JP6334530B2 - 微細藻類により産生されるルテインに富む組成物を調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、微細藻類、より具体的にはクロレラ科（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆａｍｉｌｙ）の微細藻類により産生される、さらに具体的にはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）により産生される、ルテインに富む組成物を得る方法に関する。

最新技術の提示
カロチノイド類は、非常に多数の生体に存在する、幾らかオレンジ色または黄色の色素である。それらは脂溶性であり、一般に生物によって容易にシミュレートされ得る。

カロチノイド類はテルペノイド類の化学族に属し、脂肪族構造または脂環構造を有するイソプレン構造の重合から形成される。それらが脂質の代謝経路に似た代謝経路に従うことは、一般に認められている。

それらは全ての緑色植物および多くの菌類および細菌（シアノバクテリアを含む）ならびに全ての藻類により合成される。それらは、動物により食品で吸収される。

カロチノイド類は抗酸化性を有し、癌および他のヒト疾患の予防のために研究されてきた。

カロチノイド類は、食用の葉、花および果実に自然に存在し、花（たとえば、マリゴールド）、ベリーおよび根組織（たとえば、ニンジン）から容易に得られる。

カロチノイド類の代表例としては、α−カロチン、β−カロチンおよびリコピンなどがある。

β−カロチンおよびリコピンは、一般に遊離型の非結合形で存在し、植物細胞の葉緑体内に捕捉されている。

キサントフィル類は、酸素原子（アルコール、ケトン、エポキシ等々の官能基）の付加によって、カロチンから誘導される黄色い分子である。

キサントフィル類は、一定の黄色またはオレンジ色の果物および野菜、たとえばモモ、マンゴー、パパイヤ、プルーン、カボチャおよびオレンジ等に豊富に存在する。

それらは、植物細胞、特に、特定の黄色、オレンジ色または赤色の花の花弁における、また藻類、たとえば褐藻類（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）における、葉緑体または有色体にも存在し、そこでは葉緑素を隠している。

キサントフィル類は、とりわけ、目の健康に貢献する抗酸化剤である。

キサントフィル類の例としては、ルテイン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン等がある。

幾つかのキサントフィルは、一般にパルミチン酸やミリスチン酸等の酸のジエステルの形で、マリゴールド等の、植物の花に存在する。

概して、遊離型のカロチノイド類は、アルファルファ、ホウレン草や縮緬キャベツ、緑葉および緑色植物性物質ｇｒｅｅｎ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｍａｔｔｅｒ）等の、緑色植物の葉緑体にも存在する。

遊離型のカロチノイド類は、食品でまたは栄養補助食品として消費されるとき、より良く吸収される。

ルテインは、目の黄斑および網膜の中心部に高濃度で見られる、式４−［１８−（４−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチルシクロヘクス−１−エン−１−イル）−３，７，１２，１６−テトラメチルオクタデカ−１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７−ノナエン−１−イル］−３，５，５−トリメチルシクロヘクス−２−エン−１−オールのキサントフィル色素である。

それは、目の水晶体および網膜黄斑への損傷を予防するために紫外線波長を除去する上で重要な役割を果たす。

ルテインはさらに、ポリ不飽和脂肪酸に富む、網膜黄斑を、光誘発性フリーラジカルから保護することを可能にする抗酸化性を有する。

ルテインは、体で産生することができず、したがって食事で摂取しなければならない。

したがって、ルテインは、加齢に伴う黄斑変性（すなわちＡＲＭＤ）、白内障、および網膜色素変性に起因する視力喪失の予防および／または治療のための栄養補助食品に益々使用されるようになった。

最も一般的なルテインエキス源は、正確にはキンセンカであって、それは既知の最高レベルのルテインの１つを含み、かつ他のカロチノイドは低濃度だけ含有するという利点を有する。

結晶形のルテインは、オレオレジン（ルテイン７０％含有）を製造するために、キク科（ｆａｍｉｌｙ Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）のフレンチマリーゴールド（タゲテス・エレクタ（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ））の花から、溶媒で抽出することにより慣習的に得られる。

このオレオレジンは次いで、溶媒（ヘキサン、ペンタン、ジクロロメタン、エチルアルコール、メタノール）を用いるか、または１，２−プロピレングリコールおよびカリウム塩酸塩（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を使用するかのいずれかで、他の一連の抽出を実施することにより精製される。

