JP6308515B2 - Cell separation device and cell separation method - Google Patents
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Description
本発明は、細胞分離装置及び細胞分離方法に関する。 The present invention relates to a cell separation device and a cell separation method.
これまで基礎医学実験では細胞集団に対する遺伝子やタンパクに関する解析などが行われてきた。
しかし、同一細胞株の中でも隣接細胞との距離や培養ディッシュ表面の弾性や凹凸の違いにより、個々の細胞が異なる性質を示すことが明らかとなってきた。
So far, basic medical experiments have been conducted on gene and protein analysis for cell populations.
However, it has been clarified that individual cells exhibit different properties depending on the distance from adjacent cells, the elasticity of the surface of the culture dish, and unevenness in the same cell line.
従来の細胞分離技術としては、フローサイトメーターや磁気ビーズ用いた分離法が利用されている。しかしながら、これらの方法で細胞を分離する際には、細胞をトリプシンで処理して剥した上で、抗体や磁気ビーズでラベルする必要があり、細胞へのダメージや変異の誘導などの有害事象が懸念される。
また、レーザーを用いて局所的に細胞を殺すことで細胞を選抜する方法も知られているがこの方法を用いても細胞を剥離・回収するためにはトリプシン処理を必要とする。
As a conventional cell separation technique, a separation method using a flow cytometer or magnetic beads is used. However, when separating cells using these methods, it is necessary to treat cells with trypsin and peel them off, and then label them with antibodies or magnetic beads, which may cause adverse events such as damage to cells or induction of mutations. Concerned.
A method of selecting cells by locally killing the cells using a laser is also known, but even if this method is used, trypsin treatment is required to detach and collect the cells.
これに対して、流路の高さを調節したマイクロ流路チップを用いて、がん細胞をその他の細胞と分離するがん細胞自動分離装置及びがん細胞自動分離方法が提案されている（例えば特許文献１参照。）。 On the other hand, an automatic cancer cell separation apparatus and an automatic cancer cell separation method for separating cancer cells from other cells using a micro flow channel chip in which the height of the flow channel is adjusted have been proposed ( For example, see Patent Document 1.)
一方、生体内で細胞はミクロスケールで規則正しい三次元構造を形成し、近接する細胞や細胞間基質(ＥＣＭ)、血管増殖因子などの液性因子との相互作用を通して細胞機能を発現・維持している。従って、二次元平面上で培養される細胞は生体内と大きく異なる挙動を示している。生体内の三次元環境下で発現している機能を反映した細胞の分離には、三次元環境下で細胞を培養し、細胞の形態変化など特定の性質を示す細胞を分離する必要があるが、既存の技術では困難である。
特定の性質を示す単細胞を分離する技術として、特許文献１に記載の細胞自動分離装置は、未だ改善の余地があった。
On the other hand, cells form a regular three-dimensional structure on a microscale in vivo, and express and maintain cell functions through interactions with neighboring cells, intercellular matrix (ECM), and humoral factors such as vascular growth factor. Yes. Therefore, cells cultured on a two-dimensional plane behave significantly differently from the living body. In order to separate cells that reflect the functions expressed in the three-dimensional environment in the living body, it is necessary to culture the cells in the three-dimensional environment and to isolate cells that exhibit specific properties such as cell shape changes. It is difficult with existing technology.
As a technique for separating single cells exhibiting specific properties, the automatic cell separation apparatus described in Patent Document 1 still has room for improvement.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ゲル内に細胞を内包化させた状態、又は、ゲル上から細胞がゲル内に移動した状態、つまり細胞が三次元環境中で培養されている状態で目的の細胞を分離できる装置及び細胞分離方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is a state in which cells are encapsulated in a gel, or a state in which cells move into the gel from above the gel, that is, the cells are cultured in a three-dimensional environment. It is an object of the present invention to provide a device and a cell separation method that can separate target cells in a state in which the target cells are separated.
発明者らは鋭意検討し、光分解性ゲルを用いることにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。
［１］細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部と、
前記培養部に光を照射する照射部と、を備え、
前記光分解性ゲルは、ゼラチンが光分解性架橋剤で架橋されたものであり、
前記照射部は、光源と、該光源からの光を前記培養部の特定の領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞分離装置。
［２］前記光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有し、前記分岐鎖はポリエチレングリコール鎖を含む分岐鎖状の鎖状構造と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基と縮合反応可能な反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する［１］に記載の細胞分離装置。
［３］前記活性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体である［２］に記載の細胞分離装置。
［４］前記ポリエチレングリコールにおけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［２］又は［３］に記載の細胞分離装置
［５］前記分岐鎖状の鎖状構造が４分岐又は８分岐である［２］〜［４］のいずれか一つに記載の細胞分離装置。
［６］前記分岐鎖状の鎖状構造が、ネオペンチル骨格を有する［２］〜［５］のいずれか一つに記載の細胞分離装置。
The inventors have intensively studied and found that the above problems can be solved by using a photodegradable gel, and have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
[1] a culture part having a photodegradable gel containing cells;
An irradiation unit for irradiating the culture unit with light,
The photodegradable gel, which gelatin is crosslinked with photolytic cross-linking agent,
The said irradiation part has a light source and the irradiation area | region adjustment part which irradiates only the specific area | region of the said culture | cultivation part with the light from this light source, The cell separation apparatus characterized by the above-mentioned.
[2] The photodegradable crosslinking agent has a main chain composed of linear polyethylene glycol or a branched chain of 3 or more branches, and the branched chain has a branched chain structure including a polyethylene glycol chain; A photodegradable benzyl group disposed at the end of the main chain and the end of the branched chain,
The cell separation apparatus according to [1], wherein the benzyl group has an active ester group having reactivity capable of condensation reaction with an amino group or a hydroxyl group, and one or a plurality of nitro groups in the benzene ring.
[3] The cell separation device according to [2], wherein the active ester group is an N-hydroxysuccinimide derivative.
[4] The cell separation device according to [2] or [3], wherein the average number of ethylene glycol repeats in the polyethylene glycol is in the range of 20 to 500. [5] The branched chain structure has four branches or eight. The cell separation device according to any one of [2] to [4], which is a branch.
[6] The cell separation device according to any one of [2] to [5], wherein the branched chain structure has a neopentyl skeleton.
