JP6304731B2

JP6304731B2 - カラタチ抽出物を有効成分として含む抗インフルエンザウイルス組成物

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Publication number: JP6304731B2
Application number: JP2017500780A
Authority: JP
Inventors: キム・ヨンボン; キム・カンチャン; リ・ヒ−ジョン; ユン・チョンクァン; クウォン・ヨンデ; ホ・ジェヒョク; ホ・ユンギ
Original assignee: KR Biotech Co Ltd
Current assignee: KR Biotech Co Ltd
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2018-04-04
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: CN106132426B; CN106132426A; EP3130344A4; EP3130344A1; US20180008659A1; JP2017512832A; US20190083563A1; WO2015142069A1; KR20150109541A; KR101637013B1; EP3130344B1

Description

本願は、２０１４年０３月１９日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００３２３５６号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参考として組み込まれる。
本発明は、カラタチ（Ｐｏｎｃｉｒｕｓｔｒｉｆｏｌｉａｔａ）抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス組成物に関する。

インフルエンザウイルスは、ヒトと動物とで高い発病率と死亡率とを示す呼吸器疾患の原因となる。インフルエンザウイルスには、Ａ型、Ｂ型及びＣ型があり、Ａ型には、その亜種として、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ２、及びＨ１０Ｎ７がある。

鳥インフルエンザの場合、藻類と豚との間でのみ伝染されると見なされたが、１９９７年香港で、そのウイルスに感染された藻類と接触したヒトのうち、１８人が感染され、そのうち、６人が死亡する事件が発生して、ヒトも感染することが知られ始めた。鳥インフルエンザによって、２００３年には、香港では感染者２人のうち１人が、オランダでは８３人のうち、獣医師１人が死亡し、全世界的に約３００人以上のヒトが感染し、約６０％以上の死亡率を示しており、香港はＨ５Ｎ１、オランダはＨ７Ｎ７ウイルスが原因であった。

特に、前記ウイルスのうち、高病原性であるＨ５Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスは、変異が非常に速いだけではなく、他の動物にも容易に転移するという特徴を有している。感染された藻類が、他のニワトリや飼育カモと接触するか、排泄物を通じて鳥インフルエンザを伝播するので、防疫が容易ではない。

特に問題となることは、感染された藻類を通じてヒトに伝染されるという事実である。ヒトが鳥インフルエンザに感染すると、変種ウイルスが発生する可能性がさらに大きくなり、突然変異を起こした変種ウイルスは、ヒトどうしの伝染を起こしうる。すなわち、ヒト間に伝染される変種ウイルスが表われる可能性がある。

２００９年４月には、インフルエンザＡウイルスの新たな組換え体であるＨ１Ｎ１ウイルスが、初めてメキシコと米国とで９４人のヒトに伝染されたことが報告された（ＣＤＣ２００９）。その年の４月以後、前記ウイルスは、ヒトの間に継続的に転移されて、２００９年６月１１日には、世界保健機構で２１世紀の最初の大流行性インフルエンザとして分類された（ＷＨＯ２００９）。

２０１３年には、Ａ型インフルエンザＨ７Ｎ９ウイルスの鳥インフルエンザが発生して、人体感染させることによって、中国で、２０１４年２月まで２２人が死亡した例がある。季節性インフルエンザの場合、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２のインフルエンザＡウイルスが原因であり、全世界的に毎年２５０，０００〜５００，０００人が、そのウイルスによって死亡している。

ワクチンは、インフルエンザウイルスが動物と動物、ヒトとヒト、そして、動物とヒトとの間を拡散するのを防ぐ重要な役割を行うが、突然変異の発生率が高いインフルエンザウイルスの特性上、ワクチンは、次の季節に流行ると予想された変種インフルエンザウイルスをターゲットとして設計されるために、ワクチンが、あらゆるインフルエンザウイルスを予防することは不可能である。

