JP6294079B2 - 膵臓幹細胞及び前駆細胞のためのマーカーとしてのｚｓｃａｎ４及びその使用 - Google Patents

Description

本開示は、ヒト膵臓におけるＺＳＣＡＮ４発現幹細胞及び前駆細胞の同定、膵臓幹細胞及び前駆細胞のためのマーカーとしてのＺＳＣＡＮ４の使用、及び糖尿病を治療するためのそのような膵臓幹細胞及び前駆細胞の使用に関する。

ＡＳＣIIテキストファイルとしての配列表の提出
ＡＳＣIIテキストファイルの次の提出の内容物は、その全体を参照により本明細書に組込まれる：配列表（ファイル名称：６９９４４２０００３４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録された日付：２０１２年１月２５日、サイズ：５２ＫＢ）のコンピューター読み取り可能フォーム（ＣＲＦ）。

Ｚｓｃａｎ４遺伝子は、大規模ｃＤＮＡ配列決定プロジェクト（Ko et al. , Development 127: 1737-1749, 2000; Sharov et al., PLoS Biol 1:E74, 2003）及びＤＮＡマイクロアレイ分析（Hamatani et al, Dev Cell 6:117-131, 2004）を用いて、マウス胚のすべての着床前段階の発現プロファイリングにより同定された。マウスにおいては、Ｚｓｃａｎ４は、第７染色体の約８５０ｋｂ領域上にクラスター化される、６種のパラログ遺伝子（Ｐａｒａｌｏｇ ｇｅｎｅｓ）（Ｚｓｃａｎ４ａ−Ｚｓｃａｎ４ｆ）及び３種の擬遺伝子（Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ１−Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ３）から成る。前記６種のパラログの中で、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ及びＺｓｃａｎ４ｆのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）は、ＳＣＡＮドメイン及びすべての４種の亜鉛フィンガードメインをコードしている。これは、転写因子としてのそれらの潜在的な役割を示唆している。Ｚｓｃａｎ４の高い発現ピークは、マウス胚の後期２細胞期を示す。通常、胚盤胞における検出閾値以下のＺｓｃａｎ４発現は、培養中のごく一部のＥＳ細胞においてインビトロで再活性化される。すべての６種のＺｓｃａｎ４パラログはＥＳ細胞において発現されるが、Ｚｓｃａｎ４ａが優勢パラログであり、そしてＺｓｃａｎ４ｄは２細胞胚において優勢パラログである（Falco et al., Dev Biol 307:539-550, 2007; PCT Publication No. WO 2008/118957）。

Ｚｓｃａｎ４は、他の２細胞胚特異的遺伝子が活性化される末分化ＥＳ細胞における固有の遷移過程（transient state）と関連付けられていることは、以前に実証されている。Ｚｓｃａｎ４は、ゲノム完全性の長期維持、及び通常の未分化ＥＳ細胞における調整されたテロメア組換えの仲介のために必須である（Zalzman et al., Nature 464(7290):858-863, 2010）。

Ｉ型糖尿病は、インスリンを生産する膵臓細胞が補充される場合、潜在的に治療され得るので、膵臓は再生医療における集中的研究の焦点となってきた。したがって、成体ヒト膵臓の内分泌及び外分泌細胞を生じることができる前駆細胞の同定が所望される。膵管内の前駆細胞の存在が、すべての膵臓細胞が胚膵臓において膵管のような構造体を形成する前駆細胞から発生する観察に基づいて以前は推測されてきた（Oliver-Krasinski and Staffers, Genes Dev 22:1998-2021, 2008）。しかしながら、末分化前駆細胞が膵管に存在するか、又は分化細胞が他の細胞型に再分化することができるかについては、ほとんど知られていない（Aguayo-Mazzucato and Bonner- Weir, Nat Rev Endocrinol 6:139-148, 2010）。膵臓における存在する幹細胞の同定に対する１つの主なハードルは、この組織型は非常に遅い自発的自己再生速度を有し、したがって、膵臓幹細胞の数は、存在するなら、非常に低いことが予測されることである（Barker and Clevers, Gastroenterology 138:1681-1696, 2010）。存在する幹細胞を識別する別の課題は、特定の組織幹細胞マーカーの欠如であり、これがヒト膵臓組織において希少である細胞型を同定する進展を妨げてきた。

ＺＳＣＡＮ４は、成体ヒト膵臓において、希少である幹／前駆細胞のためのマーカーとして作用するという発見が本明細書に開示される。したがって、サンプル、例えば膵臓組織サンプルから、膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞、又は両者を単離する方法が本明細書中で提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、サンプルの細胞中におけるＺＳＣＡＮ４の発現を検出し、そしてＺＳＣＡＮ４を発現する細胞を単離することを含む。

対象における糖尿病を治療するための方法もまた提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞を単離し、ここで前記膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞の単離が、ＺＳＣＡＮ４を発現する膵臓組織中の細胞を検出することを含み；（ｉｉ）インビトロで、ＺＳＣＡＮ４を発現する、前記単離された膵臓細胞又は前駆細胞を増殖させ；そして（ｉｉｉ）前記増殖された膵臓幹細胞又は前駆細胞を、前記対象中に移植することを含む。特定の例によれば、膵臓幹細胞又は前駆細胞は、治療されるべき対象から単離される。

さらに、対象において膵臓幹細胞又は前駆細胞集団をインビボで増殖させる方法が提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、ＺＳＣＡＮ４タンパク質；ＺＳＣＡＮ４核酸配列；又はＺＳＣＡＮ４の発現又はＺＳＣＡＮ４細胞の数を増大させる剤を、対象の膵臓に送達することを含む。

前述及び他の目的、及び開示の特徴は、添付図面を参照して進行する次の詳細な記載からより明白になるであろう。

図１のＡ〜Ｈは、ヒト膵臓におけるＺＳＣＡＮ４の免疫局在化を示す一連の画像を示す。（Ａ）ランゲルハンス島におけるＺＳＣＡＮ４⁺細胞の存在。強い核染色がこの細胞に観察される。（Ｂ）ＺＳＣＡＮ４⁺細胞は、膵島の周辺領域に位置する。弱い細胞質染色は内分泌細胞で明らかであった。ＺＳＣＡＮ４⁺細胞もまた、腺房（Ｃ）及び膵管（Ｃ）に位置する。楕円形細胞（「膵臓卵形細胞」（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｏｖａｌ ｃｅｌｌｓ））はまた、ＺＳＣＡＮ４に対して陽性である（Ｅ）。抗マウスＺｓｃａｎ４抗体（Ｆ及びＨ）及び抗ヒト（ＺＳＣＡＮ４）抗体（Ｇ及びＨ）は、ヒト膵臓（卵形細胞）において同一細胞を染色した。ｉ、ランゲルハンス島；ａ、腺房；ｄ、膵管。 図２のＡ〜Ｎは、ヒト膵臓におけるＢＭＩ１及びＬＧＲ５の免疫局在化を示す一連の画像を示す。ＢＭＩ１⁺細胞は、ランゲルハンス島（Ａ）、膵管（Ｂ）及び腺房（Ｃ）に位置する。ＬＧＲ５⁺細胞はまた、ランゲルハンス島（Ｄ）、膵管（Ｅ）及び腺房（Ｆ）に位置する。少数の細胞のみがＢＭＩ１又はＬＧＲ５に対して陽性であり、これは図１におけるＺＳＣＡＮ４の染色パターンに類似する。膵臓腺房間の膵臓卵形細胞もまた、ＢＭＩ１及びＬＧＲ５（Ｃ及びＦ）に対して陽性である。細胞の二重免疫蛍光ラベリングを、ランゲルハンス島において実施した（Ｇ〜Ｎ）。ＢＭＩ１及びＬＧＲ５は、膵島において同一の細胞を示す（Ｇ〜Ｊ）。ＺＳＣＡＮ４は、ＬＧＲ５陽性細胞のサブセットのみを示す（Ｋ〜Ｎ）。ｄ、膵管；ａ、腺房；星印のマーク、卵形細胞；ｉ、ランゲルハンス島。 図３のＡ〜Ｈは、膵島におけるインスリン及びＬＧＲ５の免疫局在化を示す一連の画像を示す（Ａ〜Ｄ）。インスリン⁺細胞及びＬＧＲ５⁺細胞は同時局在化されない。外分泌細胞にけるアミラーゼ及びＬＧＲ５の免疫局在化を実施した（Ｅ〜Ｈ）。アミラーゼ⁺細胞及びＬＧＲ⁺細胞は同時局在化されない。 図４のＡ〜Ｎは、ヒト膵臓の一連の画像を示す。（Ａ〜Ｃ）：ヒト膵臓におけるアクアポリン１水路（ＡＱＰ１）の免疫局在化。ＡＱＰ１は、腺房中心細胞（ｃａ）から中位のサイズの小葉間ダクトに位置する細胞において発現される。膵臓星状細胞（黒の矢印）及び卵形細胞（星印マーク）の両者は、ＡＱＰ１に対して陽性である。（Ｄ〜Ｇ）：膵管におけるＺＳＣＡＮ４⁺細胞はＡＱＰ１に対して陽性である。長方形状のＺＳＣＡＮ４⁺細胞は、ＡＧＰ１に対して陰性である（星印マーク）。（Ｈ〜Ｋ）：ＢＭＩ１⁺細胞も、ＡＱＰ１に対して陽性である。ＢＭＩ１⁺細胞は、ＤＩＣ顕微鏡により隣接細胞から明白に区別できる（Ｈ）。（Ｌ−Ｎ）：ＣＤ１６３⁺細胞の局在化。腺房間の膵臓星状細胞（矢印）及び卵形細胞（星印マーク）のほとんどは、ＣＤ１６３に対して陽性である。膵管細胞（Ｍ，２つの黒の矢印間）及び膵管の基底膜（Ｎ）のサブセットはまた、ＣＤ１６３に対して陽性である。 図５のＡ〜Ｆは、慢性アルコール性膵炎及び自己免疫性膵炎を有する患者から採取された組織におけるＺＳＣＡＮ４発現パターンを示す一連の画像を示す。（Ａ）影響されていない個人からの膵臓の代表的ＺＳＣＡＮ４−免疫染色（矢印、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞）。（Ｂ）慢性アルコール性膵炎を有する患者からの膵臓の代表的ＺＳＣＡＮ４−免疫染色。（Ｃ）コルチコステロイド治療の前、自己免疫性膵炎を有する患者からの膵臓の膵管領域の代表的ＺＳＣＡＮ４−免疫染色。ＺＳＣＡＮ４⁺細胞は、慢性炎症上の組織において上昇する（矢印、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞）。（Ｄ）コルチコステロイド治療の前、自己免疫性膵炎を有する患者からの膵臓の腺房領域の代表的ＺＳＣＡＮ４−免疫染色。（Ｅ）コルチコステロイド治療の開始の３ヶ月後、自己免疫性膵炎を有する患者からの膵臓の腺房領域の代表的ＺＳＣＡＮ４−免疫染色。多数のＺＳＣＡＮ４⁺細胞が、膵管、ランゲルハンス島及び再生された腺房において見られる。（Ｆ）維持されたコルチコステロイド治療の１年後、自己免疫性膵炎を有する患者からの膵臓の腺房領域の代表的ＺＳＣＡＮ４−免疫染色。少数のＺＳＣＡＮ４⁺細胞のみがここに見られる。a、腺房；ｄ、膵管；ｉ、ランゲルハンス島。 図６のＡ〜Ｌは、マウス及びヒト膵臓におけるＺＳＣＡＮ４⁺細胞の免疫局在化を示す一連の画像を示す。（Ａ、Ｄ、Ｇ及びＪにおける）抗マウスＺｓｃａｎ４抗体、及び（Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＫにおける）抗ヒトＺＳＣＡＮ４抗体は、ヒト（Ｃ）及びマウス（Ｆ、Ｉ及びＬ）の両者において同一細胞を示す。 図７のＡ〜Ｌは、ヒト膵臓における膵臓内分泌ホルモン及びＬＧＲ５の免疫局在化を示す一連の画像を示す。グルカゴン（Ａ〜Ｄ）、ソマトスタチン（Ｅ〜Ｎ）及びグレリン（Ｉ〜Ｌ）についての染色が示される。 図８のＡ〜Ｌは、ヒト膵臓における内分泌ホルモンの免疫局在化を示す一連の画像を示す。インスリン（Ａ〜Ｃ）、グルカゴン（Ｄ〜Ｆ）、ソマトスタチン（Ｇ〜Ｉ）及びグレリン（Ｊ〜Ｌ）についての染色が示される。内分泌ホルモン陽性細胞は、膵島においてのみならず、また、膵管（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）及び膵臓腺房（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）においても見られない。ａ，腺房；ｄ，膵管。 図９のＡ〜Ｆは、ヒト膵臓におけるインスリン及びアミラーゼの免疫局在化を示す一連の画像を示す。（Ａ〜Ｃ）：内分泌細胞は消化酵素アミラーゼを生成し、そしてランゲルハンス島の内分泌細胞はインスリンを産生する。これらの細胞は、膵臓で互いに排他的である。（Ｄ〜Ｆ）：膵臓腺房における少数の細胞は、インスリン及びアミラーゼに対して二重陽性である（矢印）。 図１０のＡ〜Ｋは、ヒト膵臓における嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）の免疫局在化を示す一連の画像を示す。ＣＦＴＲは、腺房中心細胞（ｃａ）から小葉間膵管の小さな膵管における細胞の先端形質膜において発現される（Ａ）。ＡＱＰ１に比較して、ＣＦＴＲは膵臓星状細胞においては発現されない（矢印）（Ｂ）。しかしながら、膵臓卵形細胞はその形質膜においてＣＦＴＲを発現する（Ｃ）。（Ｄ〜Ｈ）：抗−ＣＦＴＲ及び抗−ＬＧＲ５抗体による細胞の二重染色。ＣＦＴＲ及びＬＧＲ５発現は互い排他的である（Ｇ及びＫ）。ａ、腺房；ｉｃ、介在管；星印は膵臓卵形細胞を示す。 図１１は、Ｚｓｃａｎ４、ＳＳＥＡ３、ＬＧＲ５及びＢＭＩｌの発現を検出するためにマウス膵臓組織の免疫組織化学的染色を示す一連の画像を示す。対照動物及びセルレイン誘発膵炎を有する動物からの組織断片が示される（Ｄ１、セルレイン処理の１日後；Ｄ４、セルレイン処理の４日後）。

