JP6281979B2

JP6281979B2 - 新規インテグリンα９β１リガンドおよびその利用

Info

Publication number: JP6281979B2
Application number: JP2014504995A
Authority: JP
Inventors: 関口　清俊; 清俊関口; 佐藤　涼子; 涼子佐藤; 幸子江副
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: University of Osaka NUC
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2018-02-21
Anticipated expiration: 2033-03-14
Also published as: WO2013137396A1; JPWO2013137396A1; EP2843048A4; EP2843048B1; EP2843048A1; US20150086557A1

Description

本発明は、新規インテグリンα９β１リガンドおよびその利用に関するものである。

細胞周囲に構築される細胞外マトリックス（extracellular matrix、以下「ＥＣＭ」と記す）は、細胞直近の微小環境として細胞の生存維持と増殖および分化の制御に不可欠な役割を担っている。インテグリンは細胞表面の主要なＥＣＭ受容体で、サブユニット組成の異なる多数のアイソフォームが存在する。ヒトでは、２４種類のインテグリンが存在し、そのうち１８種類がＥＣＭ受容体として機能している。これらインテグリンの多くはβ１鎖を含み、α鎖のタイプによって「コラーゲン結合型（α１β１、α２β１など）」、「ラミニン結合型（α３β１、α６β１など）」、「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列結合型（α５β１、α８β１など）」に大別される。しかし、α９β１のように、真のリガンドが未確定なものが少数残されている。

インテグリンα９β１は、上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、好中球等に発現しているインテグリンで、血管およびリンパ管形成、創傷治癒、自己免疫性関節炎との関わりが、これまでに指摘されている。また、角膜幹細胞や造血幹細胞に発現していることから、これら組織幹細胞の機能維持にも関わる可能性がある。インテグリンα９β１のリガンドとしては、これまでテネイシンＣ、オステオポンチン、細胞型フィブロネクチン（以上、ＥＣＭタンパク質）、ＶＣＡＭ−１（vascular cell adhesion molecule 1）、ＡＤＡＭプロテアーゼ（以上、膜タンパク質）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＮＧＦ（nerve growth factor）（以上、増殖因子）が報告されている（非特許文献１〜７参照）。しかし、インテグリンα９β１に対するこれらタンパク質の結合親和性は、ラミニン結合型インテグリンやＲＧＤ結合型インテグリンとそのリガンドとの間の結合親和性と比べると格段に低く、その活性自体もインテグリンα９β１との直接の結合活性ではなく、細胞接着活性を指標として測定されたものが多い。また、ＥＣＭの代表的なインテグリンα９β１リガンドであるテネイシンＣやオステオポンチンは、全長のタンパク質ではリガンド活性がほとんど検出されず、特定の断片のみでリガンド活性検出可能であり、果たしてそれらが生理的なリガンドとして機能するかどうかは未だ定かではない。それゆえ、インテグリンα９β１の真のＥＣＭリガンドは他にあるのではないかと考えられていた。

Yokosaki, Y., Palmer, E. L., Prieto, A. L., Crossin, K. L., Bourdon, M. A., Pytela, R., and Sheppard, D. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26691-26696 Smith, L. L., Cheung, H. K., Ling, L. E., Chen, J., Sheppard, D., Pytela, R., and Giachelli, C. M. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28485-28491 Liao, Y. F., Gotwals, P. J., Koteliansky, V. E., Sheppard, D., and Van De Water, L. (2002) J. Biol. Chem. 277, 14467-14474 Eto, K., Huet, C., Tarui, T., Kupriyanov, S., Liu, H. Z., Puzon-McLaughlin, W., Zhang, X. P., Sheppard, D., Engvall, E., and Takada, Y. (2002) J. Biol. Chem. 277, 17804-17810 Taooka, Y., Chen, J., Yednock, T., and Sheppard, D. (1999) J. Cell Biol. 145, 413-420 Vlahakis, N. E., Young, B. A., Atakilit, A., and Sheppard, D. (2005) J. Biol. Chem. 280, 4544-4552 Staniszewska, I., Sariyer, I. K., Lecht, S., Brown, M. C., Walsh, E. M., Tuszynski, G. P., Safak, M., Lazarovici, P., and Marcinkiewicz, C. (2008) J. Cell Sci. 121, 504-513

本発明は、公知のインテグリンα９β１リガンドであるテネイシンＣやオステオポンチンより高い結合親和性を有する新規なインテグリンα９β１リガンド、およびその利用方法を提供することを課題とする。

本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］以下の（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有するペプチドからなることを特徴とするインテグリンα９β１リガンド。
（Ａ）ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
［２］ＳＶＥＰ１またはその活性断片である前記［１］に記載のインテグリンα９β１リガンド。
［３］アミノ酸残基数が２５００以下である前記［１］または［２］に記載のインテグリンα９β１リガンド。
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンドを構成するペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［５］前記［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［６］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンドに対する抗体。
［７］ＳＶＥＰ１とインテグリンα９β１との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンドを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
［８］インテグリンα９β１発現細胞を培養する方法であって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンドを基質として用いることを特徴とする培養方法。
［９］組織幹細胞の未分化性を維持したまま増殖を抑制する培養方法であって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンドを基質として用いることを特徴とする培養方法。
［１０］インテグリンα９β１発現細胞を分離する方法であって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンドと結合する細胞を選択して分離することを特徴とする分離方法。
［１１］インテグリンα９β１発現細胞に薬物を送達するシステムであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンド、および薬物を含むことを特徴とする薬物送達システム。
［１２］静止期または増殖抑制状態にある組織幹細胞を増殖状態に誘導する方法であって、該幹細胞と前記［１］〜［３］のいずれかに記載のインテグリンα９β１リガンドとを接触させることを特徴とする増殖誘導方法。

本発明によれば、新規なインテグリンα９β１リガンドを提供することができる。当該インテグリンα９β１リガンドは、公知のインテグリンα９β１リガンドより高い結合親和性を有している。当該インテグリンα９β１リガンドは、ＳＶＥＰ１とインテグリンα９β１との相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法、インテグリンα９β１発現細胞の培養方法、造血幹細胞の未分化性を維持したまま増殖を抑制する培養方法、インテグリンα９β１発現細胞に薬物を送達する方法、静止期または増殖抑制状態にある幹細胞を増殖状態に誘導する方法などに好適に用いることができる。

マウスＳＶＥＰ１（図面および図面の簡単な説明において「ｐｏｌｙｄｏｍ」と記す）のドメイン構造を示す図である。マウス免疫グロブリンκ鎖のシグナル配列を有する組み換えｐｏｌｙｄｏｍを非還元または還元条件で６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。Ｎ末端にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端にＨｉｓタグを有する組み換えｐｏｌｙｄｏｍを免疫ブロッティングに供した結果を示す図であり、（Ａ）は抗Ｈｉｓ抗体を用いた結果、（Ｂ）は抗ＦＬＡＧ抗体を用いた結果である。ＲＤ細胞のｐｏｌｙｄｏｍへの接着を検討した結果を示す図である。ＲＤ細胞と基質との接着を顕微鏡で観察した結果を示す図である。ＲＤ細胞とｐｏｌｙｄｏｍとの接着がインテグリンに依存することを検討した結果を示す図である。組み換えインテグリンα９β１とｐｏｌｙｄｏｍとの結合を検討した結果を示す図である。インテグリンα９β１とｐｏｌｙｄｏｍおよび他の既知インテグリンα９β１リガンドとの結合を検討した結果を示す図である。ｐｏｌｙｄｏｍ内のインテグリンα９β１結合部位を見つけるために作製したｐｏｌｙｄｏｍＮ末端欠失変異体を示す図である。ｐｏｌｙｄｏｍＮ末端欠失変異体を用いてインテグリンα９β１に対する結合活性を評価した結果を示す図である。クラスタルＷを用いてアライメントした第２０番、第２１番、第２２番ＣＣＰドメインのアミノ酸配列を示す図である。第２１番ＣＣＰドメイン（以下、「ＣＣＰ２１」という）内のインテグリンα９β１結合部位を調べた結果を示す図である。ＣＣＰ２１のエクストラセグメントの３７アミノ酸部分（Ｄ２６２８−Ｓ２６６４）中のどの部分がインテグリンα９β１結合部位であるかを調べた結果を示す図である。ＣＣＰ２１のエクストラセグメントの１２アミノ酸部分（Ｄ２６３４−Ｌ２６４５）のどのアミノ酸残基がインテグリンα９β１との結合に関与するかを、アラニンスキャニング変異体を用いて調べた結果を示す図である。ＥＤＤＭＭＥＶＰＹまたはその一部の配列からなる合成ペプチドを用いて、インテグリンα９β１のｐｏｌ−Ｃへの結合阻害アッセイを行った結果を示す図である。ｐｏｌｙｄｏｍおよびインテグリンα９の局在を、マウス胚の組織を用いて免疫蛍光染色により確認した結果を示す図である。マウス胚の凍結切片を用いてｉｎｓｉｔｕインテグリン結合アッセイを行った結果を示す図である。ｐｏｌｙｄｏｍまたはフィブロネクチン上における造血幹細胞の増殖を検討した結果を示す図である。ｐｏｌｙｄｏｍまたはフィブロネクチン上における造血幹細胞の分化を検討した結果を示す図である。ｐｏｌｙｄｏｍ上における造血幹細胞の増殖に対するＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドの影響を検討した結果を示す図である。緑色蛍光蛋白質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）とヒストンＨ２Ｂの融合タンパク質（Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ）をマウスの出生前１週間から２週間にわたり心臓で発現させ、６週間後に心臓細胞を調製し、ＧＦＰの蛍光を指標としてセルソーターＦＡＣＳＡｒｉａで分画した結果を示す図である。図２１で分画したＧＦＰ陽性細胞とＧＦＰ非陽性細胞におけるインテグリンα９の発現をセルソーターＦＡＣＳＡｒｉａで解析した結果を示す図である。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰで心臓幹細胞を標識したマウス心臓の凍結切片におけるＧＦＰ標識保持細胞およびインテグリンα９発現細胞の局在を蛍光二重染色により確認した結果を示す図である。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰで心臓幹細胞を標識したマウス心臓の凍結切片におけるＧＦＰ標識保持細胞の局在とｐｏｌｙｄｏｍの発現領域を確認した結果を示す図である。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰで標識した心臓幹細胞（ＧＦＰ標識保持細胞）のｐｏｌｙｄｏｍおよびフィブロネクチンに対する細胞接着活性を測定した結果を示す図である。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰで標識した心臓幹細胞（ＧＦＰ標識保持細胞）のｐｏｌｙｄｏｍおよびフィブロネクチン上におけるコロニー形成能を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はコロニー形成率を示し、（Ｂ）は代表的なコロニーの形態を示す。