インフルエンザ治療剤として、Ｍ２イオンチャネル抑制剤であるアマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）とリマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ノイラミニダーゼ阻害剤であるオセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）とザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）、及びイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ抑制剤であるリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）のような３種類の抗インフルエンザ治療剤が承認されて、現在使われている。前記治療剤は、臨床症状を減らすのに有用ではあるが、副作用及び耐性ウイルス性変種の出現によって制限的にのみ使われている。したがって、インフルエンザに対する効果的な抗ウイルス治療剤が早急に必要な実情である。

植物は、長年の進化を通じてウイルスに対する抵抗能力を発展させてきたので、インフルエンザに対する優れた抗ウイルス効果だけではなく、ウイルス感染で誘発される炎症に高い治療効果を有しているという点で、天然‘生物素材’の潜在的な資源として高い関心が持たれている。

本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

本発明者らは、植物由来の天然抽出物から抗インフルエンザウイルス効果を発揮することができる物質を探し出すために研究努力してきた。その結果、カラタチの抽出物（具体的に、カラタチの種子抽出物）が、多様なインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスに対して非常に優れた抗ウイルス効果を有するということを究明することによって、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、抗インフルエンザウイルス組成物を提供することである。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、及び特許請求の範囲によってより明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、カラタチ抽出物を有効成分として含む抗インフルエンザウイルス組成物を提供する。
本発明者らは、植物由来の天然抽出物から抗インフルエンザウイルス効能を発揮することができる物質を探し出すために鋭意検討してきた。その結果、カラタチの抽出物（具体的に、カラタチ種子抽出物）が、多様なインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスに対して非常に優れた抗ウイルス効果を有することを知見し、本発明を完成した。

本発明の組成物の有効成分であるカラタチ種子抽出物は、カラタチから当業者に公知の多様な抽出方法を用いて収得することができる。

本発明で用いられるカラタチは、大韓民国の京畿道以南で育つ落葉灌木であって、高さが３〜５ｃｍの頑丈なトゲが互生する。葉は、互生し、３出葉であって、葉柄に翼が少しあり、小葉は、革質であり、倒卵形または楕円形であり、鈍頭または微凹頭であり、鋭底であり、長さ２５ｍｍである。花は、５月に咲き、白色であり、頂生または腋生であり、１個または２個ずつ付き、萼葉と花びらは、５個が離生し、雄しべは多く、子房に密毛がある。果実は丸く、直径３ｃｍであって、香りが良いが、食べることができず、９月に熟し、種子は長い楕円形であって、長さが１〜１．３ｃｍである。果実を薬用とし、苗木は、蜜柑の台木として使い、成木は、南部地方で生き垣として歓迎を受けている（大韓植物図鑑、イ・チャン・ボク、郷文社、１９９３）。

本発明の一具現例によれば、本発明のカラタチ抽出物は、カラタチの茎、根、葉、花びら、つぼみから得られ、より望ましくは、カラタチの果実またはカラタチ種子の抽出物である。

本発明の組成物で用いられるカラタチ種子抽出物をカラタチ種子に抽出溶媒を処理して得る場合には、多様な抽出溶媒が用いられうる。望ましくは、極性溶媒または非極性溶媒を利用できる。極性溶媒として適したものは、（ｉ）水、（ｉｉ）アルコール（望ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、ノルマルブタノール、１−ペンタノール、２−ブトキシエタノール、またはエチレングリコール）、（ｉｉｉ）酢酸、（ｉｖ）ＤＭＦＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、及び（ｖ）ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含む。非極性溶媒として適したものは、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸メチル、フルオロアルカン、ペンタン、ヘキサン、２，２，４−トリメチルペンタン、デカン、シクロヘキサン、シクロペンタン、ジイソブチレン、１−ペンテン、１−クロロブタン、１−クロロペンタン、ｏ−キシレン、ジイソプロピルエーテル、２−クロロプロパン、トルエン、１−クロロプロパン、クロロベンゼン、ベンゼン、ジエチルエーテル、硫酸ジエチル、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、アニリン、ジエチルアミン、エーテル、四塩化炭素、及びＴＨＦを含む。