配列表
添付配列表に列挙される核酸及びアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基についての標準の文字略語及びアミノ酸についての３文字コードを用いて示される。個々の核酸配列の１つの鎖のみが示されるが、しかしその相補鎖が示される鎖に対して参照により含まれるものとして理解される。添付配列表においては、次の通りである：

配列番号１及び２は、ヒトＺＳＣＡＮ４のヌクレオチド及びアミノ酸配列である。

配列番号３及び４は、マウスＺｓｃａｎ４ａのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。

配列番号５及び６は、マウスＺｓｃａｎ４ｂのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。

配列番号７及び８は、マウスＺｓｃａｎ４ｃのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。

配列番号９及び１０は、マウスＺｓｃａｎ４ｄのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。

配列番号１１及び１２は、マウスＺｓｃａｎ４eのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。

配列番号１３及び１４は、マウスＺｓｃａｎ４ｆのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。

配列番号１５は、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーター−エメラルド発現ベクターのヌクレオチド配列である（９３９６ｂｐ）。Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーター配列の開始ヌクレオチドは９０６であり、そして最終ヌクレオチドは４４６８である。

詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＱＰ１：アクアポリン１（ａｑｕａｐｏｒｉｎ １）
ＢＭＩ１：ポリコーム環フィンガー腫瘍遺伝子（ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）
ＣＦＴＲ：嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）
ＥＳ：胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ）
ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）
ｉＰＳ：誘発多能性幹（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ）
ＬＧＲ５：ロイシンに富んでいる反復体含有Ｇタンパク質−共役型受容体５（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５）
ＳＳＥＡ３：段階−特異的胚抗原３（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−３）

II．用語及び方法
特にことわらない限り、技術用語は、従来の用法に応じて使用される。分子生物学における共通用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Pressにより出版された, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. により出版された, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及び Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. により出版された, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出され得る。

本開示の様々な実施形態の検討を容易とするために、特定用語の以下の説明が提供される：
投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）：化合物又は組成物、例えばＺＳＣＡＮ４、ＺＳＣＡＮ４タンパク質又は核酸を発現する細胞、又はＺＳＣＡＮ４の発現を増大させる剤を、いずれかの効果的経路により、対象に提供するか又は付与することである。投与の典型的な経路としては、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮膚内、腹腔内、静脈内、動脈内又は膵臓内）を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。

成体幹細胞（Ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）：死細胞を補充し、そして損傷組織を再生するために、細胞分裂により増加する胚発生の後、体内に見出される末分化細胞。成体幹細胞は、体性幹細胞としても知られている。

剤（Ａｇｅｎｔ）：任意のタンパク質、核酸分子、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物又は他の対象分子。ある実施形態によれば、「剤」とは、ＺＳＣＡＮ４の発現を増大させる剤である。特定の例によれば、剤はＺＳＣＡＮ４又はレチノイドをコードする核酸分子である。

抗生物質耐性遺伝子（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｅ ｇｅｎｅ）：抗生物質に対する耐性を付与する微生物由来のいずれかの剤。ある実施形態によれば、抗生物質耐性遺伝子は、ピューロマイシンに対する耐性を付与する。

抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）：抗原のエピトープを特異的に認識し、そしてそれと結合する、軽鎖又は重鎖免疫ブロブリン可変領域を少なくとも含むポリペプチドリガンド。抗体は、重鎖及び軽鎖から構成され、それらの個々は、可変重鎖（Ｖ_H）領域及び可変軽鎖（Ｖ_L）領域と呼ばれる可変領域を有する。一緒に、Ｖ_H領域及びＶ_L領域は、抗体により認識される抗原の結合を担当する。

抗体は、損なわれていない免疫グロブリン及び当業界においてよく知られている抗体の変異体及び一部、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’₂断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、融合タンパク質であり、ここで免疫グロブリンの軽鎖可変領域及び免疫グロブリンの重鎖可変領域はリンカーにより結合されているが、ｄｓＦｖにおいては、前記鎖は、鎖の会合を安定化するためのジスルフィド結合を導入するために突然変異誘発されている。その用語はまた、遺伝子組み換え形、例えばキメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及びヘテロ共役抗体（例えば、二重特異的抗体）も含む。また、Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3^rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997も参照のこと。

典型的には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互結合される重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）を有する。２種のタイプの軽鎖、すなわちλ及びκが存在する。抗体分子の機能的活性を決定する次の５種の主要重鎖クラス（又はイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＬｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ。

個々の重鎖及び軽鎖は、不変領域及び可変領域（領域はまた、「ドメイン」（ｄｏｍａｉｎｓ）としても知られている。一緒になって、重鎖及び軽鎖可変領域は抗原を特異的に結合する。軽鎖及び重鎖可変領域は、「相補性決定領域」（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）又は「ＣＤＲs」とも呼ばれる、３種の超可変領域により中断される「フレームワーク」（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を含む。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は定義されている（Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースは現在、オンラインで維持されている。異なった軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域の配列は、種、例えばヒト内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成成分の軽鎖及び重鎖の一緒になったフレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲを配置し、且つ整列させるために役に立つ。

「Ｖ_H」又は「ＶＨ」とは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂの可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域のことである。「Ｖ_L」又は「ＶＬ」とは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂの可変領域を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域のことである。

「モノクローナル抗体」（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、Ｂリンパ球の単一クローンにより、又は単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされている細胞により産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により、例えば免疫脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合体からハイブリッド抗体形成を製造することにより産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」はさらに、抗原結合断片、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂ断片を含む。

「キメラ抗体」（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、１つの種、例えばヒト由来のフレームワーク残基、及び別の種、例えばネズミ抗体由来の（一般的に抗原結合を付与する）ＣＤＲを有する。

「ヒト化」（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（例えば、マウス、ラット又は合成）免疫グロブリン由来の１又は２以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」（ｄｏｎｏｒ）と呼ばれ、そしてフレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」（ａｃｃｅｐｔoｒ）と呼ばれる。一実施形態によれば、すべてのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリンからである。不変領域は存在する必要はないが、しかしそれらが存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン不変領域に対して実質的に同一、すなわち少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％又はそれ以上、同一であるべきである。したがって、おそらくＣＤＲを除く、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に対して実質的に同一である。「ヒト化抗体」（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリン又は抗体のレセプターフレームワークから取られたアミノ酸による限定数の置換を有することができる。ヒト化又は他のモノクローナル抗体は、抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に対する効果を実質的に有さない追加の保存性アミノ酸置換を有することができる。ヒト免疫グロブリンは、遺伝子工学により構成され得る（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。

「ヒト」（ｈｕｍａｎ）抗体（また、「完全ヒト」（ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ）抗体とも呼ばれる）は、ヒトフレームワーク領域、及びヒト免疫グロブリンからのＣＤＲのすべてを含む抗体である。１つの例によれば、そのフレームワーク及びＣＤＲは、同じ起源のヒト重鎖及び／又は軽鎖アミノ酸配列からである。しかしながら、１つのヒト抗体からのフレームワークは、異なったヒト抗体からのＣＤＲを含むよう構築され得る。ヒト免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。

ＢＭＩ１（ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）（ポリコーム環フィンガー腫瘍遺伝子）：既知組織幹細胞マーカー。ＢＭＩ１は成熟マウス造血管細胞の効果的自己再生細胞分裂のために必要である（Raaphorst, Trends Immunol 24:522-524, 2003）。単一のＢＭＩ１発現細胞は、腸上皮内のすべての細胞系統を形成することが示されており（Ootani et al, Nat Med 15:701-706, 2009）、そしてＢＭＩ１−系統トレーシングは、膵臓器官ホメオスタシスが可能な自己再生性膵臓腺房細胞を同定している（Sangiorgi and Capecchi, Proc Natl Acad Sci USA 106:7101-7106, 2009）。

接触（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）：直接的な物理的会合下での配置；固体形態及び液体形態のいずれの場合も含む。

同時発現される（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）：本開示においては、ＺＳＣＡＮ４と「同時発現される」遺伝子は、ＥＳ細胞及び／又は組織幹細胞、例えば膵臓幹細胞又は前駆細胞において、胚発生の間、ＺＳＣＡＮ４と類似する発現パターンを示す遺伝子である。ＺＳＣＡＮ４と同時発現される多くの遺伝子、例えばＡＦ０６７０６３、Ｔｃｓｔｖｌ／３、Ｔｈｏ４、アルギナーゼＩＩ（Arginase II）、ＢＣ０６１２１２ 及びＧｍ４２８、Ｅｉｆ１ａ、ＥＧ６６８７７７ 及び Ｐｉｆ１は、以前に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１１８９５７号を参照のこと）。さらに、ＳＳＥＡ３が膵臓細胞においてＺＳＣＡＮ４と同時発現されることが本明細書に開示されている（実施例３を参照のこと）。本明細書に開示される特定の実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子は、ＳＳＥＡ３又はＴｃｓｔｖ１／３である。

縮重変異体（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｎｔ）：遺伝子コードの結果として縮重する配列を含むポリペプチド、例えばＺＳＣＡＮ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０個の天然アミノ酸が存在し、それらのほとんどは、複数のコドンにより特定される。したがって、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変更されない限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。

検出可能なラベル（Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｌａｂｅｌ）：別の分子、例えば抗体又はタンパク質に対して直接的に又は間接的に複合体化され、前記分子の検出を容易とする、検出可能な化合物又は組成物。検出可能なラベルの特定の非制限的例として、蛍光標識、酵素結合及び放射性同位体を挙げることができる。ポリペプチド及び他の分子をラベリングする種々の方法は、周知であり、そして使用され得る。ポリペプチドに対する検出可能なラベルの例としては、次のものを挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体又は放射性ヌクレオチド（例えば、³⁵Ｓ又は¹³¹Ｉ）、蛍光ラベル（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素ラベル（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、発色団（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、ビオチニルグループ、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）、又は磁気剤、例えばガドリニウムキレート。

糖尿病：制御されていない炭水化物代謝を導くインスリンの相対的又は絶対的不足により引起される疾病。本明細書において使用される場合、「糖尿病」（ｄｉａｂｅｔｅｓ）とは、真性糖尿病のことである。１型糖尿病（時々、「インスリン依存性糖尿病」又は「若年発症性糖尿病」とも呼ばれる）は、インスリンの全体的な又はほぼ全体的な不足を導く膵臓β細胞の破綻により特徴づけられる自己免疫疾患である。２型糖尿病（時々、「非インスリン依存性糖尿病」又は「成人発症型糖尿病」とも呼ばれる）においては、インスリンが存在するが、身体はそのインスリンに応答していない。

糖尿病の症状は次のものを含む：過度の口渇（多飲）；頻尿（多尿症）；極端な飢餓又は一定の食欲（多食）；原因不明の体重減少；尿中にグルコースの存在（糖尿）；疲労感又は倦怠感；視力の変化；四肢（手、足）のしびれやうずき；遅い治癒傷やただれ；及び異常に高い頻度の感染症。糖尿病は、７５ｇの負荷で、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）の後、約２時間で、７．０ｍモル／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上か又はそれに等しい空腹時血糖値（ＦＰＧ）又は１１．１ｍモル／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）以上か又はそれに等しい血漿グルコース濃度により、臨床的には診断され得る。糖尿病についてのより詳細な説明は、Cecil Textbook of Medicine, J.B. Wyngaarden, et al, eds. (W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1992, 19^th ed.)に見出され得る。

分化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）：細胞が特定の種類の細胞（例えば、筋肉細胞、膵臓細胞、皮膚細胞等）へと発達する工程のことである。細胞がより分化されるにつれて、細胞効能、又は複数の異なる細胞型になる能力を失う。

カプセル化される（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）：本明細書において使用される場合、ナノ粒子に「カプセル化された」分子（例えば、核酸又はポリペプチド）又は細胞は、ナノ粒子内に包含されるか、又はナノ粒子の表面へ付着されるか、又はそれらの組合せである、分子又は細胞のことである。

蛍光タンパク質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）：特定波長の光に照射されると蛍光を示す、遺伝的にコードされたタンパク質。ほとんど全ての可視光スペクトルに及ぶ、蛍光発光スペクトルプロフィールを特徴とする、種々の蛍光タンパク質の遺伝的変異体が開発されてきた。それらの例として次のものを挙げることができる：花虫類蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（青色光を照射されると、緑色蛍光を示す）、及びそれらの変異体、例えばＥＧＦＰ、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍｋａｌａｍａｌ（Ｙ６６Ｈ置換を含むｍｋａｌａｍａ１を除く）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｃｙｐｅｔ、ここで、それらはＹ６６Ｗ置換を含む）、及び黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ，Ｖｅｎｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ここで、それらはＴ２０３Ｙ置換を含む）。他の特定の例としては、エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）及びストロベリー（Ｓｔｒａｗｂｅｒｙｙ）を挙げることができる。概要に関しては、Shaner et al, Nat. Methods 2(12):905-909, 2005を参照のこと。

蛍光団（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）：特定波長の光への照射により励起される場合、例えば異なった波長で光（すなわち、蛍光）を発する化合物。

