JP6319590B2 - マイクロ流体素子を用いるｌａｌ反応性物質試験方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は流体試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を決定する分野に関し、より詳細には、本発明は流体試料中のＬＡＬ反応性物質を測定するための半自動化された方法及び装置に関する。

グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母菌及び真菌などの微生物汚染は、ヒトの重篤な疾病や、時には死の原因となり得る。ヒトがグラム陰性菌に感染すると、この菌は発熱性の細菌性エンドトキシンを産生し得る。エンドトキシンはヒトにとって危険で命にかかわることもある。グラム陰性菌細胞壁のリポ多糖成分であるエンドトキシン分子は、製剤中や医療機器表面に微生物汚染とは関係なく存在し得る。エンドトキシン汚染はシステムが滅菌試験に合格しても起こり得るので、別途エンドトキシン試験が必要となる。

現在、カブトガニ由来の血球ライセートを用いて被検試料中又は表面のエンドトキシンの存在を検出する様々な試験が開発されている。血球ライセートがエンドトキシンに曝露されると凝固が生じる。血球ライセートは、リムルス種、タキプレウス種及びカルシノスコルピウス種など様々なカブトガニ種の血リンパから製造されるアメボサイトライセートである。一般的に使用されるアメボサイトライセートは、リムルス種又はタキプレウス種の血リンパから製造され、リムルスアメボサイトライセート（「ＬＡＬ」）と呼ばれる。ＬＡＬを使用するルーチンの試験としては、ゲル化アッセイ、エンドポイント比濁アッセイ、カイネティック比濁アッセイ、エンドポイント比色アッセイ及びカイネティック比色アッセイが挙げられる。ＬＡＬを使用する試験は、真菌汚染マーカーである特定の種類のグルカンの試験にも用いられる。

ＬＡＬアッセイ及び使用される基準に関するより多くの情報は、米国薬局方（ＵＳＰ）第８５章「細菌性エンドトキシン試験（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ Ｔｅｓｔ）」（ＢＥＴ）、日本薬局方４．０１「エンドトキシン試験法（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｔｅｓｔ）」、欧州薬局方２．６．１４「細菌性エンドトキシン（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ）」及び均等な他の各国薬局方から知ることができる。さらに国際的調和の薬局方情報は、ＩＣＨ Ｑ４Ｂ添付文書１４「エンドトキシン試験法（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｔｅｓｔ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈａｐｔｅｒ）」から知ることができる。医療機器のエンドトキシン試験法についての情報は、ＵＳＰ第１６１章「Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ａｎｄ Ｓｉｍｉｌａｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ」及びＡＮＳＩ／ＡＡＭＩ ＳＴ７２「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ−Ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｔｏ ｂａｔｃｈ ｔｅｓｔｉｎｇ」から知ることができる。これらの基準及び手順は、一般にコンペンディアと呼ぶことができる。

医薬品、医療機器及び食品業界の製造業者は、特定の基準を満たして、製品が微生物又はエンドトキシン汚染を絶対に含まないようにしなければならない。このような業界は、エンドトキシンの存在について頻繁に高確度、高感度の試験を行って、米国食品医薬品局や環境保護庁により定められるものなど様々な安全基準を満たすことを義務付けている。これらの機関では、コンペンディアの手順、基準の多くを認めている。したがって、製造業者が新製品の発売に際し政府の承認を得たい場合、その製品が上記のコンペンディアの方法及び基準に準拠していれば多くのＦＤＡの要件を満たし得る。これにより、新製品についてＦＤＡの承認を得るために製造業者が支払うコストは大幅に減り得る。

これらの機関は、試験結果が悪かった場合又はエンドトキシン濃度が想定外だった場合に、厳格な報告義務を課してもいる。そのような不適合の結果は、徹底調査して原因を究明し、規制機関に説明しなければならない。これには時間も費用もかかる。不適合の結果が試験自体の異常によるもので、実際に試料中又は試料表面にエンドトキシンが存在するのではないことを製造業者が示すことができれば、機関に対する報告要件の多くは満たされ得る。そうすれば、そのような報告の義務を満たすのにかかる時間や費用が削減できる。今日まで、試験自体の異常又はエラーと試料の異常とを区別できる既知の方法や装置は存在しない。

様々なコンペンディアのこれらのアッセイでは、標準品として用いられる既知濃度のエンドトキシン水溶液を必要とする。これらの水溶液は典型的には不安定なので、ふつうは試験の直前に試験現場で粉末状の毒素から作製する。ＬＡＬ試薬もふつうは粉末として販売されるので、使用前に再構成して水溶液にしなければならない。

エンドトキシン及びＬＡＬ粉末の調製は、重要な生物学的分子の溶媒和に時間がかかり、混合中は表面に吸着しやすく、その後表面で凝集しやすいので、困難である。ＬＡＬ試薬はまた、再構成後ゆっくりと反応を開始し、貯蔵寿命が非常に短い。これらを使用直前に混合するのが最良の方法であろうが、ワークフローでは典型的にはプロセス開始時に混合するように指示する。また、調製プロセスは、環境中随所に存在するエンドトキシンの混入が生じやすい。

各機関はまた、使用される装置及び試薬が適切に機能していることを確認するために、一連の較正試験の実施を義務付ける。較正試験及び試料測定は、２回以上行わなければならない。ＢＥＴ及び他のコンペンディアに準拠する現行の実験方法は細目にわたり、流体の体積を繰返し高精度で測定してマイクロプレートなどの複数の入口に汚染なしに分配することを義務付けている。

ＬＡＬ分析は、マイクロウェルプレートとリーダーを使用するのがもっとも一般的な方法である。蓋がなく底が透明窓になっている反応ウェルの行列を、複数の同時アッセイに使用される加熱された分光測光リーダー内に配置する。プレートの準備に時間がかかること、高コスト、間違いと汚染の可能性及び特別に訓練を受けこの作業に特化した技師が作業する必要性を含め、多くの欠点がある。

熟練オペレーターは、測定及び試験の適切な手法及び正確度を確保するために絶えずモニターされるが、繰返動作の正確度を確保するために必要に応じて再度訓練を受ける。典型的な方法には動きが遅く時間がかかる２４８ものピペット操作ステップがあるので、このような方法は複雑さからエラーが起きやすく、操作の長さと数のせいで汚染が生じやすい。

エンドトキシン試験のステップ数を削減するか又はステップの一部もしくは全部を自動化する方法及びデバイスが開発されている。一部の方法は、１又は複数のピペッティングもしくは分注ステップの自動化、試料混合の自動化又は試験数は非常に限られるが試験用基質に試薬をプリロードすることを含む。しかしながら、開発されているどの方法又はデバイスも、基質設計に盛り込まれる低コスト自動化、使い捨ての清浄な基質による清浄性確保、各基質に関するコンペンディア試験法の順守、組込みの個々の試験の測定バリデーション及び測定操作の簡易さ、といった局面のうちの１以上が欠けている。

他にもアッセイプロセスを部分的に自動化するマイクロ流体素子を用いる方法が存在するが、これらはサイズが限られ、また、同じ装置で同じ試薬と標準品を用いて同時に行われる較正ではなく保存された較正に依存するため、コンペンディアの方法に完全に適合するわけではない。また、そのような方法は試料の精密な測定を要し、機器や装置自体ではアリコートを作らない。

他の自動の方法は、試料及び試薬の測定及びマイクロプレートへの分配をロボット技術に依存する。準備が完了すると、手動か又は別のロボットによって、プレートがリーダーにロードされる。ロボットは典型的にはピペットベースの分配システムであり、試料と試薬を正確にバイアルラックからプレートに移し、相互汚染を避けるためピペットのチップを交換する。これはロボット動作のバリデーションを頻繁に行う必要があり、ランごとに複数の使い捨て品（ピペットのチップ、マルチウォール・プレート、希釈チューブ、ピペット・フィリング・トレイ、採取用バイアルなど）を要する、高価なシステムである。また、ウェルを順次準備するので、手動での準備と同様に反応を一斉に開始することができない。やはり汚染の問題があり、プロセスは典型的にはモニターされないので、汚染試料を不合格にする十分に適正な方法はない。

フローインジェクション又はシーケンシャルインジェクションに基づく自動システムも開発されている。このシステムでは、洗浄を必要としないので汚染が生じにくい使い捨てのマイクロ流体素子を使用する。このことは、分析を同時に行うので時短でき、コンペンディアの指定どおりに分析を行うという点で大きな進歩である。

しかし、今日まで、コンペンディアに準拠しながら、較正用標準品及び測定用試料の両方の調製及び測定においてユーザーが行わなければならないステップ数を削減できる既知の方法又は装置はない。したがって、起こり得るオペレーターのエラーの量を低減又は皆無にし、かつコンペンディアに準拠する、流体試料中のエンドトキシン濃度を試験し分析するためのより半自動化された試験方法又は手順が必要とされている。

米国特許出願公開第２０１１／２０１０４９号明細書

本発明は、単一供給源由来の単一試料の複数の分析、追加のエンドトキシン又はグルカンで「スパイク」されている同じ供給源由来、エンドトキシン又はグルカンの標準濃度及びブランク水（「ブランク」又は「ＬＡＬ試薬水」）の分析を含むＬＡＬ分析を実施できるマイクロ流体カートリッジ、システム及び方法を含む。これらの分析は、同一のマイクロ流体カートリッジ又は使い捨てデバイスにおいて同時に実施され得る。

本発明は、どのようなＬＡＬ反応性物質の検出にも使用できる。本明細書では、ＬＡＬ反応性物質とは、ＬＡＬ試薬と反応する物質を意味し、エンドトキシン又はラミナリンやカードランなどの１，３−β−Ｄ−グルカンを含む。本発明は、任意の市販のＬＡＬ試薬又はＬＡＬ反応性物質をアッセイするのに適した他の試薬と一緒に用いることもできる。

本発明は、較正用標準品と試料の両方の調製及び測定においてユーザーが行わなければならないステップの数を削減できる。このことは、高度な技術、経験及び訓練の必要性を緩和し得、コスト、時間及びヒューマンエラーの機会を削減し得る。本発明はまた、試験自体の異常又はエラーと試料の異常とを区別するのに用いることができる。加えて、本発明は、コンペンディアの要件及びＦＤＡの規定に準じる構成とするか又はそのように利用することができる。

本発明はまた、（１）指定量の光学的吸収変化までの時間を濃度と関連づけるカイネティック比色法、（２）所定時間の光学的吸収変化を濃度と関連づけるエンドポイント比色法、（３）指定量の濁度変化（ふつうは光学的吸収で測定）までの時間を濃度と関連づけるカイネティック比濁法及び（４）所定時間の濁度変化を濃度と関連づけるエンドポイント比濁法を含む、反応の進行をエンドトキシン濃度と関連づけるあらゆる定量のコンペンディアの測光法での使用にも適している。ユーザーはこのカートリッジで、各測定用試料の少なくとも２回の純粋すなわち混ぜ物のない分析及び少なくとも２回のスパイクのある分析、ならびに標準品及びブランク（較正用試料）の少なくとも２回の分析ができる。このことは、カートリッジの各流体試料用の試料導入ポート、プロセシング前に試料を収容するリザーバー及び試料が正確な容量に精密に計測され得る少なくとも４区域への分配手段を備えることによって、達成され得る。

本明細書では、「流体試料」という用語は、分析用試料（「測定用試料」）だけではなく、使用されるエンドトキシン検出試薬又はライセートと検出限界で反応を示さない水も含み得る。非反応性水の試料は、「ブランク」「ＬＡＬ試薬水」「ＢＥＴ用水」又は「注射用水」とも呼ばれ得る。「流体試料」という用語は、試薬、標準品、スパイク又は調製された検出試薬を含む調製溶液を含む溶液も含み得る。本明細書では、「試薬」は広義で使用され、あらゆる化学物質又は実験室で用いられて物質、化学物質もしくは溶液を検出、測定、その他検査するか又はそのような検査を補助する溶液を含む。試薬には、標準品及び検出試薬も含まれる。ＬＡＬ反応性物質の好適な検出試薬としては、ＬＡＬ試薬、組み換えＣ因子試薬、組み換えＣ因子とＬＡＬ試薬の混合物、ならびにスシペプチド、スシペプチド断片、スシペプチドダイマー及び他の特異的に結合するタンパク質、たとえばバクテリオファージ由来の抗体や受容体結合性タンパク質を含む標品が挙げられる。「流体試料」という用語はまた、エンドトキシン又はグルカン標準品（「ＬＡＬ反応性物質」又は「標準品」）の調製溶液も含み得る。上述の各流体試料は、専用の導入ポートを有するか又は流体試料のうちの２つ以上が１以上の導入ポートを共有してもよい。