本発明の一具現例によれば、本発明で用いられる抽出溶媒は、（ａ）水、（ｂ）炭素数１〜４の無水または含水低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなど）、（ｃ）前記低級アルコールと水との混合溶媒、（ｄ）アセトン、（ｅ）酢酸エチル、（ｆ）クロロホルム、（ｇ）酢酸ブチル、（ｈ）１，３−ブチレングリコール、（ｉ）ヘキサン、及び（ｊ）ジエチルエーテルを含む。

本発明の他の具現例によれば、本発明のカラタチ種子抽出物は、水、メタノール、エタノール、またはこれらの組合わせにより、カラタチを処理して得られたものである。

本発明の特定の具現例によれば、本発明のカラタチ種子抽出物は、エタノールをカラタチの種子に処理して得られたものである。

本明細書で使われる用語‘抽出物’は、前述したように、当業者で粗抽出物（ｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔ）として通用される意味を有するが、広義的には、抽出物を追加的に分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）した分画物も含む。すなわち、カラタチ種子抽出物は、前述した抽出溶媒を用いて得たものだけではなく、これに精製過程を追加的に適用して得たものも含む。例えば、前記抽出物を一定の分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を通過させて得た分画、多様なクロマトグラフィー（サイズ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、追加的に実施された多様な精製方法を通じて得られた分画も、本発明のカラタチ種子抽出物に含まれるものである。

本発明で用いられるカラタチ種子抽出物は、減圧蒸留及び凍結乾燥または噴霧乾燥のような追加的な過程によって粉末状態で製造可能である。

下記の実施例から確認できるように、カラタチ種子抽出物は、ＭＤＣＫ細胞でインフルエンザウイルス感染に対する細胞生存率の向上、インフルエンザの予防及び治療効果を示す。現在、インフルエンザ治療剤として広く使われているタミフルと同等以上の抗ウイルス効能を示し、特に、３ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度でも、細胞毒性に全く影響を与えず、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルス感染疾患の予防または治療のための抗ウイルス剤として使われる可能性を確認した。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスに対して０．０７〜１３．７μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値（５０％ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を有する。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または治療用薬剤学的組成物として提供されうる。

本発明の薬剤学的組成物は、前記説明された有効成分以外に、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体としては、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。一方、本発明の薬剤学的組成物の経口投与量は、望ましくは、１日当たり０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与し、非経口投与される場合、鼻腔、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の薬剤学的組成物は、適用される疾患の種類によって、投与経路が決定されることが望ましい。

本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。

本発明の薬剤学的組成物は、有効成分であるカラタチ種子抽出物以外にも、既存の抗ウイルス効果を有することが公知である他の薬理活性成分と共に使われる。例えば、本発明の薬剤学的組成物は、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ザナミビル、リバビリンなどをさらに含むか、これらと併用して使うことによって、抗ウイルス効果をより向上させることができる。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または改善のための食品組成物の形態で提供されうる。

本発明の組成物が、食品組成物として製造される場合、有効成分としてカラタチ種子抽出物だけではなく、食品製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤、及び香味剤を含む。前述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、葡萄糖、果糖など；ジサッカライト、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として、天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。例えば、本発明の食品組成物が、ドリンク剤として製造される場合には、本発明のカラタチ種子抽出物以外に、クエン酸、液状果糖、砂糖、葡萄糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、トチュウ抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などをさらに含ませることができる。

本発明の食品組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または改善のために使用される。
本発明による食品組成物は、前記医薬組成物と同じ方式で製剤化されて機能性食品として用いるか、各種の食品に添加することができる。本発明の組成物を添加することができる食品としては、望ましくは、飲料類、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがある。例えば、本発明の食品組成物が、ドリンク剤のような飲料類として製造される場合、カラタチ種子抽出物以外にも、クエン酸、液状果糖、砂糖、葡萄糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、各種の植物抽出液などをさらに含みうる。

