JP6283040B2 - 細菌によるポリペプチド送達のための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月7日付で出願された米国仮特許出願第61/774,282号の、米国特許法119条(e)の下での恩典を主張するものであり、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号ROAGM094941の下で政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2014年3月5日付で作出された前記ASCIIのコピーは、030258-075551-PCT_SL.txtと命名され、サイズが201,687バイトである。

技術分野
本明細書において記述される技術は、標的細胞へのポリペプチドの送達に関する。

背景
細胞への外因性タンパク質の導入は、導入遺伝子またはタンパク質それ自体の導入によって達成することができる。トランスジェニック法は、強力ではあるが、典型的には、外来物質の永続的導入を意味するので、結果的に起こる標的細胞ゲノムの変化が、とりわけ治療との関連においては、複雑な事態をもたらす。現行のタンパク質送達の方法は、治療への応用から細胞のリプログラミングに至るまで、労働集約型の精製プロセス、低いタンパク質収量および非効率的な細胞内ターゲティング、いくつかの技術の困難な状況によって制限される。

概要
本明細書において記述される技術は、ポリペプチドを標的細胞へ送達するための組成物および方法を対象にする。新規の送達方法は、少なくとも部分的には、3型分泌システム(T3SS)およびT3SS適合性基質を含むように非病原性細菌が改変されるならば、該細菌を利用して、ポリペプチドを標的細胞へ送達できるという発見に基づいている。

1つの局面において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列と、T3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含み、標的細胞または標的生物に対して非病原性である、操作された非病原性の微生物細胞が、本明細書において記述される。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、微生物細胞にとって外因性である。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、標的細胞に対して異所性である。いくつかの態様において、細胞は、T3SS主要調節因子をコードする第3の核酸配列を含む。いくつかの態様において、T3SS主要調節因子は、VirBおよびVirFからなる群より選択される。いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子は、virB; acp; ipaA; ipaB; ipaC; ipaD; ipgC; ipgB1; ipgA; icsB; ipgD; ipgE; ipgF; mxiG; mxiH; mxiI; mxiJ; mxiK; mxiN; mxiL; mxiM; mxiE; mxiD; mxiC; mxiA; spa15; spa47; spa13; spa32; spa33; spa24; spa9; spa29; およびspa40を含む。いくつかの態様において、3型分泌システム(T3SS)は、シゲラ属の種(Shigella spp); サルモネラ属の種(Salmonella spp); 腸管病原性大腸菌(E. coli); およびエルシニア属の種(Yersinia spp)からなる群より選択される細菌にとって内因性のポリペプチドを含む。

いくつかの態様において、第1の核酸配列はプラスミド上に位置する。いくつかの態様において、第1の核酸配列は染色体上に位置する。いくつかの態様において、非病原性の生物は、大腸菌NISSLE 1917 (EcN); 大腸菌K12; および派生株からなる群より選択される。いくつかの態様において、大腸菌K12の派生体である菌株は、大腸菌DH10βおよび大腸菌DH5αからなる群より選択される。いくつかの態様において、非病原性の生物は、大腸菌MinT3である。いくつかの態様において、非病原性の生物は、1つまたは複数のT3SS構成成分の欠失または変異によって操作されている。いくつかの態様において、1つまたは複数のT3SS構成成分は、毒素; T3SSエフェクター; T3SS構造ポリペプチド; およびT3SS構成成分の主要調節因子からなる群より選択される。いくつかの態様において、T3SS構成成分はプラスミド上に位置する。典型的には、細菌が大腸菌であるなら、T3SSはまた、主要調節因子を含む。

いくつかの態様において、病原性微生物細胞は、サルモネラ属の種; シゲラ属の種; およびエルシニア属の種からなる群より選択される。いくつかの態様において、病原性微生物細胞は、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium) SPI1およびフレクスナー赤痢菌(Shigella felxneri) mxi-spaからなる群より選択される。

いくつかの態様において、細胞は、標的細胞への接着を増大させる1種または複数種のポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、標的細胞への接着を増大させるポリペプチドは、Tirおよびインチミンを含む。いくつかの態様において、標的細胞への接着を増大させるポリペプチドは、細菌接着; Afa1; AIDA; 侵入; または標的細胞ポリペプチドの細胞外エピトープに特異的な一本鎖抗体からなる群より選択される。

いくつかの態様において、ポリペプチドは、N末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントに機能的に連結される。いくつかの態様において、3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントは、MxiE認識配列; および誘導性プロモーターからなる群より選択される。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードする核酸は、誘導性プロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードする核酸は、染色体上に位置する。いくつかの態様において、ポリペプチドは抗炎症性ポリペプチドである。いくつかの態様において、抗炎症性ポリペプチドは、細菌抗炎症性ポリペプチド; NF-κBシグナル伝達を阻害する細菌ポリペプチド; OspG; OspF; IpaH9.8; SseL; YopJ; NleB; NleC; NleE; NleH1; OspLからなる群より選択される。

いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、片利共生の腸内微生物細胞である。いくつかの態様において、片利共生の腸内微生物細胞は、大腸菌、例えば、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)である。

いくつかの態様において、3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドは毒素である。いくつかの態様において、3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドは腫瘍抑制ポリペプチドである。いくつかの態様において、3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドはリプログラミング因子である。いくつかの態様において、リプログラミング因子は、Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Lin28; Nanog; Sal4; Dppa2; Ezh2; およびEsrrbからなる群より選択される。いくつかの態様において、3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドは分化転換因子である。いくつかの態様において、分化転換因子は、myoDからなる群より選択される筋細胞分化転換因子である。いくつかの態様において、分化転換因子は、Gata4; Mec2F; およびTbs5からなる群より選択される心筋細胞分化転換因子である。いくつかの態様において、3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドは抗原である。いくつかの態様において、抗原は腸内病原体に由来する。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、標的細胞へポリペプチドを導入する方法であって、該標的細胞を、本明細書において記述される操作された微生物細胞と接触させる段階を含む該方法に関する。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、本明細書において記述される操作された微生物細胞を投与する段階を含む、対象における炎症を低減させる方法に関する。いくつかの態様において、対象は自己免疫疾患の処置を必要としている。いくつかの態様において、炎症は胃腸管の炎症である。いくつかの態様において、対象は、喘息; 炎症性腸疾患; クローン病; 肥満; および潰瘍性結腸炎からなる群より選択される状態の処置を必要としている。いくつかの態様において、操作された微生物細胞は経口的に投与される。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、本明細書において記述される操作された微生物細胞を投与する段階を含む、対象における増殖性疾患を処置する方法に関する。いくつかの態様において、増殖性疾患はがんである。いくつかの態様において、がんは胃腸管のがんであり、かつ微生物細胞は経口的に投与される。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、本明細書において記述される操作された微生物細胞を投与する段階を含む、対象における増殖性疾患を処置する方法に関する。いくつかの態様において、微生物細胞は経口的に投与される。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、標的細胞をリプログラミング/分化転換させる方法または標的細胞のリプログラミング/分化転換の効率を増大させる方法であって、該細胞を、本明細書において記述される操作された微生物細胞と接触させる段階を含む該方法に関する。いくつかの態様において、本方法は、標的細胞および操作された微生物細胞を抗生物質と接触させる段階; 未付着の微生物細胞および抗生物質を除去する段階; ならびに標的細胞を第2の操作された微生物細胞と接触させる段階をさらに含む。いくつかの態様において、これらの段階は少なくとも1回繰り返される。いくつかの態様において、標的細胞は、操作された微生物細胞と少なくとも5日間にわたって少なくとも毎日接触される。いくつかの態様において、標的細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)表現型にリプログラミングされる細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、分化転換される細胞である。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、本明細書において記述される操作された微生物細胞を含むキットに関する。1つの局面において、本明細書において記述される技術は、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列と標的細胞にとって外因性であるT3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含み標的細胞に対して非病原性である操作された微生物細胞を含むキットに関する。
[本発明1001]
機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列と、
T3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列と
を含み、標的細胞または標的生物に対して非病原性である、操作された非病原性の微生物細胞。
[本発明1002]
T3SS適合性ポリペプチドが、微生物細胞にとって外因性である、本発明1001の操作された微生物細胞。
[本発明1003]
T3SS適合性ポリペプチドが、標的細胞に対して異所性である、本発明1001〜1002のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1004]
T3SS主要調節因子をコードする第3の核酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1005]
T3SS主要調節因子が、VirBおよびVirFからなる群より選択される、本発明1001〜1004のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1006]
機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子が、virB、acp、ipaA、ipaB、ipaC、ipaD、ipgC、ipgB1、ipgA、icsB、ipgD、ipgE、ipgF、mxiG、mxiH、mxiI、mxiJ、mxiK、mxiN、mxiL、mxiM、mxiE、mxiD、mxiC、mxiA、spa15、spa47、spa13、spa32、spa33、spa24、spa9、spa29、およびspa40を含む、本発明1001〜1005のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1007]
3型分泌システム(T3SS)が、シゲラ属の種(Shigella spp)、サルモネラ属の種(Salmonella spp)、腸管病原性大腸菌(E. coli)、およびエルシニア属の種(Yersinia spp)からなる群より選択される細菌にとって内因性のポリペプチドを含む、本発明1006の操作された微生物細胞。
[本発明1008]
第1の核酸配列がプラスミド上に位置する、本発明1001〜1007のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1009]
第1の核酸配列が染色体上に位置する、本発明1001〜1007のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1010]
非病原性の生物が、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)、大腸菌K12、および派生株からなる群より選択される、本発明1001〜1009のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1011]
大腸菌K12の派生体である菌株が、大腸菌DH10βおよび大腸菌DH5αからなる群より選択される、本発明1010の操作された微生物細胞。
[本発明1012]
非病原性の生物が、1つまたは複数のT3SS構成成分の欠失または変異によって操作されている、本発明1001〜1009のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1013]
1つまたは複数のT3SS構成成分が、毒素、T3SSエフェクター、T3SS構造ポリペプチド、およびT3SS構成成分の主要調節因子からなる群より選択される、本発明1012の操作された微生物細胞。
[本発明1014]
T3SS構成成分がプラスミド上に位置する、本発明1012〜1013のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1015]
病原性の微生物細胞が、サルモネラ属の種、シゲラ属の種、およびエルシニア属の種からなる群より選択される、本発明1012〜1014のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1016]
病原性の微生物細胞が、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium) SPI1およびフレクスナー赤痢菌(Shigella felxneri) mxi-spaからなる群より選択される、本発明1015の操作された微生物細胞。
[本発明1017]
標的細胞への接着を増大させる1種または複数種のポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1001〜1016のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1018]
標的細胞への接着を増大させるポリペプチドが、Tirおよびインチミンを含む、本発明1017の操作された微生物細胞。
[本発明1019]
標的細胞への接着を増大させるポリペプチドが、細菌接着、Afa1、AIDA、侵入、または標的細胞ポリペプチドの細胞外エピトープに特異的な一本鎖抗体からなる群より選択される、本発明1018の操作された微生物細胞。
[本発明1020]
ポリペプチドが、N末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含む、本発明1001〜1019のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1021]
ポリペプチドをコードする核酸配列が、3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントに機能的に連結されている、本発明1001〜1020のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1022]
3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントが、MxiE認識配列および誘導性プロモーターからなる群より選択される、本発明1021の操作された微生物細胞。
[本発明1023]
ポリペプチドをコードする核酸が、誘導性プロモーターに機能的に連結されている、本発明1001〜1022のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1024]
ポリペプチドをコードする核酸が、染色体上に位置する、本発明1001〜1023のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1025]
ポリペプチドが抗炎症性ポリペプチドである、本発明1001〜1024のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1026]
抗炎症性ポリペプチドが、細菌抗炎症性ポリペプチド、NF-κBシグナル伝達を阻害する細菌ポリペプチド、OspG、OspF、IpaH9.8、SseL、YopJ、NleB、NleC、NleE、NleH1、OspLからなる群より選択される、本発明1025の操作された微生物細胞。
[本発明1027]
非病原性の微生物細胞が、片利共生の腸内微生物細胞である、本発明1025〜1026のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1028]
片利共生の腸内微生物細胞が、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)である、本発明1025〜1027のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1029]
3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが毒素である、本発明1001〜1024のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1030]
3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが腫瘍抑制ポリペプチドである、本発明1001〜1024のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1031]
3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドがリプログラミング因子である、本発明1001〜1024のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1032]
リプログラミング因子が、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog、Sal4、Dppa2、Ezh2、およびEsrrbからなる群より選択される、本発明1031の操作された微生物細胞。
[本発明1033]
3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが分化転換因子である、本発明1001〜1024のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1034]
分化転換因子が、myoDからなる群より選択される筋細胞分化転換因子である、本発明1033の操作された微生物細胞。
[本発明1035]
分化転換因子が、Gata4、Mec2F、およびTbs5からなる群より選択される心筋細胞分化転換因子である、本発明1033の操作された微生物細胞。
[本発明1036]
3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが抗原である、本発明1001〜1024のいずれかの操作された微生物細胞。
[本発明1037]
抗原が腸内病原体に由来する、本発明1036の操作された微生物細胞。
[本発明1038]
標的細胞へポリペプチドを導入する方法であって、該標的細胞を、本発明1001〜1037のいずれかの操作された微生物細胞と接触させる段階を含む方法。
[本発明1039]
対象における炎症を低減させる方法であって、本発明1025〜1028のいずれかの操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む方法。
[本発明1040]
対象が自己免疫疾患の処置を必要としている、本発明1039の方法。
[本発明1041]
炎症が胃腸管の炎症である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
対象が、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、および潰瘍性結腸炎からなる群より選択される状態の処置を必要としている、本発明1039〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
操作された微生物細胞が経口的に投与される、本発明1039〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
対象における増殖性疾患を処置する方法であって、本発明1029〜1030のいずれかの操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む方法。
[本発明1045]
増殖性疾患が、がんである、本発明1044の方法。
[本発明1046]
がんが胃腸管のがんであり、かつ微生物細胞が経口的に投与される、本発明1045の方法。
[本発明1047]
対象における増殖性疾患を処置する方法であって、本発明1036〜1037のいずれかの操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む方法。
[本発明1048]
微生物細胞が経口的に投与される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
標的細胞をリプログラミング/分化転換させるか、または標的細胞のリプログラミング/分化転換の効率を増大させる方法であって、該細胞を、本発明1031〜1035のいずれかの操作された微生物細胞と接触させる段階を含む方法。
[本発明1050]
(a) 標的細胞および操作された微生物細胞を抗生物質と接触させる段階;
(b) 未付着の微生物細胞および抗生物質を除去する段階; ならびに
(c) 標的細胞を第2の操作された微生物細胞と接触させる段階
をさらに含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
段階(a)〜(c)が少なくとも1回繰り返される、本発明1050の方法。
[本発明1052]
標的細胞が、操作された微生物細胞と少なくとも5日間にわたって少なくとも毎日接触される、本発明1049〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
標的細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)表現型にリプログラミングされる細胞である、本発明1049〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
標的細胞が、分化転換される細胞である、本発明1049〜1052のいずれかの方法。
[本発明1055]
本発明1001〜1037のいずれかの操作された微生物細胞を含むキット。
[本発明1056]
機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列と、
標的細胞にとって外因性であるT3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列と
を含み、標的細胞に対して非病原性である、操作された微生物細胞
を含むキット。
[本発明1057]
炎症を低減させるための、本発明1025〜1028または1036〜1037のいずれかの操作された微生物細胞の使用であって、炎症の低減を必要としている対象に該細胞を投与することを含む使用。
[本発明1058]
対象が自己免疫疾患の処置を必要としている、本発明1057の使用。
[本発明1059]
炎症が胃腸管の炎症である、本発明1057の使用。
[本発明1060]
対象が、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、および潰瘍性結腸炎からなる群より選択される状態の処置を必要としている、本発明1057〜1059のいずれかの使用。
[本発明1061]
操作された微生物細胞が経口的に投与される、本発明1057〜1060のいずれかの使用。
[本発明1062]
増殖性疾患を低減処置するための、本発明1029〜1030または1036〜1037のいずれかの操作された微生物細胞の使用であって、増殖性疾患の処置を必要としている対象に該細胞を投与することを含む使用。
[本発明1063]
増殖性疾患が、がんである、本発明1062の使用。
[本発明1064]
がんが胃腸管のがんであり、かつ微生物細胞が経口的に投与される、本発明1063の使用。

実施例6において記述される2つの系統の図を示す。

詳細な説明
細菌性病原体のなかには、細菌ポリペプチド(エフェクター)を宿主細胞へ送達するための針様システムとして働く3型分泌システム(T3SS)を含むものがある。これらのエフェクターポリペプチドは、典型的には、細菌細胞の病毒性に寄与する。対照的に、片利共生微生物はT3SSを含むと記述されていない。

生物送達システムを作出するために機能的T3SSを発現する非病原性の細菌細胞を操作により作製することにより、標的真核細胞に多種多様なペプチドを導入するための新規の方法が本明細書において記述される。1) 機能的3型分泌システム(T3SS)とT3SSに適合する少なくとも1つのポリペプチドとの両方を発現するように操作されている非病原性の細菌細胞に関する組成物および方法も本明細書において記述される。本明細書において記述される組成物およびシステムを用いて標的真核細胞へ送達されうる多種多様のポリペプチドにより、それに見合った幅広い用途、例えば治療法およびリプログラミングが企図される。

1つの局面において、(1) 機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列と; (2) T3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含み、標的細胞または標的生物に対して非病原性である、操作された非病原性の微生物細胞が、本明細書において記述される。

例えば、本明細書の実施例において記述されるように、機能的シゲラT3SS (31 kbにわたる)をコードする2つのオペロンを含んだプラスミドが作出された。

本明細書の実施例において記述されるように、誘導性プロモーター(例えばIPTG調節可能なプロモーター)の制御下に1つまたは複数の抗炎症性T3SS基質を含んだベクター(例えばプラスミド)が、いくつかの用途において用いられる。本明細書の実施例において記述されるように、MxiE応答性プロモーターの制御下に1つまたは複数の抗炎症性T3SS基質を含みかつ細菌ゲノムへ組み込まれる構築体が、いくつかの用途において用いられる。本明細書の実施例において記述される実験において用いた例示的な抗炎症性T3SS基質としては、NleH1 (例えば、NCBI Gene ID No: 8215433 (SEQ ID NO:1として開示するDNA配列; SEQ ID NO:2として開示するPRT配列)); OspG (例えば、NCBI Gene ID No: 13917115 (SEQ ID NO:3として開示するDNA配列; SEQ ID NO:4として開示するPRT配列)); OspF (例えば、NCBI Gene ID No: 13917039 (SEQ ID NO:5として開示するDNA配列; SEQ ID NO:6として開示するPRT配列)); IpaH9.8 (例えば、NCBI Gene ID No: 13917118 (SEQ ID NO:7として開示するDNA配列; SEQ ID NO:8として開示するPRT配列)); SseL (例えば、NCBI Gene ID No: 1253809 (SEQ ID NO:9として開示するDNA配列; SEQ ID NO:10として開示するPRT配列)); YopJ (例えば、NCBI Gene ID No: 1149272 (SEQ ID NO:11として開示するDNA配列; SEQ ID NO:12として開示するPRT配列)); NleB (例えば、NCBI Gene ID No: 8869954 (SEQ ID NO:13として開示するDNA配列; SEQ ID NO:14として開示するPRT配列)); NleC (例えば、NCBI Gene ID No: 8869955 (SEQ ID NO:15として開示するDNA配列; SEQ ID NO:16として開示するPRT配列)); およびNleE (例えば、NCBI Gene ID No: 8872603 (SEQ ID NO:17として開示するDNA配列; SEQ ID NO:18として開示するPRT配列))が挙げられる。本明細書の実施例において記述されるように、MyoDをコードする遺伝子を含んだ構築体が、いくつかの用途において(例えば本明細書の他の箇所に記述されるように筋細胞表現型への分化転換を誘導するために)用いられる。

例えば、MyoDをコードする遺伝子を含んだ構築体が、本明細書の実施例において記述されるように線維芽細胞(例えばマウス胚線維芽細胞)へ送達される。さらなる例として、抗炎症性T3SS基質(例えばNleH1; OspG; OspF; IpaH9.8; SseL; YopJ; NleB; NleC; および/またはNleE)を含んだ構築体が、本明細書の実施例において記述されるように腸上皮細胞へ送達される。

