JP6289517B2 - 体液試料中の脂質および他の干渉物質（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を決定するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、体液中の脂質または他の干渉物質、特に血清および血漿試料中のビリルビンおよびヘモグロビンなどの干渉物質の濃度を決定するための方法および自動分析器に関する。

体液試料での生理学的パラメータを決定するためのいくつかの検出および分析方法は、測光原理（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に基づく。測光法は、液体試料中での検体の定量および定性検出を可能にする。

多くの場合、例えば、検体の濃度または活性を含む臨床的に重要なパラメータが、患者からの体液のアリコートを生体外で１つまたはそれ以上のアッセイ試薬と混合し、生化学的反応を開始させることによって決定され、この反応は、アッセイ用製造物（ａｓｓａｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の光学特性の測定可能な変化をもたらす。測光は、吸光度および／または散乱媒体を通過するときの光束の減衰を検査および利用する。濁った液体アッセイ用製造物の測定を可能にする様々な測光法が、誘発される生化学的または生物理学的（ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ）反応の性質に応じて使用される。

このために、濁度計測（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ）方法を使用することが可能であり、この方法では、溶液または懸濁物の濁度または光学密度が、懸濁物を直接通過する光ビームの光減衰または吸光度に基づいて測定される。

光ビームの強度は、液体試料を含む測定セルまたはキュベットを通過するときに減少する。損失は、例えば吸光、回折、散乱、および／または反射効果によって、測定セル内に位置される試料との光ビームの相互作用によって影響を及ぼされることがある。一般に、回折、散乱、および反射効果は無視、または基準測定によって補償することが可能であり、それにより、主として吸光が光ビームの減衰に寄与する。

したがって、濃度の測光決定は、入射光の特定の波長で、吸光度または吸光が、溶解された物質の濃度および測定セルの層の厚さに依存するという法則に基づく。この関係は、ランベルト−ベール（Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）の法則によって次のように表される：
Ｅ（λ）＝−ｌｏｇ（Ｉ／Ｉ_０）＝ε（λ）・ｃ・ｄ
ここで、Ｅ（λ）は、光ビームの波長λに依存する吸光度であり、Ｉは、試料を通過した後の光強度であり、Ｉ_０は、試料の通過する前の光強度であり、ε（λ）は、照射（ｔｒａｎｓｉｒｒａｄｉａｔｅ）された物質の波長依存モル吸光係数（ｍｏｌａｒ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）であり、ｃは、照射された物質のモル濃度であり、ｄは、例えば測定セルの光ビームで照射された層の厚さである。

試料の吸光度Ｅ（λ）に基づいて、溶液中の物質の濃度を把握（ａｓｃｅｒｔａｉｎ）することが可能である。このために、既知の濃度の少なくとも１つの標準溶液の吸光度が予め決定されている必要がある。吸光度が濃度に比例するので、既知の濃度の複数の標準溶液の吸光度測定による較正によって、未知の試料中の溶解された物質の濃度を把握することが可能である。

しかし、試料の吸光度は、決定すべき物質自体の濃度のみならず、試料マトリックスの性質にも依存する。物質が互いに相互作用しない場合、混合物中で様々な物質の吸光度は加法的である。例えば血漿または血清を含む体液は、複雑な混合物であり、決定すべき検体のみならず、試料の合計の吸光に影響を及ぼす複数のさらなる物質も含む。

しかし、個々の場合に、体液試料は、異常に高い濃度の１つまたはそれ以上の内在性の（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）物質、すなわち内生物質（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を含むことがあり、これは、許容可能な濃度を超えるときに測光検出方法に干渉することが分かっており、系統誤差に関する影響を及ぼすことがある。

異常に高いヘモグロビン、ビリルビン、および／または脂質濃度を有する溶血性、黄疸性、および／または脂肪性血清（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｉｃｔｅｒｉｃ ａｎｄ／ｏｒ ｌｉｐｅｍｉｃ ｓｅｒｕｍ）、または血漿試料によって問題が引き起こされることが知られている。これらの干渉物質の異常に高い濃度は、患者の病的状態、または試料の不適切な取得もしくは保管によって引き起こされることがある。そのような試料に対して、分析的・診断的に重要なパラメータを決定するために使用される測光法が行われる場合、不適切な決定のリスクがあり、その結果、場合によっては誤診が生じ、最悪の場合には患者の不適切な治療が行われるおそれがある。したがって、溶血性、黄疸性、および脂肪性試料の分析前の同定は、不良の分析結果を避けるために特に重要である。

したがって、体液試料中の干渉物質の分光測定効果（ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を把握するための、または高い濃度の１つまたはそれ以上の干渉物質を含む体液試料を同定するための方法が必要である。

特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４は、血漿または血清試料中のビリルビン、ヘモグロビン、および脂質を決定するための様々な方法を表す。例えば、特許文献１では、ヘモグロビンおよびビリルビンによる吸光度を差し引いた後に残った、特に脂質によって引き起こされた吸光度を含む吸光度は、局所線形近似を受ける。

