JP6283347B2 - 成熟樹状細胞集団の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、医療分野において有用な、成熟した樹状細胞を含む細胞集団を製造する方法に関する。

樹状細胞（以下、「ＤＣ」ともいう）は、樹枝状の突起を伸展させていることを特徴とし免疫応答に関わる細胞の総称である。ＤＣは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ陽性の抗原提示細胞であり、生体内の免疫系で重要な役割を持っている。ＤＣは造血幹細胞よりミエロイド系やリンパ球系分化経路を経て未成熟ＤＣへ分化し、そして成熟ＤＣに至る。生体において、ＤＣは分化系列（ミエロイド系及びリンパ球系）や成熟段階（未成熟及び成熟）の異なる多様なサブセットとして、末梢組織やリンパ組織に広く存在している。微生物、ウイルス、異物等の外来抗原に侵襲された末梢炎症組織では、未成熟ＤＣがマンノースレセプターやｔｏｌｌ様レセプター（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ））等のパターン認識レセプター（ｐａｔｔｅｒｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＲＲ））により外来抗原を捕食して成熟ＤＣへ分化し、所属二次リンパ組織に移行する。さらに、成熟ＤＣはナイーブＴ細胞に抗原刺激と共刺激を与え、抗原特異的エフェクターＴ細胞を分化誘導し、一次免疫応答を惹起する。このようにＤＣは自然免疫と獲得免疫を繋ぐ最も強力な抗原提示細胞である。その臨床応用例として成熟ＤＣを用いた癌ワクチン療法の臨床試験が進められている。

成熟ＤＣは白血球の１％にも満たないため、成熟ＤＣを末梢血から単離することは困難である。また、成熟ＤＣを組織から抽出することも困難である。したがって、末梢血から未成熟ＤＣ及び成熟ＤＣを作製する方法の研究が進められている。これらの方法は、出発材料としてＣＤ３４陽性造血前駆細胞を使用する方法と、ＣＤ１４陽性単球を使用する方法に大きく分けられる。これらの細胞を、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン（ＩＬ）−４などのサイトカインにより未成熟ＤＣに分化させ、次いで未成熟ＤＣをＤＣ成熟化因子（エンドトキシンや炎症性サイトカイン）により成熟ＤＣに成熟させる２段階の方法が多数報告されている（非特許文献１）。

細胞の周りや細胞と細胞の間には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と総称される巨大なタンパク質の超分子複合体が存在し、細胞→組織→器官→個体という階層的な細胞社会の形成を制御している。また、細胞外マトリックスは、様々な増殖因子や分化誘導因子と同様、細胞の増殖・分化の制御に直接かかわっていることが近年明らかにされている。ＤＣに対する細胞外マトリックスの作用についても、種々検討が行われている。例えば、Ｉ型コラーゲン及びフィブリノーゲンは未成熟ＤＣを成熟化させることが報告されている。一方、フィブロネクチン（ＦＮ）はＤＣの成熟化に効果は無く、むしろ成熟ＤＣのマーカー遺伝子の発現を抑制することが報告されている（非特許文献２、３）。また、ＦＮフラグメントで刺激した単球は、抗ＣＤ３抗体により活性化したＴ細胞の増殖を抑制することが報告されている（非特許文献４）。

以上の通り、ＤＣの成熟化をより促進し、かつエフェクターＴ細胞による免疫応答をより惹起する成熟ＤＣの製造方法が求められているものの、効率的に多くの成熟ＤＣを調製するのに十分な方法はいまだ確立されていない。

イムノロジカル リサーチ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．）、第５１巻、第１５３〜１６０頁（２０１２） ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第２８巻、第１６７３〜１６８０頁（１９９８） イムノロジー レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第１００巻、第１１３〜１１９頁（２００５） ザ ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１７５巻、第３３４７〜３３５３頁（２００５）

本発明の目的は、成熟ＤＣを含有する細胞集団の製造方法、及びその方法により製造された細胞集団、さらにその細胞集団を含む医薬を提供することにある。

本発明者らは、未成熟ＤＣを含有する細胞集団をＤＣ成熟化因子及びＦＮフラグメントの存在下で培養することにより、ＤＣの成熟化が促進され、エフェクターＴ細胞による免疫応答を惹起するサイトカインの産生が促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明を概説すれば、
［１］未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を、樹状細胞成熟化因子及びフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、成熟した樹状細胞を含有する細胞集団の製造方法、
［２］樹状細胞成熟化因子が、下記１）〜３）からなる群より選択される、［１］記載の方法、
１）菌体製剤、
２）ＣＤ４０アゴニスト、及び
３）腫瘍壊死因子−α及びインターロイキン−１βを含む樹状細胞成熟化カクテル、
［３］菌体製剤が、ＯＫ−４３２である、［２］記載の方法、
［４］フィブロネクチンフラグメントが、細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン及びフィブロネクチン結合ドメイン部位からなる群より選択されるドメインを有する組換えポリペプチドである［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法、
［５］フィブロネクチンフラグメントが、ＣＨ−２９６及びＩＩＩ_１−Ｃから選択される組換えポリペプチドである［４］記載の方法、
［６］単球を含有する細胞集団より未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程をさらに含む、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法、
［７］未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程が、単球を含有する細胞集団をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養する工程である、［６］記載の方法、
［８］無血清培地を使用して培養を実施する、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法、
［９］［１］〜［８］のいずれか１つに記載の製造方法により得られる細胞集団、及び
［１０］［９］記載の細胞集団を含有する医薬、
に関する。

