JP6301199B2 - 細胞評価装置および方法並びにプログラム - Google Patents

Description

本発明は、細胞群を撮像した細胞画像内における個々の細胞を評価する細胞評価装置および方法並びにプログラムに関するものである。

従来、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＳＴＡＰ細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを培養して顕微鏡で撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の状態を評価する方法が提案されている。

ここで、培養された細胞は、培養が進むにつれてコロニー化するまでに至り、大面積に増殖する。細胞のサイズはマイクロメートルのオーダーであり、コロニーのサイズは数ミリ〜数センチのオーダーまでに至る。

このようにコロニー化した細胞群を評価する際、コロニー内の個々の細胞を評価することが重要である。たとえば、再生医療の移植過程において未分化細胞が混在していた場合がん化する可能性があり、また、多能性幹細胞を増殖させて継代する際などには、未分化細胞のみを切り出す必要がある。

個々の細胞を評価する方法として、たとえば特許文献１においては、個々の細胞について、細胞核の内側の光路長と外側の光路長とを比較し、その比較結果に基づいて、個々の細胞が良い幹細胞であるか否かを評価する方法が提案されている。また、特許文献１には、細胞コロニーの中で良い幹細胞が密集している領域を品質の良い領域として設定することが提案されている。

また、特許文献２においては、個々の細胞の画像から算出された特徴量と、予め学習された学習パラメータとに基づいて、個々の細胞が有核赤血球（ＮＲＢＣｓ）であるか否かを識別する方法が提案されている。

特開２０１２−２３１７０９号公報 特開２０１４−３９５０４号公報

しかしながら、上述したように顕微鏡により細胞群を撮像した細胞画像に基づいて、個々の細胞を評価する際、細胞画像内における各細胞の画像のみを用いて評価したのでは、その細胞の画像の鮮明度などによっては適切に評価できない場合がある。

一方、細胞は、周囲の細胞と係わり合いを持ちながら成長し、細胞単体で固有の特性を獲得するのではなく、周囲の細胞群と同等の特性をもつ傾向がある。図１３は、コロニー化している細胞群の細胞画像の一部を拡大したものであり、実線で囲まれた範囲が個々の細胞である。図１３に示すように、類似した形状の細胞が周囲に集まる傾向がある。

そこで、所定の評価対象の細胞を評価する際、その評価対象の細胞の周囲の細胞の評価結果を考慮することが考えられる。

しかしながら、たとえば図６に示すように、評価対象の細胞が、未分化状態の細胞が分布する領域と分化状態の細胞が分布する領域との境界近傍に存在する場合には、評価対象の細胞の周囲の細胞として分化状態の細胞と未分化状態の細胞との両方が混在することになり、評価対象の細胞の未分化状態または分化状態が適切に評価されない場合がある。

本発明は、上記の問題に鑑み、所定の評価対象の細胞をその周囲の細胞の評価結果を用いて評価する際、より高精度に評価対象の細胞を評価することができる細胞評価装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。

本発明の細胞評価装置は、細胞群を撮像した細胞画像を取得する画像取得部と、細胞群における評価対象の細胞とその評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、その周囲の細胞の評価結果に基づいて、評価対象の細胞を評価する細胞評価部と、細胞群の状態に基づいて、細胞画像に境界を設定する境界設定部とを備え、細胞評価部が、周囲の細胞を特定する際、境界によって分割される複数の分割領域のうち評価対象の細胞が存在する分割領域内に存在する細胞のみを周囲の細胞として特定するものであることを特徴とする。

また、上記本発明の細胞評価装置においては、細胞評価部において周囲の細胞の評価結果に基づいて評価対象の細胞を評価した際に評価不可能と判定された場合、その評価に用いられた細胞画像の撮像条件とは異なる撮像条件を取得する撮像条件取得部を設けることができる。

また、撮像条件として、撮像領域、露光時間、光学倍率、照明光波長または観察光波長を含むことができる。

また、細胞評価部は、評価対象の細胞の評価を行う際に特定した周囲の細胞が存在する領域に対して識別情報を付加することができる。

また、撮像条件取得部は、識別情報が付加された領域の細胞画像に基づいて、撮像条件を取得することができる。

また、撮像条件取得部によって取得された撮像条件を表示させる表示制御部を設けることができる。

また、撮像条件取得部によって取得された撮像条件に応じた撮像制御信号を出力する撮像制御部を設けることができる。

また、境界設定部は、細胞画像の輝度、空間周波数または色に基づいて境界を設定することができる。

また、境界設定部は、変曲点数または曲率が制限された境界を設定することができる。

本発明の細胞評価方法は、細胞群を撮像した細胞画像を取得し、細胞群における評価対象の細胞とその評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、その周囲の細胞の評価結果に基づいて、評価対象の細胞を評価する際、細胞群の状態に基づいて、細胞画像に境界を設定し、その境界によって分割される複数の分割領域のうち評価対象の細胞が存在する分割領域内に存在する細胞のみを周囲の細胞として特定することを特徴とする。

本発明の細胞評価プログラムは、コンピュータを、細胞群を撮像した細胞画像を取得する画像取得部と、細胞群における評価対象の細胞とその評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、その周囲の細胞の評価結果に基づいて、評価対象の細胞を評価する細胞評価部と、細胞群の状態に基づいて、細胞画像に境界を設定する境界設定部として機能させる細胞評価プログラムであって、細胞評価部が、周囲の細胞を特定する際、境界によって分割される複数の分割領域のうち評価対象の細胞が存在する分割領域内に存在する細胞のみを周囲の細胞として特定するものであることを特徴とする。

本発明の細胞評価装置および方法並びにプログラムによれば、細胞群を撮像した細胞画像を取得し、細胞群における評価対象の細胞とその評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、その周囲の細胞の評価結果に基づいて、評価対象の細胞を評価する際、細胞群の状態に基づいて、細胞画像に境界を設定し、その境界によって分割される複数の分割領域のうち評価対象の細胞が存在する分割領域内に存在する細胞のみを周囲の細胞として特定するようにしたので、たとえば上述したように周囲の細胞として未分化状態の細胞と分化状態の細胞とが混在することがなく、周囲の細胞として同様の特徴を有する細胞を特定することができるので、評価対象の細胞をより高精度に評価することができる。