本明細書において用いられる場合、「標的細胞」は、細菌T3SSによって送達されるポリペプチドを受けうる細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は脊椎動物を構成する細胞、または脊椎動物に由来する細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は哺乳動物を構成する細胞、または哺乳動物に由来する細胞である。「標的生物」は、少なくとも1つの「標的細胞」を含んだ生物である。標的細胞はインビトロにあってもまたはインビボにあってもよい。いくつかの態様において、標的細胞は単離された標的細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は単離された標的細胞ではない。いくつかの態様において、標的細胞は標的生物の一部である。本明細書の実施例において記述されるように、線維芽細胞(例えばマウス胚線維芽細胞)が、いくつかの用途において(例えば本明細書の他の箇所に記述されるようにiPSC細胞を作出する場合に)例示的な標的細胞として用いられる。本明細書の実施例において記述されるように、上皮細胞(例えば極性をもった腸上皮細胞、例えばCaco-2細胞)が、いくつかの用途において(例えば本明細書の他の箇所に記述されるように抗炎症性ペプチドを送達する場合に)例示的な標的細胞として用いられる。本明細書の実施例において記述されるように、HEK293がいくつかの用途において(例えば本明細書の他の箇所に記述されるようにペプチドを送達する場合に)例示的な標的細胞として用いられる。本明細書の実施例において記述されるように、TRUC (T-bet-/-×Rag2-/-潰瘍性結腸炎)マウスが、いくつかの用途において(例えば本明細書の他の箇所に記述されるように抗炎症性ペプチドを送達する場合に)例示的な標的生物として用いられた。

本明細書において用いられる場合、用語「非病原性」は、標的細胞に悪影響を及ぼさない微生物細胞をいい、すなわち非病原性の微生物細胞の存在下において、標的細胞は、統計的に有意に増加した細胞死亡率を有しないし、統計的に有意に減少した代謝率または変化した成長率および/もしくは分裂率も有しない。それゆえ、細胞が標的細胞に対して非病原性であるかどうかは、例えば標的細胞が位置している環境および微生物細胞の濃度に依って、変化しうるものと認識される。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、インビトロにおいて、微生物細胞が標的細胞と比べて50倍未満の濃度で存在する場合に標的細胞に悪影響を及ぼさないなら非病原性である。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、標的細胞に悪影響を及ぼす毒素を発現しないものでありうる。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、標的細胞内で複製しないものでありうる。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、標的細胞の細胞質において見出されないものでありうる。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、標的細胞の細胞質において見出されないが、しかし標的細胞のファゴソームにおいて見出されるものでありうる。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、片利共生の微生物細胞でありうる。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は、非免疫原性の微生物細胞、すなわち微生物細胞が存在する場合に標的細胞に、増加したレベルの、例えばIL-8を分泌させない細胞でありうる。

ヒト標的細胞に対して非病原性の微生物細胞の非限定的な例としては、大腸菌K12; 大腸菌DH5α、大腸菌HB101、大腸菌BL21、大腸菌DH10β、大腸菌JM110、大腸菌MinT3、および病毒性矯正済(virulence-cured)のシゲラ株(例えばT3SSおよび>20T3SS適合性エフェクターをコードする病毒性プラスミドを欠損しているもの)を挙げることができるが、これらに限定されることはない。ヒト対象に対して片利共生の微生物細胞の非限定的な例としては、大腸菌NISSLE 1917 (EcN); 大腸菌83972; 大腸菌M17が挙げられるが、これらに限定されることはない。本明細書の実施例において記述されるように、大腸菌NISSLE 1917がいくつかの用途において用いられる。本明細書の実施例において記述されるように、大腸菌K12および/またはDH5αがいくつかの用途において用いられる。本明細書の実施例において記述されるように、既知のエフェクターのいずれをももはやコードしない、または少なくとももはや発現しない非病毒性のフレクスナー赤痢菌(S. flexneri)および/またはネズミチフス菌(S. typhimurium)株(例えばエフェクターおよび/またはエフェクターの発現を制御する既知の主要転写調節因子の欠失された菌株)が、いくつかの用途において用いられる。

T3SSは、グラム陰性細菌において見出される多タンパク質構造である。それは、細菌細胞の細胞質からT3SS「針部」の内部を通して標的細胞の細胞質へとポリペプチドを移動させる。T3SSは、病原性株において見出され、例えば、シゲラ、サルモネラ、大腸菌、バークホルデリア(Burkholderia)、エルシニア、クラミジア(Chlamydia)、シュードモナス(Pseudomonas)、エルウィニア(Erwinia)、ラルストニア(Ralstonia)、リゾビウム(Rhizobium)、ビブリオ(Vibrio)、およびキサントモナス(Xanthamonas)の病原性分離株において観察されている。T3SSのさらなる考察は、例えば、Izore et al. Structure 2011 19:603-612; Korotkov et al. Nature Reviews Microbiology 2012 10:336-351; Wooldridge, K. (ed) Bacterial Secreted Proteins. Caster Academic Press 2009; Snyder and Champness (eds.) Molecular Genetics of Bacteria. 3^rd Ed. ASM Press: 2007において見出すことができる; これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

所与の野生型細胞における一連のT3SS関連タンパク質は、典型的には、構造タンパク質(針部それ自体を形成するタンパク質)、基質タンパク質(針部を通じて宿主へ運搬されるタンパク質)、ならびにシャペロン(細胞質内のエフェクターに結合してエフェクターを保護し、処理し、および/または針部へと往復輸送するタンパク質)に分けられる。本明細書において用いられる場合、「機能的T3SS」は、最低限、少なくとも1つのポリペプチドを標的細胞へ移動させるために必要とされる構造タンパク質のセットをいう。いくつかの態様において、機能的T3SSシステムは、1つまたは複数のシャペロンタンパク質を含みうる。いくつかの態様において、機能的T3SSは、病毒性因子ではない1つまたは複数の、例えば、2つ、3つ、または4つの基質(例えば、特定の輸送体)を含みうる。いくつかの態様において、機能的T3SSは、標的細胞へ送達される病毒性因子を含まない。

本明細書において用いられる場合、「病毒性因子」は、感染にとって有益であり、かつ標的細胞にとって有害であるように標的細胞に影響を与え、かつ/または標的細胞を操作する基質をいい、すなわち、それらは標的細胞の正常な機能をかく乱する。病毒性因子の作用の例としては、アクチン重合の調節、アポトーシスの誘導、細胞周期の調節、遺伝子転写の調節が挙げられるが、これらに限定されることはない。全ての基質が必ずしも病毒性因子であるわけではない。非限定的な例として、T3SS (および機能的T3SS)は、輸送体といわれるタンパク質を含みうる。これらの基質は、完全な形態に近づくとT3SSにより分泌され、標的細胞膜の中に細孔を作り出し、さらなる基質が標的細胞の細胞質内へ送達されることを可能にし、すなわち輸送体は、それらが針部を通じて標的細胞へ移動するという点で基質であり、かつまた、それらが、他の基質を標的細胞内へ送達する構造の一部を形成するという点で構造タンパク質である。いくつかの態様において、単一のポリペプチドが輸送体および病毒性因子の両方であることができる(例えばシゲラのIpaB)。

いくつかの態様において、機能的T3SSは1つまたは複数の輸送体を含みうる。

いくつかの態様において、機能的T3SSは、病毒性因子活性をも有する輸送体を含まない。

機能的T3SSに必要とされる最小セットのタンパク質は、例えば、移動されるポリペプチドの同一性、T3SSの起源、非病原性の細菌細胞の同一性、および/または宿主細胞の同一性に依って、変化しうる。

いくつかの態様において、機能的T3SSは、1つもしくは複数の針部単量体ポリペプチド、内部ロッドポリペプチド、リング部ポリペプチド、1つもしくは複数の輸送体、針先部ポリペプチド、ルーラー・ポリペプチド、および/またはATPaseを含みうる。

いくつかの態様において、機能的T3SSは針部単量体ポリペプチド(例えばMxiH (例えば、NCBI Gene ID No: 1238256 (SEQ ID NO:19として開示するDNA配列; SEQ ID NO:20として開示するPRT配列)); PrgI (例えば、NCBI Gene ID No: 1254396 (SEQ ID NO:21として開示するDNA配列; SEQ ID NO:22として開示するPRT配列)); YscF (例えば、NCBI Gene ID No: 1172700 (SEQ ID NO:23として開示するDNA配列; SEQ ID NO:24として開示するPRT配列)); および/またはEscF (例えば、NCBI Gene ID No: 8873370 (SEQ ID NO:25として開示するDNA配列; SEQ ID NO:26として開示するPRT配列)))、内部ロッドポリペプチド(例えばMxiI (例えば、NCBI Gene ID No: 1238257 (SEQ ID NO:27として開示するDNA配列; SEQ ID NO:28として開示するPRT配列)); PrgJ (例えば、NCBI Gene ID No: 1254395 (SEQ ID NO:29として開示するDNA配列; SEQ ID NO:30として開示するPRT配列)); YscI (例えば、NCBI Gene ID No: 2767498 (SEQ ID NO:31として開示するDNA配列; SEQ ID NO:32として開示するPRT配列)); および/またはEscI (例えば、NCBI Gene ID No: 8219253 (SEQ ID NO:33として開示するDNA配列; SEQ ID NO:34として開示するPRT配列)))、リング部ポリペプチド、1つもしくは複数の輸送体(例えばIpaC (例えば、NCBI Gene ID No: 876448 (SEQ ID NO:35として開示するDNA配列; SEQ ID NO:36として開示するPRT配列)); SipB (例えば、NCBI Gene ID No: 1254408 (SEQ ID NO:37として開示するDNA配列; SEQ ID NO:38として開示するPRT配列)); SipC (例えば、NCBI Gene ID No: 1254407 (SEQ ID NO:39として開示するDNA配列; SEQ ID NO:40として開示するPRT配列)); YopB (例えば、NCBI Gene ID No: 1449456 (SEQ ID NO:41として開示するDNA配列; SEQ ID NO:42として開示するPRT配列)); YopD (例えば、NCBI Gene ID No: 1449455 (SEQ ID NO:43として開示するDNA配列; SEQ ID NO:44として開示するPRT配列)); EspD (例えば、NCBI Gene ID No: 885777 (SEQ ID NO:45として開示するDNA配列; SEQ ID NO:46として開示するPRT配列)); および/またはEspB (例えば、NCBI Gene ID No: 8474872 (SEQ ID NO:47として開示するDNA配列; SEQ ID NO:48として開示するPRT配列))); 針先部ポリペプチド(例えばIpaD (例えば、NCBI Gene ID No: 876444 (SEQ ID NO:49として開示するDNA配列; SEQ ID NO:50として開示するPRT配列)); SipD (例えば、NCBI Gene ID No: 1254406 (SEQ ID NO:51として開示するDNA配列; SEQ ID NO:52として開示するPRT配列)); LcrV (例えば、NCBI Gene ID No: 1172676 (SEQ ID NO:53として開示するDNA配列; SEQ ID NO:54として開示するPRT配列)); および/またはEspA (例えば、NCBI Gene ID No: 960865 (SEQ ID NO:55として開示するDNA配列; SEQ ID NO:56として開示するPRT配列))); ルーラー・ポリペプチド(例えばSpa32 (例えば、NCBI Gene ID No: 876502 (SEQ ID NO:57として開示するDNA配列; SEQ ID NO:58として開示するPRT配列)); InvJ (例えば、NCBI Gene ID No: 1254415 (SEQ ID NO:59として開示するDNA配列; SEQ ID NO:60として開示するPRT配列)); YscP (例えば、NCBI Gene ID No: 5798302 (SEQ ID NO:61として開示するDNA配列; SEQ ID NO:62として開示するPRT配列)); および/またはOrf16 (例えば、NCBI Gene ID No: 8219247 (SEQ ID NO:63として開示するDNA配列; SEQ ID NO:64として開示するPRT配列)))、ならびにATPase (例えばSpa47 (例えば、NCBI Gene ID No: 876429 (SEQ ID NO:65として開示するDNA配列; SEQ ID NO:66として開示するPRT配列)); InvC (例えば、NCBI Gene ID No: 1254417 (SEQ ID NO:67として開示するDNA配列; SEQ ID NO:68として開示するPRT配列)); YscN (例えば、NCBI Gene ID No: 10216379 (SEQ ID NO:69として開示するDNA配列; SEQ ID NO:70として開示するPRT配列)); および/またはSepB (EscNとしても公知) (例えば、NCBI Gene ID No: 8873386 (SEQ ID NO:71として開示するDNA配列; SEQ ID NO:72として開示するPRT配列)))を含みうる。いくつかの態様において、機能的T3SSは1つまたは複数の輸送体に対するシャペロン(例えばIpgC (例えば、NCBI Gene ID No: 1238043 (SEQ ID NO:73として開示するDNA配列; SEQ ID NO:74として開示するPRT配列)); SicA (例えば、NCBI Gene ID No: 1254409 (SEQ ID NO:75として開示するDNA配列; SEQ ID NO:76として開示するPRT配列)); SycD (例えば、NCBI Gene ID No: 2767486 (SEQ ID NO:77として開示するDNA配列; SEQ ID NO:78として開示するPRT配列)); および/またはCesD (例えば、NCBI Gene ID No: 7063867 (SEQ ID NO:79として開示するDNA配列; SEQ ID NO:80として開示するPRT配列)))をさらに含みうる。いくつかの態様において、機能的T3SSは1つまたは複数のスイッチ・ポリペプチド(例えばSpa40 (例えば、NCBI Gene ID No: 876433 (SEQ ID NO:81として開示するDNA配列; SEQ ID NO:82として開示するPRT配列)); SpaS (例えば、NCBI Gene ID No: 1254410 (SEQ ID NO:83として開示するDNA配列; SEQ ID NO:84として開示するPRT配列)); YscU (例えば、NCBI Gene ID No: 2767517 (SEQ ID NO:85として開示するDNA配列; SEQ ID NO:86として開示するPRT配列)); および/またはEscU (例えば、NCBI Gene ID No: 7062687 (SEQ ID NO:87として開示するDNA配列; SEQ ID NO:88として開示するPRT配列)))ならびにゲイトキーパー・ポリペプチド(例えばMxiC (例えば、NCBI Gene ID No: 876426 (SEQ ID NO:89として開示するDNA配列; SEQ ID NO:90として開示するPRT配列)); InvE (例えば、NCBI Gene ID No: 1254420 (SEQ ID NO:91として開示するDNA配列; SEQ ID NO:92として開示するPRT配列)); YopN (例えば、NCBI Gene ID No: 2767534 (SEQ ID NO:93として開示するDNA配列; SEQ ID NO:94として開示するPRT配列)); および/またはSepL (例えば、NCBI Gene ID No: 8873375 (SEQ ID NO:95として開示するDNA配列; SEQ ID NO:96として開示するPRT配列)))をさらに含みうる。

いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)は、シゲラ属の種; サルモネラ属の種; 腸管病原性大腸菌; およびエルシニア属の種からなる群より選択される細菌にとって内因性のポリペプチドを含みうる。いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子は、virB; acp; ipaA; ipaB; ipaC; ipaD; ipgC; ipgB1; ipgA; icsB; ipgD; ipgE; ipgF; mxiG; mxiH; mxiI; mxiJ; mxiK; mxiN; mxiL; mxiM; mxiE; mxiD; mxiC; mxiA; spa15; spa47; spa13; spa32; spa33; spa24; spa9; spa29; およびspa40ならびに/またはそれらの相同体を含む。

いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列は、1つの連続した配列を含みうる。いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列は、プラスミド上に位置する。いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列は、染色体(例えば天然に存在する染色体、修飾された内因性染色体、または細菌人工染色体(BAC))上に位置する。いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列は、1つまたは複数のオペロン、例えば1つのオペロン、2つのオペロン、3つのオペロン、またはそれ以上のオペロンを含むことができる。いくつかの態様において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列は、1つまたは複数の別個の配列および/または分子を含むことができる(例えば遺伝子の一部分が1つのプラスミド上に見出され、遺伝子の別の部分が第2のプラスミド上に見出される)。いくつかの態様において、第1の核酸配列は、例えば、ランディングパッド技術を用いて染色体へ組み込むことができ、例えば、Kuhlman and Cox, 2010 Nucleic Acids Research 38:e92を参照されたく; これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、機能的T3SSシステムは、非病原性細菌細胞へ導入することができる。代替的な態様において、機能的T3SSを含む病原性細菌細胞は、例えば1つまたは複数のT3SS構成成分の欠失または変異によって、非病原性となるように操作することができる。非病原性の細菌細胞を操作により作製するために欠失または変異されうるT3SS構成成分の非限定的な例としては、毒素; T3SS基質; T3SS構造ポリペプチド; T3SS構成成分の主要調節因子; およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。そのような欠失および/または変異は、当技術分野において記述されており、例えば、非限定的な例としては、病毒性プラスミドの除去によるネズミチフス菌の病毒性矯正(virulence-curing) (例えばGulig and Curtiss. Infect Immun 1987 55:2891-2901を参照されたく; これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)ならびに主要調節因子、例えば内因性T3SS基質をコードする遺伝子の主要調節因子の変異によるネズミチフス菌の病毒性矯正(例えば、Eichelberg and Galan. Infect immune 1999 67:4099-4105を参照されたく; これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)が挙げられる。いくつかの態様において、T3SS構成成分はプラスミド上に位置する。例えば、エルシニアおよびシゲラは、プラスミドにおいて3型分泌システムをコードする。いくつかの態様において、T3SS構成成分を含むプラスミドは、シゲラのような細菌細胞から取り出される。いくつかの態様において、病原性微生物細胞は、サルモネラ属の種; シゲラ属の種; およびエルシニア属の種からなる群より選択される。いくつかの態様において、病原性微生物細胞は、ネズミチフス菌SPI1およびフレクスナー赤痢菌mxi-spaからなる群より選択される。例えば、T3SSをコードするプラスミドを、病毒性プラスミド矯正済のシゲラ株へ導入することができる。

T3SSを介したポリペプチドの送達には、微生物細胞と標的細胞の接近が必要になる。したがって、いくつかの態様において、ポリペプチドの送達は、標的細胞への微生物細胞の接着を引き起こすことおよび/または増加させることにより増加または増強されうる。いくつかの態様において、操作された微生物細胞は、標的細胞への接着を増加させる1種または複数種のポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかのポリペプチドが接着を増加させることができる。

いくつかの態様において、標的細胞への接着を増加させるポリペプチドは、例えば腸管病原性大腸菌由来の、Tirおよびインチミンを含む。インチミンは外膜タンパク質である。TirはT3SSの基質であり、これは、標的細胞への送達によって、原形質膜へ組み込まれ、インチミンに対する受容体として作用する。いくつかの態様において、インチミンおよびTirをコードする核酸配列を含む操作された微生物細胞はまた、TirシャペロンCesTをコードする核酸配列も含みうる。

いくつかの態様において、標的細胞への接着を増加させるポリペプチドは、細菌アドヘシン; AfaI; AIDA; インベイシン; または標的細胞ポリペプチドの細胞外エピトープに特異的な一本鎖抗体からなる群より選択することができる。いくつかの態様において、標的細胞の細胞外エピトープは、特定細胞型へのポリペプチドの送達を標的とするために、特定の標的細胞型に特異的でありうるものであり、例えばがん細胞特異的なエピトープおよび/または組織特異的なエピトープでありうる。

本明細書において記述されるように、4つの内因性シゲラポリペプチドは、機能的3型分泌システムによって分泌される場合、細菌細胞が標的細胞へのその取込みを媒介することを可能とするのに十分である。したがって、これらの4つのポリペプチド(またはそれらの相同体)を含む本明細書において記述される操作された微生物細胞は、標的細胞により内部移行されえ、標的細胞への内部移行の前に、その間に、および/またはその後に、そのT3SS適合性ポリペプチドを送達することができる。標的細胞によるその取込みはまた、例えば、細胞死に至る先天性免疫応答をトリガーしうる。いくつかの態様において、取込みは、細胞死に至る可能性のある先天性免疫応答をトリガーしうる。そのような操作された微生物細胞は、例えば、標的細胞を、例えば固形腫瘍の処置の際に、死滅させることが望まれる方法において用いるのに適当でありうる。いくつかの態様において、片利共生細胞は、4つのシゲラポリペプチドおよび/またはそれらの相同体を含むように操作されている。いくつかの態様において、非病毒性となるように操作された病原性細胞は、4つのシゲラポリペプチドおよび/またはそれらの相同体を保持するように操作されている。いくつかの態様において、4つのシゲラポリペプチドのいずれか1つは、細菌細胞の取込みを誘導するのに十分である。いくつかの態様において、操作された細胞は、操作された細胞が、4つ未満のシゲラポリペプチドおよび/またはそれらの相同体、例えばポリペプチドの1つだけ、ポリペプチドの2つだけ、またはポリペプチドの3つだけを導入するように操作されている。

逆に、これらの内因性シゲラポリペプチドの4つ全てを欠く細胞は、標的細胞による取込みを媒介することができず、細胞外の環境にとどまる。そのような操作された細菌細胞は、例えば標的細胞をリプログラミングさせる場合または抗炎症性タンパク質を標的細胞に送達する場合に、先天性免疫応答を活性化することが望ましくない方法において用いるのに適当でありうる。いくつかの態様において、片利共生細胞は、4つのシゲラポリペプチドおよび/またはそれらの相同体のいずれも保持しない、例えばそれらのどのポリペプチドも保持しないように操作されている。いくつかの態様において、非病毒性となるように操作された病原性細胞は、4つのシゲラポリペプチドおよび/またはそれらの相同体のいずれも保持しない、例えばそれらのどのポリペプチドも保持しないように操作されている。