本明細書に開示される方法に使用され得る蛍光団の例としては、次のものを挙げることができる（米国特許第５，８６６，３６６号（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．）に提供される）：４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２、２’−ジスルホン酸、アクリジン及びその誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフチレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５−ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−(４−アニリノ−l−ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ）、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、 ７−アミノ−４−メチルクマリン (ＡＭＣ、 Ｃｏｕｍａｒｉｎ １２０)、７−アミノ−４−トリフルオロメチルコウルアリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）(Ｃｏｕｍａｒｉｎ １５１)；シアノシン（ｃｙａｎｏｓｉｎｅ）; ４’、６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール (ＤＡＰＩ); ５'，５''−ジブロモピロガロール（ｄｉｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）−スルホンフタレイン(ブロモピロガロールレッド); ７−ジエチルアミノ−３−(４'−イソチオシアナートフェニル)−４−メチルクマリン; ジエチレントリアミンペンタアセテート; ４、４'−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２、２'−ジスルホン酸;４、４'−ジイソチオシアナートスチルバン−２、２'−ジスルホン酸; ５−[ジメチルアミノ]ナフタレン−１−スルホニルクロリド(ＤＮＳ、 塩化ダンシル); ４−(４'−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸 (ＤＡＢＣＹＬ); ４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４'−イソチオシアナート (ＤＡＢＩＴＣ);エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート; エリトロシン及び誘導体、例えばエリトロシンＢ及びエリトロシンイソチオシアネート; エチジウム; フルオレセイン及び誘導体、例えば ５−カルボキシフルオレセイン (ＦＡＭ)、 ５−(４、６−ジクロロトリアジン−２−イル)アミノフルオレセイン(ＤＴＡＦ)、 ２’７'−ジメトキシ−４’５'−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン(ＪＯＥ)、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート(ＦＩＴＣ)、 及びＱＦＩＴＣ (ＸＲＩＴＣ); フルオレサミン; ＩＲ１４４; ＩＲ１４４６; マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアナート; ４−メチルウムベリフェロン; オルト クレゾールフタレイン; ニトロチオシン; パラローザニリン; フェノールレッド; Ｂ−フィコエリトリン; Ｒ−フィコエリトリン; o−フタルジアルデヒド; ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート及びスクシンイミジル1 −ピレンブチレート; Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４ (Ｃｉｂａｃｒｏｎ ．ＲＴＭ. Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ−Ａ); ローダミン及び誘導体、例えば6−カルボキシ−X−ローダミン (ＲＯＸ)、 ６−カルボキシローダミン(Ｒ６Ｇ)、 リザミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンBスルホニルクロリド、 ローダミン (Ｒｈｏｄ)、 ローダミン B、ローダミン １２３、 ローダミンＸ イソチオシアナート、 スルホローダミン B、スルホローダミン １０１ 及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体 (Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ); Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン (ＴＡＭＲＡ); テトラメチルローダミン; テトラメチルローダミンイソチオシアナート(ＴＲＩＴＣ)；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体。他の適切な蛍光団としては、約６１７ｎｍで発するチオール反応性ユーロピウムキレートを挙げることができる（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）。他の適切な蛍光団としては、ＧＦＰ、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（米国特許第５，８００，９９６（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）に記載されるような）及びそれらの誘導体を挙げることができる。当業者に知られている他の蛍光団、例えば、Ｍｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手できるそれらのものもまた使用され得る。

異種（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）：異種ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、異なった源又は種に由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドのことである。

宿主細胞：ベクターが繁殖し、そしてそのＤＮＡが発現される細胞。細胞は原核生物であっても、又は真核生物であっても良い。この用語はまた、対象宿主細胞のいずれかの子孫も含む。すべての子孫は、複製の間に発生する突然変異が存在し得るので、親細胞とは同一ではないことが理解される。しかしながら、そのような子孫は、用語「宿主細胞」（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）が使用される場合に包含される。

単離された（Ｉｓｏｌａｔｅｄ）：単離された核酸、タンパク質又は細胞は、前記核酸、タンパク質又は細胞が天然において存在する他の成分から実質的に分離されるか又は精製されている。したがって、「単離された」核酸又はタンパク質は、標準の生化学的精製方法により精製された核酸又はタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸及びタンパク質、及び化学的に合成された核酸及びタンパク質を含む。同様に、「単離された」細胞、例えばＺＳＣＡＮ４を発現するそれらの細胞は、他の細胞型（例えば、ＺＳＣＡＮ４を発現しない細胞）から実質的に分離されている。本開示においては、「単離された」とは、核酸、タンパク質又は細胞の１００％純度を必要としないが、しかし少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の純度である核酸タンパク質及び細胞を含む。

ＬＧＲ５（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）（ロイシンに富んでいる反復体含有Ｇ−タンパク質共役型受容体５）：腸上皮及び毛包の幹細胞マーカー。ＬＧＲ５タンパク質は、いくつかの器官で発現され（Barker and Clevers, Gastroenterology 138: 1681-1696, 2010）、そしてＬＧＲ５⁺細胞の遺伝子マーキングは、マウスにおける腸及び皮膚組織細胞についてのマーカーとしてこの膜タンパク質を同定した（Barker et al., Nature 449:1003-1007, 2007; Snippert et al, Science 327:1385-1389, 2010）。ＬＧＲ５はまた、Ｗｎｔシグナル伝達の役割を果たすことが知られている。ＬＧＲ５配列は公的に入手できる。例えば、GenBank受託番号 NM_003667 及び NP_003658はＬＧＲ５のヒトｍＲＮＡ及びタンパク質配列である。ヒトＬＧＲ５についてのＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤは８５４９である。

多能性細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）：複数の細胞系統を形成できるが、しかしすべての細胞系統は形成できない細胞のことである。

ナノ粒子（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）：直径約１０００ナノメーター（ｎｍ）未満の粒子。本明細書において提供される方法への使用のための典型的なナノ粒子は、生物適合性及び生物分解性ポリマー材料から製造される。ある実施形態によれば、ナノ粒子はＰＬＧＡナノ粒子である。本明細書において使用される場合、「ポリマーナノ粒子」（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、特定物質又は物質類の反復サブユニットから製造されるナノ粒子である。「ポリ（乳酸）ナノ粒子」（Ｐｏｌｙ(ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ) ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、反復乳酸サブユニットを有するナノ粒子である。同様に、「ポリ（グリコール酸）ナノ粒子」（Ｐｏｌｙ(ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ) ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、反復グリコール酸サブユニットを有するナノ粒子である。

操作可能に連結された（Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）：第１核酸配列が第２核酸配列と機能的関係を持って配置されている場合、当該第１核酸配列は、その第２核酸配列と操作可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列と操作可能に連結されている。一般的に、操作可能に連結された核酸配列は隣接しており、そして２種のタンパク質コード領域を連結する必要がある場合は、同じリーディングフレーム内に存在する。

膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）：内分泌腺と外分泌腺との混合物を含む腹部の結節器官。小内分泌部分は、血流中に多くのホルモンを分泌するランゲルハンス島から成る。大外分泌部分は、十二指腸中に注ぐ膵管系中に、いくつかの消化酵素を分泌する複合腺房腺である。

膵臓β細胞（又はβ細胞）（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ）：ランゲルハンス島に見られる膵臓中の種々のタイプの細胞。β細胞は、インスリンを生成し、そして放し、これが血液中のグルコースレベルを制御する。

医薬的に許容できる担体（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ）：医薬的に許容できる担体の使用は、従来のことである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、Ｚｓｃａｎ４タンパク質、Ｚｓｃａｎ４核酸分子、又は本明細書に開示される細胞の医薬送達のために適切な組成物及び製剤を記載する。

一般的に、担体の性質は、使用される特定の投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は通常、医薬的に及び生理学的に許容できる流体、例えば水、生理食塩水、平衡化塩溶液、水性デキストロース、グリセロール又は同様のものを、ビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤又はカプセル形）に関しては、従来の非毒性固体担体は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを含む。生物学的に中性担体の他に、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存剤、及びｐＨ緩衝剤及び同様のもの、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含むことができる。

医薬剤（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）：対象又は細胞に正しく投与される場合、所望する治療又は予防効果を誘発できる、化合物、小分子、細胞又は他の組成物。「インキュベーティング」（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）とは、細胞と相互作用する薬物についての十分な時間を含む。「接触させる」（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）とは、固体又は液体形での薬物を細胞と共にインキュベートすることを含む。

多能性細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）：生殖細胞を含むすべての生物の細胞系（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）を形成できるが、しかし自立的には完全な生物を形成できない細胞。

ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）：少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００個のヌクレオチドの核酸配列（例えば、線状配列）。したがって、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含み、染色体において見られる遺伝子配列も含む。「オリゴヌクレオチド」（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、天然のホスホジエステル結合により連結される多くの連結オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、６〜３００個の長さのヌクレオチドのポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチド類似して機能するが、しかし天然には存在しない部分を有する成分のことである。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、天然に存在しない部分、例えば糖成分又は糖間結合、例えばホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを含むことができる。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的類似体は、ＲＮＡ又はＤＮＡに結合でき、そしてペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。

ポリペプチド（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）：モノマーがアミド結合を通して一緒に連結されるアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のいずれか使用され得、Ｌ−異性体が好ましい。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、本明細書において使用される場合、任意のアミノ酸配列を含むことが意図され、そして修飾された配列、例えば糖タンパク質を含む。用語「ポリペプチド」は特に、天然に存在するタンパク質、及び、組み換えで又は合成により産生されるタンパク質を含むことが意図されている。

用語「ポリペプチド断片」（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）とは、少なくとも１つの有用なエピトープを示すポリペプチドの一部のことである。用語「ポリペプチドの機能的断片」（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）とは、ポリペプチド、例えばＺＳＣＡＮ４の活性を保持する、ポリペプチドのすべての断片のことである。例えば、生物学的な機能的断片は、抗体分子と結合できるエピトープと同じくらい小さなポリペプチド断片から、細胞増殖又は分化への影響を含む、細胞内での表現型変化の特徴的誘発又はプログラミングに関与することができる大きなポリペプチドまで、その大きさを変化することができる。したがって、ＺＳＣＡＮ４の生物学的活性、又はＺＳＣＡＮ４の保存的バリアント（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ）を含む、より小さなペプチドが、役に立つものとして包含される。

用語「実質的に精製されたポリペプチド」（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｏｐｔｉｄｅ）とは、本明細書において使用される場合、天然ンおいて付随する、他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質を実質的に有さないポリペプチドのことである。一実施形態によれば、ポリペプチドは、天然においては付随する、他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質を、少なくとも５０％、例えば少なくとも８０％有さない。別の実施形態によれば、ポリペプチドは、天然においては付随する、他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質を、少なくとも９０％有さない。さらに別の実施形態によれば、ポリペプチドは、天然においては付随する、他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質を、少なくとも９５％有さない。

保存的置換は、１つのアミノ酸を、サイズ及び疎水性等が類似する別のアミノ酸と置換する。天然のＺＳＣＡＮ４タンパク質（例えば、配列番号２）でなされ得る保存的置換の例が、下記に示される：

アミノ酸変化をもたらすｃＤＮＡ配列の変動は、保存性であろうと又はなかろうと、コードされるタンパク質の機能的及び免疫学的同一性を保存するために最小化されるべきである。したがって、いくつかの非制限的な例において、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチド又は本明細書に開示される他のポリペプチドは、最大２個、最大５個、最大１０個、最大２０個又は最大５０個の保存的置換を含む。タンパク質の免疫学的同一性は、それが抗体により認識されるかどうかを決定することにより評価され得；そのような抗体により認識される変異体は免疫学的に保存される。例えば、変異体のアミノ酸は、天然のアミノ酸配列（例えば、天然のＺＳＣＡＮ４配列）に対して、少なくとも８０％、９０％又は、９５％又は９８％同一であり得る。

前駆細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）：特定の種類の細胞又は細胞系に分化する多能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）又は単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）細胞。前駆細胞は、幹細胞に類似するが、より分化されており、そして制限された自己再生を示す。

プロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）：核酸の転写へ向かわせる核酸制御配列。プロモーターは、転写の開始部位近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、場合により、遠位エンハンサー又はリプレッサー要素を含む。「構成プロモーター」（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は、継続的に活性的であり、そして外部シグナル又は分子による調節の対象ではないプロモーターである。対照的に、「誘発性プロモーター」（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の活性は、外部シグナル又は分子（例えば、転写因子）により調節される。

レポーター遺伝子（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）：関心のある別の遺伝子又は核酸配列（例えば、プロモーター配列）と操作可能に連結された遺伝子。レポーター遺伝子は、関心のある遺伝子又は核酸が細胞において発現されるか、又は細胞において活性化されているかどうかを決定するために使用される。レポーター遺伝子は典型的には、容易に同定できる特徴、例えば蛍光、又は容易に検出される産物、例えば酵素を有する。レポーター遺伝子はまた、宿主細胞に抗生物質耐性を付与することができる。典型的なレポーター遺伝子として、蛍光及び発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び遺伝子ｄｓＲｅｄからの赤色蛍光タンパク質）、酵素ルシフェラーゼ（光を生成するためにルシフェリンとの反応を触媒する）、ｌａｃＺ遺伝子（基質類似体Ｘ−ｇａｌを含む培地上で増殖される場合、遺伝子を発現する細胞の青色への出現を引起すタンパク質β−ガラクトシダーゼをコードする）、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与する）を挙げることができる。一実施形態によれば、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質Ｅｍｅｒａｌｄをコードする。別の実施形態によれば、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙをコードする。

レチノイド（Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ）：ビタミンＡに化学的に関連する種類の化合物。レチノイドは、主にそれらが上皮細胞成長を調節するので、医薬に使用される。レチノイドは、視覚における役割、細胞増殖及び分化の調節、骨組織の成長、免疫機能、及び腫瘍抑制遺伝子の活性を含む、身体を通しての多くの重要且つ多様な機能を有する。レチノイドの例として、オール−トランス型（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ）レチノイン酸（ａｔＲＡ）、９−シスレチノイン酸（９−cisＲＡ）、１３−シスＲＡ及びビタミンＡ（レチノール）を挙げることができるが、それらだけには限定されない。

サンプル（Ｓａｍｐｌｅ）：対象から得られる、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、細胞、組織又はそれらの組み合わせを含む生物学的試料。例としては、次のものを挙げることができるが、それらだけには限定されない：末梢血液、尿、唾液、脳脊髄液、組織生検（例えば、膵臓組織）、外科用試料及び剖検材料。１つの例によれば、サンプルはヒト膵臓組織サンプルである。

選択マーカー（Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）：細胞の選択又は単離を可能にする形質を付与する、細胞へ導入される遺伝子のことである。例えば、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子を挙げることができる。

配列同一性／類似性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ／ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：複数の核酸配列、又は複数のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、配列間の同一性又は類似性の観点から表される。配列同一性は、％同一性の点から測定され得；百分率（％）が高いほど、配列の同一性は高くなる。配列類似性は、％類似性（保存性アミノ酸置換を考慮する）の点から測定され得；百分率が高いほど、配列の類似性は高くなる。核酸又はアミノ酸配列の相同体（Ｈｏｍｏｌｏｇｓ）又は相同分子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）は、標準方法を用いて整列される場合、比較的高度の配列同一性／類似性を有する。

比較のための配列のアラインメント法は、当業界においてよく知られている。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、次に記載されている：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 ; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5Λ51-3, 1989; Corpet et al, Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992;及びPearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994。Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アラインメント法及び相同性計算の詳細な考慮を提供する。

