JP6324792B2 - Ｗｎｔ発現抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、胡蝶蘭の抽出物を有効成分として含有するWnt発現抑制剤に関する。より詳細には、本発明は、Wntの発現を抑制することにより、Wnt/β−カテニンシグナルの亢進に関連する疾患の治療または予防に有効なWnt発現抑制剤に関する。

Wntは分泌性糖タンパク質で、線虫やショウジョウバエから哺乳類に至るまで生物種を超えて広く保存されている。Wntは、発生、器官や臓器の形成、細胞の分化・増殖・運動・極性など様々な生命活動に関与する重要なタンパク質であり、哺乳類では１９種類が同定されている（非特許文献１）。Wntの命名は、ショウジョウバエの分節遺伝子Wingless(Wg)とマウス乳癌で同定された遺伝子int-Iに由来する。Wntが細胞に作用することにより活性化される細胞内伝達機構は「Wntシグナル経路」と呼ばれ、β−カテニンを介して遺伝子発現を制御する「β−カテニン経路」と、β−カテニンに依存しない「β−カテニン非依存性経路」が存在する。β−カテニン経路（Wnt/β−カテニンシグナル）では、Wntが細胞膜上の受容体(Frizzled)に結合するとGSK-3β(Glycogen synthase kinase-3β)によるリン酸化が抑制され、分解を免れたβ−カテニンが核内へと移行し、遺伝子発現を介して細胞の増殖や分化を促すことが知られている（非特許文献２）。β−カテニン経路に関与するWntとしては、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a等が知られている（非特許文献３）。一方、β−カテニンを介さないβ−カテニン非依存性経路は、平面内細胞極性経路（ＰＣＰ経路）とＣａ^２＋経路に分類され、細胞運動や、細胞極性の調節、あるいはβ−カテニン経路の抑制に働く（非特許文献４、５）。β−カテニン非依存性経路に関与するWntとしては、Wnt4、Wnt5a、Wnt11等が知られている（非特許文献３）。

このように、Wntは複数の細胞内シグナル伝達機構に関与し、多様な細胞応答を制御するので、Wntシグナル経路は、生体の組織を構成する細胞の機能維持にとって不可欠である一方、その異常は様々な疾患や病態と関連している。実際、Wntシグナル経路の構成分子の遺伝子異常やタンパク質の機能異常が癌、アルツハイマー病、糖尿病、精神系疾患、心疾患、骨・軟骨疾患などに関連するという報告がある。なかでも、細胞の増殖や分化の制御に関与するWnt/β−カテニンシグナルの異常は、癌との関連性が深く、乳癌、大腸癌、胃癌、肺癌、食道癌、神経膠芽腫、及び線維腫などの癌においてWnt/β−カテニンシグナルの亢進が認められる。Wnt非存在下では、細胞質内のβ−カテニンがAPC (adenomatous polyposis coli)、GSK−3βとともにAxinに結合し、このβ−カテニン分解複合体（Axin複合体）中でCKI-1α(casein kinase Iα)と、GSK−3βとによるリン酸化を受けたβ−カテニンが、さらにユビキチン化を受けてプロテアソームによって分解されるので細胞内のβ−カテニン量は低い状態に保たれている。ところが、癌細胞では、共通してβ−カテニンの細胞質や核での異常蓄積が認められる。癌細胞の増殖は、この異常蓄積したβ−カテニンと転写因子であるT cell factor/Lymphocyte exnhacing factor (Tcf/Lef)とが結合し、cyclin D1やc-Mycなどの癌関連遺伝子が過剰発現することによると考えられている。

また、皮膚や毛髪のメラニンは、メラノサイトによって合成されるが、Wnt/β−カテニンシグナルは、毛包のバルジ領域付近に存在するメラノサイトの起源となる色素幹細胞からメラノサイトへの分化や、分化したメラノサイトのメラニン合成を制御しており、その亢進は、老人性色素斑、肝斑、雀卵斑、黒子症、シミ、日焼けなどの色素沈着を引き起こす。