しかし、上記の方法でさえ、特に比較的高い脂質濃度が、同じ試料中のビリルビンおよびヘモグロビンの決定に影響を及ぼし、したがって測定値を歪めるという欠点を有する。

特許文献５が、１つの試料中で、高い脂質濃度の存在下でさえ、ビリルビンおよびヘモグロビンの正確な決定およびまた脂質濃度の決定を可能にする方法を既に述べている。特許文献５に表される方法は、基本的に、様々な波長で試料の吸光度を測定すること、脂質の吸光度に関する冪関数近似曲線（ｐｏｗｅｒ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を計算すること、脂質曲線が残るまで、吸光度のうちヘモグロビンおよびビリルビンが占める割合を差し引くこと、および最後に、−脂質含有量を決定するために−そのようにして理論的に把握された脂質吸光度値を脂質固有の吸光係数で割ることを含む。

既知の方法では、全試料のうちわずか約２０％でしか脂質含有量を正確に決定することが可能でないことが観察されている。残りの試料の場合には、決定される脂質含有量が、真の脂質含有量から±２５％よりも大きく外れる。

欧州特許出願公開第１０５９５２２号 米国特許第４，２６３，５１２号 米国特許出願公開第２００９／０００９７５０ Ａ１号 米国特許出願公開第２０１０／０１７４４９１ Ａ１号 国際公開第２０１３／０１０９７０ Ａ１号

したがって、本発明の目的は、特許文献５による方法を、体液試料中の脂質濃度のより正確な決定を可能にするように修正することである。

この目的は、とりわけ、本発明に従って、脂質固有の波長で理論上把握された脂質吸光度値を脂質固有の吸光係数で割るのではなく、２つの異なる波長での脂質の吸光度に関する近似曲線の２つの値の差が生成され、脂質固有の吸光係数で割ることによって実現される。

この手法は、体液試料中の脂質濃度のかなり正確な決定を可能にする。いずれにせよ、本発明による方法を使用して決定される脂質含有量は、真の脂質含有量から±２０％を超えて外れてはいないことが実現される。したがって、本発明による方法は、化学的分析の精度と同等の脂質決定（ｌｉｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）の精度を実現するが、さらに、本発明による方法では任意の試薬を試料と混合する必要がないという追加の利点を伴う。

したがって、本発明は、体液試料中の脂質の濃度を決定するための方法であって：
ａ）複数の波長での光で体液試料を照射する工程と；
ｂ）脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第１の波長で第１の測定値（Ａ１）を捕捉する工程と；
ｃ）ビリルビンが吸光度最大値を有する第２の波長で第２の測定値（Ａ２）を捕捉する工程と；
ｄ）ヘモグロビンが吸光度最大値を有する第３の波長で第３の測定値（Ａ３）を捕捉する工程と；
ｅ）ビリルビン、およびヘモグロビン、および脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第４の波長で第４の測定値（Ａ４）を捕捉する工程と；
ｆ）所定の指数ｑ_０での係数ｐ_０を決定することによって、第１の測定値（Ａ１）に基づいて脂質の吸光度に関する形式

の冪関数近似曲線（Ｌ_０）を計算する工程と；
ｇ）第２の測定値（Ａ２）と第２の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値との差に対応して、ビリルビンに関する第１の理論上の吸光度値（Ｅ_Ｂ）に基づいてビリルビン濃度（ｃ_Ｂ）の近似値を決定する工程と；
ｈ）第３の測定値（Ａ３）と第３の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値との差に対応して、ヘモグロビンに関する第２の理論上の吸光度値（Ｅ_Ｈ）に基づいてヘモグロビン濃度（ｃ_Ｈ）の近似値を決定する工程と；
ｉ）第４の波長でのヘモグロビン（Ｅ_Ｈ）およびビリルビン（Ｅ_Ｂ）に関する理論上の吸光度値と近似曲線（Ｌ_０）の値との和に基づいて、第４の波長に関する第３の理論上の吸光度値（Ｅ_ＨＢＬ）を決定する工程と；
ｊ）第４の測定値（Ａ４）からの第３の理論上の吸光度値の偏差（Ｅ_ＨＢＬ）を把握する工程と
を含み、
Ｉ．− 工程ｊ）で把握された偏差が所定の閾値を超えない場合 − 脂質の濃度（ｃ_Ｌ）は、第４の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値と、第１の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値との差を生成し、この差を脂質固有の吸光係数で割ることによって決定される、または
ＩＩ．− 工程ｊ）で把握された偏差が所定の閾値を超える場合 − 脂質の吸光度に関する補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）が計算され、工程ｇ）〜ｊ）は、偏差が所定の閾値に達するまで、または閾値未満になるまで、補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値で繰り返され、脂質の濃度（ｃ_Ｌ）は、
ｉ．− 第１の測定値（Ａ１）が、第１の波長での吸光度に関する所定の吸光度閾値を超えない場合 − 第４の波長での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値と、第１の波長での近似曲線（Ｌ_ｋ）の値との差を生成し、この差を脂質固有の吸光係数で割ること、または
ｉｉ．− 第１の測定値（Ａ１）が、第１の波長での吸光度に関する所定の吸光度閾値を超える場合、かつ補正された近似曲線の指数ｑ_ｋが、−１よりも大きい場合 − 第１の測定値（Ａ１）を第１の波長での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値に関係付ける等化関数（ｅｑｕａｌｉｚｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）によって第１の波長での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値を補正し、次いで、等化関数の適用によって補正された後に、第４の波長で補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値と第１の波長での値との差を生成し、この差を脂質固有の吸光係数で割ること
によって決定される
方法を提供する。

