula (1), chitosan, glycol chitosan, polyarginine and the like. And biocompatible polymers. N in the formula (1) is an arbitrary natural number.
負電荷を有する生体適合性高分子（ａｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）としては、次式（２）に示すアルギン酸（ＡＬＧ）やヒアルロン酸、デキストラン硫酸などを代表例とする生体適合性高分子を挙げることができる。式（２）のｍ、ｎはそれぞれ任意の自然数である。 Examples of the biocompatible polymer having a negative charge include biocompatible polymers such as alginic acid (ALG), hyaluronic acid, and dextran sulfate represented by the following formula (2). M and n of Formula (2) are arbitrary natural numbers, respectively.
これらの高分子は、癌細胞吸着ウイルスであるＨＶＪ−Ｅの吸着量を、高分子積層膜の膜厚を調製することにより制御できるという利点を有する。また、これらの高分子は、どのような基材表面への修飾も可能であるという利点を有する。 These polymers have the advantage that the amount of adsorption of HVJ-E, which is a cancer cell-adsorbing virus, can be controlled by adjusting the film thickness of the polymer laminated film. In addition, these polymers have the advantage that they can be modified on any substrate surface.
高分子積層膜２１は、例えば、一面を負電荷とした基板２５に、正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２を成膜してから、負電荷を有する生体適合性高分子の膜２３を成膜し、その後、これらの膜を交互に成膜することにより、形成する。 The polymer laminated film 21 is formed by, for example, forming a biocompatible polymer film 22 having a positive charge on a substrate 25 having a negative charge on one side, and then forming a biocompatible polymer film 23 having a negative charge. Are formed, and then these films are alternately formed.
高分子積層膜２１の最表層は、正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２とされている。最表層が正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２であることにより、負電荷を有する癌細胞吸着ウイルス１１を、最表層の一面に、短時間で、容易に、かつ、多量に固定することができる。 The outermost layer of the polymer laminated film 21 is a biocompatible polymer film 22 having a positive charge. Since the outermost layer is the biocompatible polymer membrane 22 having a positive charge, the cancer cell-adsorbing virus 11 having a negative charge is easily and easily fixed in a large amount on one surface of the outermost layer in a short time. be able to.
高分子積層膜２１の層数は、奇数層となる。最も基板側の層（最下層）と、最表層が正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２とされるためである。 The number of layers of the polymer laminated film 21 is an odd number. This is because the most substrate-side layer (lowermost layer) and the outermost layer are the biocompatible polymer film 22 having a positive charge.
高分子積層膜２１の層数は、４層以上とするのが好ましい。この範囲とすることにより、最表層の一面の平坦性が優れ、かつ、前記一面内の電荷の面内バラツキを低減することができ、所望の量の癌細胞吸着ウイルス１１を、最表層の一面に、短時間で、容易に、かつ、多量に固定することができる。 The number of layers of the polymer laminated film 21 is preferably four or more. By setting it as this range, the flatness of one surface of the outermost layer is excellent, and the in-plane variation of the charge in the one surface can be reduced, and a desired amount of the cancer cell-adsorbing virus 11 is applied to one surface of the outermost layer. In addition, it can be fixed easily and in a large amount in a short time.
最表層に固定する癌細胞吸着ウイルス１１の吸着量は４００ｎｇ以上とすることが好ましい。 The adsorption amount of the cancer cell-adsorbing virus 11 fixed on the outermost layer is preferably 400 ng or more.
図３は、本発明の実施形態である癌細胞吸着ウイルスの一例を示す模式図である。
図３に示すように、本発明の実施形態である癌細胞吸着ウイルス１１は、空間部２ｃを覆うエンベロープ膜２と、空間部２ｃ内に離散されたＲＮＡ断片８と、エンベロープ膜２の外膜面２ａに林立するように形成された第１のタンパク質４と、第２のタンパク質６と、を有している。第１のタンパク質６は、エンベロープ膜２を膜外部から空間部２ｃ内に向けて貫くように形成されている。
第１のタンパク質４は、癌細胞のレセプターの吸着可能なタンパク質であり、第２のタンパク質６は、細胞内侵入可能なタンパクである。
FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of a cancer cell-adsorbing virus according to an embodiment of the present invention.
As shown in FIG. 3, the cancer cell-adsorbing virus 11 according to the embodiment of the present invention includes an envelope membrane 2 that covers the space portion 2 c, RNA fragments 8 that are discrete in the space portion 2 c, and an outer membrane of the envelope membrane 2. It has the 1st protein 4 and the 2nd protein 6 which were formed so that it might stand on the surface 2a. The first protein 6 is formed so as to penetrate the envelope membrane 2 from the outside of the membrane toward the space 2c.
The first protein 4 is a protein capable of adsorbing a receptor of a cancer cell, and the second protein 6 is a protein capable of entering a cell.
癌細胞吸着ウイルス１１としては、不活性化センダイウイルス（ＨＶＪ−Ｅと略記する。）を代表例とした癌細胞レセプターに吸着可能なエンベロープウイルスを挙げることができる。
ＨＶＪ−Ｅでは、エンベロープ膜は脂質二分子膜であり、第１のタンパク質４と第２のタンパク質６は、それぞれウイルス由来のＨＮタンパク質と、Ｆタンパク質となる。
Examples of the cancer cell-adsorbing virus 11 include enveloped viruses that can be adsorbed to cancer cell receptors, typically inactivated Sendai virus (abbreviated as HVJ-E).
In HVJ-E, the envelope membrane is a lipid bilayer membrane, and the first protein 4 and the second protein 6 are virus-derived HN protein and F protein, respectively.
ＨＶＪ−Ｅは、センダイウイルス（ＨＶＪと略記する。）の内部のＲＮＡが破壊されたウイルスである。ＲＮＡの破壊により、ウイルスの持つ毒性や増殖能が不活性化される。
図４は、ＨＶＪ−Ｅの作成方法の一例を示す工程図である。
図４に示すように、ＨＶＪにＵＶ照射することにより、その内部のＲＮＡを破壊して、ＨＶＪ−Ｅを作成することができる。
HVJ-E is a virus in which RNA inside Sendai virus (abbreviated as HVJ) is destroyed. The destruction of RNA inactivates the virus's toxicity and proliferation ability.
FIG. 4 is a process diagram showing an example of a method for creating HVJ-E.
As shown in FIG. 4, HVJ-E can be created by irradiating HVJ with UV to destroy the internal RNA.
ＨＶＪ−Ｅは、前立腺癌やグリオーマなどのヒト癌に対して選択的な細胞死を誘導することができる。 HVJ-E can induce selective cell death against human cancers such as prostate cancer and glioma.
ＨＶＪ−Ｅのレセプターであるガングリオシド（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）は、多くの癌細胞で高発現が認められる。ガングリオシドとは、糖鎖上に１つ以上のシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸：略称 ＮＡＮＡ、Ｎｅｕ５Ａｃ）を結合しているスフィンゴ糖脂質の一種である。 High expression of ganglioside, a receptor for HVJ-E, is observed in many cancer cells. Ganglioside is a kind of glycosphingolipid in which one or more sialic acids (N-acetylneuraminic acid: abbreviation NANA, Neu5Ac) are bound on a sugar chain.