この２段階方式の抽出は、たとえば、国際特許出願国際公開第２０１２／０６４１８６号パンフレットに記述されている。

これらの２つの方法は、有機抽出溶媒の９９％〜９９．９％が除去されている最終生成物をもたらす。

結晶性ルテインは、販売前にコーンオイルの懸濁液に組み入れることが可能である。

マリゴールド花弁から、脂肪酸エステルの形で、ルテインを精製する方法は、たとえば、米国特許第４０４８２０３号明細書、米国特許第５３８２７１４号明細書および米国特許第５６４８５６４号明細書による文献に教示されており、そこでは、乾燥マリゴールド花弁が炭化水素系溶媒で処理される。

緑色植物からのルテインの抽出に関しては、ルテインを遊離型で放出するために鹸化およびその後の溶解という追加的化学ステップを必要としないため、有利であろう。前記遊離型は、消費されるとより良く吸収されるため、望ましい。

しかし、ルテイン、さらにはカロチン類、および脂肪酸の、植物からの抽出および精製は、それらを、植物性物質中に存在する大量の他の化合物と分離するために、多くの高価な精製ステップおよび多くの時間を必要とするため、あまり経済的ではない。

さらに、マリゴールド花のルテイン含量は低いままである（０．３ｍｇ／乾燥物質ｇ）。

したがって、このカロチノイドの代替源として微細藻類を使用することに対する関心が高まっている。

たとえば、ミュリーロプシス属（Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、クロレラ・ゾフィンジエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、セネデスムス・アルメリエンシス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ）およびクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）タイプの微細藻類が、潜在的ルテイン源として既に提唱されている。

それにもかかわらず、記述されているルテイン生産性は、産業規模で採算の合うほど十分に高くない。

培養藻類細胞からルテインまたはルテイン富化組成物を得るために、多数の手順、たとえば、国際出願国際公開第８９／００６９１０号パンフレットの手順が、記述されてきた。

欧州特許第１８０８４８３号明細書で、より具体的に使用される方法は、細胞を濃縮するための遠心分離、沈降または真空下での濾過、および濃縮された細胞の乾燥からなる。

乾燥細胞バイオマスはその後、好ましくは真空下で、容器内に低温（たとえば、−２０℃以下）で貯蔵されるか、好ましくは、酸素を除去するために窒素をプラスチックバッグに導入して貯蔵される。

欧州特許第１８０８４８３号明細書はまた、回収された細胞懸濁液への酸化防止剤および乳化剤の添加も推奨している。

ルテインに富むバイオマスの回収に加えて、欧州特許第１８０８４８３号明細書は、バイオアベイラビリティーがより良好なルテインを有する可能性を記述している。好ましい方法は次に、ルテインまたはルテインに富む組成物を得るために、回収された細胞を破壊することおよびそれらを乾燥することを含む。

標準ビーズミルの使用が推奨され、その場合ルテインの酸化を防止するために、適切な酸化防止剤の存在下、バイオマスの懸濁物が水中懸濁状態で分解される。

乾燥後、「小サイズの粒子」タイプの粉末状生成物が得られる。このようにして得られた粉末を、次には人間の消費を目的とした食品用途、たとえば栄養補助食品等で直接使用することも、または他の成分との混合物、たとえば水産養殖における魚粉として、使用することもできる。

別の方法で、ルテインは、栄養補助食品または医薬製品に調合するために、無極性溶媒または超臨界溶媒を用いた抽出方法により濃縮することができる。

無極性溶媒または超臨界流体によるルテインの抽出は、特に植物分野で記述されてきた。

このように、米国特許第６１０６７２０号明細書には、たとえば、カロチノイドを、藻類から、ニンジンジュースからまたはトマトの皮から抽出する方法が記述されており、前記方法は、特に高圧および高温条件（４５０〜１２００ｂａｒおよび５０〜３００℃）のカラム内に、水で事前飽和した超臨界二酸化炭素流を含む。

米国特許第４６３２８３７号明細書には、ディル、タラゴンの葉およびミモザの花等の、料理用ハーブの新鮮な植物から、濃縮抽出物を製造する方法が記述されており、前記方法は、温度０〜４０℃および圧力８０〜２００ｂａｒの超臨界ＣＯ_２による抽出ならびに圧力２０〜６０ｂａｒおよび温度０〜２０℃のジエチルエーテルまたはペンタンによる抽出物の分離を含む。