このようなWntシグナル経路の異常を制御して正常な状態に戻すことが、Wntシグナル経路の異常に関連する疾患や病態の治療の選択肢の一つとして期待されており、研究が進んでいる。例えば、Wnt/β−カテニンシグナルを抑制するように制御する例としては、Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt10bの発現を抑制するポリヌクレオチドを用いる色素沈着の予防または改善剤（特許文献１）、Wnt2の発現を抑制するポリヌクレオチドやその機能を阻害するモノクローナル抗体を用いた癌の治療方法などがある（特許文献２）。また、Wntシグナルは、細胞レベルにおいて、胚性幹細胞や組織特異的幹細胞（筋芽細胞、骨芽細胞、神経幹細胞、小腸幹細胞、色素幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、毛包幹細胞、骨髄及び脂肪組織由来間葉系幹細胞など）の増殖および末分化状態の維持に関与することも明らかになっており、これらの幹細胞の増殖や分化の制御のためにWntの発現を抑制するポリヌクレオチドも開発されている（特許文献３）。

従って、Wntシグナルを適切に制御することは、各種疾患の治療のみならず、幹細胞の増殖や分化を効率的に制御する上でも有用であるが、上記のようなポリヌクレオチドや抗体タンパク質は、生体内に存在する酵素により分解されやすく、また生体内に導入する手段が煩雑であるため日常的な使用が困難である。よって、これらに代わる新たな因子の解明が望まれている。

胡蝶蘭は、ラン科ファレノプシス属及びその近縁属種との交配種である多年草で、主に東南アジアに分布する。胡蝶蘭はその優美な花姿から主には鑑賞用に用いられるが、これまで胡蝶蘭の抽出物に、抗炎症作用、収れん作用があることが知られており、化粧料として用いることが提案されている（特許文献４）。しかしながら、Wnt発現抑制効果についてはこれまで何ら知られていない。

特開２０１３−６７５８２ 特表２００７−５３６９３８ 特表２００８−５２６２２９ 特開平５−７０３３８

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本発明の目的は、Wntの発現抑制作用を有し、かつ生体内で安定な新たな因子を見出し、Wnt/β−カテニンシグナルの亢進に関連する色素沈着や癌などの疾患または病態を治療、改善、および予防するための化粧品、医薬品、医薬部外品、飲食品を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、胡蝶蘭の抽出物が、優れたWnt発現抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）胡蝶蘭の抽出物を有効成分として含有するWnt発現抑制剤。
（２）Wntが、Wnt/β−カテニンシグナルに関与するWntである、（１）に記載のWnt発現抑制剤。
（３）胡蝶蘭の抽出物を有効成分として含有するメラニン合成抑制剤。
（４）胡蝶蘭が、胡蝶蘭の幼苗である、（１）〜（３）のいずれかに記載の剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の剤を含む化粧品。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の剤を含む医薬品または医薬部外品。
（７）皮膚外用製剤である、（６）に記載の医薬品または医薬部外品。
（８）（１）〜（４）のいずれかに記載の剤を含む飲食品。

本発明のWnt発現抑制剤は、細胞におけるWntの発現および分泌を抑制することができる。従って、Wnt/β−カテニンシグナルの亢進に関連する色素沈着や癌などの疾患や病態を治療、改善、および予防することができる。また本発明のWnt発現抑制剤の有効成分は緩和な植物の抽出物を有効成分とするから、安全性が高く、生体内においても安定であるから、化粧品や医薬品等に配合して日常的に使用できる。