上述した4つの内因性シゲラポリペプチドは、IpgBl (例えば、NCBI Ref Seq: NP_858263 (SEQ ID NO:97)); IpgD (例えば、NCBI Ref Seq: NP_085296 (SEQ ID NO:98)); IpaA (例えば、NCBI Ref Seq: NP_858264 (SEQ ID NO:99))およびIcsB (例えば、NCBI Ref Seq: NP_085294 (SEQ ID NO:100))である。前述のシゲラポリペプチドの相同体も、本明細書において記述される組成物および方法で用いるのに企図される。非限定的な例としては、SopB (例えば、NCBI Ref Seq: NP_460064 (SEQ ID NO:101))がIpgDの相同体であり、SipA (例えば、NCBI Ref Seq: NP_461803 (SEQ ID NO:102))がIpaAの相同体である。数多くの種が、IpgB1の相同体であるRho GTP交換因子を有する。

任意の所与のポリペプチドまたは核酸配列の相同体は、例えば、BLASTプログラム(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/にてワールドワイドウェブ上で自由に利用できる)を用いて、例えば、自由に利用できる配列データベースを相同配列について検索することにより、または相同体を示唆している注釈(例えば遺伝子名を含むもしくは遺伝子の活性について記述している検索文字列)についてそれらのデータベースを問い合わせることにより見出すことができる。相同なアミノ酸またはDNA配列は、参照配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上同一でありうる。参照配列と第2の配列との間の相同性度(%同一性)は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用される自由に利用可能なコンピュータプログラムを用いて、その2つの配列を比較することにより判定されうる。

本明細書において記述される局面のいずれかのいくつかの態様において、相同体は、参照ポリペプチドと同じ機能、機能的特徴、および/または活性を有するポリペプチドでありうる。非限定的な例として、上記の4つの内因性シゲラポリペプチド(すなわちIpgB1; IpgD; IpaA; およびIcsB)の1つと同じ機能を有する相同体は、IpgB1; IpgD; IpaA; およびIcsBの1つを発現しないように、かつ推定上の機能的相同体を代わりに発現するように細菌を操作して、その後、標的細胞に侵入する細菌の能力を測定することにより特定されうる。細菌が標的細胞に侵入する参照能力の少なくとも10%を保持するなら、推定上の機能的相同体は機能的相同体であるものと実証される。いくつかの態様において、機能的相同体は参照ポリペプチドの活性の少なくとも10%、例えば参照ポリペプチドの活性の10%もしくはそれ以上、20%もしくはそれ以上、30%もしくはそれ以上、50%もしくはそれ以上、75%もしくはそれ以上、80%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、または100%もしくはそれ以上を有する。

機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列に加えて、本明細書において記述される操作された非病原性の微生物細胞は、T3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列をさらに含む。本明細書において用いられる場合、用語「T3SS適合性ポリペプチド」は、機能的T3SSの存在下において、標的細胞の細胞質へ送達されうる微生物細胞において発現される任意のポリペプチドをいう。T3SS適合性ポリペプチドは、任意の供給源由来であることができ、例えばポリペプチドは原核生物起源、真核生物起源、または合成起源を有することができる。T3SS適合性ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたはその変異体および/もしくは変種であることができる。変種T3SS適合性ポリペプチドにおいて、機能が実質的に同じままである限り、天然に存在するおよび/または野生型のポリペプチドと比べて1つまたは複数の残基が改変され、欠失され、および/または付加されうる。

いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、微生物細胞にとって外因性である。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、微生物細胞にとって内因性である。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、微生物細胞にとって異所性である。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、標的細胞に対して異所性である。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、標的細胞に対して外因性である。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、標的細胞に対して内因性である。

用語「外因性」は、その天然の供給源以外の細胞に存在する物質をいう。用語「外因性」は、本明細書において用いられる場合、核酸(例えばT3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸)またはポリペプチド(例えば、T3SS適合性ポリペプチド)であって、該核酸またはポリペプチドをその中で通常見出すことはないが、その中へ該核酸またはポリペプチドを導入することが望まれる細胞または生物などの生物システムへと人手を伴うプロセスにより導入された核酸またはポリペプチドをいうことができる。あるいは、「外因性」とは、核酸またはポリペプチドであって、該核酸またはポリペプチドをその中で少量で見出すことはあるが、その中の該核酸またはポリペプチドの量を増加させることが望まれる細胞または生物のような生物システムへと人手を伴うプロセスにより導入された核酸またはポリペプチドをいうことができる。物質(例えばT3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸および/またはT3SS適合性ポリペプチド)は、細胞へまたは該物質を受け継いだ細胞の祖先へ導入されているなら、外因性と考えられる。対照的に、用語「内因性」は、生物システムまたは細胞(例えば微生物細胞および/もしくは標的細胞)にとって天然である物質をいう。本明細書において用いられる場合、「異所性」とは、普通ではない位置および/または量で見出される物質をいう。異所性の物質は、所与の細胞において通常見出されるが、しかしはるかに少ない量でおよび/または異なる時点で見出されるものでありうる。

いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、T3SSを介して標的細胞へ送達される天然に存在する細菌ポリペプチド、例えば抗炎症作用を有するT3SS基質でありうる(本明細書において以下でさらに記述される)。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、微生物細胞にとって外因性であり、例えば、微生物細胞は、機能的T3SSを含むように操作されている天然には非病原性の微生物細胞であり、T3SS適合性ポリペプチドは、微生物細胞にとって外因性であるポリペプチドである。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、微生物細胞にとって内因性であり、例えば、微生物細胞は、内因性T3SSを有し、かつ非病原性となるように操作されているものであり、T3SS適合性ポリペプチドは内因性T3SS基質である。

いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは標的細胞に対して異所性である。本明細書において以下でさらに記述されるように、いくつかの態様において、本明細書において記述される微生物細胞は、標的細胞において見出される核酸配列によってコードされうる真核生物ポリペプチドを送達するために用いることができる。そのような態様において、微生物細胞を介した送達は、標的細胞におけるポリペプチドのレベルを増加させることを可能にし、例えば、所望とされるレベルのポリペプチドを通例発現しない細胞型においてある一定のレベルのポリペプチドを存在させることができる。さらなる非限定的な態様において、微生物細胞を介した送達は、所望とされるレベルのポリペプチドを通例発現しない細胞型においてポリペプチドのレベルを増加させることを可能にしうる。

いくつかの態様において、例えば、T3SS適合性ポリペプチドが、T3SSを介して内因性には送達されないポリペプチド配列を含む(例えば、ポリペプチド配列が真核細胞にとって内因性であるか、ポリペプチドが原核細胞にとって内因性であるが、しかし天然にはT3SS基質ではないか、または内因的には、操作された微生物細胞において存在するものとは異なるT3SSによって送達される原核生物ポリペプチドである)場合、T3SS適合性ポリペプチドは、N末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含むことができる。

天然に存在するT3SS基質は、ポリペプチドの最初の20アミノ酸のなかに分泌シグナルを含む。特定の天然に存在するT3SS基質は、ポリペプチドの最初の50アミノ酸のなかにシャペロン結合ドメインを含む。

したがって、いくつかの態様において、T3SS適合性ペプチドはN末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含むことができ、ここでT3SSシグナルはT3SS分泌シグナルを含む。いくつかの態様において、T3SS適合性ペプチドはN末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含むことができ、ここでT3SSシグナルは、天然に存在するT3SS基質の最初の20アミノ酸を含む。いくつかの態様において、T3SS適合性ペプチドはN末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含むことができ、ここでT3SSシグナルはT3SSシャペロン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、T3SS適合性ペプチドはT3SSシャペロン結合ドメインおよびN末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含むことができ、ここでT3SSシグナルは、天然に存在するT3SS基質の最初の約50アミノ酸から最初の約70アミノ酸を含む。いくつかの態様において、T3SSシグナルポリペプチドとの関連で、用語「約」は、±3アミノ酸をいうことができる。いくつかの態様において、T3SSシグナルポリペプチドとの関連で、用語「約」は、±2アミノ酸をいうことができる。いくつかの態様において、T3SSシグナルポリペプチドとの関連で、用語「約」は、±1アミノ酸をいうことができる。

T3SS分泌シグナルおよびシャペロン結合ドメインの例は、当技術分野において公知であり、例えば、Schmitz et al. Nat Methods 2009 6:500-2を参照されたく; これはシゲラエフェクターのシグナルおよびドメインについて記述しており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらなる例が当技術分野において、例えばSory et al. PNAS 1995 92: 11998-20002において公知であり; これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。T3SSシグナルは、標的細胞へ送達されれば、T3SS適合性ポリペプチドの非T3SSシグナル部分の活性を低減させうるものと企図される。したがって、いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドはT3SSシグナル配列の後に切断部位を含みうる。いくつかの態様において、切断部位は、標的細胞の内因性構成成分によって認識される部位、例えばカルパイン、スモ、および/またはフリン切断部位である。いくつかの態様において、切断部位の代わりに、T3SS適合性ポリペプチドは、T3SSシグナル配列の後にユビキチン分子を含むことができ、真核生物標的細胞によってユビキチン分子およびそのN末端の配列がポリペプチドの残りの部分から除去されるようになる。いくつかの態様において、ユビキチン分子のC末端の最初のアミノ酸は、メチオニンであることができる。

T3SS適合性ポリペプチドが発現されるために、T3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに機能的に連結されうる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは構成的に発現されうる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸は、構成性プロモーターに機能的に連結されうる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸は、誘導性に発現されうる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸は、誘導性プロモーターに機能的に連結されうる。

本明細書において記述される場合、「誘導性プロモーター」は、転写活性を、誘導因子もしくは誘導剤の存在下、誘導因子もしくは誘導剤による影響下、または誘導因子もしくは誘導剤による接触時に、該誘導因子もしくは誘導剤の非存在下、非影響下、または非接触時よりも惹起または増強することによって特徴付けられるものである。「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であってもよく、または誘導性プロモーターから転写活性を誘導する際に活性であるように投与される通常は外因性の化合物もしくはタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、誘導因子または誘導剤、例えば、化学物質、化合物またはタンパク質はそれ自体が、制御下にありうるか誘導性プロモーターでありうる核酸配列の転写または発現の結果であることができる(例えば、誘導因子は転写抑制因子タンパク質であることができる)。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、lacオペロンプロモーター、窒素感受性プロモーター、IPTG誘導性プロモーター、塩誘導性プロモーター、およびテトラサイクリン、ステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。原核細胞システムで用いるための誘導性プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム(Chang et al., Nature, 275: 615 (1978、これは参照により本明細書に組み入れられる); Goeddel et al., Nature, 281 : 544 (1979)、これは参照により本明細書に組み入れられる)、araBADプロモーターを含む、アラビノースプロモーターシステム(Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)、これは参照により本明細書に組み入れられる; Guzman et al., J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995)、これは参照により本明細書に組み入れられる; Siegele and Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997)、これは参照により本明細書に組み入れられる)、ラムノースプロモーター(Haldimann et al., J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998)、これは参照により本明細書に組み入れられる)、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980)、これは参照により本明細書に組み入れられる)、P_LtetO-1およびP_lac/are-1プロモーター(Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997)、これは参照により本明細書に組み入れられる)、ならびにtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーター(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)、これは参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。

本明細書において開示される方法およびシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは、pH、温度、放射線、浸透圧、塩勾配、細胞表面結合、および1つまたは複数の外来性もしくは内在性誘導剤の濃度の変化のような、1つまたは複数の生理的条件によって誘導されうる。外来性の誘導因子または誘導剤は、アミノ酸およびアミノ酸類似体、糖類および多糖類、核酸、タンパク質転写活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質類似体、ホルモン、ならびにそれらの組み合わせを含みうる。具体的な態様において、誘導性プロモーターは、化学物質、金属、温度、放射線、栄養素の濃度の変化またはpHの変化のような、環境条件の変化に応じて活性化または抑制される。したがって、本明細書において開示される方法およびシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは、ファージ誘導性プロモーター、栄養誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、放射線誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、ならびに/またはそれらのハイブリッドおよび組み合わせであることができる。適切な環境誘導因子は、熱(すなわち、熱パルスまたは一定熱暴露)、さまざまなステロイド化合物、2価陽イオン(Cu2+およびZn2+を含む)、ガラクトース、テトラサイクリン、IPTG (イソプロピル-β-Dチオガラクトシド)のほか、その他の天然および合成の誘導剤および無償性誘導因子(gratuitous inducer)への暴露を含むことができるが、これらに限定されることはない。

本明細書において開示される方法およびシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは、環境要因、外部物質、または別の遺伝子の産物の作用によって不活性化に供される「転写抑制因子」により抑制されるものも含む。そのような誘導性プロモーターは、本明細書において記述される生物学的スイッチコンバータの所与のモジュールまたは構成成分における他のタイプのプロモーターと区別するために必要とされる場合には「抑制性プロモーター」と呼ぶこともできる。本発明で用いるために好ましい抑制因子は、生理学的に穏和な作用物質による不活性化に感受性である。したがって、lacOオペレーター配列を含むように操作されているプロモーター配列の発現を制御するためにlac抑制タンパク質が用いられている場合、IPTGでの宿主細胞の処理により、lacOオペレーター配列を含む操作されたプロモーターからlac抑制因子を解離させ、転写を発生させる。同様に、tetOオペレーター配列を含むように操作されているプロモーター配列の発現を制御するためにtet抑制因子が用いられている場合、テトラサイクリンでの宿主細胞の処理により、操作されたプロモーターからtet抑制因子を解離させ、操作されたプロモーターの下流の配列の転写を発生させる。

T3SS適合性ポリペプチドの発現は、機能的T3SSが発現され、かつ/または活性である時点で最も適切でありうる。機能的T3SSが発現され、かつ/または活性であるとともにT3SS適合性ポリペプチドが発現されることを可能にする1つの方法は、ポリペプチドが3型分泌システム(T3SS)関連プロモーターまたはプロモーターエレメントに機能的に連結されることである。いくつかの態様において、T3SS関連プロモーターおよび/またはプロモーターエレメントは、構造的T3SS構成成分、および/またはT3SSシャペロン、および/またはT3SS基質の発現を内因的に制御するプロモーターおよび/またはプロモーターエレメントである。T3SS関連プロモーターおよび/またはプロモーターエレメントの非限定的な例としては、MxiEまたはVirB認識配列が挙げられ、これらは、例えば、Mavris et al. J Bact 2002 184:4409-19およびBeloin et al. JBC 2002 277: 15333-15344に記述されている; これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸は、原核生物ゲノム内に存在し、例えば該核酸はゲノムへ組み込まれていてもよい。典型的には、細菌においては、細菌染色体上の特異的部位への標的遺伝子に対する相同組み換えを用いる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター内に存在する。用語「ベクター」は、本明細書において用いられる場合、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築体をいう。本明細書において用いられる場合、ベクターはウイルス性であっても、または非ウイルス性であってもよい。外因性遺伝子を標的細胞へ移入するのに有用な多くのベクターが利用可能であり、例えば、ベクターはエピソーム、例えば、プラスミド、ウイルス由来ベクターであってよく、または相同組み換えもしくは無作為組み込みを通じて、標的細胞ゲノムへ組み込まれてもよい。いくつかの態様において、ベクターは発現ベクターでありうる。本明細書において用いられる場合、用語「発現ベクター」は、細胞において異種核酸断片を組み込み、かつ発現する能力を有するベクターをいう。発現ベクターはさらなるエレメントを含みうる。ベクターへ組み込まれた核酸は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御かつ調節する場合、発現制御配列に機能的に連結されている可能性がある。

いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸は、プラスミドの一部分のなかに存在する。プラスミドベクターは、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK +/-またはKS +/- (「Stratagene Cloning Systems」 Catalog (1993) from Stratagene, La Jolla, Califを参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる)、pQE、pIH821、pGEX、pETシリーズ(Studier et. al.,「Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes」, Gene Expression Technology, vol. 185 (1990)を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)を含むことができるが、これらに限定されることはない。

本明細書において用いられる場合、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも1つのエレメントを含み、かつウイルスベクター粒子へパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築体をいう。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりにトランスジェニック遺伝子を含むことができる。ベクターおよび/または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞へ任意の核酸を移入する目的のために利用されうる。数多くのウイルスベクターが当技術分野において公知であり、細胞への核酸の担体として用いられうる、例えばラムダベクターシステムgt11、gt WES.tB、Charon 4である。

抗炎症薬
いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは抗炎症性ポリペプチドを含むことができる。抗炎症性ポリペプチドの非限定的な例としては、細菌抗炎症性ポリペプチド; NF-κBシグナル伝達を阻害する細菌ポリペプチド; OspG; OspF; IpaH9.8; SseL; YopJ; NleB; NleC; NleE; NleH1; およびOspF (細菌抗炎症性タンパク質のさらなる考察は、例えば本明細書中の表1およびKim et al. PNAS 2005 102:14046-51; Arbibe et al.; Nat Immunol 2007 8:47-56; Ashida et al. Nat Cell Biol 2010 12:66-73; Sanada et al. Nature 2012 483:623-6; Le Negrate et al. J Immunol 2008 180:5045-56; Zhou et al. J Exp Med 2005 202: 1327-32; Newton et al. PLoS Pathog 2010 6:e1000898; Baruch et al. EMBO J 2011 30:221-231; Zhang et al. Nature 2011 481:204-8; Gao et al. PLoS Pathog 2009 5:e1000708を参照されたく; これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる)が挙げられる。いくつかの態様において、非病原性の微生物細胞は片利共生の腸内微生物細胞である。片利共生の腸内微生物細胞の非限定的な例は、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)である。1つの局面において、本明細書において記述される技術は、対象における炎症を低減させる方法であって、抗炎症性T3SS適合性ポリペプチドを含む操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む該方法に関する。いくつかの態様において、対象は自己免疫疾患の処置を必要としている。いくつかの態様において、炎症は胃腸管の炎症である。いくつかの態様において、対象は、喘息; 炎症性腸疾患; クローン病; 肥満; および潰瘍性結腸炎からなる群より選択される状態の処置を必要としている。いくつかの態様において、操作された微生物細胞は経口的に投与される。特定の病態、例えば肥満および喘息においては、対象の細菌叢が変化している(すなわち、微生物の種、および任意の所与の種によって構成される集団全体に占める比率が、健常個体において観察されるものとは異なる)。抗炎症性T3SS適合性ポリペプチドを含む操作された微生物細胞の投与は、対象の炎症状態を変化させることにより、対象内に存在する微生物の集団を、健常対象または正常対象におけるものによく似た集団に戻るようにさせうることが本明細書において企図される。この細菌叢調節は、それだけで、炎症状態の調節に加えて、対象に治療のおよび/または有益な効果を与えうる。

増殖性疾患の処置
いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは毒素である。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは標的細胞に対する毒素である。いくつかの態様において、毒素は、標的細胞の成長を阻害する天然に存在するT3SS基質でありうる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、腫瘍抑制ポリペプチドである。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、活性化されたがん遺伝子および/または腫瘍細胞の成長に不可欠な他のタンパク質を切除可能な、タレンまたは亜鉛フィンガーヌクレアーゼでありうる。いくつかの態様において、腫瘍細胞の成長に不可欠なタンパク質は、健常細胞の成長には非必須でありうる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは、腫瘍成長に不可欠なタンパク質の機能を遮断する。いくつかの態様において、操作された微生物は腫瘍細胞に向かうことができ、または腫瘍細胞に選択的に接着することができる。非限定的な例として、大腸菌NISSLE 1917は腫瘍に向かうことができ(例えば、Stritzker et al. I J Med Micro 2007 297: 151-162およびZhang et al. Appl Environ Microbiol 2012 78:7603-10を参照されたく; これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)、エルシニアのインベイシンを発現する微生物細胞は、結腸直腸がん細胞(これはその頂端表面に、結腸上皮細胞の側底面にのみ通常は見出されるβ-インテグリンを発現する)に選択的に結合することができ、または本明細書において記述される微生物細胞は、腫瘍特異的な細胞表面タンパク質を認識する抗体(例えば一本鎖抗体)を発現するようにさらに操作することができる。1つの局面において、対象における増殖性疾患を処置する方法であって、T3SS適合性毒素および/または腫瘍抑制ポリペプチドを含む操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む該方法が本明細書において記述される。いくつかの態様において、増殖性疾患はがんである。いくつかの態様において、がんは胃腸管のがんであり、かつ微生物細胞は経口的に投与される。