米国特許第４４６６９２３号明細書は、温度６０〜８０℃および圧力７００〜１２００ｂａｒを同時に加えることによる、マメ科植物種子から、胚芽からおよび動物の肉からの、脂質の超臨界ＣＯ_２抽出を記述している。

米国特許第５１２０５５８号明細書は、その立場で、セージ、バニラ、コショウ、セロリ、ショウガまたはシナモン等の香辛料からの抽出方法を記述しており、前記方法は、４００〜６００ｂａｒおよび温度８０〜１２０℃で、４つの抽出タンクを用いて連続的に実行される超臨界ＣＯ_２、および香辛料からの分画を、オレオレジンを得るために使用する。

このように、これらの方法は全て、高等植物のために使用されており、それらの中で、概して微細藻類、特にクロレラからのルテインの抽出方法等の可能な外挿を示唆するものは皆無である。

さらに、これらの方法が、高圧および高温の動作条件を満たすか、または別の無極性有機溶媒と組み合わせるかのいずれかによって、超臨界流体の溶解力を向上させる必要があることによる欠点に悩まされることは明らかに明白である。

その結果として、本発明の根本的な問題は、微細藻類により産生されるルテインに富む組成物を得るための代替方法を提供することである。

本発明の主題は、微細藻類、より具体的にはクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類により産生される、さらに具体的にはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）により産生される、ルテインに富む組成物を調製する方法であり、
１）微細藻類のバイオマスから細胞可溶化物を調製すること、
２）ルテインおよび脂質を含有するオレオレジンを最初のバイオマスから得るために、溶解した微細藻類のバイオマスを極性溶媒で処理すること、
３）主としてトリグリセリド類からなる、無極性脂質に富む画分およびルテインに富む不溶性画分を得るために、ステップ２）で得られるオレオレジンを、超臨界圧の流体の形の無極性溶媒を用いて抽出すること、
４）このようなルテイン富化画分を回収すること、
を含むことを特徴とする。

幾つかの実施形態では、ステップ２）の極性溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブタノールまたはイソブタノール等のアルコール類、酢酸エチル、酢酸プロピルまたは酢酸ブチル等のエステル類、ならびにアセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトン等のケトン類からなる群から、単独でまたは組み合わせて、選択され、好ましくは酢酸エチルである。

別の実施形態では、本発明による方法は、超臨界圧の流体の形の無極性溶媒が、１０〜５０ＭＰａ、より優先的には２５〜４０ＭＰａの圧力に、また３５〜９０℃、優先的には４０〜７０℃の温度になることを特徴とする。好ましくは、無極性溶媒は二酸化炭素である。

ステップ１）で、細胞可溶化物は、重量基準で１０％〜１５％の範囲の乾燥物質含量を有するクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類のバイオマスを粉砕することにより得られる。ステップ２）を実施する前に、ステップ１）で得られる細胞可溶化物を、乾燥物質含量が重量基準で１５％超まで、好ましくは重量基準で２０％〜３０％の範囲まで、濃縮することができる。

幾つかの実施形態では、本方法のステップ２）は、細胞可溶化物を極性溶媒で、好ましくは酢酸エチルで、抽出するステップ、および得られる有機相から極性溶媒を除去するステップを含む。溶媒の除去は、真空下または減圧で、蒸発により実施することができる。

本発明による方法を用いて得られるルテイン富化組成物および医薬組成物、栄養補助食品または食品を調製するための、前記ルテイン富化組成物の使用もまた、本発明の主題である。

最後に、本発明による追加的主題は、栄養補助食品、食品および医薬組成物から選択される、ルテインを含む組成物を調製する方法であって、前記方法は：
ａ）本発明による方法を実施することにより、微細藻類のバイオマスから、ルテイン富化画分を調製すること、および
ｂ）ステップａ）で得られるルテイン富化画分から、前記組成物を得ること
を含む。