＜癌細胞吸着デバイスの作成方法＞
本発明の実施形態である癌細胞吸着デバイスの作成方法は、高分子積層膜作成工程と、癌細胞吸着ウイルス固定工程とからなる。
<How to make a cancer cell adsorption device>
The method for producing a cancer cell adsorption device according to an embodiment of the present invention comprises a polymer laminated film production step and a cancer cell adsorption virus fixing step.
（高分子積層膜作成工程）
高分子積層膜は、静電吸着を利用するＬａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（ＬｂＬ法）により行った。これにより、強固に安定した多層膜を形成できる。
図５〜７は、癌細胞吸着デバイスの作成方法の一例を示す工程図である。
(Polymer laminated film creation process)
The polymer laminated film was formed by a Layer-by-Layer Assembly method (LbL method) using electrostatic adsorption. Thereby, a strong and stable multilayer film can be formed.
FIGS. 5-7 is process drawing which shows an example of the production method of a cancer cell adsorption device.
まず、板状の基材２５を用意し、その一面２５ａを負電荷でチャージする。
次に、図５に示すように、その一面２５ａ上に正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２を成膜する。これが高分子積層膜２１の第１層２１Ａとなる。
成膜方法は、基材を、正電荷を有する生体適合性高分子を分散させた溶液中に一定時間浸漬してから、引き上げ後、乾燥して、成膜するディッピング法（ディップ法）を用いる。
First, a plate-like base material 25 is prepared, and one surface 25a thereof is charged with a negative charge.
Next, as shown in FIG. 5, a biocompatible polymer film 22 having a positive charge is formed on one surface 25a. This becomes the first layer 21 </ b> A of the polymer laminated film 21.
As a film forming method, a dipping method (dipping method) is used in which a base material is immersed in a solution in which a biocompatible polymer having a positive charge is dispersed for a certain period of time, then pulled up and dried to form a film. .
正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２の膜厚は、分散溶液における正電荷を有する生体適合性高分子の濃度及び浸漬時間により決定される。
分散溶液における正電荷を有する生体適合性高分子の濃度は、１．０〜５０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。
浸漬時間は、５〜１５分とすることが好ましい。
溶媒としてはｐＨ６〜７．４のリン酸緩衝液等を用いる。
The film thickness of the biocompatible polymer film 22 having a positive charge is determined by the concentration and the immersion time of the biocompatible polymer having a positive charge in the dispersion solution.
The concentration of the biocompatible polymer having a positive charge in the dispersion solution is preferably 1.0 to 50 mg / mL.
The immersion time is preferably 5 to 15 minutes.
As the solvent, a phosphate buffer solution having a pH of 6 to 7.4 is used.
次に、図６に示すように、正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２上に、負電荷を有する生体適合性高分子の膜２３を成膜する。これが高分子積層膜２１の第２層２１Ｂとなる。
負電荷を有する生体適合性高分子を分散させた溶液を用いる他は前工程と同様のディッピング法を用いて成膜する。
Next, as shown in FIG. 6, a biocompatible polymer film 23 having a negative charge is formed on the biocompatible polymer film 22 having a positive charge. This becomes the second layer 21 </ b> B of the polymer laminated film 21.
A film is formed using the same dipping method as in the previous step except that a solution in which a biocompatible polymer having a negative charge is dispersed is used.
負電荷を有する生体適合性高分子の膜２３の膜厚は、分散溶液における負電荷を有する生体適合性高分子の濃度及び浸漬時間により決定される。
分散溶液における負電荷を有する生体適合性高分子の濃度は、１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。
浸漬時間は、５〜１５分とすることが好ましい。
溶媒としてはｐＨ６．０〜７．４のリン酸緩衝液等を用いる。
The thickness of the biocompatible polymer film 23 having a negative charge is determined by the concentration of the biocompatible polymer having a negative charge in the dispersion solution and the immersion time.
The concentration of the biocompatible polymer having a negative charge in the dispersion solution is preferably 1.0 to 5.0 mg / mL.
The immersion time is preferably 5 to 15 minutes.
As the solvent, a phosphate buffer solution having a pH of 6.0 to 7.4 is used.
次に、最表層の負電荷を有する生体適合性高分子の膜２３上に、正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２を成膜する。これが高分子積層膜２１の第３層２１Ｃとなる。
次に、最表層の正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２上に、負電荷を有する生体適合性高分子の膜２３を成膜する。これが高分子積層膜２１の第４層２１Ｄとなる。
Next, a biocompatible polymer film 22 having a positive charge is formed on the biocompatible polymer film 23 having a negative charge on the outermost layer. This becomes the third layer 21 </ b> C of the polymer laminated film 21.
Next, a biocompatible polymer film 23 having a negative charge is formed on the biocompatible polymer film 22 having a positive charge on the outermost layer. This becomes the fourth layer 21 </ b> D of the polymer laminated film 21.
次に、図７に示すように、最表層の負電荷を有する生体適合性高分子の膜２３上に、正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２を成膜する。これが高分子積層膜２１の第５層２１Ｅとなる。
以上により、第５層からなる高分子積層膜２１を形成する。
Next, as shown in FIG. 7, a biocompatible polymer film 22 having a positive charge is formed on the biocompatible polymer film 23 having a negative charge on the outermost layer. This becomes the fifth layer 21E of the polymer laminated film 21.
Thus, the polymer laminated film 21 composed of the fifth layer is formed.
（癌細胞吸着ウイルス固定工程）
図８は、ＬｂＬ法により形成した高分子積層膜の最表層表面への細胞吸着ウイルスの固定の原理図である。最表層が正電荷とされた高分子積層膜を、負電荷を有する細胞吸着ウイルスを分散させた溶液中に浸漬することにより、静電吸着により、最表層に細胞吸着ウイルスが固定される。
(Cancer cell-adsorbing virus fixation process)
FIG. 8 is a principle diagram of immobilization of cell-adsorbed virus on the surface of the outermost layer of the polymer laminated film formed by the LbL method. By immersing the polymer laminated film having a positive charge on the outermost layer in a solution in which a cell-adsorbed virus having a negative charge is dispersed, the cell-adsorbed virus is fixed to the outermost layer by electrostatic adsorption.
図９は、癌細胞吸着デバイスの作成方法の一例を示す工程図である。
図９に示すように、最表層の正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２（第５層２１Ｅ）上に、癌細胞吸着ウイルス１１を固定する。
癌細胞吸着ウイルス１１を分散させた溶液を用いる他は前工程と同様のディッピング法を用いて固定する。
FIG. 9 is a process diagram showing an example of a method for producing a cancer cell adsorption device.
As shown in FIG. 9, the cancer cell-adsorbing virus 11 is fixed on the biocompatible polymer film 22 (fifth layer 21E) having a positive charge on the outermost layer.
Immobilization is performed using the same dipping method as in the previous step except that a solution in which the cancer cell-adsorbing virus 11 is dispersed is used.
