JP6323883B2 - 成長測定によるマススペクトル耐性判定 - Google Patents

Description

本発明は、抗生物質に対する細菌耐性を判定するためのマススペクトル方法に関するものである。

〈定義〉
制定単位の「統一原子質量単位」(u) の代わりに、この文書では単位「ダルトン」(Da) を使用する。これは、「Bureau International des Poids et Mesures」による最新版 (第8版) の2006年文書「The International System of Units (SI)」で、原子質量単位と同等のものとして追加され、これに記載されている。ダルトンの追加は主に、キロダルトン、ミリダルトン、及び同様の単位を使用できるようにするためになされたものである。

3,000〜15,000ダルトンの好ましい質量範囲の場合、しばしば、このタンパク質を「ペプチド」と呼ぶほうがふさわしいとされるが、単純化のために、本文書では用語「タンパク質」のみが使用される。軽量のペプチドから重いタンパク質への移行は流動的であり、明確に定義づけられたものではない。

用語「細菌」はしばしば、「微生物」の短い形として本明細書中で使用される。単数形の「細菌 (microbe)」は更に、一般的な表現で使用されるように、細菌種、ならびに個々の細菌細胞を意味する。複数形の「細菌 (microbes)」は、分析下にある細菌細胞を意味する。

数多くの微生物種、特に細菌及び単細胞真菌 (酵母など) は近年、マススペクトルを使用して迅速かつ低誤差率で同定可能である。この同定は、破壊 (溶解) した細菌 (特にその水溶性タンパク質) のマススペクトルと、類似タイプの既知の微生物の参照マススペクトルとの間で、相似値を計算することで、日常的に行われる。この相似値が所定の制限値を超えた場合、科、属、種、更には菌株を同定することができる。この非常に迅速で低価格の微生物同定方法は、多くの微生物研究所で大規模研究と日常的臨床検査の両方において非常な成功を収めていることが実証されている。装置に応じて、48〜384の細菌サンプルを同時に決定することができる。同定には、コロニー培養終了から同定まで、数分間しかかからない。この方法は誤差率が非常に低く、従来の微生物学的同定方法や、DNA分析による方法よりも、はるかに低い誤差率を有する。また、市場には評価プログラム及び参照スペクトルライブラリを備えた質量分析計があり、これらはドイツ医療機器法 (MPG) 及びその他の国内・国際規制及びガイドラインに準拠した医療診断用のIVD製品として認定されている。

一般的な表現で使用されるように、用語「抗生物質」は、細菌感染症 <http://de.wikipedia.org/wiki/Bakterielle_Infektionskrankheit>のための薬理学的活性物質と、殺菌用物質とを意味する。ペニシリンの成功により、数多くの他の抗生物質の探索と発見がもたらされた。抗生物質には、数多くの科の細菌に対して有効な広域抗生物質と、個々の細菌種に対して特異的に有効な狭域抗生物質がある。

ペニシリンが最初の薬理学的活性物質として使用されて以来、細菌株は、多様なタイプの抗生物質に対して様々なタイプの耐性を次第に発達させ、あるいは他の細菌から耐性を獲得する (すなわち、抗生物質の影響を弱めたり、完全に中和したりする性質を獲得する) ようになっている。残念なことに耐性は依然として一般的である。病院で発生する細菌は今日、概して耐性を有している。場合によっては、病院で通常使用される抗生物質に対して病院内で伝播する細菌の耐性を予測することが可能である。これは、病院外で獲得された感染症には該当しない。

細菌感染 (通常、敗血症などの急性状態の生命にかかわるもの、又は、既存の主疾患 (又は主感染) 中に起こる副次的感染症) の治療の成功はしばしば、有効な抗生物質を最初に投与することにかかっている。標的を絞った投与は、病原体をできる限り迅速かつ正確に同定することだけでなく、様々な抗生物質に対する耐性をできる限り迅速に判定することが必要になる。従来の耐性判定には、抗生物質存在下での培養が伴うが、残念ながらこれには24〜48時間という長い時間がかかる。

抗生物質の存在下で培養することに加え、耐性を判定する遺伝学的手法も伴う。ここで、疑われる病原体のゲノム中に既知の耐性遺伝子を検出することにより、耐性が検出される。この遺伝学的方法の利点は、耐性遺伝子がポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) などの技法により増幅でき、これにより分析に必要な時間は、細菌の成長速度により制約されなくなることである。欠点は、通常の方法よりも高価であり、実用的な試験ではないことである。耐性遺伝子が存在するけれども発現していない場合があり、これはすなわち、調べている細菌株が耐性ではないけれども、この方法では耐性であるとして検出されることを意味する。

特許文献１(V. M. Govorun and J. Franzen、2006年、特許文献２及び特許文献３に対応。以下では「Govorun」と称する) は、細菌の耐性判定のためのマススペクトル方法を開示している。

一実施形態において、例えば、細菌のタンパク質プロファイルがマススペクトルにより測定され、抗生物質入り又はなしの培地中で培養した後に比較される。ここにおいて細菌は例えば、抗生物質入り又はなしで、遠心管中で培養される。培養後、細菌を遠心分離にかけ、洗浄し、遠心管中で酸及びアセトニトリルにより破壊することにより可溶性タンパク質を放出させる。

破壊された細菌細胞を含んだこの液の少量 (約1マイクロリットル) を、サンプル支持体上に載せ、乾燥させてから、少量のマトリックス溶液 (これも約1マイクロリットル) でコーティングする。溶解したタンパク質が、乾燥プロセス中に生じるマトリックス結晶中に埋め込まれる。マトリックス結晶及び埋め込まれたタンパク質を含んだサンプルが、質量分析計中でレーザー光パルスの照射を受け、これによりタンパク質分子のイオンが蒸気プラズマ中に形成される。飛行時間型質量分析計で飛行時間を測定することで、微生物のマススペクトルが生成され、これは主にタンパク質のピークを含む。