本発明の細胞評価装置の第１の実施形態を用いた細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図 位相差顕微鏡の概略構成を示す図 未分化状態の幹細胞と分化状態の幹細胞を含む細胞群の細胞画像の一例を示す図 図３に示す細胞画像において設定された境界の一例を示す図 周囲の細胞の特定方法を説明するための図 周囲の細胞の特定方法を説明するための図 周囲の細胞の特定方法を説明するための図 評価対象の細胞の周辺領域のその他の設定方法を説明するための図 評価対象の細胞の周辺領域のその他の設定方法を説明するための図 本発明の細胞評価装置の第１の実施形態を用いた細胞培養観察システムの作用を説明するためのフローチャート 本発明の細胞評価装置の第２の実施形態を用いた細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図 本発明の細胞評価装置の第２の実施形態を用いた細胞培養観察システムの作用を説明するためのフローチャート 類似する細胞が分布した状態の細胞画像の一例を示す図

以下、本発明の細胞評価装置および方法並びにプログラムの第１の実施形態を用いた細胞培養観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。本発明は、細胞画像における個々の細胞の評価方法に特徴を有するものであるが、まず、第１の実施形態の細胞培養観察システムの全体構成について説明する。図１は、細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図である。

本実施形態の細胞培養観察システムは、図１に示すように、細胞培養装置１、撮像装置２と、細胞評価装置３と、ディスプレイ４と、入力装置５とを備えている。

細胞培養装置１は、細胞の培養を行うための装置である。培養対象の細胞としては、たとえばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞やＳＴＡＰ細胞といった多能性幹細胞や、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋、肝臓などの細胞や、がん細胞などがある。細胞培養装置１内には、培養対象の細胞を培地に播種した培養容器が複数収容されている。そして、細胞培養装置１は、ステージ１０と搬送部１１と制御部１２とを備えている。

ステージ１０は、撮像装置２による撮像対象の培養容器が設置されるものである。また、搬送部１１は、細胞培養装置１内の所定位置に収容されている複数の培養容器の中から撮像対象の培養容器を選択し、その選択した培養容器をステージ１０まで搬送するものである。

制御部１２は、細胞培養装置１全体を制御するものである。制御部１２は、培養容器の設置面における直交するＸ−Ｙ方向にステージ１０を移動させるものであり、この移動によって後述する位相差顕微鏡２０の撮像領域が変更される。

また、制御部１２は、上述したステージ１０や搬送部１１の動作以外に、細胞培養装置１内の温度、湿度およびＣＯ_２濃度などの環境条件を制御するものである。なお、温度、湿度およびＣＯ_２濃度を調整するための構成については、公知な構成を用いることができる。

撮像装置２は、ステージ１０に設置された培養容器内における細胞群の画像を撮像するものである。撮像装置２は、細胞群を撮像して細胞画像を出力する位相差顕微鏡２０と、位相差顕微鏡２０を制御する制御部２９とを備えている。

位相差顕微鏡２０は、ステージ１０上に設置された培養容器内の細胞の位相画像を撮像するものである。図２は、位相差顕微鏡２０の概略構成を示す図である。位相差顕微鏡２０は、図２に示すように、照明光を出射する照明光源２１と、リング形状のスリットを有し、照明光源２１から出射された照明光が入射されてリング状照明光を出射するスリット板２２と、スリット板２２から射出されたリング状照明光が入射され、その入射されたリング状照明光をステージ１０上に設置された培養容器１５内の細胞に対して照射する対物レンズ２３とを備えている。

そして、ステージ１０に対して照明光源２１とは反対側に、位相差レンズ２４と、結像レンズ２７と、撮像素子２８とが設けられている。

位相差レンズ２４は、対物レンズ２５と、位相板２６とを備えたものである。位相板２６は、リング状照明光の波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板２２のスリットの大きさは、この位相リングと共役な関係にある。

位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相差レンズ２４に入射された直接光は対物レンズ２５によって集光され、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、培養容器１５内の細胞によって回折された回折光は大部分が位相板の透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。

位相差レンズ２４は、図示省略した駆動機構によって図２に示す矢印Ａ方向に移動するものであり、このように位相差レンズ２４が移動することによってフォーカス位置が変更されてフォーカス制御が行われる。駆動機構は、制御部２９から出力されたフォーカス制御信号に基づいて位相差レンズ２４を移動させるものである。

また、本実施形態の位相差顕微鏡２０は、光学倍率の異なる複数の位相差レンズ２４を交換可能に構成されている。位相差レンズ２４の交換については、ユーザからの指示入力に応じて自動的に行う構成としてもよいし、ユーザが手動で交換するようにしてもよい。

結像レンズ２７は、位相差レンズ２４を通過した直接光および回折光が入射され、これらの光を撮像素子２８に結像するものである。撮像素子２８は、結像レンズ２７によって結像された像を光電変換することによって細胞の位相画像を撮像するものである。撮像素子２８としては、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。

なお、本実施形態においては、位相差顕微鏡を用いるようにしたが、これに限らず、たとえば明視野顕微鏡や微分干渉顕微鏡などを用いるようにしてもよい。

制御部２９は、撮像装置２全体を制御するものである。具体的には、制御部２９は、位相差顕微鏡２０の光学倍率、撮像素子２８の露光時間、照明光源の照明光波長、観察光波長などを制御するものである。照明光源の照明光波長については、たとえば照明光源がＬＥＤ（Light Emitting Diode）やＬＤ（Laser Diode）から構成されるものである場合には、その駆動電流を変更することによって照明光波長を変更するようにしてもよいし、また、照明光波長の異なる複数の照明光源を設け、これらの光源を切り替えることによって照明光波長を変更するようにしてもよい。また、観察光波長については、図示省略したフィルタや分光器などを用いて変更するようにすればよい。