本発明は、前記インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または改善のための食品組成物を含む健康機能食品を提供する。健康機能食品とは、カラタチ種子抽出物を飲料類、茶類などの食品素材に添加するか、カプセル化、粉末化、懸濁液などで製造した食品であって、それを摂取する場合、健康上、特定の効果をもたらすことを意味するが、一般薬品とは異なって、食品を原料として薬品の長期服用時に発生する副作用などがない長所がある。

このようにして得られる本発明の健康機能食品は、日常的に摂取することが可能であるために、非常に有用である。このような健康食品におけるカラタチ種子抽出物の添加量は、対象である健康食品の種類によって異なり、一律的に規定することができないが、対象食品に対して、通常０．０１〜５０重量％、望ましくは、０．１〜２０重量％の範囲である。また、顆粒、錠剤またはカプセル形態の食品の場合には、通常０．１〜１００重量％、望ましくは、０．５〜８０重量％の範囲で添加すればよい。
本発明の一具現例によれば、本発明の健康機能食品は、飲料の形態であり得る。

本発明による食品組成物または健康機能食品は、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ザナミビル、リバビリンなどの抗ウイルス治療剤の投与前後に、または同時に服用する補助食品として有用に使うことができる。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または改善のための動物飼料添加用組成物の形態で提供されうる。

本発明の動物飼料添加用組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスに対して抗インフルエンザウイルス効果を有するので、家畜の飼料に添加すれば、これらウイルスによって発生する疾患の予防または改善効果を期待することができる。

本明細書で、飼料は、家畜の生命を保持し、乳、肉、卵、毛皮などの生産に必要な有機または無機栄養素を供給する物質を意味する。飼料は、栄養価、主成分、流通、水分含量配合状態、及び加工形態などによってさまざまに分類し、本発明では、飼料は、粗飼料、濃厚飼料、補充飼料、タンパク質飼料、澱粉飼料、脂肪質飼料、繊維質飼料を含むが、これらに限定されるものではない。

前記飼料添加剤に含まれるカラタチ種子抽出物は、高濃縮液、粉末または顆粒の形態であり得る。本発明の飼料添加用組成物には、カラタチ種子抽出物以外にも、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸などの有機酸やリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸塩、ポリリン酸塩（重合リン酸塩）などのリン酸塩やポリフェノール、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、α−トコフェロール、ローズマリー抽出物（ｒｏｓｅｍａｒｙｅｘｔｒａｃｔ）、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸などの天然抗酸化剤のうち何れか１つまたは１つ以上をさらに含みうる。

本発明の飼料添加用組成物には、アミノ酸、無機塩類、ビタミン、抗生物質、抗菌物質、抗酸化、抗カビ酵素、他の生菌形態の微生物製剤のような補助剤成分；穀物、例えば、粉砕または破砕された小麦、燕麦、麦、トウモロコシ及び米；植物性タンパク質飼料、例えば、アブラナ、大豆及びヒマワリを主成分とするもの；動物性タンパク質飼料、例えば、血粉、肉粉、骨粉及び魚粉；糖分及び乳製品、例えば、各種の粉乳及び乳漿粉末からなる乾燥成分；脂質、例えば、加熱によって任意に液化させた動物性脂肪及び植物性脂肪のような主成分；栄養補充剤、消化及び吸収向上剤、成長促進剤、疾病予防剤のような添加剤が含まれうる。

本発明の飼料添加用組成物は、乾燥または液体状態の製剤形態であり、飼料添加用賦形剤を含みうる。飼料添加用賦形剤としては、例えば、ゼオライト、玉粉または米糠などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の飼料添加用組成物は、１つ以上の酵素製剤をさらに含みうる。例えば、リパーゼのような脂肪分解酵素、フィチン酸（ｐｈｙｔｉｃａｃｉｄ）を分解してリン酸塩とイノシトールリン酸塩とを作るフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）、澱粉とグリコーゲンなどに含まれているα−１，４−グリコシド結合（α−１，４−ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｂｏｎｄ）を加水分解する酵素であるアミラーゼ、有機リン酸エステルを加水分解する酵素であるホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、セルロースを分解するカルボキシメチルセルラーゼ、キシロースを分解するキシラナーゼ、マルトースを２分子のグルコースに加水分解するマルターゼ、及びサッカロースを加水分解してグルコース−フルクトース混合物を作る転換酵素などを含みうる。