2つのマススペクトルの相似性では、微生物の抵抗性について限定的な結論のみが得られる。例えば腸内細菌科のklebsiellaeなどのように、感受性の細菌がその成長を阻害されただけ、又は殺されただけで、破壊されていない場合、結果として得られるマススペクトルは、抗生物質なしの培地から得た細菌のマススペクトルと実際上同じである。これは、マトリックス支援レーザー脱離 (MALDI) によるイオン化を用いて得られたマススペクトルの形成が、サンプル中の細菌の量にわずかながら依存しているからである。1万個の細菌を有するサンプル調製物は、実際上、1000万個の細菌を有するサンプル調製物と同じマススペクトルを提供し、これは同定のために理想的であるが、耐性の同定には適していない。細菌の成長が単に停止した場合、同じマススペクトルが得られる。違うのは量だけであるため、マススペクトルには差が現れないのである。

特許文献１（Govorun）で詳しく述べられているように、耐性は、調べている細菌に、第2のタイプの細菌を追加することによっても同定することができる。この第2のタイプは非常に異なるマススペクトルをもたらし、耐性であり、抗生物質の存在下で明らかに成長し続ける。これにより、2つの細菌を重ね合わせたタンパク質のマススペクトルは、成長において差を示すことになる。残念ながら、この方法は様々な理由から日常的臨床検査ではあまり実用的でないことが判明している。これは、使用される細菌の少なくとも大まかな定量判定が、使用される培地における成長速度とほぼ等しく、参照細菌が数多くの抗生物質に耐性であることを想定しているからである。

耐性判定の対象となる細菌は、十分に純粋な形態で十分な量が存在していることが好ましい。例えば、細菌は寒天培地上でコロニーを形成させることができ、又は、血液培養から得た細菌として存在し得る。寒天培養では、一般的な操作として、試験のために、1つのコロニーからだけでなく、少なくとも5つのコロニーから得た細菌を合わせて試験に用い、これによって、同じ種の非耐性細菌中に存在し得る耐性細菌を同定することができる。訓練を受け経験を積んだ検査室技術者は一般に、同じ細菌種のコロニーを見分け、採取することができる。これらは混合し、培養のために分割しなければならない。血液培養は本来的に、感染により伝播した異なる細菌の混合物を含む。

原則として、耐性判定 (Govorunによるものを含む) はしばしば、寒天培養又は血液培養で成長させた細菌の同定により進められる。これは、特にGovorunによる方法の場合、細菌種とその成長速度を知るのに役立つ。また、この細菌が耐性を有し得る抗生物質も既知であるような場合にも役立つ。更に、疑わしい細菌の阻害最小濃度 (MIC) も、通常は既知である。これはすなわち、好適な濃度の抗生物質を備えた培養物を調製することができることを意味する。Govorunの方法の最小培養時間は、この既知の成長速度によって得られる。

独国特許第 10 2006 021 493 B4号明細書 英国特許第 2 438 066 B号明細書 米国特許第 8,293,496 B2号明細書 独国特許第 10 2005 044 307 B4号明細書

上記の見地から、特に、増殖が早く、したがって特に危険な病原体の、1つ以上の抗生物質に対する細菌耐性を、約1時間以内に、低価格かつほぼ自動的な方法で、そして最も重要なこととして高速で確実に判定できるようなマススペクトル方法を提供するニーズが存在する。この方法は、細菌のマススペクトル同定にも使用されるのと同じ日常的臨床検査で使用される質量分析計を用いて実行できることが望ましい。

本発明は、細菌耐性のマススペクトルによる判定の方法を提供し、ここにおいて細菌は抗生物質を含む培地中で培養され、この細菌のマススペクトルMS_cumは培養後に取得される。本発明による方法は、培養中に生じる細菌の成長が、参照物質を利用して判定されるという事実によって特徴付けられる。この参照物質は、所定量で添加され、マススペクトルMS_cumで測定される (同時測定)。ここにおいて、細菌の成長は、抗生物質に対する抵抗を示す。細菌の成長は、培養後の細菌の量をマススペクトルを使用して測定し、次に、この量を、培養前の同様に測定された細菌量、及び／又は抗生物質なしで培養した後の同様に測定された細菌量と比較することによって、確認することができる。

第1の好ましい実施形態は、培養後の細菌量をマススペクトルMS_cumから測定する工程と、その細菌量が所定の制限値を超える場合にその細菌が耐性であることを報告する工程とを含む。本明細書において、培養の開始時に細菌の量を標準化することが有利である。

第2の好ましい実施形態は、追加的に、抗生物質なしの培地で細菌を培養する工程と、抗生物質なしで培養した後に細菌のマススペクトルMS_sine を取得する工程とを含む。所定量が添加されている参照物質も、マススペクトルで測定され、マススペクトルMS_cum及びMS_sineから得られた細菌量が、所定の制限値よりも少なく、相対的又は絶対的に異なっている場合、その細菌が耐性として報告される。

第3の好ましい実施形態は、培養の前に追加的にマススペクトルMS0 を取得する工程を含む。所定量が添加されている参照物質も、マススペクトルで測定され、マススペクトルMS_cumから測定される細菌量が、マススペクトルMS0から測定される細菌量を顕著に上回る場合、その細菌が耐性として報告される。この実施形態において、細菌を培地に追加することができ、これを後で2つの (好ましくは同じサイズの) 培養に分け、これらがそれぞれ、抗生物質を伴う培養と、マススペクトルMS0 の取得とに使用される。一方、抗生物質を追加した後で、又は同時に、培養の一部を取り出すことができ、これをマススペクトルMS0の取得に使用することができる。