以下に、本発明について詳細に述べる。
本発明のWnt発現抑制剤は、胡蝶蘭の抽出物を有効成分として含有する。本発明でいう胡蝶蘭には、ファレノプシス属（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）の各種、及びそれらと交配可能な近縁種であるドリティス属（Ｄｏｒｉｔｉｓ）、ドリティノプシス属（Ｄｏｒｉｔａｅｎｏｐｓｉｓ）等の原種、その種間雑種あるいは属間雑種等が挙げられ、市販されている株を利用することができる。市販されている胡蝶蘭園芸品種の交配親の代表的品種としては、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｈｒｏｄｉｔｅ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｓｃｈｉｌｌｅｒｉａｎａ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｌｕｅｄｄｅｍａｎｎｉａｎａ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅｑｕｅｓｔｒｉｓ、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ等が挙げられる。また、ファレノプシス属以外の交配親の代表品種としては、ドリティス・プルケリマ（Ｄｏｒｉｔｉｓ ｐｕｌｃｈｅｒｉｍａ）等が挙げられる。また、ファレノプシス属とドリティス属の交配種を、ドリティノプシス属と称し交配親として用いている。

本発明において、胡蝶蘭の抽出物とは、胡蝶蘭の幼苗または成体の地上部、葉、茎、根等の植物体の一部または植物体全体（全草）、あるいはそれらの混合物の抽出物をいう。胡蝶蘭の抽出物は、成体の抽出物であってもよいが、幼苗の抽出物が好ましい。胡蝶蘭の幼苗には、実生苗、メリクロン苗、クロン苗があり、実生苗とは花同士を交配させ種を取って育てた苗、メリクロン苗は生長点由来の組織を取って培養し、増殖、育成させた苗、クロン苗は、生長点以外の組織を取って培養し、増殖、育成させた苗をいう。これらの幼苗育成工程は、一般に、フラスコやガラス瓶などの容器（本発明ではこれらをフラスコという）を用いて行うことが多い。育成した幼苗は、フラスコの外に出した後、幼苗として順化させる工程を経て（順化工程は省略することがある）、鉢上げし、さらに育成させて成体となり、花芽を形成するようになる。

本発明において抽出に用いる胡蝶蘭の幼苗は、上記の実生苗よりも、生長点由来の組織より作られるメリクロン苗、生長点以外の組織より作られるクロン苗であることが好ましい。また、胡蝶蘭の幼苗の葉の長径は、1ｍｍ〜１５ｃｍが好ましく、３ｍｍ〜１２ｃｍがより好ましく、１ｃｍ〜１０ｃｍが最も好ましい。また、葉の形成開始以後から上記の葉の長径に育つまでの植物体を用いることが好ましく、フラスコ内で生育している順化前の植物体のほうが、鉢上げ後のものよりも好ましい。

抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、または水と有機溶媒の混合溶媒を用い、攪拌またはカラム抽出する方法により行うことができる。有機溶媒としては、アルコール類、エーテル類、エステル類などを用いることができるが、エタノール、メタノール、アセトン、ｎ−プロパノール、ｔ−ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の水溶性有機溶媒が好ましく、これらの一種又は二種以上を用いてもよい。特に好ましい抽出溶媒としては、水、または水−エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば上記胡蝶蘭（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行なったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類によるが、例えば、１０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃で、３０分〜２４時間、好ましくは１〜１０時間を例示することができる。また、抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（有機溶媒、減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。

Wntとは、Wntシグナル経路に関与するタンパク質をいい、現在までに、ヒトのWntタンパク質は、１９種類同定されている（Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16）。Wntシグナル経路には、細胞表面のWnt受容体に結合することよってβ−カテニンの安定化を介して遺伝子発現を誘導するβ−カテニン経路、ＪＮＫやＲｈｏキナーゼを活性化するＰＣＰ経路、ＰＫＣなどを活性化するＣａ^２＋経路があるが、本発明におけるWntは、β−カテニン経路（以下、「Wnt/β−カテニンシグナル」と記載することもある）に関与するタンパク質をいう。よって、本発明のWnt発現抑制剤が作用するWntは、Wnt/β−カテニンシグナルに関与するWntをいい、例えば、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt10a、Wnt10b等が挙げられる。本発明において「Wntの発現抑制」とは、上記WntのmRNA発現及びタンパク質発現を抑制することをいう。

胡蝶蘭は、Wnt発現抑制により、メラニン合成を制御するWnt/β−カテニンシグナルの亢進を抑制することができるので、メラニン合成抑制剤としても使用することができる。