以前に発明者らは、ＥＣＭタンパク質をスクリーニングするためのバイオインフォマティクスに基づくプロトコールを確立し、理研ＦＡＮＴＯＭｃＤＮＡコレクションで使用可能な６５０００を超えるマウスｃＤＮＡから、１６の新しいＥＣＭタンパク質を同定した（Manabe, R., Tsutsui, K., Yamada, T., Kimura, M., Nakano, I., Shimono, C., Sanzen, N., Furutani, Y., Fukuda, T., Oguri, Y., Shimamoto, K., Kiyozumi, D., Sato, Y., Sado, Y., Senoo, H., Yamashina, S., Fukuda, S., Kawai, J., Sugiura, N., Kimata, K., Hayashizaki, Y., and Sekiguchi, K. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 12849-12854）。発明者らは、このプロトコールの対象集団をマウスおよびヒトゲノムデータベースに広げ、１５００アミノ酸残基以上からなるタンパク質をコードする転写産物に焦点を合わせることにより、さらに多くのＥＣＭタンパク質を同定した。得られた候補の１つがＳＶＥＰ１（ｐｏｌｙｄｏｍとも称される）であった。本発明者らは、鋭意検討した結果、ＳＶＥＰ１がインテグリンα９β１リガンドであることを見出した。続いて、ＳＶＥＰ１は分泌後にＮ末端側フラグメントとＣ末端側フラグメントに分かれ、インテグリンα９β１リガンド活性はＣ末端側フラグメントに存在することを見出した。次に、インテグリンα９β１認識配列が、マウスＳＶＥＰ１に３４個存在するＣＣＰ（complement control protein）ドメインのＮ末端側から第２１番目（ＣＣＰ２１）に存在することを見出した。さらに、マウスＳＶＥＰ１のＣＣＰ２１には他のＣＣＰドメインにはないエクストラセグメントが存在し、インテグリンα９β１認識配列はエクストラセグメント中のアミノ酸配列ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）であることを見出した。

〔インテグリンα９β１リガンド〕
本発明は、アミノ酸配列ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）を有するペプチドからなるインテグリンα９β１リガンドを提供する。また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列（以下、「配列番号１の変異配列」という場合がある）を有するペプチドからなるインテグリンα９β１リガンドを提供する。本発明者らは、欠失変異体を用いてインテグリンα９β１認識配列を確認した結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列における第１位のＥおよび第２位のＤが欠失してもインテグリンα９β１結合能が維持されること、さらに第９位のＹが欠失した場合は、インテグリンα９β１結合能が低下するものの、消失しないことを確認した（図１６参照）。また、アラニンスキャニング変異体を用いてインテグリンα９β１認識配列を確認した結果、アミノ酸を置換してもインテグリンα９β１結合能がほとんど変化しないアミノ酸（第４位のＭ）や、結合能の低下の程度が低いアミノ酸（第１位のＥ、第８位のＰなど）があることを確認した（図１４参照）。したがって、配列番号１の変異配列を有するペプチドまたはタンパク質は、インテグリンα９β１リガンド活性を有している。

本発明のインテグリンα９β１リガンド（以下、「本発明のリガンド」という）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列または配列番号１の変異配列を有するペプチドからなるものであればよい。すなわち、本発明のリガンドを構成するペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列または配列番号１の変異配列のみからなるものでもよく、配列番号１で表されるアミノ酸配列または配列番号１の変異配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。配列番号１で表されるアミノ酸配列または配列番号１の変異配列以外のアミノ酸配列は特に限定されず、そのアミノ酸残基数も限定されない。なお、本発明において「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを意味し、結合するアミノ酸の数は問わない。すなわち、本発明における「ペプチド」にはポリペプチドが含まれる。

配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１位のＥは任意のアミノ酸に置換可能と考えられる。第２位のＤは任意のアミノ酸、好ましくは酸性アミノ酸に置換可能と考えられる。第３位のＤはＥに置換可能と考えられる。第４位のＭは任意のアミノ酸に置換可能と考えられる。第５位のＭは他の疎水性アミノ酸に置換可能と考えられる。第６位のＥはＤに置換可能と考えられる。第７位のＶは任意のアミノ酸、好ましくは疎水性アミノ酸に置換可能と考えられる。第８位のＰは任意のアミノ酸に置換可能と考えられるが、好ましくはＰのまま置換しないことである。第９位のＹは任意のアミノ酸に置換可能と考えられるが、好ましくはＹのまま置換しないことである。

本発明のリガンドは、全長のＳＶＥＰ１またはその活性断片であることが好ましい。ＳＶＥＰ１は、主として脊椎動物のＥＣＭに存在する多数のドメインをからなる分泌タンパク質である。図１に示したように、マウスＳＶＥＰ１（全長）には、シグナル配列、フォンビルブランド因子Ａドメイン（ｖＷＦＡ）、Ｅｐｈ−ｌｉｋｅドメイン、ＣＣＰドメイン、ＨＹＲドメイン、ＳＴＴ２Ｒドメイン、ＥＧＦドメイン、ＰＴＸドメインが含まれる。他の哺乳動物のＳＶＥＰ１のドメイン構造も図１と同様である。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、哺乳動物においてよく保存されている。したがって、本発明のリガンドは哺乳動物由来のＳＶＥＰ１またはその活性断片が好ましく、より好ましくはヒトのＳＶＥＰ１またはその活性断片である。

表１に代表的な哺乳動物におけるＳＶＥＰ１のアミノ酸配列およびＳＶＥＰ１をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号を示す。これらのアミノ酸配列情報および塩基配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表１に示した哺乳動物のＳＶＥＰ１はいずれも配列番号１で表されるアミノ酸配列を有しており、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、エクストラセグメントが存在するＣＣＰドメイン内のエクストラセグメントの中に存在する。本発明のリガンドとしてのＳＶＥＰ１はこれらに限定されず、他の動物のＳＶＥＰ１もインテグリンα９β１リガンドとして好適であると考えられる。他の動物のＳＶＥＰ１のアミノ酸配列情報および塩基配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。マウスＳＶＥＰ１のアミノ酸配列を配列番号２、塩基配列を配列番号３に示し、ヒトＳＶＥＰ１のアミノ酸配列を配列番号４、塩基配列を配列番号５に示した。

インテグリンα９β１リガンドとしてのＳＶＥＰ１の活性断片は、ＳＶＥＰ１の一部からなり、インテグリンα９β１リガンド活性（インテグリンα９β１に対する結合能）を有するＳＶＥＰ１の断片であればよい。このような活性断片としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列または配列番号１の変異配列を有するＳＶＥＰ１の断片が好ましく挙げられる。具体的には、例えば、図１に「ｐｏｌ−Ｃ」として示したマウスＳＶＥＰ１のＣ末端側フラグメントに相当する哺乳動物のＳＶＥＰ１の断片、哺乳動物のＳＶＥＰ１のエクストラセグメントが存在するＣＣＰドメインを含む断片、哺乳動物のＳＶＥＰ１のエクストラセグメントを含む断片、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＳＶＥＰ１の断片、配列番号１の変異配列を含むＳＶＥＰ１の断片が挙げられる。

本発明のリガンドを構成するペプチドのアミノ酸残基数は特に限定されないが、約２５００残基以下が好ましい。下限値は、配列番号１で表されるアミノ酸配列から３個のアミノ酸が欠失した場合の６残基である。したがって、本発明のリガンドを構成するペプチドのアミノ酸残基数は、６〜約２５００残基が好ましく、より好ましくは６〜約２０００残基、さらに好ましくは６〜約１５００残基、さらに好ましくは６〜約１０００残基、さらに好ましくは６〜約５００残基、さらに好ましくは６〜約２００残基、さらに好ましくは６〜約１００残基、さらに好ましくは６〜約５０残基、さらに好ましくは６〜約２０残基、最も好ましくは９残基である。

本発明のリガンドは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、ＳＶＥＰ１またはその活性断片をコードする遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させ、精製することにより製造することができる。また、本発明のリガンドは、例えばｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて製造することができる。また、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。

ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ⁻)、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されていてもよい。

ペプチドを構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されたものでもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基などが挙げられる。さらに、ペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているものであってもよい。

ペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していてもよく、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。

〔ポリヌクレオチド〕
本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のリガンドを構成するペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドのいずれであってもよい。一本鎖の場合は、コード鎖（センス鎖）または非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。さらに、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成法やＰＣＲ法等によって取得することができる。具体的には、例えば、本発明のリガンドを構成するペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して塩基配列をデザインし、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。また、ＳＶＥＰ１をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３、配列番号５、表１のアクセッション番号参照）中の本発明のリガンドを構成するペプチドをコードする領域を増幅するためのプライマーを設計し、対応する動物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行うことにより、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