これら3つの好ましい実施形態において使用される判定基準は、該当する場合、論理演算子 (例えばAND演算又は非排他的OR演算) によって組み合わせることができる。

用語「マススペクトル」は、質量信号の位置及び強度のみを含む、処理済みピークリストへと流すためのマススペクトル生データを含む。本明細書において、マススペクトルは、連続質量範囲での複数の強度値を含み得るが、また更に、いくつかの個別の質量範囲での強度値も含み得る。マススペクトルは、細菌量を測定する前に、信号処理を行うことができる。この処理には例えば、ベースラインの補正 (差し引き)、質量信号の平滑化、ノイズ信号の除去、及び／又は所定のノイズ値を超える質量信号の選択が含まれる。

細菌量、又はその測定は、様々な方法でマススペクトルから測定することができ、例えば、細菌信号の強度と、参照信号の強度又はいくつかの参照信号の合計強度との比によって、あるいは、いくつかの細菌信号の合計強度と、参照信号の強度又はいくつかの参照信号の合計強度との比によって、あるいは、マススペクトルの一部又は全体のすべての信号の合計強度と、参照信号の強度又はいくつかの参照信号の合計強度との比によって、測定することができる。合計を行う前に、細菌信号は、例えば、繰り返し測定でしばしば生じるもの、又は高い信号強度のものを、ピークリスト又は連続マススペクトルから選択することができる。ピークリストに加え、マススペクトル生データ (参照物質の位置が既知であれば、較正済み質量軸なしであってもよい) を使用して、細菌量を測定することも可能である。例えば、必要に応じて予めベースラインを修正し、生データの選択された範囲におけるすべての強度値を合計し、参照信号のある範囲内の合計強度値でこれを割ることによって、細菌量を測定することができる。

細菌は、単一の抗生物質を加えた培地で、又は異なる抗生物質の混合物を加えた培地で、培養することができる。耐性の強度を判定するため、又は少なくとも推定するために、細菌は複数の (2つ以上の) 培養物で平行して培養することができ、このそれぞれが異なる濃度の抗生物質を含み、この各培養について、細菌と所定量の参照物質とのマススペクトルMS_cum,_iが取得される。複数の抗生物質に対する耐性を調べるために、複数の抗生物質を含む複数の (2つ以上の) 培養物で同時に (平行して)、それぞれの場合において必要に応じて抗生物質の濃度を変えて、調製することが可能である。ここでも、細菌と所定量の参照物質とのマススペクトルMS_cum,_i がそれぞれの培養物について取得される。

参照物質は、培養の前、培養中、培養後、マススペクトルサンプルの調整中、又はマススペクトルの取得中に、培地に所定量を加えることができる。所定量の参照物質は、細菌の細胞溶解後に加えることができる。参照物質を培地に加える場合は、細菌によって吸収されたり破壊されたりしてはならない。細胞溶解後に加える場合は、この条件は本質的に適用されない。マススペクトルが、マトリックス支援レーザー脱離 (MALDI) によるイオン化を用いて取得される場合、参照物質は好ましくは、サンプル支持体上で調製されているときにのみ、特にマトリックス溶液と共に、添加される。

また、所定量の参照物質の混合物を加えることも可能である。本明細書において、混合物中の参照物質によって、より広範囲の濃度がカバーされている場合に、有利であり得る。例えば3つの参照物質は、100:10:1又は25:5:1の比で使用できる。参照物質は、効率的にイオン化することができ、かつ、可能ならば、対応するマススペクトルで複数の特定可能な参照信号を提供できるものであるべきである。参照物質のプロトン親和性が、多くの細菌タンパク質のプロトン親和性よりも高いことが望ましい。好ましい参照物質は、リボヌクレアーゼ又はリゾチームである。参照物質の質量は好ましくは10〜20キロダルトンであり、具体的には14〜15キロダルトンである。

分析対象の細菌は好ましくは十分に純粋な形態で存在する。例えば、細菌は寒天培地上でコロニーを形成させることができ、又は、血液培養から得られる。また、本発明による方法を使用して、検査対象のサンプル (例えば鼻の粘膜を拭った綿棒) の細菌を、直接、又は液体培地中で予備増殖させた後に調べることも可能である。

本発明による方法を実行するために、細菌量が培養の前又は後に裸眼で見える程度であることは、原則として必要ではない。すなわち、培養前に、おそらくは10 ⁵ 未満の細菌細胞、具体的には10 ⁴ 未満の細菌細胞で十分であり、培養は好ましくは1 μl〜1 mlの容積、具体的には100 μlで実行できる。最初に検査対象のサンプル中にある細菌細胞数が少なく、培養時間が短いため、マススペクトルサンプルの調製前又は調製中に細菌のタンパク質を濃縮する必要が生じ得る。濃縮は、例えば、細菌細胞の溶解の後にタンパク質を沈殿させ、その後にタンパク質を分離することにより、行うことができる。この分離は、例えば遠心分離により行うことができ、あるいは、例えば (磁気) ビーズ上、MALDIサンプル支持体上、ピペットチップの梱包材の表面上に存在し得るような、タンパク質結合のために官能基化された表面を用いて行うことができる。タンパク質を搭載した分離されたビーズは、必要に応じて、MALDI支持体に直接適用することができる。

本発明による方法は、細菌の耐性を判定するのに使用することができ、また、単細胞真菌 (酵母など) の、抗真菌薬又は抗真菌薬混合物に対する耐性を判定するのに使用することができる。本発明による方法の更なる一実施形態は、耐性を判定する前に細菌を分類学的に同定する工程と、その分類に基づいて、参照物質、耐性を判定する制限値、培地及び／又は培養条件、特に培養時間を選択する工程とを含む。

本発明の一実施形態は、Govorunによる方法に類似であるが、特に、タンパク質の増加による細菌成長の測定を可能にすることを目的とする。マススペクトルを利用して、抗生物質の入った培地中での細菌成長を定量的に測定するために、1つ以上の好適な、精密な所定量の参照物質が、培養物又は溶解した細胞に添加される。抗生物質が入った培地中でのバイオマスの増加、及び特にタンパク質の増加は、参照物質の利用により判定される。ここで、抗生物質を含まない培地での細菌成長との比較を行うことができ、また、更なる培養なしでの細菌量との比較を行うことができる。予測された程度のバイオマスの増加は、対象の細菌が、使用されている濃度の抗生物質に対して耐性であることを示す。感受性の細菌は、抗生物質濃度が阻害最小濃度 (MIC) を上回った場合、測定可能な成長を示さない。