ＮＣＢＩ基本的局所アラインメントサーチツール（ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ 及びｔｂｌａｓｔｘに関しての使用のために、いくつかのソース、例えばNational Center for Biological Information (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)から及びインターネット上で入手できる。追加の情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見出され得る。

ＢＬＡＳＴは、核酸配列を比較するために使用され、そしてＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。２種の比較される配列が相同性を共有する場合、作成される出力ファイルは、整列された配列として相同性のそれらの領域を提供する。２種の比較される配列が相同性を共有しない場合、作成される出力ファイルは整列された配列を提供しない。

当業者は、特定の配列同一性の範囲が唯一の指針として提供されていることを理解する；提供される範囲外にある、極めて有意な相同体が得られ得る。

ＳＳＥＡ３（段階−特異的胚抗原−３）：炭水化物エピトープ認識モノクローナル抗体により本来同定された分子。ＳＳＥＡ３は、特にヒト多能性幹細胞のための既知幹細胞マーカーである（Shevinsky et al. , Cell 30(3):697-705, 1982; Kannagi et al., EMBO / 2(12):2355-2361, 1983; Kannagi et al., J Biol Chem 258(14):8934-8942, 1983）。

幹細胞（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）：変更されていない娘細胞を産生し（自己再生；細胞分析は、親細胞と同一である少なくとも１つの娘細胞を産生する）、そして特殊化された細胞型を生ぜしめる（効能）固有の能力を有する細胞。幹細胞として、次のものを挙げることができるが、それらだけには限定されない：ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＧＳ細胞、ＭＡＰＣ、ｍａＧＳＣ、ＵＳＳＣ及び成体幹細胞。一実施形態によれば、幹細胞は複数の所定の細胞型の十分に分化された機能的細胞を産生することができる。インビボでの幹細胞の役割は、動物の通常の生活の間に破壊される細胞を置き換えることである。一般的に、幹細胞は制限なしに分裂することができる。分裂の後、幹細胞は、幹細胞として存続し、前駆細胞になるか、又は最終分化に進み得る。前駆細胞は、少なくとも１つの所定の細胞型の十分に分化された機能的細胞を産生できる細胞である。一般的に、前駆細胞は分裂できる。分裂の後、前駆細胞は、前駆細胞のまま存続するか、又は最終分化へ進行できる。

対象（Ｓｕｂｊｅｃｔ）：生存多細胞脊椎動物。ヒト及び非ヒト哺乳類を含むカテゴリー。

Ｔｃｓｔｖ１／３（２細胞期、種々のグループ、メンバー１及び３）：ＺＳＣＡＮ４と同時発現することが以前に示されている遺伝子（国際公開第２００８／１１８９５７号）。Ｔｃｓｔｖ１及びＴｃｓｔｖ３はスプライスバリアントである。

治療量（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｍｏｕｎｔ）：意図される目的を達成するのに十分な治療剤の量。例えば、ＺＳＣＡＮ４⁺膵臓幹細胞又は前駆細胞の治療量は、そのような治療から恩恵を受けることができる疾患、例えば糖尿病の障害又は症状を軽減するのに十分な量である。治療量は、ある例においては、疾患又は症状を１００％治療することはできない。しかしながら、治療剤の投与から恩恵を受けることができる疾患のいずれか既知特徴又は症状の軽減、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％又はそれ以上の軽減が、治療でなされ得る。所定の治療剤の治療量は、要因、例えば剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物の大きさ及び種、及び投与の目的により変化する。それぞれの場合において、治療量は、当該技術分野において確立された方法に従って、当業者により過度の実験を行うことなく実験的に決定され得る。

全能細胞（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）：完全な生命体を自動的に形成できる細胞のことである。受精卵（卵母の細胞）のみがこの能力を有する（幹細胞にはない）。

トランスフェクティング（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）又はトランスフェクション（ｔｏｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）：細胞又は組織中に核酸を導入する工程のことである。トランスフェクションは、多くの方法のいずれか１つ、例えばリポソーム介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション及び注入（但し、それらだけには限定されない）により達成され得る。

移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）：対象中に器官、組織又は細胞を移植する工程のことである。

ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）：宿主細胞中に導入され、それにより、形質転換された宿主細胞を産生するような核酸分子。ベクターは、宿主細胞において複製を可能にする核酸配列、例えば複数の起点（ＤＮＡ合成の開始に関与するＤＮＡ配列）を含むことができる。例えば、発現ベクターは、挿入された遺伝子又は遺伝子類の転写及び翻訳を可能にするために、必要な調節配列を含む。ベクターはまた、１又は２以上の選択マーカー遺伝子及び当業界において知られている他の遺伝要素を含むことができる。例えば、ベクターは、ウィルスベクター及びプラスミドベクターを含む。

ＺＳＣＡＮ４：２−細胞特異的発現及びＥＳ細胞特異的発現を示すものとして以前に同定されており（国際公開第２００８／１１８９５７号）、そしてテロメア伸長及びゲノム安定性を促進することが示されている（Zalzman et al, Nature 464(7290):858-863, 2010）遺伝子群、本開示によれば、「ＺＳＣＡＮ４」は、ヒトＺＳＣＡＮ４及びマウスＺｓｃａｎ４の両者を含む。マウスにおいては、用語「Ｚｓｃａｎ４」は、３個の偽遺伝子（Ｚｓｃａｎｌ−ｐｓｌ、Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ２及びＺｓｃａｎ４−ｐｓ３）及び６個の発現された遺伝子（Ｚｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ及びＺｓｃａｎ４ｆ）を含む遺伝子の集合体のことである。ＺＳＣＡＮ４は、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチド、及びＺＳＣＡＮ４ポリペプチドをコードするＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチドのことである。典型的な配列が本明細書に提供される。

特に断らない限り、本明細書に使用される全ての技術及び化学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語、不定冠詞「ａ」、「ａｎ」及び定冠詞「ｔｈｅ」は、特に明白に示されない限り、複数形も含む。同様に、用語「又は」（ｏｒ）は、特に明白に示されない限り、「及び」（ａｎｄ）を含むことを意図される。したがって、「Ａ又はＢを含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）とは、Ａ又Ｂ、又はＡ及びＢを含むことを意味する。核酸又はポリペプチドについて与えられる、すべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及びすべての分子量又は分子質量値はおおよそであり、そして説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されるそれらの方法及び材料に類似するか又はそれと同等の方法及び材料が本開示の実施又は試験に使用され得るが、適切な方法及び材料が下記に記載される。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号を含む、全ての出版物、特許出願、特許及び他の引例は、それらの全体を参照により組み込まれる。競合の場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法及び実施例は単なる例示であり、制限されることを意図していない。

III ．いくつかの実施形態の概要
適切なマーカーの欠如が、成人膵臓における幹細胞及び前駆細胞の同定及び単離を妨げてきた。Ｚｓｃａｎ４、すなわちネズミ胚幹（ＥＳ）細胞において断続的に発現される遺伝子が、それらの細胞におけるテロメア伸長及びゲノム安定性を調節することは、これまで開示されている。成人ヒト膵臓において、少数のＺＳＣＡＮ４陽性細胞が、ランゲルハンス島、腺房及び膵管に位置する細胞間に存在することが本明細書に開示されている。ＺＳＣＡＮ４が、膵臓星状細胞がまた位置する、腺房間の間質に位置する卵形状細胞のいくつかにおいて発現されることをもまた決定されている。多くの場合、それらのＺＳＣＡＮ４陽性細胞もまた、他の組織幹細胞マーカー、例えばＢＭＩ１及びＬＧＲ５に対して陽性であった。さらに、ＺＳＣＡＮ４陽性細胞の数は、慢性膵炎を有する患者、特にコルチコステロイド処理の後、活動的に再生する膵臓組織において劇的に上昇した。しかしながら、処置の１年後、ＺＳＣＡＮ４陽性細胞の数は、影響を受けていない膵臓中のその数に匹敵する非常に低いレベルに戻った。本明細書に開示されるデータは、ＺＳＣＡＮ４の発現が成人ヒト膵臓における希少な幹／前駆細胞のためのバイオマーカーとして役立つことを示唆する。

したがって、サンプル、例えば膵臓組織サンプルから膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞、又はそれらの両者を単離する方法が、本明細書に提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、サンプルの細胞中におけるＺＳＣＡＮ４の発現を検出し、そしてＺＳＣＡＮ４を発現する細胞を単離することを含む。

膵臓の疾病又は障害を有する対象の治療方法もまた提供される。膵臓の疾病又は障害は、膵臓の内分泌機能又は外分泌機能に関連付けられ得る。ある場合、膵臓の内分泌機能に関連する疾病又は障害が糖尿病である。したがって、対象における糖尿病を治療する方法が本明細書に提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞を単離し、ここで前記膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞の単離がＺＳＣＡＮ４を発現する、膵臓組織中の細胞を検出することを含み；（ｉｉ）インビトロで、ＺＳＣＡＮ４を発現する、前記単離された膵臓細胞又は前駆細胞を増殖し；そして（ｉｉｉ）前記増殖された膵臓幹細胞又は前駆細胞を、前記対象中に移植し、それにより対象における糖尿病を治療することを含む。特定の例によれば、膵臓幹細胞又は前駆細胞は、治療される対象から単離される。

さらに、対象において膵臓幹細胞又は前駆細胞集団をインビボで増殖させる方法が提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、ＺＳＣＡＮ４タンパク質；ＺＳＣＡＮ４核酸配列；又はＺＳＣＡＮ４の発現を高めるか、又はＺＳＣＡＮ４⁺細胞の数を増大させる剤を対象の膵臓に送達することを含む。

ＺＳＣＡＮ４の発現を高める剤を同定することにより、外分泌及び内分泌細胞（インスリン分泌性膵臓β細胞を含む）を再生するよう膵臓幹細胞を刺激する剤を同定するためのスクリーニングアッセイがまた提供される。

Ａ．膵臓幹細胞及び前駆細胞の単離方法
サンプルから膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞、又は両者を単離するための方法が、本明細書に提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、サンプルの細胞中においてＺＳＣＡＮ４の発現を検出し（例えば、配列番号２として示される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列の存在を検出し）、そしてＺＳＣＡＮ４を発現する細胞を単離することを含む。特定の例においては、サンプルはヒト膵臓組織を含む。

開示される方法のある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４の発現の検出は、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子の発現の検出を含む。ＳＳＥＡ３、すなわち既知幹細胞マーカーが、膵臓組織において、ＺＳＣＡＮ４と類似する発現パターンを示す発現が本明細書に記載される（図１１を参照のこと）。したがって、特定の例によれば、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子はＳＳＥＡ３である。他の遺伝子が、ＺＳＣＡＮ４と同時発現されるものとして同定されている。例えば、国際公開第２００８／１１８９５７号は、ＡＦ０６７０６３、Ｔｃｓｔｖｌ／３、Ｔｈｏ４、Ａｒｇｉｎａｓｅ II、 ＢＣ０６１２１２ 及び Ｇｍ４２８、Ｅｉｆｌａ、ＥＧ６６８７７７ 及びＰｉｆｌが同時発現された遺伝子であることを開示する。したがって、ある態様によれば、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子は、ＡＦ０６７０６３、Ｔｃｓｔｖｌ／３、Ｔｈｏ４、Ａｒｇｉｎａｓｅ II、 ＢＣ０６１２１２ 及び Ｇｍ４２８、Ｅｉｆｌａ、ＥＧ６６８７７７ 及びＰｉｆｌから成る群から選択される。１つの非制限的な例によれば、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子は、Ｔｃｓｔｖ１／３である。

同時発現された遺伝子は、ＺＳＣＡＮ４と同一の発現パターンを示す必要はないが、しかし一般的に、ＺＳＣＡＮ４と非常に類似する発現パターンを示し、その結果、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子を検出することにより単離される大部分の細胞（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも９０％又は少なくとも約９５％）はまた、ＺＳＣＡＮ４を発現する。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子は、タンパク質の抗体に基づく検出を促進するために膜タンパク質をコードする。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４の発現の検出は、ＺＳＣＡＮ４によりコードされるタンパク質に対して特異的な抗体、又はＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子によりコードされるタンパク質に対して特異的な抗体とサンプルとを接触することを含む。特定の例によれば、抗体はＺＳＣＡＮ４によりコードされるタンパク質に対して特異的である。他の例によれば、抗体はＳＳＥＡ３によりコードされるタンパク質に対して特異的である。さらに他の例によれば、抗体はＴｃｓｔｖ１／３によりコードされるタンパク質に対して特異的である。ＺＳＣＡＮ４、ＳＳＥＡ３ 及びＴｃｓｔｖｌ／３によりコードされるタンパク質に対して特異的な抗体は、市販されており、そして／又は当業者によく知られている方法を用いて産生することができる（ＺＳＣＡＮ４抗体の例については、表１を参照のこと）。

抗体介在性検出及び単離方法は当業者によく知られている。ある場合、ＺＳＣＡＮ４に対して特異的な抗体、又はＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子によりコードされる遺伝子産物は、検出可能なラベル、例えば蛍光団に結合される。したがって、特定の実施形態によれば、蛍光団と複合体化したＺＳＣＡＮ４特異的抗体は、サンプル中の細胞と接触される。ＺＳＣＡＮ４⁺細胞は、抗体を結合し、そして例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により単離され得る。同様に、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子の遺伝子産物に対して特異的な蛍光団接合抗体が、サンプル中の細胞と接触され、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子を発現する細胞が単離され、それにより、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞が単離される。抗体はまた、他の検出可能なマーカー、例えば磁気ビーズ（ＺＳＣＡＮ４⁺細胞の磁気分離を可能にする）と複合体化され得る。

他の実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４の発現の検出は、異種核酸配列、例えばレポーター遺伝子又は選択マーカーに操作可能に連結されたＺＳＣＡＮ４プロモーターを含むベクターによりサンプル中の細胞をトランスフェクトすることを含む。異種核酸配列は、ＺＳＣＡＮ４を発現する細胞の検出及び／又は選択を可能にするいずれかのタイプの分子をコードすることができる。ある例によれば、異種核酸配列は、レポーター遺伝子である。例えば、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質又は酵素であり得る。特定の非制限的な例によれば、蛍光タンパク質として、ＧＦＰ又はその誘導体、例えばエメラルド（Ｅｍｅｒａｌｄ）を挙げることができる。蛍光マーカーの使用は、例えばＦＡＣＳを用いての細胞の単離を可能にする。