〔発現ベクター〕
本発明は、上記本発明のリガンドを製造するために使用される発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のリガンドを構成するペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が好ましい。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。本発明の発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のリガンドを構成するペプチドを回収、精製することができる。

発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌（Escherichia coli）および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明のリガンドを構成するペプチドを融合ペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明のリガンドを構成するペプチドをＧＦＰ融合ペプチドとして発現させてもよい。

宿主は特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このようにして得られた形質転換体も本発明に含まれる。

〔抗体〕
本発明は、上記本発明のリガンドに対する抗体を提供する。本発明のリガンドに対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原（本発明のリガンドを構成するペプチド）をＰＢＳに溶解し、所望により通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。さらに、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。

〔スクリーニング方法〕
本発明は、ＳＶＥＰ１とインテグリンα９β１との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、上記本発明のリガンドを用いるものであればよい。被験物質は特に限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。

スクリーニングの具体的な方法は特に限定されないが、例えば、被験物質と接触させたインテグリンα９β１発現細胞と本発明のリガンドとの結合レベルを、被験物質と接触させていないインテグリンα９β１発現細胞と本発明のリガンドとの結合レベルと比較し、被験物質と接触させたインテグリンα９β１発現細胞の結合レベルが低下している場合に当該被験物質をＳＶＥＰ１とインテグリンα９β１との相互作用を阻害する物質として選択する方法などが挙げられる。被験物質が結合レベルを低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の結合レベルと比較して５０％以下にする被験物質が好ましく、２５％以下にする被験物質がより好ましい。

本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、ＳＶＥＰ１とインテグリンα９β１との相互作用を阻害することができるので、例えば、静止期または増殖抑制状態にある幹細胞の増殖誘導剤、自己免疫性関節炎の治療薬などに有用である。

〔培養方法〕
本発明は、インテグリンα９β１発現細胞の培養方法を提供する。本発明の培養方法は、本発明のリガンドを基質として用いるものであればよい。本発明のリガンドはＥＣＭタンパク質であるＳＶＥＰ１に基づいて見出されたものであるので、インテグリンα９β１発現細胞の培養用基質として非常に有用である。本発明の培養方法は、例えば、本発明のリガンドをコートした培養プレートを用いてインテグリンα９β１発現細胞を培養する方法が挙げられる。インテグリンα９β１発現細胞としては、例えば、造血幹細胞、角膜幹細胞、心臓幹細胞等の組織幹細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、好中球などが挙げられる。用いる培地は特に限定されず、培養する細胞に適した培地を適宜選択して用いればよい。血清等の増殖因子は、目的に応じて適宜添加することができる。

また、本発明は、未分化性を維持したまま増殖を抑制する組織幹細胞の培養方法を提供する。本発明の組織幹細胞の培養方法は、本発明のリガンドを基質として用いるものであればよい。本発明者らは、インテグリンα９β１リガンドであるＳＶＥＰ１をコートした培養基材で造血幹細胞を培養すると、ＰＢＳ（対照）やフィブロネクチンをコートした場合と比較して造血幹細胞の増殖が著しく抑制され、未分化性が維持されることを見出した（図１８、１９参照）。したがって、本発明のリガンドは、組織幹細胞の未分化性を維持したまま増殖を抑制するための培養基材として非常に有用である。未分化性を維持したまま増殖を抑制する組織幹細胞の培養方法に用いる培地は、組織幹細胞の培養に適した培地であれば特に限定されない。ただし、無血清培地等の増殖因子を添加していない培地を用いることが好ましい。

〔分離方法〕
本発明は、インテグリンα９β１発現細胞の分離方法を提供する。本発明の分離方法は、本発明のリガンドと結合する細胞を選択して分離するものであればよい。本発明のリガンドは、インテグリンα９β１発現細胞に結合できるので、本発明のリガンドが結合した細胞を選択的に分離すればインテグリンα９β１発現細胞を単離、濃縮することができる。本発明のリガンドが結合した細胞を選択的に分離する手段は特に限定されず、公知の細胞分離手段を好適に用いることができる。例えば、本発明のリガンドが固定化された磁気ビーズ、本発明のリガンドが固定化された樹脂、セルソーター等が挙げられる。分離対象のインテグリンα９β１発現細胞としては、例えば、造血幹細胞、角膜幹細胞、心臓幹細胞等の組織幹細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、好中球などが挙げられる。

〔薬物送達システム〕
本発明は、本発明のリガンドおよび薬物を含み、インテグリンα９β１発現細胞に薬物を送達する薬物送達システムを提供する。本発明のリガンドは、インテグリンα９β１結合能を有しているので、インテグリンα９β１発現細胞に薬物を送達するための薬物送達システムに好適に用いることができる。インテグリンα９β１発現細胞としては、例えば、造血幹細胞、角膜幹細胞、心臓幹細胞等の組織幹細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、好中球などが挙げられる。

本発明の薬物送達システムは、本発明のリガンドと薬物とが一体化していない混合組成物の形態としてもよいが、本発明のリガンドと薬物とが何らかの相互作用により一体化した形態とすることが好ましい。一体化のための手段は特に限定されないが、例えば、薬物を封入したリポソームと本発明のリガンドの結合体、薬物を担持したナノマテリアルと本発明のリガンドの結合体などの形態が挙げられる。また、本発明のリガンドと薬物とが直接結合した形態でもよい。薬物がタンパク質である場合は、薬物と本発明のリガンドとの融合タンパク質が好適である。

本発明の薬物送達システムに用いられる薬物は、標的部位であるインテグリンα９β１発現細胞に送達することが好ましい薬物であればよく、特に限定されない。例えば、疾病治療用の薬物、インテグリンα９β１発現細胞を可視化するための薬物（蛍光性物質、放射性物質、化学発光性物質、磁性物質等）などが挙げられる。

〔増殖誘導方法〕
本発明は、静止期または増殖抑制状態にある幹細胞と本発明のリガンドとを接触させることにより当該幹細胞を増殖状態に誘導する方法を提供する。本発明者らは、インテグリンα９β１リガンドであるＳＶＥＰ１をコートした培養基材で造血幹細胞を培養すると造血幹細胞の増殖が著しく抑制されるが、インテグリンα９β１リガンドである配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドで造血幹細胞を処理すると、ＳＶＥＰ１コート上の造血幹細胞の増殖抑制が解除されることを見出した（図２０参照）。したがって、本発明のリガンドは、造血幹細胞の未分化状態を解除し増殖状態に誘導する用途に好適に用いることができる。

本発明の増殖誘導方法を白血病患者に適用することにより、白血病の治療効果の向上が期待できる。すなわち、白血病患者の骨髄中に存在する静止期または増殖抑制状態にある白血病幹細胞を増殖抑制状態に誘導することにより、白血病幹細胞を血流中に移動させ、白血病細胞特異的に効果のある薬剤（チロシンキナーゼ阻害剤等）を投与することにより白血病幹細胞を効率よく死滅させることが可能になると考えられる。

〔その他の利用〕
本発明のリガンドは、例えば、インテグリンα９β１活性化のシグナル伝達研究用の試薬、インテグリンα９β１発現細胞を採取するための試薬等の用途に有用である。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［実施例１：新規インテグリンα９β１リガンドの同定］
〔実験方法〕
（１）ｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクターの構築
ＦＬＡＧタグおよび６×ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。この断片をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターまたはｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（いずれもInvitrogen）のＮｏｔＩ／ＡｐａＩサイトに挿入し、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ、ｐＳｅｃ−ＦＬＡＧおよびｐＳｅｃ−Ｈｉｓを得た。Ｎ末端にＦＬＡＧタグの付いたタンパク質の発現ベクターを構築するために、ＦＬＡＧ配列をコードするＤＮＡ断片をｐＳｅｃ−ＨｉｓベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＳｅｃ−ＮＦＬＡＧ−Ｈｉｓを得た。マウスＳＶＥＰ１（以下、実施例において「ｐｏｌｙｄｏｍ」と記す）をコードするｃＤＮＡは、マウス７日胚から抽出したＲＮＡ（Clontech）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより取得し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）（Strategene）にサブクローニングした。塩基配列確認後、エラーのないｃＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ、ｐＳｅｃ−ＦＬＡＧ、ｐＳｅｃ−ＨｉｓまたはｐＳｅｃ−ＮＦＬＡＧ−ＨｉｓのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入した。切断型ｐｏｌｙｄｏｍ用の発現ベクターも、ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡをｐＳｅｃ−ＨｉｓのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトにサブクローニングすることにより構築した。

（２）組み換えｐｏｌｙｄｏｍの発現および精製
組み換えｐｏｌｙｄｏｍおよびそのフラグメントは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて作製した。Ｎ末端ｐｏｌｙｄｏｍフラグメント（以下「ｐｏｌ−Ｎ」と記す、図１参照）は、配列番号２の第１８位〜第７８９位のアミノ酸配列を有し、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されたフラグメントである。Ｃ末端ｐｏｌｙｄｏｍフラグメント（以下「ｐｏｌ−Ｃ」と記す、図１参照）は、配列番号２の第１１９２位〜第３５６７位のアミノ酸配列を有し、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されたフラグメントである。２９３ｆｅｃｔｉｎ（Invitrogen）を用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３−Ｆ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３発現培地で７２時間培養した。馴化培地を回収し、遠心分離により浄化した。発現確認のために、細胞をＴＢＳ（1 % (w/v) Nonidet P-40、1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 μg/ml aprotinin、5 μg/ml leupeptin および5μg /ml pepstatin を含む）で溶解した。馴化培地および細胞溶解液を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン）または抗ＦＬＡＧＭ２アガロース（シグマ）でプルダウンし、免疫ブロットに供した。ＦＬＡＧタグ付加タンパク質を精製するために、馴化培地を抗ＦＬＡＧＭ２アガロースカラムにアプライし、結合したタンパク質を１００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドを含むＰＢＳで溶出した。Ｈｉｓタグ付加タンパク質を精製するために、馴化培地をＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーに供した。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳで溶出した。溶出タンパク質をＰＢＳに対して透析した。精製タンパク質の濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードに用いるブラッドフォード法で定量した。