癌細胞吸着ウイルス１１の吸着量（固定量）は、分散溶液における癌細胞吸着ウイルス１１濃度及び浸漬時間により決定される。
分散溶液における癌細胞吸着ウイルス１１濃度は、１２０ＨＡＵ／ｍＬ以上とすることが好ましい。
浸漬時間は、１〜１２０分とすることが好ましい。
溶媒としてはリン酸緩衝液等を用いる。
The adsorption amount (fixed amount) of the cancer cell-adsorbing virus 11 is determined by the concentration of the cancer cell-adsorbing virus 11 and the immersion time in the dispersion solution.
The concentration of the cancer cell-adsorbing virus 11 in the dispersion solution is preferably 120 HAU / mL or more.
The immersion time is preferably 1 to 120 minutes.
A phosphate buffer or the like is used as the solvent.
なお、高分子膜の成膜方法及び固定方法としては、先に記載したディッピング法の他スピンコーティング法、キャスト法などの湿式成膜プロセスを用いてもよい。
以上により、癌細胞吸着デバイス４１を形成することができる。
In addition, as a film forming method and a fixing method of the polymer film, a wet film forming process such as a spin coating method or a cast method may be used in addition to the dipping method described above.
Thus, the cancer cell adsorption device 41 can be formed.
＜癌細胞除去装置の癌細胞除去方法＞
図１０〜１２は、癌細胞除去方法の一例を説明する図である。
まず、図１０に示すように、癌細胞除去装置５１の液導入開口部５１ａから、レセプター６４を有する癌細胞６３を含む血液６１を導入する。
血液の導入を続けると、図１１に示すように、血液は癌細胞吸着デバイス４１に達し、癌細胞吸着膜２１の最表層に固定された癌細胞吸着ウイルス１１に、癌細胞のレセプターが結合する。
血液の導入をさらに続けると、図１２に示すように、血液は液排出開口部５１ｂに達し、癌細胞を含まない血液６１を排出することができる。
<Cancer Cell Removal Method of Cancer Cell Removal Device>
FIGS. 10-12 is a figure explaining an example of the cancer cell removal method.
First, as shown in FIG. 10, blood 61 containing cancer cells 63 having receptors 64 is introduced from the liquid introduction opening 51 a of the cancer cell removal apparatus 51.
If blood introduction is continued, as shown in FIG. 11, the blood reaches the cancer cell adsorption device 41, and the cancer cell receptor binds to the cancer cell adsorption virus 11 fixed on the outermost layer of the cancer cell adsorption membrane 21. .
If the introduction of blood is further continued, as shown in FIG. 12, the blood reaches the liquid discharge opening 51b, and the blood 61 not containing cancer cells can be discharged.
（本発明の第２の実施形態）
＜癌細胞除去装置＞
図１３は、本発明の第２の実施形態である癌細胞除去装置の一例を示す断面模式図である。
本発明の実施形態である癌細胞除去装置１０５１は、図１３に示すように、癌細胞吸着デバイスが空間部内に配置される代わりに、略筒状の部材自体を基材として、その内壁面に膜が形成された他は第１の実施形態と同様の構成とされている。
本発明の第２の実施形態である癌細胞除去装置１０５１は、液導入開口部（図示略）と、液排出開口部（図示略）と、前記２つの開口部に連通され、液の流路となる空間部１０３５ｃと、空間部１０３５ｃの内壁面に形成された癌細胞吸着膜３１とからなる。
基材となる略筒状の部材１０３５と、癌細胞吸着膜３１とから、癌細胞吸着デバイス１０４１が構成されている。
(Second embodiment of the present invention)
<Cancer cell removal device>
FIG. 13: is a cross-sectional schematic diagram which shows an example of the cancer cell removal apparatus which is the 2nd Embodiment of this invention.
As shown in FIG. 13, the cancer cell removal apparatus 1051 according to the embodiment of the present invention has a substantially cylindrical member itself as a base material on its inner wall surface, instead of arranging the cancer cell adsorption device in the space. The configuration is the same as that of the first embodiment except that a film is formed.
A cancer cell removing apparatus 1051 according to the second embodiment of the present invention is connected to a liquid introduction opening (not shown), a liquid discharge opening (not shown), and the two openings, and a liquid flow path. And a cancer cell adsorption film 31 formed on the inner wall surface of the space 1035c.
A cancer cell adsorption device 1041 is composed of a substantially cylindrical member 1035 serving as a base material and the cancer cell adsorption film 31.
この構成としても、液として血液を用い、液導入開口部と動脈に接合し、液排出開口部を静脈に接合し、血液を液導入開口部から癌細胞除去装置１０５１の空間部３５ｃ内に導入し、液排出開口部から排出することにより、空間部１０３５ｃ内に配置した癌細胞吸着膜３１で、血液中に浮遊する癌細胞を吸着させ、癌細胞を除去してから、癌細胞を含有しない血液を排出することができる。 Also in this configuration, blood is used as the liquid, the liquid introduction opening is joined to the artery, the liquid discharge opening is joined to the vein, and the blood is introduced into the space 35c of the cancer cell removal apparatus 1051 from the liquid introduction opening. Then, by discharging from the liquid discharge opening, the cancer cell adsorbing film 31 disposed in the space portion 1035c adsorbs the cancer cells floating in the blood, removes the cancer cells, and does not contain the cancer cells. Can drain blood.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、２種以上の生体適合性高分子２２、２３が積層された高分子積層膜２１と、高分子積層膜２１の一面に固定され、生理活性を具備した癌細胞吸着ウイルス１１と、を有する構成なので、糖鎖を骨格に有する生体適合性高分子により、拒絶反応、免疫反応、細胞傷害性を発生させずに使用することができ、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させるというような生理活性を有する癌細胞吸着ウイルスを固定した膜とすることができる。 A cancer cell adsorption membrane 31 according to an embodiment of the present invention is fixed on one surface of a polymer laminate film 21 in which two or more kinds of biocompatible polymers 22 and 23 are laminated, and the polymer laminate film 21, and is bioactive. The cancer cell-adsorbing virus 11 having the structure can be used without causing a rejection reaction, an immune reaction, or a cytotoxicity by using a biocompatible polymer having a sugar chain as a skeleton. Can be formed into a membrane on which a cancer cell-adsorbing virus having a physiological activity such as selectively killing cancer cells or activating cells of the immune system is immobilized.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、高分子積層膜２１が、正電荷を有する生体適合性高分子の膜２２と、負電荷を有する生体適合性高分子の膜２３とが交互に積層されている構成なので、強固で、平坦な高分子積層膜を形成することができ、その一面に癌細胞吸着ウイルスを安定して固定できる。 In the cancer cell adsorption membrane 31 according to the embodiment of the present invention, the polymer laminated film 21 is alternately composed of a biocompatible polymer membrane 22 having a positive charge and a biocompatible polymer membrane 23 having a negative charge. Therefore, a strong and flat polymer laminated film can be formed, and the cancer cell-adsorbing virus can be stably fixed on one surface thereof.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、前記正電荷を有する生体適合性高分子が、ポリ−Ｌ−リシン、キトサン、グリコールキトサン、ポリアルギニンの群から選択されるいずれか一の高分子である構成なので、高分子多層膜を安定して作成できる。 In the cancer cell adsorption membrane 31 according to an embodiment of the present invention, the biocompatible polymer having a positive charge is any one selected from the group consisting of poly-L-lysine, chitosan, glycol chitosan, and polyarginine. Since the structure is a molecule, a polymer multilayer film can be stably formed.