このカートリッジのおかげで、ユーザーは、計測された試料と存在し得る任意の試薬又は標準品とを合わせて混合することができる。カートリッジはまた、１以上の光学チャンバを有し得、光学リーダーに挿入されて流体試料の光学変化が測定され得る。

カートリッジはまた、試料の流体回路網流体素子は含まないブランク及び標準品を分析する類似の構造も含み得るので、標準品又はブランクと試薬とが混合され分析される流体である。濃度が異なる３種以上の標準品が分析され得、各標準品及びブランクは、単一試料の少なくとも３回の反復試験において分析される手段を有している。このようにカートリッジは、３濃度の較正用標準品及びブランクの三重の分析をサポートする。上述のカートリッジは、コンペンディアが義務付けるすべての試験を１個のカートリッジで同一の試料を用いて実施することを可能にする。

一実施形態では、測定用試料、試薬及び標準品はすべて既製の調製液として導入され得る。各タイプの単一流体試料は使い捨て装置に導入されてから分配され得る。

別の実施形態では、ブランク水が、ブランク分析のため及び単一標準品を最高濃度で分配し希釈するために使用され得る。このように、標準品は必要に応じて分配、精密な計測及び混合によって希釈されて、その他の標準品又はスパイクが作製される。

さらに別の実施形態では、カートリッジは標準品、試薬又はそれらの混合物をプリロードされ得る。標準品は、希釈又は再構成され得る液体又は乾燥標品として、カートリッジの所定の部分に単離され得る。こうすれば標準品導入ポートが必要なくなる。単離された標準品は、分配されるか又は装置の混合部分もしくは分析部分で直接使用され得る。標準品の分析では、標準品はブランク水と混合されてから、分配されるか又は直接使用される。スパイクについては、試料、試薬又は試料と試薬の混合物により標準品が再構成され得る。

試薬も、カートリッジ内で液体又は乾燥標品として単離され得、ブランク水により希釈又は再構成されてから分配され使用され得る。このブランク水は、分析されたブランクと同じリザーバーを供給源とし得る。試薬は各混合区域又は各分析に特有の他の区域内に単離されて、ブランク水、試料又はその両方により再構成され得る。

あるいは、試薬と標準品の両方がカートリッジ内で単離され得る。したがって、装置には試料とブランク水を加えるだけで分析ができる。なお、検出試薬又はＬＡＬ試薬が乾燥形態で単離される場合は、ブランク水の代わりに試料又は標準品により再構成され得、分析対象の物質の相対的な濃度が高くなり、アッセイの速度と感度が増加する。

すべての分析用の導入ポート、リザーバー、分配手段、分析区域、計測手段及び混合手段は同じ構成とされ得るので、内部の任意の測定用試料、試薬又は標準品を除いて、分析は互いを正確に反復する。カートリッジは読み取り装置に挿入され得る。読み取り装置はカートリッジを操作する必要なすべての手段を有し得る。操作手段には、限定ではないが、ポンプ、光学素子、温度制御部、環境からの単離部及びそれらの組合せが含まれ得る。あるいは、操作手段はカートリッジ又は使い捨てカートリッジ内にあってもよい。読み取り装置はさらに、メモリー、プロセッサー、ユーザー・インターフェース及び表示又はデータ報告の手段を備えるコンピューターを含み得る。一実施形態では、読み取り装置は光学リーダーであり得る。

読み取り装置は、流体素子のプロセス、特に流体計測及び混合をモニターする手段も含み得る。読み取り装置は、計測、混合又は反応の進行における異常を検出することによってデータをバリデートする手段も有し得るので、異常分析を不合格にできる。

カートリッジの１以上の部分は改変表面を有し得る。改変表面を有する部分は、限定ではないが、チャネル、リザーバー及び光学チャンバを含み得る。表面は、当業者が知るあらゆる手段で改変され得、それには限定ではないが、動力学的に表面を覆い得るコーティング、照射又は溶解した試薬の塗布が含まれるので、表面と試薬又は試料の相互作用は標準的なマイクロプレート分析の相互作用を模倣して、製造業者の仕様又はコンペンディアの分析基準を満たす。

本発明の一態様では、流体試料を試験するマイクロ流体カートリッジが提供される。カートリッジは、２以上の試験モジュールを含み、各試験モジュールは、流体試料のうちの１種を受ける入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含む。各試験チャネルは、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み得る。弁が計測部分と分析部分の間に配置されて、計測部分と分析部分を選択的流体的に隔てて、精密で繰返し性のある計測を可能にし得る。各試験モジュールは、１種以上の試薬が内部に単離されている１以上の試験チャネルを有し得る。

別の実施形態では、１以上の試験モジュールが、８以上の試験チャネルを含む較正モジュールである。２以上のチャネルは内部にＬＡＬ反応性物質がなくてもよく、２以上のチャネルは内部に第１の量のＬＡＬ反応性物質が単離され得、２以上のチャネルは内部に第２の量のＬＡＬ反応性物質が単離され得、２以上のチャネルは内部に第３の量のＬＡＬ反応性物質が単離され得る。

さらに別の実施形態では、１以上の試験モジュールが、４以上の試験チャネルを含む試料測定モジュールである。２以上のチャネルは内部にＬＡＬ反応性物質がなくてもよく、２以上のチャネルは内部に第４の量のＬＡＬ反応性物質を有するスパイクが単離され得る。

別の実施形態では、すべての試験チャネルは内部に１種以上の追加の試薬が単離され得る。追加の試薬は検出試薬を含み得る。別の実施形態では、マイクロ流体カートリッジはさらに、入口ポートと流体連通して余剰の流体試料を回収するための出口ポートを備え得る。この出口ポートは、カートリッジの内側で内部にあってもよいし、外部と流体又は気体連通する開放型ポートであってもよい。

さらに別の実施形態では、弁は、真空、遠心力又は空気圧がアリコートを駆動して弁を通過させ計測部分から分析部分に流れさせるのを許可するように構成される。別の実施形態では、マイクロ流体カートリッジはさらに、分析部分の端部に隣接して計測部分内に配置されて、試験チャネル内に圧力差を発生させる第１の圧力ポートを含み得る。さらに別の実施形態では、マイクロ流体カートリッジはさらに、混合部分内に配置されて、試験チャネル内に圧力差を発生させる第２の圧力弁を含み得る。

別の実施形態では、分析部分は、アリコートの少なくとも一部を受けて流体試料の光学的測定を行う光学チャンバを含み得る。別の実施形態では、混合部分は、アリコートが混合部分内で試薬と混合できるように構成され得る。さらに別の実施形態では、試薬は混合部分内に固定化され得る。

本発明の他の態様では、１種以上の流体試料のＬＡＬ反応性物質を試験する方法が提供される。この方法は、マイクロ流体カートリッジを提供することを含み、該カートリッジは、２以上の試験モジュールを含み、各試験モジュールは、流体試料のうちの１種を受ける入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含む。各試験チャネルは、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み得る。計測部分と分析部分の間には弁が配置されて、選択的流体的に計測部分と分析部分を隔てることができる。方法はさらに、１種以上の流体試料を入口ポートのうちの少なくとも１つに導入することを含み得る。方法はまた、マイクロ流体カートリッジを光学リーダーに導入して、マイクロ流体カートリッジ内の１種以上の流体試料を光学的に測定することを含む。方法はさらに、マイクロ流体カートリッジ内の各試料について試験プロセスを実施し、試験プロセスの測定データを記録することを含む。

別の実施形態では、方法はさらに、各アリコートを計測部分から分析部分に移動させて各試験チャネルの分析部分で光学的測定に供することを含み得る。さらに別の実施形態では、真空、遠心力又は空気圧が、アリコートの流れを駆動して弁を通過させ計測部分から分析部分に流れさせることができる。別の実施形態では、各試験モジュールは、真空又は空気圧がかけられて試験モジュール内に圧力差を発生させてアリコートの流れを駆動し得る１以上の圧力ポートを含み得る。

さらに別の方法の実施形態では、流体試料は手動か又は自動式に入口ポートに導入され得る。

本発明の他の態様では、１種以上の流体試料のＬＡＬ反応性物質を試験する方法が提供される。この方法は、マイクロ流体カートリッジを提供することを含み、該カートリッジは、２以上の試験モジュールを含み、各試験モジュールは、流体試料のうちの１種を受ける入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含む。各試験チャネルは、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み得る。計測部分と分析部分の間には弁が配置されて、選択的流体的に計測部分と分析部分を隔てることができる。方法はさらに、１種以上の流体試料を入口ポートのうちの少なくとも１つに導入することを含み得る。方法はさらに、マイクロ流体カートリッジ内の各試料について試験プロセスを実施し、試験プロセスの測定データを記録することを含む。別の方法では、マイクロ流体カートリッジを光学リーダーに導入してから流体試料を入口ポートに導入することができる。別の方法では、流体試料は試験プロセス中に試薬と混合され得る。さらに別の実施形態では、試薬は混合部分内に固定化され得る。

本発明の別の態様では、測定データは、アリコートの体積、反応動態、流体運動、透過、吸光、光密度、色、明度、色相、スペクトル、濁度、散乱光、化学発光、蛍光及び磁気共鳴を含み得る。試験プロセス及び測定データは、従前の測定データ及び／又は既知の反応動態データを用いて、バリデートされ得る。さらに別の実施形態では、トレーサーを混合部分及び／又は分析部分内に固定化して、アリコート体積の測定に役立てることができる。

本発明の利点は、当業者にとって、例示として示され説明されている以下の本発明の実施形態の説明からより明白になる。本発明は他の異なる実施形態も可能であり、その細部もあらゆる点で変形が可能であることが理解されよう。

本発明のこれら及び他の特性及びそれらの利点を、これから説明する本発明の実施形態で添付の概略的図面を参照しながら例として具体的に説明する。

複数の流体試料を試験するためのカートリッジの例示的実施形態の図である。 試験モジュールの例示的実施形態の図である。 カートリッジの試験モジュールの試験プロセスの概略図である。 カートリッジの試験モジュールの試験プロセスの例示的図である。 カートリッジの試験モジュールの試験プロセスの別の例示的図である。 カートリッジの各試験チャネル内の試薬／反応物質の表である。 カートリッジの各試験チャネル内の試薬／反応物質の代替の表である。 カートリッジで使用される試薬の範囲の表である。 試験モジュールの別の例示的実施形態の図である。 マイクロ流体ディスクの例示的実施形態の図である。

なお、図面はすべて概略的であり、一定の比例に応じて描かれていない。これらの図の各部の相対的な寸法及び比率は、図面の明瞭さと便宜のためにサイズを誇張又は縮小して示されている。異なる実施形態の対応する又は類似の部分への言及には同じ参照番号が広く用いられる。したがって、図面及び説明は限定的ではなく例示的なものと考えられるべきである。

図１を参照すると、試料流体の試験用のメンブレンベースのマイクロ流体素子を用いるＬＡＬ反応性物質試験カートリッジ１０の例示的実施形態が示されている。カートリッジ１０は、試験の確度を高め、測定（タイミング、熱変動、反応開始、試薬混合及び光学的測定）のエラーを削減し、試料汚染を低減し、試料処理量を増加させ、総合的な試験時間を短縮し、組込みの試験バリデーションを利用して信頼性を増大し、あらゆる国際規制機関及び薬局方の要件を満たすことによって、流体試料中のＬＡＬ反応性物質の測定を改善する。ＬＡＬ反応性物質の試験は、マイクロ流体素子を含むカートリッジ１０及び光学的方法を用いて自動化され、高密度の試験が最少量のユーザー入力で実現できる。