（３）ｐｏｌｙｄｏｍ抗体
ｐｏｌｙｄｏｍに対する抗体は、ＦＬＡＧタグ付加全長ｐｏｌｙｄｏｍを免疫原として用いてウサギで作製した。抗体は、Ｎ末端ｐｏｌｙｄｏｍフラグメントまたはＣ末端ｐｏｌｙｄｏｍフラグメントのどちらかを含むカラムを用いてアフィニティー精製した。カラムを０．５ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、続いて０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を用いて結合した抗体を溶出した。溶出画分を直ちに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM５５５標識抗ｐｏｌｙｄｏｍ（ｐｏｌ−Ｎ）抗体は、ＡＰＥＸ^TM ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ抗体標識キット（Invitrogen）を用いて作製した。

（４）細胞接着アッセイ
細胞接着アッセイは文献（Sato, Y., Uemura, T., Morimitsu, K., Sato-Nishiuchi, R., Manabe, R., Takagi, J., Yamada, M., and Sekiguchi, K. (2009) J. Biol. Chem. 284, 14524-14536）の記載に従って実施した。阻止抗体に関するアッセイのために、ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫由来）を目的のモノクローナル抗体と室温で１５分間プレインキュベーションし、組み換えｐｏｌｙｄｏｍタンパク質またはフィブロネクチンをコートした９６穴プレートに播種した。細胞を３０分間インキュベートし、洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％トルイジンブルーで染色した。

（５）フローサイトメトリー
Ａ５４９細胞（ヒト肺腺癌由来）、ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫由来）およびＲＤ細胞表面のインテグリンα９β１発現レベルは、抗インテグリンα９β１モノクローナル抗体Ｙ９Ａ２を用いたフローサイトメトリーにより確認した。コントロールとしてマウス正常ＩｇＧを用いた。

（６）組み換えインテグリンの発現および精製
ヒトインテグリンα９の細胞外領域をコードするｃＤＮＡは、ＲＤ細胞から抽出したトータルＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）にクローニングした。塩基配列確認後、エラーのないｃＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ−ＡＣＩＤ−ＦＬＡＧ（Nishiuchi, R., Takagi, J., Hayashi, M., Ido, H., Yagi, Y., Sanzen, N., Tsuji, T., Yamada, M., and Sekiguchi, K. (2006) Matrix Biol. 25, 189-197）に挿入した。インテグリンβ１の細胞外領域用発現ベクターは高木淳一博士から分与を受けた（Takagi, J., Erickson, H. P., and Springer, T. A. (2001) Nat. Struct. Biol. 8, 412-416）。組み換えインテグリンは、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて作製し、前記 Matrix Biol. 25, 189-197, (2006) に記載の方法で精製した。

（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングおよびアミノ酸配列解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ法で行った。銀染色、ＣＢＢ染色またはニトロセルロース膜（免疫ブロッティング用）もしくはフッ化ポリビニリデン膜（アミノ酸配列解析用）にトランスファーすることにより、分離したタンパク質を可視化した。免疫ブロッティングのために、膜を抗体でプローブし、続いてＥＣＬ検出キット（GE Healthcare）を用いて可視化した。アミノ酸配列解析のために、膜上のタンパク質バンドをＣＢＢ染色で可視化し、タンパク質バンドを膜から切り出した。Ｎ末端のアミノ酸をＰｒｏｃｉｓｅ４９１ｃＬＣｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applied Biosystems）を用いてエドマン法で分析した。

（８）インテグリン結合アッセイ
インテグリン結合アッセイは、前記 Matrix Biol. 25, 189-197, (2006) に記載の方法で実施した。いくつかの実験を行い、インテグリンと合成ペプチドとを種々の濃度でプレインキュベーションすることにより合成ペプチドの阻害活性を評価した。見かけの解離常数を文献（Nishiuchi, R., Murayama, O., Fujiwara, H., Gu, J., Kawakami, T., Aimoto, S., Wada, Y., and Sekiguchi, K. (2003) J. Biochem. 134, 497-504）に従い決定した。

（９）ＧＳＴ融合ｐｏｌｙｄｏｍ、テネイシンＣおよびオステオポンチンフラグメントの発現および精製
ＣＣＰ２１またはその欠失変異体をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＸ４Ｔ−１（GE Healthcare）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサイトにサブクローニングした。ＣＣＰ２１および当該ドメインのＧｌｕ２６２８−Ｓｅｒ２６６４が欠失した断片（以下、「ΔＤ２６２８−Ｓ２６６４」と記す）は、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されている。ＧＳＴ融合タンパク質は、０．１ｍＭＩＰＴＧを添加して２５℃で２時間インキュベートすることにより大腸菌ＢＬ２１中に誘導した。菌をソニケーションにより溶解し、上清をグルタチオンセファロース４Ｂカラム（GE Healthcare）に通した。結合したタンパク質を１０ｍＭグルタチオンを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出した。ＧＳＴ融合ＣＣＰ２１の正常体および変異体を、さらにＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムで精製した。精製タンパク質を１３０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）に対して透析し、ブラッドフォード法で定量した。

ヒトテネイシンＣの第３番フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（以下、「Ｔｎｆｎ３」と記す）をコードするｃＤＮＡは、ＨＴ１０８０細胞から抽出したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより取得し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）にサブクローニングした。ヒトオステオポンチンをコードするｃＤＮＡは、ＮＩＨＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Invitrogen）から購入した。オステオポンチンのＮ末端フラグメント（以下、「ＯＰＮ−Ｎｈａｌｆ」と記す）をコードするｃＤＮＡは、ＰＣＲで増幅した。インテグリンα９β１との特異的結合のために、Ｔｎｆｎ３およびＯＰＮ−Ｎｈａｌｆ内のＲＧＤモチーフをＲＡＡに変異させた（以下、それぞれ「Ｔｎｆｎ３−ＲＡＡ」および「ＯＰＮ−Ｎｈａｌｆ−ＲＡＡ」と記す）。塩基配列確認後、ｃＤＮＡ断片はｐＧＥＸ４Ｔ−１のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサイトに挿入した。どちらのタンパク質も、上述のとおり発現させ、精製した。

（１０）免疫組織化学
マウス胚をＯ.Ｃ.Ｔ.コンパウンド（サクラファインテック）で包埋し、凍結切片を作製した。３．７％ホルムアルデヒド（ｐｏｌｙｄｏｍ染色用）または氷冷アセトン（ｐｏｌｙｄｏｍとインテグリンα９のダブル染色用）で切片を固定した。その後、切片をコンドロイチナーゼＡＢＣ（５Ｕ／ｍｌ、生化学工業）およびヒアルロニダーゼ（１Ｕ／ｍｌシグマ）を含むＰＢＳで３７℃３０分間前処理し、続いて０．３％Ｈ_２Ｏ_２で内因性ペルオキシダーゼを失活させ、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。４℃で一夜、切片を抗体で標識し、ＰＢＳで洗浄した。結合した抗体をＨＲＰポリマー標識抗ウサギＩｇＧおよびＤＡＢ（Dako）またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM標識二次抗体で可視化した。マイヤー・ヘマトキシリン（ＤＡＢ染色）またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（免疫蛍光染色）で切片を対比染色し、マウントクイック（大道産業）またはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＭｏｕｎｔｉｎｇＭｅｄｉｕｍ（Dako）で切片をマウントした。

（１１）Ｉｎｓｉｔｕインテグリン結合アッセイ
マウス胚の凍結切片を氷冷アセトンで１５分間固定し、ＴＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡを含むＴＢＳでブロッキングした。ＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡおよび１ｍＭＭｎＣｌ_２を含むＴＢＳで溶解した組み換えインテグリンα９β１（３μｇ／ｍｌ）を用いて４℃で一夜、切片を標識した。１ｍＭＭｎＣｌ_２を含むＴＢＳ（ＴＢＳ／Ｍｎ）で洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ／Ｍｎ（ＴＢＳ／Ｍｎ／ＢＳＡ）に溶解した抗Ｖｅｌｃｒｏ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）で、室温で２時間、切片をインキュベートした。ＴＢＳ／Ｍｎで洗浄した後、ＴＢＳ／Ｍｎ／ＢＳＡに溶解したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM４８８標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体で、室温で２時間、切片をインキュベートした。洗浄後、ＴＢＳ／Ｍｎ／ＢＳＡに溶解した１００μｇ／ｍｌの正常ウサギＩｇＧ（Dako）で、室温で１時間、切片をインキュベートし、二次抗体か結合していない領域をブロッキングした。１３０ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＭｎＣｌ_２を含む２０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で切片を洗浄し、１３０ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＭｎＣｌ_２を含む２０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した３．７％ホルムアルデヒドで、１０分間再固定した。ＴＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳに溶解したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM５５５標識抗ｐｏｌｙｄｏｍ抗体で、４℃で一夜、切片をインキュベートした。ＴＢＳで洗浄後、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＭｏｕｎｔｉｎｇＭｅｄｉｕｍ（Dako）で切片をマウントした。