細胞評価装置３は、コンピュータに対して本発明の細胞評価プログラムの一実施形態がインストールされたものである。

細胞評価装置３は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の細胞評価プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示すような画像取得部３０、境界設定部３１、細胞評価部３２および表示制御部３３が動作する。

画像取得部３０は、撮像装置２によって撮像された細胞群の細胞画像を取得して記憶するものである。本実施形態においては、位相差顕微鏡２０の光学倍率を４倍〜２０倍として細胞群を撮像した細胞画像を取得する。

境界設定部３１は、細胞画像における細胞群の状態に基づいて、細胞画像に境界を設定するものである。本実施形態の境界設定部３１は、具体的には、たとえば幹細胞の細胞群において、分化状態の幹細胞が分布する領域と未分化状態の幹細胞で分布する領域とがある場合、その分化領域と未分化領域とを判定し、分化領域と未分化領域との境界を設定するものである。

図３は、未分化状態の幹細胞と分化状態の幹細胞を含む細胞群の細胞画像の一例を示すものである。図３に示すように、未分化状態の幹細胞と分化状態の幹細胞とを比較すると、未分化状態の幹細胞の方が分化状態の幹細胞よりも円形度が高く、分化状態の幹細胞の方が未分化状態の幹細胞よりも細長く最大径が大きい。

したがって、このような分化状態の幹細胞と未分化状態の幹細胞の形状の違いに着目し、境界設定部３１は、細胞画像の空間周波数を算出し、空間周波数が所定の閾値以上の領域を未分化領域として判定し、空間周波数が閾値未満の領域を分化領域として判定する。

また、上述したような細胞画像の空間周波数に基づく判定ではなく、輝度変化や色変化を用いて分化領域と未分化領域とを判定するようにしてもよい。たとえば図３に示すように、未分化状態の幹細胞が分布する領域は、幹細胞が密集するとともに、幹細胞間の境界にはハロが発生して輝度が高くなっている。なお、照明光が細胞間を通過する際に生じる高輝度なアーチファクトのことである。

一方、分化領域の幹細胞が分布する領域は、分化した幹細胞が培地に這うように分布し、幹細胞間の境界もあまり明確ではない。したがって、境界設定部３１が、細胞画像の輝度変化を算出し、輝度変化が所定の閾値以上の領域を未分化領域として判定し、輝度変化が閾値未満の領域を分化領域として判定するようにしてもよい。また、輝度変化ではなく、色変化として捉え、境界設定部３１が、細胞画像の色変化を算出し、色変化が所定の閾値以上の領域を未分化領域として判定し、色変化が閾値未満の領域を分化領域として判定するようにしてもよい。

また、幹細胞の細胞群の成長が進むと未分化細胞の密集度が高くなり、未分化細胞が積層化した領域と、分化細胞が分布する領域とが形成され、未分化細胞が積層化した領域の輝度が、分化細胞が分布する領域の輝度よりも高くなる。したがって、境界設定部３１が、細胞画像の輝度を算出し、輝度が所定の閾値以上の領域を未分化領域として判定し、輝度が閾値未満の領域を分化領域として判定するようにしてもよい。

また、空間周波数、輝度および色の少なくとも２つの特徴を組み合わせて分化領域と未分化領域とを判定するようにしてもよい。この場合、たとえば複数の特徴に対してそれぞれ重み付けて加算することによって１つの評価値を算出し、その評価値が閾値以上であるか閾値未満であるかによって分化領域と未分化領域とを判定するようにしてもよい。

上述したように、本実施形態の境界設定部３１は、空間周波数や輝度変化や色変化などといった細胞画像全体に亘る特徴量を算出し、その特徴量に基づいて細胞群を大まかに分割する境界を設定するものである。

ここで、上述したように細胞画像の空間周波数、輝度または色に基づいて分化領域と未分化領域との境界を設定する際、閾値の設定の仕方などによっては、たとえば図３に示す未分化細胞間の輝度が高いハロの部分を境界として設定しまう可能性がある。また、境界設定部３１において境界を設定する目的は、上述したように周囲の細胞の判定結果を用いて評価対象の細胞を評価する際において、その周囲の細胞に不適切なものが含まれないようにするためであるので、厳密な境界ではなく、細胞群を大まかに分割する境界であればよく、より直線性のあるものであることが望ましい。

そこで、たとえば境界を設定する際、その境界の変曲点数または曲率などの上限を設定し、その上限よりも少ない変曲点数や小さい曲率を有する線分を境界として設定するようにしてもよい。具体的には、たとえば境界候補の線分を複数抽出し、その境界候補の中から上述した上限を超えないものを最終的な境界として設定するようにすればよい。

図４は、図３に示す細胞画像において設定された境界の一例を示すものである。図４において一点鎖線で示す線分が境界設定部３１によって設定された境界である。

また、上記説明では、境界設定部３１が、未分化領域と分化領域との境界を設定するようにしたが、未分化領域と分化領域との境界に限らず、たとえば細胞群が分化誘導された細胞である場合には、その細胞の分化度に応じて境界を設定するようにしてもよい。たとえば分化度が所定の閾値以上である領域と閾値未満である領域との間に境界を設定するようにしてもよい。また、細胞群ががん細胞である場合には、そのがん細胞の悪性度に応じて境界を設定するようにしてもよい。たとえば悪性度が所定の閾値以上である領域と閾値未満である領域との間に境界を設定するようにしてもよい。

図１に戻り、細胞評価部３２は、細胞画像内の細胞群における評価対象の細胞とその評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、その特定した周囲の細胞の評価結果を用いて、評価対象の細胞を評価するものである。

上述したように細胞画像に基づいて個々の細胞の状態を評価する際、個々の細胞の画像のみに注目して状態を評価したのでは適切に評価できない場合がある。したがって、細胞評価部３２は、評価対象の細胞を評価する際、周囲の細胞の評価結果も取得し、その周囲の細胞の評価結果と、評価対象の細胞の評価結果とを用いて、その評価対象の細胞の評価を行うものである。以下、個々の細胞の評価方法について、具体的に説明する。