本発明のWnt発現抑制剤またはメラニン合成抑制剤は、そのまま使用することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに化粧品、医薬品、医薬部外品、飲食品などの組成物に配合することができる。なお、本発明の医薬品には、動物に用いる薬剤、即ち獣医薬も包含されるものとする。

本発明のWnt発現抑制剤またはメラニン合成抑制剤を化粧品や医薬部外品に配合する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、または水−油−粉末三層系等のいずれでもよい。また、当該化粧品や医薬部外品は、Wnt発現抑制剤またはメラニン合成抑制剤とともに、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。配合成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。

化粧品や医薬部外品の種類としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、洗顔料、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、ボディローション等が挙げられる。

本発明のWnt発現抑制剤またはメラニン合成抑制剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて、適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。本発明の医薬品を上記の各形態で提供する場合、通常当業者に用いられる製法、たとえば日本薬局方の製剤総則［２］製剤各条に示された製法等により製造することができる。

経口投与用製剤には、例えば、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、結晶セルロース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム、又はデキストリン等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、又はヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。

非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。

本発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、点眼剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などの非経口剤などが挙げられる。また、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよく、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。

本発明のWnt発現抑制剤またはメラニン合成抑制剤を、色素沈着を治療、改善、または予防するための医薬品として用いる場合に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤などが挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。

本発明のWnt発現抑制剤またはメラニン合成抑制剤は、有効成分である胡蝶蘭が、Wnt発現抑制によりWnt/β−カテニンシグナルの亢進を抑制することができるので、Wnt/β−カテニンシグナルの亢進に関連する疾患または病態の治療、改善、および予防に有効である。ここで、Wntシグナルの亢進に関連する疾患または病態としては、メラニン合成促進による色素沈着が認められる皮膚疾患（老人性色素斑、肝斑、雀卵斑、黒子症、脂漏性角化症、炎症性色素沈着、黒子（母斑細胞母斑、色素性母斑）、後天性真皮メラノサイトーシス（遅発性太田母斑）、扁平母斑、Riehl黒皮症、摩擦黒皮症、遺伝性対側性色素異常症、Addison病、光線性花弁状色素斑、色素異常性固定紅斑、日焼けなど）、癌（大腸癌、黒色腫、胃癌、肝細胞癌、前立腺癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮頚癌、卵巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、神経膠腫、グリア芽腫など）が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の医薬品は、上記疾患または病態の発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。本発明の医薬品の有効成分は、天然物由来であるため、非常に安全性が高く副作用がないため、前述の疾患の治療、改善、および予防用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的にまたは非経口的に投与することができる。

本発明の医薬品の投与量は、疾患の種類、投与対象の年齢、性別、体重、症状の程度などに応じて適宜決定することができる。例えば、成人に経口投与する場合には、一日の投与量は、胡蝶蘭の抽出物として０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇ、より好ましくは５〜３００ｍｇである。

胡蝶蘭の抽出物を上記の化粧品や医薬品に配合する場合、その含有量は特に限定されないが、製剤全重量に対して、胡蝶蘭の抽出物の乾燥固形分に換算して、０．００１〜３０重量％が好ましく、０．０１〜１０重量％がより好ましい。０．００１重量％以下では効果が低く、また３０重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくい。又、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。

また、本発明のWnt発現抑制剤またはメラニン合成抑制剤は、飲食品にも配合できる。本発明において、飲食品とは、一般的な飲食品のほか、医薬品以外で健康の維持や増進を目的として摂取できる食品、例えば、健康食品、機能性食品、保健機能食品、または特別用途食品を含む意味で用いられる。健康食品には、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等の名称で提供される食品を含む。保健機能食品は食品衛生法または食品増進法により定義され、特定の保健の効果や栄養成分の機能、疾病リスクの低減などを表示できる、特定保健用食品および栄養機能食品が含まれる。飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。