バイオマスの粉砕前（ダークグレイの図表）および粉砕後（ライトグレイの図表）の、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の総カロチノイド（カロチンおよびルテイン）のアッセイを示す。結果は、バイオマスの乾燥重量と比較して、ルテインまたはカロチンの質量百分率として表される。本方法のステップ２）を実施するために、様々な抽出溶媒をテストした。 様々な溶媒による細胞可溶化物の抽出により得られた、ルテイン（ライトグレイの図表）およびカロチン（ダークグレイの図表）の抽出結果を表す。左から右へ：酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサンおよびシクロヘキサノン。収率を、ルテインまたはカロチンの質量百分率として表す。 細胞可溶化物の乾燥物質が、ステップ２）で得られるカロチン（ダークグレイの図表）およびルテイン（ライトグレイの図表）抽出収率に及ぼす影響を図示する。左から右へ：乾燥物質２４％を含有する濃縮クロレラ細胞可溶化物（クロレラＤＭ：２４％）、乾燥物質１１％を含有する濃縮クロレラ細胞可溶化物（クロレラＤＭ：１１％）および未粉砕未溶解バイオマス（対照）。 出発バイオマス中（ライトグレイの図表）およびこれらのバイオマスから得たオレオレジン中（ダークグレイの図表）のルテイン含量（乾燥重量と比較した質量％）を表す。左から右へ：粉砕して遠心分離したクロレラバイオマス（乾燥物質（ＤＭ）２４％を含有する濃縮細胞可溶化物）、未遠心分離の、粉砕したクロレラバイオマス（乾燥物質１１％を含有する細胞可溶化物）、未溶解クロレラバイオマス（対照）。

微細藻類、より具体的にはクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類により産生される、さらに具体的にはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）により産生される、ルテインに富む組成物を得るための、より有効な方法を開発することを切望して、出願人企業は、ルテインの富化を保証するために、独自の調査研究を発展させ、超臨界流体抽出テクノロジーの改変に成功した。

本発明はしたがって、微細藻類、より具体的にはクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類により産生される、さらに具体的にはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）により産生される、ルテインに富む組成物を調製する方法に関し、以下の一連のステップ：
１）微細藻類のバイオマスから細胞可溶化物を調製するステップ、
２）ルテインおよび脂質を含有するオレオレジンを最初のバイオマスから得るために、溶解した微細藻類のバイオマスを極性溶媒で処理するステップ、
３）主としてトリグリセリド類からなる、無極性脂質に富む画分およびルテインに富む不溶性画分を得るために、ステップ２）で得られるオレオレジンを、無極性溶媒、この場合、超臨界圧の流体を用いて抽出するステップ、
４）このようなルテイン富化画分を回収するステップ、
を含むことを特徴とする。

微生物は、優先的にクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科に属する微細藻類であり、より優先的にクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）である。

本発明による方法の第１ステップはしたがって、微細藻類のバイオマス細胞可溶化物の調製にある。

高濃度の二酸化炭素を注入することが可能な、閉じた、一般に管状の、光バイオリアクタ内で、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類、より具体的にはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）を、慣例的に培養する方法は知られている。

独立栄養条件でこれらを培養することにより、慣例的に、約５０〜８０ｇ／ｌのクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）微細藻類の濃度を得ることが可能になる。

次いで、遠心分離等の、当業者に周知の任意の方法で、バイオマスの回収および濃縮が実施される。

本発明との関連において、このようにして回収され、その後濃縮される微細藻類のバイオマスは、１０％〜１５％の乾燥物質含量、好ましくは約１１％の乾燥物質含量を有することができる。

カロチノイドを含む、対象の分子を抽出するために、細胞粉砕ステップ（すなわち、細胞可溶化物を調製するステップ）は多くの場合不可欠である。

非変性条件下で対象の分子を抽出するために、多分、低温条件下、不活性雰囲気かつ暗所で、細胞粉砕を実施することが好ましい。

高温および光は実際に、分子の酸化を開始することができる。

したがって、本発明による方法の幾つかの実施形態では、ステップ１は、粉砕によって微細藻類のバイオマスから細胞可溶化物を調製することを含む。好ましくは、微細藻類のバイオマスは、その総重量に関して、重量基準で１０％〜１５％の範囲の乾燥物質含量を有する。別の好ましい実施形態では、低温条件下、暗所かつ不活性雰囲気で、粉砕ステップが実施される。

以下で例示する通り、出願人企業は、再循環またはパスモードで、ビーズミルテクノロジーを使用することを推奨する。しかし、対象の分子抽出収率を高めるために、濃縮微細藻類のバイオマスを粉砕することが想定され、粉砕は溶媒相で実施することが可能である。

粉砕の有効性を光学顕微鏡（倍率×４０）でモニターし、もはや完全な細胞が顕微鏡の視野に１つも見えないとき、溶解は完全である。

以下で例示する通り、この粉砕ステップは、せいぜい総カロチノイドの１０％を損失するに過ぎない。

本発明による方法の第２ステップは、最初のバイオマスからルテインおよび脂質を含有するオレオレジンを得るために、溶解した微細藻類のバイオマスを極性溶媒で処理することにある。