他の例によれば、異種核酸分子は、選択マーカーである。ある例によれば、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。適切な抗生物質耐性遺伝子としては、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、Ｇ４１８及び同様のものに対する耐性を付与する遺伝子を挙げることができるが、それらだけには限定されない。当業者は、哺乳類細胞及び対応する抗生物質のための適切な選択マーカーを容易に選択でき、ＺＳＣＡＮ４を発現する細胞を選択できる。ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含む場合、そのベクターによりトランスフェクトされた細胞は、対応する抗生物質の存在下で培養され得る。ＺＳＣＡＮ４を発現する細胞はまた、抗生物質耐性遺伝子を発現し、そして抗生物質の存在下で生存し；ＺＳＣＡＮ４を発現しない細胞は死滅し、それにより、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞の単離を可能にする。

ある実施形態によれば、プロモーターは、ヒトＺＳＣＡＮ４プロモーターの少なくとも一部を含む。特定の例によれば、プロモーターはヒトＺＳＣＡＮ４プロモーターを含む。他の実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４プロモーターは、マウスＺｓｃａｎ４ａプロモーターの少なくとも一部を含む。特定の例によれば、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド９０６−４４６８として示される核酸配列を含む。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞の検出のためのベクターは、配列番号１５として示される配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、そしていつか例においては、配列番号１５を含む。

本明細書に開示されるある実施形態によれば、前記方法はさらに、既知組織幹細胞マーカー、例えばＬＧＲ５又はＢＭＩ１（但しそれらだけには限定されない）の発現の検出を含む。したがって、特定の例によれば、前記方法はさらに、ＬＧＲ５又はＢＭＩ１、又は両者の発現の検出、及び、ＬＧＲ５又はＢＭＩ１、又は両者を発現する細胞の単離を含む。

Ｂ．膵臓の疾患又は障害の治療方法
膵臓の疾患又は障害を有する対象の治療方法もまた、本明細書において提供される。膵臓の疾患又は障害は、膵臓の内分泌機能又は膵臓の外分泌機能に関連付けられ得る。ある場合、膵臓の内分泌機能に関連する疾患又は障害は糖尿病である。

ドナー膵臓からインビトロで単離された、インスリン産生ランゲルハンス島細胞、又はそのような細胞に分化できる膵臓幹／前駆細胞の移植が、１型及び、幾つかの場合の２型糖尿病を治療する能力を有する（Serup et al, BMJ 322:29-32, 2001）。しかしながら、十分なドナー細胞の欠乏、及び治療の必要な対象中に同種細胞を都合よく移植するのに必要とされる免疫抑制治療の副作用が、この治療の選択肢の可能性を制限してきた。膵臓幹細胞及び前駆細胞を単離するための本明細書に開示される方法は、それらの困難性を克服するための手段を提供する。

対象における糖尿病の治療方法が本明細書に提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、（ｉ）膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞を単離し、ここで前記膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞の単離がＺＳＣＡＮ４（例えば、配列番号２として示される配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＺＳＣＡＮ４配列）を発現する、膵臓組織中の細胞を検出することを含み；（ｉｉ）インビトロで、ＺＳＣＡＮ４を発現する、前記単離された膵臓細胞又は前駆細胞を増殖し；そして（ｉｉｉ）前記増殖された膵臓幹細胞又は前駆細胞を、前記対象中に移植することを含む。特定の例によれば、膵臓幹細胞又は前駆細胞は、治療される対象から単離される。ある実施形態によれば、前記方法は、治療の必要な対象、例えば糖尿病（１型又は２型糖尿病を含む）を有するものとして診断された対象の選択をさらに含む。

膵臓組織は、標準的な方法、例えば手術又は生検を用いて、治療される対象から、又はドナー対象から得られる。膵臓の生検は、いずれかの標準的な方法、例えば細針吸引（ＦＮＡ）、コア生検又は腹腔鏡検査に従って実施され得る（Paulsen et al., Interventional Radiology 187:769-772, 2006; Freeny et al, West J Med 132:283-287, 1980）。特定の例によれば、膵臓組織は、超音波内視鏡の視覚ガイダンス下で、１９ゲージのＴＲＵ−ＣＵＴ（商標）生検針を用いて得られる。

ある実施形態によれば、前記方法はさらに、膵臓幹細胞又は前駆細胞を、対象に移植する前、膵臓β細胞に分化させることを含む。インビトロで膵臓細胞を培養し、そして膵臓幹細胞又は前駆細胞を（例えばβ細胞に）分化させる方法は記載されている（例えば、Ramiya et al. , Nat Med 6:278-282, 2000; Bonner- Weir et al. , Proc Natl Acad Sci USA 97(14):7999-8004, 2000；米国特許出願公開番号２００５／００６９５２９号及び２００８／０２７４０９０号を参照のこと）。

治療の必要な対象中への膵臓細胞（幹細胞、前駆細胞又は分化された細胞）の移植は、当業界において知られているいずれかの適切な方法を用いて達成され得る。ある実施形態によれば、膵臓細胞は膵臓中に直接的な注入により送達される。１つの例として、膵臓細胞は、皮下注射針により腎臓カプセルを穿刺し、前記腎臓中に穿刺部位を介して細い毛細管を通し、そして膵臓の皮質領域中に細胞を注入することにより移植され得る（例えば、米国特許出願公開第２００８／０２７４０９０号に記載される）。別の例によれば、膵臓細胞は、上腹部を介して、肝臓の門脈中にカテーテルを配置することにより移植される。次に、膵臓細胞は、徐々に肝臓内に注入される。

ある実施形態によれば、増殖された膵臓幹細胞、前駆細胞又はβ細胞は、単独で、医薬的に許容できる担体（例えば、適切なポリマーにカプセルを封入されている）の存在下で、又は他の治療剤の存在下で投与される。

１つの例によれば、膵臓細胞は、糖尿病患者に移植される半透性ポリマー膜及びポリマー膜にカプセル封入される（化合物及び細胞のカプセル封入の説明については、米国特許第５，５７３，５２８号を参照のこと）。

半透性ポリマー膜は、合成物であっても、又は天然物であっても良い。使用され得るポリマーの例としては、次のものを挙げることができる：ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、アクリロニトリル−塩化ビニル共重合体（polyacrylonitrile-co-vinyl chloride)（Ｐ［ＡＮ／ＶＣ］）、ポリ（乳酸）、乳酸−グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolic acid)）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン及び同様のもの。ポリマー膜内のカプセル封入された膵臓細胞の送達は、細胞に対する宿主の拒絶及び免疫応答、及び拒絶及び炎症に関連する問題を回避できる。さらに、ポリマー膜内に含まれる細胞は、細胞生存性を維持し、そしてポリマー壁を通して分子、栄養物及び代謝生成物の輸送を可能にしながら、免疫監視機構から、ポリマー壁（すなわち、個々の繊維、フィブリル、フィルム、スプレー、液滴、粒子等の壁）により保護される。ポリマーカプセル封入された細胞の移植は、Aebischer et al. （Transplant, 111:269-275, 1991)により開発されており、そして非ヒト霊長類及びヒトの両者により都会良く使用されてきた（Aebischer et al, 1994, Transplant, 58:1275-1277;米国特許第６，１１０，９０２号）。

１つの例によれば、増殖された膵臓細胞は、最初に、コラーゲン、アガロース又はＰＶＡ（ポリビニルアルコール）のいずれかのマトリックス中にそれらの細胞を埋めることによりカプセル封入される。続いて、埋められた細胞は、ポリアクリルニトリル：ポリ塩化ビニルの６０：４０のコポリマーのポリプロピレンから製造された中空繊維中に注入される。前記繊維は、移植のために断片に切断され、そして末端−密封される。

Ｃ．インビボでの膵臓幹／前駆細胞の増殖方法
さらに、対象において膵臓幹細胞又は前駆細胞集団をインビボで増殖させる方法が本明細書に提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、ＺＳＣＡＮ４タンパク質；ＺＳＣＡＮ４核酸配列；又はＺＳＣＡＮ４の発現を増大させるか又はＺＳＣＡＮ４⁺細胞の数を増大させる剤を、対象の膵臓に送達することを含む。ある実施形態によれば、前記方法はさらに、膵臓幹細胞又は前駆細胞の増殖の必要な対象を選択することを含む。例えば、対象は糖尿病を有する対象であり得る。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質又は核酸配列は、ヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質又は核酸配列である。他の実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質又は核酸配列は、ネズミ科のＺｓｃａｎ４配列である。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。ある例によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。特定の非制限的な例によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列から成る。他の例によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質は、配列番号２の機能的断片、又は配列番号２の保存的バリアントを含む。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４核酸配列は、配列番号１の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。ある例によれば、ＺＳＣＡＮ４核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。特定の非制限的例によれば、ＺＳＣＡＮ４核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド配列から成る。他の例によれば、ＺＳＣＡＮ４核酸配列は、配列番号２の機能的断片、又は保存的バリアントをコードする。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４核酸配列の送達は、ＺＳＣＡＮ４核酸配列を含むべきベクターの投与を含む。ＺＳＣＡＮ４発現ベクターの作製及び使用方法は、本出願の他のセクションに記載されている。

ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質又はＺＳＣＡＮ４核酸配列（例えば、ＺＳＣＡＮ４核酸配列を含むベクター）の送達は、ナノ粒子にカプセル封入されるＺＳＣＡＮ４タンパク質又は核酸の投与を含む。ナノ粒子を用いてのタンパク質及び核酸分子の送達方法は、当業者において良く知られており、そして下記セクションＶ．Ｄに記載される。

本発明者は、レチノイドがマウスＥＳ細胞培養物においてＺｓｃａｎ４⁺細胞を過渡的に高めることができることを以前示している（２０１０年９月２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７６４４号）。したがって、ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４の発現を高める剤はレチノイドである。典型的なレチノイドとして、ａｔＲＡ、９−ｃｉｓＲＡ、Ｂ−ｃｉｓＲＡ及びビタミンＡを挙げることができるが、それらだけには限定されない。

ＺＳＣＡＮ４タンパク質、ＺＳＣＡＮ４核酸、又はＺＳＣＡＮ４の発現を増大させる（又はＺＳＣＡＮ４⁺細胞の数を増大させる）剤の送達は、当業界において知られているいずれかの適切な方法を用いて達成され得、そして送達される分子又は組成物に依存して変化する。ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４タンパク質、ＺＳＣＡＮ４核酸、又はＺＳＣＡＮ４の発現を高めるか、又はＺＳＣＡＮ４⁺細胞の数を高める剤は、注入により対象の膵臓に送達される。他の実施形態によれば、剤は、局部又は全身血液循環中に注入され、膵臓への剤の送達が可能にされる。さらに他の実施形態によれば、剤は経口投与される。

Ｄ．スクリーニングアッセイ
所定の細胞集団（例えば、膵臓における細胞）においてＺＳＣＡＮ４の発現を増大させるか又はＺＳＣＡＮ４⁺細胞の数を増大させる剤を同定することにより、内分泌及び外分泌細胞（インスリン分泌膵臓β細胞を含む）を再生するよう膵臓幹細胞を刺激する剤を同定するスクリーニングアッセイがさらに本明細書に提供される。ある実施形態によれば、前記方法は、細胞培養物と、候補剤とを接触させ、そしてＺＳＣＡＮ４の発現を検出することを含む。対照と比較して細胞培養物へ剤を添加した後におけるＺＳＣＡＮ４の発現の上昇は、剤が内分泌及び外分泌細胞を再生するよう膵臓幹細胞を刺激できることを示唆する。例えば、対照は、剤の添加前のＺＳＣＡＮ４発現レベル、対照細胞培養物におけるＺＳＣＡＮ４の発現、又は基準値、例えば外因性剤の不在下で類似する細胞培養物におけるＺＳＣＡＮ４発現の代表値であり得る。

ある実施形態によれば、細胞培養物は、膵臓細胞、例えば一次膵臓細胞、又は膵臓細胞系の細胞を含む。他の実施形態によれば、細胞培養物は、多能性幹細胞、例えば胚幹細胞を含む。

ある実施形態によれば、アッセイは、例えばＰＣＲによるＺＳＣＡＮ４ｍＲＮＡの発現の検出を含む。他の実施形態によれば、アッセイは、例えばＥＬＩＳＡによるＺＳＣＡＮ４タンパク質の発現の検出を含む。さらに他の実施形態によれば、アッセイは、ＺＳＣＡＮ４プロモーターの制御下でのレポーター（例えば、ＧＦＰ）の発現の検出を含む。

例えば、開示されるスクリーニングアッセイを用いて同定される剤を用いて、対象に投与し、膵臓幹／前駆細胞をインビボで増殖できる。

IV．Ｚｓｃａｎ４プロモーター配列及び発現ベクター
ＺＳＣＡＮ４プロモーター及びレポーター遺伝子を含む発現ベクターはこれまでに記載されている（国際公開第２００８／１１８９５７号を参照のこと）。異種ポリペプチド（例えば、レポーター遺伝子又は選択マーカー）をコードする核酸配列に操作可能に連結されたＺＳＣＡＮ４プロモーター配列を含む発現ベクターを用いて、ＺＳＣＡＮ４を発現する細胞を同定できる。レポーター遺伝子の発現を検出する方法、したがって、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞を検出する方法は、レポーター遺伝子の種類に依存して変化し、そしてこのことは、当業界においてよく知られている。例えば、蛍光レポーターが使用される場合、発現の検出は、ＦＡＣＳ又は蛍光顕微鏡により達成され得る。他の例によれば、選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子が使用される場合、細胞は、ＺＳＣＡＮ４を発現しない全ての細胞を死滅させる、適切な選択剤（例えば、抗生物質）の存在下でインキュベートされる。

ある例によれば、異種核酸配列（例えば、レポーター分子）は、ＺＳＣＡＮ４プロモーター（例えば、ベクター）の制御下で発現される。ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４プロモーターは、マウスＺｓｃａｎ４ｃプロモーターである。例えば、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド９０６−４４６８として示される核酸配列を含むことができる。ある例によれば、Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターは、Ｚｓｃａｎ４ｃエキソン及び／又はイントロン配列を含む。他の発現制御配列、例えば適切なエンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、及び停止コドンが、発現ベクターにおいて、ＺＳＣＡＮ４プロモーターと共に含まれ得る。一般的に、プロモーターは、異種核酸配列の転写へ向かわせるために十分な最小配列を少なくとも含む。いくつかの例によれば、異種核酸配列は、レポーター分子又は選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする。