リプログラミングおよび分化転換
いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドはリプログラミング因子、例えば少なくとも部分的に分化した細胞に、より未分化な状態をとるようにさせる(またはその率/効率を増加させる)ポリペプチドである。リプログラミング因子は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Lin28; Nanog; Sal4; Dppa2; Ezh2; およびEsrrbを含む。リプログラミング因子のさらなる考察は、例えば、Sterneckert et al. Stem Cells 2012 30: 15-21; Plath et al. Nature Reviews Genetics 2011 12:253-265; Wang et al. EMBO Reports 2011 12:373-8; Mali et al. Stem cells 30:75-81; およびPapp and Plath. Cell Res 2011 21:486-501において見出すことができ; これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは分化転換因子、例えば細胞に、新たな分化表現型をとるようにさせる(またはその率/効率を増加させる) (例えば線維芽細胞を筋細胞および/または心筋細胞表現型へ分化転換させる)タンパク質である。分化転換因子は、当技術分野において公知であり、例えば線維芽細胞表現型から筋細胞表現型への分化転換を引き起こしうるmyoDおよびGata4; Mec2F; ならびに線維芽細胞表現型から心筋細胞表現型への分化転換を引き起こしうるTbs5を含む。分化転換因子のさらなる考察は、例えばPournasr et al. Stem Cells 2011 29: 1933-1941; Masip et al. Molecular Human Reproduction 2010 16:856-868; およびMa et al. Circ Res 2013 112:562-574において見出すことができ; これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。1つの局面において、標的細胞をリプログラミングおよび/もしくは分化転換させる方法または標的細胞のリプログラミングおよび/もしくは分化転換の効率を増大させる方法であって、該細胞を、T3SS適合性のリプログラミングおよび/または分化転換因子ポリペプチドを含む操作された微生物細胞と接触させる段階を含む該方法が本明細書において記述される。いくつかの態様において、標的細胞は単離された標的細胞である。いくつかの態様において、本方法は、(a) 標的細胞および操作された微生物細胞を抗生物質と接触させる段階; (b) 未付着の微生物細胞および抗生物質を除去する段階; ならびに(c) 標的細胞を第2の操作された微生物細胞と接触させる段階をさらに含む。いくつかの態様において、段階(a)〜(c)は少なくとも1回繰り返される。いくつかの態様において、標的細胞は、操作された微生物細胞と少なくとも5日間にわたって少なくとも毎日接触される。いくつかの態様において、標的細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)表現型にリプログラミングされる細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、分化転換される細胞である。リプログラミングおよび/または分化転換のための本明細書において記述される方法は、標的細胞を遺伝的に改変しないリプログラミングおよび/または分化転換の無ウイルス方法を可能にすることが特に企図される。

粘膜ワクチン
いくつかの態様において、T3SS適合性ポリペプチドは抗原である。いくつかの態様において、抗原は、腸内病原体に由来する抗原である。1つの局面において、対象における増殖性疾患を処置する方法であって、T3SS適合性抗原ポリペプチドを含む操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む該方法が本明細書において記述される。いくつかの態様において、微生物細胞は経口的に投与される。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、標的細胞へポリペプチドを導入する方法であって、該標的細胞を、本明細書において記述されるT3SSおよびT3SS適合性基質を含む操作された微生物細胞と接触させる段階を含む該方法に関する。

本明細書において記述されるさまざまな態様において、記述される特異的なポリペプチドのいずれかの変種(天然のもしくはそれ以外の)、対立遺伝子、相同体、保存的に改変された変種、および/または保存的置換変種が包含されることがさらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を改変させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換体、欠失体または付加体が、その改変によってあるアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換がもたらされ、かつポリペプチドの所望の活性を保持する「保存的に改変された変種」であることを認識しているであろう。そのような保存的に改変された変種は、多形変種、種間相同体、および本開示と整合する対立遺伝子に加えて存在し、それらを除外しない。

例えば、1つの脂肪族残基を別の脂肪族残基(例えばIle、Val、LeuもしくはAlaをIle、Val、LeuもしくはAlaの別のもの)に置換することによって、または1つの極性残基を別の極性残基に(例えばLysとArg; GluとAsp; もしくはGlnとAsnとの間で)置換することによって、所与のアミノ酸を、類似の生理化学的特徴を有する残基に交換することができる。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特徴を有する領域全体の置換が周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、天然または参照ポリペプチドの所望の活性、例えば抗原結合活性および特異性が保持されていることを確認するために本明細書において記述されるアッセイ法のいずれか1つにおいて試験することができる。

アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性にしたがって分類することができる(A. L. Lehninger中, Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中): (1) 非極性: Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M); (2) 非荷電極性: Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q); (3) 酸性: Asp (D)、Glu (E); (4) 塩基性: Lys (K)、Arg (R)、His (H)。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいていくつかの群に分けることができる: (1) 疎水性: ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile; (2) 中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln; (3) 酸性: Asp、Glu; (4) 塩基性: His、Lys、Arg; (5) 鎖配向に影響を与える残基: Gly、Pro; (6) 芳香族: Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらのクラスの1つの成員の別のクラスへの交換を伴う。特定の保存的置換は、例えば、以下を含む; AlaをGlyにもしくはSerに; ArgをLysに; AsnをGlnにもしくはHisに; AspをGluに; CysをSerに; GlnをAsnに; GluをAspに; GlyをAlaにもしくはProに; HisをAsnにもしくはGlnに; IleをLeuにもしくはValに; LeuをIleにもしくはValに; LysをArgに、GlnにもしくはGluに; MetをLeuに、TyrにもしくはIleに; PheをMetにLeuにもしくはTyrに; SerをThrに; ThrをSerに; TrpをTyrに; TyrをTrpに; および/またはPheをValに、IleにもしくはLeuに。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるポリペプチドは、本明細書において記述される配列の変種でありうる。いくつかの態様において、変種は保存的に改変された変種である。保存的置換変種は、例えば、天然ヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。本明細書においていわれる「変種」は、天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと実質的に相同なポリペプチドであるが、しかしこれは1つのまたは複数の欠失、挿入または置換のために天然ポリペプチドまたは参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。変種ポリペプチドをコードするDNA配列は、天然DNA配列または参照DNA配列と比べてヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、しかし活性を保持している変種タンパク質またはその断片をコードする配列を包含する。多種多様のPCRに基づく部位特異的変異誘発法がまた、当技術分野において公知であり、当業者によって適用されうる。

変種アミノ酸またはDNA配列は、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、天然配列または参照配列と同一でありうる。天然配列と変異体配列との間の相同性度(%同一性)は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用される自由に利用可能なコンピュータプログラム(例えばデフォルトの設定でBLASTpまたはBLASTn)を用いて、その2つの配列を比較することにより判定されうる。

天然アミノ酸配列の改変は、当業者に公知のいくつかの技法のいずれかによって達成することができる。変異は、例えば、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位が両側に配置された変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーションの後、結果的に得られる再構成された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発手順を利用し、要求された置換、欠失、または挿入にしたがって特定のコドンが改変されている、改変されたヌクレオチド配列を提供することができる。そのような改変を作出するための技法は、とてもよく確立されており、例えば、Walderら(Gene 42: 133, 1986); Bauerら(Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smithら(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)によって開示されているもの; ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号を含むが、それらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ポリペプチドの適切な高次構造の維持に関与していない任意のシステイン残基をまた、一般的にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋結合を防いでもよい。逆に、システイン結合をポリペプチドに付加して、その安定性を改善し、またはオリゴマー化を促進してもよい。

機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列およびT3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列に加えて、いくつかの態様において、本明細書において記述される操作された非病原性の微生物細胞は、T3SS主要調節因子をコードする第3の核酸配列をさらに含む。T3SS主要調節因子は、機能的T3SSシステムの1つもしくは複数の構成成分および/またはT3SS基質の発現を誘導しうる。これは、第1および第2の核酸配列によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドの構成的発現が望まれない場合に、例えば標的細胞以外の細胞にT3SS適合性ポリペプチドを導入するのを回避するために、ならびに/または第1および第2の核酸配列によってコードされるポリペプチドの構成的発現に関連した高い適応コストを回避するために、望ましいことがある。

逆に、いくつかのシステム、例えば大腸菌において、第1および第2の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、T3SS主要調節因子の非存在下において発現されえない。換言すれば、典型的には、例えば、大腸菌において、主要調節因子を付加してT3SSシステムの発現を得る。このプラスミドの欠如は、T3SSの発現をもたらすことができない。

T3SS主要調節因子の非限定的な例としては、VirB、VirF、および/またはそれらの相同体が挙げられる。T3SSのいくつかの主要調節因子は、当技術分野において公知であり、例えば、Fass and Groisman. Current Opinion in Microbiology 2009 12: 199-204を参照されたく; これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。

いくつかの態様において、操作された微生物細胞は、複数のT3SS適合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含みうる。複数のT3SS適合性ポリペプチドは、同じオペロンの一部として、および/または別個のオペロンの一部としてコードされうる。

1つの局面において、本明細書において記述される操作された微生物細胞を含むキットが本明細書において記述される。1つの局面において、機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列とT3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列とを含み標的細胞に対して非病原性である操作された微生物細胞を含むキットが本明細書において記述される。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、対象を処置することに関する。本明細書で記述される状態(例えば、炎症またはがん)を有する対象は、そのような状態を診断する現行の方法を用いて医師により特定されうる。症状および/または合併症は、これらの状態を特徴付け、診断に役立つ。

本明細書において記述される組成物および方法は、処置を必要としている、例えば、炎症またはがんの処置を必要としている対象に投与することができる。いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、症状を軽減するために対象に、本明細書において記述される組成物、例えば操作された微生物細胞の有効量を投与する段階を含む。本明細書において用いられる場合、「症状を軽減すること」は、所与の状態に関連した任意の状態または症状を軽減することである。等価な未処置対照と比べて、そのような低減は、任意の標準的な技法によって測定された場合に少なくとも5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、99%またはそれ以上の低減である。本明細書において記述される組成物を対象に投与するための種々の手段は、当業者に知られている。そのような方法は、経口、皮下、経皮、気道(エアロゾル)、皮膚、局所、注射、または腫瘍内の投与を含むことができるが、これらに限定されることはない。投与は局所性であっても、または全身性であってもよい。

本明細書において用いられる用語「有効量」は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要とされる操作された微生物細胞の量をいい、所望の効果を与えるのに十分な薬理学的組成物の量に関する。用語「治療的有効量」はそれゆえ、典型的な対象への投与時に特定の効果をもたらすのに十分である操作された微生物細胞の量をいう。本明細書において用いられる有効量はまた、さまざまな状況で、疾患の症状の発現を遅延させるのに、疾患の症状の経過を変化させるのに(例えば、限定されることはないが、疾患の症状の進行を遅らせるのに)、または疾患の症状を改善するのに十分な量を含む。したがって、正確な「有効量」を指定することは一般に実用的ではない。しかしながら、任意の所与の場合に、当業者は日常の実験のみを用いて適切な「有効量」を判定することができる。

有効量、毒性、および治療効力は、例えば、LD50 (集団の50%に対して致死的な用量)およびED50 (集団の50%において治療的に有効な用量)を判定するための、細胞培養物または実験動物での標準の薬学的手順によって判定することができる。投与量は、採用される投薬形態および利用される投与経路に依って変化しうる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50比として表すことができる。大きい治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ法から最初に推定することができる。また、用量を動物モデルにおいて処方し、細胞培養において、または適切な動物モデルにおいて判定された通りのIC50 (すなわち、症状の半最大阻害を達成する操作された微生物細胞の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適当なバイオアッセイ法、例えば、数ある中でも、炎症のアッセイ法によってモニターすることができる。投与量は、医師が判定し、必要に応じて調整し、認められた処置の効果に合わせることができる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される技術は、本明細書において記述される操作された微生物細胞と、任意で薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。薬学的に許容される担体および希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および/または分散媒が含まれる。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として働きうる材料のいくつかの非限定的な例としては、(1) ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖類; (2) トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン; (3) セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース; (4) 粉末トラガカント; (5) 麦芽; (6) ゼラチン; (7) ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤; (8) カカオ脂および坐剤ワックスのような賦形剤; (9) 落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油のような油; (10) プロピレングリコールのようなグリコール; (11) グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール(PEG)のようなポリオール; (12) オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル; (13) 寒天; (14) 水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤; (15) アルギン酸; (16) 発熱物質を含まない水; (17) 等張食塩水; (18) リンゲル液; (19) エチルアルコール; (20) pH緩衝溶液; (21) ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物; (22) ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤; (23) 血清アルブミン、HDLおよびLDLのような血清成分; (22) エタノールのようなC₂〜C₁₂アルコール; ならびに(23) 薬学的製剤中で採用される他の無毒性の適合物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤、芳香剤、保存料および抗酸化物質も、製剤中に存在しうる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などのような用語は、本明細書において互換的に用いられる。

操作された微生物細胞を含む薬学的組成物は、経口投与に適するように、例えば、限定されることはないが、錠剤(非限定的に分割錠もしくはコーティング錠を含む)、丸剤、カプレット、カプセル、咀嚼錠、粉末パケット、カシェ剤、トローチ、オブラート、エアロゾルスプレイのような、分離した投薬形態、あるいは限定されることはないが、シロップ、エリキシル剤、水性液体、非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油乳剤、または油中水乳剤のような液体として製剤化することができる。そのような組成物は、予め決められた量の、開示される化合物の薬学的に許容される塩を含有し、当業者には周知の薬学の方法によって調製されうる。一般には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照されたい。

本明細書において記述される方法は、例えば組み合わせ療法の一部として、対象に第2の薬剤および/または処置を投与する段階をさらに含むことができる。

本明細書において記述される方法は、例えば組み合わせ療法の一部として、対象に第2の薬剤および/または処置を投与する段階をさらに含むことができる。非限定的な例として、本明細書において記述される方法により対象が炎症の処置をされるなら、対象はまた、疼痛または炎症に苦しんでいる対象にとって有益であることが知られている第2の薬剤および/または処置を投与されうる。そのような薬剤および/または処置の例としては、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID - 例えばアスピリン、イブプロフェン、もしくはナプロキセン); グルココルチコイド(例えばコルチゾール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、およびベクロメタゾン)を含む、コルチコステロイド; メトトレキサート; スルファサラジン; レフルノミド; 抗TNF薬; シクロフォスファミド; 炎症収束性(pro-resolving)薬; ミコフェノレート; またはアヘン剤(例えばエンドルフィン、エンケファリン、およびダイノルフィン)、ステロイド、鎮痛剤、バルビツレート、オキシコドン、モルヒネ、リドカインなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。

がんの処置を必要としている対象のための第2の薬剤および/または処置の非限定的な例としては、放射線治療、外科手術、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、AMG479、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ABT-737、PI-103; チオテパおよびCYTOXAN(登録商標)シクロフォスファミドのようなアルキル化剤; ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル; ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパのようなアジリジン; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド(trietylenephosphoramide)、トリエチレンチオホスホルアミド(triethiylenethiophosphoramide)およびトリメチロロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン(methylamelamine); アセトゲニン(特にブラタシンおよびブラタシノン); カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む); ブリオスタチン; カリスタチン; CC-1065 (そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む); クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8); ドラスタチン; デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む); エリュテロビン; パンクラチスタチン; サルコジクチイン; スポンギスタチン; クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード; カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン(ranimnustine)のようなニトロソ尿素; 抗生物質、例えばエンジイン抗生物質(例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ1IおよびカリケアミシンωI1(例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照のこと); ダイネミシンAを含むダイネミシン; クロドロネートのようなビスホスホネート; エスペラミシン; ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連した色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア)、アクラシノマイシン(aclacinomysin)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン(caminomycin)、カルジノフィリン、クロモマイシン(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン; メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU)のような代謝拮抗物質; デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体; フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体; アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジン類似体; カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン; アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤; フロリン酸のような葉酸補給剤; アセグラトン; アルドホスファミドグリコシド; アミノレブリン酸; エニルウラシル; アムサクリン; ベストラブシル; ビサントレン; エダトラキサート(edatraxate); デフォファミン; デメコルシン; ジアジクオン; エルホルミチン; 酢酸エリプチニウム; エポチロン; エトグルシド; 硝酸ガリウム; ヒドロキシウレア; レンチナン; ロニダイニン; メイタンシンおよびアンサマイトシンのようなメイタンシノイド; ミトグアゾン; ミトキサントロン; モピダンモール(mopidanmol); ニトラエリン; ペントスタチン; フェナメット; ピラルビシン; ロソキサントロン; ポドフィリン酸; 2-エチルヒドラジド; プロカルバジン; PSK(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products、Eugene、Oreg.); ラゾキサン; リゾキシン; シゾフラン(sizofuran); スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジクオン; 2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン; トリコテセン(特にT-2毒素、ベラクリンA、ロリジンAおよびアングイジン); ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン; マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポブロマン; ガシトシン; アラビノシド(「Ara-C」); シクロホスファミド; チオテパ; タキソイド、例えば、TAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE(登録商標)パクリタキセルのクレモフォール(Cremophor)無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, I11.)、およびTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); クロランブシル; GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン; 6-チオグアニン; メルカプトプリン; メトトレキサート; シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンのような白金類似体; ビンブラスチン; 白金; エトポシド(VP-16); イホスファミド; ミトキサントロン; ビンクリスチン; NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン; ノバントロン; テニポシド; エダトレキサート; ダウノマイシン; アミノプテリン; ゼローダ; イバンドロネート; イリノテカン(Camptosar、CPT-11) (イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンとの処置レジメンを含む); トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000; ジフルオロメチルオルニチン(DMFO); レチノイン酸のようなレチノイド; カペシタビン; コンブレタスタチン; ロイコボリン(LV); オキサリプラチン処置レジメン(FOLFOX)を含む、オキサリプラチン; ラパチニブ(Tykerb(登録商標)); 細胞増殖を低減させるPKC-α、Raf、H-Ras、EGFR (例えば、エルロチニブ(Tarceva(登録商標)))およびVEGF-Aの阻害剤ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を挙げることができる。

特定の態様において、本明細書において記述される操作された微生物細胞を含む組成物の有効な用量は、患者に1回投与することができる。特定の態様において、操作された微生物細胞を含む組成物の有効な用量は、患者に繰り返し投与することができる。いくつかの態様において、用量は、例えば本明細書において記述される細菌細胞を含むカプセルの、連日投与、例えば経口投与でありうる。いくつかの態様において、用量は、例えば、所望の領域、例えば腫瘍への細菌細胞の注射でありうる。いくつかの態様において、用量は全身に、例えば静脈内注射により投与することができる。いくつかの態様において、用量は10⁶〜10¹²個の細胞を含むことができる。いくつかの態様において、用量は約10⁸〜10¹⁰個の細胞を含むことができる。操作された微生物細胞を含む組成物は、5分、10分、15分、20分、または25分間のような、時間をかけて投与することができる。投与を、例えば、1時間に1回で3時間、6時間、12時間、毎日(すなわち1日1回)もしくはそれ以上など、または週1回もしくは2週間に1回(すなわち、2週間ごとに)で1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間もしくはそれ以上など、定期的に繰り返すことができる。

いくつかの態様において、最初の処置レジメンの後、処置をさらに低頻度で施すことができる。例えば、2週間に1回で3ヶ月間の処置の後、処置を1ヶ月に1回で6ヶ月間もしくは1年間またはそれ以上繰り返すことができる。本明細書において記述される方法による処置は、状態のマーカーまたは症状のレベルを、例えば少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%もしくは少なくとも90%またはそれ以上低減させることができる。

本明細書において記述される組成物の投与量は、医師が判定し、必要に応じて調整し、認められた処置の効果に合わせることができる。処置の持続期間および頻度に関して、熟練医師にとって、処置が治療効果をもたらしている時点を判定するために、投与量を増やすかもしくは減らすか、投与頻度を増やすかもしくは減らすか、処置を中止するか、処置を再開するか、または処置レジメンに対して他の変更を行うかどうかを判定するために、対象をモニターすることは典型的なことである。投薬スケジュールは、対象の、操作された微生物細胞に対する感受性のような、いくつかの臨床因子に依って、1週間に1回から1日に1回まで変化しうる。活性化の所望の用量または量は、1回で投与することができ、または分割用量、例えば、2〜4つの分割用量に分け、一定期間にわたって、例えば、1日を通して適当な間隔でまたは他の適切なスケジュールで投与することができる。いくつかの態様において、投与は長期的であってよく、例えば、数週間または数ヶ月にわたり1つもしくは複数の用量および/または毎日の処置であってよい。投薬および/または処置スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月もしくは6ヶ月、またはそれ以上の期間にわたって、毎日、1日2回、1日3回または1日4回もしくはそれ以上の投与である。

本明細書において記述される方法による操作された微生物細胞の投与の投与量範囲は、例えば、細胞の形態、その効力、および本明細書において記述される状態の症状、マーカーまたは指標がどの程度低下することが望ましいか、例えば望ましい低下率に依存する。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど多くすべきではない。概して、投与量は、患者の年齢、状態および性別とともに変化し、当業者によって決定されうる。投与量はまた、任意の合併症が生じた場合に、個々の医師によって調整されうる。