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、前記負電荷を有する生体適合性高分子が、アルギン酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸の群から選択されるいずれか一の高分子である構成なので、高分子多層膜を安定して作成できる。 The cancer cell adsorption membrane 31 according to an embodiment of the present invention has a configuration in which the biocompatible polymer having a negative charge is any one polymer selected from the group of alginic acid, hyaluronic acid, and dextran sulfate. A polymer multilayer film can be stably formed.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、高分子積層膜２１の層数が、４層以上である構成なので、最表層の平坦性が優れ、かつ、電荷の面内バラツキを低減することができ、所望の量の癌細胞吸着ウイルスを、最表層の一面に、短時間で、容易に、かつ、多量に固定することができ、癌細胞吸着ウイルスを安定して固定できる。 The cancer cell adsorbing film 31 according to the embodiment of the present invention has a structure in which the number of layers of the polymer laminated film 21 is four or more, so that the flatness of the outermost layer is excellent and the in-plane variation in charge is reduced. In addition, a desired amount of cancer cell-adsorbing virus can be immobilized on one surface of the outermost layer in a short time, easily and in a large amount, and the cancer cell-adsorbing virus can be stably immobilized.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、癌細胞吸着ウイルス１１が、空間部２ｃを覆うエンベロープ膜２、空間部２ｃ内に離散されたＲＮＡ断片８と、エンベロープ膜２の外膜面２ａに林立するように形成されたタンパク質４、６と、を有しており、前記タンパク質が、癌細胞のレセプターの吸着可能な第１のタンパク質４を有する構成なので、癌細胞のレセプターの吸着可能な第１のタンパク質により、癌細胞のレセプターを吸着して、癌細胞吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有するようにできる。 The cancer cell adsorbing film 31 according to the embodiment of the present invention includes an envelope film 2 in which the cancer cell adsorbing virus 11 covers the space part 2c, an RNA fragment 8 dispersed in the space part 2c, and an outer membrane surface of the envelope film 2 2a, and the protein 4 and 6 formed to stand in the forest 2a. Since the protein has the first protein 4 capable of adsorbing the cancer cell receptor, the cancer cell receptor can be adsorbed. The first protein can adsorb the cancer cell receptor to adsorb and remove the cancer cell, selectively kill the cancer cell, or have a physiological activity to activate the cell of the immune system.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、第１のタンパク質４がＨＮタンパク質であり、前記エンベロープ膜が脂質二分子膜である構成なので、癌細胞のレセプターの吸着可能なＨＮタンパク質により、癌細胞のレセプターを吸着して、癌細胞吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有するようにできる。 The cancer cell adsorption membrane 31 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the first protein 4 is an HN protein and the envelope membrane is a lipid bilayer membrane. Cancer cell receptors can be adsorbed and adsorbed / removed, and cancer cells can be selectively killed or have a physiological activity that activates cells of the immune system.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜３１は、癌細胞吸着ウイルス１１が、不活性化センダイウイルス（ＨＶＪ−Ｅ）である構成なので、ＨＶＪ−Ｅを代表例とした癌細胞レセプターに吸着可能なエンベロープウイルスにより、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有するようにできる。 The cancer cell adsorbing membrane 31 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the cancer cell adsorbing virus 11 is an inactivated Sendai virus (HVJ-E), and therefore can be adsorbed to a cancer cell receptor using HVJ-E as a representative example. With such an enveloped virus, cancer cells can be adsorbed and removed, and cancer cells can be selectively killed or have a physiological activity that activates cells of the immune system.
本発明の実施形態である癌細胞吸着デバイス４１は、基材２５と、基材２５の一面２５ａに形成された膜とを有し、前記膜が癌細胞吸着膜３１である構成なので、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有するとともに、基材を有し、取り扱いが容易なデバイスとして利用することができる。 The cancer cell adsorption device 41 according to the embodiment of the present invention has a base material 25 and a film formed on one surface 25a of the base material 25, and the film is a cancer cell adsorption film 31. Can be adsorbed and removed to selectively kill cancer cells, or have a physiological activity to activate cells of the immune system, and have a substrate and can be used as an easy-to-handle device.
本発明の実施形態である癌細胞吸着デバイス４１の作成方法は、Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（ＬｂＬ法）を用いた高分子積層膜作成工程と、湿式成膜法を用いた癌細胞吸着ウイルス固定工程とを有する構成なので、所望の厚さの高分子積層膜を形成して、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させるというような生理活性を有する癌細胞吸着デバイスを容易に、かつ、短時間で作成できる。 The method for producing a cancer cell adsorption device 41 according to an embodiment of the present invention includes a polymer laminated film production process using a Layer-by-Layer Assembly method (LbL method), and a cancer cell adsorption virus using a wet film formation method. Because it has a fixing process, it can form a polymer laminated film with a desired thickness to adsorb and remove cancer cells, selectively kill cancer cells, or activate cells of the immune system Cancer cell adsorbing device having various physiological activities can be easily prepared in a short time.
本発明の実施形態である癌細胞吸着デバイス４１の作成方法は、癌細胞吸着ウイルス固定工程が、癌細胞吸着ウイルス濃度を１２０ＨＡＵ／ｍＬ以上とした分散溶液に高分子積層膜を浸漬してから、引き上げ・乾燥して、前記高分子積層膜の一面に癌細胞吸着ウイルスを固定する工程である構成なので、最適な量のウイルスを固定した癌細胞吸着デバイスを容易に、かつ、短時間で作成できる。 In the method for producing the cancer cell adsorption device 41 according to the embodiment of the present invention, the cancer cell adsorption virus fixing step immerses the polymer laminated film in a dispersion solution having a cancer cell adsorption virus concentration of 120 HAU / mL or more. The structure is a process of lifting and drying to fix the cancer cell-adsorbing virus on one surface of the polymer laminated film, so that it is possible to easily and quickly create a cancer cell-adsorbing device with an optimal amount of virus fixed. .
本発明の実施形態である癌細胞除去装置５１は、液導入開口部５１ａと、液排出開口部５１ｂと、２つの開口部５１ａ、５１ｂに連通され、液の流路となる空間部３５ｃを有し、空間部３５ｃ内に、癌細胞吸着膜３１が形成されている構成なので、癌細胞を吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させる生理活性を有するようにできる。 The cancer cell removing apparatus 51 according to the embodiment of the present invention has a liquid introduction opening 51a, a liquid discharge opening 51b, and a space 35c that is communicated with the two openings 51a and 51b and serves as a liquid flow path. In addition, since the cancer cell adsorbing film 31 is formed in the space portion 35c, the cancer cells can be adsorbed / removed to selectively kill the cancer cells or to activate the cells of the immune system. You can have it.
