JP6320833B2 - 美白成分のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、線維芽細胞を用いることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法に関するものである。

一般に、シミ、ソバカス、日焼け等にみられる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞（メラノサイト）がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。そして従来から、メラニンの過剰な生成を抑制する目的で、アルブチン、ハイドロキノン、コウジ酸、トラネキサム酸及びこれらの誘導体等が用いられてきた。

ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１（ＮＲＧ１）は、中枢神経系において、神経細胞やグリア細胞の増殖、分化を調節している神経栄養因子であるが、近年、真皮の線維芽細胞において、その発現がみられること、又、メラノサイトに作用してメラニン生成を引き起こすことが分かってきた（非特許文献１及び２）。

美白成分のスクリーニング方法としては、Ｂ１６マウスメラノーマを用いたメラニン生成抑制試験によるスクリーニング方法（特許文献１）、メラノサイト内でのメラノソーム構造タンパク質ｇｐ１００を指標とするスクリーニング方法（特許文献２）、アドレノメジュリン結合受容体を介するシグナル伝達系への不活性化作用を指標とするスクリーニング方法（特許文献３）等が既に知られている。しかしながら、これらは全て表皮に存在するケラチノサイトやメラノサイトが指標であった。

最近の研究から、皮膚色が濃いほど真皮中のＮＲＧ１の発現が高いことが明らかとなり、表皮以外の因子がメラニン生成に関与していることが分かってきた（非特許文献１及び２）。ところが、今までに、真皮に存在する線維芽細胞から産生される因子を指標とする美白成分のスクリーニング方法は開発されていなかった。

特開２００８−２８０２４９ 特開２００８−２３２６９３ 特開２０１２−２５５７１０

Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１２３（Ｐｔ１８），３１０２−３１１１（２０１０） Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ．Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．，２５（４），４７７−４８１（２０１２）

そこで、本発明は、優れた美白成分の発見に繋がる新規の技術を確立することを課題とする。特に、ケラチノサイトやメラノサイトを用いる既知の作用機序に基づいた美白作用を利用するだけでは、優れた美白成分を発見することは困難であると考えられる。即ち、本発明は、新規の作用機序に基づいた美白作用を評価し得る方法を確立することを課題とする。

本発明者らは、上記課題の解決に向け鋭意検討を行った結果、神経栄養因子ＮＲＧ１を指標にし、表皮に存在するケラチノサイトやメラノサイトではなく、真皮に存在する線維芽細胞に着目した新規の美白成分のスクリーニング方法を完成するに至った。ＮＲＧ１は、真皮由来のメラニン生成促進因子であると考えられ、メラノサイトにおけるメラニンの過剰な生成を抑制するには、この真皮由来メラニン生成促進因子の制御も重要である。更に、かかる方法により評価し、選択した成分を含有した組成物が、色素沈着の予防又は改善効果を発揮することを確認した。

即ち、本発明は以下の（１）〜（５）から成る。

（１）線維芽細胞を用いることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。
（２）線維芽細胞における神経栄養因子の産生量を指標とする（１）記載の方法。
（３）神経栄養因子がｎｅｕｒｅｇｌｉｎ１（ＮＲＧ１）であることを特徴とする（２）記載の方法。
（４）神経栄養因子の産生抑制効果を指標とする（２）又は（３）記載の方法。
（５）予め酸化ストレスを負荷した線維芽細胞を用いることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか一項記載の方法。

本発明によれば、線維芽細胞における神経栄養因子ＮＲＧ１を指標とすることにより、化粧料や皮膚外用剤等に用いる美白成分の評価又はスクリーニングが可能となる。

ヒト皮膚線維芽細胞におけるＮＲＧ１タンパク質の免疫染色の図である。一つの紡錘形が一つの細胞である。

本発明における美白成分のスクリーニング方法とは、美白効果のある成分を選抜する方法である。本発明の方法によりスクリーニングされた美白成分は、化粧料又は皮膚外用剤等に配合及び調製することができる。

本発明における神経栄養因子とは、神経細胞へ栄養を送り届け、神経の機能維持や成長等の要因となっている因子のことである。代表的なものとして、ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ、ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ等が挙げられる。好ましくは、ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎである。