（１２）使用抗体
抗ヒトインテグリンα３マウスモノクローナル抗体（３Ｇ８）および抗ヒトインテグリンα３マウスモノクローナル抗体（８Ｆ１）は、それぞれ文献（Kikkawa, Y., Sanzen, N., Fujiwara, H., Sonnenberg, A., and Sekiguchi, K. (2000) J. Cell Sci. 113, 869-876 および Manabe, R., Ohe, N., Maeda, T., Fukuda, T., and Sekiguchi, K. (1997) J. Cell Biol. 139, 295-307）に記載の方法で自作した。抗インテグリンサブユニットα６モノクローナル抗体（ＡＭＣＩ７−４）は、片山政彦博士（エーザイ筑波研究所）から分与を受けた（Katayama, M., Sanzen, N., Funakoshi, A., and Sekiguchi, K. (2003) Cancer Res. 63, 222-229）。抗ヒトインテグリンβ１マウスモノクローナル抗体（ＡＩＩＢ２）は、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａＢａｎｋ（アイオワ）から入手した。抗ヒトインテグリンα２サブユニットマウスモノクローナル抗体（Ｐ１Ｅ６）、抗ヒトインテグリンα９β１マウスモノクローナル抗体（Ｙ９Ａ２）、およびマウスノーマルＩｇＧは、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗マウスインテグリンα９ヤギポリクローナル抗体は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから入手した。ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧＭ２抗体および抗ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体は、それぞれシグマおよびキアゲンから入手した。抗Ｖｅｌｃｒｏ抗体は、文献（Takagi, J., Erickson, H. P., and Springer, T. A. (2001) Nat. Struct. Biol. 8, 412-416）の記載に従い、コイルドコイル酸性および塩基性ペプチドをウサギに免疫することにより作製した。

〔実験結果〕
（１）組み換えｐｏｌｙｄｏｍの確認
マウス免疫グロブリンκ鎖のシグナル配列を有する組み換えｐｏｌｙｄｏｍ発現用の細胞を培養した培地を抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いてアフィニティー精製し、得られたｐｏｌｙｄｏｍを非還元または還元条件で６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

結果を図２に示した。図２から明らかなように、非還元条件（ＮＲ）で２２０ｋＤａおよび１００ｋＤａの２つの主要なバンドを検出した。還元条件（Ｒ）でも同様のバンドパターンが得られたが、非還元条件より移動速度が少し遅かった（２７０ｋＤａおよび１１５ｋＤａ）。この結果から、両者はいずれもペプチド内ジスルフィド結合に富んでいることが示唆された。両タンパク質バンドのＮ末端のアミノ酸配列を決定したところ、１１５ｋＤａのバンドはＤＡＡＱから始まっており、マウス免疫グロブリンκ鎖のシグナル配列を除いたＮ末端の配列と推定された。一方、２７０ｋＤａのバンドはＶＡＰＧから始まっており、これは配列番号２の第１１７７位〜第１１８０位と一致し、Ｎ末端は第１番ＥＧＦドメインに位置した。これらの結果から、ｐｏｌｙｄｏｍは分泌後または分泌前にタンパク質分解処理されて２つのパート、すなわちＮ末端側の１１５ｋＤａフラグメントとＣ末端側の２７０ｋＤａフラグメントに分かれるが、タンパク質分解的切断後も結合が維持されることが示唆された。

次に、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端にＨｉｓタグを有する組み換えｐｏｌｙｄｏｍを２９３−Ｆ細胞を用いて発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体ビーズまたはＮｉ−ＮＴＡビーズを用いて培地および細胞溶解液から組み換えｐｏｌｙｄｏｍを沈殿させた。沈殿物を還元条件で５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗Ｈｉｓ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。陰性コントロールとして、遺伝子を導入していない２９３−Ｆ細胞を用いて同様の手順で行った。

結果を図３（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は抗Ｈｉｓ抗体による免疫ブロッティングの結果であり、（Ｂ）は抗ＦＬＡＧ抗体による免疫ブロッティングの結果である。図３中ｍｅｄは培地、ｃｅｌｌは細胞溶解液を表し、ＨｉｓはＮｉ−ＮＴＡビーズによる沈殿物、ＦＬＡＧは抗ＦＬＡＧ抗体ビーズによる沈殿物を表す。レーン１は陰性コントロール、レーン２は組み換えｐｏｌｙｄｏｍである。使用したビーズの種類に関わらず、培地由来の沈殿物から２７０ｋＤａおよび１１５ｋＤａの２つのフラグメントが回収され、これらのフラグメントが結合したままであることが確認された。明らかに３００ｋＤａの移動度を越える高分子量のバンドが、細胞溶解液由来の両方のビーズによる沈殿物から検出された（図３（Ａ）および（Ｂ）のアローヘッド）。この結果から、Ｎ末端１１５ｋＤａおよびＣ末端２７０ｋＤａの各フラグメントへのタンパク質分解処理は、分泌後に生じていると考えられた。

（２）ｐｏｌｙｄｏｍはα９β１インテグリン依存性細胞接着を媒介する
ヒト肺腺癌由来Ａ５４９細胞、ヒト線維肉腫由来ＨＴ１０８０細胞およびヒト横紋筋肉腫由来ＲＤ細胞の３種類のヒト細胞株を用いて、ｐｏｌｙｄｏｍが細胞接着を促進するか否かについて検討した。全長ｐｏｌｙｄｏｍ、ｐｏｌ−Ｎ、ｐｏｌ−Ｃまたは血漿フィブロネクチン（ＦＮ）を段階希釈した濃度でコーティングした９６穴プレートに細胞を播種して３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄により非接着細胞を除いた後、接着細胞を固定してトルイジンブルーで染色した。接着細胞を顕微鏡でカウントした。実験はトリプリケートで行った。

ＲＤ細胞の結果を図４に示した。図４から明らかなように、ＲＤ細胞は濃度依存的に全長ｐｏｌｙｄｏｍに接着し、コーティング濃度３μｇ／ｍｌでマキシマムに達した。ｐｏｌ−Ｎまたはｐｏｌ−Ｃをコーティングした場合は、ｐｏｌ−Ｃのみが細胞接着を促進でき、全長ｐｏｌｙｄｏｍとほぼ同等の能力であった。示していないが、Ａ５４９細胞およびＨＴ１０８０細胞はｐｏｌｙｄｏｍに接着しなかった。

図５は、ＲＤ細胞と全長ｐｏｌｙｄｏｍ、ｐｏｌ−Ｃまたはフィブロネクチンとの接着の状態を顕微鏡で観察した結果である。図５からわかるように、全長ｐｏｌｙｄｏｍまたはｐｏｌ−Ｃと接着している細胞は、伸展した形態をとっているが、フィブロネクチンに接着している細胞より伸展の程度は少なかった。
これらの結果から、ｐｏｌｙｄｏｍは細胞の接着およびそれに続く細胞の伸展を媒介できること、細胞接着促成活性は、ＣＣＰドメインが多数並んで構成されるＣ末端領域に存在することが示された。

次に、ＲＤ細胞のｐｏｌｙｄｏｍへの接着が、ＥＣＭタンパク質の主要な細胞表面受容体であるインテグリンに依存するかどうかを調べた。９６穴プレートに全長ｐｏｌｙｄｏｍ（３μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌ−Ｃ（３μｇ／ｍｌ）または血漿フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ）をコートした。ＲＤ細胞を、７種類の機能阻害モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と室温で１０分間プレインキュベーションした後、ウェルに添加した。７種類の機能阻害モノクローナル抗体は、コントロールマウスＩｇＧ（ＩｇＧ）、抗インテグリンβ１モノクローナル抗体ＡＩＩＢ２（β１）、抗インテグリンα２モノクローナル抗体Ｐ１Ｅ６（α２）、抗インテグリンα３モノクローナル抗体３Ｇ８（α３）、抗インテグリンα５モノクローナル抗体８Ｆ１（α５）、抗インテグリンα６モノクローナル抗体ＧｏＨ３（α６）および抗インテグリンα９β１モノクローナル抗体Ｙ９Ａ２（α９）である。３７℃で３０分間インキュベーションした後、非結合細胞を洗い流した。続いて、接着細胞を固定し、トルイジンブルーで染色した。

結果を図６に示した。図中、接着細胞数はコントロールマウスＩｇＧ処理における接着細胞数（１００％）に対するパーセンテージとして表した。図６から明らかなように、インテグリンβ１サブユニットに対するモノクローナル抗体は、ＲＤ細胞のｐｏｌｙｄｏｍへの接着を強く阻害した。α２、α３、α５およびα６サブユニットに対するモノクローナル抗体は、ＲＤ細胞のｐｏｌｙｄｏｍへの接着を阻害しなかったが、α９β１に対するモノクローナル抗体は、ＲＤ細胞のｐｏｌｙｄｏｍへの接着を強く阻害した。この結果は、Ａ５４９細胞およびＨＴ１０８０細胞がｐｏｌｙｄｏｍに接着しなかったことと一致する。ＲＤ細胞にはインテグリンα９β１が発現しており、Ａ５４９細胞およびＨＴ１０８０細胞には発現していないからである。したがって、ｐｏｌｙｄｏｍへの接着は、インテグリンα９β１によって一次的に仲介されると考えられた。

（３）ｐｏｌｙｄｏｍはインテグリンα９β１の好ましいリガンドである
ｐｏｌｙｄｏｍの接着受容体としてのインテグリンα９β１の役割を確認するために、組み換えインテグリンα９β１を用いて直接インテグリン結合アッセイを行った。すなわち、全長ｐｏｌｙｄｏｍ、ｐｏｌ−Ｎ、ｐｏｌ−Ｃ、血漿フィブロネクチン（ｐＦＮ）および細胞フィブロネクチン（ｃＦＮ）をコートしたプレートに、１ｍＭＭｎＣｌ_２または１０ｍＭＥＤＴＡ存在下で組み換えインテグリンα９β１を接着させた。陰性対照にＢＳＡを用いた。結合したインテグリンは、ビオチン化した抗Ｖｅｌｃｒｏ抗体およびＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いて定量した。