本発明の実施形態である癌細胞吸着膜、癌細胞吸着デバイス、癌細胞吸着デバイスの作成方法及び癌細胞除去装置は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The cancer cell adsorption film, the cancer cell adsorption device, the method for producing the cancer cell adsorption device, and the cancer cell removal device according to the embodiment of the present invention are not limited to the above embodiment, but are within the scope of the technical idea of the present invention. It can be implemented with various changes. Specific examples of this embodiment are shown in the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
（試験例１）
癌細胞吸着ウイルスであるＨＶＪ−Ｅの吸着量（固定量）を、ディッピング法の浸漬時間の関数として調べた。
まず、図１４に示すように、瓶にＨＶＪ−Ｅ分散溶液を調製した。ＨＶＪ−Ｅ分散溶液における癌細胞吸着ウイルスであるＨＶＪ−Ｅの濃度は、１２０〜６０００ＨＡＵ／ｍＬとした。溶媒としてはリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。
次に、図１５に示す金電極を有する水晶子を備えた基板を、ＨＶＪ−Ｅ分散溶液に浸漬した。金電極の面積Ａは、０．１９６５ｃｍ２であり、クオーツ上に成膜されていた。
このとき、水晶子の端子を電流測定器に接続し、水晶子マイクロバランス法 （ＱＣＭ）により、ＨＶＪ−Ｅの金表面への吸着量（固定量）の評価を行った。水晶子マイクロバランス法 （ＱＣＭ）では、クオーツからの発振周波数から、金電極への付着量を算出する。
図１６が、ＨＶＪ−Ｅの金表面への吸着量（固定量）と浸漬時間の関係を示すグラフである。
Example 1
(Test Example 1)
The adsorption amount (fixed amount) of HVJ-E, which is a cancer cell-adsorbing virus, was examined as a function of dipping method immersion time.
First, as shown in FIG. 14, an HVJ-E dispersion solution was prepared in a bottle. The concentration of HVJ-E, which is a cancer cell-adsorbing virus, in the HVJ-E dispersion solution was 120 to 6000 HAU / mL. As the solvent, a phosphate buffer (pH 7.4) was used.
Next, the board | substrate provided with the crystal | crystallization which has a gold electrode shown in FIG. 15 was immersed in the HVJ-E dispersion solution. The area A of the gold electrode was 0.1965 cm 2 and was formed on the quartz.
At this time, the terminal of the crystallite was connected to an electric current measuring device, and the adsorption amount (fixed amount) of the HVJ-E on the gold surface was evaluated by the crystallite microbalance method (QCM). In the crystal microbalance method (QCM), the amount of adhesion to the gold electrode is calculated from the oscillation frequency from quartz.
FIG. 16 is a graph showing the relationship between the adsorption amount (fixed amount) of HVJ-E on the gold surface and the immersion time.
（試験例２）
高分子積層膜の層数と厚さの関係を調べた。
まず、ＰＬＬ分散溶液及びＡＬＧ分散溶液を調製した。それぞれ分散溶液の高分子濃度は、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬとした。溶媒としてはリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。
次に、先に示した金電極を有する水晶子を備えた基板を、交互にＰＬＬ分散溶液及びＡＬＧ分散溶液に浸漬して、ＬｂＬ法により高分子積層膜を形成した。
このとき、水晶子の端子を電流測定器に接続し、水晶子マイクロバランス法 （ＱＣＭ）により、金表面への高分子の層数と厚さの関係を調べた。
(Test Example 2)
The relation between the number of layers and the thickness of the polymer laminated film was investigated.
First, a PLL dispersion solution and an ALG dispersion solution were prepared. The polymer concentration of the dispersion solution was 1 mg / mL and 5 mg / mL, respectively. As the solvent, a phosphate buffer (pH 7.4) was used.
Next, the substrate provided with the crystal having the gold electrode as described above was alternately immersed in the PLL dispersion solution and the ALG dispersion solution to form a polymer laminated film by the LbL method.
At this time, the terminal of the crystallite was connected to an electric current measuring device, and the relationship between the number of polymer layers on the gold surface and the thickness was examined by the crystallite microbalance method (QCM).
図１７は、高分子積層膜の層数と厚さの関係を示すグラフである。Ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｎｓｉｔｙを１ｇ／ｃｍ３として換算したところ、１Ｈｚ＝０．０２７２６（ｎｍ）であった。 FIG. 17 is a graph showing the relationship between the number of layers and the thickness of the polymer laminated film. When converted to Polymer density of 1 g / cm 3 , 1 Hz = 0.27726 (nm).
（試験例３）
高分子積層膜の膜厚とウイルス吸着量の関係を調べた。
まず、膜厚が０以上５０ｎｍの範囲で膜厚の異なる、１０種のＬｂＬ法により高分子積層膜を形成した。
次に、これらのサンプルを１２０分（２時間）、ＨＶＪ−Ｅ分散溶液に浸漬して、ＨＶＪ−Ｅの吸着量（固定量）を調べた。溶媒はリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、濃度は１２００ＨＡＵ／ｍＬとした。
(Test Example 3)
The relationship between the film thickness of the polymer laminated film and the amount of adsorbed virus was investigated.
First, polymer laminated films were formed by 10 LbL methods having different film thicknesses in the range of 0 to 50 nm.
Next, these samples were immersed in the HVJ-E dispersion for 120 minutes (2 hours), and the adsorption amount (fixed amount) of HVJ-E was examined. The solvent was phosphate buffer (pH 7.4), and the concentration was 1200 HAU / mL.
図１８は、高分子積層膜のＬｂＬ膜厚とＨＶＪ−Ｅの吸着量との関係を示すグラフである。
高分子積層膜へのＨＶＪ−Ｅの吸着量は、ＬｂＬ膜厚を変えることでコントロール可能であった。具体的には、０〜４ｎｍの範囲と、４ｎｍ（３層）〜５５ｎｍ（１７層）の範囲に特性が分かれた。それぞれの領域では、一定の傾きの線形特性を示した。金表面にＨＶＪ−Ｅが吸着しにくいことから、０〜４ｎｍの範囲の傾きが急であることは、膜が低密度で空孔部が多く存在することによると考察した。
４ｎｍの厚さとした場合、空孔部がなくなり、膜の本来の吸着特性を示したと考察した。
FIG. 18 is a graph showing the relationship between the LbL film thickness of the polymer laminated film and the adsorption amount of HVJ-E.
The amount of HVJ-E adsorbed on the polymer laminated film could be controlled by changing the LbL film thickness. Specifically, the characteristics were divided into a range of 0 to 4 nm and a range of 4 nm (3 layers) to 55 nm (17 layers). Each region showed a linear characteristic with a constant slope. Since HVJ-E is difficult to adsorb on the gold surface, it was considered that the steep slope in the range of 0 to 4 nm was due to the low density of the film and the presence of many pores.
It was considered that when the thickness was 4 nm, the pores disappeared and the original adsorption characteristics of the film were exhibited.
図１９は、分散溶液におけるＨＶＪ−Ｅ濃度とＨＶＪ−Ｅの吸着量との関係を示すグラフである。
１１層の高分子積層膜を用いた。
３０００ＨＡＵ／ｍＬ以上では、吸着量は飽和した。吸着表面が３０００ＨＡＵ／ｍＬ程度で無くなったためと考察した。
FIG. 19 is a graph showing the relationship between the HVJ-E concentration in the dispersion solution and the adsorption amount of HVJ-E.