［７］光分解性ゲルに細胞を内包させて、細胞含有光分解性ゲルを得る工程Ａと、
前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程
Ｂと、
前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程Ｃと、
を有し、
前記光分解性ゲルは、光分解性架橋剤と、ゼラチンと、を反応させて得られたものであることを特徴とする細胞分離方法。
［８］前記光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有し、前記分岐鎖はポリエチレングリコール鎖を含む分岐鎖状の鎖状構造と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基と縮合反応可能な反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する［７］に記載の細胞分離方法。
［９］前記活性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体である［８］に記載の細胞分離方法。
［１０］前記ポリエチレングリコールにおけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［８］又は［９］に記載の細胞分離方法。
［１１］前記分岐鎖状の鎖状構造が４分岐又は８分岐である［７］〜［１０］のいずれか一つに記載の細胞分離方法。
［１２］前記分岐鎖状の鎖状構造が、ネオペンチル骨格を有する［７］〜［１１］のいずれか一つに記載の細胞分離方法。
[ 7 ] Step A of encapsulating cells in a photodegradable gel to obtain a cell-containing photodegradable gel;
Irradiating a specific region of the cell-containing photodegradable gel with light to decompose the gel in the specific region; and
A step C of separating cells in the specific region and cells in a region other than the specific region;
I have a,
The cell separation method, wherein the photodegradable gel is obtained by reacting a photodegradable crosslinking agent and gelatin .
[8] The photodegradable crosslinkers, have a backbone or 3 or more branches of the branched-chain consisting of linear polyethylene glycol, the branched chain is a branched chain structure comprising a polyethylene glycol chain, A photodegradable benzyl group disposed at the end of the main chain and the end of the branched chain,
[ 7 ] The cell separation method according to [ 7 ], wherein the benzyl group has an active ester group having reactivity capable of condensation reaction with an amino group or a hydroxyl group, and one or more nitro groups in the benzene ring.
[ 9 ] The cell separation method according to [ 8 ], wherein the active ester group is an N-hydroxysuccinimide derivative.
[ 10 ] The cell separation method according to [ 8 ] or [ 9 ], wherein the average number of ethylene glycol repeats in the polyethylene glycol is in the range of 20 to 500.
[ 11 ] The cell separation method according to any one of [ 7 ] to [ 10 ], wherein the branched chain structure is 4 branches or 8 branches.
[ 12 ] The cell separation method according to any one of [ 7 ] to [ 11 ], wherein the branched chain structure has a neopentyl skeleton.
本発明によれば、細胞が三次元環境中で培養されている状態で目的の細胞を分離できる。 According to the present invention, a target cell can be separated in a state where the cell is cultured in a three-dimensional environment.
［細胞分離方法］
本発明の細胞分離方法は、光分解性ゲルに細胞を内包させて、細胞含有光分解性ゲルを得る工程Ａと、
前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程Ｂと、
前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程Ｃと、
を有する。
[Cell separation method]
The cell separation method of the present invention comprises a step A of encapsulating cells in a photodegradable gel to obtain a cell-containing photodegradable gel;
Irradiating a specific region of the cell-containing photodegradable gel with light to decompose the gel in the specific region; and
A step C of separating cells in the specific region and cells in a region other than the specific region;
Have
幹細胞は、組織形成の大本になる細胞であり、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞などの全能性を有する細胞や間葉系幹細胞などの体性幹細胞の再生治療への応用が検討されている。このような組織由来の幹細胞を医療応用するためには、骨髄や肝臓などの組織から実際に幹細胞を分離したり、分化誘導した細胞を理想的には非標識で分離する必要がある。特許文献１に記すような浮遊細胞による細胞分離方法では、多種ある幹細胞の一部の特徴による分離しかできず、培養状態下の表現型による標的細胞の選別は困難である。特に三次元培養条件下で細胞を分離することができれば、その細胞の高次機能を発現した状態で細胞を分離することが可能となり、分離した細胞を再生医療へ応用することができるようになる。
本発明は、係る幹細胞や分化細胞の単離に好適に用いられる。以下、図１を参照しながら、各工程について具体的に説明する。
Stem cells are cells that become a major tissue formation, and their application to regenerative treatment of somatic stem cells such as mesenchymal stem cells such as embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, etc. Yes. In order to medically apply such tissue-derived stem cells, it is necessary to actually separate stem cells from tissues such as bone marrow and liver, or ideally to separate differentiation-induced cells without labeling. In the cell separation method using floating cells as described in Patent Document 1, it is only possible to separate various characteristics of stem cells, and it is difficult to select target cells based on the phenotype in a cultured state. In particular, if cells can be separated under three-dimensional culture conditions, the cells can be separated in a state in which higher-order functions of the cells are expressed, and the separated cells can be applied to regenerative medicine. .
The present invention is suitably used for isolation of such stem cells and differentiated cells. Hereinafter, each step will be described in detail with reference to FIG.
工程Ａは、光分解性ゲルに細胞を内包させて、細胞含有光分解性ゲルを得る工程である。本発明に用いられる光分解性ゲルは、光分解性を有するものであれば特に限定されないが、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものが好ましい。 Step A is a step of encapsulating cells in a photodegradable gel to obtain a cell-containing photodegradable gel. The photodegradable gel used in the present invention is not particularly limited as long as it has photodegradability, and a photodegradable crosslinking agent and a polymer compound having a total of two or more amino groups or hydroxyl groups in the molecule; What was obtained by making these react is preferable.
光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有することが好ましい。
係る光分解性架橋剤としては、例えば、下記式一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
The photodegradable cross-linking agent is composed of a main chain composed of linear polyethylene glycol or a main chain composed of branched polyethylene glycol having three or more branched chains, and a terminal of the main chain and a terminal of the branched chain. A photodegradable benzyl group disposed,
The benzyl group preferably has an active ester group having reactivity to an amino group or a hydroxyl group and one or more nitro groups in the benzene ring.
Examples of the photodegradable crosslinking agent include compounds represented by the following general formula (1).
前記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｚ、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。
Ｚは、光分解性のベンジル基を表し、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
複数のＡ１は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
該アルキル基中の１個又は非隣接の２個以上の−ＣＨ２−はそれぞれ独立して−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよい。
ｐは０、又は１以上の整数を表し、ｐが１以上の場合、複数存在するＲ２及びＲ４は同一でも異なっていてもよい。Ｒ１〜Ｒ４のうち少なくとも２つ以上のＲがＺを含み、１つ以上のＲが−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚであることとする。
In the general formula (1), R 1 to R 4 are each independently a hydrogen atom, Z, —O (CH 2 CH 2 O) n —Z, or a linear or branched group having 1 to 20 carbon atoms. Represents a chain alkyl group.
Z represents a photodegradable benzyl group, and the benzyl group has an active ester group reactive to an amino group or a hydroxyl group, and one or more nitro groups in the benzene ring.
A plurality of A 1 represent a linking group, each independently represents a single bond or a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms,
One or two or more non-adjacent —CH 2 — in the alkyl group are each independently —CH═CH—, —C≡C—, —O—, —CO—, —COO—, —OCO. -Or may be substituted by a cyclohexylene group.
p represents 0 or an integer of 1 or more, and when p is 1 or more, a plurality of R 2 and R 4 may be the same or different. It is assumed that at least two of R 1 to R 4 include Z, and one or more R is —O (CH 2 CH 2 O) n —Z.