本発明による方法の一実施形態では、脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第１の波長は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの間、好ましくは６４５ｎｍである。

本発明による方法のさらなる実施形態では、ビリルビンが吸光度最大値を有する第２の波長は、４４０ｎｍ〜４８０ｎｍの間、好ましくは４７０ｎｍである。

本発明による方法のさらなる実施形態では、ヘモグロビンが吸光度最大値を有する第３の波長は、４００ｎｍ〜４４０ｎｍの間、好ましくは４１５ｎｍである。

本発明による方法のさらなる実施形態では、ビリルビン、およびヘモグロビン、および脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第４の波長は、３５０ｎｍ〜３７０ｎｍの間、好ましくは３６５ｎｍである。

本発明による方法の好ましい実施形態では、化学的分析によって把握された既知の脂質含有量の天然体液試料（Ｌ_１、Ｌ_２、…、Ｌ_ｎ）中の天然脂質を決定するために本発明による方法を使用することによって、脂質固有の吸光係数（εＬ）を予め把握した。人工脂質（例えばＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ）を含有するエマルジョンが使用される従来技術で開示されている吸光係数（ε_{Ｌｉｐｉｄ}）の把握に関して、この利点は、後の脂質決定が高い精度を有することである。

本発明の文脈での「測定値」（Ａ１；Ａ２；Ａ３など）は、測光デバイスを使用して記録することができる吸光度測定値である。測定値は、可視、赤外、および／または紫外波長範囲での光ビームの通過に関する体液試料の不透明度の波長依存尺度を示す無次元の変数でよい。また、強度測定値を捕捉するために光ビームの通過中に体液試料が中に維持される測定セルまたはキュベットの単位厚さに関して吸光度測定値が特定されることも同様に可能である。この場合、測定値は、［１／ｍｍ］の次元を有することがある。いずれにせよ、以下の実施形態での示される測定値は、例示的な性質のものにすぎず、測定デバイス、試料特性、および試料組成に依存する。本明細書では以後、各場合に、吸光度測定値は吸光値と等しいものとする。この考慮点に関し、回折、散乱、および反射も吸光度値に寄与するが、それらは、考察される波長範囲内での吸光に比べて実質的に無視できることが当業者には明らかであろう。

本発明の文脈での「理論上の吸光度値」（Ｅ_Ｈ、Ｅ_Ｂ、Ｅ_ＨＢＬなど）は、実際に測定された吸光度値ではなく、計算された値である。

本出願の文脈での「脂質」は、特に、ヒトまたは動物生物体（ａｎｉｍａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）で生じる脂肪またはトリグリセリドもしくはトリアシルグリセロールを含む。

本発明による方法の好ましい実施形態では、ヘモグロビンの濃度（ｃ_Ｈ）および／またはビリルビンの濃度（ｃ_Ｂ）がさらに決定される。

これはケースＩ．）で行われ、すなわち、工程ｊ）で把握された第４の測定値（Ａ４）からの第３の理論上の吸光度値（Ｅ_ＨＢＬ）の偏差が所定の閾値を超えない場合、工程ｇ）およびｈ）で近似曲線（Ｌ_０）に基づいて決定されたヘモグロビン濃度およびビリルビン濃度（ｃ_Ｈ、ｃ_Ｂ）に関する近似値を実際のヘモグロビンおよびビリルビンの濃度として出力することによって行われる。

ケースＩＩ．）、すなわち、工程ｊ）で把握された第４の測定値（Ａ４）からの第３の理論上の吸光度値（Ｅ_ＨＢＬ）の偏差が所定の閾値を超える場合には、これは、工程ｇ）およびｈ）で補正された近似曲線（Ｌ_０）に基づいて決定されたヘモグロビン濃度およびビリルビン濃度（ｃ_Ｈ、ｃ_Ｂ）に関する近似値を実際のヘモグロビンおよびビリルビンの濃度として出力することによって行われる。

有利な実施形態では、第４の測定値（Ａ４）からの第３の吸光度値（Ｅ_ＨＢＬ）の偏差に関する所定の閾値は１０ｍＡＵである。

さらなる有利な実施形態では、第１の波長での吸光度に関する所定の吸光度閾値は９５０ｍＡＵである。

有利には、複数の波長での光を用いた体液試料の照射は、レーザもしくは発光ダイオードを使用して、または様々な光フィルタを有する光源を使用して実現され、複数の測定値（Ａ１；Ａ２；Ａ３；Ａ４）の捕捉は、光検出器を使用して、例えばＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサ、光センサ、または波長に依存して光ビームの強度を捕捉するのに適した同様のデバイスを使用して実現される。