この方法は非常に迅速であることが実証されている。バイオマス成長を4倍にするためには、倍加を2世代だけ行えばいいため、危険な感染症の耐性 (これは通常、倍加時間が20分の成長が速い細菌による) は、40分間の培養後に検出可能になり得る。成長の遅い細菌は、これより長い時間がかかる。必要な培養時間は、細菌種、従ってその倍加時間が既知である場合、特定することができる。

本発明は更に、大きなサンプル面積の、マトリックス支援レーザー脱離 (MALDI) によるイオン化のサンプル支持体を提供し、このそれぞれがMALDIマトリックス基質の薄層である。サンプル支持体は、その薄層が、10〜20キロダルトン、具体的には14〜15キロダルトンの質量の、所定量の参照物質を含むことで特徴付けられる。この薄層は更に、少なくとも2つの異なる参照物質を有し得、これらは、5〜100倍、また必要に応じて1000倍の濃度差がある。更に、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離 (MALDI) によるイオン化の消耗材を提供する。この消耗材は、MALDIマトリックス基質と、少なくとも1つの参照物質との凍結乾燥混合物である。1つ以上の参照物質の質量は、好ましくは10〜20キロダルトンであり、具体的には14〜15キロダルトンである。参照物質が、例えば5:1、10:1、100:1又は1000:1などの異なる濃度で存在することが好ましい。

本発明による細菌の同定とその耐性の判定のための好ましい方法のフローチャートの一例である。 klebsiella属の一種である細菌の2つの菌株のマススペクトル4つを示すチャートである。上の2つのマススペクトルは菌株1に由来するもので、この菌株1は感受性であるため、添加された抗生物質 (「Ab」) を伴う培養において成長が生じない。上から2番目のスペクトル (「菌株1 + Ab」) において、事実上、右側に離れた一価のピーク、及び中央からやや左の二価のピークとして、参照物質 (リボヌクレアーゼA) の質量ピークのみが見られる。下の2つのマススペクトルは菌株5から得られたもので、この菌株は耐性であるため、抗生物質 (「菌株5 + Ab」) が添加された後でも、成長が阻害されていない (いちばん下のスペクトル)。マススペクトルはすべて、培養時間1時間のみの後に取得した。 5つのklebsiella株のマススペクトルの評価図であり、それぞれ、抗生物質ありとなしの場合を示す。菌株1と菌株2は感受性であり、よって、抗生物質の存在下では成長していない。菌株3と5は耐性であり、抗生物質ありとなしの場合で同じ成長を示す。菌株4は、中程度の耐性があるか、採取されたコロニーのうち一部のみが耐性である (よって耐性菌の初期量が少なかった) と推定することができる。図中のボックスは、繰り返し測定の平均分散を表わす。

本発明は、数多くの実施形態を参照して示され説明されているが、添付の請求項で定義される本発明の要旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行い得ることが、当業者には理解されよう。

本発明は、抗生物質の添加あり及びなしで、同じタイプのいくつかの培地で培養した後、細菌のマススペクトルを比較することにより、細菌の耐性をマススペクトルで判定するための好ましい方法を提案し、ここにおいて培養中の細菌成長は、少なくとも1つの添加された参照物質の助けにより判定され、抗生物質を含む培地で細菌が成長した場合は、その濃度でこの抗生物質に対し耐性であることを示す。細菌は、特に、様々なタイプの抗生物質を備えた複数の (2つ以上の) 培地で平行して培養することもできる。

参照物質は培地に所定量添加しておくことができ、これは、洗浄及び細胞溶解の後の調製物においても見ることができるよう、細菌により常に同じ量で吸収され、かつ分解しない種類のものでなければならない。この条件は充足することが難しいため、参照物質は好ましくは培養後に添加される。例えば、溶解した細胞に添加され、又は、マトリックス支援レーザー脱離によるイオン化の場合、サンプル支持体上のサンプルの調製物に添加される。

耐性の強度を判定するため、又は採取されたすべてのコロニーの細菌が同様に耐性であるかどうかを判定するためには、いくつかの濃度レベルの抗生物質を含む培地で細菌を培養することができる。採取されたコロニーの一部のみが耐性である場合は、本明細書では「混合耐性」という用語が用いられ、この場合、すべての濃度レベルで、抗生物質なしの培養に比較して、同じ割合で成長の減少が見られる。なぜなら、成長はより少ない量の耐性菌で始まっているからである。しかしながら、これは比較的稀である。一方、中程度の耐性を有する場合には、抗生物質濃度が高い場合には成長は見られないが、濃度が低い場合にはフルに成長する。コロニーの細菌を混合しないようにすることも可能ではあるが、その場合は、各コロニーの細菌について別個にこれらの試験を実施しなければならない。

現行の実践技術では、通常一晩かけて、同定のために寒天又は血液培地で細菌を培養する。寒天培養では、通常複数のコロニーがあり、そのうち1つを同定のために採取する。耐性を判定するためには、同じ種の非耐性細菌コロニーの中にある耐性細菌コロニーの存在 (混合耐性) も検出するために、この試験に少なくとも更に5つのコロニーから得た細菌を合わせて行うのが一般的な実践技術である。訓練を受け経験を積んだ検査室技術者は一般に、同じ細菌のコロニーを見分け、採取することができる。これらのコロニーの細菌は好ましくは混合し、異なる培養に分割することができる。しかしながら特殊な場合、例えば、コロニーが同じ細菌種に属することが確実だと想定できないような場合には、これらは個別に耐性判定を行うことができる。血液培養の細菌は本来的に、感染により伝播した異なる細菌の混合物を含む。当業者には周知のように、血液培養では通常、遠心分離ペレットが得られ、これには、同定、更には耐性判定を行うのに十分な細菌が含まれている。