異種核酸配列によりコードされる異種タンパク質は典型的には、レポーター分子又は選択マーカー、マーカー、酸素、蛍光タンパク質、細胞に抗生物質耐性を付与するポリペプチド、又は従来の分子生物学方法を用いて同定され得る抗原である。レポーター分子を用いて、関心のある細胞又は細胞集団、例えばＺＳＣＡＮ４⁺膵臓細胞を同定できる。１つの実施形態によれば、異種タンパク質は、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質又はその変異体、例えばエメラルド（Ｅｍｅｒａｌｄ）（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））；抗原マーカー（例えば、ヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、ヒトＨＬＡ抗原）；細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４又はいずれかの細胞表面受容体）；又は酸素マーカー（例えば、ｌａｃＺ、アルカリホスファターゼ）である。レポーター遺伝子の発現は、細胞がＺｓｃａｎ４を発現することを示唆する。レポーター遺伝子の発現の検出方法は、レポーター遺伝子のタイプに依存して変化し、そして当業界においてよく知られている。例えば、蛍光レポーターが使用される場合、発現の検出はＦＡＣＳ又は蛍光顕微鏡により達成され得る。

別の実施形態によれば、異種タンパク質は、抗生物質耐性、例えばピューロマイシン耐性を付与する。したがって細胞は、適切な抗生物質（例えば、ピューロマイシン）の存在下でインキュベートされ、ＺＳＣＡＮ４を発現する細胞が選択される。

発現ベクターは典型的には、複製の起点、及び形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定遺伝子を含む。使用に適したベクター、例えばウィルスベクター及びプラスミドベクター（例えば、下記セクションＶに記載されるそれら）は、当業界においてよく知られている。１つの例によれば、エンハンサーはＺＳＣＡＮ４プロモーターの上流に位置するが、しかしエンハンサー要素は一般的に、ベクター上の任意の位置に配置され、そしてまだ、増強効果を有する。しかしながら、増強された活性の量は一般的に、距離と共に減少し得る。さらに、エンハンサー配列の複数のコピーが、プロモーター活性のさらなる増大を生成するために、次々と操作可能に連結され得る。

ＺＳＣＡＮ４プロモーターを含む発現ベクターを用いて、宿主細胞、例えば膵臓細胞（但し、それらだけには限定されない）を形質転換できる。宿主において発現及び複製できる生物学的に機能的なウィルス及びプラスミドＤＮＡベクターは、当業界において知られており、そして興味あるいずれかの細胞をトランスフェクトするために使用され得る。

「トランスフェクトされた細胞」（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌ）は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）、例えばＺＳＣＡＮ４プロモーター要素を含むＤＮＡ分子を導入されている宿主細胞（又は祖先（ａｎｃｅｓｔｏｒ））である。組換え核酸分子による宿主細胞のトランスフェクションは、当業者によく知られているような従来の技法により実施され得る。本明細書において使用される場合、トランスフェクションは、リポソーム介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、注入、又は核酸分子を細胞中に導入するためのいずれか他の適切な技法を含む。

Ｖ．Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列
ＺＳＣＡＮ４核酸及びアミノ酸配列は、当業界においてこれまで記載されている（例えば、国際公開第２００８／１１８９５７号（この開示は参照により本明細書に組込まれる）；Falco et al, Dev. Biol. 307(2):539-550, 2007; 及びCarter et al., Gene Expr. Patterns. 8(3): 181-198, 2008）。本明細書において使用される場合、用語「ＺＳＣＡＮ４」は、ヒトＺＳＣＡＮ４、２−細胞胚段階又はＥＳ細胞−特異的発現を示すマウス遺伝子群のいずれか１つ（Ｚｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ 及び Ｚｓｃａｎ４ｆを含む）、又はＺＳＣＡＮ４いずれか他の種の相同分子を含む。

Ａ．ＺＳＣＡＮ４アミノ酸配列
典型的なＺＳＣＡＮ４アミノ酸配列は、配列番号２ (ヒトＺＳＣＡＮ４)、配列番号４ (Ｚｓｃａｎ４ａ)、配列番号６ (Ｚｓｃａｎ４ｂ)、配列番号８ (Ｚｓｃａｎ４ｃ)、配列番号１０ (Ｚｓｃａｎ４ｄ)、配列番号１２ (Ｚｓｃａｎ４ｅ) 及び配列番号１４ (Ｚｓｃａｎ４ｆ)として配列表に示されている。当業者は、それらの配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有し、そしてＺＳＣＡＮ４活性（例えば、ゲノム安定性を増強し、そしてＥＳ細胞においてテロメア長を増大する能力）を保持する配列が、本明細書に提供される方法に使用され得ることを理解する。

他の種からのＺＳＣＡＮ４アミノ酸配列、例えばイヌＺＳＣＡＮ４ (ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５４１３７０ 及び ＸＰ＿８５３６５０); ウシＺＳＣＡＮ４ (ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１７８９３０２); 及びウマＺＳＣＡＮ４ (ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１４９３９９４)は、公的に入手できる。上記に列挙されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号の個々は、２０１１年１月１４日のＧｅｎＢａｎｋデータベースに表示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。

細胞（例えば、膵臓細胞）において発現されるか、又は本明細書に提供される方法に従ってインビボで（例えば膵臓に）送達され得る、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドの特定の非制限の例として、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。更なる実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４の保存的バリアントであり、その結果、それは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４において５０以下の保存性アミノ酸置換、例えば２以下、５以下、１０以下、２０以下又は５０以下の保存性アミノ酸置換を含む。別の実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４で示されるアミノ酸配列から成るアミノ酸配列を有する。

ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドの断片及び変異体は、分子技法を用いて、当業者により容易に調製され得る。一実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドの断片は、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドの少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０又は少なくとも５００の連続アミノ酸を含む。さらなる実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４の断片は、関心のある細胞中へと移行される場合、ＺＳＣＡＮ４の機能を付与する断片である。

ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドの一次アミノ酸配列のマイナー修飾は、本明細書に記載される修飾されていない対応ポリペプチドに比較して、実質的に同等の活性を有するペプチドをもたらすことができる。このような修飾は、部位特異的突然変異誘発によるものとして考えられても、又は自発的であるものとしても考えられる。それらの修飾により産生されるペプチドのすべては、本明細書に含まれる。

当業者は、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチド及び関心のある第二のポリペプチドを含む融合タンパク質を容易に産生できる。場合により、リンカーが、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドと、興味ある第ニポリペプチドとの間に含まれ得る。融合タンパク質としては、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチド及びマーカータンパク質を含むポリペプチドを挙げることができるが、但しそれだけには限定されない。一実施形態によれば、マーカータンパク質を用いて、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドを同定するか又は精製できる。典型的な融合タンパク質として、緑色蛍光タンパク質、６種のヒスチジン残基、又はｍｙｃ及びＺＳＣＡＮ４ポリペプチドを挙げることができるが、それらだけには限定されない。

当業者は、開示される方法のために有用なＺＳＣＡＮ４のそのような変異体、断片及び融合体は、ＺＳＣＡＮ４活性を保持するそれらであることを理解する。

Ｂ．ＺＳＣＡＮ４核酸配列
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドをコードする核酸分子は、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド又は核酸分子と呼ばれる。それらのポリヌクレオチドは、ＺＳＣＡＮ４タンパク質をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む。ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドもまた、それらが認識されるＺＳＣＡＮ４活性、例えば、ＥＳ細胞におけるゲノム安定性又はテロメア長をモジュレートする能力を有するポリペプチドをコードする限り、本明細書に包含されることが理解される。ポリヌクレオチドは、遺伝子コードの結果として縮重している配列を含む。２０の天然アミノ酸が存在し、それらのほとんどは１以上のコドンにより特定される。したがって、すべての縮重ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列によりコードされるＺＳＣＡＮ４ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変更されない限り、包含される。ＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるように、ＺＳＣＡＮ４ポリペプチドをコードする。本明細書に提供される方法を用いて、細胞において発現されるか、又は細胞又は組織に送達されるＺＳＣＡＮ４コードする典型的なポリヌクレオチド配列は、配列番号１ (ヒト ＺＳＣＡＮ４)、配列番号３ (Ｚｓｃａｎ４ａ)、配列番号５ (Ｚｓｃａｎ４ｂ)、配列番号７ (Ｚｓｃａｎ４ｃ)、配列番号９ (Ｚｓｃａｎ４ｄ)、配列番号１１ (Ｚｓｃａｎ４ｅ)、及び配列番号１３ (Ｚｓｃａｎ４ｆ)として配列表に示される。

他の種からのＺＳＣＡＮ４核酸配列、例えばイヌＺＳＣＡＮ４ (ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号ＸＭ＿５４１３７０ 及びＸＭ＿８４８５５７);ウシＺＳＣＡＮ４ (ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号ＸＭ＿００１７８９２５０);及びウマ ＺＳＣＡＮ４ (ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号ＸＭ＿００１４９３９４４)は公的に入手できる。上記に列挙されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号の個々は、それが２０１１年１月１４日におけるＧｅｎＢａｎｋデータベースで見られるように、参照により本明細書に組み込まれる。

ある実施形態によれば、本明細書において提供される方法に従って細胞（例えば、膵臓細胞）において発現されるか又はその細胞に送達されるＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である。ある実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３で示される核酸配列を含む。ある実施形態によれば、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３で示される核酸配列から成る。

ＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチドの断片及び変異体は、分子技法を用いて、当業者により容易に調製され得る。一実施態様によれば、ＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチドの断片は、ＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチドの少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個又は少なくとも２０００個の連続核酸を含む。さらなる実施形態によれば、ＺＳＣＡＮ４の断片は、興味ある細胞において発現される場合、ＺＳＣＡＮ４の機能を付与する断片である。

ＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド配列のマイナーな修飾は、本明細書に記載される修飾されていない対応ポリヌクレオチドに比較して、実質的に同等の活性を有するペプチドの発現をもたらすことができる。そのような修飾は、部位特異的突然変異誘発によるものとして考えられても、又は自発的であっても良い。それらの修飾により生成されるポリヌクレオチドのすべては、本明細書に包含される。

Ｃ．ＺＳＣＡＮ４をコードするベクター
ＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチドは、ベクター中に；自律的に複製するプラスミド又はウィルス中に；又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれるか、又は他の配列とは無関係に独立した分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する組み換えＤＮＡを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのヌクレオチドの修飾形であり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖を含む。

上記いくつかのＺＳＣＡＮ４核酸及びタンパク質配列の提供により、標準的な実験技法を用いて、細胞（例えば、膵臓細胞）におけるいずれかのＺＳＣＡＮ４タンパク質（例えば、異種ＺＳＣＡＮ４タンパク質）の発現が可能となる。ある例によれば、ＺＳＣＡＮ４核酸配列はプロモーターの制御下にある。ある例によれば、ベクター系、例えばプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物性ウィルス及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が、ＺＳＣＡＮ４を発現するために使用される。それらのベクターはその後、膵臓細胞中に導入され得る。

ＺＳＣＡＮ４コード配列は、異種プロモーターに操作可能に連結され、ＺＳＣＡＮ４コード核酸配列の転写へと向かう。プロモーターは、転写の開始部位近くの必要な核酸配列、例えばポリメラーゼII型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ要素を含む。プロモーターはまた、場合により、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置する遠位エンハンサー又はリプレッサー要素を含む。１つの例によれば、プロモーターは、構成プロモーター、例えばＣＡＧ−プロモーター（Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991）、又はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）−プロモーターである。別の例によれば、プロモーターは、誘発性プロモーター、例えばテトラサイクリン誘発性プロモーターである（Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005）。ＺＳＣＡＮ４発現を駆動するために使用され得る他の典型的なプロモーターは、次のものを含むが、それらだけには限定されない：ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ｔａｃシステム、ｔｒｃシステム、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、バキュロウィルス及びシミアンウィルス由来のプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター、酵母酸性ホスホターゼのプロモーター、及び酵母α−核合因子のプロモーター。ある例によれば、天然のＺＳＣＡＮ４プロモーターが使用される。

ベクター系を用いて、ＺＳＣＡＮ４を発現できる。細胞においてＺｓｃａｎ４を発現するために使用され得る典型的なベクターとしては、プラスミド及びウィルスベクターを挙げることができるが、それらだけには限定されない。１つの例によれば、ＳＶ４０のプロモーター及びエンハンサー領域、ラウス肉腫ウィルスの長い末端反復体（ＬＴＲ）、及びＳＶ４０からのポリアデニル化及びスプライシングシグナルを含むベクター（Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072-6; Gorman et al, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:6777-81）から使用される。１つの例によれば、ベクターは、ウィルスベクター、例えばアデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）（米国特許第４，７９７，３６８号（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）及びMclaughlin et al．（J．Virol．62：１９６３−７３、1988）に記載される）、例えばタイプ４ＡＡＶ（Chiorini et al. J. Virol. 71:6823-33, 1997）及びタイプ５ＡＡＶ（Chiorini et al. J. Virol. 73:1309-19, 1999）、又はレトロウィルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、及びレトロウィルス、例えばラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウィルス、鳥類白血病ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス、及び乳腺腫瘍ウィルス由来のベクター）である。他のウィルストランスフェクション系、例えばワクシニアウィルス（Moss et al, 1987, Annu. Rev. Immunol. 5:305-24）、ウシ乳頭腫ウィルス（Rasmussen et al, 1987, Methods Enzymol 139:642-54）又はヘルペスウィルス群のメンバー、例えばエプスタイン・バー・ウィルス（Margolskee et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:2837-47）がまた、使用され得る。さらに、ベクター（したがって、ＺＳＣＡＮ４核酸）の安定した長期発現を示す、トランスフェクトされた細胞の選択を可能にするために、抗生物質選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はミコフェノール酸）を含むことができる。

Ｄ．ＺＳＣＡＮ４タンパク質及び核酸の送達のためのナノ粒子
ナノ粒子は、カプセル封入された薬物、例えば合成小分子、タンパク質、ペプチド、細胞及び核酸基材の急速又は調節された放出のための生物薬物を担持するサブミクロン（約１０００ｎｍ以下）のサイズの薬物送達ビヒクルである。種々の分子（例えば、タンパク質、ペプチド及び核酸分子）が、当業界においてよく知られている方法を用いて、ナノ粒子に効果的にカプセル封入され得る。