本発明の文脈での「体液試料」は、液体粘稠性を有し、複数の生物学的に活性の物質を様々な濃度で含む生物起源の全ての試料でよい。例えば、体液試料は、血清、血漿、血液、尿、リンパ液、胆汁、または同様の流体を含むことができる。

本発明は、さらに、本発明による方法の方法工程ａ）〜ｅ）を実施するように設計された測定デバイスを含む自動分析器であって、さらに、請求項１に記載の脂質の濃度（ｃ_Ｌ）を決定するための残りの方法工程を実施するように設計された計算デバイス、例えばプロセッサを含む自動分析器を提供する。

一実施形態では、自動分析器の測定デバイスは、異なる波長の光を発生するための少なくとも１つの光源および複数の光フィルタを含む。別の実施形態では、測定デバイスは、複数の光源、好ましくは複数の発光またはレーザダイオードを含む。

好ましい実施形態では、自動分析器の測定デバイスは、少なくとも４つの光源を含み、第１の光源は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出し、第２の光源は、４４０ｎｍ〜４８０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出し、第３の光源は、４００ｎｍ〜４４０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出し、第４の光源は、３５０ｎｍ〜３７０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出する。

特に好ましい実施形態では、自動分析器の測定デバイスは、少なくとも４つの光源を含み、第１の光源は、６４５ｎｍの波長の光を放出し、第２の光源は、４７０ｎｍの波長の光を放出し、第３の光源は、４１５ｎｍの波長の光を放出し、第４の光源は、３６５ｎｍの波長の光を放出する。

有利には、測定デバイスはまた、少なくとも１つの光検出器、例えばＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサ、光センサ、または、波長依存で光ビームの強度を捕捉するのに適した同様のデバイスも含む。

以下、本発明の様々な例示的実施形態および設計を、添付図面を参照してより詳細に述べる。

血漿試料の吸光度曲線を含むグラフの概略図を示す。 図１と同様に、血漿試料の吸光度曲線を含むグラフの概略図である。 複数のヒト血漿試料に関して、化学的分析によって把握された真の脂質含有量（Ｘ軸）と、本発明による方法を使用して把握された脂質含有量（Ｙ軸）との比較の概略図に関するグラフを示す。 様々なビリルビン濃度（Ｘ軸）を有する血漿試料における、化学的分析による（菱形）、特許文献５からの従来技術による方法による（三角形）、および本発明による方法による（正方形）脂質決定（Ｙ軸）の比較の概略図に関するグラフを示す。 高い脂質濃度（Ｘ軸）を有する１１個の血漿試料における、化学的分析による（菱形）、等価関数を用いない本発明による（正方形）、および等価関数を用いた本発明による方法による（三角形）脂質決定（Ｙ軸）の比較の概略図に関するグラフを示す。

図１は、血漿試料の吸光度曲線を含むグラフの概略図を示す。測定値Ａ１＝Ａ_６４５、Ａ２＝Ａ_４７０、Ａ３＝Ａ_４１５、およびＡ４＝Ａ_３６５を有する吸光度曲線（実線）は、ある濃度のヘモグロビン、ビリルビン、および脂質を含むヒト血漿の波長依存吸光度に関する例示的な概略プロファイルを反映し、ヘモグロビン、ビリルビン、および脂質のそれぞれの吸光度は、加法的に重なる。脂質の吸光度に関する近似曲線Ｌ_０（点線）は、第１の測定値Ａ１＝Ａ_６４５と冪関数

とに基づいて計算される。近似曲線Ｌ_ｋ（破線）が計算され、脂質濃度と、ヘモグロビンおよびビリルビン濃度とを計算するために最終的に使用される。測定された血漿試料の吸光度値は比較的低く、その結果、近似曲線Ｌ_０は、最終的な近似曲線Ｌ_ｋに達するまで、反復的に吸光度スペクトル（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を下から近似する。

図２は、図１と同様に、血漿試料の吸光度曲線を含むグラフの概略図である。図１からの試料と比較すると、この場合の測定される吸光度値は比較的高く、その結果、近似曲線Ｌ_０は、最終的な近似曲線Ｌ_ｋに達するまで、反復的に吸光度スペクトルを上から近似する。

図３は、複数のヒト血漿試料に関して、化学的分析によって把握された真の脂質含有量（Ｘ軸）と、本発明による方法を使用して把握された脂質含有量（Ｙ軸）との比較の概略図に関するグラフを示す。いずれにせよ、本発明に従って決定された脂質含有量は、真の脂質含有量から±２０％よりも大きく外れてはいないことが明らかである。