本発明の方法を用いれば、Ｔ細胞の活性化をはじめ、免疫反応を強く惹起する成熟ＤＣを効率よく製造することができる。当該方法により製造された成熟ＤＣを含む細胞集団は、免疫細胞療法、癌ワクチン療法等に有用である。

ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 ＤＣが産生するサイトカイン量を示す図である。 ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 ＤＣが産生するサイトカイン量を示す図である。 ＤＣが産生するサイトカイン量を示す図である。 ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 ＤＣが産生するサイトカイン量を示す図である。 ＤＣが産生するサイトカイン量を示す図である。 ＤＣが産生するサイトカイン量を示す図である。 ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 ＤＣの成熟化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。

本明細書において「樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ）」とは、樹枝状の突起を伸展させていることを特徴とし強力な抗原提示機能を有する細胞の一群を意味する。「未成熟（Ｉｍｍａｔｕｒｅ）ＤＣ」は成熟ＤＣの前駆細胞を意味し、ＣＤ１４陰性、ＣＤ８３陽性、ＣＤ８６陽性、ＭＨＣクラスＩＩ陽性であるＤＣを意味する。また、「成熟（Ｍａｔｕｒｅ）ＤＣ」は、ＣＤ１４陰性、ＣＤ８３強陽性、ＣＤ８６強陽性、ＭＨＣクラスＩＩ強陽性であるＤＣを意味する。表１にヒト単球及びヒトＤＣが発現している表面マーカーを例示する。なお、「陽性」は、「強陽性（bright）」及び「弱陽性（dim）」を含む。

本明細書において「フィブロネクチン（ＦＮ）フラグメント」とは、分子内にフィブロネクチン由来のアミノ酸配列の一部を含有するポリペプチドを意味する。ＦＮフラグメントは、天然由来の単離されたポリペプチド、人為的に合成されたポリペプチド、又は遺伝子工学的に調製された組換えポリペプチドのいずれでもよい。

本発明に使用できるＦＮフラグメント、並びに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）、ＥＭＢＯ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第４巻、第７号、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）、及びバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）、国際公開第２００７／１４２３００号パンフレット等より得ることができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列及びフィブロネクチンのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７にて開示されている。

ＦＮのドメイン構造は７つに分けられており、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれている。これらの各配列の繰り返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型とそれぞれ呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型は７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。ＦＮ中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、１番目、２番目及び３番目（それぞれＩＩＩ_１、ＩＩＩ_２及びＩＩＩ_３と称する）はフィブロネクチン結合ドメインに、８番目、９番目及び１０番目（それぞれＩＩＩ_８、ＩＩＩ_９及びＩＩＩ_１０と称する）は細胞接着ドメインに、また１２番目、１３番目及び１４番目（それぞれＩＩＩ_１２、ＩＩＩ_１３及びＩＩＩ_１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側に、ＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには、２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。

以下、本発明を具体的に説明する。
（１）成熟したＤＣを含有する細胞集団の製造方法
本発明の成熟したＤＣを含有する細胞集団の製造方法は、未成熟のＤＣを含有する細胞集団を、ＤＣ成熟化因子及びＦＮフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする。

本発明に使用できるＦＮフラグメントは、ＦＮ結合ドメイン、細胞接着ドメイン又はヘパリン結合ドメインに含まれるフラグメントから選択される。例えば、ＩＩＩ_１、ＩＩＩ_２、ＩＩＩ_３、ＩＩＩ_７、ＩＩＩ_８、ＩＩＩ_９、ＩＩＩ_１１、ＩＩＩ_１２、ＩＩＩ_１３及びＣＳ−１から選択される少なくとも１つのフラグメントを含めばよく、さらに複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ−５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ−４へのリガンドであるＣＳ−１ドメイン、ＩＩＩ_１等を含有するフラグメントが本発明に使用される。前記フラグメントとしては、例えば、前記のＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、並びにこれらの誘導体や改変物が例示される。前記のＣＨ−２９６はレトロネクチン（登録商標）の名称で市販されている。また、ＩＩＩ_１のＣ末端側の２／３のポリペプチドがＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＩＩＩ_１−Ｃの名称で市販されている。

ＦＮフラグメントは、培地中に溶解して使用してもよく、適切な固相、例えば、細胞培養器材、ビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。固相へのＦＮフラグメントの固定化は、例えば、国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法に従って実施することができる。本発明において使用するＦＮフラグメントの濃度は、特に限定はなく、例えば最終濃度が０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、好適には０．０１〜５００μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加する。また、ＦＮフラグメントを固定化して使用する場合は、前記濃度のＦＮフラグメント溶液を使用して固相への固定化を実施すればよい。ＦＮフラグメント存在下での細胞集団の培養は、国際公開第０３／０８０８１７号パンフレットに詳細に記載されており、これを参照して実施することができる。