本明細書に記載される方法による使用のためのナノ粒子は、いずれかのタイプの生物適合性ナノ粒子、例えば生物分解性ナノ粒子、例えばポリマーナノ粒子、例えばポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルケン、ポリビニルエーテル及びセルロースエーテルナノ粒子であり得る。ある実施形態によれば、ナノ粒子は、生物適合性及び生物分解性材料から製造される。ある実施形態によれば、ナノ粒子は、ポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸）、又はポリ（乳酸）及びポリ（グリコール酸）の両者を含むが、但しそれらだけには制限されない。特定の実施形態によれば、ナノ粒子はＤ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である。

ＰＬＧＡは、吸収性縫合糸及び生物分解性インプラントとして使用されてきた、ＦＤＡ承認を受けた生物材料である。ＰＬＧＡナノ粒子はまた、多くの投与経路、例えば皮下、静脈内、眼球、経口及び筋肉投与を通して種々の薬物のための薬物送達システムにも使用されてきた。ＰＬＧＡはそのモノマー構成成分、すなわち乳酸及びグリコール酸に分解し、それらの成分は代謝の天然の副産物であり、前記材料を高い生物分解性にする。さらに、ＰＬＧＡは、ナノ粒子の合成のための臨床グレードの材料として市販されている。

他の生物分解性ポリマー材料、例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）及びポリグリコリド（ＰＧＡ）が、本明細書に記載される組成物及び方法への使用のために検討される。追加の有用なナノ粒子としては、生物分解性ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子を挙げることができる（Vauthier et al., Adv. Drug Del. Rev. 55: 519-48, 2003）。

ヒト用途のために現在使用されている生物分解性ポリマーの中で、ＰＬＡ、ＰＧＡ及びＰＬＧＡは、それらが無害な乳酸及びグリコール酸へのインビボ加水分解を受けるので、一般的に安全であることが知られている。それらのポリマーは、手術後の除去が必要とされない縫合糸の製造に、及びヒト使用のためにＦＤＡにより承認されている、カプセル封入された酢酸ロイプロリドの配合に使用されてきた（Langer and Mose, Science 249:1527, 1990; Gilding and Reed, Polymer 20:1459, 1979; Morris, et ai, Vaccine 12:5, 1994）。それらのポリマーの分解速度は、グリコリド／ラクチド比及びその分子量により変化する。したがって、カプセル封入された分子（例えば、タンパク質又はポリペプチド）の放出は、ポリマーの分子量及びグリコリド／ラクチド比、並びに粒度及びカプセル配合物の被膜の厚さを調節することにより、数ヶ月にわたって持続され得る（Holland, et ai, J. Control. Rel. 4:155, 1986）。

ある実施形態によれば、本明細書に記載される組成物及び方法への使用のためのナノ粒子は、直径約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍのサイズの範囲である。ある場合、ナノ粒子は約６００ｎｍ以下である。ある実施形態によれば、ナノ粒子は直径約１００〜約６００ｎｍである。ある実施形態によれば、ナノ粒子は直径約２００〜約５００ｎｍである。ある実施形態によれば、ナノ粒子は直径約３００〜約４５０ｎｍである。当業者は、ナノ粒子のサイズが、調製方法、臨床応用及び使用される撮像物質に依存して変化できる。

種々のタイプの生物分解性及び生物適合性ナノ粒子、そのようなナノ粒子、例えばＰＬＧＡナノ粒子の製造方法、及び種々の化合物、例えばタンパク質及び核酸のカプセル封入方法は、当業界においてよく知られている（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８０７４号、第２００７／００９２５７５号、及び第２００６／０２４６１３９号；米国特許第５，７５３，２３４号及び第７，０８１，４８９号；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０５２２８５号を参照のこと）。

以下の実施例は、ある特定の特徴及び／又は実施形態を例示するために提供される。それらの実施例は、記載される特定の特徴又は実施形態に本開示を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１：材料及び方法
この実施例は、実施例２に記載された試験のために使用される実験方法を記載する。

対象
外科的に切除された膵臓組織及び膵臓生検サンプルを、免疫組織化学的分析のために使用した。胆道癌の治療のために切除された正常膵臓組織を用いた（ｎ＝３）。慢性アルコール性膵炎の治療のために切除された組織（ｎ＝３）を同様に用いた。自己免疫性膵炎を有する１８人の患者からの膵臓生検サンプルは、これまで報告されている（Ko et al, Gastroenterology 138:1988-1996, 2010）。全ての膵臓生検は悪性腫瘍を排除するために行われ、そして書面によるインフォームドコンセントは、手順の前、各患者から得られた。超音波内視鏡検査の視覚的ガイダンス（ＧＦ−ＵＣＴ２４０、Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で、膵臓組織を、１９−ゲージＴＲＵ−ＣＵＴ（商標）生検針（Ｗｉｌｓｏｎ−Ｃｏｏｋ Ｉｎｃ．）を用いて、膵体から得た。患者は自己免疫性膵炎についての次の２００６年改訂版日本臨床診断基準を満たした：膵臓の核酸性腫脹、主膵管の不規則な狭窄、及び自己抗体又は高ＩｇＧ（≧１８００ｍｇ／ｄｌ）／ＩｇＧ４濃度（≧１３５ｍｇ／ｄｌ）についての陽性試験。自己免疫性膵炎を有する１８人の患者のうち（Mizuno et al., J Gastroenterol 44:742-750, 2009）、３人の患者は、次の３種の異なった時点で悪性腫瘍を排除するために膵臓生検を行われた：診断の時点、コルチコステロイド治療の開始の３ヶ月後、及び治療の開始の１年後。経口コルチコステロイドについての標準プロトコールは次に応じて使用された：初期投与量として週３０ｍｇ／日でのプレドニソロン、第２週の２０ｍｇ／日、さらに４週間の１０ｍｇ／日、及び観察期間を通してすべて維持用量として５ｍｇ／日（Ko et al, Gastroenterology 138:1988-1996, 2010）。

免疫組織化学及び免疫蛍光
ヒト及びマウスの両膵臓を、１０％ホルマリンに固定し、そしてパラフィンに包埋した。包埋された組織を、５μｍで、ライカミクロトーム（Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany）により薄くスライスした。切片を脱パラフィン化し、透過性にし、そして免疫組織化学分析のために使用した。（Ko et al, Gastroenterology 138: 1988-1996, 2010）。この研究に使用される抗体は、表１に要約されている。

抗体を、製造業者の推薦に従って希釈した。免疫反応を、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ ＭＡＸ−ＰＯ (Nichirei Biosciences, Inc, Tokyo, Japan)を用いて強化した。免疫ラベリングを、ホースラディッシュペルオキシダーゼのための基質として３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）を用いて可視化した。切片をマイヤーヘマトキシリンで対比染色した。免疫蛍光に関しては、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標） ４８８ (緑色) 又はＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）５９６ (赤色)によりラベルされた二次抗体を、二重染色のために使用した。免疫ラベリングを、オリンパス蛍光顕微鏡（ＡＸ８０：Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２により対比染色した。

材料
分子生物学グレードのすべての試薬は、特に断らない限り、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。

実施例２：成人ヒト膵臓におけるＺＳＣＡＮ４により標識された前駆体／幹細胞
この実施例は、少数のＺＳＣＡＮ４陽性細胞が、成人膵臓のランゲルハンス島、腺房及び膵管に位置する細胞間に存在するという発見を記載している。この実施例に記載される結果は、ＺＳＣＡＮ４発現が、成人ヒト膵臓において希少な幹／前駆細胞のマーカーであることを示唆する。

成人ヒト膵臓におけるＺＳＣＡＮ４の発現及び局在化
ヒトＺＳＣＡＮ４に対して生じた特異的抗体による免疫染色は、大部分のヒト膵臓組織がＺＳＣＡＮ４染色に対して陰性であるが、しかし少数の細胞がＺＳＣＡＮ４に対して強い核染色を示したことを表した（図１Ａ）。より特定には、ヒト膵臓の内分泌部分において、大部分のランゲルハンス島がいずれのＺＳＣＡＮ４染色も示さず、そしていくらか（＜１％）のランゲルハンス島がＺＳＣＡＮ４染色を示し；強い核染色を有する少数の細胞及び残存細胞のいくらかが弱い細胞質染色を示した（図１Ｂ）。ヒト膵臓の外分泌部分においては、大部分の腺房細胞はいずれのＺＳＣＡＮ４染色も示さず、そしていくらか（＜１％）の腺房細胞は、少数の細胞において時折強い核染色を伴って、弱いＺＳＣＡＮ４染色を示した（図１Ｃ）。さらに、少数のＺＳＣＡＮ４陽性（ＺＳＣＡＮ４⁺）細胞がまた、膵管に見出された（図１Ｄ）。ＺＳＣＡＮ４はまた、膵臓腺房間の領域に位置する卵形細胞にも発現された（図１Ｅ）。それらの位置及び細胞形態から、それらの卵形細胞（仮に、「膵臓卵形細胞」と呼ばれる）は、１つの形の膵臓星状細胞として同定され得る（Bachem et al, Gastroenterology 115:421-432, 1998; Apte et al, Gut 43:128-133, 1998）。

ヒトＺＳＣＡＮ４抗体の検証として、ヒトＺＳＣＡＮ４及びマウスＺＳＣＡＮ４に対する両抗体がヒト（図１Ｆ〜１Ｈ及び図１Ａ〜Ｃ）又はマウス（図６Ｄ〜６Ｌ）膵臓切片のいずれか上でほぼ同一の細胞を示したことが観察された。マウスＺＳＣＡＮ４は多能性ＥＳ細胞についての特異的マーカーであり（Falco et al, Dev Biol 307:539-550, 2007; Carter et al, Gene Expr Patterns 8:181-198, 2008）、そしてマウスＥＳ細胞におけるゲノム安定性に関与する（Zalzman et al, Nature 464:858-863, 2010）ので、それらの免疫組織学的データは、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞が膵臓組織幹細胞のための優れた候補であることを示している。そのことは以前から推定されてきたが、まだ発見されていなかった（Aguayo-Mazzucato et al, Nat Rev Endocrinol 6: 139-148, 2010）。

ヒト膵臓におけるＬＧＲ５及びＢＭＩ１の発現及び局在化
膵臓におけるＺＳＣＡＮ４⁺細胞をさらに調べるために、マウスにおいて組織幹細胞マーカーとして十分に確立されている次の２種の他のタンパク質を選択した：ポリコーム環フィンガー腫瘍遺伝子（ＢＭＩ１）及びロイシンに富んでいる反復体含有Ｇ−タンパク質共役型受容体５（ＬＧＲ５）。ＢＭＩ１は、成熟マウス造血幹細胞の効果的自己再生細胞分裂のために必要である（Raaphorst, Trends Immunol 24:522-524, 2003）。単一のＢＭＩ１発現細胞が、腸上皮における全ての細胞系統を形成することが示されており（Ootani et al, Nat Med 15:701-706, 2009）、そしてＢＭＩ１系統のトレーシングは、膵臓器官ホメオスタシスが可能な自己再生膵臓腺房細胞を同定した（Sangiorgi and Capecchi, Proc Natl Acad Sci USA 106:7101-7106, 2009）。ＬＧＲ５はいくつかの器官において発現され（Barker and Clevers, Gastroenterology 138:1681-1696, 2010）、そしてＬＧＲ５⁺細胞の遺伝子マーキングがマウスにおける腸及び皮膚組織幹細胞のためのマーカーとしてこの膜タンパク質を同定している（Barker et al, Nature 449:1003-1007, 2007; Snippert et al, Science 327:1385-1389, 2010）。

免疫組織化学的分析は、ＢＭＩ１及びＬＧＲ５の両者が、ランゲルハンス島（それぞれ、図２Ａ及び２Ｄ）、膵管細胞（それぞれ、図２Ｂ及び２Ｅ）、膵臓腺房細胞（それぞれ、図２Ｃ及び２Ｄ）、及び隣接する腺房間に位置する膵臓卵形細胞（それぞれ、図２Ｃ及び２Ｆにおける星印）の少数の内部細胞に検出されたことを示した。結果的に、ＺＳＣＡＮ４⁺、ＢＭＩ１⁺及びＬＧＲ５⁺細胞の局在化はお互い類似し；しかしながら、一般的に、ＢＭＩ１⁺及びＬＧＲ５⁺細胞はＺＳＣＡＮ４⁺細胞よりも豊富であった。

ヒト膵臓におけるＺＳＣＡＮ４、ＢＭＩ１及びＬＧＲ５により同時染色された細胞の存在
ＺＳＣＡＮ４、ＢＭＩ１及びＬＧＲ５が同じ細胞において発現されるかどうかを試験するために、免疫蛍光による二重染色を、同じ一連のヒトパラフィン切片において実施した。ＢＭＩ１を発現する細胞及びＬＧＲ５を発現する細胞は、わずかに多くのＬＧＲ５⁺細胞がＢＭＩ１⁺細胞よりも認められているが、ヒト膵臓切片においてはほとんどオーバーラップした（図２Ｇ〜２Ｊ）。対照的に、ＺＳＣＡＮ４発現は、ＬＧＲ⁺細胞のサブセット（５〜１０％）においてのみ見出された（図２Ｋ〜２Ｎ）。それらの結果は、マウスＥＳ細胞においてＺＳＣＡＮ４タンパク質の発現パターンと良好に一致し、ここでＺｓｃａｎ４は過渡的に発現され、そしてＥＳ細胞のわずか約５％が所定の時点でＺｓｃａｎ４に対して陽性である（Zalzman et al, Nature 464:858-863, 2010）。用語「ＢＭＩ１⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-」は、ＢＭＩ１及びＬＧＲ５の同時発現により示され、そしてＺＳＣＡＮ４を断続的に発現する能力を有する細胞を示すために使用される。

ＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞は膵臓内分泌ホルモンも外分泌酵素アミラーゼも発現しない
ＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞が分化された細胞の表現型を有するかどうかを試験するために、蛍光ベースの共染色を、ＬＧＲ５に対する抗体及び内分泌ホルモン又は外分泌酵素アミラーゼの１つに対する抗体の組合せにより実施した。