本発明の動物飼料添加用組成物は、動物に単独で投与されるか、食用担体のうちから他の飼料添加剤と組み合わせて投与される。また、これらは、抗インフルエンザウイルス効果を示すか、インフルエンザウイルスを含む呼吸器ウイルス感染疾患の予防または改善に有用な公知の他の物質を含有することができる。また、前記動物飼料添加用組成物には、トップドレッシングとして、または、これらを動物飼料に直接混合するか、または飼料と別途に、別途の経口剤形に、あるいは他の成分と組み合わせて容易に投与することができる。通常、当業者によく知られたように、単独一日摂取量または分割一日摂取量を使うことができる。

本発明の飼料添加用組成物が使用される動物は、例えば、食用牛、乳牛、子牛、豚、子豚、羊、山羊、馬、兎、犬、猫のような家畜、ひよこ、卵鶏、家庭用ニワトリ、雄鳥、カモ、ガチョウ、七面鳥、ウズラ、小鳥のような家禽類を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明によるカラタチ種子抽出物を含む飼料添加剤を含む飼料は、カラタチ種子抽出物を含む飼料添加剤を飼料に乾燥重量基準に飼料１ｋｇ当たり約１ｇ〜１００ｇの量で混合することで得られる。飼料混合物は、完全に混合した後、成分の粉砕程度によって硬粘性の粗粒、または顆粒物質が得られる。それをマッシュとして供給するか、または追加加工及び包装のために、所望の分離された形状に形成する。この際、貯蔵中に分離することを防止するために、飼料に水を添加し、引き続き、通常のペレット化、膨張化、または押出工程を経ることが望ましい。過剰の水は、乾燥除去される。

本発明の一具現例によれば、本発明は、カラタチ種子抽出物を有効成分として含むインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスに対する消毒剤用組成物を提供する。

本発明のインフルエンザウイルス消毒剤用組成物は、製剤によってインフルエンザウイルスの殺傷のために、添加可能な公知の添加物をさらに含みうる。
本発明のインフルエンザウイルス消毒剤用組成物は、液剤、錠剤、顆粒剤、散剤などの多様な形態の製剤として製造が可能である。

本発明の消毒剤用組成物に添加可能な公知の添加剤の例を挙げれば、液状配合の場合、エタノールまたはイソプロピルアルコールがある。特に、エタノールまたはイソプロピルアルコールは、それ自体が消毒力を有し、人体に無害であり、特に、前記薬理作用を有する天然抽出物の均一な分散を目的として添加されうる。このようなアルコールとしては、これに制限されるものではないが、１．０重量％〜８０．０重量％、望ましくは、１０．０重量％〜５０．０重量％で含まれうる。

本発明の組成物のうち、液状配合の場合、抗インフルエンザウイルス消毒剤を溶解及び分散させる目的として、望ましくは、精製水を使うことができる。この際、精製水の含量は、添加される成分の含量が定められた以後の残余量であり得る。

本発明のインフルエンザウイルス消毒剤用組成物は、消毒剤または洗浄剤に製剤化されうる。したがって、本発明は、カラタチ種子抽出物を有効成分として含むインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルス消毒剤用組成物を含む洗浄剤及び消毒剤を提供する。