前記一般式（１）で表される光分解性架橋剤が含むポリエチレングリコール分岐鎖のエチレングリコールの平均繰り返し数ｎは、２０から５００の範囲にあり、３０から２５０の範囲にあることがより好ましく、４０から１２５の範囲にあることがさらに好ましい。
エチレングリコールの繰り返し数を上記範囲に設定することで、ゲルの水に対する溶解度を高めることができ、製造時および使用時において扱いの容易で、状態の均一な光分解性ゲルを得ることができる。
The average repeating number n of polyethylene glycol of the polyethylene glycol branched chain contained in the photodegradable crosslinking agent represented by the general formula (1) is in the range of 20 to 500, and more preferably in the range of 30 to 250. More preferably, it is in the range of 40 to 125.
By setting the number of ethylene glycol repeats within the above range, the solubility of the gel in water can be increased, and a photodegradable gel that is easy to handle during production and use and has a uniform state can be obtained.
前記一般式（１）において、Ｚは光分解性のベンジル基である。前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
係るベンジル基としては、下記一般式（２）又は（３）で表される基が好ましい。
In the general formula (1), Z is a photodegradable benzyl group. The benzyl group has an active ester group having reactivity with an amino group or a hydroxyl group and one or more nitro groups in the benzene ring.
The benzyl group is preferably a group represented by the following general formula (2) or (3).
前記一般式（２）〜（３）中、Ｂ１は、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−で表される基を表し、ｍは、０〜５の整数を表し、５が好ましい。
＊は、エチレングリコールの酸素原子との結合位置を表す。
Ｒ５は、水素又は炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルキル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。Ｒ６は、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルコキシ基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基が特に好ましい。Ｒ７は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基を表し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体が好ましく、下記一般式（４）で表される誘導体がより好ましい。
In the general formulas (2) to (3), B 1 represents a group represented by — (CH 2 ) m —C (═O) —NH—, m represents an integer of 0 to 5, 5 is preferred.
* Represents a bonding position with an oxygen atom of ethylene glycol.
R 5 represents hydrogen or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and particularly preferably a methyl group. R 6 represents a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and is a linear chain having 1 to 6 carbon atoms. Are more preferable, and a methoxy group is particularly preferable. R 7 represents an active ester group having reactivity with an amino group or a hydroxyl group, preferably an N-hydroxysuccinimide derivative, and more preferably a derivative represented by the following general formula (4).
前記一般式（４）中、＊は、ベンゼン環の炭素原子との結合位置を表す。ｑは１〜１０の整数を表し、１〜６が好ましく、２〜５がより好ましく、３が特に好ましい。 In the general formula (4), * represents a bonding position with the carbon atom of the benzene ring. q represents the integer of 1-10, 1-6 are preferable, 2-5 are more preferable, and 3 is especially preferable.
前記一般式（１）で表される化合物において、ｐが０の場合、該化合物は、具体的には下記一般式（５）で表される化合物であることが好ましい。 In the compound represented by the general formula (1), when p is 0, the compound is preferably a compound represented by the following general formula (5).
前記一般式（５）中、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。
前記一般式（１）で表される化合物において、ｐが１以上の場合、該化合物は、具体的には下記一般式（６）〜（８）で表される化合物であることが好ましい。
In the general formula (5), Z is the same as that in the general formula (1).
In the compound represented by the general formula (1), when p is 1 or more, the compound is preferably a compound represented by the following general formulas (6) to (8).
前記一般式（６）〜（８）中、ｎ、Ｚ、Ａ１、Ｒ２、Ｒ４、及びｐは前記一般式（１）におけるものと同様である。） In the general formulas (6) to (8), n, Z, A 1 , R 2 , R 4 , and p are the same as those in the general formula (1). )
ｐが１の場合、前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（９）で表される化合物であることが好ましい。 When p is 1, specifically, the compound represented by the general formula (1) is preferably a compound represented by the following general formula (9).
前記一般式（９）中、Ｚ、Ａ１、及びＲ１〜Ｒ４は前記一般式（１）におけるものと同様である。）
前記一般式（９）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１０）又は（１１）で表される化合物であることが好ましい。
In the general formula (9), Z, A 1 and R 1 to R 4 are the same as those in the general formula (1). )
Specifically, the compound represented by the general formula (9) is preferably a compound represented by the following general formula (10) or (11).
前記一般式（１０）〜（１１）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。） In the general formulas (10) to (11), n and Z are the same as those in the general formula (1). )
前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１２）で表される化合物であることが好ましい。 Specifically, the compound represented by the general formula (1) is preferably a compound represented by the following general formula (12).
前記一般式（１２）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。ｐ１は１以上の整数を表す。） In the general formula (12), n and Z are the same as those in the general formula (1). p 1 represents an integer of 1 or more. )
前記一般式（１２）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１３）又は（１４）で表される化合物であることが好ましい。 Specifically, the compound represented by the general formula (12) is preferably a compound represented by the following general formula (13) or (14).
前記一般式（１３）〜（１４）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。）
４分岐又は８分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は合成しやすく、また、入手も容易であることから、前記一般式（１）で表される化合物において、ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐であることが好ましい、
即ち、本発明に用いられる光分解性架橋剤としては、下記一般式（１５）又は（１６）で表される化合物がより好ましい。
In the general formulas (13) to (14), n and Z are the same as those in the general formula (1). )
Since the 4-branched or 8-branched polyethylene glycol (or derivative) is easy to synthesize and is easily available, in the compound represented by the general formula (1), the branched chain of polyethylene glycol is 4-branched or It is preferably 8 branches,
That is, the photodegradable crosslinking agent used in the present invention is more preferably a compound represented by the following general formula (15) or (16).
前記一般式（１５）〜（１６）中、ｎ、Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（２）〜（４）におけるものと同様である。） In the general formulas (15) to (16), n, B 1 , R 5 to R 6 , and q are the same as those in the general formulas (2) to (4). )
前記一般式（１５）〜（１６）で表される化合物において、具体的には下記式（１７）又は（１８）で表される化合物であることが更に好ましい。 In the compounds represented by the general formulas (15) to (16), specifically, a compound represented by the following formula (17) or (18) is more preferable.
また、前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有するものが好ましく、前記式（１７）、前記式（１８）で表される化合物が特に好ましい。 In addition, the polyethylene glycol preferably has a neopentyl skeleton, and the compounds represented by the formula (17) and the formula (18) are particularly preferable.
図２に、前記式（１７）で表される化合物の模式図を示す。図２に示されるように、光分解性架橋剤１は、分岐鎖状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる主鎖２と、この主鎖２及び分岐鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基を含む基３と、ニトロベンジル基を含む基３の末端側に配置された活性エステル基４とからなり、４分岐のポリエチレングリコールの分岐鎖を有し、ポリエチレングリコールの分岐鎖が中心にネオペンチル骨格を有する。
図２および図３（ａ）〜（ｄ）に示すように、主鎖２はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５（―ＮＨＣＯ―）を介して主鎖２に結合している。
FIG. 2 shows a schematic diagram of the compound represented by the formula (17). As shown in FIG. 2, the photodegradable crosslinking agent 1 includes a main chain 2 made of branched polyethylene glycol (PEG), and a photodegradable material disposed on both ends of the main chain 2 and the branched chain. A group 3 containing a nitrobenzyl group, and an active ester group 4 arranged on the terminal side of the group 3 containing a nitrobenzyl group, having a 4-branched polyethylene glycol branched chain, It has a neopentyl skeleton at the center.