膵島においては、ＬＧＲ５⁺細胞は、インスリン（図３Ａ〜３Ｄ及び３Ａ〜８Ｃ）、グルカゴン（図７Ａ〜７Ｄ及び８Ｄ〜８Ｆ）、ソマトスタチン（図７Ｅ〜７Ｈ及び８Ｇ〜８Ｉ）及びグレリン（図７Ｉ〜７Ｌ及び８Ｊ〜８Ｌ）に関してすべて陰性であった。それらの内分泌ホルモンの発現の欠如は、それらのＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞がランゲルハンス島に位置する既知の分化された細胞に属してないことを示唆し、このことは、新規細胞型、おそらく組織幹／前駆細胞の存在を示唆する。少数の内分泌ホルモン発現細胞をまた、膵管（図８Ｃ、８Ｆ、８Ｉ及び８Ｌ）及び膵臓腺房（図８Ｂ、８Ｅ、８Ｈ及び８Ｋ）において観察され、これは以前の報告と一致している（Bertelli and Bendayan, Am J Physiol 273:C1641-1649, 1997）（図９Ｄ〜９Ｆ）。

膵臓腺房においては、ＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞は、膵臓外分泌細胞のための消化酵素アミラーゼ−特異的マーカーに対して陰性であり（図３Ｅ−３Ｈ）、このことは、膵臓腺房に新規細胞型、おそらく組織幹／前駆細胞の存在を示唆する。

膵管及び腺房間の間質中のいくつかのＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞におけるＡＱＰ１、ＣＦＴＲ及びＣＤ１６３の発現
アクアポリン１水チャネル（ＡＱＰ１）及び嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）クロライドチャンネルの両者が、ヒト膵管の形質膜で発現され、そして成熟膵管細胞についてのマーカーとして使用され得る（図４Ａ及び図１０Ａ）（Ko et al, Gastroenterology 138:1988-1996, 2010）。膵島及び腺房における細胞に比較して、膵管に位置する少数のＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞はまた、ＡＱＰ１に対して陽性であった（図４Ａ及び図４Ｄ〜４Ｇ）。膵臓星状細胞はＡＱＰ１に対して陽性であるが、しかしＣＦＴＲに対して陽性ではなかったことがまた見出された（図４Ｂ及び４Ｃ）。他方では、膵臓卵形細胞は、ＡＱＰ１及びＣＦＴＲの両者に対して陽性であった（図４Ｃ及び図１０Ｂ及び１０Ｃ）。膵臓卵形細胞及び膵臓星状細胞のほとんどは、造血幹細胞マーカーＣＤ１６３に対して陽性であった（図４Ｌ）。膵臓星状細胞と造血幹細胞との間に関連性が存在することは推定されている（Sparmann et al, Cell Res 20:288-298, 2010）。さらに、いくつかのＣＤ１６３⁺細胞もまた、膵管において（図４Ｍ）及び膵管周囲に、特にいくつかの膵管近くの基底膜（図４Ｎ）に見出された。免疫組織化学的分析がまた、表２に要約される。

慢性膵炎におけるＺＳＣＡＮ４⁺細胞の増殖
次に、ＺＳＣＡＮ４発現を、コルチコステロイドホルモンによる３ヶ月間、患者を治療した後、慢性炎症から回復した膵臓組織により試験した（Ko et al, Gastroenterology 138:1988-1996, 2010）。影響されていない個々からの膵臓組織（図５Ａ）と比較して、ＺＳＣＡＮ４⁺の劇的な増加が慢性炎症、すなわち慢性アルコール性膵炎（図５Ｂ）及び自己免疫性膵炎（図５Ｃ及び５Ｄ）下での組織において観察された。ＺＳＣＡＮ４⁺細胞のさらなる上昇が、３ヶ月のコルチコステロイド治療の後、再生した膵臓組織において観察された（図５Ｅ）。前述したように、正常ヒト膵臓においては、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞は非常に希少であり、そして見つけるのはかなり難しく（図５Ａ）；しかしながら、再生した組織においては、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞は豊富に存在した（図５Ｅ）。それらのＺＳＣＡＮ４⁺細胞は、治療後１年で、消出し、そして正常レベルに戻った（図５Ｆ）。それらのデータは、膵臓組織の炎症及び再生がＺＳＣＡＮ４⁺細胞の上昇に伴い、このことは、組織再生へのＺＳＣＡＮ４⁺細胞の関与を示唆する。

議論
上記免疫組織化学分析は、幾つかの膵島、腺房、膵管及び腺房間の間質において、ＺＳＣＡＮ４、並びにＬＧＲ５及びＢＭＩ１の強い発現により特徴付けられる希少細胞を同定した。それらのデータは、それらの希少細胞が、いくつかの証拠に基づいて、成人ヒト膵臓における組織幹／前駆細胞であることを示す。

最初に、それらの細胞における幹細胞マーカー遺伝子（ＺＳＣＡＮ４、ＬＧＲ５及びＢＭＩ１）の同時発現が、希少ではあるが、それらの細胞が実在し、そして幹細胞の特徴を有する、という強い示唆を提供する。膵臓組織におけるそれらの希少な存在はまた、膵臓が活性組織ターンオーバー／再生を有さない器官である概念と一致する（Barker and Clevers, Gastroenterology 138:1681-1696, 2010）。さらに、所定の時点でのわずか約５％の未分化マウスＥＳ細胞における、マウスＳｃａｎ４の強い発現と一致して（Zalzman et al, Nature 464:858-863, 2010）、１０％未満のＬＧＲ５陽性細胞がＺＳＣＡＮ４に対して陽性である。膵臓におけるＺＳＣＡＮ４発現のこの強く且つ特有なパターンは、ＥＳ細胞に類似する機能、すなわち膵臓におけるテロメア及びゲノム安定性を維持する特有のメカニズムの存在を示唆する。発明者の以前の研究は、２−細胞胚及び亜集団の未文化マウスＥＳ細胞においてのみのマウスＺｓｃａｎ４の発現を示してきたので（Falco et al., Dev Biol 307:539-550, 2007）、この開示は、ヒト組織及び成人組織／器官におけるＺＳＣＡＮ４発現の最初の実証を提供する。

第二に、腺房及び膵島における他の分化細胞間に位置するＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞における分化マーカー、例えばアミラーゼ及び膵臓ホルモンの欠如は、それらの細胞が未分化幹／前駆細胞であることを強く示唆する。対照的に、膵管に位置するＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞は、分化を示す遺伝子である、ＡＱＰ１及びＣＦＴＲを発現する。膵管に位置するＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞の特定の特徴は、その膵管細胞がしばしば、膵臓での潜在的な幹／前駆細胞として選抜されている事実に関連しているかもしれない（Bonner-Weir et al, Pediatr Diabetes 5 Suppl 2:16-22, 2004）。

第三に、ＺＳＣＡＮ４⁺細胞の数は、慢性炎症に起因する腺房の大量の消耗からコルチコステロイド治療の後に再生される膵臓組織において劇的に上昇し、続いて、１年間の治療の後、正常レベルまで急激に減少する。これは、膵臓再生の間、ＺＳＣＡＮ４⁺組織幹細胞プールの上昇、又はＺＳＣＡＮ４⁺推定組織幹細胞からの分化の直後の細胞におけるＺＳＣＡＮ４タンパク質の連続した存在のいずれかを示唆する。慢性膵炎におけるＺＳＣＡＮ４⁺の有意な上昇の観察は、炎症に対する免疫抑制療法による膵臓実質の再生への膵臓幹／前駆細胞の役割を示唆する。

第四に、ＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞はまた、隣接する膵臓腺房又は周囲の膵管間にも位置する。ＡＱＰ１及び造血幹細胞マーカーＣＤ１６３のそれらの位置及び発現に基づいて、それらの卵形状のＺＳＣＡＮ４細胞は、膵臓星状細胞に関連し（Apte et al, Gut 43: 128-133, 1998）、これらは慢性炎症での膵線維症に関連すると思われる（Masamune et al, Clin Gastroenterol Hepatol 7:S48-54, 2009）。そしてそれらの少なくともいくらかは、骨髄由来の幹／前駆細胞であると思われる（Sparmann et al, Cell Res 20:288-298, 2010; Marrache et al, Gut 57:1113-1120, 2008）。膵臓星状細胞のいくらかは、β様細胞を産生できる前駆細胞である最近の実証（Mato et al. , Biochem J 421:181-191, 2009）は、それらの細胞が膵臓星状細胞のための場所に位置する卵形状のＢＭＩｌ⁺ＬＧＲ５⁺ＺＳＣＡＮ４^+&-細胞とオーバーラップすることを示唆する。

機能的に不十分な量のインスリン産生膵臓β細胞が存在する場合に、１型糖尿病及び一部の２型糖尿病は発生する。糖尿病は、細胞置換療法のための十分なβ細胞を得る手段を見出すことが可能である場合、治癒され得る。死体膵島、ヒトＥＳ細胞、及び誘発された多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、移植のためのβ細胞源として良好な候補であると思われるが（Bonner-Weir and Weir, Nat Biotechnol 23:857-861, 2005）、好結果をもたらすβ細胞置換療法が利用できる前、克服するための大きな障害が存在する。本明細書に開示される膵臓幹／前駆細胞は、超音波誘導ＴＲＵ−ＣＵＴ（商標）生検による膵臓組織の小片を得ることが可能であるので（Mizuno et al , J Gastroenterol 44:742-750, 2009）、分化β細胞の新しい源として役立ち得る。

実施例３：ＺＳＣＡＮ４及び幹細胞マーカーＳＳＥＡ３の同時発現
セルレイン誘発された実験的膵炎が膵炎のためのモデルとして広く使用されてきた。ＺＳＣＡＮ４及び他のマーカー、例えば段階−特異的胚抗原−３（ＳＳＥＡ３）、炭水化物エピトープ及び既知幹細胞マーカーの発現パターンを、膵炎を受けている膵臓組織において実験した。免疫組織化学染色を、Ｚｓｃａｎ４、ＳＳＥＡ３、ＬＧＲ５及びＢＭＩ１の発現を評価するために実施した。図１１に示されるように、ＳＳＥＡ３はＺｓｃａｎ４と類似する（但し、同一ではない）発現パターンを示す。したがって、それらの結果は、ＳＳＥＡ３が、場合によっては、ＺＳＣＡＮ４発現細胞のマーカーとして及び／又はＺＳＣＡＮ４⁺細胞の富化手段として使用され得ることを示唆する。

開示される発明の原理が適用され得る多くの可能性ある実施形態を考慮して、例示される実施形態は本発明の単なる例であり、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、次の請求項により定義される。したがって我々は、それらの請求項の範囲及び趣旨内にある全てを我々の発明として主張する。

Claims (21)

1. 膵臓組織を含むサンプルからの膵臓幹細胞若しくは膵臓前駆細胞、又はそれらの両者の単離方法であって、
   （ｉ）前記サンプルの細胞中におけるＺＳＣＡＮ４の発現を検出し；そして
   （ｉｉ）ＺＳＣＡＮ４を発現する細胞を単離し、それにより、前記サンプルから膵臓幹細胞若しくは膵臓前駆細胞、又はそれらの両者を単離すること
   を含んで成る、前記方法。
2. ＺＳＣＡＮ４の発現の検出が、ＺＳＣＡＮ４と同時発現される遺伝子の発現を検出することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
3. ＺＳＣＡＮ４と同時発現される前記遺伝子が、ＳＳＥＡ３又はＴｃｓｔｖ１／３である、請求項２に記載の方法。
4. ＺＳＣＡＮ４の発現の検出が、ＺＳＣＡＮ４によりコードされるタンパク質に対して特異的な抗体、又はＺＳＣＡＮ４により同時発現される遺伝子によりコードされるタンパク質に対して特異的な抗体と、前記サンプルとを接触させることを含んで成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記抗体が、ＺＳＣＡＮ４によりコードされるタンパク質に対して特異的である、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗体が、ＳＳＥＡ３によりコードされるタンパク質に対して特異的である、請求項４に記載の方法。
7. 前記抗体が、Ｔｃｓｔｖｌ／３によりコードされるタンパク質に対して特異的である、請求項４に記載の方法。
8. ＺＳＣＡＮ４の発現の検出が、レポーター遺伝子又は選択マーカーに操作可能に連結されたＺＳＣＡＮ４プロモーターを含むベクターを用いて、サンプル中の細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＺＳＣＡＮ４プロモーターがマウスＺｓｃａｎ４ｃプロモーターである、請求項８に記載の方法。
10. 前記Ｚｓｃａｎ４ｃプロモーターが、配列番号１５のヌクレオチド９０６〜４４６８として示される核酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質又はその変異体である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ベクターが、配列番号１５として示される核酸配列を含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記抗生物質耐性遺伝子が、ピューロマイシン耐性遺伝子である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記サンプルが、生検により得られるヒト膵臓組織を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. サンプルの細胞中において、ＬＧＲ５若しくはＢＭＩ１、又はそれらの両者の発現を検出し、そして、ＬＧＲ５若しくはＢＭＩ１、又はそれらの両者を発現する細胞を単離することをさらに含んで成る、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 対象における糖尿病を治療するためのインビトロでＺＳＣＡＮ４を発現する膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞を含んでなる医薬であって、当該膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞は下記のステップを含む方法で調製され：
    i)前記膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞を単離するステップ、ここで前記膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞の単離はＺＳＣＡＮ４を発現する膵臓組織中の細胞を検出するステップを含む；
    ii)インビトロでＺＳＣＡＮ４を発現する膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞を増殖させるステップ、
    ここで前記増殖された膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞は前記対象に移植され、それにより、前記対象における糖尿病を治療する、
    前記医薬。
19. 前記ステップ(i)の膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞が、治療される対象から単離された細胞である、請求項１８に記載の医薬。
20. 前記膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞が、前記対象へ前記細胞を移植する前に、膵臓β細胞へ分化される、請求項１８又は１９に記載の医薬。
21. 対象における糖尿病を治療するためのＺＳＣＡＮ４を発現する膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞を含んでなる医薬であって、当該ＺＳＣＡＮ４を発現する膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞は下記のステップを含んでなる方法により膵臓組織を含むサンプルから単離され：
    （ｉ）前記サンプルの細胞中におけるＺＳＣＡＮ４の発現を検出し；そして
    （ｉｉ）ＺＳＣＡＮ４を発現する細胞を単離し、それにより、前記サンプルから膵臓幹細胞若しくは膵臓前駆細胞、又はそれらの両者を単離するステップ；
    ここで前記膵臓幹細胞又は膵臓前駆細胞は前記対象に移植され、それにより、前記対象における糖尿病を治療する、前記医薬。

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