本発明のインフルエンザウイルス消毒剤用組成物は、例えば、動物関連施設及び動物に直接噴射するための抗呼吸器ウイルス消毒剤として製品化され、動物関連施設または衛生を必要とする接客業などで手及び器具などの洗浄のための抗インフルエンザウイルス消毒剤及び洗浄剤として製品化されうる。このような消毒剤または洗浄剤は、本発明のインフルエンザウイルス消毒剤用組成物以外にも、消毒剤または洗浄剤に必要とされる公知の成分をさらに含みうる。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである。
（ｉ）本発明は、カラタチ種子抽出物を有効成分として含むインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスに対する抗インフルエンザウイルス組成物を提供する。
（ｉｉ）本発明の組成物の有効成分であるカラタチ種子抽出物は、インフルエンザウイルスの複製及び感染を抑制することによって、優れた抗ウイルス効果を示す。
（ｉｉｉ）本発明の組成物の有効成分であるカラタチ種子抽出物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、及びインフルエンザＢ型ウイルスの感染を治療するだけではなく、予防する効果を示し、タミフルとは異なって、高濃度でも細胞毒性を示さず、さらに低い濃度で効果を示す。
（ｉｖ）本発明の組成物は、インフルエンザウイルスによる疾患の治療または予防用途の薬剤学的組成物として使われるだけではなく、インフルエンザウイルスによる疾患の改善または予防用途の機能性食品組成物、動物飼料添加用組成物、または消毒剤用組成物として開発が可能である。

図１Ａは、カラタチ種子抽出物のインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルスのＭＤＣＫ細胞結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）に対する抑制効果を示すグラフである。図１Ｂは、ＭＤＣＫ細胞にカラタチ種子抽出物またはタミフルを表示された濃度どおりに処理した後、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルスを感染させた場合、各濃度によるＭＤＣＫ細胞の生存率を示すグラフである。添付の写真は、前記実験で表示された濃度のカラタチ種子抽出物及びタミフルを処理した場合の細胞写真である。図２Ａは、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルスを感染させたＭＤＣＫ細胞にカラタチ種子抽出物またはタミフルを表示された濃度どおりに処理した場合、各濃度によるＭＤＣＫ細胞の生存率を示すグラフである。添付の写真は、前記実験でインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルスを感染させた後、表示された濃度のカラタチ種子抽出物及びタミフルを処理した場合の細胞写真である。図２Ｂは、インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルスを感染させたＭＤＣＫ細胞にカラタチ種子抽出物またはタミフルを表示された濃度どおりに処理した場合、各濃度によるＭＤＣＫ細胞の生存率を示すグラフである。図２Ｃは、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２ウイルスを感染させたＭＤＣＫ細胞にカラタチ種子抽出物またはタミフルを表示された濃度どおりに処理した場合、各濃度によるＭＤＣＫ細胞の生存率を示すグラフである。図２Ｄは、インフルエンザＢ型ウイルスを感染させたＭＤＣＫ細胞にカラタチ種子抽出物またはタミフルを表示された濃度どおりに処理した場合、各濃度によるＭＤＣＫ細胞の生存率を示すグラフである。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

実施例
実験材料及び実験方法
カラタチ種子抽出物の準備
粉砕した１００ｇの乾燥されたカラタチの種子を２日間１Ｌのエタノールで抽出した後、濾過し、回収されたエタノールによるカラタチ種子抽出物を約２〜３日間減圧蒸発後、凍結乾燥して抽出物を収得した。

細胞培養
実験に使われたＭＤＣＫ細胞株は、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙｃｌｏｎｅＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）が含まれたＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）培地で保持した。

インフルエンザウイルスの細胞結合の調査方法
９６ウェルプレートに、分取したＭＤＣＫ細胞を４℃で１時間培養した。インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルス１００ＴＣＩＤ_５０とそれぞれ異なる濃度のカラタチ種子抽出物またはタミフルを混合して細胞株に感染させた後、４℃で３時間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄し、再び３７℃で培養した。４８時間後、細胞生存率を測定した。細胞生存率は、直接顕微鏡下で観察し、ＭＴＴ分析キット（Ｄａｅｉｌｌｌａｂｓｅｒｖｅｒｓｃｏ．Ｓｅｏｕｌ．Ｋｏｒｅａ）を用いて細胞生存率を再び定量数値化した。ＥＣ_５０値は、細胞生存率が５０％である区間の抗ウイルス剤の濃度を求めた値である。