図４は、様々なビリルビン濃度（Ｘ軸）を有する血漿試料における、化学的分析による（菱形）、特許文献５からの従来技術による方法による（三角形）、および本発明による方法による（正方形）脂質決定（Ｙ軸）の比較の概略図に関するグラフを示す。本発明に従って決定された脂質含有量が、化学的に決定された脂質含有量と実質的に一致することが明らかである。

図５は、高い脂質濃度（Ｘ軸）を有する１１個の血漿試料における、化学的分析による（菱形）、等価関数を用いない本発明による（正方形）、および等価関数を用いた本発明による方法による（三角形）脂質決定（Ｙ軸）の比較の概略図に関するグラフを示す。等化関数を用いた本発明による決定が、化学的分析と良い一致を示すことが明らかである。

ａ）波長
本発明による方法を、４つのレーザダイオードを有する測光構成を含む自動分析器で実施した。ヒト血漿試料を、以下の波長の光で照射した：
６４５ｎｍ 脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第１の波長；
４７０ｎｍ ビリルビンが吸光度最大値を有する第２の波長；
４１５ｎｍ ヘモグロビンが吸光度最大値を有する第３の波長；
３６５ｎｍ ビリルビン、ヘモグロビン、および脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第４の波長。

上述した４つの測定値（Ａ１＝Ａ_６４５、Ａ２＝Ａ_４７０、Ａ３＝Ａ_４１５、およびＡ４＝Ａ_３６５）を記録した。

ｂ）脂質固有の吸光係数
化学的分析によって把握された既知の脂質含有量の７０個の試料（Ｌ_１、Ｌ_２、…、Ｌ_ｎ）に関して上述した波長を使用して吸光度スペクトルを測定し、所定の指数ｑ_０＝−２．４６を使用して脂質の吸光度に関する形式

の冪関数近似曲線（Ｌ_０）を計算し、第４の波長（Ｅ_３６５）での近似曲線（Ｌ_０）の値および第１の波長（Ｅ_６４５）での近似曲線（Ｌ_０）の値を生成することによって、脂質固有の吸光係数ε_{Ｌｉｐｉｄ}を把握した。補正された近似曲線Ｌ_ｋ（以下のｃ）項を参照されたい）に基づいて、様々な吸光度値を計算した。

値Ｅ_３６５とＥ_６４５の差を脂質濃度で割った値が、脂質固有の吸光係数を生成する。全ての測定値にわたって平均と中央値を生成した：

結果は、脂質固有の吸光係数ε_{Ｌｉｐｉｄ}＝０．００１０ｄＬ／ｍｇである。

ｃ）脂質の吸光度に関する冪関数近似曲線の確立、ならびに脂質とヘモグロビンおよびビリルビンとの濃度の計算
所定の指数ｑ_０での係数ｐ_０を決定することによって、第１の測定値（Ａ１＝Ａ_６４５）に基づいて脂質の吸光度に関する形式

の冪関数近似曲線（Ｌ_０）を計算する。

測定値Ａ_６４５のみでは、２つの変数ｐおよびｑを決定するためにまだ使用することができないことは自明である。したがって、指数ｑ_０は、基準値に基づく推定に基づいて生成することができる。したがって、指数ｑ_０は、経験値に基づいて予め定めることができる。ここで述べる決定の場合、指数ｑ_０＝−２．４６は、予め定められていた。６４５ｎｍの第１の波長では、脂質以外の物質による吸光度は無視することができるので、所与の指数ｑ_０で、第１の波長での測定値Ａ_６４５によって係数ｐ_０を決定することが可能である。パラメータｐ_０およびｑ_０を有するそのようにして把握された近似曲線は、試料中の脂質の吸光度の吸光度プロファイルに関する一次近似を反映することができる。これに関し、さらなる測定値が捕捉されている全ての波長の場合に、吸光度のうち脂質が占める特定の割合を計算することが可能である。

この結果が、一次近似曲線Ｌ_０であり、これは、実際の脂質吸光度の良い近似を既に提供する。しかし、特に青色または紫外スペクトル範囲内での近似曲線Ｌ_０は、脂質に関する実際の吸光度プロファイルよりも横ばいであることがある。

次いで、波長４７０ｎｍおよび４１５ｎｍでの測定値Ａ２＝Ａ_４７０およびＡ３＝Ａ_４１５に基づいて、ビリルビン（ｃ_Ｂ）およびヘモグロビン（ｃ_Ｈ）の濃度に関する一次近似値を決定する：

ここで、ε_Ｈ４７０、ε_Ｈ４１５、ε_Ｂ４７０、およびε_Ｂ４１５は、測定値Ａ_４７０およびＡ_４１５の波長での、ビリルビン（Ｂ）およびヘモグロビン（Ｈ）のそれぞれの吸光
係数である。これに関し、吸光係数は、基準測定によって予め決定することができ、または、基準値が記憶されている記憶デバイスから計算を検索することができる。

２つの濃度ｃ_Ｂおよびｃ_Ｈは、２つの前述の式の線形方程式（ｌｉｎｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を解くことによって把握することができ、ヘモグロビン（Ｈ）の濃度に関する式