一実施形態では、カートリッジ１０は上部プレート１２及び下部プレート１４で形成され、上部プレート１２と下部プレート１４とは一体に接合され、接着剤、超音波溶接又はその他の方法で溶合され密封されて、一体のカートリッジ１０を形成する。複数の試験モジュール１６の少なくとも一部分が上部プレート１２と下部プレート１４の各々に形成されるので、上部プレート１２と下部プレート１４が接合されると試験モジュール１６が密封され画定される。別の実施形態では、カートリッジ１０は単体として射出成型されるので、試験モジュール１６は内部に一体形成される。カートリッジ１０は型押しプラスチックで形成されるが、複数の試験流路を提供でき、以下に説明する試験手順中に使用される試薬及び試料に対し化学的に不活性な任意の他の材料で形成してもよい。一実施形態では、カートリッジ１０は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）及びグリコール改質ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ−Ｇ）又は任意の他の鋳造可能な実質的に透明なポリマーで形成される。一実施形態では、カートリッジ１０は、刻印、高温エンボス加工、マイクロ鋳造、射出成型などで形成される。

図１〜図２に示す例示的実施形態では、各カートリッジ１０は、試験用の２１種の流体試料を受けるほか、米国薬局方（「ＵＳＰ」）第８５章「細菌性エンドトキシン試験」（以後「ＢＥＴ」と呼ぶ）（本明細書にその基準を参照により援用する）に定められるブランク試験ならびに検量線作成ができるように構成される。当業者であれば、図示の本明細書に記載の例示的カートリッジ１０は、内部に形成された２４の試験モジュール１６を含むが、カートリッジ１０の他の実施形態はこれよりも多いか又は少ない数の試験モジュール１６で形成され得ることを理解するはずである。また、当業者であれば、以下の記述はＢＥＴに定められる試験群の実施におけるカートリッジの使用法に関するが、カートリッジ１０は流体試料を試験する他のあらゆる試験法にも使用され、較正試験ならびにベースラインのブランク試験を提供するように構成され得ることも理解するはずである。

一実施形態では、各カートリッジ１０は、図１〜図２に示すように、内部に形成された複数の試験モジュール１６を含む。各試験モジュール１６は、そこに注入される流体を正確に測定し試験するように構成されたマイクロ流体デバイス又は要素である。試験モジュール１６は、入口ポート１８を含み、そこに流体が注入されるか又は他の方法で試験モジュール１６に導入される。試験用流体は、手動か又は自動式に入口ポート１８に導入され得る。入口ポート１８は、試験シーケンスの開始まで流体を保持するリザーバー２０と流体接続される。各試験モジュール１６内で試験される流体は、ピペットで又は流体を正確に測定し、測定した体積の流体を放出できる任意の他の注入装置で入口ポート１８から注入され得る。なお、以下の説明により、試験に必要な量よりも多めの流体（少なめではなく）がリザーバー２０に加えられる限りは、各試験モジュール１６に導入される流体を精密に測定する必要はないことが理解されるはずである。流体は、入口ポート１８を通じて送達されると、リザーバー２０に入る。一実施形態では、試験用に所定量の流体がリザーバー２０に導入される。別の実施形態では、入口ポート１８に導入される流体の量を精密に測定せずに、リザーバー２０を試験用流体で満杯にする。

図２に示すように、リザーバー２０は、移送チャネル２４を介して第１の流体マニフォールド２２と流体連通している。第１の流体マニフォールド２２は、流体を各試験チャネル２６に分配し、また、回収されるべき余剰の流体を出口ポート３０から出口チャネル２８に移送するように構成された細長い中空管である。流体がリザーバー２０に入ると、流体は、その物理的位置や高さから発生するリザーバー２０内の流体のいくらかの静水圧によってリザーバー２０から移送チャネル２４を通って移動し、試料でチャネル２４の壁が濡れることで発生するいくらかの毛管圧力によって容易に移送チャネル２４を通って第１の流体マニフォールド２２に流れる。第１の流体マニフォールド２２は各試験チャネル２６に対し略横断するように配置され、各試験チャネル２６の一端が第１の流体マニフォールド２２の別々の箇所で第１の流体マニフォールド２２と流体連通している。移送チャネル２４は、第１の流体マニフォールド２２の第１の遠位端と流体連通しているか又は隣接し、出口チャネル２８は、第１の流体マニフォールド２２の反対側の第２の遠位端と流体連通しているか又は隣接している。移送チャネル２４は、第１の流体マニフォールド２２と直接接続され、出口チャネル２８は第１の弁３２を介して第１の流体マニフォールド２２と接続されている。第１の弁３２は、第１の流体マニフォールド２２から出口チャネル２８に移送される流体を選択的に許可するどのような弁でもよい。弁の目的は、分析用の１種又は複数の流体の精密な量を分取することである。

一実施形態では、第１の弁３２はバースト弁である。バースト弁は、試験チャネル２６の毛管圧力中で変化する。このことは、流体素子の表面エネルギー及びチャネルのサイズを制御することでなされる。バースト弁は、流体が分析部分３８に早期に入ってしまわないように、使用される。別の実施形態では、第１の弁３２は、たとえばＫａｔｅｒｉｎａ Ｔｓｏｕｇｅｎｉらの「“Ｓｍａｒｔ” Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｗｅｔｔｉｎｇ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｆｉｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｖａｌｖｉｎｇ」（２００９年１１月３０日）に記載されるように、マイクロ流体システムに適した濡れ性勾配で表面操作するプラズマエッチングにより疎水性表面処理して作製される受動弁として形成され得る。当業者であれば、第１の弁３２は、出口チャネル２８と第１の流体マニフォールド２２の間の流路を表面処理して又は流路内に配置される物理的バリア又はメンブレンによって、形成できることを理解するはずである。さらに別の実施形態では、第１の弁３２は、手動、電動又はその前後の圧力差によって選択的に作動されて、流体が第１の流体マニフォールド２２と出口チャネル２８間を流れるのを許可する機械弁である。一実施形態では、圧力差はマイクロ流体カートリッジに遠心力をかけることで発生し得る。別の実施形態では、弁は、回転速度の変化により弁が作動する求心システムで使用するように設計されるサイフォン弁であり得る。さらなる実施形態では、第１の弁３２は、第１の流体マニフォールド２２と出口チャネル２８間の流路内に配置されるメンブレンである。

第１の弁３２は、疎水性多孔質バリアとして構成され、流体が第１の流体マニフォールド２２から出口チャネル２８に自由に流れるのを選択的に防止する。流体は、第１の弁３２を通過して第１の流体マニフォールド２２から出口チャネル２８に選択的に移送される。一実施形態では、流体を第１の流体マニフォールド２２から出口チャネル２８に移送するには、出口ポート３０に圧力差をかけて出口チャネル２８内に陰圧を発生させ、それによって第１の流体マニフォールド２２内の流体が第１の弁３２を越えて又はそうでなければ流れて通過し、出口チャネル２８に流入する。圧力差は真空又は空気圧を利用して発生させることができるが、本明細書では説明を簡単にするため、圧力差は真空をかけるものとして言及される。流体は出口チャネル２８に入ると出口チャネル２８内に単離されるので、すでに試験チャネル２６ａ、２６ｂ、２６ｃ、２６ｄに分配されている流体を希釈したり干渉したりすることはない。

図２に示す試験モジュール１６の例示的実施形態では、４本の試験チャネル２６ａ、２６ｂ、２６ｃ、２６ｄの各々の第１の遠位端は第１の流体マニフォールド２２と流体接続しており、各試験チャネル２６ａ〜２６ｄと隣の試験チャネル２６ａ〜２６ｄとの間には間隔がある。当業者であれば、例示的実施形態では第１の流体マニフォールド２２と流体接続する４本の試験チャネル２６ａ〜２６ｄを示すが、試験モジュール１６は、試験チャネル２６で試験される流体の一部を受けるのに、第１の流体マニフォールド２２と流体接続する試験チャネル２６を何本含んで形成されてもよいことを理解するはずである。各試験チャネル２６ａ〜２６ｄは、第２の弁３４によって第１の流体マニフォールド２２と隔てられ、該第２の弁３４は、流体が第１の流体マニフォールド２２と試験チャネル２６の間を流れるのを選択的に防止するように構成される。一実施形態では、第２の弁３４は各々、上述した第１の弁３２と同じ種類である。別の実施形態では、第２の弁３４のうちの少なくとも１つは、第１の弁３２と同じ種類である。さらなる実施形態では、第２の弁３４は第１の弁３２とは違う種類として形成される。第２の弁３４は、流路内に配置される機械弁、メンブレン、インサート、もしくは薄膜であり得又は第１の流体マニフォールド２２と試験チャネル２６ａ〜２６ｄの間の流路の表面処理によって形成され得る。各第２の弁３４は、手動もしくは電動で作動するか又はその前後の圧力差によって作動できる。第２の弁３４の例示的実施形態は、バースト弁、プラズマエッチングにより疎水性表面処理して作製される受動弁、疎水性多孔質メンブレン、機械弁又は第１の流体マニフォールド２２と各試験チャネル２６ａ〜２６ｄの間の選択的な流体フローを十分提供できる任意の他の種類の弁であり得る。

図示の例示的実施形態では、各試験チャネル２６ａ〜２６ｄは、図２に示すように、互いに流体接続される計測部分３６、分析部分３８及び混合部分４０で形成される。各部分は、試験チャネル２６の隣接する部分間を流体がそれを通過して選択的に移動するのを許可する弁又は別の疎水性バリアによって、隣の部分と随意に隔てられる。計測部分３６は第１の流体マニフォールド２２に隣接して配置され、第２の弁３４は計測部分３６の一端に配置される。計測部分３６は、第１の流体マニフォールド２２と試験チャネル２６の分析部分３８との間に配置される。計測部分３６は、流体中にさしたる気泡の形成なく流体が容易に流れることができる管状流路である。

第３の弁４２は、計測部分３６の反対側の端に隣接して配置され、該第３の弁４２は図２に示すように試験チャネル２６の計測部分３６と分析部分３８の間に配置される。第３の弁４２は、流体が計測部分３６と分析部分３８の間を自由に流れるのを選択的に防止するように構成される。第３の弁４２は、流路内に配置される機械弁、メンブレン、インサート、もしくは薄膜であり得又は計測部分３６と分析部分３８の間の流路の表面処理によって形成され得る。各第３の弁４２は、手動もしくは電動で作動するか又はその前後の圧力差によって作動できる。第３の弁４２のどの例示的実施形態も、バースト弁、プラズマエッチングにより疎水性表面処理して作製される受動弁、機械弁などであり得る。

一実施形態では、図２に示すように、第１の圧力ポート４４が第３の弁４２に隣接して、試験モジュール１６の対応する試験チャネル２６ａ〜２６ｄと流体連通して、配置されている。第１の圧力ポート４４は、計測部分３６に対し略垂直に延びる。第１の圧力ポート４４は、真空又は圧力差を試験チャネル２６内に発生させて、試験モジュール１６の部分を隔てる疎水性表面又は疎水性多孔質メンブレンを越えて流体が移動するか又は引かれるのを補助するように構成される。疎水性多孔質メンブレン（図示せず）又は他の弁が第１の圧力ポート４４内に配置されて、流体が計測部分３６から第１の圧力ポート４４を通って回収されるのを防止する。図２に示すように、各試験モジュール１６の各試験チャネル２６の第１の圧力ポート４４は、第２のマニフォールド４６（図１）と流体的かつ機能的に接続し、カートリッジ１０内の各試験モジュール１６の各第１の圧力ポート４４が同時に操作できるようになっている。各第１の圧力ポート４４を通じて真空又は圧力差が発生すると、試験チャネル２６の隣り合う部分内の圧力が低下し、それによって流体が第１の圧力ポート４４の方に引かれる。たとえば、流体がリザーバー２０に注入されて第１の流体マニフォールド２２に充填された後、第１の圧力ポート４４で真空又は圧力差が発生すると、流体は第２の弁３４を通過して計測部分３６へと引かれる。真空又は圧力差は、流体を計測部分３６に引き込むには十分であるが、それ以上第１の圧力ポート４４を通って引くことはない圧力差を発生させる。