一実施形態において、本発明はGovorunによる方法と同様であり、ここにおいて、抗生物質の添加あり及びなしでの培養物から得た細菌のマススペクトルが互いに比較されるが、本発明は、Govorun特許で言及されていない、細菌の成長の測定を目的とする。マススペクトルを利用して、抗生物質の入った培地中での細菌成長を定量的に測定するために、1つ以上の好適な、精密な所定量の参照物質が添加され、好ましくは細胞溶解後に添加される。抗生物質が入った培地中でのバイオマスの増加、及び特にこれに伴うタンパク質の増加は、参照物質の利用により定量的に測定される。特に、抗生物質を含まない培地での細菌成長との比較を行うことができ、また、更なる培養なしでの細菌量との比較を行うことができる。予測された程度のバイオマスの増加は、対象の細菌が、使用されている濃度の抗生物質に対して耐性であることを示す。感受性の細菌は、抗生物質濃度が阻害最小濃度 (MIC) を上回った場合、成長を示さない。

マトリックス支援レーザー脱離 (MALDI) によるイオン化を伴う飛行時間型質量分析計が、主にこの同定に使用される。MALDIは何十年にもわたり、定量分析には不適切だと見なされてきた。しかしながらそれが誤りであり、サンプル支持体上のサンプルについて過去に使用されていた非常に粗い調製方法によるものであったことが、かなり以前に示されている。例えば、非常に良好かつ均一な薄層調製を行い、参照物質を適切に精密な所定量で添加した場合、2パーセントの精度でMALDIを用いて物質の量を測定することができることが示されている。本明細書では、これほどの精度は必要としない。精度のために必要とされる労力が、日常的臨床検査を不必要に煩雑にしてしまう可能性がある。20パーセント程度の定量精度を、大した労力なしに臨床検査業者で達成することができる。倍加時間ごとの細菌成長は、2倍ずつであるため (すなわち、倍加時間が2回で、4倍となる)、たとえ、抗生物質の存在下で成長が遅くなったとしても、また採取されたすべての細菌コロニーが耐性ではない場合でも、MALDI は容易に、細菌成長を測定するこのタスクを遂行することができる。

よって本発明は、細菌のマススペクトルを測定する前に、好適で、正確に既知の量 (又は濃度) (本明細書では「所定量」という用語が使用される) で定量的参照として好適な、1つ以上の物質を添加することを目的とする。参照物質は、培地にあらかじめ添加することができる。しかしながらこの場合、参照物質は細菌により常に同じ量で吸収され、かつ消化により分解しないものである必要がある。よって、細菌を殺した後にのみ、遠心管中の破壊された細菌液中のタンパク質か、又は、MALDIサンプル支持体上の乾燥タンパク質に適用するマトリックス溶液のいずれかに、所定量の参照物質を添加することが有利である。これらの参照物質により、抗生物質の添加ありおよびなしでの細菌の相対的成長を定量的に推定することが可能になり、またこれから耐性若しくは感受性を判定することが可能になる。この使用する量及び濃度の精度は、本方法の全体的な精度を約20パーセントに維持するために、好ましくは約10パーセントにすべきである。参照物質は、プロトン親和性が高く容易にイオン化されるものであるべきであり、これによりイオン化が、細菌のタンパク質により抑制されないようにする。可能ならば、マススペクトル中で容易に識別可能なピークを複数提供するものであるべきである。参照物質が、より広範囲の量をカバーする場合、有利であり得る。例えば3つの参照物質は、100:10:1又は25:5:1の比で使用できる。参照物質が最高濃度のとき、マススペクトル中の参照信号が、阻害されていないフル成長後の細菌の最高信号 (通常はタンパク質信号) が呈するのとほぼ同じ高さ (強度) であることが、有利であることが実証されている。

リボヌクレアーゼAは、本明細書において物質の一例として引用されており、これは好適に使用することができる。分子量は13,638ダルトンであり、プロトン親和性が高く、リボヌクレアーゼAの一価、及び二価、更には三価のイオンが、MALDIスペクトルに現れる。一価RNアーゼAイオンは、ふつう他のピークの干渉がない、容易に識別可能なマススペクトル領域に現れる。

例えば、他のリボヌクレアーゼを、更に好適な物質として挙げることもできる。しかしながら、例えばリゾチームなどの、高プロトン親和性を備えた別の物質種を使用することも可能である。リゾチームCは分子量が14.3キロダルトンであり、これも、マススペクトルの混み合っていない範囲にピークを有する。

この方法は驚異的に迅速であることが実証されている。危険な感染症は通常、倍加時間がわずか約20分間の成長が速い細菌によって引き起こされる。バイオマスを4倍に成長させるのに、わずか倍加時間2世代分だけが必要であるため、このような成長の速い細菌の耐性は、わずか約40分の培養時間で識別することができる。倍加時間が30分間の成長の遅い細菌の場合は、1時間が必要になる。細菌の処理、MALDIイオン化の調製、及びマススペクトルの取得に更に20分間加えれば、その耐性は、同定から1時間〜1時間半で判明できる。ここにおいて、細菌は、耐性を判定する前に同定されることが有利である。細菌種とその倍加時間が既知であるとき、必要な培養時間を最適に特定することができる。

この方法は更に、細菌の採取時又はサンプルの調製時に生じる間違いをチェックする可能性も提供する。培養の後に取得された細菌のマススペクトルは、正しい判定を確認するため、その細菌に対してもう一度同定手順を行うことができる。この同定方法は時間がかかるため、培養後に取得されたマススペクトルと、同定に使用したマススペクトルとの間の相似性を単に判定することによって、迅速化することができる。この相似値は、耐性を判定するための正しいマススペクトルがあるかどうかについての情報を提供する。