As shown in FIG. 2 and FIGS. 3A to 3D, the main chain 2 is polyethylene glycol (PEG). The group 3 containing a nitrobenzyl group is bonded to the main chain 2 via the amide bond portion 5 (—NHCO—).
本発明に用いられる光分解性ゲルは、上述した光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものであることが好ましい。
高分子化合物は、ポリエチレングリコール、塩基性多糖類、タンパク質、及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一つであることが好ましい。
高分子化合物としては、分岐型のポリエチレングリコールもしくはその誘導体、またはタンパク質としてゼラチンがより好ましい。
The photodegradable gel used in the present invention is obtained by reacting the above-described photodegradable crosslinking agent with a polymer compound having a total of two or more amino groups or hydroxyl groups in the molecule. Is preferred.
The polymer compound is preferably at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol, basic polysaccharides, proteins, and derivatives thereof.
As the polymer compound, branched polyethylene glycol or a derivative thereof, or gelatin as the protein is more preferable.
ポリエチレングリコールは細胞との相互作用が少なく、しかも高分子化合物自体が水に可溶であるために好ましい。なかでも、分岐型のポリエチレングリコールまたはその誘導体を用いると、網目構造が形成されやすく、ゲル化が進行しやすくなるため好ましい。分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の分岐数は３以上が好ましい。特に、４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は入手しやすいため好適である。
ポリエチレングリコール（または誘導体）は、末端にアミノ基を有することが望ましい。
ポリエチレングリコール（または誘導体）の分子量は１万から４万の範囲にあることが好ましい。
Polyethylene glycol is preferred because it has little interaction with cells and the polymer compound itself is soluble in water. Among them, it is preferable to use branched polyethylene glycol or a derivative thereof because a network structure is easily formed and gelation easily proceeds. The number of branches of the branched polyethylene glycol (or derivative) is preferably 3 or more. In particular, 4-branched polyethylene glycol (or a derivative) is preferable because it is easily available.
The polyethylene glycol (or derivative) desirably has an amino group at the terminal.
The molecular weight of the polyethylene glycol (or derivative) is preferably in the range of 10,000 to 40,000.
ゼラチンの主成分であるコラーゲンは多細胞生物（動物）の細胞外基質の主成分であることから、細胞の足場タンパク質として好ましく、また、細胞の増殖、分化を促す場合があるために好ましい。用いられるゼラチンの種類は特に制限されないが、ウシ、又はブタ皮由来原料を酸処理して得られたｔｙｐｅＡゼラチンが好ましい。
ゼラチンの強度は特に制限されないが、２００〜４００ブルームが好ましく、２５０〜３５０ブルームがより好ましい。
Collagen, which is the main component of gelatin, is preferable as a cell scaffolding protein because it is a main component of the extracellular matrix of multicellular organisms (animals), and is also preferable because it may promote cell proliferation and differentiation. The type of gelatin used is not particularly limited, but type A gelatin obtained by acid treatment of bovine or pig skin-derived raw materials is preferred.
The strength of gelatin is not particularly limited, but is preferably 200 to 400 bloom, more preferably 250 to 350 bloom.
塩基性多糖類としては、キトサンが好ましい。 As the basic polysaccharide, chitosan is preferable.
高分子化合物と光分解性架橋剤とを混合すると、高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基は、光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋される。
前記アミノ基は光分解性架橋剤の活性エステル基とアミド結合を形成し、前記ヒドロキシル基は活性エステル基とエステル結合を形成する。これによって、網目構造が形成され、ゲル化が進行し、光分解性ゲルが生成する。
本発明では、架橋反応を促進させるための添加剤は特に必要ないため、高分子化合物と光分解性架橋剤とを混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。また、反応時の温度は常温でよいが、高分子化合物としてゼラチンを用いる場合は、反応前溶液のゲル化を避けるなどを目的として加温してもよい。
また、本発明における架橋反応は溶存酸素の影響を受けないため、薄膜状のゲルの形成が容易である。
When the polymer compound and the photodegradable crosslinking agent are mixed, the amino group or hydroxyl group of the polymer compound is condensed and crosslinked with the active ester group of the photodegradable crosslinking agent.
The amino group forms an amide bond with the active ester group of the photodegradable crosslinking agent, and the hydroxyl group forms an ester bond with the active ester group. As a result, a network structure is formed, gelation proceeds, and a photodegradable gel is generated.
In the present invention, since an additive for promoting the crosslinking reaction is not particularly required, the crosslinking reaction occurs only by mixing the polymer compound and the photodegradable crosslinking agent, and the gelation proceeds. The temperature during the reaction may be room temperature, but when gelatin is used as the polymer compound, it may be heated for the purpose of avoiding gelation of the pre-reaction solution.
Further, since the crosslinking reaction in the present invention is not affected by dissolved oxygen, it is easy to form a thin film gel.
高分子化合物に対する光分解性架橋剤の添加量（光分解性架橋剤／高分子化合物）はゲル化する範囲で自由に設定することができるが、強度の高いゲルを調製するためには高分子化合物のアミノ基と光分解性架橋剤の活性エステル基のモル比で１：１程度であることが好ましい。高分子化合物と光分解性架橋剤との混合比は、例えば４分岐型のアミノ末端ポリエチレングリコール（またはその誘導体）を高分子化合物として用い、４分岐型の光分解性架橋剤を用いる場合は、モル比（高分子化合物：光分解性架橋剤）で４：１から１：４の範囲が好ましく、モル比で２：１から１：２の範囲がより好ましい。
高分子化合物の使用量は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の場合、光分解性ゲル中に２．５重量％以上含有されるように設定することができ、ゼラチンの場合、光分解性ゲル中に１．０重量％以上含有されるように設定することができる。
The amount of photodegradable crosslinking agent added to the polymer compound (photodegradable crosslinking agent / polymer compound) can be freely set within the range of gelation. The molar ratio of the amino group of the compound to the active ester group of the photodegradable crosslinking agent is preferably about 1: 1. The mixing ratio of the polymer compound and the photodegradable crosslinking agent is, for example, when using a 4-branched amino-terminated polyethylene glycol (or a derivative thereof) as the polymer compound and using a 4-branched photodegradable crosslinking agent, The molar ratio (polymer compound: photodegradable crosslinking agent) is preferably in the range of 4: 1 to 1: 4, and the molar ratio is more preferably in the range of 2: 1 to 1: 2.