細胞評価部３２は、まず、細胞画像内に含まれる個々の細胞を特定する。個々の細胞の特定方法としては、たとえば細胞画像を２値化画像に変換した後、フィルタ処理を行って個々の細胞のエッジを検出し、そのエッジに対してパターンマッチングを行うことによって個々の細胞を特定するようにすればよい。また、パターンマッチングの際には、機械学習を用いたパターン認識を行うことが望ましい。ただし、このような方法に限らず、種々の公知な方法を用いることができる。

次に、細胞評価部３２は、上述したようにして特定した個々の細胞について、分化状態であるのか未分化状態であるのかをそれぞれ評価するが、この際、評価対象の細胞の周囲の細胞を特定し、その周囲の細胞の評価結果も用いて評価対象の細胞を評価する。以下、評価対象の細胞の周囲の細胞の特定方法について説明する。

周囲の細胞を特定する方法としては、たとえば図５に示すように、所定の評価対象の細胞（実線の楕円で示す）の輪郭に接する矩形領域を設定し、その設定した矩形領域と同じ大きさの矩形領域を評価対象の細胞の矩形領域の周辺に設定し、この周辺の８つの矩形領域に全部または一部が含まれる細胞（点線の楕円で示す）を周囲の細胞として特定するようにすればよい。

ここで、上述したように評価対象の細胞の周辺領域を設定し、その周辺領域に含まれる細胞を周囲の細胞として特定する場合、たとえば図６に示すように、評価対象の細胞が未分化領域と分化領域との境界近傍に存在し、上記境界を跨いで周辺領域が設定された場合には、評価対象の細胞の周囲の細胞として分化状態の細胞と未分化状態の細胞との両方が混在し、評価対象の細胞の未分化状態または分化状態が適切に評価されない場合がある。

そこで、本実施形態の細胞評価部３２は、境界設定部３１において設定された境界の情報を取得し、その境界の情報に基づいて周辺領域を再設定する。

たとえば図７に示すように評価対象の細胞が境界近傍であって分化領域内に存在する細胞である場合には、分化領域内における細胞のみが周囲の細胞として特定されるように周辺領域を再設定する。具体的には、上述した８つの矩形領域が全て分化領域内に配置されるように再設定する。なお、周辺領域の再設定の方法としては、図７に示す例に限らず、分化領域内に全ての周辺領域が配置される方法であればその他の方法を採用するようにしてもよい。

上述したように周辺領域を再設定することによって、評価対象の細胞を評価する際、その評価対象の細胞が存在する領域内の細胞のみの評価結果を用いることができるので、評価対象の細胞の未分化状態または分化状態をより高精度に評価することができる。

なお、上記説明では、評価対象の細胞の輪郭に接する矩形領域を設定し、この矩形領域と同じ大きさの矩形領域を周辺に設定するようにしたが、すなわち評価対象の細胞の細胞質の大きさおよび形状に基づいて周辺の矩形領域の大きさを設定するようにしたが、これに限らず、たとえば評価対象の細胞の細胞核や核小体を検出し、その細胞核や核小体の大きさや形状に応じて、周辺領域を設定し、その周辺領域に全部または一部が含まれる細胞を周囲の細胞として特定するようにしてもよい。

図８は、たとえば細胞核が大きいほど周辺領域を広く設定した場合の一例を示すものであり、図９は、細胞核の形状に合わせて周辺領域の形状も変化させて設定した場合の一例を示すものである。核小体の大きさや形状に基づいて周辺領域を設定する場合も同様である。

また、上述したように１枚の細胞画像における細胞の特徴に基づいて周辺領域を設定するのではなく、時系列に複数の細胞画像を撮像している場合には、その複数の細胞画像から細胞の増殖速度に関する情報や遊走速度に関する情報などを取得し、これらに基づいて周辺領域を設定するようにしてもよい。

たとえば増殖速度が速い細胞は、類似する状態の細胞がより広い範囲に分布していると考えられる。したがって、増殖速度が速いほど大きい周辺領域を設定するようにすればよい。

細胞の増殖速度を取得する方法としては、たとえば、異なる時刻に撮像された細胞画像内に含まれる単位面積当たりの細胞の数をそれぞれカウントし、その細胞の数の増加分と撮像間隔とに基づいて増殖速度を算出するようにすればよい。上記単位面積は、細胞画像全体としても良いし、評価対象の細胞を含む一部の領域としてもよい。

また、上述したように細胞の増殖速度を直接算出するのではなく、たとえば異なる時刻に撮像された細胞画像内に含まれる細胞群の面積をそれぞれ算出し、その面積増加率を増殖速度に関する情報として取得するようにしてよい。

また、遊走速度が速い細胞は、類似する状態の細胞がより広い範囲に分布していると考えられる。したがって、遊走速度が速いほど大きい周辺領域を設定するようにすればよい。

細胞の遊走速度を取得する方法としては、たとえば異なる時刻に撮像された細胞画像内に含まれる評価対象の細胞の移動距離を算出し、その移動距離と撮像間隔とに基づいて遊走速度を算出するようにすればよい。

異なる時刻に撮像された細胞画像における評価対象の細胞の対応付けについては、たとえば細胞の形状が類似しており、かつ予め設定された範囲内に存在する細胞同士を対応付けるようにすればよい。また、その他の公知な手法を用いるようにしてもよい。

また、評価対象の細胞の遊走速度を算出するのではなく、細胞画像内に含まれる全ての細胞の移動距離に基づいて遊走速度を算出するようにしてもよい。たとえば個々の細胞の移動距離の平均値、最大値または最小値などの統計値を算出し、その統計値と撮像間隔とに基づいて遊走速度を算出するようにしてもよい。

また、上述したように細胞の遊走速度を算出するのではなく、単に上述した移動距離の統計値を遊走速度に関する情報として取得するようにしてもよい。

また、上述したように周囲の細胞を特定するための周辺領域を設定する際、その周辺領域内に含まれる周囲の細胞が予め設定された数に到達するまで周辺領域を広げるようにしてもよい。このように周辺領域を広げることによって、細胞の密集度によらず、常に所望の数の周囲の細胞を特定することができるので、評価対象の細胞の評価の精度を安定して向上させることができる。