本明細書において記述される操作された微生物細胞の、例えば本明細書において記述される状態の処置における有効性または本明細書において記述される応答を誘発させる有効性は、熟練の臨床医によって決定されうる。しかしながら、処置は、本明細書において記述される状態の兆候または症状のいずれか1つまたは全てが有益な様式で変えられ、他の臨床的に許容される症状が好転または改善されるか、または所望の応答が例えば本明細書において記述される方法による処置後に少なくとも10%誘発される場合に、「有効な処置」と見なされ、この用語が本明細書において用いられる。有効性は、例えば、本明細書において記述される方法によって処置される状態のマーカー、指標、症状および/もしくは発生率、または適当な任意の他の測定可能なパラメーターを測定することによって評価されうる。有効性はまた、入院によって評価される場合には個体が悪化しなかったこと、または医学的介入の必要性(すなわち、疾患の進行が停止する)によっても測定されうる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知でありかつ/または本明細書において記述される。処置は、個体または動物(いくつかの非限定的な例としては、ヒトまたは動物が挙げられる)における疾患の任意の処置を含み、(1) 疾患を阻害すること、例えば、症状(例えば、疼痛または炎症)の悪化を抑制すること; または(2) 疾患を軽減する、例えば、症状の退縮を引き起こすことを含む。疾患の処置のための有効量は、それを必要とする対象に投与されたとき、本明細書においてその用語が定義されたように、その疾患に対して有効な処置がもたらされるのに十分な量を意味する。薬剤の有効性は、状態の身体的指標または所望の応答を評価することによって決定されうる。そのようなパラメーターのいずれか1つまたはパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって、投与および/または処置の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の技能の範囲内である。有効性は、本明細書において記述される状態の動物モデルにおいて評価されうる。実験動物モデルを用いる場合、処置の有効性は、マーカーの統計的に有意な変化が観察される場合に証明される。

便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語および語句の意味を以下に提供する。特に明記しない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下の用語および語句は以下に示す意味を含む。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は、特定の態様の記述を助けるために提供するものであって、主張する本発明を限定する意図はない。特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と本明細書において提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書のなかで提供される定義が優先されるものとする。

便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において利用される特定の用語をここにまとめる。

用語「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」は全て、本明細書において、統計的に有意な量の減少を意味するように用いられる。いくつかの態様において、用語「低減した」、「低減」、「減少する」、または「阻害する」は、参照レベルと比べて少なくとも10%の減少、例えば参照レベルと比べて少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%またはそれ以上の減少あるいは少なくとも10%のうちの任意の減少を意味することができる。いくつかの態様において、これらの用語は参照レベルと比べて100%の減少、すなわち検出不可能なレベルを表すことができる。マーカーまたは症状との関連で、「減少」はそのようなレベルの統計的に有意な減少である。減少は、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%またはそれ以上であることができ、そのような障害のない個体に対する正常の範囲内として受け入れられるレベルまで下がることが好ましい。場合によっては、症状を本質的に取り除くことができ、このことは、症状が低減される、すなわち個体は少なくとも一時的な回復にあることを意味する。

用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は全て、統計的に有意な量の増加を意味するように本明細書において用いられる。いくつかの態様において、用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は、基準レベルと比べて少なくとも10%の増加、例えば、少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%の増加、または100%を含め100%までの増加、または参照レベルと比べて10〜100%の間の任意の増加、あるいは参照レベルと比べて少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍〜10倍の間の任意の増加またはそれ以上の増加を意味することができる。マーカーまたは症状との関連で、「増加する」は、そのようなレベルの統計的に有意な増加である。

本明細書において用いられる場合、「対象」はヒトまたは非ヒト動物を意味する。通常、非ヒト動物は霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザル(Rhesus)が含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば、イエネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥科の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えば、マス、ナマズおよびサケが含まれる。いくつかの態様において、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。用語「患者」、「個体」、および「対象」は、本明細書において互換的に用いられる。

好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるが、しかしこれらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物を、所与の状態の動物モデルに相当する対象として有利に用いることができる。対象は雄性であっても、または雌性であってもよい。

対象は、以前に、処置を必要としている状態またはそのような状態に関連した1つもしくは複数の合併症と診断された、あるいはそれらに苦しんでいるとまたはそれらを有すると特定された、かつ任意で、処置を既に受けたものでありうる。あるいは、対象はまた、状態または状態に関連した1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていないものでありうる。例えば、対象は、1つもしくは複数のリスク因子を示す対象であっても、またはリスク因子を示さない対象であってもよい。

特定の状態の処置を「必要としている対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断された、またはその状態を発現するリスクがある対象でありうる。

本明細書において用いられる場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に用いられて、隣接残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により、互いに連結されている一連のアミノ酸残基を指定する。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸(例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化アミノ酸など)およびアミノ酸類似体を含む、アミノ酸の重合体をいう。「タンパク質」および「ポリペプチド」は比較的大きいポリペプチドに関して用いられることが多く、用語「ペプチド」は小さいポリペプチドに関して用いられることが多いが、当技術分野におけるこれらの用語の用法は重なっている。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物およびその断片をいう場合、本明細書において互換的に用いられる。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、断片ならびに前記の他の等価物、変種、断片、および類似体が含まれる。

本明細書において用いられる場合、用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体の単位を組み込んでいる、任意の分子、好ましくは重合体分子をいう。核酸は一本鎖または二本鎖のどちらかでありうる。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAの1つの鎖の核酸でありうる。あるいは、いかなる二本鎖DNA由来でもない一本鎖核酸でありうる。1つの局面において、核酸はDNAでありうる。別の局面において、核酸はRNAでありうる。適当な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適当な核酸分子は、mRNAを含むRNAである。

用語「発現」は、例えば、適用可能な場合には、転写、転写プロセッシング、翻訳およびタンパク質折り畳み、修飾ならびにプロセッシングを含むが、これらに限定されない、RNAおよびタンパク質の産生、必要に応じて、タンパク質の分泌に関与する細胞プロセスをいう。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドを含む。用語「遺伝子」は、適切な調節配列に機能的に連結された場合にインビトロでまたはインビボでRNAに転写される(DNA)核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域に先立つおよびコード領域の後に続く領域、例えば5'非翻訳(5'UTR)または「リーダー」配列および3'UTRまたは「トレイラー」配列を含んでもまたは含まなくてもよい。

用語「機能的に連結された」とは、発現されるポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル(例えば、ATG)を有すること、ならびに発現制御配列の制御下のポリヌクレオチド配列の発現を可能とするように、および、任意で、ポリヌクレオチド配列によりコードされる所望のポリペプチドの産生を可能とするように的確な読み枠を維持することを含む。いくつかの例において、核酸の転写は、発現を意図する細胞型における核酸の発現を制御するプロモーター配列(または他の転写調節配列)の制御下にある。核酸は、天然に存在するタンパク質形態の転写を制御する配列と同じものであるまたはそれとは異なる転写調節配列の制御下にありうることも理解されよう。

本明細書において用いられる用語「単離された」または「部分的に精製された」とは、核酸またはポリペプチドの場合、その天然供給源において見られるように該核酸もしくはポリペプチドとともに存在する、および/または細胞で発現させた場合には該核酸もしくはポリペプチドとともに存在すると考えられる、または分泌ポリペプチドの場合には分泌される、少なくとも1種の他の構成成分(例えば、核酸またはポリペプチド)から分離された、核酸またはポリペプチドをいう。化学的に合成された核酸もしくはポリペプチド、またはインビトロの転写/翻訳を用いて合成されたものは、「単離された」と見なされる。

本明細書において用いられる用語「リプログラミング」は、細胞または細胞集団(例えば、体細胞)の発生能(developmental potential)を、変化または反転させるプロセスをいう。言い換えると、リプログラミングとは、細胞がより高い発生能の状態になるように誘導するプロセスを、すなわち、より未分化な状態へと戻すプロセスをいう。リプログラミングされる細胞は、リプログラミングの前には、部分的に分化したまたは完全に分化した細胞のいずれであってもよい。本明細書において記述される局面のいくつかの態様において、リプログラミングは、分化状態の完全なまたは部分的な逆転、多能性の状態を有する細胞への細胞の発生能の増加を包含する。いくつかの態様において、リプログラミングは、その細胞が胚性幹細胞の発生能を有するように、すなわち、胚性幹細胞の表現型を示すように、体細胞を多能性の状態に誘導することを包含する。いくつかの態様おいて、リプログラミングは、細胞の分化した状態の部分的な逆転または発生能の部分的な向上、例えば体細胞または単能性細胞の複能性状態への変化も包含する。リプログラミングはまた、操作をさらに行った場合の、多能性状態への完全なリプログラミングに対する感受性がより高い状態にする、細胞の分化状態の部分的な逆転も包含する。特定の態様おいて、細胞のリプログラミングにより、複能性状態にあると仮定される(例えば、複能性細胞である)細胞が生じる。いくつかの態様において、細胞(例えば体細胞)のリプログラミングにより、多能性様状態または胚性幹細胞表現型と仮定される細胞が生じる。結果的に得られる細胞は、本明細書において「リプログラミングされた細胞」といわれる。本明細書においていわれる用語「部分的にリプログラミングされた体細胞」とは、本明細書において開示される方法により、発生能が低い細胞からリプログラミングされた細胞をいい、ここで部分的にリプログラミングされた細胞は、多能性の状態に完全にはリプログラミングされておらず、多能性ではない、安定な中間状態にある。そのような部分的にリプログラミングされた細胞は、多能性細胞よりは低いが、しかし複能性細胞よりも高い発生能を有することができる。部分的にリプログラミングされた細胞は、例えば、三胚葉のうちの1つか2つへ分化することができるが、しかし3つ全部の胚葉へは分化することができない。

用語「リプログラミング因子」は、本明細書において用いられる場合、ポリペプチドであって、その発現が、細胞、例えば体細胞の、より未分化な状態または未分化状態への、例えば多能性状態または部分的に多能性状態の細胞へのリプログラミングに寄与するものをいう。リプログラミング因子は、例えば、SOX2、OCT3/4、KLF4、NANOG、LIN-28、c-MYCなどのような、多能性状態へ細胞をリプログラミングできる転写因子でありえ、インビトロで細胞をリプログラミングさせる方法においてこれらのうちの1つまたは複数と置き換わりうる、任意の遺伝子、タンパク質、RNAまたは小分子として含む。

本明細書において用いられる場合、用語「分化転換」は、好ましくは、1段階での、1つの細胞型の別の細胞型への分化; したがって多能性の中間細胞の形成なしに細胞の分化した表現型または発生能を修正する方法; すなわち、細胞が最初に脱分化され(またはリプログラミングされ)、その後、別の細胞型へ分化されることを要しない方法をいう。実際に、細胞型は、より未分化の表現型を経由せずに1つの細胞型から別のものに単に「スイッチされる」にすぎない。

本明細書において用いられる場合、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」は、目的が、疾患または障害、例えばがんまたは炎症と関連した状態の進行または重症度を食い止める、軽減する、改善する、阻害する、遅らせるまたは阻止する、治療的処置をいう。用語「処置すること」は、状態、疾患または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を低減させることまたは軽減することを含む。処置は一般に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減されるなら、「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止されるなら、処置は「有効」である。つまり、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置がない場合に予想されるであろうものと比べて症状の進行または悪化の、休止、または少なくとも緩徐化も含む。有益なまたは所望の臨床結果には、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮減、安定化した(すなわち、悪化していない)疾患状態、疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の改善もしくは緩和、寛解(部分的であれ全体的であれ)、および/または死亡率の減少が検出可能であれ検出不可能であれ含まれるが、これらに限定されることはない。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの解放の供与(待機的処置を含む)を含む。

本明細書において用いられる場合、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば製薬業界において通常用いられる担体と組み合わされた活性剤をいう。語句「薬学的に許容される」は、本明細書においては、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益/リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適する化合物、物質、組成物および/または剤形をいうように用いられる。

本明細書において用いられる場合、用語「投与する」は、薬剤を所望の部位に少なくとも部分的に送達させる方法または経路によって、本明細書において開示される化合物を対象へ入れることをいう。本明細書において開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象に効果的な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与されうる。

用語「統計学的に有意な」または「有意に」は、統計的有意性をいい、一般には2標準偏差(2SD)またはそれ以上の差異を意味する。

操作実施例(operating example)以外において、または別のように指示される場合を除き、本明細書において用いられる成分の数量または反応条件を表す全ての数は、いかなる場合にも「約」という用語で修飾されていると理解されるべきである。用語「約」は、割合に関連して用いられる場合、±1%を意味しうる。

本明細書において用いられる場合、用語「含む(comprising)」または「含む(comprises)」は、本方法または組成物に不可欠である、組成物、方法、およびその各成分に関連して用いられるが、不可欠であるかどうかにかかわらず、明記されていない要素の包含も受け入れる。

用語「からなる」は、態様のその記述において列挙されていない任意の要素を除く、本明細書において記述される組成物、方法、および各成分をいう。

本明細書において用いられる場合、用語「本質的に〜からなる」は、所与の態様に必要とされる要素をいう。この用語は、その態様の基本的かつ新規または機能的な特徴に著しく影響を及ぼさない、要素の存在を許容する。

単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈によって明らかに別のことが示される場合を除き、複数形の言及を含む。同様に、「または」という語は、文脈によって明らかに別のことが示される場合を除き、「および」を含むものと意図される。本明細書において記述されるものと同様または同等な方法および材料を、本開示の実践または試験において用いることができるが、適当な方法および材料を以下に記述する。「例えば(e.g.)」という略号は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために本明細書において用いられる。したがって「例えば(e.g.)」という略号は「例えば(for example)」という用語と同義である。

細胞生物学および分子生物学における一般用語の定義は、「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」, 19th Edition, Merck Research Laboratories刊行, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.刊行, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, Jones & Bartlett Publishing刊行, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.),, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.刊行, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., edsのなかで見出すことができる。

特に明記しない限り、本発明は、例えば、どれも参照により全体が本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)、およびCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)に記述されているように、標準的な手順を用いて行われた。

他の用語は、本発明のさまざまな局面の記述のなかで本明細書において定義される。

本出願を通じて引用されている、文献参考図書、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含めて、全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して用いられうるそのような刊行物に記述されている方法論を、記述および開示する目的で参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日の前にこれらが単に開示されたことを示しているだけである。この点で、本発明者らが先行発明によってまたはその他任意の理由で、そのような開示に先行する資格がないと認めるものと解釈されるべきではない。日付に関する全ての記載またはこれらの書類の内容に関する表現は、本出願者らが入手できる情報に基づいており、これらの書類の日付または内容の正確さに関して何らの承認をなすものではない。

本開示の態様の記述は、網羅的であるものと、または開示された正確な形態に本開示を限定するものと意図されない。本開示の特定の態様および例が例示を目的として本明細書に記述されるものの、当業者なら認識するように、本開示の範囲内で種々の等価な修正が可能である。例えば、方法の段階または機能は所与の順序で提示されるが、代替的な態様が異なる順序で機能を果たすこともあり、または機能は実質的に同時に果たされることもある。本明細書において提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用されうる。本明細書において記述されるさまざまな態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面を、必要なら、上記の参考文献および出願書類の組成物、機能および概念を採用するように修正して、本開示のさらなる態様を提供することができる。さらに、生体機能等価の考慮によって、種類または量で生物学的または化学的作用に影響を与えることなくタンパク質構造のいくらかの変化を加えることができる。これらのおよびその他の変更を、詳細な説明に照らして本開示に加えることができる。そのような変形は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

前述の態様のいずれかの特定の要素は組み合わされてもよく、または他の態様における要素に代用されてもよい。さらに、本開示の特定の態様に関連した利点がこれらの態様との関連で記述されているが、他の態様がそのような利点を示すこともあり、本開示の範囲内に入るように全ての態様がそのような利点を必ずしも示すことを要しない。

本明細書において記述される技術は以下の実施例によってさらに例示されるが、以下の実施例は、決して、さらに限定するものであると解釈されるべきではない。

本明細書において記述される技術のいくつかの態様は、以下の番号付けされた項目のいずれかに従って定義されうる。
1. 機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列と、
T3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列と
を含み、標的細胞または標的生物に対して非病原性である、操作された非病原性の微生物細胞。
2. T3SS適合性ポリペプチドが、微生物細胞にとって外因性である、項目1に記載の操作された微生物細胞。
3. T3SS適合性ポリペプチドが、標的細胞に対して異所性である、項目1〜2のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
4. T3SS主要調節因子をコードする第3の核酸配列を含む、項目1〜3のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
5. T3SS主要調節因子が、VirBおよびVirFからなる群より選択される、項目1〜4のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
6. 機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子が、virB、acp、ipaA、ipaB、ipaC、ipaD、ipgC、ipgB1、ipgA、icsB、ipgD、ipgE、ipgF、mxiG、mxiH、mxiI、mxiJ、mxiK、mxiN、mxiL、mxiM、mxiE、mxiD、mxiC、mxiA、spa15、spa47、spa13、spa32、spa33、spa24、spa9、spa29、およびspa40のうちの1つまたは複数を含む、項目1〜5のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
7. 3型分泌システム(T3SS)が、シゲラ属の種(Shigella spp)、サルモネラ属の種(Salmonella spp)、腸管病原性大腸菌(E. coli)、およびエルシニア属の種(Yersinia spp)からなる群より選択される細菌にとって内因性のポリペプチドを含む、項目6に記載の操作された微生物細胞。
8. 第1の核酸配列がプラスミド上に位置する、項目1〜7のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
9. 第1の核酸配列が染色体上に位置する、項目1〜7のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
10. 非病原性の生物が、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)、大腸菌K12、および派生株からなる群より選択される、項目1〜9のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
11. 大腸菌K12の派生体である菌株が、大腸菌DH10βおよび大腸菌DH5αからなる群より選択される、項目10に記載の操作された微生物細胞。
12. 非病原性の生物が、1つまたは複数のT3SS構成成分の欠失または変異によって操作されている、項目1〜9のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
13. 1つまたは複数のT3SS構成成分が、毒素、T3SSエフェクター、T3SS構造ポリペプチド、およびT3SS構成成分の主要調節因子からなる群より選択される、項目12に記載の操作された微生物細胞。
14. T3SS構成成分がプラスミド上に位置する、項目12〜13のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
15. 病原性の微生物細胞が、サルモネラ属の種、シゲラ属の種、およびエルシニア属の種からなる群より選択される、項目12〜14のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
16. 病原性の微生物細胞が、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium) SPI1およびフレクスナー赤痢菌(Shigella felxneri) mxi-spaからなる群より選択される、項目15に記載の操作された微生物細胞。
17. IpgB1、IpgD、IpaA、およびIcsB、またはそれらの相同体をコードする遺伝子を含む、項目1〜16のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
18. IpgB1、IpgD、IpaA、およびIcsB、またはそれらの相同体からなる群より選択される3種以下のT3SS分泌ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、項目1〜16のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
19. IpgB1、IpgD、IpaA、およびIcsB、またはそれらの相同体をコードする遺伝子を含まない、項目18に記載の操作された微生物細胞。
20. 標的細胞への接着を増大させる1種または複数種のポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、項目1〜19のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
21. 標的細胞への接着を増大させるポリペプチドが、Tirおよびインチミンを含む、項目20に記載の操作された微生物細胞。
22. 標的細胞への接着を増大させるポリペプチドが、細菌接着、Afa1、AIDA、侵入、または標的細胞ポリペプチドの細胞外エピトープに特異的な一本鎖抗体からなる群より選択される、項目21に記載の操作された微生物細胞。
23. ポリペプチドが、N末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含む、項目1〜22のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
24. ポリペプチドをコードする核酸配列が、3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントに機能的に連結されている、項目1〜23のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
25. 3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントが、MxiE認識配列および誘導性プロモーターからなる群より選択される、項目24に記載の操作された微生物細胞。
26. ポリペプチドをコードする核酸が、誘導性プロモーターに機能的に連結されている、項目1〜25のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
27. ポリペプチドをコードする核酸が、染色体上に位置する、項目1〜26のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
28. ポリペプチドが抗炎症性ポリペプチドである、項目1〜27のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
29. 抗炎症性ポリペプチドが、細菌抗炎症性ポリペプチド、NF-κBシグナル伝達を阻害する細菌ポリペプチド、OspG、OspF、IpaH9.8、SseL、YopJ、NleB、NleC、NleE、NleH1、OspLからなる群より選択される、項目28に記載の操作された微生物細胞。
30. 非病原性の微生物細胞が、片利共生の腸内微生物細胞である、項目28〜29のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
31. 片利共生の腸内微生物細胞が、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)である、項目28〜30のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
32. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが毒素である、項目1〜27のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
33. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが腫瘍抑制ポリペプチドである、項目1〜27のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
34. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドがリプログラミング因子である、項目1〜27のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
35. リプログラミング因子が、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog、Sal4、Dppa2、Ezh2、およびEsrrbからなる群より選択される、項目34に記載の操作された微生物細胞。
36. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが分化転換因子である、項目1〜27のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
37. 分化転換因子が、myoDからなる群より選択される筋細胞分化転換因子である、項目36に記載の操作された微生物細胞。
38. 分化転換因子が、Gata4、Mec2F、およびTbs5からなる群より選択される心筋細胞分化転換因子である、項目36に記載の操作された微生物細胞。
39. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが抗原である、項目1〜27のいずれかに記載の操作された微生物細胞。
40. 抗原が腸内病原体に由来する、項目39に記載の操作された微生物細胞。
41. 標的細胞へポリペプチドを導入する方法であって、該標的細胞を、項目1〜40のいずれかに記載の操作された微生物細胞と接触させる段階を含む方法。
42. 対象における炎症を低減させる方法であって、項目28〜31のいずれかに記載の操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む方法。
43. 対象が自己免疫疾患の処置を必要としている、項目42に記載の方法。
44. 炎症が胃腸管の炎症である、項目42に記載の方法。
45. 対象が、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、および潰瘍性結腸炎からなる群より選択される状態の処置を必要としている、項目42〜44のいずれかに記載の方法。
46. 操作された微生物細胞が経口的に投与される、項目42〜45のいずれかに記載の方法。
47. 対象における増殖性疾患を処置する方法であって、項目32〜33のいずれかに記載の操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む方法。
48. 増殖性疾患が、がんである、項目47に記載の方法。
49. がんが胃腸管のがんであり、かつ微生物細胞が経口的に投与される、項目48に記載の方法。
50. 対象における増殖性疾患を処置する方法であって、項目39〜40のいずれかに記載の操作された微生物細胞を該対象に投与する段階を含む方法。
51. 微生物細胞が経口的に投与される、項目50に記載の方法。
52. 標的細胞をリプログラミング/分化転換させるか、または標的細胞のリプログラミング/分化転換の効率を増大させる方法であって、該細胞を、項目34〜38のいずれかに記載の操作された微生物細胞と接触させる段階を含む方法。
53. (a) 標的細胞および操作された微生物細胞を抗生物質と接触させる段階;
(b) 未付着の微生物細胞および抗生物質を除去する段階; ならびに
(c) 標的細胞を第2の操作された微生物細胞と接触させる段階
をさらに含む、項目52に記載の方法。
54. 段階(a)〜(c)が少なくとも1回繰り返される、項目53に記載の方法。
55. 標的細胞が、操作された微生物細胞と少なくとも5日間にわたって少なくとも毎日接触される、項目52〜54のいずれかに記載の方法。
56. 標的細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)表現型にリプログラミングされる細胞である、項目52〜55のいずれかに記載の方法。
57. 標的細胞が、分化転換される細胞である、項目52〜55のいずれかに記載の方法。
58. 項目1〜40のいずれかに記載の操作された微生物細胞を含むキット。
59. 機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列と、
標的細胞にとって外因性であるT3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列と
を含み、標的細胞に対して非病原性である、操作された微生物細胞
を含むキット。
60. 炎症を低減させるための、項目23〜31または39〜40のいずれかに記載の操作された微生物細胞の使用であって、炎症の低減を必要としている対象に該細胞を投与することを含む使用。
61. 対象が自己免疫疾患の処置を必要としている、項目60に記載の使用。
62. 炎症が胃腸管の炎症である、項目60に記載の使用。
63. 対象が、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、および潰瘍性結腸炎からなる群より選択される状態の処置を必要としている、項目60〜62のいずれかに記載の使用。
64. 操作された微生物細胞が経口的に投与される、項目60〜63のいずれかに記載の使用。
65. 増殖性疾患を低減処置するための、項目32〜33または39〜40のいずれかに記載の操作された微生物細胞の使用であって、増殖性疾患の処置を必要としている対象に該細胞を投与することを含む使用。
66. 増殖性疾患が、がんである、項目65に記載の使用。
67. がんが胃腸管のがんであり、かつ微生物細胞が経口的に投与される、項目66に記載の使用。