カラタチ種子抽出物のインフルエンザウイルス感染の予防効果の調査方法
９６ウェルプレートに、各ｗｅｌｌ当たり１×１０^４個のＭＤＣＫ細胞を分取して３７℃で１６時間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄した後、それぞれ異なる濃度のカラタチ種子抽出物またはタミフルをＭＤＣＫ細胞に処理した。再び、３７℃で６時間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄し、１００ＴＣＩＤ_５０ＨＩＮ１インフルエンザウイルスを細胞に感染させた後、３７℃で培養した。２時間後、ＰＢＳで３回洗浄して感染されていないウイルスを除去した後、ウイルス成長培地（ＥＭＥＭ、０．３％ＢＳＡ、１％Ｐ／Ｓ、０．０００５％ｔｒｙｓｉｎ）を入れ、３７℃で４８時間培養した後、細胞の病変効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ、ＣＰＥ）を観察した。

カラタチ種子抽出物の抗ウイルス活性の調査方法
９６ウェルプレートに、各ｗｅｌｌ当たり１×１０^４個のＭＤＣＫ細胞を分取して３７℃で１６時間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄した後、それぞれＡ型インフルエンザＨ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２ウイルス、またはＢ型インフルエンザウイルス１００ＴＣＩＤ_５０で、３７℃にて２時間感染させた後、再びＰＢＳで２回洗浄した。インフルエンザウイルスが感染された細胞に、それぞれ異なる濃度のカラタチ種子抽出物またはタミフルを処理した後、３７℃で４８時間培養した。カラタチ種子抽出物の抗ウイルス効果は、ウイルス感染によるＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）阻害有効濃度５０％値（ＥＣ_５０）で示した。カラタチ種子抽出物の細胞毒性濃度の５０％値（ＣＣ_５０）は、細胞の形態学的変形に基づいて決定した。カラタチ種子抽出物の抗インフルエンザウイルスの能力は、ＣＣ_５０値をＥＣ_５０値で割った選択度インデックス（ＳＩ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｅｘ）として示した。

実験の結果
カラタチ種子抽出物のウイルスの細胞結合の抑制効果
前記実験方法によって、インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスとそれぞれ異なる濃度のカラタチ種子抽出物またはタミフルを混合して細胞株に感染させた後、培養した結果、タミフルの場合、あらゆる細胞がウイルスに感染されて、抗ウイルス効果を示していないが、一方、カラタチ種子抽出物は、０．２５μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を示すことによって、ウイルスが細胞に結合する過程を抑制する効果を示した（図１Ａ）。

カラタチ種子抽出物のウイルス予防効果
前記実験方法によって、培養したＭＤＣＫ細胞に、それぞれ異なる濃度のカラタチ種子抽出物またはタミフルをＭＤＣＫ細胞に処理した後、インフルエンザＨＩＮ１ウイルスを細胞に感染させた後、３７℃で４８時間培養して、細胞のＣＰＥを観察した。その結果、タミフルを処理した細胞は、いずれもウイルスに感染されて死ぬ一方、カラタチ種子抽出物を処理した場合には、ＥＣ_５０値が１２３．５μｇ／ｍｌを示した（図１Ｂ）。また、細胞を顕微鏡で観察した結果、タミフルを処理した場合、感染された細胞のような状態を示した一方、カラタチ種子抽出物１２３．５μｇ／ｍｌを処理した場合、正常細胞（Ｎｏｒｍａｌｃｅｌｌ）と類似しているようにウイルスに感染されていない状態を示した（図１Ｂ）。
このような結果は、タミフルとは異なって、カラタチ種子抽出物が、ウイルスが細胞に感染する過程を抑制するということを示すものであって、カラタチ種子抽出物が、インフルエンザに対する高い予防効果を有している可能性を提示する。