用語「極性溶媒」は、非ゼロ双極子モーメントを有するあらゆる溶媒を意味するものとする。

極性溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、ブタノールおよびイソブタノール、酢酸エチル、酢酸プロピルまたは酢酸ブチル等のエステル類、ならびにアセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトン等のケトン類からなる群から、単独でまたは組み合わせて、選択され、好ましくはエステルであり、さらに好ましくは酢酸エチルである。

酢酸エチルは、以下で例示する通り、テストした全ての溶媒の中で最も有効であることが分かり、さらに相対的に猛毒性ではないため、出願人企業は、酢酸エチルを抽出溶媒として使用することを推奨する。

抽出溶媒は、好ましくは蒸発により、たとえば真空下または減圧で、オレオレジンが得られる方法を用いて、有機画分から除去することができる。

やはり以下で例示する通り、酢酸エチルによる反復抽出は、本発明による方法の前ステップで調製された、乾燥物質１１％を含有するクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）バイオマスを完全消耗することにより、ルテインを５〜１０倍濃縮して約７０％という抽出収率を達成することが可能になる。

このように、本発明による方法の幾つかの実施形態では、ステップ２は、極性溶媒、好ましくは酢酸エチルで細胞可溶化物を抽出する、少なくとも１つのステップを含み、前記抽出ステップは、繰り返すことが可能である。抽出ステップは、ステップ１で得られる細胞可溶化物に当初存在していたルテインの重量と比較して、ルテイン収率が重量基準で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに少なくとも６５％になるまで繰り返すことができる。したがって、抽出ステップは、２〜８回、一般に５回、繰り返すことができる。

各抽出ステップにおける極性溶媒／細胞可溶化物の体積比は、１：３〜３：１の範囲であってもよい。たとえば、ほぼ１：１の体積比を使用することができる。

有機画分（上澄）を合併し、好ましくは真空下または圧力下で、蒸発により、極性溶媒を、少なくとも部分的に、除去することができ、結果としてオレオレジンが得られる。

水が制限因子であるため、出願人企業はまた、極性溶媒で抽出を実施する前に、任意選択的に、細胞可溶化物を濃縮する（たとえば遠心分離による）ステップを追加することも推奨する。これは、これによって、総体的抽出収率を少なくとも１０％、高めることが可能になるためである。抽出は、乾燥マトリックスを使用することも想定できる。

乾燥物質２４％を含有する溶解バイオマスの濃縮はこのように、抽出収率８０％の取得を可能にする。

このように、本発明による方法の幾つかの実施形態では、オレオレジンを調製するステップ２が実施される前に、ステップ１で得られる細胞可溶化物が、好ましくは重量基準で１５％超、好ましくは重量基準で２０％〜３０％の範囲の乾燥物質含量まで濃縮される。一般に、細胞可溶化物は、ほぼ２２％〜２６％、たとえば２４％の乾燥物質含量まで、濃縮することができる。この濃縮ステップは、遠心分離で実施することができる。

本発明による方法の第３ステップは、主としてトリグリセリド類からなる、無極性脂質に富む画分およびルテインに富む不溶性画分を得るために、ステップ２）で得られるオレオレジンを無極性溶媒で、この場合、超臨界圧の流体で、抽出することにある。

ルテインに富む不溶性画分、言い換えればルテインに富む組成物は、超臨界圧の流体により同伴されなかったオレオレジンの画分に相当する。

主としてトリグリセリド類からなる、無極性脂質に富む画分は、超臨界圧の無極性溶媒により同伴される画分に相当し、したがって、使用される温度条件および圧力条件で、前記溶媒に溶解できる。

本方法の第３ステップは無極性脂質の選択的抽出を可能にし、次いで抽出物は溶媒の蒸発（凝縮されてリサイクルされる）によって分画され、主としてトリグリセリドからなる、無極性脂質に富む、ペースト（一般に「コンクリート」と呼ばれる）が回収される；超臨界圧の流体に不溶性の残留物は、ルテインに富み、したがって、この残留物中に残分として存在する超臨界圧の流体を除去した後、最初のバイオマスと比較して、高濃縮であり高収率で回収される。