An 11-layer polymer laminated film was used.
Above 3000 HAU / mL, the adsorption amount was saturated. It was considered that the adsorption surface was lost at about 3000 HAU / mL.
（試験例４）
金電極を有する水晶子を備えた基板の代わりに、ガラス基板を用いた他は試験例１と同様にして、デバイスを作製した。
高分子積層膜の膜厚とウイルス吸着量の関係を調べた。
(Test Example 4)
A device was fabricated in the same manner as in Test Example 1 except that a glass substrate was used instead of the substrate having a crystal having a gold electrode.
The relationship between the film thickness of the polymer laminated film and the amount of adsorbed virus was investigated.
ガラス基材表面に高分子を修飾してから、その表面にＨＶＪ−Ｅを吸着させた。
図２０は、用いたガラス基板の写真（ａ）、調製したＰＬＬ分散溶液、ＡＬＧ分散溶液、ＨＶＪ−Ｅ分散溶液の写真（ｂ）である。
ＨＶＪ−Ｅ分散溶液は、ＨＶＪ−Ｅを、赤色蛍光を有するｐＫＨ２６標識薬でラベル化し、赤色蛍光色素を含有した分散溶液とした。
After the polymer was modified on the glass substrate surface, HVJ-E was adsorbed on the surface.
FIG. 20 is a photograph (a) of the used glass substrate, and a photograph (b) of the prepared PLL dispersion solution, ALG dispersion solution, and HVJ-E dispersion solution.
The HVJ-E dispersion solution was prepared by labeling HVJ-E with a pKH26 labeling agent having red fluorescence and containing a red fluorescent dye.
図２１は、ガラス基板をＰＬＬ分散溶液に浸漬した状態を示す写真（ａ）、ガラス基板をＡＬＧ分散溶液に浸漬した状態を示す写真（ｂ）、ガラス基板を、ｐＫＨ２６で標識をしたＨＶＪ−Ｅ分散溶液に浸漬した状態を示す写真（ｃ）である。 FIG. 21 shows a photograph (a) showing a state in which a glass substrate is immersed in a PLL dispersion solution, a photograph (b) showing a state in which the glass substrate is immersed in an ALG dispersion solution, and an HVJ-E labeled with pKH26. It is a photograph (c) which shows the state immersed in the dispersion solution.
次に、蛍光顕微鏡の励起光を照射して、ｐＫＨ標識ＨＶＪ−Ｅ吸着表面の蛍光観察を行った。
図２２は、ＨＶＪ−Ｅ吸着前蛍光観察写真（ａ）とＨＶＪ−Ｅ吸着後の蛍光観察写真（ｂ）である。
図２２に示すように、ＨＶＪ−Ｅ上のｐＫＨ２６蛍光色素由来の赤色蛍光が観察された。
Next, the fluorescence light of the pKH labeled HVJ-E adsorption surface was observed by irradiating with excitation light of a fluorescence microscope.
FIG. 22 is a fluorescence observation photograph (a) before HVJ-E adsorption and a fluorescence observation photograph (b) after HVJ-E adsorption.
As shown in FIG. 22, red fluorescence derived from the pKH26 fluorescent dye on HVJ-E was observed.
ガラス基板に１１層の高分子膜を形成して、１１層のガラス基板を作成した。
次に、その基板を、濃度が１２０ＨＡＵ／ｍＬ、１２００ＨＡＵ／ｍＬ、６０００ＨＡＵ／ｍＬの分散溶液に２時間浸漬してから、引き上げ乾燥して、ＨＶＪ−Ｅ吸着ＬｂＬ膜付きガラス基板を作成した。
図２３は、ＨＶＪ−Ｅ吸着１１層被膜基板の写真である。いずれも透明であった。
An 11-layer glass substrate was formed by forming an 11-layer polymer film on a glass substrate.
Next, the substrate was immersed in a dispersion having a concentration of 120 HAU / mL, 1200 HAU / mL, and 6000 HAU / mL for 2 hours, and then pulled up and dried to prepare a glass substrate with an HVJ-E adsorption LbL film.
FIG. 23 is a photograph of the HVJ-E adsorption 11-layer coated substrate. All were transparent.
濃度が１２０ＨＡＵ／ｍＬ、１２００ＨＡＵ／ｍＬ、６０００ＨＡＵ／ｍＬの分散溶液に２時間浸漬してから、引き上げ乾燥したときの基板のＨＶＪ−Ｅ吸着ＬｂＬ膜付きガラス基板のＵＶ−ｖｉｓ測定を行った。図２４は、ＨＶＪ−Ｅ吸着１１層被膜基板の２８０ｎｍの吸収強度を示すグラフである。図２５は、ＨＶＪ−Ｅ吸着１１層被膜基板のＵＶ吸収強度のフルスペクトルである。
１２００ＨＡＵ／ｍＬ、６０００ＨＡＵ／ｍＬの分散溶液を使用したサンプルの２８０ｎｍの吸収強度が大きかった。２８０ｎｍの吸収は、タンパク質由来のものであるので、ガラスに対しても、高分子積層膜が形成され、ＨＶＪ−Ｅが吸着されたことが示された。
After immersing in a dispersion solution having a concentration of 120 HAU / mL, 1200 HAU / mL, and 6000 HAU / mL for 2 hours, the glass substrate with the HVJ-E adsorption LbL film of the substrate when pulled up and dried was subjected to UV-vis measurement. FIG. 24 is a graph showing the absorption intensity at 280 nm of the HVJ-E adsorption 11-layer coated substrate. FIG. 25 is a full spectrum of UV absorption intensity of the HVJ-E adsorption 11 layer coated substrate.
The absorption intensity at 280 nm of the sample using the dispersion solution of 1200 HAU / mL and 6000 HAU / mL was large. Since the absorption at 280 nm was derived from protein, it was shown that a polymer laminated film was formed on glass and HVJ-E was adsorbed.
次に、ＨＶＪ−Ｅ吸着表面のＡＦＭ観察を行った。
図２６は、ＨＶＪ−Ｅ吸着表面のＡＦＭ写真であって、ＬｂＬ表面（ａ）、１２０ＨＡＵ／ｍＬ濃度サンプル表面（ｂ）、１２００ＨＡＵ／ｍＬ濃度サンプル表面（ｃ）、６０００ＨＡＵ／ｍＬ濃度サンプル表面（ｄ）のＡＦＭ写真である。
６０００ＨＡＵ／ｍＬ濃度サンプル表面（ｄ）から、２５０ｎｍの大きさのウイルス１個１個が面内にぎっしりと固定されていることがわかる。
Next, AFM observation of the HVJ-E adsorption surface was performed.
FIG. 26 is an AFM photograph of the HVJ-E adsorption surface, including an LbL surface (a), a 120 HAU / mL concentration sample surface (b), a 1200 HAU / mL concentration sample surface (c), and a 6000 HAU / mL concentration sample surface (d ) AFM photograph.
From the sample surface (d) having a concentration of 6000 HAU / mL, it can be seen that each virus having a size of 250 nm is firmly fixed in the plane.