各計測部分３６の第２の弁３４と第３の弁４２とは所定の距離だけ離れて、その間に特定量の流体を正確に保持する。第１の圧力ポート４４に真空又は圧力差をかけると、流体の精密な容量つまりアリコートが、各試験チャネル２６の計測部分３６に引き込まれる。その後第１の流体マニフォールド２２内に残っている流体の残分は、上で説明したようにして、出口ポート３０から回収される。流体のアリコートが測定され、各計測部分３６内で第２の弁３４と第３の弁４２の間に保持されると、第２の弁３４と第３の弁４２は、この流体を、第１の圧力ポート４４で真空又は圧力差がかかることなくそれらの間に維持することができる。

試験チャネル２６の分析部分３８は、図２に示すように、第３の弁４２及び計測部分３６の一端に隣接して配置される。分析部分３８は、第３の弁４２と随意の第４の弁５０の間に配置される光学チャンバ４８を含む。光学チャンバ４８は、その内部に流体の少なくとも一部が配置されたとき、この流体を分光測光法により光学的に分析、モニターできるように構成される。光学チャンバ４８は、正確に光密度が測定できるように構成され、流体の固定化又は混合チャンバとしても使用できる。光学チャンバ４８は、（１）物質及びリーダーのベースラインデータを得るため、試薬の添加又は試薬との混合前、（２）流体のベースラインデータを得るため、試薬／反応物質の添加又は混合後、ただし試薬の溶媒和前及び（３）分析及び試験プロセスの間の流体の継続的モニタリング、を含むあらゆる分析段階で、流体の光密度をモニターする能力を提供する。試薬／反応物質の添加又は混合後、ただし試薬の溶媒和前に、光学チャンバ４８はその内部の流体を光学チャンバ４８表面の光反射の変化によって分析するのに使用され得る。これは、出発点を設けて、その後の光学的測定のタイミングの正確度を高めるためになされ得る。光学チャンバ４８は、通常の（ｎｏｒｍａｌ）光学的モニタリング波長で自然吸光によって、通常の光学的モニタリング波長でトレーサーを用いて、代替の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）光学的モニタリング波長で自然吸光によって及び／又は代替の光学的モニタリング波長でトレーサーを用いて、試薬の適正な量を確認又はチェックするのに使用され得る。トレーサーとは、流体に添加されて、体積、流体の所在及び動き（流体の運動）の決定を補助する不活性化合物である。トレーサーは、測定データのバリデーションの補助にも使用され得る。好適なトレーサーとしては、限定ではないが、色素が挙げられる。標準的な汎用のプレートリーダーと比べて、光学チャンバ４８内の流体の継続的モニタリングは相当高頻度で実施でき、高時間分解能、より良好なノイズ除去及びデータのエンドポイントまでより正確に外挿することが提供される。光学チャンバ４８内の流体の継続的モニタリングは、専用リーダー内に固定された光学素子でも実施できる。

カートリッジの１以上の部分は改変表面を有し得る。改変表面を有する部分は、限定ではないが、チャネル、リザーバー及び光学チャンバを含み得る。表面は、当業者が知るあらゆる手段で改変され得、それには限定ではないが、動力学的に表面を覆い得るコーティング、照射、プラズマエッチング又は溶解した試薬の塗布が含まれるので、表面と試薬又は試料の相互作用は標準的なマイクロプレート分析の相互作用を模倣して、製造業者の仕様又はコンペンディアの分析基準を満たす。

一実施形態では、マイクロ流体チャネルの表面を改変して、生化学的なＬＡＬとＬＡＬ反応性物質の相互作用を制御するか又は表面エネルギーを制御することができる。表面の化学物質の反応化学物質との相互作用のレベルを制御することで、生化学的パフォーマンスの繰返し性及び確度が向上し得る。たとえば、カートリッジの製造に適した材料も、ＬＡＬ又はＬＡＬ反応性物質の反応特性を生化学的に阻害又は増強し得る。この材料表面と反応化学物質との生化学的相互作用は、コーティング塗布又は表面の化学的改変によって、抑制又は削減できる。加えて、カートリッジの未改変表面は、カートリッジ内のマイクロ流体素子にとって望ましくない表面エネルギーを有し得る。化学的改変又はコーティング付加により表面エネルギーも所望の値に改変して、表面エネルギーをより親水性又はより疎水性にするか、あるいはこれらの２つの状態の中間の任意の他の表面エネルギーを得ることができる。表面エネルギーを最適化することによって、カートリッジ内のマイクロ流体素子も最適化され得る。

カートリッジ表面を改変する別の手段としてプラズマエッチングが挙げられるが、これは表面をプラズマ曝露して表面の最終的な特定の化学的構造に影響を及ぼすことで改変するものである。たとえば酸素やアンモニアなど種々の成分をプラズマに添加して、表面の化学的構造を改変することができる。その他の手段としては、恒久的静的又は動的表面コーティングの使用が挙げられる。静的表面コーティングを加えてカートリッジ表面に層を形成して、表面特徴を変えることができる。静的表面コーティングは、溶媒とともに溶液として塗布して乾燥させるか又はコーティングが表面に化学結合する表面グラフトにより施すことができる。グラフトされるか又はコーティングとして塗布され得る静的コーティングの例としては、限定ではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びコラーゲンが挙げられる。動的表面コーティングは、試薬、試料又は標準品に添加されて、カートリッジ内を移動する流体として現場で表面を被膜し得る。カートリッジ内に保存されている標準品にコーティング材料を添加するとき、コーティング材料は、標準品を必要としない試験チャネル内にこれら標準品なしで保存することもできる。動的コーティングの例としては、限定ではないが、ＰＥＧ及びデオキシコール酸ナトリウムのような界面活性剤が挙げられる。

一実施形態では、光学リーダー（図示せず）は固定された光学的構成要素を含む。固定された光学的構成要素には、低コストのＬＥＤ及びフォトダイオードが含まれ得る。リーダーは、バンドパスフィルターを含んで、光学的測定の確度を高めることができる。リーダーはまた、調節されるか又は電子的に断続されて（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃａｌｌｙ ｃｈｏｐｐｅｄ）、光学ノイズを低下させ、環境光を拒絶し、迷光を拒絶することもできる。リーダーはまた、多重光学的構成要素を含み得るので、モニタリング点の行列は各々の行又は列に１個の構成要素を有し、時分割多重化（ｔｉｍｅ−ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）読み取りスキームにより構成要素のコストを下げることができる。窓、暗視野、絞り、レンズ、反射器又は散光器などの光学的構成要素は、マイクロ流体カートリッジ自体に内蔵されて、光路の一部を提供するか又はシステムの安定性もしくは感度を増大することができる。

好適なリーダーは、限定ではないが、透過、吸光、光密度、色、明度、色相、スペクトル、濁度、散乱光、化学発光及び蛍光などを含む様々な光学的検知方法及び測定法を使用するか又は実施し得る。

検知される光は、単一の波長もしくは分光帯又は複数の波長もしくは帯の光であり得る。複数の明帯を用いて、信号を増大するか又は干渉及びノイズを低減することができる。たとえば、複数の周波数で光密度の変化をモニターすると、不安定な試料の色の干渉を減じることができる。

使用される検知法は、ラマン分光法、磁気共鳴及び表面プラズモン共鳴などのより複雑な光学的方法、ならびに電気容量、粘性、磁性、音響抵抗（ｓｏｎｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）及び音響屈折（ｓｏｎｉｃ ｒｅｆｒａｃｔｉｏｎ）などの非光学的方法を含み、流体の変化を遠隔でも検知する能力があり得る。

第４の弁５０は、図２に示すように各試験チャネル２６の分析部分３８と混合部分４０の間に配置される随意の弁である。第１の弁３２、第２の弁３４、第３の弁４２と同じく、第４の弁５０は、試験チャネル２６の２つの隣接する部分の間に選択的バリアを設けるように構成され、そうすることで流体が第４の弁５０上を流れるか又は通過するのを選択的に防止する。第４の弁５０は、分析部分３８と混合部分４０の間の流体の流れを選択的に防止するように構成される。第４の弁５０は、流路内に配置される機械弁、メンブレン、インサート、もしくは薄膜であり得又は分析部分３８と混合部分４０の間の流路の表面処理によって形成され得る。第４の弁５０は、手動もしくは電動で作動するか又はその前後の圧力差によって作動できる。第４の弁５０のどの例示的実施形態も、バースト弁、プラズマエッチングにより疎水性表面処理して作製される受動弁、機械弁などであり得る。

図２に示すように、第４の弁５０は各混合部分４０の一方の遠位端に配置され、第２の圧力ポート５２は混合部分４０の反対側の遠位端に配置される。第２の圧力ポート５２は、試験モジュール１６の対応する試験チャネル２６ａ〜２６ｄと流体連通している。第２の圧力ポート５２は、混合部分４０に対し略垂直に延びる。第２の圧力ポート５２は、真空又は圧力差を試験チャネル２６内に発生させて、試験モジュール１６の部分を隔てる疎水性表面又は弁を越えて流体が移動するか又は引かれるのを補助するように構成される。疎水性多孔質メンブレン（図示せず）又は他の弁が第２の圧力ポート５２内に配置されて、流体が混合部分４０から第２の圧力ポート５２を通って回収されるのを防止する。図２に示すように、各試験モジュール１６の各試験チャネル２６の第２の圧力ポート５２は、第３のマニフォールド５４（図１）と流体的かつ機能的に接続し、カートリッジ１０内の各試験モジュール１６の各第２の圧力ポート５２が同時に操作できるようになっている。各第２の圧力ポート５２を通じて真空又は圧力差が発生すると、試験チャネル２６の隣り合う部分内の圧力が低下し、それによって流体が第２の圧力ポート５２の方に引かれる。たとえば、流体が計測部分３６内に移動した後、第２の圧力ポート５２で真空又は圧力差が発生すると、流体は第３の弁４２、第４の弁５０を通過して混合部分４０へと引かれる。真空又は圧力差は、流体を混合部分４０に引き込むのには十分であるが、それ以上第２の圧力ポート５２を通って引くことはない圧力差を発生させる。

混合部分４０は、細長い中空構造であり、図２に示すように、試験チャネル２６の第１の流体マニフォールド２２の反対側の端部を形成する。試験チャネル２６の混合部分４０は、試験用流体が試薬又は他の物質と混合部分４０内で混合できるように構成される。流体試料と混合される試薬又は他の反応物質は、混合部分４０内にプリロードすることもできるし又は試験プロセス中に混合部分４０内に導入することもできる。一実施形態では、混合部分４０の容積は計測部分３６の容積よりも大きいので、混合部分４０内で流体は適切に混合される。混合部分４０は、流体が第２の圧力ポート５２の方へ、そして第１の圧力ポート４４の方へと交互に引かれ、チャネル２６の混合部分４０内を前後に移動できるように構成され、それによって流体は混合部分４０内であらゆる試薬又は反応物質と混合される。

リザーバー２０、移送チャネル２４、第１の流体マニフォールド２２及び試験チャネル２６の各表面は、それらの内部を流体が流れることができるように構成される。これらの表面は、試験モジュール１６の各部分内で流体が毛管的な動きをすることも可能にし、この流体の動きは第１の弁３２、第２の弁３４、第３の弁４２及び／又は第４の弁５０により選択的に阻止される。試験モジュール１６は、圧力差を発生させて、流体に試験モジュール１６の部分間の弁及び他のバリアを通過させることによって、流体を試験モジュール１６のある箇所又は部分から他へ移動させるように構成される。