超臨界状態、すなわち、純物質の場合、臨界圧および臨界温度よりそれぞれ高い圧力と温度の両者か、または混合物の場合、図表上に示された臨界点（圧力、温度）の包絡線外に位置する代表点（圧力、温度）のいずれかを特徴とする状態の流体は、非常に多くの物質について、圧縮ガス状態で、この同一流体で観察されるものと比較できない高い溶解力を示すことは知られている；「亜臨界」液体すなわち、純物質の場合には、臨界圧より大きい圧力、および臨界温度より低い温度の両方か、または混合物の場合、成分の臨界圧より大きい圧力および臨界温度より低い温度を特徴とする状態の液体にも同じことが当てはまる。

言語的便宜のため、慣行的に、用語「圧縮流体」は、大気圧より実質的に大きい圧力に達した流体に使用され；用語「超臨界圧の流体」は、その臨界圧より大きい圧力に達した流体、すなわち、実際の超臨界流体か、または上で定義された「亜臨界」と呼ばれる液体のいずれかに使用され；同様に、用語「液化ガス」は、大気圧および周囲温度で気体状態である化合物からなり、それぞれ、その臨界圧およびその臨界温度より低い圧力および温度に達した、液体に使用されることを意味する。

超臨界圧における流体の溶解力の、顕著かつ調整可能な変化は、（固体／液体）抽出、（液体／流体）分画、分析クロマトグラフィまたは分取クロマトグラフィ、材料（セラミックス、ポリマー、等々）の処理の、多くの方法で使用され；化学反応および生化学反応も、そのような溶媒中で実施される。

注目すべきは、二酸化炭素の物理化学的特性およびまたその臨界座標（臨界圧：７．４ＭＰａおよび臨界温度：３１℃）のために、二酸化炭素が多くの用途で好ましい溶媒となることであり、特に、これは、二酸化炭素は少しも毒性を示さず非常に安く大量に入手できるためである；超臨界圧に達した、二酸化炭素は、無極性溶媒であり、特に、一定の極性を有する分子に関して、溶解力を顕著に変化させるであろう極性有機溶媒からなる共溶媒に加える場合もあるが、この目的のためにエタノールがしばしば使用される。

しかし、一部の化合物は、超臨界圧で、２〜５個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子を有する軽質炭化水素で、より好ましくは抽出される。

当業者に知られている通り、超臨界圧の流体による抽出は、多くの用途で益々使用される、非常に高品質の抽出物を生成する。

超臨界圧の流体を使用する方法の主な利点の１つは、溶媒（流体）を抽出物および固体と容易に分離できることにある。

超臨界流体の他の重要な利点の１つは、混合物の成分に関して、それらの「適合可能な」選択性にある。この非常に高い選択性は、超臨界流体の特定の性質、特に超臨界圧における二酸化炭素の性質と関連しており：溶解力は、流体の圧力と温度を調節することによって精密に調節することができ；溶媒は、選択性が高いほど、その溶解力は低いため、「穏和な」条件が最も選択的であることが分かっている。

このように、本発明による方法の幾つかの実施形態において、ステップ３）では、超臨界圧で流体の形の無極性溶媒は、１０〜５０ＭＰａ、より優先的には２５〜４０ＭＰａの圧力、および３５〜９０℃、より優先的には４０〜７０℃の温度になる。別の実施形態において、ステップ３）で、超臨界圧で流体の形の無極性溶媒は二酸化炭素である。

ステップ３）を実施する間、出願人企業は、溶解力を高めるであろう共溶媒が添加された二酸化炭素ではなく、好ましくは純粋な二酸化炭素を使用して、１０〜５０ＭＰａ、より優先的には２５〜４０ＭＰａの操作圧力、および、３５〜９０℃、より優先的には４０〜７０℃の温度を選択する。

例として、ステップ３）は、圧力２５〜３０ＭＰａ、一般にほぼ２８ＭＰａ、および温度４０℃〜５０℃、一般にほぼ４５℃のＣＯ_２を使用して、実施することができる。

このように、出願人企業は、このようにして未抽出の抽残液中で高度に濃縮されているであろうルテインを抽出せずに、本発明による方法のステップ３の間に得たコンクリートから、トリグリセリドタイプの、無極性脂質を、選択的に抽出することが可能なことが分かった。