ＤＣ成熟化因子は、ＤＣの成熟を促進する物質であればいずれも使用できるが、例えば、１）菌体製剤、２）ＣＤ４０アゴニスト、３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びＩＬ−１βを含むＤＣ成熟化カクテル（ＭＣ：Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）から選択される少なくとも１つの生物応答修飾剤を使用することができる。
本発明に使用する菌体製剤は、例えば、細菌由来製剤［ＯＫ−４３２、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ及びこれらの細胞壁骨格］、担子菌由来製剤（レンチナン、シゾフィラン、ＰＳＫ等）、リポポリ多糖（ＬＰＳ）を使用することができる。本発明にはＯＫ−４３２を好適に使用できる。ＯＫ−４３２はＡ群３型溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の弱毒性自然変異株（Ｓｕ株）をペニシリンで処理した細菌由来製剤の一般名である。本製剤はピシバニール（登録商標）の商品名で市販されている。本発明に使用する菌体製剤の添加量に特に限定はなく、使用される培地及び菌体製剤に応じて、適切な量を選択すればよい。特に本発明を限定するものではないが、菌体製剤は最終濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜２００ｎｇ／ｍＬ程度になるように、特にＯＫ−４３２を使用する場合、０．００１〜１ＫＥ／ｍＬ、好ましくは０．００５〜０．５ＫＥ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０１〜０．２ＫＥ／ｍＬの終濃度で培地に添加される。

本発明に使用するＣＤ４０アゴニストは、哺乳動物ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、好ましくはヒトＣＤ４０Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００００６５）とその可溶性フラグメント及びバリアント、並びにＣＤ４０レセプターに対するアゴニスト抗体である。ＣＤ４０Ｌは膜貫通型タンパク質であり、その細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインを除去した細胞外ドメインからなるＣＤ４０Ｌ可溶性フラグメントが好適に使用される。また、ＣＤ４０アゴニストと共に、ＴＮＦ−αを添加しても良い。添加するＣＤ４０アゴニストの濃度は限定されることはなく適宜設定すればよいが、最終濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜５０μｇ／ｍＬ程度である。

本発明に使用するＤＣ成熟化カクテルは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βを含む生物応答修飾剤の混合物であり、さらに、ＩＬ−６、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−γ、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの核酸類からなる群より選択される物質を含有してもよい。例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２を含むＤＣ成熟化カクテル、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γを含むＤＣ成熟化カクテルが例示される。使用する量は各成熟化カクテルの組成に応じて適宜設定すれば良い。例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γなどのサイトカイン類は、最終濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ程度である。ＰＧＥ２は、最終濃度が０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ程度である。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、最終濃度が１μｇ／ｍＬ〜１０００μg／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ程度である。用いるサイトカインは生体成分から分離されたものでも遺伝子工学的手法により生産したものでもよく、市販品を入手することもできる。また、本発明には、サイトカインの作用を示し得る各サイトカインの変異体及びフラグメントも使用できる。

本発明に使用するＤＣ成熟化因子として、合成物質（ピランコポリマー、レバミゾール等）を使用しても良い。

未成熟ＤＣを含有する細胞集団を培養する工程において、培養開始時の細胞濃度は特に限定はないが、例えば、１〜１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０〜５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０^２〜２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。

未成熟ＤＣを含有する細胞集団の培養は、公知の培養条件で行ってもよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ_２条件下で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、又は細胞培養器材を交換することができる。培養期間は、数時間から数週間程度が好ましく、より好ましくは１２時間〜１０日間であり、１〜５日間程度がさらに好ましい。

本発明の方法において、対象とする特定の抗原を成熟ＤＣに提示させるために、抗原を負荷（パルス）させることができる。例えば、前記抗原をＤＣ成熟化因子の代わりに使用することができる。また、前記抗原をＤＣ成熟化因子と共存させて、抗原と未成熟ＤＣを接触させることができる。さらに、抗原を未成熟ＤＣ内又は成熟ＤＣ内に強制的に導入することができ、抗原がポリペプチドの場合は抗原をコードする核酸を未成熟ＤＣ内又は成熟ＤＣ内に導入して細胞内で発現させることができる。核酸はウイルスベクター又はエレクトロポレーションを使用してＤＣに導入することができ、これらの方法に使用する試薬やキットが広く市販されている。

対象とする特定の抗原としては、例えば、病原体、病原体溶解産物、病原体抽出物、病原体ポリペプチド、ウイルス粒子、細菌、タンパク質、ポリペプチド、がん細胞、がん細胞溶解産物、がん細胞特異的ポリペプチド（がん抗原）があるが、それらに限定されない。また、これらの抗原は、天然由来又は組換体の抗原のいずれもが使用できる。

以上の、本発明の方法により未成熟のＤＣを含有する細胞集団の培養を実施することにより、成熟したＤＣを含有する細胞集団を得ることができる。

本発明の方法に使用される未成熟ＤＣを含有する細胞集団は、単球又は造血前駆細胞を含有する細胞集団、すなわち単核細胞フラクションより調製することができる。これらの細胞集団は適切な出発材料から調製することができ、例えば末梢血から調製される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は本発明に好適である。末梢血からＰＢＭＣを分離する方法として、密度勾配遠心分離法が一般に用いられている。密度勾配遠心分離法には、例えば、市販のフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などの密度勾配遠心用媒体を使用することができる。さらに血球分離用に調製されたＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）、Ｍｏｎｏ−ｐｏｌｙ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）などを利用してもよい。密度勾配遠心分離法における媒体の量、温度設定等は用いる媒体により、適宜、設定される。