結果を図７に示した。図７から明らかなように、組み換えインテグリンα９β１は、全長ｐｏｌｙｄｏｍおよびｐｏｌ−Ｃと結合したが、ｐｏｌ−Ｎとは結合しなかった。組み換えインテグリンα９β１のｐｏｌｙｄｏｍへの結合がＥＤＴＡの存在により完全に消失したことから、インテグリン結合アッセイの特異性が確認された。ＥＩＩＩＡドメインを含む細胞フィブロネクチンは、インテグリンα９β１の推定のリガンドであるが、組み換えインテグリンα９β１はこれに対してわずかな結合活性を示したに過ぎなかった。これらの結果は細胞接着アッセイの結果と一致し、インテグリンα９β１が直接に結合すること、インテグリン結合部位はｐｏｌｙｄｏｍのＣ末端側２７０ｋＤａの領域に存在することが確認された。

インテグリンα９β１は、テネイシンＣの第３フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（ＴＮｆｎ３）およびオステオポンチンのＮ末端側半分（ＯＰＮ−Ｎｈａｌｆ）と結合することが知られている。そこで、インテグリンα９β１リガンドをＧＳＴ融合タンパク質として組み換え発現させ、精製した。その中の細胞接着モチーフＲＧＤを、ＲＧＤ結合インテグリン（例えば、αｖサブユニットを含むもの）と相互作用する能力を完全に消失させるためにＲＡＡに置き換えた。ｐｏｌ−Ｃ（１０ｎＭ）、ＧＳＴ−ＴＮｆｎ３ＲＡＡ（１００ｎＭ）、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ＮｈａｌｆＲＡＡ（１００ｎＭ）をコートしたマイクロプレートに１ｍＭＭｎＣｌ_２存在下でインテグリンα９β１を結合させた。

結果を図８に示した。図８から明らかなように、ＴＮｆｎ３ＲＡＡおよびＯＰＮ−ＮｈａｌｆＲＡＡはインテグリンα９β１との結合能を有したが、インテグリンα９β１への親和性はｐｏｌ−Ｃと比較して有意に低かった。インテグリンの最高濃度においても結合の飽和が不十分であったため、これらのインテグリンα９β１リガンドの見掛けの解離常数を求めることができなかったが、インテグリンα９β１とｐｏｌ−Ｃとの間の解離常数は、独立した３回の測定結果から３２．４±２．７ｎＭと見積もられた。

（４）インテグリンα９β１はＣＣＰ２１に結合する
ｐｏｌｙｄｏｍ内のインテグリンα９β１結合部位を見つけるために、５種類のｐｏｌｙｄｏｍＮ末端欠失変異体シリーズを作製した（ｐｏｌ−Ｃ、ΔＥＧＦ６、ΔＰＴＸ、ΔＣＣＰ２０およびΔＣＣＰ２１、図９参照）。これらの組み換えタンパク質（１０ｎＭ）をマイクロタイタープレートにコートし、１ｍＭＭｎＣｌ_２または１０ｍＭＥＤＴＡ存在下で、インテグリンα９β１に対する結合活性を評価した。

結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、ＣＣＰ２１より上流を欠失してもｐｏｌ−Ｃのインテグリン結合活性は低下しなかったが、ＣＣＰ２１の欠失は、インテグリン結合活性を劇的に低下させたことから、ＣＣＰ２１がインテグリン結合活性の重要な役割を果たしていることが明らかとなった。ＣＣＰ２１がインテグリンα９β１結合部位を有することを確認するために、ＧＳＴ融合タンパク質として組み換えＣＣＰ２１を作製し、インテグリンα９β１結合活性を調べた。図１０に示したように、ＣＣＰ２１のみでも十分なインテグリンα９β１結合活性を有しており、ＣＣＰ２１がインテグリン結合活性に重要な役割を果たしていることを確認した。

図１１は、クラスタルＷを用いてアライメントした第２０番、第２１番、第２２番ＣＣＰドメインのアミノ酸配列を示した図である。ｐｏｌｙｄｏｍに含まれる合計３４個のＣＣＰドメインのなかで、ＣＣＰ２１は他のＣＣＰドメインと比較して、約４０個の余分なアミノ酸が含まれる点でユニークである。そこで、ＣＣＰ２１内の余分な部分（以下、「エクストラセグメント」という）がインテグリンα９β１との結合に関与することを確認するための実験を行った。すなわち、ＧＳＴ融合ＣＣＰ２１、ＧＳＴ融合ＣＣＰ２１のＤ２６２８−Ｓ２６６４欠失変異体（ＣＣＰ２１ΔＤ２６２８−Ｓ２６６４）、Ｄ２６２８−Ｓ２６６４のみ（図１１参照）、ｐｏｌ−ＣまたはＧＳＴのみをマイクロタイタープレートにコートし、１ｍＭＭｎＣｌ_２または１０ｍＭＥＤＴＡ存在下で、インテグリンα９β１を結合させた。

結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、ＣＣＰ２１ΔＤ２６２８−Ｓ２６６４はインテグリンα９β１と結合することができず、Ｄ２６２８−Ｓ２６６４はインテグリンα９β１との結合活性を維持していた。この結果から、ｐｏｌｙｄｏｍのインテグリンα９β１結合部位は、ＣＣＰ２１のエクストラセグメントの３７アミノ酸（Ｄ２６２８−Ｓ２６６４）部分に存在することが明らかとなった。

（５）インテグリンα９β１は配列ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ配列を認識する
インテグリンα９β１との結合に対応する領域をさらに狭めるために、ＣＣＰ２１のエクストラセグメントの３７アミノ酸部分をさらに小さな部分に分割し、ＧＳＴ融合タンパク質として作製した。ＣＣＰ２１、ｐｏｌ−Ｃ、ＧＳＴのみを含む８種類の断片を、それぞれマイクロタイタープレートにコートし、１ｍＭＭｎＣｌ_２または１０ｍＭＥＤＴＡ存在下で、インテグリンα９β１を結合させた。

結果を図１３に示した。図１３から明らかなように、インテグリンα９β１はＤ２６２８−Ｓ２６６４のＮ末端側の、Ｄ２６２８−Ｌ２６４５およびＤ２６３４−Ｌ２６４５とのみ結合した。この結果から、インテグリンα９β１結合部位は、ＣＣＰ２１のエクストラセグメント内の１２アミノ酸部分（Ｄ２６３４−Ｌ２６４５）にマップできることが明らかとなった。

インテグリンα９β１との結合に関与するアミノ酸残基を特定するために、Ｄ２６３４−Ｌ２６４５のアラニンスキャニング変異体およびＮ末端またはＣ末端の欠失変異体をＧＳＴ融合タンパク質として作製した。各断片をそれぞれマイクロタイタープレートにコートし、インテグリンα９β１を結合させた。

アラニンスキャニング変異体を図１４に示した。図１４から明らかなように、グルタミン酸２６４１をアラニンに代えた変異体（Ｅ２６４１Ａ）は、インテグリン結合活性をほぼ完全に失った。グルタミン酸２６３６〜チロシン２６４４のアラニン変異体は、それぞれ異なる程度でインテグリン結合活性の一部低下を引き起こした。この結果から、インテグリンα９β１は配列ＥＤＤＭＭＥＶＰＹを認識し、その中のグルタミン酸２６４１が、インテグリンα９β１のリガンド認識に決定的に関与する酸性残基であることが明らかとなった。

さらに、インテグリンα９β１の認識配列としてのＥＤＤＭＭＥＶＰＹの役割を確認するために、ＥＤＤＭＭＥＶＰＹまたはその一部の配列からなる合成ペプチドを用いて、インテグリンα９β１のｐｏｌ−Ｃへの結合阻害アッセイを行った。ｐｏｌ−Ｃ（１０ｎＭ）をコートしたマイクロタイタープレートに１ｍＭＭｎＣｌ_２および各濃度の合成ペプチド存在下で、インテグリンα９β１（１０ｎＭ）をインキュベーションした。ペプチドの沈殿を防止するために、１０％ＤＭＳＯの存在下で実験を行った。ｐｏｌ−Ｃへのインテグリンα９β１の結合量を１００％として、相対結合率を求めた。

結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、ＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドは、ｐｏｌ−Ｃとインテグリンα９β１との結合を濃度依存的に阻害し、そのＩＣ５０は０．１８μＭであった。より小さいＤＭＭＥＶＰＹペプチドは、ＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドに近いインテグリンα９β１結合阻害能を有していた。この結果は、Ｎ末端のグルタミン酸−アスパラギン酸のインテグリンα９β１結合への貢献が相対的に小さいことと一致した。さらに、ＤＭＭＥＶＰＹペプチドからＣ末端のチロシンを欠失したペプチドは、阻害能が減少したことから、インテグリンα９β１によるＣＣＰ２１の認識におけるチロシン２６４４の関与を支持した。ＤＭＭＥＶＰＹペプチドのグルタミン酸２６４１のアラニン置換体は、阻害能の顕著な減少を示し、インテグリンα９β１によるＣＣＰ２１の認識におけるグルタミン酸２６４１の重要性と一致した。