本発明におけるｎｅｕｒｅｇｌｉｎ（ＮＲＧ）とは神経細胞の軸索成長因子であり、神経やグリアの増殖・転移・運命決定に重要な役割を果たしている。今までのところ、ＮＲＧのサブタイプとしてＮＲＧ１、２、３及び４が知られている。最近の研究から、ＮＲＧ１は神経系だけではなく皮膚の線維芽細胞にも発現しており、皮膚色が濃いほどその発現が高く、ＮＲＧ１タンパク質をメラノサイトに作用させるとメラニン生成に影響を及ぼすことが報告されている。

本発明における神経栄養因子の産生抑制効果とは、真皮に存在する線維芽細胞にて産生される神経栄養因子ＮＲＧ１を指標とし、何らかの成分によりその産生を抑制する効果のことである。この目的のために、ＮＲＧ１を測定する必要がある。この測定に用いられる方法は特に限定されず、何れかの方法を用いることができる。代表的なものとして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＮＲＧ１ ｍＲＮＡ発現量の測定を行う方法、ウェスタンブロッティング法によりＮＲＧ１タンパク質量の測定を行う方法、ＥＬＩＳＡ法によりＮＲＧ１タンパク質量の測定を行う方法等が挙げられる。好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＮＲＧ１ ｍＲＮＡ発現量の測定を行う方法である。

本発明における酸化ストレスとは、酸化反応により引き起こされる生体にとって有害な作用のことである。細胞を用いた試験においては、紫外線、活性酸素、過酸化脂質等で曝露することにより酸化ストレスを負荷する手法が用いられている。好ましくは、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を用いた手法である。

次に、本発明を詳細に説明するため、具体的な実施例を挙げて説明する。これらの実施例は効果を具体的に説明するもので、発明の範囲を限定するものではない。実施例中の配合量は重量％である。

スクリーニング対象薬剤として、月下美人抽出物を使用した。月下美人とは、サボテン科クジャクサボテンの原種（Ｅｐｉｐｈｙｌｌｕｍ ｏｘｙｐｅｔａｌｕｍ Ｈａｗ．）及びその近縁種であり、その園芸品種の全草や花の乾燥物等を利用することができる。

月下美人の製造例として、下記の抽出を行うことができる。

製造例１ 月下美人抽出物
月下美人の花の乾燥物１００ｇに精製水３Ｌを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した。濾過した後、濾液を減圧濃縮し、更に凍結乾燥して月下美人抽出物４８ｇを得た。

スクリーニング対象薬剤として用いる月下美人抽出物は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。

処方例１ クリーム
処方 配合量（％）
１．月下美人抽出物（製造例１） ０．１
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２５
１２．１，３‐ブチレングリコール ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却後、製品とする。

比較例１ 従来のクリーム１
処方例１において、月下美人抽出物（製造例１）をシラカバ抽出物（一丸ファルコス）に置き換えたものを従来のクリーム１とした。

比較例２ 従来のクリーム２
処方例１において、月下美人抽出物（製造例１）を精製水に置き換えたものを従来のクリーム２とした。

次に、本発明を詳細に説明するため、具体的な実験例を挙げて説明する。本発明はこれら実験例に何ら制約されるものではない。

実験例１ 線維芽細胞におけるＮＲＧ１タンパク質の検出
ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ホルマリンにて固定後、ＮＲＧ１タンパク質の免疫染色を行った。使用した一次抗体はＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、二次抗体はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）である。染色後、蛍光顕微鏡にて観察した。

実験結果を図１に示した。その結果、線維芽細胞において、ＮＲＧ１タンパク質が検出された。従って、線維芽細胞において、確かにＮＲＧ１が発現していることが示された。

実験例２ ＮＲＧ１タンパク質のメラニン生成促進効果
メラニン生成においては、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）及びチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）が主要な酵素として関与し、これら酵素の発現制御には小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）が重要な役割を担っている。コンフルエントな状態のヒト正常メラノサイト（ＮＨＥＭ）に、最終濃度が１００及び２００ｎｇ／ｍＬになるように調製したＮＲＧ１（ＰＲＯＳＰＥＣ）を添加して２４時間培養後、ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡを基に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、ＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用い、ＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦ用のプライマーは以下に示すものを用いた。内部標準として、β−アクチンを用いた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの操作は定められた方法に従い、ＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦ ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるβ−アクチン ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦの発現率は、未添加のｍＲＮＡ発現量に対するＮＲＧ１添加群のｍＲＮＡ発現量の比率として算出した。