細菌の完全な耐性と完全な感受性との間には、中間段階が存在する。成長が妨げられているが、完全には阻害されていない状態である。細菌の耐性の強度を判定、又は少なくとも推定するために、抗生物質の実際の阻害濃度を測定することができる。抗生物質のMIC値 (完全に感受性の細菌の阻害最小濃度) はかなりよく知られている。ただし実際の阻害濃度は、耐性の強度に従って増加する。実際の阻害濃度を測定するために、様々な濃度レベルの抗生物質を添加した培養を使用することができ、ここにおいて濃度レベルは、例えば、既知のMIC値に対して、1* MIC、10* MIC、及び100* MICの濃度に対応し得る。発明者らの経験では、1*MICの濃度での細菌成長の阻害は、その細菌が完全に感受性である場合にのみ、上記の方法で検出することができる。弱い耐性の場合、細菌は、10*MICの濃度でのみ阻害される。一方、非常に強い耐性の場合、100*MICの濃度でも成長が依然として検出され得る。この影響は、細菌成長の値からも判定することができる。このように、中間の耐性の場合は、異なる抗生物質濃度で、成長が異なる。

しかしながら、採取したコロニーの一部のみ (例えば半分) が耐性で、残りが感受性であるという場合もあり得る。これは、「混合耐性」と呼ばれる。そのような場合、強い耐性を有している場合であっても、少ない成長が検出されるように見える。しかしながらこれは、単に開始時に培養中の耐性細菌の数が少ないことによるものである。ここで、異なる抗生物質濃度で試験を実施した場合、すべての濃度で、抗生物質なしの培養に比べて、タンパク質成長の低減が同じ割合で見られる。

この方法を濃度レベルなしで実施する場合、10*MICの濃度が特に好適であることが実証されている。

複数の抗生物質に対する耐性を調べるために、複数の抗生物質を含む複数の培養物で、それぞれの場合において必要に応じて抗生物質の濃度を変えて、調製することが可能である。複数 (2つ以上) の培養物から細菌を調製するのに必要な追加時間は、培養に必要な時間に比べれば取るに足らない。

多剤耐性菌 (例: MRSA、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌) の迅速試験については、複数のタイプの抗生物質の混合物を培地に添加することができる。細菌がこの混合物中で成長した場合は、多剤耐性である。この迅速試験で、検査対象のサンプル (例えば鼻の粘膜を拭った綿棒) も、細菌の混合物を含む可能性があり、事前にサンプル中の細菌を同定する必要がない。取得したマススペクトルは、抗生物質を含む培地中で成長した細菌を同定し、よって耐性であると判断するのに使用できる。

好ましい一実施形態において、耐性菌と感受性菌との区別をより正確にするために、抗生物質の入った培地に、反応性物質を追加で添加する。この反応性物質は、抗生物質によりすでに弱っている細菌を、反応により改変し、これにより抗生物質の影響を強化及び支援することができる。例えば、酵素を添加して、影響をすでに受けている細菌を攻撃かつ破壊できるが、影響を受けていない細菌はこの酵素の攻撃を受けないようにすることが可能である。

好ましい一方法において、スペクトルの特定部分 (例えば4,000〜10,000ダルトン) におけるすべての質量ピークの強度を合計し、これを一価参照イオンのピーク強度で割り、比qが得られる。例えば、この比qの値が200以下の場合は成長なしの感受性ピークを表わし (ピークの多くはノイズである)、一方、比qの値が200を超える場合は耐性であるというように、耐性判定のための日常的臨床検査方法を改善することが可能である。より好ましいのは、抗生物質入り (q_cum) 及び抗生物質なし (q_sine) の培地中の細菌について、比Q = q_cum/q_sineを形成する評価である。この比が1に近い場合 (0.8 < Q < 1.3)、細菌は耐性である。培養時間が倍加時間の約2倍である場合、感受性菌であれば、Qは約0.25 (0.1 < Q < 0.4) となる。

別の好ましい一方法において、抗生物質入りの培地で培養した後の細菌から取得したマススペクトルMS_cumは、ベースライン差し引き後に必要に応じて、最大信号に合わせて正規化される。0と1の間の複数の閾値が選択され、好ましくは10個超、より好ましくは約100個の等間隔閾値が選択される。各閾値について、閾値を超える強度のピークが判定され、その判定されたピークの数が、対応する閾値に割当てられて、曲線を形成する (閾値を超えるピークの数と、閾値とをそれぞれ軸にとる)。

閾値を超えるピークの数を判定する工程は、好ましくは、正規化されベースラインを差し引いたマススペクトルMS_cumから得られたピークリストで実施される。正規化曲線下の面積 (AUC) 又は原点と曲線との間の最小距離が、細菌成長の好ましい測定として決定され得る。AUCが所定の値を上回る場合、その抗生物質に対してその細菌が耐性であることを示し得る。より好ましくは、AUCは更に、MS_sineについても測定される。すなわち、同じ信号処理を、抗生物質なしで同じ条件下で培養した細菌のマススペクトルMS_sineに適用する。上記の値の比、AUC(MS_cum)/AUC(MS_sine) (好ましくは4/10) は、検査対象の抗生物質に対する耐性を示す。

同定とその耐性試験の両方を行わなければならない細菌サンプルが多数ある臨床検査業者では、手順工程の少なくとも一部を自動化できることに価値がある。方法全体の完全自動化は現在のところまだ可能になっていない。ただし、少なくとも一部の手順工程を自動的又は半自動的に扱うことができる数多くの装置が、すでに市販されているか、又は開発中で市販段階に近づいている。視覚的制御又は画像分析のいずれかにより寒天プレートから細菌コロニーを採取し、その細菌を同定のためのサンプル支持プレートに適用できる装置が存在する。