The amount of the polymer compound used can be set so that, for example, in the case of 4-branched polyethylene glycol (or derivative), it is contained at 2.5% by weight or more in the photodegradable gel. It can set so that it may contain 1.0 weight% or more in a degradable gel.
光分解性ゲルに細胞を内包させるに際し、光分解性ゲルは、液体培地を含有することが好ましい。
前記工程Ａにおいて、分別対象となる細胞は、特に限定されず、例えば、生体組織をパパイン緩衝液で処理して単一細胞としたものが好適に用いられる。
その他、目的に応じて、動物由来の細胞（例えばヒト細胞）、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を使用できる。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。
また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等のほか、研究用に樹立された各種株化細胞も本発明の対象となり得る。
When encapsulating cells in the photodegradable gel, the photodegradable gel preferably contains a liquid medium.
In the step A, the cell to be sorted is not particularly limited, and for example, a single cell obtained by treating a biological tissue with a papain buffer is preferably used.
In addition, animal-derived cells (for example, human cells), plant-derived cells, microorganism-derived cells, and the like can be used depending on the purpose.
Specific examples include somatic stem cells such as hematopoietic stem cells, myeloid stem cells, neural stem cells, and skin stem cells, embryonic stem cells, and induced pluripotent stem cells.
Also, leukocytes such as neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, lymphocytes (T cells, NK cells, B cells, etc.), platelets, erythrocytes, vascular endothelial cells, lymphoid stem cells, erythroblasts In addition to blood cells such as myeloblasts, monoblasts, megakaryocytes and megakaryocytes, endothelial cells, epithelial cells, liver parenchymal cells, pancreatic islet cells, etc., various cell lines established for research purposes Can also be the subject of the present invention.
工程Ａについて、図４を参照しながら具体的に説明する。
図４（ａ）は、光分解性架橋剤１の末端側に配置された活性エステル基４と高分子化合物のアミノ基６とが縮合して架橋される反応を示すものである。
図４（ｂ）は、光分解性架橋剤１と高分子化合物７とを反応させることによって、光分解性ゲル１０を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物７は、末端にアミノ基６を有する４分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
高分子化合物７と、光分解性架橋剤１と、上述した細胞と、を混合すると、高分子化合物７のアミノ基６は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物７は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物７と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル１０が生成し、細胞は、光分解性ゲル１０に内包される。
Step A will be specifically described with reference to FIG.
FIG. 4A shows a reaction in which the active ester group 4 arranged on the terminal side of the photodegradable crosslinking agent 1 and the amino group 6 of the polymer compound are condensed and crosslinked.
FIG. 4B schematically shows a reaction for generating the photodegradable gel 10 by reacting the photodegradable crosslinking agent 1 with the polymer compound 7.
The polymer compound 7 is a 4-branched polyethylene glycol derivative having an amino group 6 at the terminal.
When the polymer compound 7, the photodegradable crosslinking agent 1 and the above-described cells are mixed, the amino group 6 of the polymer compound 7 is condensed and crosslinked with the active ester group 4 of the photodegradable crosslinking agent 1. The
As a result, the polymer compound 7 is bonded to the other polymer compound 7 via the photodegradable crosslinking agent 1 to produce a photodegradable gel 10 having a network structure. Included.
また、図４（ｃ）は、光分解性架橋剤１と高分子化合物２７とを反応させることによって、光分解性ゲル２０を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物２７は、ゼラチンに含まれ、分子内にアミノ基を有するコラーゲンである。
高分子化合物２７と、光分解性架橋剤１と、上述した細胞と、を混合すると、高分子化合物２７のアミノ基１６は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物２７は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物２７と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル２０が生成し、細胞は、光分解性ゲル２０に内包される。
FIG. 4C schematically shows a reaction for generating the photodegradable gel 20 by reacting the photodegradable crosslinking agent 1 and the polymer compound 27.
The polymer compound 27 is collagen which is contained in gelatin and has an amino group in the molecule.
When the polymer compound 27, the photodegradable crosslinking agent 1 and the cells described above are mixed, the amino group 16 of the polymer compound 27 is condensed and crosslinked with the active ester group 4 of the photodegradable crosslinking agent 1. The
As a result, the polymer compound 27 is bonded to the other polymer compound 27 via the photodegradable crosslinking agent 1 to produce a photodegradable gel 20 having a network structure. Included.
本発明において、このようにして光分解性ゲルに内包させた細胞を培養することが好ましい。光分解性ゲル中の細胞は、３次元環境下で培養された状態であり、一般的な培養ディッシュ上での培養と比べて、生体内で発現している機能を保持していると考えられる。また、光分解性ゲル中の細胞は、３次元的に他の細胞と分離された状態にあるため、培養により、クローン化した細胞塊が光分解性ゲル中に形成される。 In the present invention, it is preferable to culture the cells encapsulated in the photodegradable gel in this way. The cells in the photodegradable gel are in a state of being cultured in a three-dimensional environment, and are considered to retain the function expressed in the living body as compared with the culture on a general culture dish. . Further, since the cells in the photodegradable gel are three-dimensionally separated from other cells, a cloned cell mass is formed in the photodegradable gel by culturing.
工程Ｂは、前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程である。工程Ｂについて、図５を参照しながら具体的に説明する。
本発明に用いられる光分解性ゲルは、光の照射により光分解性架橋剤１が分解されることによって、分解される。
図５（ａ）は、光分解性架橋剤のニトロベンジル基の分解を示すものである。ニトロベンジル基を含む基３は、例えば波長３３０〜３８０ｎｍの紫外線などの光の照射により、破線位置で分解可能である。
ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５のアミノ基との間の結合が切断され、ニトロベンジル基３’となる。なお、ニトロベンジル基の構造によっては、前記光照射によりニトロベンジル基を含む基３と活性エステル基４との結合が切断されることもある。
図５（ｂ）と図５（ｃ）は、それぞれ光分解性ゲル１０と２０が、光の照射により分解される様子を模式的に示すものである。光分解性ゲルが分解されることにより、光分解性ゲルは水に溶解する。
工程Ｂにおいて、このような、分解メカニズムを示す細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する。つまり、光分解性ゲル内の三次元環境下で培養されている細胞のうち、特定の形態を有する細胞周辺に限定した形で光を照射することで、特定の形態を有する細胞を三次元培養系から分離することができる。例えば、組織を形成する細胞のうち、ごく僅かにしか存在しない幹細胞様の形態を示す細胞を含有する光分解性ゲルに対して、三次元培養系における増殖能や浸潤能を指標に分離する細胞を選定し、選定された細胞に選択的に光照射することにより、幹細胞含有光分解性ゲルのみが分解される。
Step B is a step of irradiating a specific region of the cell-containing photodegradable gel with light to decompose the gel in the specific region. Step B will be specifically described with reference to FIG.
The photodegradable gel used in the present invention is decomposed when the photodegradable crosslinking agent 1 is decomposed by light irradiation.