また、このように周辺領域を広げる際、その周辺領域が矩形領域である場合、矩形領域の広げ幅の縦と横のアスペクト比は同じにしてもよいし、異なるようにしてもよい。たとえば、評価対象の細胞質、核、核小体の円形度が高く円に近い場合には、アスペクト比を同じにし、これらの形が縦方向または横方向に延びるような楕円形状である場合には、その延びる方向の広げ幅が相対的に大きくなるようにアスペクト比を設定するようにしてもよい。

また、増殖速度に基づいて矩形領域の周辺領域を設定する場合には、増殖速度が速い方向の広げ幅が相対的に大きくなるようにアスペクト比を設定するようにしてもよい。また、遊走速度に基づいて矩形領域の周辺領域を設定する場合には、遊走速度が速い方向の広げ幅が相対的に大きくなるようにアスペクト比を設定するようにしてもよい。

また、上述したように周辺領域内に含まれる周囲の細胞が予め設定された数に到達するまで周辺領域を広げる際、縦方向の細胞の探索する細胞数と横方向の細胞の探索する細胞数は同じ数としてもよいし、異なる数としてもよい。

上述した周辺領域のアスペクト比を設定する場合と同様に、たとえば、評価対象の細胞質、核、核小体が円に近い場合には、縦方向と横方向の探索する細胞数を同じにし、これらの形が縦方向または横方向に延びるような楕円形状である場合には、その延びる方向の探索する細胞数が相対的に多くなるように設定するようにしてもよい。

また、増殖速度に基づいて矩形領域の周辺領域を設定する場合には、増殖速度が速い方向の探索する細胞数が相対的に多くなるように設定するようにしてもよい。また、遊走速度に基づいて矩形領域の周辺領域を設定する場合には、遊走速度が速い方向の探索する細胞数が相対的に多くなるように設定するようにしてもよい。

以上が、評価対象の細胞の周囲の細胞を特定する方法である。なお、本実施形態においては、上述したように周囲の細胞を自動的に特定するようにしたが、ユーザが入力装置５を用いて周囲の細胞を指定し、その指定情報を細胞評価部３２が受け付けることによって周囲の細胞を特定するようにしてもよい。

次に、細胞評価部３２は、細胞画像内における個々の細胞を順次、評価対象の細胞として特定するとともに、その評価対象の細胞の周囲の細胞を順次特定し、評価対象の細胞毎について、周囲の細胞の評価結果を用いて評価する。

本実施形態の細胞評価部３２は、上述したように評価対象の細胞が分化状態であるか未分化状態であるかの評価を行う。具体的には、本実施形態では、評価対象の細胞および周囲の細胞の円形度を算出し、円形度が所定の閾値以上である場合には未分化状態であると評価し、閾値未満である場合には分化状態であると評価する。そして、評価対象の細胞および周囲の細胞の評価結果をその細胞の位置情報とともに記憶する。

なお、ここでは円形度に基づいて未分化状態であるか分化状態であるかを評価するようにしたが、円形度に限らず、たとえば個々の細胞の最大径、最小径、面積などの大きさの情報や、細胞内に含まれる核小体の密度などに基づいて未分化状態であるか分化状態であるかを評価するようにしてもよい。

また、上述したような個々の細胞の形状の特徴に限らず、個々の細胞を含む所定の領域の画像情報に基づいて分化状態であるか未分化状態であるかを評価するようにしてもよい。たとえば、評価対象の細胞を含む所定領域内の細胞の密集度を算出し、密集度が所定の閾値以上である場合には未分化状態であると評価し、閾値未満である場合には分化状態であると評価するようにしてもよい。また、評価対象の細胞を含む所定領域内の輝度の平均値最大値または最小値などの統計値を算出し、その輝度の統計値が所定の閾値未満である場合には未分化状態で評価し、閾値以上である場合には分化状態であると評価するようにしてもよい。また、その他の公知な方法によって、未分化状態であるか分化状態であるかを評価するようにしてもよい。

そして、細胞評価部３２は、たとえば評価対象の細胞の評価結果と周囲の細胞の評価結果とを合わせ、未分化状態の評価結果の数の方が多いが多い場合には、評価対象の細胞は、未分化状態であると評価し、分化状態の評価結果の数の方が多いが多い場合には、評価対象の細胞は、分化状態であると評価する。

また、上記のように評価結果の多数決によって評価対象の細胞の評価結果を決定するのではなく、評価対象の細胞の評価結果と、周囲の細胞の評価結果とを重み付け加算することによって１つの評価値を算出し、その評価値に基づいて評価対象の細胞の評価結果を決定するようにしてもよい。

具体的には、評価結果が未分化状態である場合には評価値「２」とし、評価結果が分化状態である場合には評価値「１」とし、評価対象の細胞の評価値と周囲の細胞の評価値とを加算して１つの評価値を算出し、その評価値が所定の閾値以上である場合には、評価対象の細胞の評価結果を未分化状態であると決定し、閾値未満である場合には、評価対象の細胞の評価結果を分化状態であると決定するようにしてもよい。

そして、上述したように評価対象の細胞の評価値と周囲の細胞の評価値とを加算する際、評価対象の細胞の評価値に対して周囲の細胞の評価値よりも大きい重み付けをして加算するようにしてもよい。

また、さらに周囲の細胞の評価値については、評価対象の細胞との距離に応じて重み付けを変えるようにしてもよい。たとえば評価対象の細胞に近い周囲の細胞の評価値ほど大きい重み付けを設定するようにしてもよい。

また、上述したようにして評価対象の細胞の評価値と周囲の細胞の評価値とを算出する際、たとえば円形度に基づいて未分化・分化を評価する場合、その円形度が通常の範囲外の異常な値である場合には、その細胞については、評価不可能であると判定し、評価値を「０」とするようにしてもよい。このように評価不可能である細胞の評価値を「０」とすることによって、評価結果が確定している細胞の評価結果のみを用いて評価対象の細胞を評価することができるので、より高精度な評価を行うことができる。