実施例1
非病原性の大腸菌実験室・片利共生株への、哺乳動物細胞へ細菌から直接的にタンパク質を送達できる特殊化された3型分泌システムの導入が本明細書において記述されるものであり、それらの株はその後、真核細胞へ病毒性タンパク質以外の定義された治療用分子を送達するために操作される。無ウイルス人工多能性幹細胞を作出するために哺乳動物細胞へリプログラミング因子を送達できる大腸菌株; ウイルス分化転換細胞を作出するために哺乳動物細胞へリプログラミング因子を送達できる、すなわちMyoD送達を介した筋細胞への線維芽細胞のリプログラミングが可能な、大腸菌株; 炎症性腸疾患を含む自己免疫疾患の潜在的処置としての、インビボで宿主細胞へ抗炎症促進性のタンパク質(病原性細菌の分泌システムの正常基質であるもの)を送達する片利共生の大腸菌株; 毒性タンパク質を腫瘍へ送達する片利共生の大腸菌株; 腫瘍抑制タンパク質を腫瘍細胞へ送達する片利共生の大腸菌株; 定義された真核生物タンパク質を哺乳動物細胞へ送達する片利共生の大腸菌株の開発も本明細書において記述される。

本明細書において記述される技術は、生物界間の機能的分泌システム(例えばシゲラ由来)を大腸菌実験室・片利共生株へ仕立てるのに必要とれる遺伝子の全ての導入に関する。そのような分泌システムをコードするように特定または操作された片利共生細菌はこれまでにない。本明細書において記述される組成物は、以下の方法で適用することができる:
iPS/分化転換株: 安価、効率的かつ安全な送達機構(細菌)を用いた無ウイルスリプログラミング細胞の開発
抗炎症促進性細菌: 全身性の免疫抑制薬の使用により観察される副作用の多くを軽減すべき疾患の部位に対する不適切な炎症応答の下方制御を標的とする能力
抗腫瘍細菌: 腫瘍の成長を緩徐化または阻止するためにがん細胞へ毒性タンパク質または腫瘍抑制タンパク質を送達する能力
細胞療法のためにまたは創薬のために使用できる、人工多能性幹細胞および分化転換細胞を作出するための新しい安価な無ウイルス手段
炎症性腸疾患およびがんを含む種々の疾患の処置のための、患者に経口投与できる改変された片利共生細菌。

実施例2
炎症性腸疾患(IBD)の病原性の顕著な特徴は、リンパ球、マクロファージ、上皮細胞および樹状細胞を含む、腸細胞によるサイトカイン産生の調節不全である。これらの細胞型の各々が、炎症促進性サイトカインの産生を引き起こす不適切なNF-κB活性化を示す。活性化NF-κBの量は腸炎の重症度に対応し、IBD処置における大きな進展は、恐らくNF-κBの活性化をもたらすシグナル伝達の多くを制限することによる、TNFαに対する抗体の使用であったという証拠が存在する。この治療介入は、IBDを有する患者の症状、疾患経過および生活の質を劇的に改善させた(1)。しかしながら、これらの薬剤の使用に関連した全身免疫抑制は、潜伏結核の再活性化、脳膿瘍および播種性真菌疾患の発生などの重篤な感染性疾患の発生に対するこれらの患者の感受性を大いに高める。本明細書において記述されるこの方法および組成物は、IBDを処置するための微生物に基づく手法を提供し、これによって免疫抑制が疾患の主要部位、つまり腸に限定される。具体的には、NF-κB活性化を阻害する細菌タンパク質を直接的に腸細胞へ送達できる片利共生の大腸菌株の作出およびこれらの菌株が自発性大腸炎の実験モデルにおいて腸炎を、少なくとも一時的に、抑制するように作用しうるかどうかの試験が本明細書において記述される。本明細書において記述される方法および組成物は、全身免疫抑制に関連した問題を回避しうるIBD処置のための強力な新しい治療パラダイムである。

IBDおよび先天性免疫
先天性免疫システムは、感染の始まりをシグナル伝達する、外来分子を認識する際の宿主の防御の最前線として働く監視システムである。この応答は、宿主がリポ多糖類およびペプチドグリカンのような微生物に関連した分子パターン(MAMP)を感知する場合にトリガーされる。これらのMAMPは、TLR (Toll様受容体)およびNOD受容体により認識され、これが今度は、サイトカインの発現をもたらす下流のシグナル伝達カスケードを活性化する。これらのサイトカインは、感染部位への好中球およびマクロファージの動員を含めて炎症応答を樹立するように作用する。先天性免疫応答は、体液性および細胞性免疫システムの活性化を引き起こす。IBDとの関連で、これらの細胞型の各々が転写因子NF-κBの不適切な活性化を示す。興味深いことに、活性化NF-κBの量は、腸炎の重症度に関連付けられている(2)。NF-κBのサブユニットの1つp65に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの局所投与は、IBDの実験マウスモデルにおいて炎症を著しく減少させることが実証されている(3)。これらの所見から、NF-κBを遮断する標的治療がIBDに対する有効な処置であると判明する可能性が高いことが示唆される。

病原性細菌タンパク質によるNF-κB活性化の標的阻害
細菌性病原体は、宿主応答を抑制するためにまたは宿主応答に対抗するために多数の機構を進化させてきた。例えば、サルモネラ、シゲラ、腸管病原性大腸菌およびエルシニアの種を含む多くのグラム陰性腸内病原菌は、数十種のタンパク質(エフェクター)を真核生物宿主細胞へ直接的に注入するために特殊化された3型分泌システムを利用する。これらの分泌システムは、宿主細胞への細菌タンパク質の送達のためのチャネルを本質的に形成する、宿主細胞膜へ挿入する細孔形成タンパク質で覆われた針部を形成する細菌内膜および細菌外膜の両方に及ぶ20〜25種のタンパク質から構成される複雑な機構である。T3SSの構成成分は高度に保存されているが、各細菌はそれ自体の独特のエフェクターセットを宿主細胞へ注入する。興味深いことに、ここ数年で、NF-κB活性化の阻害につながるシグナル伝達経路を阻害する複数のエフェクターが特定された。表1にまとめているように、これらのエフェクターは、NF-κBの活性化に必要とされる種々の段階を標的とする。

（表１）NF-κBシグナル伝達を阻害することが現在知られているエフェクターのまとめ

実験室株3型コンピテント大腸菌の作出
シゲラの場合、機能的T3SSを形成するために必要とされる20〜25種のタンパク質をコードする遺伝子の全てが、病毒性プラスミド上に位置する2つの大きな隣接オペロン内にコードされる[26]。一連の相同組み換えに基づく手法を通じて[33, 34]、この31 kbの領域全体がもっと小さな、自己複製プラスミド上へ捕捉された。大腸菌実験室株(DH10B)およびBL21へのこのプラスミドの導入は、シゲラエフェクターを培地へ分泌可能な、および宿主細胞へ直接的にエフェクターを送達可能な菌株を作出するのに十分である。顕著には、3型分泌機構をコードする病毒性プラスミドのこの領域を特異的に捕捉することにより、20種超のエフェクターをコードする遺伝子が、大腸菌株へ導入されないシゲラ病毒性プラスミド上の他の場所にコードされる。したがって、これらの3型分泌コンピテント大腸菌株は、宿主細胞に侵入する数少ない生物が複製することなく、ファゴソームに閉じ込められるので、非病原性である。加えて、これらの菌株に感染したヒト細胞は、IL-8分泌を示さず、非免疫原性の送達菌株が作出されたことを示唆している。

シゲラT3SSを介した異種エフェクターの認識
シゲラT3SSがサルモネラ、エルシニアおよび腸管病原性大腸菌由来のエフェクターを認識かつ分泌することが、実験によって実証された。

抗炎症促進性の片利共生大腸菌株の開発
抗炎症性エフェクターを分泌できるNISSLE 1917株を作出することができる。現在、大々的な配列決定の努力にもかかわらず、哺乳動物の微生物叢に存在する細菌種が、T3SS (または任意の他のさらに高次の細菌分泌システム、すなわち宿主細胞へ複数のタンパク質を送達できるもの)をコードすることは特定されていない。治療用分子をマウス腸へ送達するための安全かつ有効な媒体であることが以前に実証されている菌株である片利共生ヒト大腸菌NISSLE 1917株(EcN) (4)へ、シゲラT3SSを保有するプラスミドを、導入することによって新たにそのような菌株を作出することが、本明細書において記述される。表1に記述されている9種の抗炎症性エフェクターの各々を培地へ、および直接的に宿主細胞へ分泌するこの菌株の能力を、定量的免疫ブロットアッセイ法を用いることにより試験して、培地へ分泌される各エフェクターの量を、および宿主細胞へ直接的に送達された各エフェクターの量をFLAGでタグ付けされた場合、判定することができる。異種エフェクターの1つがシゲラ3型分泌システム(これはEcNへ導入されうる)によって認識されない、あり得そうにない場合には、そのN末端をシゲラエフェクターのN末端と交換することができる。

NF-κBシグナル伝達を阻害する片利共生の抗炎症促進性大腸菌株の能力および炎症促進性サイトカインの産生の判定
表1に記載されている9種のエフェクターの各々を分泌する3型分泌コンピテントEcN株がNF-κB活性化を阻害する能力を、2つの補完的な手法を用いて比較することができる。先天性免疫応答を抑制する際の単一エフェクターの個々の役割が研究されるのは、これが初めてである。第一に、TNFαへの曝露後の、9種の3型コンピテントEcN株を感染させた極性をもった腸(Caco-2)上皮細胞の上清中に存在するIL-8のレベルを比較することができる。感染細胞および非感染細胞の上清を24時間、回収することができ、IL-8レベルを、市販のIL-8 ELISAキット(BD Scientific)を用いて判定することができる。これらの結果は、遺伝子特異的なプライマーを用いてqPCRによりIL-8 mRNAレベルを測定することによって確認することができる。第二には、NF-κB活性化を阻害する9種の3型コンピテントEcN株の能力は、蛍ルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いて比較することができる。Caco-2細胞へのプラスミドの導入に関連した技術的困難を考慮すると、この場合には、高度にトランスフェクション可能なHEK293細胞が用いられうる。NF-κBルシフェラーゼおよび構成的ウミシイタケレポーター・プラスミドをHEK293細胞へ導入してから24時間後に、9種の抗炎症促進性EcN株の各々を細胞に感染させることができる。1時間後に、TNFαを培地に加えて、NF-κB活性化につながるシグナル伝達経路を誘導することができる。NF-κB活性化を阻害する各菌株の能力は、市販のDual-Glo Luciferase Reporter Assayキット(Promega)を用いて経時的にルシフェラーゼ活性をモニタリングすることにより比較することができる。ウミシイタケ・レベルを測定し、トランスフェクション効率および/または細胞生存性に関する潜在的な問題の説明とする。

相加的または相乗的に作用してNF-κBシグナル伝達を阻害するエフェクターの特定
上記の実験は、NF-κB活性化を阻害する単一の3型エフェクターの能力の最初の対照比較を提供しうる。しかしながら、IBDの処置のため、複数のエフェクターを宿主細胞へ送達する菌株を作出することができる。というのは、恐らく、エフェクターは相加的にまたは多分、相乗的にでさえ働いて、NF-κB活性化を阻害するからである。そのようなエフェクターを特定するため、潜在的な72種のエフェクター対の各々を宿主細胞に注入する3型コンピテントEcN株を感染させたCaco-2細胞がTNFαに曝露される場合に分泌されるIL-8のレベルを、比較することができる。これらの研究の場合、2種のエフェクターを同じEcN株へ導入するのではなく、Caco-2細胞に、実験的に判定された感染多重度(MOI)で2種の菌株の1:1混合物を感染させて、両方のエフェクターが類似のレベルで細胞へ注入されることを確実にすることができる。これらの結果および各エフェクターの作用部位に関する情報(表1)に基づき、より複雑な組み合わせのエフェクターを調べ、相乗作用について試験することができる。3,000超の潜在的な組み合わせを伴う、可能な全ての組み合わせを試験することとは対照的に合理的基準が使用される。菌株が最低の全感染多重度で感染される場合にIL-8産生の最も顕著かつ一貫した阻害をもたらす最大4種までのエフェクターの組み合わせを、特定することができる。

シゲラT3SSで同時に調節される安定的に組み込まれた抗炎症性エフェクターを有する片利共生大腸菌株の作出
初期のインビトロ用途の場合、抗炎症促進性エフェクターをコードする遺伝子を、IPTG調節可能なプロモーターを介して発現される低コピー数のプラスミドにて行うことができる。しかしながら、マウス研究の場合、抗炎症性エフェクターをコードする遺伝子が、少なくとも12種のシゲラエフェクターの発現を調節する転写因子MxiEの制御下でEcN染色体上に存在するような菌株を作出することができる。8種のMxiE調節遺伝子の転写開始部位がマッピングされた(5)。この情報は、抗炎症性エフェクターの上流に配置する配列の選択を手助けし、それらのエフェクターが的確な時間で協調的に転写されることを確実にすることができる。

細胞がTNFαに曝露される場合に最大4種までの抗炎症促進性エフェクターを宿主細胞へ送達し作用して、NF-κB活性化を効果的に阻害する3型コンピテントEcN株の作出が、本明細書において記述される。

抗炎症促進性EcN株がIBDのマウスモデルにおいて炎症を抑制できるかどうかの評価
本明細書において上述される抗炎症促進性EcN株がIBDのマウスモデルにおいて腸炎を抑制できるかどうかを判定する実験が、本明細書において記述される。野生型EcNは、ヒトにおいて安全であることが既に確立されており、臨床試験においてIBDを有する患者に毎日投与された場合には寛解の状態の維持で5-ASA (経口抗炎症性腸薬剤)と同じくらい有効である(6)。EcNは、3日間経口的に投与された後に少なくとも2週間(7)、およびアンピシリンの単回用量とともに単回の経口用量後に少なくとも40日間(4)マウスの腸に持続的に定着できるという証拠も存在している。しかしながら、EcNはヒトまたはマウスにおいて結腸炎の再発を抑制することは未だ実証されていない。IBDを研究するための多くの動物モデルが存在する。本明細書において記述される実験においては、TRUC (T-bet-/-×Rag2-/-潰瘍性結腸炎)モデルが用いられる。これらのマウスは自発性、高浸透性、かつ伝染性の結腸炎を発症し、この結腸炎は、1) 3.5週齢までに組織学的に検出可能であり、2) ヒト潰瘍性結腸炎に似ており、かつ3) 結腸障壁機能の変化およびTNFαの上昇と関連している(8)。

抗炎症性菌株が腸に定着できるかどうかおよびその場所の判定
「野生型」EcNおよびT3分泌コンピテント抗炎症促進性EcNが正常な腸および炎症を起こした腸に定着する能力を比較することができる。糞便中のEcNの排菌の定量化によりおよび殺処理時の組織検査により、定着を測定することができる。EcNの可視化を促進するため、eGFPを安定的に発現する各菌株の変形体(version)を作出することができる。出生後21日目に、野生型マウスおよびTRUCマウスに3日連続で経口接種材料[1〜2×10⁹個のコロニー形成単位(CFU)]を投与することができる。次の30日の期間にわたり、個々のマウス(n=5/株)を粘膜に沿っておよび腸壁全体にわたってeGFPを発現する大腸菌の証拠がないか、毎日の糞便サンプリングによっておよび殺処理時の組織検査(接種後d7、d14、d21、d28の1マウス/菌株遺伝子型)によってともに評価することができる。糞便ペレット中の片利共生大腸菌の検出に有利に働くように、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)を濃縮し、かつUV光への曝露による蛍光細菌の可視化および/またはqPCRによるeGFPの直接測定を促すマッコンキー培地上に、細菌をプレーティングすることができる。新鮮マウント小腸および大腸組織サンプルを用いeGFPシグナルについて組織を評価することができる。組織を固定し、包埋し、定着パターンのさらなる分析のため抗eGFP抗体で染色することもできる。腸間膜リンパ節をサンプリングし、EcN特異的プライマーを用い菌株の検出のためにqPCR分析を行うこともできる(9)。連日投与によって菌株が腸の領域に接着することが可能になるかどうかを判定することもできる。

抗炎症促進性エフェクターがEcNを介して腸細胞へ送達されるかどうかの判定
3型コンピテントEcN株によって標的とされる細胞型を特定するために、エルシニアおよびサルモネラ3型分泌システムによって標的とされる腸細胞を特定すべく成功裏に用いられたインビボに基づくアッセイ法(10)を用いることができる。このアッセイ法においては、TEM-1の3型分泌形態を発現する細菌株が用いられる。TEM-1は、蛍光に基づくアッセイ法によって哺乳動物細胞内の活性をモニターできるβ-ラクタマーゼである。野生型マウスおよびTRUCマウスに上述のように、抗炎症促進性エフェクターのほかにIII型分泌基質として認識されるTEM-1変形体を発現する抗炎症促進性EcN株を、経口的に接種することができる。次の4週間にわたり、週1回の間隔でマウス2〜3匹を殺処理して、EcN株により標的とされる細胞を特定することができる。免疫細胞について濃縮された上皮細胞調製物および単個細胞浮遊物を、十分に確立されたプロトコルを用いて小腸および結腸から作出することができる。細胞を次いで、TEM-1活性のFRETレポーターであるCCF2-AMとともにインキュベートすることができる。3型分泌TEM-1タンパク質が細胞へ送達されるなら、CCF2-AMは、その蛍光が緑色(520 nm)から青色(450 nm)へ変化するように切断される。細胞を次に、フローサイトメトリーにより分析して、緑色(520 nm) vs. 青色(450 nm)発光スペクトルを発現するサブセットを特定することができる。不変の大腸菌株を接種されたマウスの組織由来の細胞を、陰性対照として用いることができる。