FIG. 5A shows the decomposition of the nitrobenzyl group of the photodegradable crosslinking agent. The group 3 containing a nitrobenzyl group can be decomposed at the position of the broken line by irradiation with light such as ultraviolet rays having a wavelength of 330 to 380 nm.
The group 3 containing a nitrobenzyl group is cleaved at the bond with the amino group of the amide bond portion 5 to become a nitrobenzyl group 3 ′. Depending on the structure of the nitrobenzyl group, the bond between the group 3 containing the nitrobenzyl group and the active ester group 4 may be cleaved by the light irradiation.
FIG. 5B and FIG. 5C schematically show how the photodegradable gels 10 and 20 are decomposed by light irradiation, respectively. When the photodegradable gel is decomposed, the photodegradable gel is dissolved in water.
In Step B, the specific region of the cell-containing photodegradable gel showing the decomposition mechanism is irradiated with light to decompose the gel in the specific region. In other words, among cells cultured in a three-dimensional environment in a photodegradable gel, cells having a specific form are three-dimensionally cultured by irradiating light in a form limited to the periphery of the cell having a specific form. It can be separated from the system. For example, among cells that form tissues, cells that can be separated from a photodegradable gel containing stem cell-like cells that are present only in a few, using the proliferation ability and invasion ability in a three-dimensional culture system as an index. Is selected, and the selected cells are selectively irradiated with light, whereby only the stem cell-containing photodegradable gel is degraded.
工程Ｃは、前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程である。前記工程Ｂにおいてゲルに内包されていた細胞は、ゲルの分解により、ゲルから分離する。ゲルから分離した細胞は、培地中に浮遊するため、例えば培地を回収するのみの操作により容易に回収される。 Step C is a step of separating cells in the specific area and cells in areas other than the specific area. The cells encapsulated in the gel in the step B are separated from the gel by the degradation of the gel. Since the cells separated from the gel float in the medium, they can be easily recovered, for example, by simply recovering the medium.
このようにして回収された細胞は、マイクロアレイ解析や表面マーカー解析といった一般的な分子生物学的な分析を行うことができる。これにより、三次元培養系の形態情報と分子生物学的な情報を比較することで、細胞の形態と機能の関係を調べることが可能となる。細胞の形態と機能の関係が明らかになることで、特定の機能を有する細胞を三次元培養系の形態情報を元に非破壊かつ非標識で分離することが可能となる。このような分離方法はｉＰＳ細胞や体性幹細胞などの幹細胞から三次元培養系で分化させた細胞群の中から特定の機能を有する細胞を分離する手法としても利用できる。 The collected cells can be subjected to general molecular biological analysis such as microarray analysis and surface marker analysis. This makes it possible to examine the relationship between cell morphology and function by comparing the morphological information of the three-dimensional culture system with the molecular biological information. By clarifying the relationship between cell morphology and function, cells having a specific function can be separated non-destructively and unlabeled based on the morphology information of the three-dimensional culture system. Such a separation method can be used as a method for separating cells having a specific function from a group of cells differentiated in a three-dimensional culture system from stem cells such as iPS cells and somatic stem cells.
［細胞分離装置］
本発明の細胞分離装置は、細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部と、前記培養部に光を照射する照射部と、を備え、前記照射部は、光源と、該光源からの光を前記培養部の特定の領域にのみ照射させる照射領域調整部を有する。
図６を参照しながら、本発明の細胞分離装置の好ましい形態について説明する。
図６に示すように、本実施形態の細胞分離装置５０は、細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部１１と、培養部１１を保持する保持台１２と、培養部１１に光を照射する照射部１３を備えている。
照射部１３は、光源（図示略）と、培養部１１の特定の領域にのみ光照射する照射領域調整部１４（微小パターン光照射ユニット）と、パソコンなどの制御部１５とを有する。
照射領域調整部１４は、所定のパターン１６をなす光１８を培養部１１に照射することができる。パターン１６は表示装置１７に表示される。
[Cell separator]
The cell separation device of the present invention includes a culture unit having a photodegradable gel containing cells, and an irradiation unit that irradiates the culture unit with light, and the irradiation unit includes a light source and light from the light source. Has an irradiation region adjustment unit that irradiates only a specific region of the culture unit.
A preferred embodiment of the cell separation device of the present invention will be described with reference to FIG.
As shown in FIG. 6, the cell separation device 50 of the present embodiment irradiates the culture unit 11 with light, a culture unit 11 having a photodegradable gel containing cells, a holding table 12 that holds the culture unit 11, and An irradiating unit 13 is provided.
The irradiation unit 13 includes a light source (not shown), an irradiation region adjustment unit 14 (micropattern light irradiation unit) that irradiates only a specific region of the culture unit 11, and a control unit 15 such as a personal computer.
The irradiation region adjusting unit 14 can irradiate the culture unit 11 with light 18 having a predetermined pattern 16. The pattern 16 is displayed on the display device 17.
照射領域調整部１４は、例えばＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を備えている。ＤＭＤは複数のマイクロミラーを有し、各マイクロミラーは、制御部１５からの信号により独立に角度を設定できるようにされ、光源からの光を反射することによって、前記信号に応じたパターンの光を培養部１１に照射できるようになっている。
照射領域調整部１４は、レンズ、ミラー、レンズを経て、培養部１１の特定の領域に光１８を照射できる。
光源としては、光分解性架橋剤を分解させ得るものが選択され、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの（例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等）が使用できる。
光の波長域は、例えば２００〜１０００ｎｍを例示できる。特に３００〜６００ｎｍ、なかでも３５０〜４００ｎｍは好適である。照射エネルギーは、通常は０．０１〜１０００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは１〜１０Ｊ／ｃｍ２である。
なお、光を細胞培養基材の一部領域にのみ照射させるための構成としては、ＤＭＤに限らず、液晶シャッターアレイ、光空間変調素子、所定形状のフォトマスク等も採用できる。
The irradiation region adjustment unit 14 includes, for example, a DMD (Digital Micromirror Device). The DMD has a plurality of micromirrors, and each micromirror is independently angled by a signal from the control unit 15. The culture unit 11 can be irradiated with light having a pattern corresponding to the signal by reflecting light from the light source.
The irradiation region adjustment unit 14 can irradiate the specific region of the culture unit 11 with the light 18 through the lens, the mirror, and the lens.
As the light source, a light source capable of decomposing the photodegradable crosslinking agent is selected. For example, a light source capable of irradiating light such as ultraviolet light and visible light (for example, an ultraviolet lamp, a visible light lamp, etc.) can be used.
The wavelength range of light can illustrate 200-1000 nm, for example. In particular, 300 to 600 nm, particularly 350 to 400 nm is preferable. The irradiation energy is usually 0.01~1000J / cm 2, preferably 0.1~100J / cm 2, more preferably 1~10J / cm 2.
Note that the configuration for irradiating only a partial region of the cell culture substrate with light is not limited to DMD, and a liquid crystal shutter array, a light spatial modulation element, a photomask having a predetermined shape, and the like can also be employed.