単核細胞フラクションからの単球の分離は、プラスチック付着法によって行うことができる。プラスチック付着法は、例えば、まず通常の培養用のプラスチックフラスコにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を注入し底面に十分いきわたらせた後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回程度洗浄する。１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地などに浮遊させた単核細胞フラクションを上記フラスコ内に注入し、３７℃で１時間程度培養する。上清を吸引後、培地によりフラスコを３回程度洗浄し、非付着細胞を除去する。さらに冷却した０．５％ＥＤＴＡ、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加し４℃で３０分程度放置する。その後、ピペット等でフラスコから遊離した細胞を回収することにより、単球を含有する細胞集団を調製することができる。

さらに別の方法として、後述する実施例で示すように、ＰＢＭＣから抗ＣＤ１４固定化ビーズを用いてＣＤ１４陽性の単球を含有する細胞集団を回収する方法も挙げられる。

単球を含有する細胞集団を、ＩＬ−４、顆粒球・マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−αから選択される少なくとも１つのサイトカインを含有する未成熟ＤＣ分化誘導因子の存在下で培養することにより、単球から未成熟ＤＣへの分化を誘導し、未成熟ＤＣを含有する細胞集団を得ることができる。この操作にはＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの組合せが好適である。また、必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等のサイトカインをさらに添加することが好ましい。用いるサイトカインは生体成分から分離されたものでも遺伝子工学的手法により生産したものでもよく、市販品を入手することもできる。また、本発明には、サイトカインの作用を示し得る各サイトカインの変異体及びフラグメントも使用できる。添加する各サイトカインの濃度は適宜設定すればよいが、最終濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養期間は、数時間から数週間程度が好ましく、より好ましくは１〜１０日間であり、４〜８日間程度がさらに好ましい。また、培養条件は、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ_２条件下が好ましい。

また、未成熟ＤＣを含有する細胞集団を造血前駆細胞から調製する場合は、ＰＢＭＣから調製したＣＤ３４陽性細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）又はトロンボポエチン（ＴＰＯ）を単独、もしくはその組合せの存在下で培養する。この操作により、未成熟ＤＣを含有する細胞集団を得ることができる。

未成熟ＤＣを含有する細胞集団を調製する工程は、未成熟ＤＣを含有する細胞集団から未成熟ＤＣを採取する工程や、未成熟ＤＣ以外の細胞を除去する工程を包含することができる。この工程により、未成熟ＤＣを濃縮することができる。例えば、未成熟ＤＣの細胞表面マーカー（例えばＣＤ１ａ）を指標に、フローサイトメーターや前記マーカーに結合する分子を固定化したビーズ等により分離すればよい。

なお、単球、造血前駆細胞及び未成熟ＤＣを含有する細胞集団を培養する各工程で使用する培地は、培養する細胞及び細胞集団に応じて適宜適切な培地を使用すれば良いが、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地、ＴＩＬ培地（免疫生物研究所）、表皮角化細胞（ＫＢＭと）培地、イスコフ（ＩＭＥＭ）培地等、細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて５〜２０％のウシ血清、ＦＢＳ、ヒト血清、血漿などを添加することができる。０．１〜５％の血清を添加した低血清培地を使用しても良い。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）又は非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでもよいが、安全性の観点から、自己由来のものが好適に使用される。また、ＡＩＭ−Ｖ培地、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏ ＧＭＰ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ ＤＣ Ｍｅｄｉｕｍなどの無血清培地を使用することもできる。全ての培養工程を同一の培地を使用しても良く、各培養工程で異なる培地を使用しても良い。

各工程の培養に使用される細胞培養器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ_２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、バイオリアクターの使用が有利である。また、培養は開放系又は閉鎖系のいずれでも実施することができるが、得られる成熟ＤＣの安全性の観点から、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。

（２）本発明の製造方法により得られる細胞集団
本発明の細胞集団は、前記（１）の方法により得られる細胞集団である。本発明の細胞集団は、成熟したＤＣを含有する。ＤＣの成熟は、当該分野で公知の方法によって、細胞表面マーカー、産生するサイトカイン量又はＤＣ特異的遺伝子の発現量でモニタリングすることができる。これらのモニタリングは、当該分野で通常のアッセイ（例えば、免疫組織化学、ｍＲＮＡ定量法など）を用いて実施することができる。さらに、酵素免疫定量（ＥＬＩＳＡ）法、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー）法などのアッセイにより、細胞表面マーカー及びサイトカイン産生量をモニタリングすることができる。本発明の細胞集団は、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲが強陽性で、ＣＤ８３を発現する細胞を含有する細胞集団である。さらに、本発明の細胞集団はＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを産生する。特にＩＬ−１２の産生増強は、１型（Ｔｈ−１）の免疫応答を強く促進する。成熟ＤＣはまた、貪食による抗原取り込み能力を失う。貪食活性は、通常の取り込みアッセイによって測定することができる。