次に、表面の親水性評価実験を行った。
まず、ビーカーに水を満たした。
次に、水中でビーカー底面に平行となるように、サンプル基板を配置した。
次に、サンプル基板に垂直な方向に向けたシリンダ先端部から、１．０ｍＬ程度の球状の空気の泡を放出した。
空気の泡は、形状を保ったまま、サンプル基板表面に達した。その状態で写真を撮影した。
Next, surface hydrophilicity evaluation experiments were conducted.
First, the beaker was filled with water.
Next, the sample substrate was placed so as to be parallel to the bottom surface of the beaker in water.
Next, about 1.0 mL of spherical air bubbles were discharged from the tip of the cylinder oriented in the direction perpendicular to the sample substrate.
The air bubbles reached the sample substrate surface while maintaining the shape. I took a picture in that state.
図２７は、親水性評価実験の結果を示す写真であって、ＰＬＬ１ｓｔｅｐ（ａ）、５ｓｔｅｐ（ｂ）、１１ｓｔｅｐ（ｃ）、ＨＶＪ−Ｅ＋１ｓｔｅｐ（ｄ）、ＨＶＪ−Ｅ＋５ｓｔｅｐ（ｅ）、ＨＶＪ−Ｅ＋１１ｓｔｅｐ（ｆ）である。
親水性表面の場合は、接触角が小さくなり、球状となり、組成性表面の場合は、接触角が大きくなり、球の形状が保たれない。
図２７の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）では、接触角が約５０度であり、球の形状が保たれていないことから、疎水性表面であることがわかる。一方、図２７の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）では、接触角が約３０度であり、球の形状が保たれていることから、親水性表面であることがわかる。
FIG. 27 is a photograph showing the results of the hydrophilicity evaluation experiment. f).
In the case of a hydrophilic surface, the contact angle becomes small and spherical, and in the case of a composition surface, the contact angle becomes large and the shape of the sphere is not maintained.
In (a), (b), and (c) of FIG. 27, the contact angle is about 50 degrees, and since the shape of the sphere is not maintained, it can be seen that the surface is hydrophobic. On the other hand, in (d), (e), and (f) of FIG. 27, the contact angle is about 30 degrees, and the spherical shape is maintained, so that the surface is hydrophilic.
図２８は、ＨＶＪ−Ｅ吸着前後の接触角の変化の高分子層依存性を示すグラフである。
ＨＶＪ−Ｅを吸着させると、接触角は約５０度から約３０度となり、より親水的な表面が構築された。
以上により、ＨＶＪ−Ｅが固定されたと考察した。
FIG. 28 is a graph showing the polymer layer dependence of the change in contact angle before and after HVJ-E adsorption.
When HVJ-E was adsorbed, the contact angle was about 50 degrees to about 30 degrees, and a more hydrophilic surface was constructed.
From the above, it was considered that HVJ-E was fixed.
（試験例５）
癌細胞のＨＶＪ−Ｅ表面への吸着を確かめるために、細胞実験を行った。
まず、２枚の細胞培養基材（ＴＣＰＳ）上に、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅとアルギン酸の濃度をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬに調整したリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．４）を用いてＬｂＬ修飾を１１層行った。
(Test Example 5)
Cell experiments were performed to confirm the adsorption of cancer cells to the HVJ-E surface.
First, LbL using a phosphate buffer solution (pH 7.4) in which the concentrations of Poly-L-Lysine and alginic acid were adjusted to 1 mg / mL and 5 mg / mL on two cell culture substrates (TCPS), respectively. Eleven layers of modification were performed.
ＬｂＬ修飾後、片方の基材上にのみ、ＨＶＪ−Ｅを１２００ＨＡＵ／ｍＬの濃度に調整したリン緩衝液を加え、２時間、ＨＶＪ−Ｅを吸着させた。
ＨＶＪ−Ｅの吸着有り・無し、それぞれの表面に対し、ヒト悪性中皮腫細胞（ＭＳＴＯ）細胞を１．０×１０４ｃｅｌｌ播種し、２４時間インキュベーターで培養した。
ＨＶＪ−Ｅの吸着有りの表面に細胞培養したサンプルを、ＬｂＬ １１ｓｔｅｐ＋ＨＶＪ−Ｅ ｓｕｒｆａｃｅサンプルと呼ぶ。また、ＨＶＪ−Ｅの吸着無しの表面に細胞培養したサンプルを、ＬｂＬ １１ｓｔｅｐ ｓｕｒｆａｃｅサンプルと呼ぶ。
After LbL modification, a phosphatase buffer in which HVJ-E was adjusted to a concentration of 1200 HAU / mL was added to only one substrate, and HVJ-E was adsorbed for 2 hours.
Adsorption there less - of HVJ-E, for each surface, human malignant mesothelioma cells (MSTO) cells 1.0 × to 10 4 cell seeded and cultured in 24 hours incubator.
A sample obtained by cell culture on the surface with HVJ-E adsorption is referred to as an LbL 11step + HVJ-E surface sample. Moreover, the sample which carried out the cell culture on the surface without adsorption | suction of HVJ-E is called a LbL 11step surface sample.
２４時間後、細胞を赤色蛍光色素であるｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色したのち、蛍光顕微鏡で細胞の伸展度を観察した。
図２９は、癌細胞の表面への吸着写真であって、ＬｂＬ １１ｓｔｅｐ ｓｕｒｆａｃｅ（ａ）と、ＬｂＬ １１ｓｔｅｐ＋ＨＶＪ−Ｅ ｓｕｒｆａｃｅ（ｂ）である。図２９に示すように、（ａ）では細胞が伸展せず丸い形状であったのに対し、（ｂ）では細胞が伸展している様子が観察された。
After 24 hours, the cells were stained with phalloidin, a red fluorescent dye, and then the degree of cell extension was observed with a fluorescence microscope.
FIG. 29 is an adsorption photograph on the surface of a cancer cell, which is LbL 11 step surface (a) and LbL 11 step + HVJ-E surface (b). As shown in FIG. 29, in (a), the cells did not extend and had a round shape, whereas in (b), the cells were observed to extend.
更に、細胞の伸展度を、細胞の長軸方向と短軸方向の長さの差からアスペクト比として算出した。アスペクト比が１に近いほど細胞が丸く、０に近いほど細胞が進展していることを意味する。通常、細胞と基材の相互作用が強いほど、ＭＳＴＯ細胞は伸展することが知られており、アスペクト比は０に近づく。
図３０は、Ｗｉｔｈｏｕｔ ＨＶＪ−ＥとＷｉｔｈ ＨＶＪ−Ｅへの細胞のアスペクト比を示すグラフである。
ＨＶＪ−Ｅの吸着有りの表面に細胞培養したサンプルを、Ｗｉｔｈ ＨＶＪ−Ｅサンプルと呼ぶ。また、ＨＶＪ−Ｅの吸着無しの表面に細胞培養したサンプルを、Ｗｉｔｈｏｕｔ ＨＶＪ−Ｅサンプルと呼ぶ。
図３０に示すように、本実験において細胞のアスペクト比はＨＶＪ−Ｅ無しの表面では１に近く、ＨＶＪ−Ｅありの場合は０に近い。
つまり、ＨＶＪ−Ｅが表面に存在することで細胞がより伸展しやすくなっていることが示された。本実験から癌細胞とＨＶＪ−Ｅ吸着表面に強い相互作用が存在することが明らかとなった。
Furthermore, the degree of cell extension was calculated as the aspect ratio from the difference in length between the major axis direction and the minor axis direction of the cell. The closer the aspect ratio is to 1, the more round the cells are, and the closer the aspect ratio is to 0, the more advanced the cells are. Usually, it is known that the stronger the interaction between the cell and the base material, the more the MSTO cell extends, and the aspect ratio approaches zero.