本発明の細胞分離装置は、上述した本発明の細胞分離方法に好適に用いられる。 The cell separation apparatus of the present invention is suitably used for the above-described cell separation method of the present invention.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
［光分解性架橋剤の合成］
以下は、光分解性架橋剤（４ａｒｍＰＥＧ−ＰＬ−ＮＨＳ）の合成方法である。
Ｎ,Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）洗浄した３−（１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ（６６ ｇ）のＤＭＳＯ（１３０ ｍＬ）溶液に４−｛４−［１−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ｝ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（２．７ ｇ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。濾過後、濾取物をＤＭＳＯで洗浄し、減圧下、全量が約１３０ ｍＬになるまでＤＭＳＯを留去した。得られた残留物にＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＨＳ（ＮＯＦ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、９．６ ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、残渣を氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、数時間〜３日間静置後、析出物を濾取した。析出物を少量のＴＨＦに溶解させ、氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。減圧下、乾燥させた析出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）で分離精製し、得られた化合物のＴＨＦ溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を加えて希釈した。得られたＣＨ２Ｃｌ２溶液を５％塩酸水溶液および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下溶媒を留去し、少量のＴＨＦに溶解させた残渣をエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。析出物を減圧下乾燥後、下記式（１７）で表される目的化合物の光分解性架橋剤を９．８０ ｇ得た。
[Synthesis of photodegradable crosslinking agent]
The following is a method for synthesizing a photodegradable crosslinking agent (4armPEG-PL-NHS).
N, N-dimethylsulfoxide (DMSO) washed 3- (1-piperazino) propyl functionalized silica gel (66 g) in DMSO (130 mL) solution in 4- {4- [1- (9-Fluorenylmethylcarbonyl-ethylamino) ethyl] 2-methoxy-5-nitrophenoxy} butanoic acid (2.7 g) was added, and the mixture was stirred for several tens of minutes to 24 hours under room temperature to reflux conditions. After filtration, the filtered product was washed with DMSO, and DMSO was distilled off under reduced pressure until the total amount was about 130 mL. A tetrahydrofuran (THF) solution of SUNBRIGHT PTE-100HS (NOF CORPORATION, 9.6 g) was added to the obtained residue, and the mixture was stirred for several tens of minutes to 24 hours under room temperature to reflux conditions. After THF was distilled off from the reaction mixture under reduced pressure, the residue was slowly added dropwise to ice-cooled ether and allowed to stand for several hours to 3 days, and then the precipitate was collected by filtration. The precipitate was dissolved in a small amount of THF, slowly dropped into ice-cooled ether, allowed to stand for 1 to 24 hours, and then collected by filtration (repeated twice). The precipitates dried under reduced pressure were separated and purified with Sephadex LH-20 (MeOH), and N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) were added to a THF solution of the obtained compound. Carbodiimide hydrochloride (EDC) was added, and the mixture was stirred for several tens of minutes to 24 hours under room temperature to reflux conditions. After THF was distilled off from the reaction mixture under reduced pressure, dichloromethane (CH 2 Cl 2 ) was added for dilution. The obtained CH 2 Cl 2 solution was washed with 5% aqueous hydrochloric acid solution and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue dissolved in a small amount of THF was added to ether. The solution was slowly added dropwise and allowed to stand for 1 to 24 hours, and then the precipitate was collected by filtration (repeated twice). The precipitate was dried under reduced pressure, and 9.80 g of a target compound photodegradable crosslinking agent represented by the following formula (17) was obtained.
得られた目的化合物についてＮＭＲによる分析を行い、目的の化合物が得られたことを確認した。以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）：１．３５ （ｍ, ２Ｈ）， １．５３ （ｄ, Ｊ ＝ ７．０９ Ｈｚ, ３Ｈ）， １．６０ （ｍ, ４Ｈ）， ２．１８ （ｂｒ ｔ, Ｊ ＝ ７．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．２８ （ｔｔ, Ｊ ＝ ７．３３， ５．９８ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．８５ （ｂｒ ｓ, ４Ｈ）, ２．８８ （ｔ, Ｊ ＝ ７．３３ Ｈｚ， ２Ｈ）, ３．４１ （ｓ, ２Ｈ）, ３．４３ （ｔ, Ｊ ＝ ７．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）, ３．４７‐３．８３ （ｍ， Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）, ３．９４ （ｓ, ３Ｈ）, ４．１５ （ｔ, Ｊ ＝ ５．９８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．４９ （ｄｑ, Ｊ ＝ ７．５７, ７．０９ Ｈｚ， １Ｈ）, ６．３９ （ｂｒ ｄ, Ｊ ＝ ７．５７ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ, １Ｈ）, ７．５６ （ｓ, １Ｈ）.
The obtained target compound was analyzed by NMR to confirm that the desired compound was obtained. The analysis results by NMR are shown below.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ): 1.35 (m, 2H), 1.53 (d, J = 7.09 Hz, 3H), 1.60 (m, 4H), 2.18 (br t, J = 7.21 Hz, 2H), 2.28 (tt, J = 7.33, 5.98 Hz, 2H), 2.85 (br s, 4H), 2.88 (t, J = 7.33 Hz, 2H), 3.41 (s, 2H), 3.43 (t, J = 7.21 Hz, 2H), 3.47-3.83 (m, O (CH 2 CH 2 O N ), 3.94 (s, 3H), 4.15 (t, J = 5.98 Hz, 2H), 5.49 (dq, J = 7.57, 7.09 Hz, 1H), 6 .39 (br d, J = 7.57 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 7.56 (s, 1H).
［細胞含有光分解性ゲルの製造］
ゼラチン（ＴｙｐｅＡ、３００ブルーム、ブタ皮由来）を３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ ７．０) と液体培地（ＦＢＳなし、抗生物質なし）の体積比１：１の混合液に溶解し、 １．２５％，２．５％, ５．０％のゼラチン溶液を得た。これらゼラチン溶液それぞれに、緑色蛍光ＧＦＰ発現安定株ＲＧＭ−ＧＦＰ及び赤色蛍光ＫＯ発現安定株ＲＧＫ−ＫＯを計２．０×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁させ、２種細胞混合溶液を作製した。
この２種細胞混合溶液１５μＬに、上記光分解性架橋剤（４ａｒｍＰＥＧ−ＰＬ−ＮＨＳ）の溶解液（１０ｍＭ クエン酸、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）１５μＬを加え、３７℃３０分間インキュベートした。光分解性架橋剤とゼラチンの混合比は、光分解性架橋剤の活性エステル基／ゼラチンのアミノ基のモル比で０, ０．２,０．４, ０．６の細胞含有光分解性ゲルを作製した。
細胞含有光分解性ゲル中の細胞生存率の評価はＬＩＶＥ ＤＥＡＤ染色を用いて行った。また、細胞含有光分解性ゲルに、ＵＶ照射(３６５ｎｍ, ２６３ｍＷ／ｃｍ２)を行い細胞分離が可能であるか検討を行った。
[Production of cell-containing photodegradable gel]
Gelatin (Type A, 300 Bloom, derived from pig skin) was dissolved in a 1: 1 volume ratio mixture of 300 mM HEPES (pH 7.0) and liquid medium (no FBS, no antibiotics), 1.25%, 2 Gelatin solutions of 5% and 5.0% were obtained. In each of these gelatin solutions, a green fluorescent GFP expression stable strain RGM-GFP and a red fluorescent KO expression stable strain RGK-KO are suspended at a total concentration of 2.0 × 10 6 cells / mL to prepare a mixed solution of two types of cells. did.