本発明の細胞集団は、インビトロでＴ細胞と接触させることによりＴ細胞を活性化させることができる。その際、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、又はＩＬ−２などのサイトカインを培地に添加することができる。特に、対象とする特定の抗原を負荷させたＤＣは、前記抗原を認識するＴ細胞を活性化することから、特定の抗原に対する免疫応答を生じさせるために有用である。このように活性化されたＴ細胞は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に投与することができる。

（３）本発明の細胞集団を含有する医薬
本発明の医薬は、前記（２）の細胞集団を含有することを特徴とする。本発明の医薬は、従来技術に従って、有効量の前記細胞集団を許容される担体と混合するなどして、経口／非経口製剤として製造することが出来る。本発明の医薬は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。また、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤、免疫抑制剤（ラパマイシンなど）、抗体製剤、細胞製剤（制御性樹状細胞）などと配合してもよい。さらに、必要に応じてサイトカインを添加してもよい。

本発明の医薬が含有する細胞集団の細胞量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば非経口投与の場合、１日につき、１０^５〜１０^１２ｃｅｌｌｓであることが好ましく、より好ましくは１０^６〜１０^７ｃｅｌｌｓである。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算して同等の量を投与することができる。本発明の医薬は、１回又は複数回、例えば毎日又は毎月患者に投与することができる。

本発明の医薬は、静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、所属リンパ節へ注射等により注入することもできる。また、直接病変部に注入してもよく、全身に投与することも可能である。あるいは、病変部近傍の動脈から注入することも可能である。

本発明の医薬を投与することにより患者体内のＴ細胞を活性化することができる。特に対象とする特定の抗原を負荷させたＤＣを含有する医薬は、特定の抗原に特異的な細胞傷害活性を有するＴ細胞を活性化させるため、例えば、癌や感染症の治療に用いることが可能である。医薬に含有される細胞は、投与する患者に対して同種異系でも又は自家でもよい。

したがって、本発明は、本発明の医薬を投与することを特徴とする治療方法を提供する。さらに、本発明は、医薬の製造における本発明の細胞集団の使用を提供する。また、本発明は、治療において使用するための、成熟したＤＣを含有する細胞集団を提供する。さらに、本発明によれば、本発明の細胞集団を投与することによる、Ｔ細胞の活性化方法が提供される。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞（ＤＣ）の製造−１
（１）単球の調製
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）よりＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、ＣＤ１４陽性細胞（単球）を多く含む細胞集団を回収した。

（２）樹状細胞への分化
実施例１−（１）で得られた細胞を、ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社製）を最終濃度５％、ペニシリン−ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ社製）を最終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）（以下、ＦＳ培地と記載）に、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。さらに、この細胞懸濁液にＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）及びＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）をそれぞれ最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、細胞培養用１２ウェルプレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで樹状細胞誘導培養を開始した。培養２日後、培地を半量除き、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４をそれぞれ最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ含むＦＳ培地を、除いた量と等量加えさらに３日間培養した。

（３）固定化プレートの調製
フィブロネクチン（ＦＮ）フラグメントであるＣＨ−２９６［レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製］、ヒト血漿由来フィブロネクチン（シグマアルドリッチ社製）をそれぞれ２５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（ライフテクノロジーズ社製）に溶解し、表面未処理９６ウェル平面プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウェルに０．０７ｍＬずつ加え、４℃で３日間放置した後、３７℃で４時間保持した。また、対照として溶媒（ＰＢＳ）のみを表面未処理９６ウェル平面プレートの各ウェルに０．０７ｍＬ加え、４℃で３日間放置した後、３７℃で４時間保持した。以下、ＦＮフラグメントＣＨ−２９６（レトロネクチン）を固定化したプレートをＲＮプレート、ヒト血漿由来ＦＮを固定化したプレートをＦＮプレート、溶媒のみを使用したプレートをＮＴプレートと記載する。こうして調製したプレートは、溶液を除去しＰＢＳで２回洗浄した後に使用した。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例１−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２（日本標準商品分類番号８７４２９９、中外製薬社製）を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＦＳ培地に６．７×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．１５ｍＬを実施例１−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

また、細胞をＤＣ成熟化因子を含有しないＦＳ培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した群を調製した。

実施例２ 樹状細胞の表面抗原発現解析−１
実施例１−（４）で得られた培養細胞を、ウシ胎児血清を最終濃度１％、ペニシリン−ストレプトマイシンを最終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加したＰＢＳ（以下、１％ＦＢＳ／ＰＢＳ培地と記載）に懸濁し、下記の蛍光色素標識抗体をそれぞれ添加し４℃で２０分間抗体反応を行った。その後、１％ＦＢＳ／ＰＢＳ培地で洗浄した細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ベクトン・ディッキンソン社製）での解析に供した。解析では前方散乱光（ＦＳＣ）と側方散乱光（ＳＳＣ）でミエロイド系列細胞にゲートを掛け、平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）としてＧｅｏ Ｍｅａｎの値により、細胞表面抗原の発現量を測定した。

蛍光色素標識抗体は、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８６抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をそれぞれ使用した。