カラタチ種子抽出物の抗ウイルス活性
前記実験方法によって、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１、またはＢ型インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させた後、それぞれ異なる濃度のカラタチ種子抽出物またはタミフルを処理して、抗ウイルス活性を分析した（ｐｏｓｔ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｓｓａｙ）。カラタチ種子抽出物の抗ウイルス効果は、ウイルス感染によるＣＰＥ阻害有効濃度５０％値（ＥＣ_５０）で示し、カラタチ種子抽出物の細胞毒性濃度の５０％値（ＣＣ_５０）は、細胞の形態学的変形に基づいて決定した。ＥＣ_５０値とＣＣ_５０値は、ＲｅｅｄとＭｕｅｎｃｈ方法で算出した。
カラタチ種子抽出物の抗インフルエンザウイルスの能力は、ＣＣ_５０値をＥＣ_５０値で割った選択度インデックス（ＳＩ）として示した。表１は、ＭＤＣＫ細胞でタミフルとカラタチ種子抽出物のインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ウイルス、またはインフルエンザＢ型ウイルスに対する抗インフルエンザウイルス活性を比較した結果を示す。

表１から分かるように、陽性対照群として使用したタミフルの場合、ＣＣ_５０値は、１１１１．１μｇ／ｍｌ、ＥＣ_５０値は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２で３．５μｇ／ｍｌ、Ｈ５Ｎ１で１．５μｇ／ｍｌ、Ｂ型ウイルスで１３．７μｇ／ｍｌをそれぞれ示した。カラタチ種子抽出物の場合、細胞毒性が３３３３．３μｇ／ｍｌで示されず、ＥＣ_５０値は、Ｈ１Ｎ１で０．０７μｇ／ｍｌ、Ｈ３Ｎ２で１．５μｇ／ｍｌ、Ｈ５Ｎ１で０．５μｇ／ｍｌ、Ｂ型ウイルスで１３．７μｇ／ｍｌをそれぞれ示した。

Ｈ１Ｎ１感染株に対する結果を見れば、タミフルの場合、５０％以上の抗ウイルス効果を示すＥＣ_５０は、３．５μｇ／ｍｌで観察され、カラタチ種子抽出物の場合、０．２μｇ／ｍｌ以上で５０％抗ウイルス効果（ＥＣ_５０）を示した。また、細胞を顕微鏡で観察した結果、タミフルの場合、感染されて死んだ細胞が多い一方、カラタチ種子抽出物の場合、０．０７μｇ／ｍｌを処理した場合にも、抗ウイルス効果を示した（図２Ａ）。
Ｈ５Ｎ１感染株に対する結果を見れば、タミフルの場合、ＥＣ_５０は、１．５μｇ／ｍｌで観察され、カラタチ種子抽出物の場合、０．５μｇ／ｍｌで５０％抗ウイルス効果（ＥＣ_５０）を示した（図２Ｂ）。
Ｈ３Ｎ２感染株に対する結果を見れば、タミフルの場合、ＥＣ_５０は、３．５μｇ／ｍｌで観察され、カラタチ種子抽出物の場合、１．５μｇ／ｍｌで５０％抗ウイルス効果（ＥＣ_５０）を示した（図２Ｃ）。
インフルエンザＢ型感染株に対する結果を見れば、タミフルとカラタチ種子抽出物のいずれも１３．７μｇ／ｍｌで５０％抗ウイルス効果を示した（図２Ｄ）。

総合して見れば、以上の結果は、カラタチ種子抽出物が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１、またＢ型インフルエンザウイルスに対してタミフルほどの高いレベルの抗ウイルス活性を有していることを示す。このような結果は、カラタチ種子抽出物が、インフルエンザウイルスに対して比較的高いレベルの治療効果を有している可能性を提示する。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。

Claims

カラタチの種子（ｓｅｅｄ）の抽出物を有効成分として含み、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスに対する抗インフルエンザウイルス（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）組成物。
前記組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または治療用薬剤学的組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
前記組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または改善用機能性食品組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
前記組成物は、動物でのインフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防または改善のための動物飼料添加用組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
前記組成物は、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２ウイルス、インフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスによる疾患の予防のための消毒剤用組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。