なお、細胞が評価不可能であると判定される例としては、たとえば細胞が死細胞である場合や、または細胞ではないゴミなどが細胞として誤認識されてしまった場合などがある。また、評価対象の細胞の周辺の輝度に基づいて未分化・分化を評価する場合、その周辺に死細胞やゴミが含まれる場合には、死細胞の核小体は白いので輝度が異常に高くなり、また、ゴミも輝度が異常に高くなる場合があるので、輝度に基づく評価値が異常な値となり、評価不可能と判定される。

そして、上述したように、細胞評価部３２は、細胞画像内に含まれる個々の細胞を順次、評価対象の細胞として特定するとともに、周囲の細胞を順次特定して評価を行うが、この際、一度評価を行った細胞については評価を行うことなく、既に記憶された評価結果を用いるようにしてもよい。これにより評価の処理を簡略化することができ、処理を高速化することができる。

なお、上記説明では、細胞評価部３２において、評価対象の細胞が未分化状態であるか分化状態であるかを評価するようにしたが、これに限らず、たとえば細胞群が分化誘導された細胞である場合には、その細胞の分化度を評価するようにしてもよい。この場合、たとえば個々の細胞の形状などに基づいて分化度の段階を数値で表し、評価対象の細胞の分化度と周囲の細胞の分化度との平均値、最大値、最小値などの統計値を算出し、その統計値を評価対象の細胞の分化度として決定するようにすればよい。また、この場合も、評価対象の細胞と周囲の細胞との距離に応じて重み付け加算を行うようにしてもよい。また、細胞群ががん細胞である場合には、その細胞の悪性度を評価するようにしてもよい。

表示制御部３３は、画像取得部３０から読み出された細胞画像を取得するとともに、細胞評価部３２において評価された個々の細胞の評価結果を取得し、これらをディスプレイ４に表示させるものである。個々の細胞の評価結果の表示方法としては、たとえばユーザが入力装置５を用いて指定した細胞の評価結果をテキストで表示するようにしてもよいし、個々の細胞の評価結果をたとえば異なる色でマッピングして細胞評価画像を生成し、細胞画像に細胞評価画像を重畳して表示させるようにしてもよい。細胞評価画像としては、細胞画像を透過して観察できるような半透明の画像としてもよいし、個々の細胞の輪郭を異なる色などで表した画像としてもよい。

入力装置５は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる設定入力を受け付けるものである。たとえば、入力装置５は、位相差顕微鏡２０の光学倍率などの撮像条件や、細胞画像における個々の細胞の指定情報などの設定入力を受け付け可能なものである。

次に、上述した細胞培養観察システムの作用について、図１０に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、細胞培養装置１において、搬送部１１によって、収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養が選択され、その選択された培養容器がステージ１０に設置される（Ｓ１０）。

そして、撮像装置２の位相差顕微鏡２０によって培養容器内における細胞コロニーの画像が撮像され、その撮像された細胞画像は、細胞評価装置３の画像取得部３０によって取得される（Ｓ１２）。

次いで、画像取得部３０によって取得された細胞画像が境界設定部３１によって読み出され、境界設定部３１は、細胞画像内における細胞群の状態に基づいて、細胞画像に境界を設定する（Ｓ１４）。本実施形態においては、上述したように分化領域と未分化領域との境界を設定する。

境界設定部３１において設定された境界の情報は細胞評価部３２に出力され、細胞評価部３２は、細胞画像内における個々の細胞を特定するとともに（Ｓ１６）、入力された境界の情報に基づいて周囲の細胞を特定する（Ｓ１８）。

そして、細胞評価部３２は、細胞画像内における個々の細胞を評価対象の細胞として順次特定するとともに、その周囲の細胞を順次特定し、評価対象の細胞について、その周囲の細胞の評価結果を用いて評価する（Ｓ２０）。

細胞評価部３２において評価された個々の細胞領域の評価結果は表示制御部３３に出力され、表示制御部３３は、細胞画像および個々の細胞の評価結果をディスプレイ４に表示させる（Ｓ２２）。

次に、本発明の細胞評価装置の第２の実施形態の細胞培養観察システムについて説明する。

上記第１の実施形態の細胞培養観察システムにおいては、評価対象の細胞をその周囲の細胞の評価結果を用いて評価する際、評価対象の細胞および周囲の細胞の評価結果のうち評価不可能な細胞の評価結果を用いないようにしたが、第２の実施形態の細胞培養観察システムは、このような評価不可能な細胞がある場合、評価不可能な細胞を含む細胞画像とは異なる撮像条件で撮像された細胞画像を用いて、評価不可能な細胞を再評価するようにしたものである。

第２の実施形態の細胞培養観察システムは、具体的には、図１１に示すように、さらに撮像条件取得部３４と、撮像制御部３５とを備えている。

そして、第２の実施形態の細胞培養観察システムにおける細胞評価部３２は、周囲の細胞の評価結果を用いて評価対象の細胞を評価する際、評価対象の細胞および周囲の細胞の中に評価不可能な細胞が含まれる場合には、その評価対象の細胞および周囲の細胞を含む評価対象領域に対して識別情報を付加して記憶するものである。この識別情報は、評価対象領域の中に評価不可能な細胞が含まれていることを示す識別情報である。

撮像条件取得部３４は、細胞評価部３２において上述した識別情報が付加された評価対象領域が存在する場合には、その評価対象領域の再評価に用いる細胞画像を再撮像する際の撮像条件を取得するものである。

撮像条件取得部３４は、具体的には、評価不可能な細胞を含む細胞画像を撮像した際における光学倍率よりも高い光学倍率を取得するものである。具体的には、たとえば最初の評価の際には、光学倍率を４倍とした細胞画像を用い、再評価の際には、光学倍率を２０倍とした細胞画像を用いるようにすればよい。なお、評価不可能な細胞を含む細胞画像を撮像した際の撮像条件については、細胞画像とともに記憶されているものとする。また、再撮像の際の撮像条件についても予め設定されているものとする。