を生成する。ここで、近似曲線Ｌ_０を使用して、脂質に関する吸光度値Ｅ_Ｌ４７０およびＥ_Ｌ４１５を決定することが可能である。したがって、結果は、ヘモグロビンの濃度ｃ_Ｈに関する一次近似値である。次いで、濃度ｃ_Ｈに関する一次近似値を、ビリルビンの濃度ｃ_Ｂに関する一次近似値を決定するために使用することができる。これは、ヘモグロビン、ビリルビン、および脂質の濃度に関する良好な一次近似値ｃ_Ｈ、ｃ_Ｂ、およびｃ_Ｌを既に生成しており、これらの値は、パラメータｐ_０およびｑ_０に関する冪関数および一次近似値を用いた上述した線形方程式に基づいて把握された。

しかし、ここで、近似値は、以下に述べるように、さらに反復的に改良することができる。このために、第４の波長に関する理論上の吸光度値（Ｅ_ＨＢＬ）が、第４の波長（３６５ｎｍ）での、すなわち近似曲線からの実際の脂質吸光度の比較的大きい偏差が予想される範囲内でのヘモグロビン（Ｅ_Ｈ）およびビリルビン（Ｅ_Ｂ）に関する理論上の吸光度値と、近似曲線（Ｌ_０）の値との和に基づいて決定される：
Ｅ_ＨＢＬ＝ｃ_Ｈ・ε_Ｈ３６５＋ｃ_Ｂ・ε_Ｂ３６５＋Ｅ_Ｌ３６５

濃度ｃ_Ｈおよびｃ_Ｂは上で決定した。値Ｅ_Ｌ３６５（Ｅ_Ｌ４）は、パラメータｐ_０およびｑ_０を有する冪関数によって再び生成された。

次いで、値Ｅ_ＨＢＬとこの波長での実際の測定値Ａ４＝Ａ_３６５との比較を行って、偏差（ＤｅｌｔａＥ）
ΔＥ＝Ａ_３６５−Ｅ_ＨＢＬ
を得る。偏差ΔＥ（ＤｅｌｔａＥ）が所定の閾値、例えば１０ｍＡＵよりも大きい場合、脂質の濃度に関する把握された近似曲線Ｌ_０は、十分に正確には把握されていないと判断することができる。この場合、近似曲線Ｌ_０の補正は、さらなる工程で行うことができる。このために、波長３６５ｎｍでの吸光度のうち脂質が占める割合を表す計算された吸光度値Ｅ_Ｌ３６５（Ｅ_Ｌ４）を、偏差ΔＥのパーセンテージによって補正することができる。例えば、偏差ΔＥの値の半分を、吸光度値Ｅ_Ｌ３６５（Ｅ_Ｌ４）に加えることができる。次いで、補正された吸光度値Ｅ_Ｌ３６５（Ｅ_Ｌ４）に基づいて、パラメータｐ_ｋおよびｑ_ｋを有する補正された近似曲線Ｌ_ｋを決定することが可能である：

ここで、値Ｅ_Ｌ３６５と補正値Ｅ_Ｌ３６５＋ΔＥ／２を冪関数に挿入することによって式が得られる。これは、波長６４５ｎｍでの測定値Ａ１＝Ａ_６４５が補正された近似曲線Ｌ_ｋ上に位置し続けるように、すなわち測定値Ａ_６４５が近似曲線に関するアンカーポイント（ａｎｃｈｏｒ ｐｏｉｎｔ）として使用されるように、近似曲線Ｌ_０を補正することができることを意味する。

次いで、次の工程で、補正された近似曲線Ｌ_ｋに基づいて、吸光度のうち脂質が占める様々な割合を計算する。この方法は、偏差が所定の閾値未満であると判断されるまで繰り返される。次いで、体液試料中のヘモグロビン、ビリルビン、および脂質の濃度に関する補正された近似値が出力される。

上記の方法を使用して、全ての試料中の脂質含有量を、真の脂質含有量（図３参照）から±２０％を超えない偏差を有すると決定した。

ｄ）濁った試料中での脂質含有量の決定
頻繁に凍結および解凍される血漿試料は、高い吸光度をもたらす濁度を示す。

特許文献５から知られている方法とは対照的に、本発明による方法を使用して濁度とは関係なく脂質決定を実施することが可能であることが判明している。

既知の脂質濃度（６６７．７ｍｇ／ｄＬ）の血漿試料（Ｎｏ．２００４６５７３５５）の脂質含有量を、特許文献５からの従来技術による方法と、本発明による方法とを使用して決定した。次いで、試料を凍結し、６カ月後に解凍し、脂質含有量を再び決定した。使用した波長での解凍された試料の吸光度の合計の上昇は、１１５％であった。すなわち、試料は、凍結前よりも解凍後のほうが濁っていた。これらの結果は表１に示される。従来の方法では、解凍後に測定される脂質含有量は凍結前の２倍超であるが、依然として真の脂質含有量から２０％を超えて外れており、一方、本発明による方法では、凍結前に対して解凍後にわずか５％の偏差が測定されることが表から分かる。さらに、脂質濃度の真の値からの偏差は、わずか−４．７％または０．４％であり、すなわち、本発明による方法はまた、原理的により正確である。