カートリッジ１０の試験モジュール１６内の例示的な試験プロセス又は方法は、図３のステップ１００に示すように、入口ポート１８を介してリザーバー２０に流体を入れておくことを含む。次いで流体は、移送チャネル２４を介してリザーバー２０から第１の流体マニフォールド２２に移送される。次のステップ１０２は、計測部分３６内に精密に計測された流体のアリコートを作製することを含む。このことは、第２の流体マニフォールド４６（図１）を介して各第１の圧力ポート４４に真空をかけて試験チャネル２６内に圧力差を発生させることによってなされ得、この真空のせいで計測部分３６（流体の下流側）内の圧力はリザーバー２０（流体の上流側）内の圧力よりも低くなる。計測部分３６内の圧力差によって、流体は第２の弁３４を通過して各計測部分３６に流入する。試験モジュール１６のすべての第１の圧力ポート４４で同時に真空を発生させることができる。別の実施形態では、真空を順次又は非同時に発生させて、流体を計測部分３６に引き込む。真空は、各計測部分３６が流体で完全に満たされるまで各第１の圧力ポート４４にかけられ、精密な量の流体が第２の弁３４と第３の弁４２の間に収容される。流体のアリコートが計測部分３６内に配置されると、第１の圧力ポート４４の真空を停止する。

流体のアリコートが試験チャネル２６の各計測部分３６内に収容されると、図３の次のステップ１０４に示すように、第１の流体マニフォールド２２、移送チャネル２４及びリザーバー２０内に残っている余剰の流体は出口チャネル２８に移送される。流体は、出口ポート３０に真空をかけて出口チャネル２８（流体の下流側）内の圧力を第１の流体マニフォールド２２（流体の上流側）内の圧力よりも低くすることによって回収される。出口チャネル内の圧力差のせいで、流体は第１の弁３２を通過して出口チャネル２８に流入し、出口ポート３０のところで止まる。流体は、出口チャネル２８内に単離されるので、すでに試験チャネル２６ａ、２６ｂ、２６ｃ、２６ｄに分配されている流体を希釈したり干渉したりすることはない。余剰の流体がすべて出口チャネル２８に保存されると、出口ポート３０にかける真空を停止できるが、出口チャネル２８内に保存された流体が第１の流体マニフォールド２２内に戻らないように、出口ポート３０は開放せず閉鎖しておくべきである。

流体のアリコートが各計測部分３６に入ると、試験モジュール１６の試験プロセスは次に、図３のステップ１０６にあるように、流体のアリコートを各計測部分３６から分析部分３８に又は（第４の弁５０がない場合は）分析部分３８及び混合部分４０に移送することを含む。少なくとも流体の一部分が分析部分３８に入ると、流体は、図３の次のステップ１０８にあるように、混合部分４０内で何らかの試薬又は反応物質と接触する前に、分光測光法（ｐｈｏｔｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）又は任意の他の光学的測定プロセスにより分析される。第３の流体マニフォールド５４（図１）を介して各第２の圧力ポート５２に真空をかけると、真空のせいで混合部分４０（流体の下流側）内の圧力が第１の流体マニフォールド２２（流体の上流側）内の圧力よりも低くなり、混合部分４０内に圧力差が発生して、流体は各試験チャネル２６の分析部分３８か又は光学チャンバ４８及び混合部分４０に引き込まれる。混合部分４０内の圧力差によって、流体のアリコートは第３の弁４２を通過して各分析部分３８に流入する。試験モジュール１６のすべての第２の圧力ポート５２で真空を同時発生させることができる。別の実施形態では、真空を順次又は非同時に発生させて、流体を分析部分３８に引き込む。真空は、流体の全アリコートが第３の弁４２を通過し、計測可能な量の流体が分析部分３８内に収容されるまで、各第２の圧力ポート５２にかけられる。流体の全アリコートが分析部分３８内に配置されるか又は光学チャンバ４８及び混合部分４０に入ると、第２の圧力ポート５２の真空を停止し、未反応流体が光学チャンバ４８内で分析される。

試験チャネル２６が分析部分３８と混合部分４０の間に第４の弁５０を含む場合の試験モジュール１６の試験プロセスでは、図３のステップ１０６にあるように、流体の全アリコートが光学チャンバ４８に移送され、第３の弁４２と第４の弁５０の間に収容されるまで、各第２の圧力ポート５２に真空をかける。流体の全アリコートが各試験チャネル２６の分析部分３８内に配置されると、第２の圧力ポート５２の真空を停止し、図３のステップ１０８に示すように、光学チャンバ４８内の未反応流体を分析させる。流体の分析が終了すると、ステップ１１０に示すように、第２の圧力ポート５２に真空をかけ流体全体に圧力差を発生させて流体を引き第４の弁５０を通過させることによって、流体の全アリコートを混合部分４０に移送する。流体のアリコートが混合部分４０に移送されると、第２の圧力ポート５２の真空を停止する。

流体のアリコートが各試験チャネル２６の混合部分４０内又は分析部分３８及び混合部分４０内に配置されると、図３のステップ１１２に示すように、流体は混合部分４０内で試薬／反応物質と混合される。一実施形態では、混合部分４０内の試薬／反応物質は、混合部分４０内にプリロード又は予め付着させるので、試薬／反応物質は試験モジュール１６の試験プロセスの開始前に混合部分４０に配置されている。

別の実施形態では、混合部分４０内の試薬／反応物質は、試験モジュール１６の試験プロセスが開始してから、混合部分４０に導入される。混合部分４０内での流体と試薬／反応物質との混合では、第１の圧力ポート４４と第２の圧力ポート５２に交互に真空をかけ、ただし一方の圧力ポートに真空がかかるときは他方にはかからないようにして、流体を各圧力ポートの方に移動させて混合部分４０内で流体移動を生じさせて、流体が試薬／反応物質と混ざるのを可能にする。一実施形態では真空を継続的にかけるが、第１の圧力ポート４４と第２の圧力ポート５２のいずれか一方に真空がかかり、一方の圧力ポートに真空がかかっているとき他方の圧力ポートにはかかっていないので、第１の圧力ポート４４と第２の圧力ポート５２に交互に真空がかかる。別の実施形態では、第１の圧力ポート４４と第２の圧力ポート５２のいずれか一方に真空をかけて、流体を当該圧力ポートの方に移動させ、所定の時間真空を停止してから、第１の圧力ポート４４と第２の圧力ポート５２の他方に真空をかけて、混合部分４０内で流体を逆方向に移動させる。なお、当業者であれば、第１の圧力ポート４４と第２の圧力ポート５２のどちらにも真空がかからない所定の待ち時間もあり得ることを理解するはずである。第１の圧力ポート４４と第２の圧力ポート５２の各々に真空をかける回数は、試験の種類又は混合部分４０内の試薬／反応物質の種類によって変わり得るが、当業者であれば、流体は、試薬／反応物質と十分に混ざるように各々の圧力ポートの方に何回でも移動させてよいことを理解するはずである。

このカートリッジ１０のマイクロ流体特性は、内部の流体のスラグフロー（ボーラス混合）を提供する。マイクロ流体素子は、流れのチャンバ及びチャネルへの出入りを伴い、流路は方向によって変化する。

別の実施形態では、流体のアリコートが混合部分４０内の試薬／反応物質と完全に混ざると、流体の全アリコートは分析部分３８に移送されて引き続き試薬／反応物質と反応し、混合された流体は光学チャンバ４８内で一定の時間かけて分析されモニターされる。

試験モジュール１６の試験プロセスにおける次のステップは、図３のステップ１１４に示すように、反応済流体を各試験チャネル２６の分析部分３８に移送することを含む。この移送ステップは、第１の圧力ポート４４には真空をかけるが第２の圧力ポート５２の真空は停止して、少なくとも計測可能な量の流体を分析部分３８の光学チャンバ４８に移動させるか流入させることにより達成される。少なくとも計測可能な量の反応済流体が光学チャンバ４８に移送されると、次のステップは、図３のステップ１１６に示すように、反応済流体の光学的分析を行うことを含む。一実施形態では、この試験モジュール１６における各反応済流体の光学的分析が、試験モジュール１６の試験プロセスの最後である。別の実施形態では、１回目の光学的分析が完了すると、反応済流体は混合部分４０に移送されてさらに混合されるか又は追加の時間放置されてさらに反応し、反応済流体は光学チャンバ４８に戻されて２回目の光学的分析に供され得る。これらのステップは、反応済流体の継時的な追加データを得るために必要に応じて繰り返すことができる。

図４Ａは試験モジュールの試験プロセスの例示的な概要を説明する。圧力は、静水圧水頭のセンチメートルで示し、陰圧は真空を表し、弁圧力は陽圧として示す。第１の弁３２は、膨潤性ポリマー弁又は狭隘部で形成されて、ステップ５、６及び７の間、第１の圧力ポート４４からの真空を許可する。

図４Ｂは試験モジュールの試験プロセスの別の例示的な概要を説明する。圧力は、静水圧水頭のセンチメートルで示し、陰圧は真空を表し、弁圧力は陽圧として示す。第１の弁３２は、膨潤性ポリマー弁又は狭隘部で形成されて、ステップ５の間、第１の圧力ポート４４からの真空を許可する。

上述したように、カートリッジ１０の例示的実施形態は、内部に形成された２４の試験モジュール１６を含み、各試験モジュール１６は別々の流体を試験するように構成される。図５Ａは、２４の試験モジュール１６を有するカートリッジ１０の各混合部分４０内の試薬／反応物質を説明し、各試験モジュール１６は４本の試験チャネル２６を含む。図５Ｂは、２４の試験モジュール１６を有するカートリッジ１０の各混合部分４０内の試薬／反応物質の別の実施形態を説明し、各試験モジュール１６は４本の試験チャネル２６を含む。図５Ｂの表は、図５Ｃに示すように、最低、中域及び最高のエンドトキシン濃度は特定のカートリッジ１０の範囲によることを示し、１個のカートリッジ１０における範囲濃度は各試験モジュール１６について同じである。図５Ｃの異なる範囲の単位はＥＵ／ｍＬ（１ミリリットル当たりのエンドトキシン単位）である。較正反復試験を平均化して検量線を作成する。陰性コントロールは、最低較正濃度と比べて有意差がなくてはならない。試料分析反復試験を平均化して各報告値とする。陽性コントロールのスパイクを平均化し、有効な分析としてはスパイク分析とベース分析の差が中域値の５０％〜２００％の範囲でなくてはならない。図５Ａ〜５Ｂに示す各例示的カートリッジ１０の較正分析は、三重反復試験コントロールに基づく。図５Ａ〜５Ｂの表中のドットは、その間に値が存在することを示す。当業者であればこのような間にある値を容易に決定できる。

別の実施形態では、非コンペンディアの方法が許容されるか又は均等であり規制機関にも許容されるとしてバリデートされている場合、個々の標準品の結果の代わりに従前の測定データに基づく保存された較正を使用できる。

図６は、カートリッジ１０及びその構成要素の別の例示的実施形態を説明する。操作時、第１のステップは、液体ＬＡＬをＡに添加し、ならびに流体試料をＢに添加することを含み、その量は試験モジュールの試験プロセスの実施に必要な量をわずかに上回る。次に、Ｆ及びＧに真空をかけて、分配チャネルＲ及びＳを満たす。次いでバースト弁Ｌを突破するよりも低い圧力の真空がＭにかけられ、それによって各光学チャネルＮに至る分岐部が計測された試料又はＬＡＬのアリコートで満たされる。次に、Ｆ及びＧを開放せずにＪ及びＫに真空をかけて、余剰の試薬及びＬＡＬをＲ及びＳから除去しＨ及びＩに満たす。次に、Ｆを開放して（Ｇは開放せずに）Ｐに真空をかけて、流体試料を混合チャネルＱに引き込む。ＭとＰとに交互に真空をかけて流体試料をＱ内で往復させて、（存在する場合は）ＬＡＬ反応性物質と混合させる。次に、Ｍに真空をかけると、流体試料は光学チャンバ内へと移動する。流体試料が光学チャンバ内に入ると、次のステップは、Ｆに対する開放を閉鎖し、Ｇを開放することを含み、Ｐに真空をかけて流体試料を、続いてＬＡＬ試薬を片側に寄せる。次のステップは、ＭとＰとに交互に真空をかけて、これらの２種類の流体をＱ内で往復させて混合することを含む。次いでＭに真空をかけて試料を光学セルＮに移動させ、反応をモニターする。