その結果を図１に示す。図１の縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１より、ＯＫ−４３２存在下（以下、図中で「ＯＫ４３２」と記載する）にＲＮプレートで成熟させたＤＣは、ＮＴプレートやＦＮプレートで成熟させたＤＣより成熟化マーカーであるＣＤ８３、ＣＤ８０及びＣＤ８６の細胞表面発現量が上昇した。一方、ＯＫ−４３２非存在下（以下、図中「−」と記載する）では、いずれのプレート（ＮＴプレートやＲＮプレートやＦＮプレート）を使用しても成熟化マーカーの発現量の上昇は見られなかった。以下、図中で、ＲＮプレートは「ＲＮ」、ＦＮプレートは「ＦＮ」、ＮＴプレートは「ＮＴ」と記載する。

以上の実施例から、ＦＮフラグメントはＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣ成熟化マーカーの発現量を増加させること、すなわち、ＦＮフラグメントはＤＣの成熟化を促進することが明らかとなった。

実施例３ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−２
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
実施例３−（１）で得られた細胞をＦＳ培地に１．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、さらにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４をそれぞれ最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、細胞培養用１２ウェルプレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで樹状細胞誘導培養を開始した。培養３日後、培地を半量除き、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４をそれぞれ最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ含むＦＳ培地を、除いた量と等量加えさらに３日間培養した。

（３）固定化プレートの調製
ＦＮフラグメントＣＨ−２９６（レトロネクチン）を２５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、表面未処理４８ウェル平面プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウェルに０．３ｍＬ加え、４℃で３日間放置した後、３７℃で４時間保持してＲＮプレートを調製した。また、対照として溶媒（ＰＢＳ）のみを表面未処理４８ウェル平面プレートの各ウェルに０．３ｍＬ加え、４℃で３日間放置した後、３７℃で４時間保持してＮＴプレートを調製した。こうして調製したプレートは、溶液を除去しＰＢＳで２回洗浄した後に使用した。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例３−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＦＳ培地に４．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．５ｍＬを実施例３−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例４ 樹状細胞の培養上清中サイトカインの定量解析−１
実施例３−（４）で得られた培養上清を試料とし、Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２ １１ｐｌｅｘ ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、フローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにて、ＤＣから産生される培養上清中のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ）量を測定した。解析はＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｐｒｏ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。

その結果を図２に示す。図２の縦軸はサイトカイン量を示す。図２より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートで成熟させたＤＣより、その培養上清中にＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γが多く存在した。

以上の実施例から、ＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣからのＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ産生を促進することが明らかとなった。

実施例５ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−３
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
ヒトＡＢ血清（ロンザ社製）を最終濃度５％、ペニシリン−ストレプトマイシンを最終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（以下、ＨＳ培地と記載）を使用した点以外、実施例１−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
ＲＮプレート及びＮＴプレートを、実施例１−（３）と同様の方法で調製した。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例５−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＨＳ培地に４．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．１５ｍＬを実施例５−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

また、成熟化因子を加えずにＨＳ培地で懸濁後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した群を調製した。

実施例６ 樹状細胞の表面抗原発現解析−２
実施例５−（４）で得られた培養細胞を、実施例２と同様の方法で測定した。

蛍光色素標識抗体は、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８３抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８０抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８６抗体をそれぞれ使用した。

その結果を図３に示す。図３の縦軸は平均蛍光強度を示す。図３より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートで成熟させたＤＣより、ＤＣ成熟化マーカーであるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６の細胞表面発現量が上昇した。一方、ＯＫ−４３２非存在下（図中「−」）では、いずれのプレート（ＮＴプレート及びＲＮプレート）を使用しても発現量の上昇は見られなかった。

以上の実施例から、ヒトＡＢ血清含有培地を用いてもＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣ成熟化マーカーの発現を促進することが明らかとなった。

実施例７ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−４
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
細胞培養用２４ウェルプレートを使用した点以外、実施例５−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
ＦＮフラグメントＣＨ−２９６（レトロネクチン）、ヒト血漿由来フィブロネクチン、フィブロネクチン断片ＩＩＩ_１―Ｃヒト（シグマアルドリッチ社製）を５０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、細胞培養用９６ウェル平面プレート（コーニング社製）の各ウェルに０．０７ｍＬ加え、４℃で３日間放置した後、３７℃で４時間保持した。また、対照として溶媒（ＰＢＳ）のみを細胞培養用９６ウェル平面プレートの各ウェルに０．０７ｍＬ加え、４℃で３日間放置した後、３７℃で４時間保持した。以下、ＦＮフラグメントＩＩＩ_１―Ｃを固定化したプレートをＩＩＩＣプレートと記載する。こうして調製したプレートは、溶液を除去しＰＢＳで２回洗浄した後に使用した。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例７−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＨＳ培地に３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．１２５ｍＬを実施例１−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例８ 樹状細胞の表面抗原発現解析−３
実施例７−（４）で得られた培養細胞の表面マーカーを、実施例２と同様の方法で測定した。

蛍光色素標識抗体は、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８３抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８０抗体を使用した。

その結果を図４に示す。図４の縦軸は平均蛍光強度を示す。図４より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレート及びＩＩＩＣプレートで成熟させたＤＣは、ＮＴプレートで成熟させたＤＣより成熟化マーカーであるＣＤ８０の細胞表面発現量が上昇した。以下、図中で、ＩＩＩＣプレートは「ＩＩＩＣ」と記載する。