FIG. 30 is a graph showing the aspect ratio of cells to Without HVJ-E and With HVJ-E.
A sample obtained by cell culture on the surface with HVJ-E adsorption is referred to as a Whith HVJ-E sample. Moreover, the sample which carried out the cell culture on the surface without adsorption | suction of HVJ-E is called Without HVJ-E sample.
As shown in FIG. 30, in this experiment, the cell aspect ratio is close to 1 on the surface without HVJ-E, and close to 0 with HVJ-E.
That is, it was shown that the presence of HVJ-E on the surface facilitates cell extension. From this experiment, it was revealed that a strong interaction exists between the cancer cell and the HVJ-E adsorption surface.
本発明の癌細胞吸着膜、癌細胞吸着デバイス、癌細胞吸着デバイスの作成方法及び癌細胞除去装置に関するものであり、癌細胞吸着・除去でき、癌細胞を選択的に殺す、あるいは、免疫系の細胞を活性化させるというような生理活性を生じさせることができ、医療機器装置産業、医療用材料産業等において利用可能性がある。
なお、本発明の癌細胞吸着膜、癌細胞吸着デバイス及び癌細胞除去装置の効果は、癌細胞の吸着のみならず、レセプターに吸着したＨＶＪ−Ｅが活性化して、癌細胞の細胞死を効率的に誘導することができ、抗癌化作用を高めることができる効果も奏すると推察している。
The present invention relates to a cancer cell adsorption film, a cancer cell adsorption device, a method for producing a cancer cell adsorption device, and a cancer cell removal apparatus, which can adsorb and remove cancer cells, selectively kill cancer cells, or Physiological activity such as activating cells can be generated, and it can be used in the medical device apparatus industry, the medical materials industry, and the like.
The effect of the cancer cell adsorption membrane, the cancer cell adsorption device and the cancer cell removal apparatus of the present invention is that not only the adsorption of cancer cells but also the HVJ-E adsorbed on the receptor is activated, and the cell death of cancer cells is efficiently performed. It is presumed that it can be induced in an effective manner and has an effect of enhancing the anticancer effect.
２…エンベロープ膜、２ａ…癌細胞吸着ウイルス、２ｃ…空間部、４…第１のタンパク質、６…第２のタンパク質、８…ＲＮＡ断片、１１…癌細胞吸着ウイルス、２１…高分子積層膜、２１ａ…一面、２１Ａ…第１層、２１Ｂ…第２層、２１Ｃ…第３層、２１Ｄ…第４層、２１Ｅ…第５層、２２…正電荷を有する生体適合性高分子の膜、２３…負電荷を有する生体適合性高分子の膜、２５…基材、２５ａ…一面、３１…癌細胞吸着膜、３５…部材、３５ｃ…空間部、４１…癌細胞吸着デバイス、５１…癌細胞除去装置、５１ａ…液導入開口部、５１ｂ…液排出開口部、６１…血液、６３…癌細胞、６４…レセプター、１０３５…部材、１０３５ｃ…空間部、１０４１…癌細胞吸着デバイス、１０５１…癌細胞除去装置。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 2 ... Envelope membrane, 2a ... Cancer cell adsorption virus, 2c ... Space part, 4 ... 1st protein, 6 ... 2nd protein, 8 ... RNA fragment, 11 ... Cancer cell adsorption virus, 21 ... Polymer laminated film, 21a ... one side, 21A ... first layer, 21B ... second layer, 21C ... third layer, 21D ... fourth layer, 21E ... fifth layer, 22 ... biocompatible polymer membrane having a positive charge, 23 ... Negatively-charged biocompatible polymer membrane, 25 ... base material, 25a ... one side, 31 ... cancer cell adsorption membrane, 35 ... member, 35c ... space, 41 ... cancer cell adsorption device, 51 ... cancer cell removal device , 51a ... liquid introduction opening, 51b ... liquid discharge opening, 61 ... blood, 63 ... cancer cell, 64 ... receptor, 1035 ... member, 1035c ... space, 1041 ... cancer cell adsorption device, 1051 ... cancer cell removal apparatus .
Claims (9)
前記癌細胞吸着ウイルスは不活性化センダイウイルス（ＨＶＪ−Ｅ）であり、
前記高分子積層膜が、正電荷を有する生体適合性高分子の膜と、負電荷を有する生体適合性高分子の膜とが交互に積層されている積層膜であるとともに、
前記高分子積層膜の最表層が前記正電荷を有する生体適合性高分子の膜である
ことを特徴とする癌細胞吸着膜。 A polymer laminated film in which two or more kinds of biocompatible polymers are laminated, and a cancer cell-adsorbing virus fixed on one surface of the polymer laminated film and having physiological activity,
The cancer cell adsorbing virus is an inactivated Sendai virus (HVJ-E);
The polymer laminated film is a laminated film in which a biocompatible polymer film having a positive charge and a biocompatible polymer film having a negative charge are alternately laminated,
The cancer cell-adsorbing film, wherein the outermost layer of the polymer laminated film is a biocompatible polymer film having the positive charge.
前記タンパク質が、癌細胞のレセプターの吸着可能な第１のタンパク質を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌細胞吸着膜。 The cancer cell-adsorbing virus has an envelope membrane covering the space portion, an RNA fragment dispersed in the space portion, and a protein formed to stand on the outer membrane surface of the envelope membrane,
The cancer cell-adsorbing membrane according to any one of claims 1 to 4, wherein the protein has a first protein capable of adsorbing a receptor of a cancer cell.
前記高分子積層膜がポリ−Ｌ−リシン及びアルギン酸を含む積層膜であり、
癌細胞吸着ウイルス固定工程が、癌細胞吸着ウイルス濃度を１２０ＨＡＵ／ｍＬ以上とした分散溶液に前記高分子積層膜を浸漬してから、引き上げ・乾燥して、前記高分子積層膜の一面に癌細胞吸着ウイルスを固定する工程である
ことを特徴とする請求項７に記載の癌細胞吸着デバイスの作成方法。 A polymer laminated film preparation step using a Layer-by-Layer Assembly method (LbL method), and a cancer cell-adsorbing virus fixing step using a wet film formation method,
The polymer laminated film is a laminated film containing poly-L-lysine and alginic acid,
In the cancer cell-adsorbing virus fixing step, the polymer laminated film is immersed in a dispersion solution having a cancer cell-adsorbing virus concentration of 120 HAU / mL or more, and then pulled up and dried, so that the cancer cell is placed on one surface of the polymer laminated film. The method for producing a cancer cell adsorption device according to claim 7, which is a step of fixing an adsorbed virus.
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