カートリッジの形態及び形状は上述した幾何学的形状に限定されない。カートリッジは、チップ又はディスク形状でもよい。当業者であれば代替の適当な幾何学的形状にも想到し得るが、それも本発明の範囲内である。

図７は、カートリッジ１０の別の例示的実施形態を説明するものであり、該カートリッジはマイクロ流体ディスクの形態である。マイクロ流体ディスクは、限定ではないが、複数の試験モジュール、入口ポート、試験チャネル、計測部分、分析部分、混合部分、弁などを含む、上述したカートリッジ１０のすべての構成要素及び部品を含み得る。図７は、マイクロ流体ディスク５６の一実施形態の配置を示し、該ディスク５６は中心にハブ５８の穴を有して、該ディスクを回転させるリーダーのスピンドル（図示せず）に脱着可能に取り付けられる。

スピンドルをモーター（図示せず）と連結することにより、モーターによってディスク５６を回転させることができる。モーターは、ディスク５６を回転させることができるどのタイプの機械的アクチュエーターでもよいことが予測できる。ディスクはその内部の流体試料に遠心力をかけるのに十分な速度で回転され得、試験チャネル内のアリコートに弁を通過させる。様々な速度で回転することにより、このようなシステムは、以前の流体運動によって生じた力、流体圧又は空気圧の変化によって、全回路網のあらゆる必要な流体運動を実施することもできる。

個々の試料、試料の一部、リファレンスもしくはコントロール又はリファレンスもしくはコントロールの一部は、試験区域６０に単離された光学チャンバ４８群によって分析され得る。ディスク５６の典型的な実施形態では、放射状試験区域６０が放射状パターンに配置されている。しかし、当業者であれば別のパターンが選択できることが予測される。

各試験区域６０は、流体回路網６４を含み得る。各流体回路網６４は、リザーバー２０を含み得る。試料又はリファレンス、試薬又は標準品は、ディスク５６のハブ５８により近いリザーバー２０内に配置され得る。ディスク５６が回転すると、流体は開いた試験チャネル２６からディスク５６の外縁部６２に向けて移動することになる。一部の実施形態では、試験チャネル２６は計測部分３６及び混合部分４０も含んで、試料が光学チャンバ４８の方に移動するときに試料を分取し混合することができる。上述したように、混合部分４０は試薬、標準品又は他の反応物質をプリロードされ得る。

ディスク５６のほとんどの実施形態では、リザーバー２０内に入れられた試料は、典型的には４つのアリコートに分けられ、各アリコートは別々の光学チャンバ４８に送達される。これは、現行のコンペンディアの要件では各試料を４回（陽性コントロールを添加せずに２回、添加して２回）分析することになっているためである。このことは、較正及び陰性コントロールの分析にも便利である。これらの「ユニバーサル」な実施はＬＡＬ試薬水を試料とする１２回の分析を義務付けることがあるが、本配置を用いて３組４回の分析で容易に達成できるからである。３つのリザーバー２０に試料を供給し、各リザーバー２０内の試料は４つのアリコートに分けられ個々の光学チャンバ４８に供給されるので、必要な１２回の分析ができる。なお、ディスク５６の幾つかの実施形態では、単一のより大きいリザーバー２０から１２幅の配置が使用され得、単一のリザーバー２０に試料が供給され、１２のアリコートに分けられ個々の光学チャンバ４８に供給されるので、必要な１２回の分析ができる。試料を１２回の分析に提供する実施形態のリザーバー２０は、試料を４回の分析に提供する実施形態のリザーバー２０よりも、大きいものとする。

ディスク５６の幾つかの実施形態では、弁が流体回路網６４の流体の流れを制御する。上述した弁が実装されて、流体の流れを一時的又は恒久的に止める、ディスクを通る流体の流れを制御する、ディスク５６内で生じる反応プロセスを制御する、といった動作が実行され得る。弁の一種類としてバースト弁がある。バースト弁は、チャネルの表面エネルギー及び毛管力を利用して流体の流れを制御する。毛管動作によって、流体は狭小チャネルを這い上がるか又はそうでなければ引き上げられることが知られている。流体はチャネル壁を濡らそうとするので流体の表面張力がその駆動力を提供し、チャネル内の圧力が表面張力による駆動力と等しくなるまでチャネルを伝って自体を引き上げる。これと同じ表面張力は、親水性材料の代わりに疎水性材料でチャネルを作製するか又はチャネル壁を疎水性材料で被膜することによって、流体がチャネルを通過できないように利用することもできる。疎水性材料は水をはじき、親水性材料は水を引き付ける（水に濡れる）。一つの例示的な疎水性材料は、疎水性マイクロ多孔質メンブレンであり、その材料の孔径は、空気を通過させるが水は通過させない。疎水性マイクロ多孔質メンブレンの孔の径は小さいので、水を通過させるには毛管圧力として大きい圧力を要する。この毛管圧力は、チャネル内の流体の表面エネルギー、チャネル材料もしくはチャネル内部のコーティングの表面エネルギー及びチャネルの寸法及び形状に依存する。ディスク５６は、限定ではないが、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー及びグリコール改質ポリエチレンテレフタレートを含む様々な材料で作製できる。ディスク５６の幾つかの実施形態では、炭素を添加してポリスチレンブラックとし、光学的吸収法が促進され得る。

各カートリッジ１０には１種以上の試料流体が入っており、各カートリッジ１０自体は、標準品分析の少なくとも２回の反復試験及び２種の陽性コントロールすなわちＬＡＬ反応性物質でスパイクしたもの、ならびに少なくとも３点で形成された検量線及び陰性コントロール（ブランク）の各々少なくとも２回（又は３回）の反復試験からなる。

乾燥標準品からスパイクを作製する場合、試料と試薬の体積は、他の分析及び較正試験と同じである。スパイクが液体の場合は「ホットスパイク」として添加することができる。これは製造業者が勧める業界で認可された方法であり、規制機関からも認可されている。この方法では、所望のスパイク濃度の１０倍濃度の標準品溶液が試料に添加される。添加する標準品の体積は、試料体積の１０％である。規格量のＬＡＬ試薬が添加され、得られた混合物を、標準のスパイクなしのセル長よりも５％長い光路長のセルでモニターする。こうすることでマイクロプレートで使用されるホットスパイク法が模倣され、試料と試薬を合わせた体積は、したがって光学カラム及び光路長も、ホットスパイク試料では５％大きい。

別の実施形態では、ブランク水が、ブランク分析の試料供給源として及び単一標準品を最高濃度で分配し希釈するために使用され得る。このように、標準品は必要に応じて分配、精密な計測及び混合によって希釈されて、その他の標準品又はスパイクが作製される。たとえば、ブランク水と最高濃度の標準品とがカートリッジに添加され得る。添加されたブランク水は、反復試験３回のブランク分析にそのまま利用され得る。添加された最高濃度の標準品も、反復試験３回の最高濃度の標準品分析にそのまま利用され得る。次にマイクロ流体回路網を利用して、ブランク水及び最高濃度の標準品の量を計測し、これらを混合して１種又は複数の中間濃度の標準品を生成することができる。計測ステップ及び混合ステップは各反復試験について別々に実施され得る。同様に、最高濃度の標準品又は中間濃度の標準品の一部のいずれか一方（それを利用する分析から「とっておく」必要があろう）及び追加のブランク水を利用して、最低濃度の標準品が作製され得る。各段階で標準品濃度を９０％低下させる場合、最初の希釈は１：９（標準品の分量１に対しブランク水の分量９）ということになる。最低濃度は、中間濃度の標準品の１：９の希釈を別に行うか又は最高濃度の標準品の１：９９の希釈で作製できる。

各カートリッジ１０は、カートリッジの試験プロセスを開始する前に、流体試料を充填される。流体を入口ポート１８に入れるが、これは手動で行っても自動で行ってもよい。流体が各入口ポート１８に入ると、カートリッジ１０は、カートリッジ１０の上部表面の第２の流体マニフォールド４６及び第３の流体マニフォールド５４（図１）と流体接続するように構成されたリーダー（図示せず）に挿入される。カートリッジ１０がリーダーに挿入されると、上述したようにモジュールの試験プロセスが開始される。モジュールの試験プロセスの間、流体が光学的分析のために光学チャンバ４８内に配置されると、リーダーは、光学的分光法などの光学的試験、分析データの記録及び記録データのコンパイルを実施するように構成されている。

カートリッジ１０は、ＬＡＬ反応性物質を試験する標準的なマイクロプレート法ならびに任意の他の流体試験と比べて分析時間が短い。カートリッジ１０は典型的なマイクロプレートよりも準備に要する時間がかなり短いので、汚染が生じる機会が少なく、他の実験作業に組み込みやすく、コストも低い。マイクロ流体素子を用いる試験カートリッジ１０は、ＵＳＰ第８５章「細菌性エンドトキシン試験」の予備試験を含む比濁法又は比色法の有効な試験要件をすべて満たす。この予備試験は、検量線の規準の確認及び干渉因子の試験を含み、試験手順、計算及び（注射用水の場合は）結果が０．２５ＥＵ／ｍｌ未満であり、製品の場合はエンドトキシンが製品の限度値未満であるという判定を含む。入口ポート１８と光学チャンバ４８とを連結する測定部分３６内には試薬を付着させないので、流体に試薬を添加又は混合する前に流体試料の初期の重要な光学的特質の測定ができる。加えて、流体試料、ブランク及び較正用ＬＡＬ反応性物質試験は各々、内部でバリデートされる。

カートリッジ１０は、試験又は分析をバリデートする手段も含み得る。本明細書では「バリデート（バリデーション）」とは、分析の確実性又は分析の進行の実証、その質の確認又は確定を意味する。分析の適性についてバリデートする場合、２種以上の陽性コントロール（検量線の中点濃度のＬＡＬ反応性物質でスパイクした試料）、３種の陰性コントロール（ブランク）及び製造業者又はコンペンディアにより指定される任意の他のパラメータを含むコンペンディアの方法が使用され得る。陽性製品コントロールスパイクは、コンペンディアの要件（スパイク収率５０％〜２００％）、陰性コントロール（最低濃度とブランクの差、ブランクの応答レベルの方が低い）及び製造業者の仕様（たとえば０．００５ＥＵ／ｍＬの試料とブランクの差又は特定の標準品のオンセット時間の限界）を満たす必要がある。これらの分析が合格ならば、当該システム及び試薬は仕様通りに機能していることが確認される。データストリームをバリデートする、とは、データストリームの挙動が、従前の測定データ又は検出試薬とＬＡＬ反応性物質の反応の既知の反応動態に基づき予測される挙動と統計学的に一致することを意味する。このことは、データストリームが、何らかの異常、たとえば気泡などに基づくチャンバ内や光路内の変化ではなく、ＬＡＬ反応に基づく分析チャンバ内の変化により生成されていることを示す。最終的に、この差異自体は、異なる試薬及びロットの複数の試験、ならびに異常の誘導によってバリデートされて、限定ではないが、試料の重要な光学的特質のブランクの読み取り、混合された試料／試薬／随意のＬＡＬ反応性物質、初期の光学的読み取り、重要な光学的特質の変化の平滑さ及び変化速度、理論上予測される変化に対する適合接近度（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ ｏｆ ｆｉｔ）、データのノイズレベルの見込みなどを含む機能を確認されることになる。試験結果が不適合であれば、モジュールの試験プロセスが中止され、エラーメッセージが送信され、ＬＡＬ反応性物質の測定結果は作成されない。