さらに、テネイシンＣおよびフィブロネクチンＥＩＩＩＡドメインにおけるインテグリンα９β１認識配列として知られているＡＥＩＤＧＩＥＬペプチドおよびＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥペプチドの結合阻害活性を、ＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドの結合阻害活性と比較し、図１５に示した。図１５から明らかなように、ＡＥＩＤＧＩＥＬペプチドはインテグリンα９β１のｐｏｌ−Ｃへの結合を阻害できたが、その能力はＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドより一桁小さく、ＩＣ５０は７．８μＭであった。ＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥペプチドは、インテグリンα９β１のｐｏｌ−Ｃへの結合をほとんど阻害しなかった。この結果は、インテグリンα９β１が、テネイシンＣおよび他の公知のリガンドより有意に高い親和性でｐｏｌｙｄｏｍに結合するとの結論を支持し、ＥＤＤＭＭＥＶＰＹがインテグリンα９β１によるリガンド認識の好ましい配列であるとの結論を支持する。

（６）ｐｏｌｙｄｏｍは組織においてインテグリンα９と一部一緒に局在する
ｐｏｌｙｄｏｍのインテグリンα９β１に対する相対的に高い結合親和性は、ｐｏｌｙｄｏｍがインテグリンα９β１の生理的リガンドとして機能することを暗示する。この可能性を確認するために、マウス胚の組織を抗ｐｏｌｙｄｏｍ抗体および抗インテグリンα９抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。

結果を図１６に示した。ｐｏｌｙｄｏｍは、胃および腸の粘膜下間葉にインテグリンα９と共局在した（図１６のＡ〜Ｆ）。インテグリンα９は、胃および腸の平滑筋層に発現し、そこにはｐｏｌｙｄｏｍはほとんど発現していない。ｐｏｌｙｄｏｍおよびインテグリンα９は肝臓の類洞で共局在し（図１６のＧ〜Ｉ）、腎臓では、ボーマン嚢および尿細管の間の間葉領域で共局在した（図１６のＪ〜Ｌ）。肺では、ｐｏｌｙｄｏｍは間葉に検出され、そこにはインテグリンα９が部分的にだけ共局在した（図１６のＭ〜Ｏ）。インテグリンα９は、肺の平滑筋層に強く発現したが、そこではｐｏｌｙｄｏｍは検出されなかった。これらの結果から、ｐｏｌｙｄｏｍは、インテグリンα９が強く発現した平滑筋層を除く種々の臓器の胚間葉でインテグリンα９と共局在することが証明され、ｐｏｌｙｄｏｍがインテグリンα９の生理的リガンドの１つとしての役割を果たす可能性と一致した。

インテグリンα９β１に対する生理的リガンドとしてのｐｏｌｙｄｏｍの役割をさらに確認するために、組織全体のインテグリンα９β１リガンドを可視化するｉｎｓｉｔｕインテグリン結合アッセイを行った。
結果を図１７に示した。図１７のＡ、ＥおよびＩに示したように、マウス胚の凍結切片とインテグリンα９β１とをＭｎ^２＋存在下でインキュベーションした場合、インテグリンα９β１のリガンドは間葉、ならびに胃、腸および肺の平滑筋層に検出された。図１７のＤ、ＨおよびＬに示したように、ＥＤＴＡ存在下でインキュベーションした場合は、何も検出されず、ｉｎｓｉｔｕインテグリン結合アッセイの特異性が確認された。図１７のＢ、ＦおよびＪに示したように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM５５５標識抗ｐｏｌｙｄｏｍ抗体を用いた免疫蛍光染色によりｐｏｌｙｄｏｍを検出したところ、図１７のＣ、ＧおよびＫに示したように、ｐｏｌｙｄｏｍの検出部位は、胃、腸および肺の間葉領域におけるインテグリンα９β１の結合部位と重複した。この結果は、ｐｏｌｙｄｏｍがこれらの臓器における間葉ＥＣＭの生理的インテグリンα９β１リガンドとして役に立っているとの結論を支持するものである。

［実施例２：新規インテグリンα９β１リガンドと造血幹細胞との相互作用］
６〜７週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）３匹の大腿骨および頸骨からフラッシュ操作により骨髄細胞を回収し、回収した骨髄細胞を２２Ｇの注射針を用いて分離分散させた。ビオチン標識ｌｉｎｅａｇｅ抗体を３０分反応させた後、抗ビオチン抗体標識磁気ビーズを反応させ、自動磁気細胞分離装置ａｕｔｏＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec）を用いてｌｉｎｅａｇｅ陽性細胞を除いた。さらに、ＰＥ−ＣＤ３、ＰＥ−Ｍａｃ１、ＰＥ−Ｇｒ１、ＰＥ−Ｔｅｒ１１９、ＰＥ−Ｂ２２０、ＦＩＴＣ−Ｓｃａ１およびＡＰＣ−ｃ−Ｋｉｔで染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いてｌｉｎｅａｇｅ（−）Ｓｃａ１（＋）ｃ−Ｋｉｔ（ｈｉｇｈ）細胞分画を選別し、以下の実験に使用した。

（１）造血幹細胞の増殖および分化に関する検討
組み換えｐｏｌｙｄｏｍタンパク質またはフィブロネクチンをコートした４８穴プレートに上記細胞を播種した。コントロールとして何もコートしていないプレートを用いた。培地は１０％ウシ胎児血清、ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（30 ng/mL）、ｆｌｔ３ｌｉｇａｎｄ（100 ng/mL）を含むＲＰＭＩを用いた。増殖検討には、細胞を１０００個／ウェルで各コートにつき２ウェル播種して培養を開始し、培養開始時、２日目および３日目に細胞数をカウントした。残りの細胞は全てを３等分して各コートのウェルに播種し、培養開始から３日目にＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳ解析は、ＰＥ−ＣＤ３、ＰＥ−Ｍａｃ１、ＰＥ−Ｇｒ１、ＰＥ−Ｔｅｒ１１９、ＰＥ−Ｂ２２０、ＦＩＴＣ−Ｓｃａ１およびＡＰＣ−ｃ−Ｋｉｔの抗体カクテルで染色し、ＦＡＣＳＣｏｎｔを用いて行った。

増殖検討の結果を図１８に示した。図１８から明らかなように、フィブロネクチンコート上の細胞は、コントロールと同様に増殖したが、ｐｏｌｙｄｏｍコート上の細胞は、増殖が著しく抑制されていた。
ＦＡＣＳ解析の結果を図１９に示した。図１９中、縦軸はｃ−Ｋｉｔの発現量を示し、横軸はＳｃａ１の発現量を示す。図１９から明らかなように、ｐｏｌｙｄｏｍコート上の細胞は、Ｓｃａ１の発現を維持しているが、増殖因子受容体であるｃ−Ｋｉｔの発現が低下していた。一方、フィブロネクチンコート上の細胞は、ｃ−Ｋｉｔの発現が上昇していた。
以上の結果から、造血幹細胞はｐｏｌｙｄｏｍと相互作用することにより増殖が抑制され、未分化能が維持されると考えられた。

（２）造血幹細胞とｐｏｌｙｄｏｍタンパク質との相互作用に対するＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドの影響に関する検討
上記細胞を３群に分け、５０００個／ウェルで４８穴プレートに播種した。培地は１０％ウシ胎児血清、ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（30 ng/mL）、ｆｌｔ３ｌｉｇａｎｄ（100 ng/mL）を含むＲＰＭＩを用いた。ＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチド添加群には濃度が５０μＭとなるようにペプチドを２μｌ添加し、他の２群についてはＰＢＳを２μｌ添加して３７℃で２時間培養を行った。続いて、組み換えｐｏｌｙｄｏｍタンパク質またはフィブロネクチンをコートした４８穴プレートに細胞を移した。ペプチドを添加した細胞は組み換えｐｏｌｙｄｏｍタンパク質をコートしたプレートに、他の２群はそれぞれ組み換えｐｏｌｙｄｏｍタンパク質をコートしたプレートおよびフィブロネクチンをコートしたプレートに移した。３日間培養を続け、２日目、３日目および４日目に細胞数をカウントした。

結果を図２０に示した。図１８と同様に、フィブロネクチンコート上の細胞（図中、Fibronectin）は増殖したが、ｐｏｌｙｄｏｍコート上の細胞（図中、Polydom）は増殖が抑制された。一方、ＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドで処理した後にｐｏｌｙｄｏｍコート上で培養した細胞（図中、Polydom + peptide 50μM）は、フィブロネクチンコート上の細胞より速度は遅いものの増殖することが確認された。この結果は、ＥＤＤＭＭＥＶＰＹペプチドが造血幹細胞のインテグリンα９β１と結合したことにより、造血幹細胞のインテグリンα９β１とプレート上のｐｏｌｙｄｏｍとの相互作用が阻害されたことに起因するものと考えられた。

［実施例３：新規インテグリンα９β１リガンドと心臓幹細胞との相互作用］
（１）心臓幹細胞の分離
組織幹細胞は一般的に細胞周期の間隔が非常に長いため、ＤＮＡや細胞内に取り込まれた標識化合物が細胞分裂に伴う減衰を起こさず、長期間安定に保持されることが知られている。この性質を利用し、臭素化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のようなヌクレオチド類縁体、あるいは緑色蛍光蛋白質（green fluorescent protein、以下「ＧＦＰ」と記す）と核タンパク質ヒストンの融合タンパク質を用いて細胞を短期間標識し、これら標識を長期間保持する細胞（標識保持細胞）として組織幹細胞を同定・分離することが可能である。本実験では、ＲＯＳＡ２６プロモーターとテトラサイクリン誘導発現系を組み合わせ、ＧＦＰとヒストンＨ２Ｂの融合タンパク質（Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ）をマウスの出生前１週間から２週間にわたり心臓で発現させ、６週間後に心臓からＧＦＰ標識保持細胞として心臓幹細胞を分離した。