飲食品の種類としては、パン類、麺類、菓子類、乳製品、水産・畜産加工食品、油脂及び油脂加工食品、調味料、各種飲料（清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料など）および該飲料の濃縮原液及び調整用粉末等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、澱粉等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。

本発明の飲食品における胡蝶蘭の抽出物の配合量は、Wnt発現抑制作用を発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコストなどを考慮して適宜設定すればよい。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

[実施例１]
胡蝶蘭の抽出物を以下のとおり製造した。製造例１〜６において抽出材料として用いた胡蝶蘭幼苗（フラスコ苗）は、葉の長径が３〜８ｃｍの範囲であって、幼苗分化から花芽形成前のメリクロン苗をいう。

（製造例１） 胡蝶蘭幼苗の葉の５０％エタノール抽出物の調製
胡蝶蘭のフラスコ苗の葉の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液に室温で４日間浸漬した。得られた抽出液を濾過した後エバポレーターで濃縮乾固して胡蝶蘭の５０％エタノール抽出物を１．６ｇ得た。

（製造例２）胡蝶蘭幼苗の根の５０％エタノール抽出物の調製
胡蝶蘭のフラスコ苗の根の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液に室温で４日間浸漬した。得られた抽出液を濾過した後エバポレーターで濃縮乾固して胡蝶蘭の５０％エタノール抽出物を１．７ｇ得た。

（製造例３）胡蝶蘭幼苗全草の５０％エタノール抽出物の調製
胡蝶蘭のフラスコ苗全草の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液に室温で４日間浸漬した。得られた抽出液を濾過した後エバポレーターで濃縮乾固して胡蝶蘭の５０％エタノール抽出物を１．５ｇ得た。

（製造例４）胡蝶蘭幼苗全草の熱水抽出物の調製
胡蝶蘭のフラスコ苗全草の乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥して胡蝶蘭の熱水抽出物を２．３ｇ得た。

（製造例５）胡蝶蘭幼苗全草の１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）抽出物の調製
胡蝶蘭のフラスコ苗全草の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％(Ｖ／Ｖ)１，３−ＢＧ水溶液に室温で５日間浸漬した。得られた抽出液を濾過して胡蝶蘭の１，３−ＢＧ抽出物を１９０ｇ得た。

（製造例６）胡蝶蘭成体全草の５０％エタノール抽出物の調製
胡蝶蘭の成体全草の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液に室温で４日間浸漬した。得られた抽出液を濾過した後エバポレーターで濃縮乾固して胡蝶蘭の５０％エタノール抽出物を１．８ｇ得た。

[実施例２]
胡蝶蘭の抽出物の効果の評価実験を次のとおり行った。

（試験例１）Wnt1発現抑制効果の評価
20% ウシ胎児血清(FBS、ニチレイバイオ社製)を含有するDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM、Sigma-Aldrich社製)を用いて培養したヒト扁平上皮がん細胞HSC-1（Wnt1発現細胞、JCRB細胞バンク製）を、2%FBS含有DMEMに懸濁し、8ウェルカルチャースライドに1x10³個ずつ播種した。24時間培養後、胡蝶蘭抽出物(製造例１〜６)を最終濃度が0.01%になるように添加した2%FBS含有DMEMに交換し、さらに72時間培養した。細胞をPBS(-)にて2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で10分間インキュベーションして細胞を固定した。

細胞をPBS(-)にて2回洗浄し、2%ウシ血清アルブミン(BSA、和光純薬工業社製)含有PBS(-)に抗Wnt1抗体(Spring Bioscience社製)及び抗β-アクチン抗体を添加した一次抗体溶液を加え、37℃で1時間インキュベーションした。細胞をPBS(-)にて2回洗浄し、2%BSA含有PBS(-)にAlexa488標識抗ウサギIgG抗体及びAlexa594標識抗マウスIgG抗体を添加した二次抗体溶液を加え、37℃で1時間インキュベーションした。細胞をPBS(-)にて2回洗浄し、蛍光顕微鏡(Olympus社製)を用いて観察し、Wnt1の発現を緑色の蛍光として、β-アクチンの発現を赤色の蛍光として画像を撮影した。取得した画像について、市販の解析ソフトを用いて測定した蛍光強度を指標に各タンパク質の発現量を測定し、Wnt1の相対発現量(緑色の蛍光強度/赤色の蛍光強度)を算出した。試料を添加せずに培養した細胞におけるWnt1の相対発現量を100％とし、これに対し、試料を添加して培養した細胞におけるWnt1の相対発現量の値を算出し、評価した。結果を表１に示す。