カートリッジ１０は、流体試料の導入エラーを防止するように構成される。一実施形態では、カートリッジ１０は、流体試料の配置の視認フィードバックを含み、これには着色又は目印の領域又は他の光学活性フィードバックが含まれ得る。カートリッジ１０は、ピペッティングエラーを最小限化するようにも構成される。各流体試料は、複数の試験用に自動的に分取される。各流体試料は、１個のリザーバー２０に注入され（好ましくは約１００μｌの流体）、４つの等量の流体アリコートに分けられて、ＵＳＰ第８５章「細菌性エンドトキシン試験」の要件を満たす。一実施形態では、試験モジュール１６の計測部分３６で計測される各アリコートの体積は、２５μｌ（リザーバーに導入された流体体積の４分の１）よりも約１０％少なく、ユーザーによる試料導入エラーが最小限化される。ユーザーは、流体試料及びＬＡＬ反応性物質を含まない水（ブランク水）をカートリッジ１０に注入するだけである。試験に用いる流体試料の量が少ないので、試験プロセスに必要な試薬の量も少なくなり、必要な試薬の量が少ないのでＬＡＬ反応性物質の試験が低価格になる。

カートリッジ１０は、ＢＥＴ測定結果を予測するようにも構成される。カートリッジ１０は、重要な光学的特質（透過、吸光、濁度、化学発光又は蛍光）を時間関数としてモニターし様々な予測アルゴリズムを適用することによって、試料中のエンドトキシン又は他のＬＡＬ反応性物質の濃度を正確に予測又は予想する手段を含む。この予測は、最終結果が出るまでの測定時間を速めるのに用いられる。カートリッジ１０は、光学的分析中、ノイズからの信号抽出も可能にする。カートリッジ１０は、動態反応モデル又は他の反応モデルの使用も可能にする。本明細書では「予測する」又は「予想する」は、ある量が将来の特定の時点で有することになる大きさを推定することを意味する。予想することは、当業者に知られるあらゆる方法により達成され得、これには限定ではないが、情報が適切に維持され、そのデータの将来の時点での挙動について予測が行われるようにデータ処理を行うあらゆる線形又は非線形法が含まれる。予測の方法には、限定ではないが、曲線フィッティング及び外挿が含まれる。

カートリッジはさらに、疎水性メンブレン及びこのメンブレンを試料が複数回通過する移動による、随意の能動的な流体試料のガス抜きを含む。試料が静止しメンブレンと静的に接触している間、片側の圧力を下げて液体もしくは直接気泡からガスを除去することによって、ガス抜きが随意に達成され得る。他の気泡抜き又はガス抜きの方法としては、（ａ）流体素子の一部分、全流体素子又は全流体素子構造を加圧してガスが液体から移動しないようにすることで、気泡をなくすこと又は（ｂ）気泡の移動を防止するように作製されたメンブレン又は狭隘部マトリックスなどのデバイス内に気泡を閉じ込めることで、気泡をなくすこと、が挙げられる。界面活性剤や消泡剤など、気泡形成を削減する活性剤を使用してもよく、これらはカートリッジ内に固定化されるか又はユーザーによって導入されることができる。

カートリッジ１０は、ユーザーがどの入力ポートに充填すべきかを示す方法を含み、データ収集インターフェースに入力される試料の標識又は識別子、計算を含む結果の自動分析、ユーザーが規制要件を満たすのに必要とする全結果の自動報告を関連づけるオプションを有する。カートリッジリーダー又は調製デバイスも、入口ポートへの試料アクセスを制限する手段を含んで、誤りのない試料導入を確保することができる。カートリッジ１０は、インターフェースが、カートリッジならびに試薬のロット番号、古さ及び貯蔵寿命期限に関するあらゆる関連情報を含むレポートを作成することも可能にする。たとえば、カートリッジの情報又は印は、リーダーに手動又は自動のいずれかで転送されて記録され得る。

疎水性メンブレンがカートリッジ１０で使用されて、適切な圧力又は真空がメンブレンの外側にかかると、試料流体アリコートが駆動される。この駆動手段は、試料流体のアリコートを精密に測定し、流体アリコートの移動によって試料流体中に試薬を混合し、アリコートを光学チャンバ４８内に精確に配置して測定及び分析を実施するために用いられる。疎水性パッチ又はメンブレンは、流体アリコートをカートリッジ内に配置するのを補助するために使用され得、また、バースト弁を生成して、試料流体アリコートの試験モジュール１６内での配置をさらに向上させるために使用され得る。

試薬（ＬＡＬ、ＬＡＬ反応性物質及び随意の発色性試薬など）は、試薬を試験チャネル２６の壁に固定化、溶解性試薬をあらゆる剤型（ペレット、粉末又はビーズ）で添加又はカートリッジ１０に挿入される溶解性及び不溶性フィルム又は形態（ｆｏｒｍｓ）に付着させる、などを含むあらゆる実用的な手段によって正確な濃度でカートリッジ内にプリロードされ得る。

カートリッジ１０は、汚染を低減又は皆無にするように構成される。入口ポート、出口ポート、ならびに第１及び第２の圧力ポートを封止する手段が用いられて、水、酸素、環境内エンドトキシン及び細菌、ならびに他のＬＡＬ反応性物質の伝達を防ぐことができる。カートリッジ１０は、カートリッジの製造及び保存の間、乾燥試薬を相対湿度４％未満に維持する手段も含み得る。

光学リーダー（図示せず）は、好ましくは流体試料導入前に、カートリッジを制御された温度まで温めるヒーター又は他の装置を含み得る。光学リーダーは、反応の前、間及び後で試料の光密度を測定するように構成され得る。カートリッジ１０の他の実施形態は、第２の別のヒーター又は加熱装置を用いて予熱し、試料を流体アリコートに配置するため駆動し、試薬と流体試料を混合し、流体試料を光学チャンバ４８内に配置して、重要な光学的特質を標準的な市販のマイクロプレートリーダー内で測定するように構成され得る。次いでカートリッジ１０は、反応の分析及びＬＡＬ反応性物質の測定のために、標準的なマイクロプレートリーダー内に配置され得る。

上述したように、カートリッジ１０は、たとえばＬＡＬ、ＬＡＬ反応性物質及び／又は発色性試薬などの試薬／反応物質を含み得る。試薬／反応物質は、遅乾又は速乾法を用いて添加剤を加えることで安定化し、貯蔵寿命が延長される。試薬／反応物質は、流体試料とともに再構成されたとき、溶媒和の速度が制御されるように構成され得る。ＬＡＬ反応性物質測定の感度を損失することなく再度溶解する証明された能力に応じて、遅乾と高速凍結乾燥のどちらを用いてもよい。細菌から抽出した発熱性天然材料を利用して、速やかに溶解し、生体分子の凝集を防止し、良好な安定性のある材料を生成することができる。試薬／反応物質を試験モジュール１６内に付着させて、付着の確度、早期の反応を防止するため種々の試薬成分の単離及び最良の物理的配置による最適化された混合、を制御する。試薬は、光学的測定の確度を高めるために速やかに溶媒和に達するように設計される。溶媒和の速度は、流体試料との混合が最大効率を有するように制御されるべきである。試薬の溶媒和は、光学的分析が既知の又は所定の時間に開始できるように制御されるべきであり、それによって光学的測定の確度が高まる。

気泡は流体の運動及び流体の光学的特性に干渉し得るので、気泡を抑制することは頑健な分析システムにとって重要である。流体試料中の気泡は、（１）流体との溶媒和の間気泡が生じないように試薬／反応物質を乾燥させること、（２）流体チャネルを気泡が生成しない設計にすること、（３）流体運動を気泡が生成しない設計にすること、（４）試験チャネル２６の表面を気泡核ができないように形成すること、（５）カートリッジ１０を気泡核ができないように組み立てること及び（６）試薬を固定化して気泡核ができないようにすること、により予防できる。さらに、試料中に少しでも気泡が残る場合は、気泡はバリデーションプロセスにおいて異常として現れるので、その分析は不合格とされ得る。

メンブレンベースのマイクロ流体カートリッジ１０は、真空又は圧力を利用して、チャネル及びその部分内の流体移動を駆動する。あるいは、流体はカートリッジの回転によって駆動され得る。一実施形態では、カートリッジ１０は、疎水性多孔質メンブレンとチャネル形状の組合せを利用して、流体試料の正確な分取を制御する。別の実施形態では、カートリッジ１０は、疎水性多孔質メンブレンと表面エネルギーの組合せを利用して、流体試料の正確な分取を制御する。さらなる実施形態では、カートリッジ１０は、疎水性多孔質メンブレンと形状の組合せを利用して、流体試料を特に光学的測定のために正確に配置する。さらに別の実施形態では、カートリッジ１０は、疎水性多孔質メンブレンと表面エネルギーの組合せを利用して、流体試料を正確に配置する。カートリッジ１０は、メンブレンを通過する二次フローによって発生される部分真空を利用することができる。別の実施形態では、カートリッジ１０は、流体が毛管力によって駆動され制御されるマイクロ流体システムである。

別の実施形態では、シリンジポンプなどの容積式ポンプが、図２に示す試験モジュール１６の４つの圧力ポート５２に取り付けられる。容積式ポンプは、リザーバー２０、第１の流体マニフォールド２２及び移送チャネル２４に収容される液体試料を、４つのアリコートを各々第３の弁４２のところの位置に移動させることによって分取するのに用いられる。その時点でリザーバー２０、第１の流体マニフォールド２２及び移送チャネル２４の中の余剰試料はすべて出口チャネル２８内に送られるか又は廃棄試料としてシステムから除去されるかもしくは引き出され、第１の流体マニフォールド２２内には空気しか残らない。次いで容積式ポンプは圧力ポート５２に真空をかけて試料を光学チャンバ４８に移動させ、随意の初期のブランクの光学的測定が行われる。初期ブランク測定は、試料が光学チャンバ４８に満杯になっているかどうか又はシステム内に気泡があるかどうかを決定するのに使用され得る。これが可能なのは、光信号は光学チャンバ４８内に気泡があるときと、光学チャンバ４８が水だけで満杯のときとでは大いに異なるからである。次いで試料は混合部分４０内に送られるが、ここには随意の試薬と随意のＬＡＬ反応性物質が配置されている。次いで容積式ポンプによって移動方向を逆にして、試料を混合部分４０から光学チャンバ４８に戻して後者を満杯にする。随意であるが、試料はさらに、光学チャンバ４８の光学的特性が気泡の存在を示すまで計測部分３６内に送られ、流れが停止される。合わされた試料と試薬類は第２の圧力ポート５２の方へと戻され、１回の混合サイクルが完了する。このプロセスは、混合が完了するまで複数回繰り返すことができる。試薬と試料水とを混合するのに必要な前後移動の回数は、以前の実験から決定し固定することができる。あるいは、混合プロセスをモニターし、混合された試料と試薬の光学的特性が変化しなくなると終了することもできる。これは、各混合サイクルの間、混合された試料と試薬の光学的応答の変化を検出することによって、測定できる。なお、光学的特性は、光学チャンバが満杯であって気泡が存在しないときにしか測定できない。

別の実施形態では、随意の疎水性メンブレンが弁４２に使用され得る。メンブレンの非液体側に真空がかけられ得る。真空によって、試料と試薬の混合物が混合部分４０を通って前後に移動するときに混合物を脱ガスできる。試料と試薬が混合されると光学チャンバ４８に送られ、光学的又は他の特性が時間関数として測定されて、選択された反応温度で存在するＬＡＬ反応性物質の量が決定される。この実施形態は、前述の実施形態で記載したように、弁３２、３４及び４２なしで使用することができるので、より簡単である。流体の配置は、ポンプの容積動（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）を精密に制御して又は光学センサーからの光学チャンバ４８内の液体又は液体の不足を計測した光学的フィードバックによって、行われる。この実施形態は、各圧力ポート５２と連携する個別の容積式ポンプを有するか又は１個のポンプをマニフォールド５４を通じて複数の圧力ポート５２に接続することができる。加えて、この実施形態は、オンラインのＬＡＬ反応性物質検出モードで使用することができ、各流体素子セクション３４、３６、４０及び４８は、箇所３４で別々に環境から密閉され得る。水系からオンラインで収集された新鮮な試料を収容するポートが取り付けられると、シールは破られ得る。流体素子セクション３４、３６、４０及び４８の数は、１つから４つまで又はそれ以上に変えてもよい。こうしてそのような流体素子セクションを多数有するカートリッジを作製し、各流体素子セクションの各々の密封ポート３４に新鮮な試料を送達するポートを有する試料収集デバイスにロードする。カートリッジ又は試料収集デバイスは、各新しい接続部の密封ポート３４に移動できる。この方法は、規制要件を満たすように操作されるか又は規定の方法の測定及びバリデーション要素の全部は含まないプロセス制御だけに適するように操作され得る。