ｅ）高いビリルビン濃度の存在下での脂質含有量の決定
様々な量のビリルビンを血漿試料に加え、それにより、９つの視覚的に区別可能な濃度レベルを得た。脂質含有量は、特許文献５からの従来技術による方法を使用して、および本発明による方法を使用して、化学的手段によって決定した。これらの結果が図４に示されている。ここから、様々なビリルビン濃度の存在下で、本発明による脂質決定は、化学的手段による決定と実質的にほぼ同等に働くことが明らかである；最大偏差は、わずか７％（濃度レベル９）である。

ｆ）非常に濁った試料中の脂質含有量の決定
例えば非常に高い脂質含有量（＞５００ｍｇ／ｄＬ）による非常に高い濁度の試料が、高い合計の吸光度を有する。したがって、前述したように、いくつかの試料の場合には、本発明による方法を使用しても十分に正確な脂質決定が可能ではない。その理由は、脂質濃度の増加と共に、試料の吸光度スペクトルが最初は一様に上昇するが、次いで非対称に変化するからである。これは、高い波長で、より低い波長に比べ吸光度の増加が大きいからである。この結果、本発明による方法で使用される第１の波長（６４５ｎｍ）と第４の波長（３６５ｎｍ）の吸光度の差は、十分な精度で脂質含有量を決定するためにこの方法を使用することを可能にするのに十分に大きくはない。最大で−７０％の決定不全が観察された。

しかし、この効果は、等化関数によって補正可能である。等化関数は、第１の波長（Ｅ_６４５）での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値を補正する。等化関数は、既知の脂質濃度のいくつかの試料を使用して把握可能である。予想される吸光度への濃度の逆算によって、真の脂質含有量の計算を可能にする等化関数を決定することが可能である。

濁度が波長６４５ｎｍでの吸光度に大きく依存するので、６４５ｎｍでの濁度の割合を考慮に入れることができる。

計算は、以下のように成される：
ＤｅｌｔａＥ＝Ｅ_Ｌ３６５−（−０．７７９８・Ｅ_Ｌ６４５＋１．４６２６）・Ｅ_Ｌ６４５

この関数を試料の第１の測定値（Ａ１＝Ａ_６４５）に適用し、その後、等化関数の適用によって補正された後に、第４の波長（３６５ｎｍ）での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値と第１の波長（６４５ｎｍ）での値との差（ＤｅｌｔａＥ）を脂質固有の吸光係数で割ることにより、非常に濁った試料でさえ、真の値から±２０％未満の偏差で、十分な精度で脂質濃度を決定することができる。図５は、高い脂質濃度を有する１１個の血漿試料に関する脂質決定の比較を示す。

Claims (16)

1. 体液試料中の脂質の濃度を決定するための方法であって：
   ａ）複数の波長での光で体液試料を照射する工程と；
   ｂ）脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第１の波長で第１の測定値（Ａ１）を捕捉する工程と；
   ｃ）ビリルビンが吸光度最大値を有する第２の波長で第２の測定値（Ａ２）を捕捉する工程と；
   ｄ）ヘモグロビンが吸光度最大値を有する第３の波長で第３の測定値（Ａ３）を捕捉する工程と；
   ｅ）ビリルビン、およびヘモグロビン、および脂質によって引き起こされたものではない吸光度を無視できる第４の波長で第４の測定値（Ａ４）を捕捉する工程と；
   ｆ）所定の指数ｑ_０での係数ｐ_０を決定することによって、第１の測定値（Ａ１）に基づいて脂質の吸光度に関する式
   

   