15 μL of the photodegradable crosslinking agent (4armPEG-PL-NHS) solution (10 mM citric acid, 140 mM NaCl) was added to 15 μL of this two-cell mixed solution, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The mixing ratio of the photodegradable crosslinker and gelatin is a cell-containing photodegradable gel having a molar ratio of active ester group of the photodegradable crosslinker / amino group of gelatin of 0, 0.2, 0.4, 0.6. Was made.
Evaluation of cell viability in the cell-containing photodegradable gel was performed using LIVE DEAD staining. In addition, the cell-containing photodegradable gel was subjected to UV irradiation (365 nm, 263 mW / cm 2 ) to examine whether cell separation was possible.
最も低架橋密度である１．２５％ゼラチン溶液 (光分解性架橋剤／ゼラチン＝０．２ｗ／ｖｏｌ％)の条件下においてもゲルの作製が可能であった。また、１．２５％ゼラチン溶液を用いたゲル中の細胞生存率は、光分解性架橋剤とゼラチンの混合比に依存し、光分解性架橋剤の活性エステル基／ゼラチンのアミノ基のモル比で０．２〜０．６の範囲で７４〜９２％であり低毒性であることが確認された。
また、１．２５％ゼラチン溶液を用いた細胞含有光分解性ゲルに２分間のＵＶ照射を行い、３７℃で３０分間インキュベートした。結果を図７に示す。図７に示すように、ＵＶ照射により、単一細胞の分離が確認された。また、ＵＶ照射部位外の細胞はゲル内に固定されたままであった。
The gel could be prepared even under the condition of a 1.25% gelatin solution (photodegradable crosslinking agent / gelatin = 0.2 w / vol%) which is the lowest crosslinking density. The cell viability in the gel using a 1.25% gelatin solution depends on the mixing ratio of the photodegradable crosslinking agent and gelatin, and the molar ratio of the active ester group of the photodegradable crosslinking agent / the amino group of gelatin. In the range of 0.2 to 0.6, it was confirmed to be 74 to 92% and low toxicity.
Further, the cell-containing photodegradable gel using a 1.25% gelatin solution was irradiated with UV for 2 minutes and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 7, separation of single cells was confirmed by UV irradiation. In addition, cells outside the UV irradiation site remained fixed in the gel.
以上の結果より、本発明によれば、細胞が三次元環境中で培養されている状態で、ゲルを用いた局所光分解により単一細胞の分離が可能であることが明らかである。 From the above results, it is clear that according to the present invention, single cells can be separated by local photolysis using a gel in a state where the cells are cultured in a three-dimensional environment.
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。 The configurations and combinations thereof in the embodiments described above are examples, and the addition, omission, replacement, and other modifications of the configurations can be made without departing from the spirit of the present invention. Further, the present invention is not limited by each embodiment, and is limited only by the scope of the claims.
本発明は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。 The present invention is useful in the fields of cell engineering, regenerative medicine, bio-related industries, tissue engineering, and the like.
１…光分解性架橋剤、２…主鎖、３，３’…ニトロベンジル基を含む基、４…活性エステル基、５…アミド結合部、６，１６…アミノ基、７，２７…高分子化合物、１０，２０…光分解性ゲル、１１…培養部、１２…保持台、１３…照射部、１４…調整部、１５…制御部、１６…パターン、１７…表示装置、１８…光、５０…細胞分離装置。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Photodegradable crosslinking agent, 2 ... Main chain, 3,3 '... Group containing nitrobenzyl group, 4 ... Active ester group, 5 ... Amido bond part, 6,16 ... Amino group, 7,27 ... Polymer Compound, 10, 20 ... photodegradable gel, 11 ... culture part, 12 ... holding stand, 13 ... irradiation part, 14 ... adjustment part, 15 ... control part, 16 ... pattern, 17 ... display device, 18 ... light, 50 ... cell separator.
Claims (12)
前記培養部に光を照射する照射部と、を備え、
前記光分解性ゲルは、ゼラチンが光分解性架橋剤で架橋されたものであり、
前記照射部は、光源と、該光源からの光を前記培養部の特定の領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞分離装置。 A culture part having a photodegradable gel containing cells;
An irradiation unit for irradiating the culture unit with light,
The photodegradable gel, which gelatin is crosslinked with photolytic cross-linking agent,
The said irradiation part has a light source and the irradiation area | region adjustment part which irradiates only the specific area | region of the said culture | cultivation part with the light from this light source, The cell separation apparatus characterized by the above-mentioned.
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基と縮合反応可能な反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する請求項１に記載の細胞分離装置。 The photodegradable crosslinkers, have a backbone or 3 or more branches of the branched-chain consisting of linear polyethylene glycol, the branched chain is a branched chain structure comprising a polyethylene glycol chain, the main chain And a photodegradable benzyl group disposed at the end of the branched chain and the end of the branched chain,
The cell separation device according to claim 1 , wherein the benzyl group has an active ester group having reactivity capable of condensation reaction with an amino group or a hydroxyl group, and one or a plurality of nitro groups in the benzene ring.
前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程Ｂと、
前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程Ｃと、
を有し、
前記光分解性ゲルは、光分解性架橋剤と、ゼラチンと、を反応させて得られたものであることを特徴とする細胞分離方法。 A step A of encapsulating cells in a photodegradable gel to obtain a cell-containing photodegradable gel;
Irradiating a specific region of the cell-containing photodegradable gel with light to decompose the gel in the specific region; and
A step C of separating cells in the specific region and cells in a region other than the specific region;
I have a,
The cell separation method, wherein the photodegradable gel is obtained by reacting a photodegradable crosslinking agent and gelatin .
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基と縮合反応可能な反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する請求項７に記載の細胞分離方法。 The photodegradable crosslinkers, have a backbone or 3 or more branches of the branched-chain consisting of linear polyethylene glycol, the branched chain is a branched chain structure comprising a polyethylene glycol chain, the main chain And a photodegradable benzyl group disposed at the end of the branched chain and the end of the branched chain,
The cell separation method according to claim 7 , wherein the benzyl group has an active ester group having reactivity capable of condensation reaction with an amino group or a hydroxyl group, and one or a plurality of nitro groups in the benzene ring.
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