抗炎症促進性EcN株は腸に定着するが、しかし関与する3型分泌システムが宿主細胞へエフェクターを効率的に注入できるようには腸細胞に安定的に接着しない可能性がある。2つの修正を菌株に加えて、腸細胞に接着するその能力を増加させることができる。第一に、腸管病原性大腸菌、つまり腸内病原体からの戦略を適応させることによって、宿主細胞と安定な接触を形成する3型コンピテントEcN株の変形体を作出することができる。腸管病原性大腸菌はTir/インチミンシステムを用いて、腸上皮細胞へのその付着を支持する。インチミンは外膜細菌タンパク質であるのに対し、Tirは大腸菌T3SSの基質である。TirがT3SSにより宿主細胞へ送達されると、それは哺乳動物の原形質膜へ組み込まれ、インチミンに対する受容体として働く。Tirは、その同族シャペロンCesTと共発現される限り、異種III型分泌システムの基質として認識されることが既に実証されている(11)。インチミンは自己輸送体であり、したがってV型分泌タンパク質に分類されている。種々の細菌由来の自己輸送体が大腸菌における発現時に外膜を正確に標的とすることが最近になって実証されたので、インチミンは、発現して、大腸菌の外膜を正確に標的とする可能性が極めて高い(12)。第二に、尿路病原性大腸菌由来の細菌アドヘシンAfaIを、3型コンピテントEcN株へ導入することの有用性を調べることができる。少なくともインビトロにおいて、このアドヘシンの存在は、種々の細胞型に接着するシゲラの能力を大いに増加させる。

炎症環境に対する菌株の効果の試験
本明細書において上述される実験で判定された接種条件に基づき、3週齢TRUCマウスに「野生型」および抗炎症促進性EcN株を接種することができる。腸の炎症環境は、3つの補完的アッセイ法を用いて2週および4週後に判定することができる。第一に、炎症に対する全体的効果は、組織学に基づく腸炎症評価のために固定されパラフィン包埋された腸組織を直接検査することによって判定することができる(13)。第二に、処置マウスの炎症環境中に存在するサイトカインの特異的変化についてモニターするために、T-bet-/-×Rag2-/-マウスの遠位結腸を単離することができ(14)、Luminexプラットフォームを用い外植片上清を分析して、IL-1α、IL-1β IL-2、IL-4、IL-6、KC、TNF-α、IFNγ、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IL-21、およびIL-23レベルを分析することができる。そして、第三に、フローサイトメトリーに基づく実験をマウスに関して実施し、2種の異なるEcN株の存在下において腸内に存在する異なる細胞型を定量化することができる。

抗炎症促進性エフェクターを哺乳動物細胞へ送達できる3型コンピテントEcN株の作出およびこれらの菌株がTRUCマウスの腸炎を抑制できるかどうかの確立が、本明細書において記述される。将来の研究は、このシステムの最適化、例えば、相乗的に作用してNF-κB活性化を阻害するいっそう複雑な組み合わせの抗炎症促進性エフェクターの体系的スクリーニング、および3型コンピテント菌株へ他の細菌アドヘシンを導入して、特定の細胞型へのエフェクターの送達を促進するかまたは潜在的に指令することの有用性の調査に向けることができる。特にNF-κB活性の阻害は腸治癒の遅延に関連付けられうるので、抗炎症促進性細菌の存在に関連した考えられうる長期の後遺症だけでなく、DSSおよびIL-10-/-モデルを含むIBDの他の動物モデルにおいて抗炎症性細菌を用いることの有効性についても調べることができる。片利共生EcNの3型分泌システムが発現される時点を制御する手段だけでなく、IBD炎症を予防および処置する際の抗炎症促進性菌株の一過的 vs 持続的定着の有用性についても調べることができ、すなわち、誘導因子を経口的に導入することによってマウスの腸内に存在するEcNのアラビノースまたはテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下の遺伝子の発現を遠隔的に制御することが可能であることが最近になって実証された(15)。

参考文献

実施例3
細菌を介したMyodタンパク質送達による分化転換
外因性遺伝子強制発現は、細胞分化および脱分化の両方を指令するための有効な方法として十分に特徴付けられている。しかしながら、導入遺伝子発現は、挿入突然変異の可能性があるため治療用途に適していない。タンパク質に基づく技法は、安全な代替案となるが、しかし現行のタンパク質送達方法は、労働集約的な精製プロセス、低いタンパク質収量および非効率的な細胞内ターゲティングによってかなり制限される。そのような制限は、本明細書において記述される天然の細菌タンパク質注入システムを用いることによって克服されうる。

緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)はIII型分泌システムを利用して、細菌タンパク質を直接的に真核生物細胞の細胞質へ注入する。本発明者らは、遺伝学的に弱毒化された菌株を用いて分化細胞および多能性細胞の両方に多量のタンパク質を容易に送達するこのシステムの能力を実証した。Creリコンビナーゼをレポーターとして利用することにより、レシピエント細胞の染色体における高頻度LoxP媒介性の組み換えが実証されており、このタンパク質が核を効率的に標的とするだけでなく、その生体機能も保持することが示唆されている。

MyoDは重要な筋調節因子であり、その過剰発現は線維芽細胞のような、多数の細胞型の機能的筋細胞への分化転換を誘導することができる。緑膿菌によるMyoDタンパク質の一過的注入は、筋胚線維芽細胞の筋原性変化を誘導するのに十分であることが本明細書において実証される。明らかな形態学的変化に加えて、筋特異的な遺伝子発現が免疫染色、およびRT-PCRによって観察された。これらの研究は、濃度依存的かつ一時的な遺伝子発現の活性化を効率的に調節して、ゲノム(genonic)完全性を損なうことなく細胞の運命を方向付けるための細菌による転写因子送達の基盤となる。

実施例4
胚性幹(ES)細胞は、体内でありとあらゆる細胞型を生じうる胚由来の多能性細胞株である。したがって、これらの細胞は、組織形成の機構および疾患の発症の研究のための非常に貴重なツールであり、組織修復のための「補充細胞」の有望な供給源となる。しかしながら、胚由来ES細胞による研究は、とりわけ疾患モデルまたは移植可能な補充細胞としてのその使用に関して、新しい系統の派生を妨げる調節障害によりおよび「患者特異的な」組織適合細胞を得る際の難しさにより妨げられている。成体の体細胞のES様「人工多能性(iPS)細胞」への直接的な「リプログラミング」を可能にする、エキサイティングな最近の発見は、これらの障害を減じたように思われており、研究および治療用の患者特異的な多能性細胞の産生のための簡易な機構となる。iPS技術の革新的開発は、多くの新しい機会を切り開いた; 多分、最もエキサイティングな潜在的用途は、移植用の患者特異的組織の使用である。

しかしながら、現在、体細胞をリプログラミングさせるのに最も効率的な方法では、レトロウイルスベクターを介した、4種の哺乳動物転写因子をコードするcDNAの体細胞への導入を伴う。ウイルス媒介性の挿入事象が、がん遺伝子を活性化し、または腫瘍抑制因子を不活性化し、かくしてリプログラミングされた細胞の腫瘍原性に関する懸念をもたらしうるというリスクを考慮すると、これらの操作された細胞を患者に戻すことの安全性に関しては大きな懸念がある。かくして、特殊化された細菌生物界間の分泌システムを再操作して、病毒性タンパク質ではなく、iPS形質転換タンパク質を、直接的に哺乳動物細胞へ送達することにより、ウイルスによって作出されたiPS細胞に関連した問題を回避するための新しいシステムの開発が本明細書において記述される。これは、体細胞のリプログラミングで大きな進歩を示し、iPS細胞の作出の効率を潜在的に増加させる新たな手段となりうるばかりでなく、iPSに基づく移植療法の患者への送達の加速に多大な影響を与えうる。

幹細胞生物学における大きな進展は、分化した体細胞が、細胞へのcDNAの導入を通じて多能性細胞に転換されうるという実証により浮上した。これらの手法は、患者特異的な補充に基づく細胞療法に対する非常に大きな可能性を有しているが、しかし現在、補充細胞を患者へ導入する際の主な障害は、これらの細胞の染色体へのDNAの組み込みが腫瘍形成を誘導しうるという可能性である。患者特異的な治療法へと向かう際のこの主な障害を回避するため、再操作された生物界間・細菌分泌システムを用いてリプログラミングタンパク質を（これらをコードするcDNAではなく）分化細胞へ直接導入する技術が本明細書において記述される。

胚性幹(ES)細胞は、体内でありとあらゆる細胞型を生じうる胚由来の多能性細胞株である。したがって、これらの細胞は、組織形成の機構および疾患の発症の研究のための非常に貴重なツールであり、組織修復のための「補充細胞」の有望な供給源となる。しかしながら、胚由来ES細胞による研究は、とりわけ疾患モデルまたは移植可能な補充細胞としてのその使用に関して、新しい系統の派生を妨げる調節障害によりおよび「患者特異的な」組織適合細胞を得る際の難しさにより妨げられている。成体の体細胞のES様「人工多能性(iPS)細胞」への直接的な「リプログラミング」を可能にする、エキサイティングな最近の発見は、これらの障害を減じたように思われており、研究および治療用の患者特異的な多能性細胞の産生のための簡易な機構となる。

iPS技術の革新的開発は、多くの新しい機会を切り開いた; 多分、最もエキサイティングな潜在的用途は、移植用の患者特異的組織の使用である。しかしながら、現在、体細胞をリプログラミングさせるのに最も効率的な方法は、レトロウイルスベクターを介して4種の哺乳動物転写因子をコードするcDNAを体細胞へ導入することである。このようにして作出されたiPS細胞はインビトロ研究のための強力なツールであるが、これらの操作された細胞を患者に戻すことの安全性に関しては大きな懸念がある。主な懸念は、ウイルス媒介性の挿入事象が潜在的に、がん遺伝子を活性化し、または腫瘍抑制因子を不活性化し、かくしてこれらの細胞の腫瘍原性に関する懸念をもたらしうるということである。

顕著には、リプログラミングTFの発現は、体細胞のリプログラミングのために一過的に必要とされるだけである。iPS細胞に転換されれば、これらの因子の活性はもはや必要とされず、実際に、これらの異所性因子のサイレンシングはiPS細胞の「正常な」多能性に不可欠である。したがって、これらの細胞へのcDNAの送達は不可欠ではなく、長時間にわたる体細胞へのタンパク質それ自体の直接送達は、より有利な手法となりうる。特殊化された細菌生物界間の分泌システムを再操作して、病毒性タンパク質ではなく、iPS形質転換タンパク質、TFを、直接的に哺乳動物細胞へ送達することにより、ウイルスによって作出されたiPS細胞に関連した問題を回避するためのシステムの開発が本明細書において記述される。

このシステムの開発は、(A) TTSSをコードする非病原性細菌の開発、(B) 細菌TTSSによって効率的に分泌されるような哺乳動物TFの修飾および(C) 体細胞のリプログラミングのためのTTSSに基づくアッセイ法の開発を含みうる。本明細書において記述されるシステムは、体細胞のリプログラミングで大きな進歩を示し、iPS細胞の作出の効率を潜在的に増加させる新たな手段となりうるばかりでなく、iPSに基づく移植療法の患者への送達の加速に多大な影響を与えうる。

人工多能性幹細胞(iPS)は、多能性状態にリプログラミングされた体細胞であり、このことは基本的には、これらの細胞が体内でありとあらゆる細胞型を作出する能力を維持することを意味している。したがって、これらの細胞は、基本的な生物学的プロセスを研究するための強力なツールとなり、その上、疾患機構を解明するために、疾患処置のための新たな標的を発見するために、および最終的には、患者に合わせた細胞療法を提供するために用いられうる患者特異的な細胞株の開発のための供給源となる。iPS細胞への体細胞の誘導的リプログラミングにおいてここ数年で、著しい進歩が遂げられた。顕著には、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc Lin28および/またはNanogを含む3種または4種の転写因子(TF)をコードする遺伝子の送達は、マウス胚線維芽細胞(MEF)および他の成体幹細胞を多能性細胞へリプログラミングさせるのに十分である[1, 2]。これらの細胞は、胚性幹(ES)細胞と機能的に等価であるものと思われる。現在、リプログラミングにおける最大の成功は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター内に含まれたcDNAの体細胞への送達で観察されている。とはいえ、最近の証拠から、かなり非効率的ではあるが、一過性トランスフェクション[3]、非組み込み型アデノウイルスベクター[4]および精製タンパク質[5]を用いて成功裏に細胞をリプログラミングできることが示唆された。iPS技術の革新的開発は、多くの新しい機会を切り開いたが、多分、最もエキサイティングな潜在的用途は、パーキンソン病、脊髄損傷、網膜疾患、I型糖尿病および重度の熱傷を含む疾患の処置用の患者特異的細胞の使用である。しかしながら、これらの多能性細胞またはそれらに由来する組織が患者へ導入されうる前に、ベクターを含まないiPS細胞が作出されなければならないということが現在の通説である。主な懸念は、ウイルスベクターを介したcDNAの組み込みが、がん遺伝子を活性化するか、または腫瘍抑制遺伝子を阻害するウイルス媒介性の挿入事象をもたらしうるということである。さらに、組み込み事象は多くの場合、持続的な低レベルのリプログラミング因子の発現をもたらし、これがまた、後続のアッセイ法での細胞挙動を著しく変化させ、これらの細胞に腫瘍形成を起こしやすくさせうる。

顕著には、リプログラミングTFの発現は、体細胞のリプログラミングのために一過的に必要とされるだけである。iPS細胞に転換されれば、これらの因子の活性はもはや必要とされず、実際に、これらの異所性因子のサイレンシングはiPS細胞の「正常な」多能性に不可欠である。したがって、これらの細胞へのcDNAの送達は不可欠ではなく、むしろ体細胞への形質転換タンパク質それ自体の直接送達は、より有利な手法となりうる。特殊化された細菌生物界間の分泌システム、具体的にはIII型分泌システム(TTSS)を再操作して、その正常レパートリーの病毒性タンパク質ではなく、iPS形質転換タンパク質、TFを、直接的に哺乳動物細胞へ送達することにより、ウイルスによって作出されたiPS細胞に関連した問題を回避するためのシステムが本明細書において記述される。

TTSSは、病毒性に関与する数十種のタンパク質を宿主細胞へ送達するようなグラム陰性病原体に共通である。これらの複雑な細胞の機構は、細菌細胞質からペリプラズムに及んで、最終的には、哺乳動物の宿主細胞膜中に細孔を形成するチャネルを形成する、細菌内膜および細菌外膜の両方に及ぶ20〜25種のタンパク質から構成される[6]。哺乳動物タンパク質を含む、異種タンパク質は、III型分泌シグナルの付加によって分泌システムの基質となるように修飾されうることが十分に確立されている。

宿主細胞へ病原性タンパク質ではなく哺乳動物の転写因子を送達するための細菌TTSSの再操作が本明細書において記述される。このシステムは、体細胞へのウイルスベクターの導入で観察された問題の全てを回避するものと考えられる。

体細胞のリプログラミングのためのTTSSに基づくタンパク質送達システムの開発は、iPS細胞の開発における主要な技術的進歩である。最大の潜在的影響は、ウイルスを含まないiPS細胞を作出し、かくして染色体へのウイルスベクターの組み込みに関連した発がん事象のリスクを回避するための手段の提供にある。したがって、この技術は、患者において治療的に用いられうるiPS細胞およびiPSで作出した組織を作出するための安全な手段を提供することができ、かくして、基礎科学者、臨床医および最終的には、消耗性疾患を有する多くの患者を含む多数の地域社会に影響を与える可能性がある。

さらに、このタンパク質に基づく送達システムは、既存のレトロウイルスcDNA送達システムに比べていくつかのさらなる潜在的利点を有する。例えば、体細胞のリプログラミングに関与する前初期分子事象に関しては、現在、ほとんど知られていない。というのは、これらは、リプログラミング因子がレトロウイルスベクター中でcDNAとして導入される場合、該タンパク質はそのcDNAがゲノムへ組み込まれ、転写され、かつ翻訳されるまで産生されないので、研究することが困難だからである。明らかに、再形質転換タンパク質の直接送達がこれらの問題を回避すると考えられる。加えて、組み込みベクターを介して送達される場合、TFの定序発現または化学量論がリプログラミングに関与するかどうかを評価することは基本的に不可能である。TTSSに基づくタンパク質送達システムは、タンパク質の送達のタイミングおよび相対量の柔軟性を可能にし、かくして、これらの問題に対処するために用いることができる。初期事象の理解は、リプログラミングの効率を改善し、その上、それ自体でいずれの生物学的材料の送達なしにリプログラミングを潜在的に媒介しうる小分子の発見を加速しうる。最後に、TTSSに基づくタンパク質送達システムを、腫瘍抑制因子のがん細胞への送達または変異体遺伝性の対立遺伝子を補完する野生型のタンパク質の送達のような、さらなる治療的使用に適応することができる。

現在使用されているウイルスベクターシステムに損害を与える制限の多くを回避する人工多能性幹(iPS)細胞を作出するための新規の方法論が本明細書において記述される。関心対象の遺伝子をコードするcDNAを送達するのではなく、タンパク質を哺乳動物細胞へ直接注入して、転写因子それ自体を送達する細菌分泌システムが本明細書において記述される。具体的には、病毒性タンパク質ではなく哺乳動物転写因子(TF)を哺乳動物細胞へ特異的に送達する病原性細菌由来の操作されたIII型分泌システム(TTSS)が本明細書において記述される。

(A) TTSSをコードする非病原性細菌の開発
TTSSは内部共生体において見出されるが、研究の大部分は、病原性細菌、特にシゲラ、サルモネラおよびエルシニア属の種内にコードされるこれらのシステムを理解することに焦点を向けてきた。これらの細菌は、「エフェクター」といわれる、およそ数十種のタンパク質を、直接的に宿主細胞へ送達する。エフェクターではなく哺乳動物TFを宿主細胞へ特異的に送達するインタクトで、完全に機能的なTTSSを有する非病原性の細菌株を作出するためのいくつかの手法が、本明細書において記述される。そのような菌株を作出するために、2つの基本的な手法: (1) 大部分のエフェクターをもはやコードかつ産生しないよう病原性細菌を遺伝的に操作する手法、および(2) K12またはDH5aなどの一般的な非病原性の実験室大腸菌株へ機能的TTSSを導入する手法を取ることができる。インビボおよびインビトロの両方の条件下でネズミチフス菌SPI1 TTSSおよびフレクスナー赤痢菌mxi-spa TTSSの活性化を誘導する条件が知られている。機能的サルモネラSPI1またはシゲラmxi-spa TTSSを形成させるのに必要とされる20〜25種のタンパク質をコードする遺伝子の全てが、シゲラ病毒性プラスミドおよびサルモネラ染色体上に互いに隣接して位置する2つの大きなオペロン内にコードされる。これらの分泌システムの各々は、これらのオペロンが他の細菌へ導入される場合に機能的であり、かつ発現される[7], [8]。シゲラTTSSが大腸菌において発現され、サルモネラTTSSがシゲラにおいて発現されることを考慮すると、サルモネラTTSSは大腸菌において発現され、同様に発現時に機能的である可能性が高い。

サルモネラおよびシゲラはそれ自体の、非食細胞への取り込みを媒介する細胞内病原体である。それらのTTSSは侵入の媒介において主要な役割を果たす。しかしながら、顕著には、TTSSの機構の構成成分はそれ自体、取り込みを媒介せず、むしろその活性はいくつかのエフェクタータンパク質の協調的努力に依存する[9]。したがって、本明細書において記述される操作された大腸菌株は、哺乳動物細胞に侵入するという可能性が極めて低い。むしろ、それらは細胞の外表面に付着したままである可能性が高い。注目すべきは、細菌はインビボにおいて特定の細胞型に選択的に付着するが、細胞培養において、細菌はそのTTSSを用いて、遭遇するどんな細胞型へもエフェクターを送達することができる。