以上の実施例から、ＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下でＤＣ成熟化マーカーの発現を促進することが明らかとなった。

実施例９ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−５
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
培地にＨＳ培地を使用した点以外、実施例３−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
実施例３−（３）と同様の方法で行った。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例９−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＨＳ培地に３．４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．５ｍＬを実施例９−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例１０ 樹状細胞の培養上清中サイトカインの定量解析−２
実施例９−（４）で得られた培養上清を試料とし、Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２ １１ｐｌｅｘ ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを用い、フローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにて、ＤＣから産生される培養上清中のＩＬ−６、ＴＮＦ−α量を測定した。解析はＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｐｒｏを用いた。

その結果を図５に示す。図５の縦軸はサイトカイン量を示す。図５より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートで成熟させたＤＣより、その培養上清中にＩＬ−６、ＴＮＦ−αが多く存在した。

以上の実施例から、ヒトＡＢ血清含有培地を用いて分化させたＤＣの場合も、ＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣからのＩＬ−６、ＴＮＦ−α産生を促進することが明らかとなった。

実施例１１ レトロネクチンを用いた樹状細胞の製造−６
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
細胞培養用６ウェルプレートを使用し、細胞濃度を１．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした点以外、実施例５−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
ＦＮフラグメントＣＨ−２９６（レトロネクチン）の濃度を５０μｇ／ｍＬとし、固定化するプレートとして細胞培養用４８ウェル平面プレートを使用した点以外、実施例３−（３）と同様の方法で行った。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例１１−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＨＳ培地に５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．４ｍＬを実施例１１−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例１２ 樹状細胞の培養上清中サイトカインの定量解析−３
実施例１１−（４）で得られた培養上清を試料とし、Ｈｕｍａｎ ＩＬ−１２ ｐ７０ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、ＤＣから産生される培養上清中のＩＬ−１２量を測定した。

その結果を図６に示す。図６の縦軸はＩＬ−１２量を示す。図６より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートで成熟させたＤＣより、その培養上清中にＩＬ−１２が多く存在した。

以上の実施例から、ヒトＡＢ血清含有培地を用いてもＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣからのＩＬ−１２産生を促進することが明らかとなった。

実施例１３ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−７
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
培地にＸ−Ｖｉｖｏ１５（ロンザ社製）培地（以下、ＸＶ培地と記載）を使用した点以外、実施例７−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
実施例７−（３）と同様の方法で行った。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例１３−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＸＶ培地に２．６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．１２５ｍＬを実施例１３−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例１４ 樹状細胞の表面抗原発現解析−４
実施例１３−（４）で得られた培養細胞を、実施例２と同様の方法で測定した。

蛍光色素標識抗体は、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８３抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８０抗体をそれぞれ使用した。

その結果を図７に示す。図７の縦軸は平均蛍光強度を示す。図７より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレート及びＩＩＩＣプレートで成熟させたＤＣは、ＮＴプレートで成熟させたＤＣより成熟化マーカーであるＣＤ８３及びＣＤ８０の細胞表面発現量が上昇した。

以上の実施例から、無血清培地であるＸ−Ｖｉｖｏ１５培地を用いても、ＦＮフラグメントはＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下でＤＣ成熟化マーカーの発現を促進することが明らかとなった。

実施例１５ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−８
実施例１３と同様の方法で単球の調製、樹状細胞への分化、固定化プレートの調製、固定化プレートでの樹状細胞の成熟化、の各操作を行った。

実施例１６ 樹状細胞の培養上清中サイトカインの定量解析−４
実施例１５で得られた培養上清を試料として、実施例１２と同様の方法でサイトカインを測定した。

その結果を図８に示す。図８の縦軸はＩＬ−１２量を示す。図８より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレート及びＩＩＩＣプレートで成熟させたＤＣは、ＮＴプレートで成熟させたＤＣより、その培養上清中にＩＬ−１２が多く存在した。

以上の実施例から、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地を用いても、ＦＮフラグメントはＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣからのＩＬ−１２産生を促進することが明らかとなった。

実施例１７ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−９
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
細胞培養用２４ウェルプレートとＡＩＭ−Ｖ（ライフテクノロジーズ社製）培地（以下、ＡＭ培地と記載）を使用し、細胞濃度を１．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした点以外、実施例１−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
固定化するプレートとして細胞培養用９６ウェル平面プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）を使用した点以外、実施例１−（３）と同様の方法で行った。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例１７−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＡＭ培地に２．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．１２５ｍＬを実施例１７−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例１８ 樹状細胞の培養上清中サイトカインの定量解析−５
実施例１７−（４）で得られた培養上清を試料とし、Ｈｕｍａｎ ＩＬ−１２（ｐ７０） ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｓｉｍｐｌｅｘ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、フローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにて、ＤＣから産生される培養上清中のＩＬ−１２量を測定した。解析はＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｐｒｏを用いた。

その結果を図９に示す。図９の縦軸はＩＬ−１２量を示す。図９より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートやＦＮプレートで成熟させたＤＣより、その培養上清中にＩＬ−１２が多く存在した。

以上の実施例から、ＡＩＭ−Ｖ培地を用いても、ＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣからのＩＬ−１２産生を促進することが明らかとなった。