表１に示すように、胡蝶蘭の抽出物（製造例１〜６）の全てに、顕著なWnt1発現抑制効果が認められた。以上より、胡蝶蘭の抽出物の極めて優れたWnt1発現抑制効果が明らかとなった。

（試験例２）メラニン合成抑制効果の評価
(1) セルカルチャーインサート内でのHSC-1の単独培養
24ウェルプレートの各ウェルに0.7mLの2%FBS含有DMEMを添加し、ポアサイズ0.4 μmのセルカルチャーインサートをその上からセットした。ヒト扁平上皮がん細胞HSC-1を、2%FBS含有DMEMに懸濁し、セルカルチャーインサートに4x10⁴個ずつ播種した。このとき、対照としてHSC-1を含まない2%FBS含有DMEMを添加したものも用意した。24時間後、培地を胡蝶蘭の抽出物(製造例１〜６)を最終濃度が0.01%になるように添加した2%FBS含有DMEMに交換し、さらに72時間培養した。

(2) 24 well plate内でのNHEMの単独培養
Medium254に1%となるようにhuman melanocyte growth supplement(Life Technologies社製)を添加した培地(Medium254+)にて培養した継代数1のヒト正常メラノサイト(NHEM、TOYOBO社製)を、Medium254+に懸濁し、24ウェルプレートに4x10⁴個ずつ播種し、72時間培養した。

(3) HSC-1とNHEMの共培養
(2)で用意したNHEMの培地を除き、新しいMedium254を各ウェルに0.7mLずつ添加した。(1)で用意したセルカルチャーインサート内の培地を除き、NHEMを培養した24ウェルプレートにセットし、新しい2%FBS含有DMEMを各セルカルチャーインサートに0.2mLずつ添加し、NHEMとHSC-1を72時間共培養した。

(4) メラニン合成関連遺伝子発現の確認
NHEMとHSC-1の共培養後、セルカルチャーインサートと培地を除き、NHEMをPBS(-)にて2回洗浄した後、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、メラニン合成関連遺伝子（Mitf、Dct、Tyr、Tyrp1）の発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。

Mitf用プライマーセット：
5'-GCAGTGGTTTGGGCTT-3' (配列番号１)
5'-AATTCTGCACCCGGGAATC-3' (配列番号２)
Dct用プライマーセット：
5'-GGAATGCTTTGGAAGGGTTTG-3' (配列番号３）
5'-AAAGCGTTTGTCCCGTTCAG-3' (配列番号４）
Tyr用プライマーセット：
5'-TGCGGTGGGAACAAGAAATC-3' (配列番号５）
5'-GAAGAATGATGCTGGGCTGAGT-3' (配列番号６）
Tyrp1用プライマーセット：
5'-CGAAACACAGTGGAAGGTTACAGT-3' (配列番号７）
5'-CTCCTCAGCCATTCATCAAAGACT-3' (配列番号８）
18srRNA(内部標準)用プライマーセット：
5'-CCGAGCCGCCTGGATAC-3' (配列番号９）
5'-CAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGA-3'(配列番号１０）

メラニン合成関連遺伝子発現抑制効果は、HSC-1と共培養していないNHEMにおけるMitf mRNA、Dct mRNA、Tyr mRNA、Tyrp1 mRNAの発現量を内部標準である18s ribosomal RNA（18srRNA）の発現量に対する割合として算出した遺伝子相対発現量(それぞれの遺伝子発現量/18srRNA遺伝子発現量)の値を100％とし、これに対し、胡蝶蘭の抽出物を添加または未添加の状態で培養したHSC-1と共培養したNHEMにおける各遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。これらの試験結果を以下の表２に示す。