   の冪関数近似曲線（Ｌ_０）を計算する工程と；
   ｇ）第２の測定値（Ａ２）と第２の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値との差に対応して、ビリルビンに関する第１の理論上の吸光度値（Ｅ_Ｂ）に基づいてビリルビン濃度（ｃ_Ｂ）の近似値を決定する工程と；
   ｈ）第３の測定値（Ａ３）と第３の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値との差に対応して、ヘモグロビンに関する第２の理論上の吸光度値（Ｅ_Ｈ）に基づいてヘモグロビン濃度（ｃ_Ｈ）の近似値を決定する工程と；
   ｉ）第４の波長でのヘモグロビン（Ｅ_Ｈ）およびビリルビン（Ｅ_Ｂ）に関する理論上の吸光度値と近似曲線（Ｌ_０）の値との和に基づいて、第４の波長に関する第３の理論上の吸光度値（Ｅ_ＨＢＬ）を決定する工程と；
   ｊ）第４の測定値（Ａ４）からの第３の理論上の吸光度値の偏差（Ｅ_ＨＢＬ）を把握する工程と
   を含み、ここで、
   Ｉ．− 工程ｊ）で把握された偏差が所定の閾値を超えない場合 − 脂質の濃度（ｃ_Ｌ）は、第４の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値と第１の波長での近似曲線（Ｌ_０）の値との差を生成し、該差を脂質固有の吸光係数で割ることによって決定される、または
   ＩＩ．− 工程ｊ）で把握された偏差が所定の閾値を超える場合 − 脂質の吸光度に関する補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）が計算され、工程ｇ）〜ｊ）は、偏差が所定の閾値に達するまで、または閾値未満になるまで、補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値で繰り返され、脂質の濃度（ｃ_Ｌ）は、
   ｉ．− 第１の測定値（Ａ１）が、第１の波長での吸光度に関する所定の吸光度閾値を超えない場合 − 第４の波長での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値と、第１の波長での近似曲線（Ｌ_ｋ）の値との差を生成し、該差を脂質固有の吸光係数で割ること、または
   ｉｉ．− 第１の測定値（Ａ１）が、第１の波長での吸光度に関する所定の吸光度閾値を超える場合、かつ補正された近似曲線の指数ｑ_ｋが−１よりも大きい場合 − 第１の測定値（Ａ１）を第１の波長での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値に関係付ける等化関数によって第１の波長での補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値を補正し、次いで、等化関数の適用によって補正された後に、第４の波長で補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値と第１の波長での値との差を生成し、該差を脂質固有の吸光係数で割ること
   によって決定される
   前記方法。
2. 第１の波長は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの間の範囲内であり、第２の波長は、４４０ｎｍ〜４８０ｎｍの間の範囲内であり、第３の波長は、４００ｎｍ〜４４０ｎｍの間の範囲内であり、第４の波長は、３５０ｎｍ〜３７０ｎｍの間の範囲内である請求項１に記載の方法。
3. 第１の波長は６４５ｎｍであり、または第２の波長は４７０ｎｍであり、または第３の波長は４１５ｎｍであり、または第４の波長は３６５ｎｍである請求項２に記載の方法。
4. ヘモグロビンの濃度（ｃ_Ｈ）またはビリルビンの濃度（ｃ_Ｂ）がさらに決定される請求項１に記載の方法。
5. 工程ｊ）で把握された偏差が所定の閾値を超えない場合、ヘモグロビンおよびビリルビンの濃度（ｃ_Ｈ、ｃ_Ｂ）は、工程ｇ）およびｈ）で決定されたヘモグロビン濃度およびビリルビン濃度の近似値をヘモグロビンおよびビリルビンの濃度（ｃ_Ｈ、ｃ_Ｂ）として出力することによって決定される請求項４に記載の方法。
6. 工程ｊ）で把握された偏差が所定の閾値を超える場合、ヘモグロビンおよびビリルビンの濃度（ｃ_Ｈ、ｃ_Ｂ）は、補正された近似曲線（Ｌ_ｋ）の値で繰り返される工程ｇ）およびｈ）で決定されたヘモグロビン濃度およびビリルビン濃度の近似値を、偏差が所定の閾値に達した、または所定の閾値未満になったときヘモグロビンおよびビリルビンの濃度（ｃ_Ｈ、ｃ_Ｂ）として出力することによって決定される請求項３に記載の方法。
7. 所定の閾値は、１０ｍＡＵである請求項１に記載の方法。
8. 第１の波長での吸光度に関する所定の吸光度閾値は、９５０ｍＡＵである請求項１に記載の方法。
9. 複数の波長での光を用いた体液試料の照射は、レーザまたは発光ダイオードを使用して、または様々な光フィルタを有する光源を使用して実現され、複数の測定値（Ａ１；Ａ２；Ａ３；Ａ４）の捕捉は、光検出器を使用して実現される請求項１に記載の方法。
10. 体液は血清または血漿である請求項１に記載の方法。
11. 請求項１に記載の方法工程ａ）〜ｅ）を実施するように設計された測定デバイスを含む自動分析器であって、請求項１に記載の脂質の濃度（ｃ_Ｌ）を決定するための残りの方法工程を実施するように設計された計算デバイスをさらに含むことを特徴とする前記自動分析器。
12. 測定デバイスは、少なくとも１つの光源および複数の光フィルタを含む請求項１１に記載の自動分析器。
13. 測定デバイスは、複数の光源、好ましくは複数の発光またはレーザダイオードを含む請求項１１に記載の自動分析器。
14. 測定デバイスは、少なくとも４つの光源を含み、第１の光源は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出し、第２の光源は、４４０ｎｍ〜４８０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出し、第３の光源は、４００ｎｍ〜４４０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出し、第４の光源は、３５０ｎｍ〜３７０ｎｍの間の範囲内の波長の光を放出する請求項１３に記載の自動分析器。
15. 第１の光源は、６４５ｎｍの波長の光を放出し、第２の光源は、４７０ｎｍの波長の光を放出し、第３の光源は、４１５ｎｍの波長の光を放出し、第４の光源は、３６５ｎｍの波長の光を放出する請求項１４に記載の自動分析器。
16. 測定デバイスは、少なくとも１つの光検出器を含む請求項１１に記載の自動分析器。

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