１つの特定の実施形態では、本発明による方法は、下記の特徴の１つまたは複数（１、２、３、４、５または６）を含む：
− 微細藻類はクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属のもの、より具体的にはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）種のものであり、かつ／または
− ステップ１）は、重量基準で１０％〜１５％の範囲、一般にほぼ１１％の乾燥物質含量を有する微細藻類のバイオマスから、粉砕によって細胞可溶化物を調製することを含み、かつ／または
− ステップ１で得られる細胞可溶化物は、重量基準で１５％超、好ましくは２０％〜３０％の範囲の乾燥物質含量を有するために濃縮され、かつ／または
− 極性溶媒、好ましくは酢酸エチルで細胞可溶化物を抽出する少なくとも１つのステップ、およびオレオレジンを得るために得られた有機相から極性溶媒を除去することを含むステップ２）、および／または
− ステップ２）で、細胞可溶化物中に最初に含まれていたルテインの重量と比較して、重量基準で少なくとも５０％のルテイン抽出収率が得られるまで抽出ステップが繰り返され、かつ／または
− ステップ３）では、ステップ２）で得たオレオレジンが、超臨界圧、好ましくは圧力１０〜５０ＭＰａ、より好ましくは２５〜４０ＭＰａ、および温度３５〜９０℃、好ましくは４０℃〜７０℃のＣＯ_２で抽出される。

本発明による方法が、前述したものに加えて１つまたは複数のステップ、たとえば、ステップ４）で得られるルテイン富化組成物を包装するステップを含んでもよいことは言うまでもない。

本発明による方法を用いて得られるルテイン富化組成物もまた、本発明の主題である。

本発明による追加的主題は、栄養補助食品または医薬組成物を調製するための、本発明によるルテイン富化組成物の使用である。本発明による栄養補助食品および医薬組成物は、人間用であっても動物用であってもよい。

栄養補助食品および医薬組成物から選択される、ルテインを含む組成物を調製する方法も、本発明の主題であり、前記方法は：
ａ）本発明による方法を実施することにより、微細藻類のバイオマスから、ルテイン富化画分を調製すること、および
ｂ）ステップａ）で得られるルテイン富化画分から、前記組成物を得ること、
を含む。

ステップｂ）は、所望の栄養補助食品または所望の医薬組成物を得るために、ルテイン富化画分を、食品および／または薬学的見地から許容できる１つまたは複数の賦形剤または担体と混合することを一般に含む。栄養補助食品または医薬組成物は、粉末、錠剤、懸濁液、シロップあるいは経口液剤の形であってもよい。

ルテイン富化画分はまた、人間または動物に食物を与えることを目的とする食品の調製にも使用できる。食品を調製する方法も本発明の主題であり、前記方法は：
ａ）本発明による方法を実施することにより、微細藻類のバイオマスから、ルテイン富化画分を調製すること、および
ｂ）ステップａ）で得られるルテイン富化画分から、前記食品を得ること、
を含む。

ステップｂ）は一般に、ルテイン富化組成物を１つまたは複数の食品成分と混合すること、および調理ステップまたは冷却ステップ等のステップも含む。

本発明は、例示目的であって非限定的である、下記の実施例によってより明瞭に理解されるであろう。

実施例１：クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）バイオマスからのルテイン濃縮オレオレジンの調製
＃ステップ１：乾燥物質含量１１％〜１２％のクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）バイオマスの調製
光バイオリアクタで従来の発酵を使用すれば、発酵の最後に、微細藻類濃度約７８ｇ／ｌを有するバイオマスを得ることは容易である。前記バイオマスを次に、ウェストファリア（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）モデルＮＡ７遠心分離機で、遠心分離により濃縮する。バイオマスは、このようにしてほぼ１２０ｇ／ｌに濃縮される。

＃ステップ２：細胞粉砕
このように培養してその後ステップ１の動作条件に従って濃縮した微細藻類のバイオマスを、次にはネッツ・ラブスタ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｌａｂｓｔａｒ）撹拌機ビーズミルシステムを使用して処理する。

ステップ１の間に回収された、乾燥物質１２％を含有するバイオマス６リットルを、再循環モードで処理した。

したがって、生成物は、Ｚｅｔａビーズタイプ（Ｎｅｔｚｓｃｈ）粒径６００μｍのセラミックビーズで８５％満たされた、０．５４リットル粉砕チャンバを繰り返し通過する。これらのビーズを周速１２ｍ／秒で撹拌し、これによって実質的に全ての微細藻類の細胞を２時間で粉砕することが可能になる。細胞が顕微鏡の視野に見えなくなるまで、粉砕の品質を顕微鏡観察でモニターする。