また、撮像条件取得部３４は、上述した光学倍率以外のその他の撮像条件を取得するようにしてもよい。その他の撮像条件としては、たとえば撮像領域、撮像タイミング、撮像素子の露光時間、照明光波長、観察光波長などがある。

撮像領域については、再撮像の際には、光学倍率の変更に応じて狭い範囲に変更するようにすればよい。

また、撮像タイミングについては、たとえば評価不可能な細胞を含む細胞画像を撮像した撮像タイミングが培養初期である場合には、再撮像の撮像タイミングは、培養完了時とすればよい。また、逆に、評価不可能な細胞を含む細胞画像を撮像した撮像タイミングよりも過去の撮像タイミングを取得するようにしれてもよい。すなわち、過去に撮像された細胞画像を用いて再評価するようにしてもよい。なお、撮像タイミングについては、たとえばタイマなどを設けて計測するようにすればよい。また、撮像タイミングは、細胞の分裂周期に合わせたタイミングとすることが望ましい。

また、撮像素子の露光時間については、再撮像の際には、露光時間を長くして細胞画像のＳ/Ｎを上げるようにしてもよいし、逆に、輝度が異常に高いゴミなどがある場合には、露光時間を短くして細胞画像の輝度を下げるようにしてもよい。

また、照明光波長については、再撮像の際には、たとえば照明光波長を短くすることによって細胞画像の分解能を高くするようにすればよい。また、逆に照明光波長を長くすることによって散乱光を減らし、ボケの少ない細胞画像を再撮像するようにしてもよい。

また、観察光波長については、再撮像の際には、たとえばフィルタや分光器を用いることによって波長を切り替えるようにすればよい。

また、上記説明では、撮像条件取得部３４に対して再撮像の撮像条件を予め設定するようにしたが、これに限らず、撮像条件取得部３４が、評価不可能な細胞を含む評価対象領域の細胞画像を用いて、自動的に撮像条件を決定して取得するようにしてもよい。

具体的には、たとえば評価対象領域の細胞画像に含まれる個々の細胞の大きさが所定の閾値以下である場合には、所定の閾値よりも大きくなる高い光学倍率を決定して取得するようにすればよい。また、撮像タイミングについては、たとえば評価対象領域の細胞画像における個々の細胞の密集度などから培養期間を予測し、その培養期間を基準として予め設定された培養周期などに基づいて再撮像の撮像タイミングを決定して取得するようにしてもよい。

また、撮像素子の露光時間については、評価対象領域の細胞画像のＳ/Ｎを取得し、Ｓ/Ｎが所定の閾値以下である場合には、露光時間を長くして細胞画像のＳ/Ｎを上げるようにすればよい。また、評価対象領域の細胞画像の輝度の平均値、最大値、最小値などの統計値を取得し、その統計値が所定の閾値以上である場合には、露光時間を短くして細胞画像の輝度を下げるようにしてもよい。

また、照明光波長については、評価対象領域の細胞画像の分解能を取得し、分解能が所定の閾値以下である場合には、照明光波長を短くすることによって細胞画像の分解能を高くするようにすればよい。評価対象領域の細胞画像のボケを取得し、ボケの程度が所定の程度以上である場合には、照明光波長を長くすることによって細胞画像のボケを減らすようにしてもよい。また、観察光波長も同様に、細胞画像から分解能やボケを取得することによって変更するようにすればよい。

撮像制御部３５は、撮像条件取得部３４において取得された再撮像の撮像条件を取得し、その撮像条件に基づいて、撮像装置２の制御部２９や細胞培養装置１の制御部１２に撮像制御信号を出力するものである。撮像装置２の制御部２９は、撮像制御部３５から出力された撮像制御信号に基づいて、光学倍率、撮像素子の露光時間、撮像タイミング、照明光波長、観察光波長を制御するものである。また、細胞培養装置１の制御部１２は、撮像制御部３５から出力された撮像制御信号に基づいて、ステージ１０を移動させることによって撮像領域を制御するものである。

次に、第２の実施形態の細胞培養観察システムの作用について、図１２に示すフローチャートを参照しながら説明する。

第２の実施形態の細胞培養観察システムにおいても、細胞画像内における個々の細胞を特定するとともに、入力された境界の情報に基づいて周囲の細胞を特定するまで（Ｓ３０〜Ｓ３８）の作用については、第２の実施形態の細胞培養観察システムと同様である。

そして、細胞評価部３２は、細胞画像内における個々の細胞を順次、評価対象の細胞として特定するとともに、その周囲の細胞を順次特定し、評価対象の細胞毎について、その周囲の細胞の評価結果を用いて評価する（Ｓ４０）。そして、この評価の際、評価対象の細胞および周囲の細胞の中に評価不可能な細胞が存在する場合には（Ｓ４２，ＮＯ）、その際の評価対象領域に対して識別情報を付加して記憶する（Ｓ４４）。

そして、全ての個々の細胞を評価した後、上述した識別情報が付加された評価対象領域がある場合には、その評価対象領域の位置情報などが細胞評価部３２から撮像条件取得部３４に出力され、撮像条件取得部３４は、その評価対象領域の再撮像の撮像条件を取得する（Ｓ４６）。

撮像条件取得部３４によって取得された撮像条件は撮像制御部３５に出力され、撮像制御部３５は、入力された撮像条件に基づいて、撮像装置２の制御部２９または細胞培養装置１の制御部１２に撮像制御信号を出力する。そして、撮像装置２の制御部２９または細胞培養装置１の制御部１２の制御により再撮像が行われ、前回の評価に用いた細胞画像とは異なる撮像条件の細胞画像が取得される（Ｓ４８）。

そして、再撮像によって取得された細胞画像は、再び細胞評価部３２に入力され、評価不可能である細胞を含む評価対象領域について再評価が行われる（Ｓ４０）。そして、評価不可能な細胞がなくなった場合には（Ｓ４２，ＹＥＳ）、個々の細胞領域の評価結果は表示制御部３３に出力され、表示制御部３３は、細胞画像および個々の細胞の評価結果をディスプレイ４に表示させる（Ｓ５０）。なお、上述した再撮像によって評価不可能な細胞がなくならなかった場合でも、その旨を示すメッセージなどをディスプレイ４に表示させることによって処理を終了するようにしてもよい。