本発明のさらなる態様では、単一試料を別々の部分に分け、個々のマイクロ流体回路網に分配し、個別の試験用に分取する。いずれの場合も、試料体積は精密である必要はなく、単に全アリコートに足りるだけの、ただし装置から溢れるほどではない量でよい。

また、各セクションは、通常は試薬が長期間安定するようなたとえば低温の環境に保存され、１つ又は幾つかのセクションをこの保管エリアから取り出して分析用に条件が調節された、たとえば３７℃に加熱されたエリアに移して実際のアッセイを行うことができるように、単一又は複数のカートリッジに配列され得る。

本発明の一態様では、流体試料を試験するマイクロ流体カートリッジが提供される。カートリッジは、２以上の試験モジュールを含み、各試験モジュールは、流体試料のうちの１種を受ける入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含む。各試験チャネルは、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み得る。計測部分と分析部分の間には弁が配置されて、選択的流体的に計測部分と分析部分を隔てることができる。各試験モジュールは、１種以上の試薬が内部に単離されている１以上の試験チャネルを有し得る。

別の実施形態では、１以上の試験モジュールが、８以上の試験チャネルを含む較正モジュールである。２以上のチャネルは内部にＬＡＬ反応性物質がなくてもよく、２以上のチャネルは内部に第１の量のＬＡＬ反応性物質が単離され得、２以上のチャネルは内部に第２の量のＬＡＬ反応性物質が単離され得、２以上のチャネルは内部に第３の量のＬＡＬ反応性物質が単離され得る。別の実施形態では、第１の量、第２の量、第３の量は同じか又は異なり得る。エンドトキシンを使用する場合、第１の量は、エンドトキシンが溶液中に存在するときの濃度範囲が０．００５〜０．５ＥＵ／ｍＬとなるように選択され得る。同様に、第２の量は０．０５〜５．０ＥＵ／ｍＬ、第３の量は０．５〜５０ＥＵ／ｍＬの範囲であり得る。

さらに別の実施形態では、１以上の試験モジュールが、４以上の試験チャネルを含む試料測定モジュールである。２以上のチャネルは内部にＬＡＬ反応性物質がなくてもよく、２以上のチャネルは内部に第４の量のＬＡＬ反応性物質を有するスパイクが単離され得る。エンドトキシンを使用する場合、第４の量は、エンドトキシンが溶液中に存在するとき、「スパイク」が本明細書で上述したような特徴を有するように選択され得る。

別の実施形態では、すべての試験チャネルは内部に１種以上の追加の試薬が単離され得る。追加の試薬は検出試薬を含み得る。別の実施形態では、マイクロ流体カートリッジはさらに、入口ポートと流体連通して余剰の流体試料を回収するための出口ポートを備え得る。

さらに別の実施形態では、弁は、真空、遠心力又は空気圧がアリコートを駆動して弁を通過させ計測部分から分析部分に流れさせるのを許可するように構成される。別の実施形態では、マイクロ流体カートリッジはさらに、分析部分の端部に隣接して計測部分内に配置されて、試験チャネル内に圧力差を発生させる第１の圧力ポートを含み得る。さらに別の実施形態では、マイクロ流体カートリッジはさらに、混合部分内に配置されて、試験チャネル内に圧力差を発生させる第２の圧力弁を含み得る。

別の実施形態では、分析部分は、アリコートの少なくとも一部を受けて流体試料の光学的測定を行う光学チャンバを含み得る。別の実施形態では、混合部分は、アリコートが混合部分内で試薬と混合できるように構成され得る。さらに別の実施形態では、試薬は混合部分内に固定化され得る。

本発明の他の態様では、１種以上の流体試料のＬＡＬ反応性物質を試験する方法が提供される。この方法は、マイクロ流体カートリッジを提供することを含み、該カートリッジは、２以上の試験モジュールを含み、各試験モジュールは、流体試料のうちの１種を受ける入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含む。各試験チャネルは、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み得る。計測部分と分析部分の間には弁が配置されて、選択的流体的に計測部分と分析部分を隔てることができる。方法はさらに、１種以上の流体試料を入口ポートのうちの少なくとも１つに導入することを含み得る。方法はまた、マイクロ流体カートリッジを光学リーダーに導入して、マイクロ流体カートリッジ内の１種以上の流体試料を光学的に測定することを含む。方法はさらに、マイクロ流体カートリッジ内の各試料について試験プロセスを実施し、試験プロセスの測定データを記録することを含む。

別の実施形態では、方法はさらに、各アリコートを計測部分から分析部分に移動させて各試験チャネルの分析部分で光学的測定に供することを含み得る。さらに別の実施形態では、真空、遠心力又は空気圧は、アリコートの流れを駆動して弁を通過させ計測部分から分析部分に流れさせることができる。別の実施形態では、各試験モジュールは、真空又は空気圧がかけられて試験モジュール内に圧力差を発生させてアリコートの流れを駆動し得る１以上の圧力ポートを含み得る。

さらに別の方法の実施形態では、流体試料は手動か又は自動式に入口ポートに導入され得る。

本発明の他の態様では、１種以上の流体試料のＬＡＬ反応性物質を試験する方法が提供される。この方法は、マイクロ流体カートリッジを提供することを含み、該カートリッジは、２以上の試験モジュールを含み、各試験モジュールは、流体試料のうちの１種を受ける入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含む。各試験チャネルは、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み得る。計測部分と分析部分の間には弁が配置されて、選択的流体的に計測部分と分析部分を隔てることができる。方法はさらに、１種以上の流体試料を入口ポートのうちの少なくとも１つに導入することを含み得る。方法はさらに、マイクロ流体カートリッジ内の各試料について試験プロセスを実施し、試験プロセスの測定データを記録することを含む。別の方法では、マイクロ流体カートリッジを光学リーダーに導入してから流体試料を入口ポートに導入することができる。別の方法では、流体試料は試験プロセス中に試薬と混合され得る。さらに別の実施形態では、試薬は混合部分内に固定化され得る。

本発明の別の態様では、測定データは、アリコートの体積、反応動態、流体運動、透過、吸光、光密度、色、明度、色相、スペクトル、濁度、散乱光、化学発光、蛍光及び磁気共鳴を含み得る。試験プロセス及び測定データは、従前のデータ及び／又は既知の反応動態データを用いて、バリデートされ得る。さらに別の実施形態では、トレーサーを混合部分及び／又は分析部分内に固定化して、アリコート体積の測定に役立てることができる。

本発明の好ましい実施形態を記載してきたが、本発明はそれらには限定されず、本発明から逸脱することなく変更を加えることが可能であることを理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求項により規定され、請求項の文言どおりか又は均等な、請求項の意義の範囲内のあらゆるデバイス、プロセス及び方法も包含されるものとする。

１０ カートリッジ
１２ 上部プレート
１４ 下部プレート
１６ 試験モジュール
１８ 入口ポート
２０ リザーバー
２２ 第１の流体マニフォールド
２４ 移送チャネル
２６ 試験チャネル
２８ 出口チャネル
３０ 出口ポート
３２ 第１の弁
３４ 第２の弁
３６ 計測部分
３８ 分析部分
４０ 混合部分
４２ 第３の弁
４４ 第１の圧力ポート
４６ 第２の流体マニフォールド
４８ 光学チャンバ
５０ 第４の弁
５２ 第２の圧力ポート
５４ 第３の流体マニフォールド
５６ ディスク
５８ ハブ
６０ 試験区域
６２ 外縁部
６４ 流体素子回路網

Claims (15)

1. ２以上の試験モジュールを含む、流体試料を試験するためのマイクロ流体カートリッジであって、
   試験モジュールは各々、流体試料のうちの１つを受けるための１以上の入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含み、
   試験チャネルは各々、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み、弁が計測部分と分析部分の間に配置されて、選択的流体的に計測部分と分析部分を隔てており、
   試験モジュールは各々、１種以上の試薬が内部に単離される１以上の試験チャネルを有し、試薬はＬＡＬ反応性物質を含んでいる、
   マイクロ流体カートリッジ。
2. １以上の試験モジュールが８以上の試験チャネルを含む較正モジュールであって、試験チャネルの２以上は内部にＬＡＬ反応性物質を有しておらず、試験チャネルの２以上は内部に第１の量のＬＡＬ反応性物質が単離され、試験チャネルの２以上は内部に第２の量のＬＡＬ反応性物質が単離され、試験チャネルの２以上は内部に第３の量のＬＡＬ反応性物質が単離されている、請求項１記載のマイクロ流体カートリッジ。
3. １以上の試験モジュールが４以上の試験チャネルを含む試料測定モジュールであり、
   試験チャネルの２以上は内部にＬＡＬ反応性物質を有しておらず、
   試験チャネルの２以上は内部に第４の量のＬＡＬ反応性物質を有するスパイクが単離されている、
   請求項１記載のマイクロ流体カートリッジ。
4. 入口ポートと流体連通して余剰の流体試料を回収する出口ポートをさらに含む、請求項１記載のマイクロ流体カートリッジ。
5. 弁は、真空、遠心力又は空気圧がアリコートを駆動して、弁を通過して計測部分から分析部分に流れるのを許可するように構成されている、請求項１記載のマイクロ流体カートリッジ。
6. 分析部分の端部に隣接して計測部分内に配置されて、試験チャネル内に圧力差を発生させる第１の圧力ポートをさらに含んでいる、請求項１記載のマイクロ流体カートリッジ。
7. 混合部分内に配置されて、試験チャネル内に圧力差を発生させる第２の圧力弁をさらに含んでいる、請求項１記載のマイクロ流体カートリッジ。
8. 分析部分は、アリコートの少なくとも一部を受けて流体試料の光学的測定を行う光学チャンバ（４８）を含んでいる、請求項１記載のマイクロ流体カートリッジ。
9. １種以上の流体試料のＬＡＬ反応性物質を検査するための方法であって、
   マイクロ流体カートリッジを使用するステップであって、マイクロ流体カートリッジは２以上の試験モジュールを含み、試験モジュールは各々、流体試料のうちの１つを受けるための１以上の入口ポート及び入口ポートと流体連通する４以上の試験チャネルを含み、試験チャネルは各々、流体試料のアリコートを計測する計測部分、分析部分及び混合部分を含み、弁が計測部分と分析部分の間に配置されて、選択的流体的に計測部分と分析部分を隔てており、マイクロ流体カートリッジが、ＬＡＬ反応性物質を検出するための試薬を含んでいる、ステップと、
   １種以上の流体試料を入口ポートのうちの少なくとも１つに導入するステップと、
   マイクロ流体カートリッジ内の１種以上の流体試料の各々について試験プロセスを実施するステップと、
   試験プロセスの測定データを記録するステップと
   を含む方法。
10. アリコート各々の流れを計測部分から分析部分に駆動して、各試験チャネルの分析部分で光学測定を行うステップをさらに含む、請求項９記載の方法。
11. 真空、遠心力又は空気圧が、アリコートの流れを駆動して弁を通過させ計測部分から分析部分に流れさせる、請求項１０記載の方法。
12. １種以上の流体試料を入口ポートのうちの少なくとも１つに導入するステップは、１種以上の流体試料を手動で導入するか又は１種以上の流体試料を自動式に導入することを含んでいる、請求項９記載の方法。
13. １種以上の流体試料を入口ポートのうちの１つに導入するステップの前に、マイクロ流体カートリッジを光学リーダーに導入するステップをさらに含んでいる、請求項９記載の方法。
14. 流体試料は、試験プロセスの間に試薬と混合される、請求項９記載の方法。
15. 試薬は混合部分内に固定化されている、請求項９記載の方法。