表２に示すように、Wnt1発現細胞であるHSC-1との共培養によりNHEMのメラニン合成関連遺伝子の発現亢進が確認された。一方で、胡蝶蘭の抽出物(製造例１〜６)を添加した群においては、メラニン合成関連遺伝子の発現亢進が顕著に抑制された。以上より、胡蝶蘭の抽出物の極めて優れたメラニン合成関連遺伝子発現抑制効果を明らかにした。

[実施例３]製品の処方例
製造例１〜６で製造した胡蝶蘭の抽出物を配合した製品の処方例を以下に示す。以下の処方例において「胡蝶蘭の抽出物」は、製造例１〜６で製造した胡蝶蘭の抽出物のいずれかを意味する。

（処方例１）ローション
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ０．１
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 ０．１
１１．精製水 残量

成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解した後、両者を混合し濾過しローションを調製する。

（処方例２） クリーム
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ０．１
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水 残量

成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。次いで、油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例３）乳液
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ０．１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタン
モノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水 残量

成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４）ゲル剤
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ０．１
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．１
５．香料 適量
６．１，３−ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水 残量

成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例５）軟膏
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ２．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水 残量

成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化し、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例６）パック
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ０．１
２．ポリビニルアルコール １２．０
３．エタノール ５．０
４．１，３−ブチレングリコール ８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
６．パラオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
７．クエン酸 ０．１
８．クエン酸ナトリウム ０．３
９．香料 適量
１０．精製水 残量

成分１〜１０を均一に溶解し製品とする。

（処方例７）ファンデーション
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 １．０
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．パラオキシ安息香酸ブチル ０．１
１０．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１１．ベントナイト ０．５
１２．プロピレングリコール ４．０
１３．トリエタノールアミン １．１
１４．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１５．二酸化チタン ８．０
１６．タルク ４．０
１７．ベンガラ １．０
１８．黄酸化鉄 ２．０
１９．香料 適量
２０．精製水 残量

成分２〜９を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分２０に成分１０をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１１〜１４を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１５〜１８を加え、水相とする。水相を８０℃に昇温し、油相に水相を徐々に加え乳化する。その後、撹拌しながら冷却し、４５℃で成分１９を加え、３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例８）錠剤
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ５．０
２．乾燥コーンスターチ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０

成分１〜５を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分６を加えて混合し打錠し、錠剤（１錠３００ｍｇ）を得る。

（処方例９）飲料
処方 配合量(重量％）
１．胡蝶蘭の抽出物 ０．１
２．ステビア ０．０５
３．リンゴ酸 ５．０
４．香料 ０．１
５．精製水 残量

成分１〜４を成分５の一部の精製水に撹拌溶解する。次いで、成分５の残りの精製水を加えて混合し、９０℃に加熱して５０ｍＬのガラス瓶に充填する。

本発明は、Wnt/β−カテニンシグナルの亢進に関連する疾患や病態、例えば色素沈着などの予防、改善、または治療を目的とした医薬品、医薬部外品、化粧品の製造分野において利用できる。

Claims (7)

1. 胡蝶蘭のメリクロン苗の抽出物を有効成分として含有するWnt発現抑制剤。
2. Wntが、Wnt/β−カテニンシグナルに関与するWntである、請求項１に記載のWnt発現抑制剤。
3. 胡蝶蘭のメリクロン苗の抽出物を有効成分として含有するメラニン合成抑制剤。
4. 胡蝶蘭のメリクロン苗の抽出物を含むWnt発現抑制用化粧品。
5. 胡蝶蘭のメリクロン苗の抽出物を含むWnt発現抑制用医薬品または医薬部外品。
6. 皮膚外用製剤である、請求項５に記載のWnt発現抑制用医薬品または医薬部外品。
7. 胡蝶蘭のメリクロン苗の抽出物を含むWnt発現抑制用飲食品。