上記実施形態の細胞培養観察システムによれば、所定の撮像条件で撮像した細胞画像に基づいて個々の細胞を評価した際、評価不可能な細胞が存在する場合でも、異なる撮像条件で再撮像を行い、その再撮像された細胞画像を用いて再評価を行うようにしたので、個々の細胞をより高精度に評価することができる。

なお、上記第２の実施形態の細胞培養観察システムにおいては、撮像条件取得部３４が、自動的に撮像条件を取得するようにしたが、これに限らず、ユーザが入力装置５を用いて再撮像の撮像条件を入力し、その入力された撮像条件を撮像条件取得部３４が取得するようにしてもよい。

また、上記第２の実施形態の細胞培養観察システムにおいては、撮像制御部３５が、撮像条件取得部３４によって取得された撮像条件に基づいて、自動的に再撮像を行うようにしたが、これに限らず、撮像条件取得部３４によって取得された撮像条件を表示制御部３３がディスプレイ４に表示させ、ユーザに対して再撮像を促し、これによってユーザが手動で再撮像を行うようにしてもよい。

１ 細胞培養装置
２ 撮像装置
３ 細胞評価装置
４ ディスプレイ
５ 入力装置
１０ ステージ
１１ 搬送部
１２ 制御部
１５ 培養容器
２０ 位相差顕微鏡
２１ 照明光源
２２ スリット板
２３ 対物レンズ
２４ 位相差レンズ
２５ 対物レンズ
２６ 位相板
２７ 結像レンズ
２８ 撮像素子
２９ 制御部
３０ 画像取得部
３１ 境界設定部
３２ 細胞評価部
３３ 表示制御部
３４ 撮像条件取得部
３５ 撮像制御部

Claims (11)

1. 細胞群を撮像した細胞画像を取得する画像取得部と、
   前記細胞群における評価対象の細胞と該評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、前記周囲の細胞の評価結果に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する細胞評価部と、
   前記細胞群の状態に基づいて、前記細胞画像に境界を設定する境界設定部とを備え、
   前記細胞評価部が、
   前記評価対象の細胞の周辺の周辺領域を設定し、前記周辺領域が上記境界を跨いで設定されていない場合には、前記周辺領域に全部または一部が含まれる細胞を前記周囲の細胞として特定し、
   前記周辺領域が上記境界を跨いで設定された場合には、前記境界設定部において設定された境界の情報に基づいて、前記評価対象の細胞と同様の特徴を有する細胞のみが周辺領域内に存在するように、前記周辺領域を再設定して、前記周辺領域に全部または一部が含まれる細胞を周囲の細胞として特定することを特徴とする細胞評価装置。
2. 前記細胞評価部において前記周囲の細胞の評価結果に基づいて前記評価対象の細胞を評価した際に評価不可能と判定された場合、前記評価に用いられた細胞画像の撮像条件とは異なる撮像条件を取得する撮像条件取得部を備える請求項１記載の細胞評価装置。
3. 前記撮像条件が、撮像領域、露光時間、光学倍率、照明光波長または観察光波長を含む請求項２記載の細胞評価装置。
4. 前記細胞評価部が、前記評価対象の細胞の評価を行う際に特定した前記周囲の細胞が存在する領域に対して識別情報を付加するものである請求項２または３記載の細胞評価装置。
5. 前記撮像条件取得部が、前記識別情報が付加された領域の前記細胞画像に基づいて、前記撮像条件を取得するものである請求項４記載の細胞評価装置。
6. 前記撮像条件取得部によって取得された撮像条件を表示させる表示制御部を備える請求項２から５いずれか１項記載の細胞評価装置。
7. 前記撮像条件取得部によって取得された撮像条件に応じた撮像制御信号を出力する撮像制御部を備える請求項２から６いずれか１項記載の細胞評価装置。
8. 前記境界設定部が、前記細胞画像の輝度、空間周波数または色に基づいて前記境界を設定するものである請求項１から７いずれか１項記載の細胞評価装置。
9. 前記境界設定部が、変曲点数または曲率が制限された前記境界を設定するものである請求項１から８いずれか１項記載の細胞評価装置。
10. 細胞群を撮像した細胞画像を取得し、
    前記細胞群における評価対象の細胞と該評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、前記周囲の細胞の評価結果に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する際、
    前記細胞群の状態に基づいて、前記細胞画像に境界を設定し、
    前記評価対象の細胞の周辺の周辺領域を設定し、前記周辺領域が上記境界を跨いで設定されていない場合には、前記周辺領域に全部または一部が含まれる細胞を前記周囲の細胞として特定し、
    前記周辺領域が上記境界を跨いで設定された場合には、前記境界の情報に基づいて、前記評価対象の細胞と同様の特徴を有する細胞のみが周辺領域内に存在するように、前記周辺領域を再設定して、前記周辺領域に全部または一部が含まれる細胞を前記周囲の細胞として特定することを特徴とする細胞評価方法。
11. コンピュータを、細胞群を撮像した細胞画像を取得する画像取得部と、
    前記細胞群における評価対象の細胞と該評価対象の細胞の周囲の細胞とを特定し、前記周囲の細胞の評価結果に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する細胞評価部と、
    前記細胞群の状態に基づいて、前記細胞画像に境界を設定する境界設定部として機能させる細胞評価プログラムであって、
    前記細胞評価部が、
    前記評価対象の細胞の周辺の周辺領域を設定し、前記周辺領域が上記境界を跨いで設定されていない場合には、前記周辺領域に全部または一部が含まれる細胞を前記周囲の細胞として特定し、
    前記周辺領域が上記境界を跨いで設定された場合には、前記境界設定部において設定された境界の情報に基づいて、前記評価対象の細胞と同様の特徴を有する細胞のみが周辺領域内に存在するように、前記周辺領域を再設定して、前記周辺領域に全部または一部が含まれる細胞を周囲の細胞として特定するものであることを特徴とする細胞評価プログラム。