この装置は、更に耐性を判定するための細菌採取を行うよう、容易に開発することができる。サンプル支持プレート上で細菌を溶解させ、マトリックス溶液と共に調製する装置も、想像可能である。遠心分離ペレットの溶解を、好適なマイクロタイトレーションプレート又は一連の遠心管で実行できるような、ピペッティングロボットも入手できる。培養は、遠心管 (例えばエッペンドルフ管) 又はフィルタープレート (例えばAcropep 96ウェルフィルタープレート) 中で実行することができる。48、96又は384サンプルを保持できるサンプル支持体で使用できるMALDI質量分析計のIVD認定方法も、市販で入手できる。

マトリックス支援レーザー脱離 (MALDI) によるイオン化は、マトリックス基質がすでに薄層内に調製されているサンプル支持プレートか、マトリックス溶液調製物のいずれかを必要とする。市販のマトリックス基質はしばしば、超音波なしで溶かすのが難しいという欠点を有する。このように、精密に一定量の精製かつ凍結冷凍されたマトリックス基質の入った小さな瓶が利用可能であり、この中で、溶媒を加えるとマトリックス基質がすぐに溶解する。溶液は、正しい濃度ですぐに使用可能になる。本発明により、タンパク質増加の定量のために、少なくとも1つの参照物質を、これら正しい所定量のマトリックス基質製品に添加することができる。MALDIサンプルの調製のための装置において、マトリックス溶液を、適正な所定量で、かつ接触させることなしに、細菌の乾燥した細胞構成成分 (特にタンパク質) に適用することができる。すでに市販されている薄いマトリックス層付きのサンプル支持プレートは、更に、所定量の参照物質を含み得る。この薄層はそれぞれ、小さなサンプル領域に適用され、これら領域は互いに十分に離れていて、それぞれ約2ミリメートルの直径を有する。

耐性を判定するための好ましい一方法の手順が、例として図1のチャートに示されている。ここに示されている方法は、細菌を寒天上で培養する (101) ことから始まる。コロニーの細菌を採取し (102)、破壊し (細胞溶解)、処理してMALDIサンプルにする (103)。マススペクトルの取得 (104) で、参照スペクトルとこのマススペクトル比較することにより、細菌の同定が得られる (105)。臨床検査業者では、平行して同定する細菌サンプルの数にもよるが、コロニー採取から同定までわずか10〜30分程度しかかからない。耐性を判定するために、同じ細菌の更に複数のコロニーを同時に採取することが可能である (106)。これらのコロニーは混合され、異なるタイプの培養に分割される (107)。この図の例では、3つの培養物が調製される。1つは抗生物質なしの培地で培養 (108)、2つは抗生物質Ab1 (109) 及びAb2 (110) ありの培養である。もちろん、更に他の抗生物質を入れた培養物も調製することができ、また耐性の強度も判定する場合には、異なる抗生物質濃度での培養物も調製することができる。

細菌に衝撃を与えないよう、また加熱によって時間の遅れが生じないよう、培養物はすべて、最適温度で調製済みである。培養時間は、細菌の倍加時間 (世代時間) に依存し、これは細菌の同定により既知である。培養は、倍加時間2回又は3回分だけが必要である。成長の速い細菌には、約40分間で十分である。さまざまな培養から得た細菌を、参照物質の添加によりMALDIに加工し、マススペクトルを取得する (111)。比q_sineは、抗生物質なしで培養した細菌のマススペクトルから得られ、例えば質量範囲4,000〜10,000ダルトンにあるすべてのピーク強度を合計し、これを参照ピーク強度で割ることによって得られる。対応する比q_cum,_n は、それぞれの抗生物質nと共に培養した細菌のマススペクトルから得られる (112)。上述のように、比Q_n = q_cum,_n/q_sineは、それぞれの場合の耐性を示す。

この方法は、これまでに、MALDI飛行時間型質量分析計で、MALDIによるイオン化を用いて実施されている。MALDIは、ほぼ一価の分子イオンのみを形成するという大きな利点を有する。よって、3,000〜15,000ダルトンの好ましい質量範囲に50〜100ものピークが現れるにもかかわらず、マススペクトルは過負荷にならず、相似性が比較的容易に識別できる。ただしこれは、他のタイプのイオン化は使用できないということを意味するものではない。例えばESI (エレクトロスプレーイオン化) やDESI (エレクトロスプレーによる固体サンプルの直接表面イオン化、脱離エレクトロスプレーイオン化) といったスプレー式方法は、多価イオンを形成し、これはマススペクトルを容易に過負荷にし得るが、これらは液体クロマトグラフィー (HPLC) やキャピラリー電気泳動 (CE) などの分離方法と組み合わせることができ、これにより物質を分離して、よりシンプルな組成物でマススペクトルを取得することが可能である。

しかしながら、例えば化学的イオン化 (CI) などの、ほぼ一価イオンのみを生成する他のイオン化方法もある。化学的イオン化は、中性スプレー法と組み合わせて使用することができるが、また、固体サンプルのレーザーアブレーションと共に使用することもでき、またOTOF-MS (直交イオン射出を伴う飛行時間型質量分析計) と共に採用することもできる。このようにして取得されたマススペクトルは、高感度を備えた非常に高い質量分解能を提供する (例えば、J. Franzen 及び K. Michelmann, 特許文献４を参照)。

もちろん、マススペクトル測定に好ましい質量範囲である3,000〜15,000ダルトンを提供するものであれば、他のタイプの質量分析計を使用することも可能である。

本発明の様々な態様が、上記で説明された。ただし、本発明の様々な態様又は詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく、変更可能であり、また本発明の異なる実施形態に関連して開示された様々な態様は、実践可能であれば任意に組み合わせられることが理解されよう。更に、上述の説明は説明のみを目的としたものであり、本発明を制限する目的ではない。本発明の制限範囲は添付の請求項でのみ定義される。

Claims (26)