ＴＹＲ用のプライマーセット
ＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣ（配列番号１）
ＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴ（配列番号２）
ＴＲＰ１用のプライマーセット
ＣＧＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＡＣＡＧＴ（配列番号３）
ＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＴ（配列番号４）
ＴＲＰ２用のプライマーセット
ＧＧＡＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＴＴＧ（配列番号５）
ＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧ（配列番号６）
ＭＩＴＦ用のプライマーセット
ＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴ（配列番号７）
ＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＣ（配列番号８）
β―アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号９）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号１０）

実験結果を表１〜４に示した。その結果、ＮＲＧ１タンパク質は、メラノサイトにおけるＴＹＲ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びＭＩＴＦの発現を促進した。従って、ＮＲＧ１は、メラノサイトに作用してメラニン生成促進効果を有することが示された。

実験例３ 酸化ストレスによるＮＲＧ１生成促進効果
コンフルエントな状態のヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）に、最終濃度が２５０及び５００μＭになるように調製した過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を添加して２４時間培養後、ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡを基に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、ＮＲＧ１ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用い、ＮＲＧ１用のプライマーは以下に示すものを用いた。内部標準として、β−アクチンを用いた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの操作は定められた方法に従い、ＮＲＧ１ ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるβ−アクチン ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＮＲＧ１の発現率は、未添加のｍＲＮＡの発現量に対するＨ_２Ｏ_２添加群のｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。

ＮＲＧ１用のプライマーセット
ＧＣＣＣＡＴＣＡＣＴＣＣＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡ（配列番号１１）
ＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＧＴＴＧＣＴ（配列番号１２）

実験結果を表５に示した。その結果、Ｈ_２Ｏ_２添加による酸化ストレスは、ＮＲＧ１の発現を促進した。従って、線維芽細胞に酸化ストレスを負荷すると、ＮＲＧ１の産生が亢進されることが示された。

実験例４ ＮＲＧ１の産生量を指標とする美白成分のスクリーニング方法
コンフルエントな状態のヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）に、最終濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬになるように調製した月下美人抽出物（製造例１）及びメラニン生成抑制効果を有することが知られているシラカバ抽出物（比較例３、一丸ファルコス）を添加して２４時間培養後、ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡを基に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、ＮＲＧ１ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用い、ＮＲＧ１用のプライマーは実験例３と同様のものを用いた。内部標準として、β−アクチンを用いた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの操作は定められた方法に従い、ＮＲＧ１ ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるβ−アクチン ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＮＲＧ１の発現率は、未添加のｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。

実験結果を表６に示した。その結果、シラカバ抽出物はＮＲＧ１の発現に影響を及ぼさなかったが、月下美人抽出物はＮＲＧ１の発現を顕著に抑制した。従って、ＮＲＧ１産生に対し、月下美人抽出物は優れた抑制効果を示した。

実験例５ 酸化ストレスを負荷することを特徴とする美白成分のスクリーニング方法
コンフルエントな状態のヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）に、最終濃度が５００μＭになるように調製した過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）と同時に、最終濃度が１００及び２００μｇ／ｍＬになるように調製した月下美人抽出物（製造例１）を添加した。２４時間培養後、ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡを基に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、ＮＲＧ１ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用い、ＮＲＧ１用のプライマーは実験例３と同様のものを用いた。内部標準として、β−アクチンを用いた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの操作は定められた方法に従い、ＮＲＧ１ ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるβ−アクチン ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＮＲＧ１の発現率は、未添加のｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。