（２）心臓のＧＦＰ標識保持細胞におけるインテグリンα９の発現解析
ＧＦＰ標識保持細胞は、Ｈ２Ｂ−ＧＦＰを出生前後２週間にわたり強制発現させたのち、６週間チェイスしたマウスの心臓より調製した。心臓の細胞は０．１％コラゲナーゼＢ（Roche）、２．４Ｕ／ｍｌディスパーゼ（Life Technologies）を含むハンクス平衡塩溶液（以下「ＨＢＳＳ」と記す）を用い３７℃で３０分間処理することにより分散させた後、ＢＤＦａｌｃｏｎセルストレイナーに通して、単一細胞とした。得られた細胞をＧＦＰの蛍光を指標としてセルソーターＦＡＣＳＡｒｉａ（BD社製）を用いて分画し、ＧＦＰ陽性細胞を分離した（図２１参照）。１０^６個のＧＦＰ陽性細胞とＧＦＰ非陽性細胞を、抗マウスインテグリンα９抗体（R&D社）１μｇと１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ１００μｌに浮遊させ、氷中で３０分反応させた。１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ５００μｌで洗浄した後、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（R&D社、２０倍希釈で使用）と１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ１００μｌに細胞を懸濁し、氷中で２０分反応させ、細胞表面のインテグリンα９を蛍光標識した。１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ５００μｌで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ５００μｌに再懸濁し、セルソーターＦＡＣＳＡｒｉａによりインテグリンα９の発現を解析した。図２２に示すように、ＧＦＰ陽性細胞にはインテグリンα９を高発現する細胞が濃縮されることがわかった。

（３）インテグリンα９の免疫組織染色
心臓幹細胞がインテグリンα９を高発現していることを確認するため、ＧＦＰ標識保持細胞とインテグリンα９発現細胞を二重免疫蛍光染色により解析した。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰで心臓幹細胞を標識したマウス心臓の凍結切片を８μｍの厚さで作成し、３．７％ホルマリンで１０分間固定した。３％ＢＳＡを含むＰＢＳにより室温で３０分間ブロッキングした後、抗マウスインテグリンα９抗体（５μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩反応させ、さらにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM５４６標識抗ヤギＩｇＧ抗体を用いて結合した抗体を蛍光標識した。蛍光標識されたインテグリンα９は共焦点顕微鏡により観察した。心臓幹細胞はＧＦＰ標識保持細胞として同定した。
結果を図２３に示した。左がＧＦＰ、右がインテグリンα９の染色像であり、図中矢頭はＧＦＰ標識保持細胞の位置を示す。図２３より、ＧＦＰ標識保持細胞は心外膜に主に局在しており、インテグリンα９発現細胞と局在部位が重なることが確認された。

（４）ｐｏｌｙｄｏｍの免疫組織染色
上記（３）と同様にして、インテグリンα９のリガンドであるｐｏｌｙｄｏｍが心臓幹細胞の周囲に発現しているかを二重免疫蛍光染色により検索した。抗ｐｏｌｙｄｏｍ抗体は２μｇ／ｍｌの濃度で用い、結合した抗ｐｏｌｙｄｏｍ抗体はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM５４６標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて可視化した。
結果を図２４に示した。左がＧＦＰ、右がｐｏｌｙｄｏｍの染色像であり、図中矢頭はＧＦＰ標識保持細胞の位置を示す。図２４より、ｐｏｌｙｄｏｍは心外膜のＧＦＰ標識保持細胞の周囲に限局して発現していた。この結果はｐｏｌｙｄｏｍが心臓幹細胞が発現するインテグリンα９β１のリガンドとして機能している可能性を支持している。

（５）ＧＦＰ標識保持細胞を用いた細胞接着アッセイ
ｐｏｌｙｄｏｍがインテグリンα９β１を発現する心臓幹細胞の足場として働くことを確認するために、心臓幹細胞をＧＦＰ標識保持細胞として分離し、細胞接着アッセイを行った。１００ｎＭのｐｏｌｙｄｏｍまたはフィブロネクチンを９６穴イムノプレート（Nunc Maxisorp）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して４℃で一晩コーティングした。ＦＡＣＳＡｒｉａにより回収したＧＦＰ標識保持細胞を無血清イスコフ改変ダルベッコ培地（以下「ＩＭＤＭ」と記す）に１×１０^６細胞／ｍｌで懸濁後、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで１２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、３．７％ホルマリンを１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、細胞を１５分間固定した。その後、０．５％トルイジンブルー（１５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加えて１０分間インキュベートし、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄した。乾燥後、顕微鏡下で接着した細胞数を数えた。

結果を図２５に示した。上段は接着した細胞の顕微鏡写真であり、下段は細胞接着活性（１平方ミリメートル当たりの接着細胞数）を示すグラフである。図２５から明らかなように、何もコーティングしていないプレートには細胞はほとんど接着しなかったが、フィブロネクチンおよびｐｏｌｙｄｏｍをコーティングしたプレート上では多数の細胞が接着していた。ｐｏｌｙｄｏｍはフィブロネクチンと同等あるいはそれ以上の細胞接着活性を心臓幹細胞に対して有していた。

（６）ＧＦＰ標識保持細胞を用いたコロニー形成能の測定
ｐｏｌｙｄｏｍをコーティングしたプレート上で心臓幹細胞が増殖するか、コロニー形成を指標として測定した。１００ｎＭのｐｏｌｙｄｏｍまたはフィブロネクチンをＦａｌｃｏｎ６ウェルプレートに８００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して４℃で一晩コーティングした。ＦＡＣＳＡｒｉａにより回収したＧＦＰ標識保持細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭに懸濁後、１×１０^４細胞／ｗｅｌｌで播種して、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養した。培地交換は３日ごとに行い、２週間培養した。１ｍＭＣａＣｌ_２入りＨＢＳＳで洗浄後、ギムザ染色液（Merck）を１ｍｌ／ｗｅｌｌ加え、３０分後水道水で洗浄した。乾燥後、顕微鏡下でコロニー数を数えた。

結果を図２６に示した。（Ａ）はコロニー形成率を示すグラフであり、（Ｂ）は代表的なコロニーの形態を示す図である。コロニー形成能は播種した細胞に対する生じたコロニー数の百分率で示した。図２６から明らかなように、何もコーティングしていないプレート上ではコロニー形成率が０．２％以下であるのに対し、ｐｏｌｙｄｏｍをコーティングしたプレート上では約０．８％のコロニー形成率が観測された。フィブロネクチンをコーティングしたプレート上でのコロニー形成率は約０．４％であった。すなわち、ｐｏｌｙｄｏｍ上ではフィブロネクチン上よりも心臓幹細胞がコロニーを形成し易いことが示された。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims

以下の（Ａ）、（Ｂ１）または（Ｂ２）のアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とするインテグリンα９β１作用剤。
（Ａ）ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１位のＥ、第１位のＥと第２位のＤ、第９位のＹ、第１位のＥと第９位のＹまたは第１位のＥと第２位のＤと第９位のＹが欠失または任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（Ｂ２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第４位のＭ、第７位のＶまたは第８位のＰがアラニンに置換したアミノ酸配列
ＳＶＥＰ１またはその活性断片である請求項１に記載のインテグリンα９β１作用剤。
アミノ酸残基数が２５００以下である請求項１または２に記載のインテグリンα９β１作用剤。
ＳＶＥＰ１とインテグリンα９β１との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、以下の（Ａ）、（Ｂ１）または（Ｂ２）のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
（Ａ）ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１位のＥ、第１位のＥと第２位のＤ、第９位のＹ、第１位のＥと第９位のＹまたは第１位のＥと第２位のＤと第９位のＹが欠失または任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（Ｂ２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第４位のＭ、第７位のＶまたは第８位のＰがアラニンに置換したアミノ酸配列
インテグリンα９β１発現細胞を培養する方法であって、以下の（Ａ）、（Ｂ１）または（Ｂ２）のアミノ酸配列を有するペプチドを基質として用いることを特徴とする培養方法。
（Ａ）ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１位のＥ、第１位のＥと第２位のＤ、第９位のＹ、第１位のＥと第９位のＹまたは第１位のＥと第２位のＤと第９位のＹが欠失または任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（Ｂ２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第４位のＭ、第７位のＶまたは第８位のＰがアラニンに置換したアミノ酸配列
組織幹細胞の未分化性を維持したまま増殖を抑制する培養方法であって、以下の（Ａ）、（Ｂ１）または（Ｂ２）のアミノ酸配列を有するペプチドを基質として用いることを特徴とする培養方法。
（Ａ）ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１位のＥ、第１位のＥと第２位のＤ、第９位のＹ、第１位のＥと第９位のＹまたは第１位のＥと第２位のＤと第９位のＹが欠失または任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（Ｂ２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第４位のＭ、第７位のＶまたは第８位のＰがアラニンに置換したアミノ酸配列
インテグリンα９β１発現細胞を分離する方法であって、以下の（Ａ）、（Ｂ１）または（Ｂ２）のアミノ酸配列を有するペプチドと結合する細胞を選択して分離することを特徴とする分離方法。
（Ａ）ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１位のＥ、第１位のＥと第２位のＤ、第９位のＹ、第１位のＥと第９位のＹまたは第１位のＥと第２位のＤと第９位のＹが欠失または任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（Ｂ２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第４位のＭ、第７位のＶまたは第８位のＰがアラニンに置換したアミノ酸配列
インテグリンα９β１発現細胞に薬物を送達するシステムであって、以下の（Ａ）、（Ｂ１）または（Ｂ２）のアミノ酸配列を有するペプチド、および薬物を含むことを特徴とする薬物送達システム。
（Ａ）ＥＤＤＭＭＥＶＰＹ（配列番号１）
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１位のＥ、第１位のＥと第２位のＤ、第９位のＹ、第１位のＥと第９位のＹまたは第１位のＥと第２位のＤと第９位のＹが欠失または任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（Ｂ２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第４位のＭ、第７位のＶまたは第８位のＰがアラニンに置換したアミノ酸配列