1. 細菌の抗生物質に対する耐性を判定するマススペクトル判定方法であって、該細菌は前記抗生物質を含む培地で培養され、該培養の後に該細菌のマススペクトルMS_cumが取得され、
   該培養の後に、参照物質が前記培地に、培養物に、もしくは溶解した細胞に所定量で添加され、これも該マススペクトルMS_cumにおいて測定され、
   該培養中に起こった該細菌の成長が、前記参照物質の質量信号を用いて判定され、ここにおいて、該細菌の成長が、該抗生物質に対する耐性を示すことを特徴とする、方法。
2. 培養の開始時に前記細菌の量が標準化され、前記細菌の量は、前記培養後にマススペクトルMS_cumから判定され、該細菌の量が所定の制限値を超える場合に該細菌が前記抗生物質に耐性であることが報告される、請求項1に記載の方法。
3. 前記細菌が更に、前記抗生物質なしの前記培地で付加的に培養され、該抗生物質なしの該培地で培養後に、該細菌のマススペクトルMS_sine が取得され、ここにおいて前記参照物質が前記培養後に所定量で添加され、それも該マススペクトルMS_sineにおいて測定され、かつ、該マススペクトルMS_cum及びMS_sineから得られた該細菌の量が互いに相対的又は絶対的に異なっていて、その差異が所定の制限値よりも少ない場合、該細菌が耐性として報告される、請求項1に記載の方法。
4. 前記細菌が前記培地で培養される前に、前記培地の一部分が取り除かれ、前記細菌の付加的マススペクトルMS₀ を取得するために用いられ、ここにおいて前記参照物質が所定量で添加され、それもマススペクトルMS₀で測定され、
   該マススペクトルMS_cumから判定される培養後の該細菌の量が、該マススペクトルMS₀から判定される培養前の該細菌の量を上回る場合、該細菌が耐性として報告される、請求項1に記載の方法。
5. 前記細菌の量が、マススペクトルから得られる比として判定され、該比は、（１）細菌信号の強度と、参照信号の強度又は複数の参照信号の合計強度との比、（２）複数の細菌信号の合計強度と、参照信号の強度又は複数の参照信号の合計強度との比、並びに（３）一領域又は全マススペクトル内のすべての細菌信号と参照信号の合計強度と、参照信号の強度又は複数の参照信号の合計強度との比、のうちの1つから形成される、請求項2〜請求項4のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記細菌が、マススペクトルサンプルとして調製され、前記参照物質が、該調製中に所定量添加される、請求項1〜請求項5のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記マススペクトルが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)を用いて取得され、前記参照物質が、サンプル支持体上でMALDIサンプルの調製中に添加される、請求項６に記載の方法。
8. 前記細菌が、それぞれが異なる抗生物質を含む複数の培養物で同時に培養され、該細菌及び前記参照物質のマススペクトルが各培養物について取得される、請求項1〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記細菌が、それぞれが前記抗生物質の異なる濃度を有する複数の培養物で同時に培養され、該細菌及び前記参照物質のマススペクトルが各培養物について取得される、請求項1〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記参照物質のプロトン親和性が、前記細菌のタンパク質のプロトン親和性よりも大きい、請求項1〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記参照物質がリボヌクレアーゼ又はリゾチームである、請求項10に記載の方法。
12. 前記細菌のタンパク質が、マススペクトルサンプルの調製の前又は調製中に濃縮される、請求項1〜請求項11のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記参照物質が複数ありそれらの混合物が所定量添加され、前記細菌の前記マススペクトルで共に測定される、請求項1〜請求項12のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記細菌が分類学的に同定されてから、該分類学的同定に基づいて、前記参照物質、耐性を判定する制限値、培地及び培養条件のうち、少なくとも1つが選択される、請求項1〜請求項13のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記マススペクトルが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) を用いて取得される、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
16. 10〜20キロダルトンの質量の所定量の前記参照物質を含む薄層内にマトリックス基質が予め調製されたサンプル支持体上で、複数のMALDIサンプルが用意される、請求項15に記載の方法。
17. 前記混合物の中の複数の参照物質は、互いに異なる濃度で存在する、請求項13に記載の方法。
18. 前記細菌は、遠心管又はフィルタープレートの中で培養される、請求項1〜請求項17のいずれか１項に記載の方法。
19. 細菌の抗生物質に対する耐性を判定するためのマススペクトル判定方法であって、該細菌は前記抗生物質を含む培地で培養され、該培養の後に該細菌のマススペクトルMS_cumが取得され、
    該培養の後に、又はマススペクトルサンプルの調製中に、参照物質が前記培地に所定量で添加され、これも該マススペクトルMS_cumにおいて測定され、
    該培養中に起こった該細菌の成長が、前記参照物質の質量信号を用いて判定され、ここにおいて、該細菌の成長が、該抗生物質に対する耐性を示すことを特徴とする、方法。
20. 前記細菌の成長は、マススペクトルMS_cumを用いて培養後の細菌の量を判定し、この細菌の量を、抗生物質なしで、培養前に及び／又は培養後にそれに応じて判定された細菌の量と比べることにより決定される、請求項19に記載の方法。
21. 前記細菌は溶解され、細菌のタンパク質は沈殿及びその後の分離により、又は官能基化された表面に結合することにより濃縮される、請求項19又は請求項20に記載の方法。
22. 前記官能基化された表面は、ビーズ上、MALDIサンプル支持体上、又はピペットチップの内壁材の表面上に存在する、請求項21に記載の方法。
23. 細菌のタンパク質を搭載したビーズは、分離され、MALDI支持体に適用される、請求項22に記載の方法。
24. 前記細菌は、遠心管又はフィルタープレートの中で培養される、請求項19〜請求項23のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記マススペクトルは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)を用いて取得される、請求項19又は請求項20に記載の方法。
26. 前記マススペクトルは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)を用いて取得され、前記参照物質が、サンプル支持体上でMALDIサンプルの調製中に添加される、請求項19又は請求項20に記載の方法。

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