これらの所見から、K12大腸菌などの一般的な非病原性の実験室株へ機能的TTSSを導入することは可能なはずであるものと示唆される。具体的には、相同組み換えを用いて、細菌プラスミドまたは人工染色体を酵母において作出することができる。酵母および細菌の両方において低コピー数のベクターとして発現される本発明者らのシャトルベクターを用いて、この目標を達成することができる。この手法は最近、細菌ゲノム全体を酵母から細菌へ移動させることが確証されている[10]ので、約30〜40 kBしか含まないTTSSをコードするオペロンの往復に適しているはずである。

代替的な手法は、エフェクターおよび/またはエフェクターのその発現を制御する既知の主たる転写調節因子(しかし3型分泌機構の構成成分ではない)が欠失された菌株を作出することにより、既知のエフェクターのいずれをももはやコードしない、または少なくとももはや発現しない非病原性のフレクスナー赤痢菌株および/またはネズミチフス菌株を作出することでありうる。

(B) TTSSを介した転写因子の分泌の最大化
宿主細胞への細菌TTSSからの機能的な哺乳動物TFの分泌を最大化するためには、最適化される必要のある変数がいくつかある: (1) タンパク質は、III型分泌基質として認識されるように修飾される必要があり、(2) 修飾されたTFは依然として、リプログラミングを媒介できる必要があり、(3) 細菌中のこれらの哺乳動物タンパク質の発現は、最適化される必要があり、かつ(4) TFはTTSSと協調的に発現される必要がある。真核生物タンパク質を含む、多数の異種タンパク質は、細菌TTSSによって認識かつ分泌されうる[11]。それらの分泌は、そのアミノ末端への分泌シグナルの付加に依る。コンセンサスIII型分泌シグナルが存在しない場合には、これらのシグナルの基本的な構成成分が知られている[12]。全てのエフェクターは、その最初の20アミノ酸のなかに「分泌シグナル」をコードする。この配列は、場合によっては、宿主細胞へのエフェクターの送達を媒介するのに十分である。しかしながら、他の場合には、それらの分泌はIII型分泌シャペロンの存在に依る。これらの場合には、エフェクターはその最初の60〜70残基のなかにシャペロン結合ドメインをコードする。本発明者らは体系的に、25種のうちのどのシゲラエフェクターが各範疇に入るのかについて判定し、全25種のエフェクターの分泌の相対的効率について判定した[13]。種々の分泌シグナルをTFのアミノ末端に体系的に融合させることにより、どの配列が宿主細胞へのTFの最大の分泌/移行(translocation)をもたらすかを判定することができる。恐らく、最少の残基を付加する修飾は、機能を妨害する可能性が最も少ない。感染細胞の核への修飾TFの最大の送達をもたらす修飾を、スクリーニングすることができる。これらが特定されれば、修飾TFを発現する遺伝子を、レトロウイルスベクターへ導入することができ、その上、これらの変形体がMEFをiPS細胞へリプログラミングできるかを確認することができる。

修飾TFが機能的ではない場合、シグナル配列は、TFが哺乳動物細胞の細胞質へ送達された後に切断されうる。例えば、カルパインまたはフリン切断部位を、分泌シグナルとエフェクターとの間に付加することができる。あるいは、分泌シグナルとTFとの間に単一のユビキチン分子(または、例えばsumo)をコードする融合タンパク質を作出することができ、注入されたタンパク質がN末端規則により認識されて、ユビキチン分子およびその上流配列の除去が生じるようにする。この場合、融合は、新たに曝露される残基がアミノ末端の位置であり、メチオニンであるように操作されうる。というのは、このアミノ酸を有するタンパク質は、少なくともGFPおよびβ-ガラクトシダーゼの場合には、ユビキチンの切断後20時間超の間、安定だからである[14]。

TTSSを介した機能的TFの送達を確立した後に、哺乳動物細胞へのその送達を最大化する条件を判定することができる。TFが、IPTGまたはアラビノース誘導性プロモーターと対比して内因性III型調節プロモーターから発現される場合の分泌のレベルを、比較することができる。異なるコピー数のプラスミド上にコードされる場合の分泌のレベルを、比較することもできる。場合によってはエフェクターの過剰発現はIII型分泌機構を「妨げ」うるので、より多くの産生は最大の分泌と一致しない可能性があるが、これは、使われる菌株がTTSSの通常の基質の、全部ではないが、大部分をもはや発現しないので、問題ではないかもしれない。細菌中のTFの発現レベルが低い場合、そのコドン組成が細菌発現について最適化されるような、合成による遺伝子変形体のアッセンブリの探索を行うことができる。

(C) 体細胞のリプログラミングのためのTTSSに基づくアッセイ法の開発
リプログラミングをともに媒介するTFの1つをそれぞれが分泌する4種の細菌株が構築された後に、マウス胚線維芽細胞(MEF)のiPS細胞へのリプログラミングのための細菌「感染」アッセイ法を開発することができる。アッセイ法の基本設計は、MEFに4種の細菌株(異なる細菌株中にコードされた各TF)を感染させ、iPS細胞の作出についてスクリーニングすることでありうる。これらの実験では、MEFのiPS細胞への転換後にのみ発現されるOct4プロモーターの制御下のGFPを保有しているMEFを用い、それによって簡単な、可視的アッセイ法を提供し、iPS細胞への成功裏のリプログラミングのスコアをつけることができる[15]。下記のように、この直接的システムを体系的に最適化して、細菌タンパク質発現および宿主細胞相互作用における重要な局面に対処することにより効率を増加させる。

第一に、細菌の観点からすれば、細菌が明らかに、MEFよりも増殖することがあり、培地条件を乱しうるので、MEF共培養物中に存在する細菌の数を制限することが必要でありうる。本システムは、細菌が2〜3時間感染することができ、その後に細菌を死滅させるため、ゲンタマイシンのような、培地に限定される抗生物質が添加されるといった、周期的間隔(例えば、8〜12時間)で細菌がMEFに添加される場合に最もうまく機能しうる。細菌は、それらが宿主細胞に侵入しうるのではなく、正常な細胞内プロセスを維持しうるように操作されうる。これらの時点を最適化するため、遺伝的に改変された細菌のT3SSがMEFの接触後にTFを活発に送達する時間の長さを判定するための一連の制御実験を行うことができる。

細菌が宿主に接触すれば、T3SSは唯一活性化される。MEFに実際に接触する細胞培養物に添加される細菌の数を最適化するため、1種または2種の大腸菌アドヘシン、例えば大腸菌Afa1およびAIDAを、遺伝子操作された菌株へ導入することの有用性を試験することができる。これらのアドヘシンは、宿主細胞への大腸菌の接着において主要な役割を果たす。シゲラへのAfaIの添加は、種々の宿主細胞型に接着するその能力の1,000倍の増加をもたらす[16]。先天性免疫シグナル伝達プロセスの活性化を回避するため、フラジェリンまたは免疫原性LPSを産生しない細菌株を用いることができる。

MEFへの機能的TFの送達が最適化され、MEF増殖に及ぼす影響が最小限の条件が特定されたら、TF送達によるMEFのリプログラミングに焦点を向けることができる。(ウイルス形質導入または遺伝子誘導手法による)リプログラミングに関して報告されている効率は、典型的には、わずか0.01〜1%であるが、これらの稀有な事象を検出する能力を、Oct4プロモーターの制御下にGFPをコードするMEFを用いることによって増強することができる。このプロモーターはMEFにおいて不活性であるが、しかしiPS細胞において活性化される。したがって、リプログラミングされたiPS細胞の可視的スクリーニングを行うことができる。さらに、iPS細胞を産生する可能性を増加させるため、これらの実験を、リプログラミングの効率を100倍増加させることが報告されているバルプロ酸(VPA)のような、小分子の存在下において行うことができる[17]。そのような可視的選択を用いて、リプログラミングアッセイ法を24または48ウェルの形式にて行い、かくして種々の異なる条件の迅速なスクリーニングを可能にすることができる。

組み合わせOct4、Sox2、Klf4、およびc-Myc、またはOct4、Sox2、NanogおよびLin28を含む、異なる組み合わせのTFが、体細胞を成功裏にリプログラミングさせることが報告されている。現在、リプログラミングにおいて、これらの個々のTFの各々の特定要件、またはそれらの最適な化学量論に関してはほとんど知られていない。したがって、TFの1つを各々が分泌する細菌株が構築される。全4種以外の単一のTFを分泌する菌株は、各々が異なるTFを送達する異なる比率の3種または4種の菌株にMEFを曝露することによって、(a) 各タンパク質の分泌を最大化し、(b) リプログラミングを媒介する異なる条件についてのスクリーニングを可能にしうる。リプログラミングTFは少なくとも6〜14日間、存在することが必要であり[18, 19]、かくして、毎日の感染が長期間(2〜4週間)行われうることを示唆している証拠が存在する。注目すべきは、並行して、T3SSに基づくアッセイ法を用いて、MEFを筋芽細胞へリプログラミングできるかどうか、比較的より単純な操作、を試験することもできる。この場合、単一のTF、つまりMyoDの発現は、リプログラミングを媒介するのに十分である[20]。この実験の場合、T3SSを介してMyoDを分泌できる細菌株を作出することができ、MEFから筋細胞を作出するT3SSシステムの能力を試験することができる。このアッセイ法は異なる細菌株の、3〜4種ではなく、1種のみの感染を伴う。

本明細書において記述される技術は、特に本システムが指定のタンパク質を特定の細胞型へインビボにおいて送達するように適応されうるという点で、広く有用である。例えば、腫瘍抑制因子は腫瘍を標的とすることが可能であり、抗炎症促進性タンパク質は、クローン病または潰瘍性結腸炎のような、自己免疫媒介性の疾患に関与する組織を標的とすることが可能である。

細菌分泌システムを用いてiPS細胞を作出するための本明細書において記述される手法は、本発明者らの知る限り、これまでに提唱されておらず、臨床の場面において患者へiPSに基づく治療法を届ける際の最大の主要な技術的障害に対処する。

参考文献

実施例5
DH10bおよびNissle大腸菌1917の染色体における、3型分泌システム・オペロンをコードする領域の組み込み
細菌への導入時に3型分泌プラスミドを保有する大きなプラスミドの相対的不安定性を考慮して、相同組み換え技術を用いてオペロンを染色体へ導入し、不安定要因を取り除いた。具体的には、Kuhlman and Cox (Nucleic Acids Research 2010 38:e92)により開発された「ランディングパッド」技術の変法を利用した。この改変は、機能的3型分泌システムを安定的に発現する菌株を生じさせ、重要なさらなる改変をもたらす。というのは、菌株がインビボの生物剤として使われる場合には安定性が所望の状態でありうるからである。

実施例6
非侵入性3型分泌コンピテント大腸菌株の開発
機能的な機構を作出するために必要とされる遺伝子を含んだシゲラプラスミドDNAの領域上に存在する4種の3型内因性分泌シゲラタンパク質は、宿主細胞の細胞質ゾルへのminT3細菌の取り込みを媒介するのに十分であることが本明細書において実証される。「MinT3」は、最小の3型分泌システムを発現する大腸菌をいう。最小の3型分泌システムの遺伝子は、染色体中におよび/または1つもしくは複数のプラスミド上に存在しうる。この知見を考慮して、いずれの内因性分泌タンパク質も、もはやコードしないminT3細菌の変形体が開発された。この大腸菌株は、細胞の外表面に結合し、ヒトへタンパク質を送達するが、しかしそれ自体は細胞に侵入しない(図1)。菌株は異なる治療的使用を有しうることが本明細書において特に企図される。非限定的な例として、侵入し、かつ細胞死を含む先天性免疫応答をトリガーする菌株は、固形腫瘍を標的とするのに有利であるが、細胞外にとどまる菌株は、例えば、リプログラミングにまたは宿主細胞への抗炎症性タンパク質の送達に有益である。

機能的シゲラ3型分泌機構を作出するために必要とされる構成成分をコードするオペロンに存在している分泌タンパク質は4種ある。これらのタンパク質はIpgB1、IpgD、IpaAおよびIcsBである。これらのタンパク質のうちの3つIpgB1、IpgDおよびIpaAは、宿主細胞への細胞内病原体シゲラの取り込みの一翼を担うのに関与するとされてきた。これらにはIpgB1、IpgDおよびIpaAが含まれる。4番目の分泌タンパク質IcsBは、自食作用の遮断およびオートファゴソームへのシゲラの取り込みの抑止に関与している。IpgDは、宿主細胞へのサルモネラの取り込みに関与するサルモネラタンパク質SopBと相同性を持つ。IpgB1は、Racを特異的に標的とし、宿主細胞へのシゲラの取り込みを媒介するラッフルを誘導するものと思われるRho GTP交換因子(exchange favor)である。

多くの他の細菌病原体は、シゲラを含めて、IpgB1相同体をコードし、これらの相同体は種々のRho GTPaseを標的とする。IpaAは、宿主細胞へのサルモネラの取り込みに関与するタンパク質サルモネラSipAといくらかの相同性を持つ。しかし、IpaAはビンキュリンと相互作用する可能性が高いが、SipAはアクチンと相互作用する。

Claims (47)

1. 機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列であって、機能的T3SSをコードする遺伝子が、
   acp；ipaA；ipaB；ipaC；ipaD；ipgC；ipgB1；ipgA；icsB；ipgD；ipgE；ipgF；mxiG；mxiH；mxiI；mxiJ；mxiK；mxiN；mxiL；mxiM；mxiE；mxiD；mxiC；mxiA；spal5；spa47；spal3；spa32；spa33；spa24；spa9；spa29；spa40;ならびに
   virFおよび/もしくはVirB；または
   シゲラ属の種(Shigella spp)、サルモネラ属の種(Salmonella spp)、腸管病原性大腸菌(E. coli)、またはエルシニア属の種(Yersinia spp)に由来する、以下の遺伝子の相同体
   acp；ipaA；ipaB；ipaC；ipaD；ipgC；ipgB1；ipgA；IcsB；ipgD；ipgE；ipgF；mxiG；mxiH；mxiI；mxiJ；mxiK；mxiN；mxiL；mxiM；mxiE；mxiD；mxiC；mxiA；spal5；spa47；spal3；spa32；spa33；spa24；spa9；spa29；およびspa40；ならびに
   virFおよび/もしくはVirBである、第1の核酸配列と、
   T3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列であって、T3SS適合性ポリペプチドが、T3SSを介して内因性には送達されないポリペプチド配列を含む、第2の核酸配列と
   を含み、標的細胞または標的生物に対して非病原性であり、かつ第1の核酸配列を含むよう操作される前にT3SSを含まない、操作された非病原性の微生物細胞。
2. T3SS適合性ポリペプチドが、微生物細胞にとって外因性である、請求項1に記載の操作された微生物細胞。
3. T3SS適合性ポリペプチドが、標的細胞に対して異所性である、請求項1〜2のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
4. 第1の核酸配列がプラスミド上に位置する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
5. 第1の核酸配列が染色体上に位置する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
6. 非病原性の生物が、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)、大腸菌K12、および派生株からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
7. 大腸菌K12の派生体である菌株が、大腸菌DH10β、大腸菌DH5α、大腸菌MinT3、大腸菌83972、および大腸菌M17からなる群より選択される、請求項6に記載の操作された微生物細胞。
8. 標的細胞への接着を増大させる1種または複数種のポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
9. 標的細胞への接着を増大させるポリペプチドが、Tirおよびインチミンを含む、請求項8に記載の操作された微生物細胞。
10. 標的細胞への接着を増大させるポリペプチドが、細菌接着、Afa1、AIDA、侵入、または標的細胞ポリペプチドの細胞外エピトープに特異的な一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項9に記載の操作された微生物細胞。
11. ポリペプチドが、N末端3型分泌システム(T3SS)シグナルを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
12. ポリペプチドをコードする核酸配列が、3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントに機能的に連結されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
13. 3型分泌システム(T3SS)に関連したプロモーターまたはプロモーターエレメントが、MxiE認識配列および誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項12に記載の操作された微生物細胞。
14. ポリペプチドをコードする核酸が、誘導性プロモーターに機能的に連結されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
15. ポリペプチドをコードする核酸が、染色体上に位置する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
16. ポリペプチドが抗炎症性ポリペプチドである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
17. 抗炎症性ポリペプチドが、細菌抗炎症性ポリペプチド、NF-κBシグナル伝達を阻害する細菌ポリペプチド、OspG、OspF、IpaH9.8、SseL、YopJ、NleB、NleC、NleE、NleH1、OspLからなる群より選択される、請求項16に記載の操作された微生物細胞。
18. 非病原性の微生物細胞が、片利共生の腸内微生物細胞である、請求項16〜17のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
19. 片利共生の腸内微生物細胞が、大腸菌NISSLE 1917 (EcN)である、請求項16〜18のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
20. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが毒素である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
21. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが腫瘍抑制ポリペプチドである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
22. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドがリプログラミング因子である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
23. リプログラミング因子が、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog、Sal4、Dppa2、Ezh2、およびEsrrbからなる群より選択される、請求項22に記載の操作された微生物細胞。
24. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが分化転換因子である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
25. 分化転換因子が、myoDからなる群より選択される筋細胞分化転換因子である、請求項24に記載の操作された微生物細胞。
26. 分化転換因子が、Gata4、Mec2F、およびTbs5からなる群より選択される心筋細胞分化転換因子である、請求項24に記載の操作された微生物細胞。
27. 3型分泌システム(T3SS)適合性ポリペプチドが抗原である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞。
28. 抗原が腸内病原体に由来する、請求項27に記載の操作された微生物細胞。
29. 標的細胞へポリペプチドを導入するための、請求項1〜28のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞を含む薬学的組成物。
30. 請求項16〜19のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞を含む、対象における炎症を低減させるための薬学的組成物。
31. 対象が自己免疫疾患の処置を必要としている、請求項30に記載の薬学的組成物。
32. 炎症が胃腸管の炎症である、請求項30に記載の薬学的組成物。
33. 対象が、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、および潰瘍性結腸炎からなる群より選択される状態の処置を必要としている、請求項30〜32のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
34. 経口的に投与されるものである、請求項30〜33のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
35. 請求項20〜21のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞を含む、対象における増殖性疾患を処置するための薬学的組成物。
36. 増殖性疾患が、がんである、請求項35に記載の薬学的組成物。
37. がんが胃腸管のがんであり、経口的に投与されるものである、請求項36に記載の薬学的組成物。
38. 請求項27〜28のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞を含む、対象における増殖性疾患を処置するための薬学的組成物。
39. 経口的に投与されるものである、請求項38に記載の薬学的組成物。
40. 標的細胞をインビトロでリプログラミング/分化転換させるか、または標的細胞のリプログラミング/分化転換の効率をインビトロで増大させる方法であって、該細胞を、請求項22〜26のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞とインビトロで接触させる段階を含む方法。
    
41. (a) 標的細胞および操作された微生物細胞を抗生物質と接触させる段階;
    (b) 未付着の微生物細胞および抗生物質を除去する段階; ならびに
    (c) 標的細胞を第2の操作された微生物細胞と接触させる段階
    をさらに含む、請求項40に記載の方法。
42. 段階(a)〜(c)が少なくとも1回繰り返される、請求項41に記載の方法。
43. 標的細胞が、操作された微生物細胞と少なくとも5日間にわたって少なくとも毎日接触される、請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法。
44. 標的細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)表現型にリプログラミングされる細胞である、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
45. 標的細胞が、分化転換される細胞である、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
46. 請求項1〜28のいずれか一項に記載の操作された微生物細胞を含むキット。
47. 機能的3型分泌システム(T3SS)をコードする遺伝子を含む第1の核酸配列であって、機能的T3SSをコードする遺伝子が、
    acp；ipaA；ipaB；ipaC；ipaD；ipgC；ipgB1；ipgA；icsB；ipgD；ipgE；ipgF；mxiG；mxiH；mxiI；mxiJ；mxiK；mxiN；mxiL；mxiM；mxiE；mxiD；mxiC；mxiA；spal5；spa47；spal3；spa32；spa33；spa24；spa9；spa29；spa40;ならびに
    virFおよび/もしくはVirB；または
    シゲラ属の種(Shigella spp)、サルモネラ属の種(Salmonella spp)、腸管病原性大腸菌(E. coli)、またはエルシニア属の種(Yersinia spp)に由来する、以下の遺伝子の相同体
    acp；ipaA；ipaB；ipaC；ipaD；ipgC；ipgB1；ipgA；IcsB；ipgD；ipgE；ipgF；mxiG；mxiH；mxiI；mxiJ；mxiK；mxiN；mxiL；mxiM；mxiE；mxiD；mxiC；mxiA；spal5；spa47；spal3；spa32；spa33；spa24；spa9；spa29；およびspa40；ならびに
    virFおよび/もしくはVirBである、第1の核酸配列と、
    標的細胞にとって外因性であるT3SS適合性ポリペプチドをコードする第2の核酸配列であって、T3SS適合性ポリペプチドが、T3SSを介して内因性には送達されないポリペプチド配列を含む、第2の核酸配列と
    を含み、標的細胞または標的生物に対して非病原性であり、かつ第1の核酸配列を含むよう操作される前にT3SSを含まない、操作された微生物細胞
    を含むキット。

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