実施例１９ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−１０
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
培地にＣｅｌｌＧｒｏＤＣ（セルジェニックス社製）培地（以下、ＣＧ培地と記載）を使用した点以外、実施例７−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
固定化するプレートとして細胞培養用９６ウェル平面プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）を使用し、ＣＨ−２９６溶液を０．０７ｍＬ添加した点以外、実施例１１−（３）と同様の方法で行った。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例１９−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子としてＯＫ−４３２を最終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬ含むＣＧ培地に２．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．１２５ｍＬを実施例１９−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例２０ 樹状細胞の培養上清中サイトカインの定量解析−６
実施例１９−（４）で得られた培養上清を試料とし、実施例１２と同様の方法でサイトカインを測定した。

その結果を図１０に示す。図１０の縦軸はＩＬ−１２量を示す。図１０より、ＯＫ−４３２存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートで成熟させたＤＣより、その培養上清中にＩＬ−１２が多く存在した。

以上の実施例から、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地を用いても、ＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＯＫ−４３２存在下にＤＣからのＩＬ−１２産生を促進することが明らかとなった。

実施例２１ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−１１
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
細胞濃度を２．１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした点以外、実施例９−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
実施例１−（３）と同様の方法で行った。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
実施例２１−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、ＤＣ成熟化因子として、ＴＮＦ―α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６をそれぞれ最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとＰＧＥ２を最終濃度２μｇ／ｍＬとなるように、ＭＣを含むＨＳ培地に８．９×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。この細胞懸濁液０．１５ｍＬを実施例２１−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例２２ 樹状細胞の表面抗原発現解析−５
実施例２１−（４）で得られた培養細胞の表面マーカーを、実施例２と同様の方法で測定した。

蛍光色素標識抗体は、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８０抗体を使用した。

その結果を図１１に示す。図１１の縦軸は平均蛍光強度を示す。図１１より、ＭＣ存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートやＦＮプレートで成熟させたＤＣより成熟化マーカーであるＣＤ８０の細胞表面発現量が上昇した。

以上の実施例から、ＦＮフラグメントは、ＤＣ成熟化因子であるＭＣ存在下でもＤＣ成熟化マーカーの発現を促進することが明らかとなった。

実施例２３ ＦＮフラグメントを用いた樹状細胞の製造−１２
（１）単球の調製
実施例１−（１）と同様の方法で行った。

（２）樹状細胞への分化
培地にＸＶ培地、ＡＭ培地又はＣＧ培地を使用した点以外、実施例１７−（２）と同様の方法で行った。

（３）固定化プレートの調製
実施例１７−（３）と同様の方法で行った。

（４）固定化プレートでの樹状細胞の成熟化
ＤＣ成熟化因子として、ＴＮＦ―α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６をそれぞれ最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとＰＧＥ２を最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように、ＭＣを含むＸＶ培地、ＡＭ培地又はＣＧ培地を調製した。実施例２１−（２）で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を５００×ｇ、８分間の遠心で回収し、それぞれの培地に２．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３．４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３．９×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、０．１２５ｍＬを実施例２１−（３）で調製した各プレートにて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２日間培養した。

実施例２４ 樹状細胞の表面抗原発現解析−６
実施例２３−（４）で得られた培養細胞の表面マーカーを、実施例２と同様の方法で測定した。

蛍光色素標識抗体は、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８０抗体を使用した。

その結果を図１２、１３、１４に示す。各図の縦軸は平均蛍光強度を示す。図１２（ＡＭ培地を用いた場合）、図１３（ＣＧ培地を用いた場合）、図１４（ＸＶ培地を用いた場合）いずれにおいても、ＭＣ存在下にＲＮプレートで成熟させたＤＣはＮＴプレートやＦＮプレートで成熟させたＤＣより成熟化マーカーであるＣＤ８０の細胞表面発現量が上昇した。

以上の実施例から、無血清培地（ＸＶ培地、ＡＭ培地又はＣＧ培地）をＤＣ成熟化因子であるＭＣと組み合わせた場合でも、ＦＮフラグメントはＤＣ成熟化マーカーの発現を促進することが明らかとなった。

本発明により、成熟したＤＣを含む細胞集団の製造方法が提供される。当該方法により、活性の高いＤＣを含有する細胞集団が得られる。本発明の細胞集団は、免疫応答の誘導において優れており、ＤＣワクチン療法、養子免疫療法をはじめとする医療分野において極めて有用である。

Claims (6)

1. 未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を、樹状細胞成熟化因子及びフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、成熟した樹状細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、該フィブロネクチンフラグメントが、ＣＨ−２９６及びＩＩＩ _１ −Ｃから選択される組換えポリペプチドである、方法。
2. 樹状細胞成熟化因子が、下記１）〜３）からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
   １）菌体製剤、
   ２）ＣＤ４０アゴニスト、及び
   ３）腫瘍壊死因子−α及びインターロイキン−１βを含む樹状細胞成熟化カクテル。
3. 菌体製剤が、ＯＫ−４３２である、請求項２記載の方法。
4. 単球を含有する細胞集団より未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程が、単球を含有する細胞集団をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養する工程である、請求項４記載の方法。
6. 無血清培地を使用して培養を実施する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。

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