実験結果を表７に示した。その結果、月下美人抽出物は酸化ストレスによるＮＲＧ１の発現亢進を抑制した。従って、酸化ストレスを負荷した時に増加するＮＲＧ１に対し、月下美人抽出物は優れた抑制効果を示した。

実験例６ Ｂ１６マウスメラノーマを用いたメラニン生成抑制試験
マウスメラノーマ由来細胞株であるＢ１６細胞を６ｃｍディッシュに３×１０^４個播種し、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ ｗｉｔｈ ＮＥＡＡにて５％ＣＯ_２、３７℃条件下で５日間培養した。その時、最終濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬになるように調製した月下美人抽出物（製造例１）及びメラニン生成抑制効果を有することが知られているシラカバ抽出物（比較例３、一丸ファルコス）を添加した。次に、細胞をＰＢＳ（−）にて２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）１ｍＬを加え、ラバーポリスマンにて集めた。遠心操作をして得られたペレットにＰＢＳ（−）０．５ｍＬを加え、超音波破砕操作をしてペレットを溶解させた。タンパク量はＬｏｗｒｙ法｛Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５−２７５（１９５１）｝により測定した。又、１ｍｇタンパクあたりのメラニン量を測定する場合、タンパク定量用に取った残りの細胞破砕溶液に４Ｎ水酸化ナトリウム０．５ｍＬを加え、６０℃で２時間反応させた後Ｏ．Ｄ．４７５を測定し、検量線からメラニン定量を行った。データは１ｍｇタンパクあたりのメラニン量を算出し、試料未添加のメラニン生成量をコントロールとし、コントロールに対する試料添加時のメラニン生成量の値からメラニン生成抑制率を算出した。

これらの試験結果を表８に示す。その結果、月下美人抽出物はメラノーマにおけるメラニン生成に影響を及ぼさなかったが、シラカバ抽出物はメラニン生成を抑制した。従って、メラノーマにおけるメラニン生成に対し、月下美人抽出物は抑制効果を示さなかった。

実験例７ 使用試験
処方例１のクリーム、比較例１の従来のクリーム１及び比較例２の従来のクリーム２を用いて、各々女性３０人（２０〜４５歳）を対象に３カ月間の使用試験を行った。使用後、シミ及びソバカスの改善についてのアンケート調査を行って、美白効果を判定した。アンケートの評価基準は、有効なものを「優」、やや有効なものを「良」、わずかに有効なものを「可」、無効なものを「不可」として評価した。

これらの結果を表９に示した。処方例１の月下美人抽出物を含有する本発明のクリームは優れた美白効果を示した。又、比較例１のシラカバ抽出物を含有する従来のクリーム１は美白効果を示したが、処方例１の月下美人抽出物を含有する本発明のクリームよりも効果は低かった。尚、試験期間中皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。

前記図１及び表１〜４より、ＮＲＧ１は線維芽細胞から産生されてメラニン生成に関与していることが確認された。そして、前記表５より、酸化剤曝露にてＮＲＧ１の発現が亢進されることが分かった。又、前記表９より、月下美人抽出物は最終的に美白効果を有する薬剤であることが認められた。しかしながら、前記表８より、そのメカニズムはメラノサイトのみによるものではないことが分かった。一方、前記表６及び７より、月下美人抽出物の美白効果は、真皮線維芽細胞におけるＮＲＧ１の発現量と相関があることが認められた。

以上より、線維芽細胞における神経栄養因子ＮＲＧ１発現量を指標とすることで美白成分のスクリーニングが可能となった。又、同様に、神経栄養因子ＮＲＧ１の産生抑制効果を指標とすることで美白成分のスクリーニングが可能となった。

本発明の線維芽細胞を用いることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法は、これまでのケラチノサイトやメラノサイトを用いる美白成分のスクリーニング方法では評価することができなかった化粧料や皮膚外用剤等に用いる美白成分の開発に用いられるものである。

Claims (1)

1. 線維芽細胞に過酸化水素と試料を添加し、過酸化水素による神経栄養因子ｎｅｕｒｅｇｌｉｎ１（ＮＲＧ１）の産生上昇に対する試料の抑制作用を、ＮＲＧ１の産生抑制効果を指標として評価することを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。