生成物の温度上昇を制限するために、粉砕チャンバは、低温条件の維持を可能にするジャケットを有する。ミル供給タンクはまた、ＪｕｌａｂｏタイプＦ３２低温槽によって供給される４℃の冷水の再循環により冷却される。

この細胞粉砕ステップ中に得た総カロチノイドのアッセイ結果を図１に示す。図１は、粉砕前後の、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の総カロチノイド（カロチンおよびルテイン）のアッセイを示す（乾燥重量と比較した、質量％）。細胞粉砕は、合理的な１０％ルテイン損失および２０％カロチン損失を生じる。

＃ステップ３：溶媒による抽出
下記ステップ２で得られる粉砕した微細藻類材料を、次には様々な極性の溶媒、たとえば酢酸エチル、酢酸プロピルおよび酢酸ブチルを含む、エステル類、シクロヘキサノン等のケトン類およびヘキサン等の無極性溶媒等で希釈する。１：１（Ｖバイオマス／Ｖ溶媒）体積比で、各溶媒を単独でテストした。

その後、暗所および周囲温度で１時間、撹拌しながら抽出を実施し、操作は全てポリプロピレン管内で実施する。

１時間の接触後、混合物を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６４Ｒ遠心分離機で、２００００ｇにて１５分間遠心分離することにより分離する。単回抽出後に、テストした各溶媒の上澄にカロチノイドアッセイを実施した。

抽出収率結果を図２に示す。

図２は、様々な溶媒の、総カロチノイド（ルテインおよびカロチン）抽出収率を示す：酢酸エチル（純度＞９９．５％）、酢酸プロピル（純度＞９９．５％）、ヘキサン（純度＞９５％）およびシクロヘキサン（純度＞９５％）。Ｙ−軸：抽出パーセンテージ。

酢酸エチル、酢酸プロピルおよびシクロヘキサノンで、最上のルテイン抽出が得られる。単回抽出で実施されるこれらのテストは、ほぼ４０％のルテイン回収を可能にする。

酢酸プロピルとは違って、シクロヘキサノンおよび酢酸エチルは、カロチンに関して非常に良好な抽出収率を有する。

このスクリーニングはまた、エステルの脂肪族鎖が長いほど、ルテイン抽出収率は低下する傾向があることも示す；したがって、この結果は使用される溶媒の特徴に一致する。

酢酸エチルとシクロヘキサノンは非常に類似した抽出収率を示すものの、酢酸エチルはシクロヘキサノンとちょうど同じぐらい効率的であるが、特に低毒性であるため、好ましい。

＃ステップ４：粉砕した細胞材料の濃縮
ステップ２で得られる粉砕した細胞材料の一部を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｊ２０ＸＰローターＪＬＡで、６０００ｇにて３分間の遠心分離により濃縮する。

異なる３試料：
− 粉砕し、その後遠心分離で濃縮したバイオマス（乾燥物質２４％）、
− 粉砕し、濃縮していないバイオマス（乾燥物質１１％）、
− 粉砕せず、濃縮していない対照（乾燥物質１１％）、
で、オレオレジンの調製を実施した。

＃ステップ５：オレオレジンの調製−完全消耗による酢酸エチルでの抽出
体積比１：１の粉砕バイオマスと酢酸エチル（最小純度９９．８％）を、化学製品に強い１リットルポリプロピレン製フラスコ内で混合する。

次いでこの混合物を、暗所にて周囲温度で撹拌する。１時間の接触後、混合物を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｊ２０ＸＰローターＪＬＡで、１２２２７ｇにて１５分間の遠心分離により分離する。

このようにして得た上澄（ほぼ０．４リットル）を、暗所のフラスコに取っておく。ペレットに関しては、再度、溶媒で処理する。摂取量は、前に分取した量と同じである。

同じバイオマスペレットに対して、この操作を５回実施する。暗所のまま、このようにして得られた５つの上澄を、次には、分析する１画分（Ｆ）に合併する。

図３は、ステップ４で調製されたバイオマスの完全消耗により、抽出中に得られた３画分の、すなわち、粉砕バイオマス（乾燥物質含量（ＤＭ）２４％および１１％を有する）および非粉砕バイオマスの、酢酸エチルを使用したルテインおよびカロチン抽出収率を示す。

ＤＭ ２４％を含有するバイオマスのサンプルでは、最良抽出収率は、ルテイン回収８０％およびカロチノイド回収９０％に達する。

１回抽出後、ルテイン（１、３）は既に４０％回収されるが、５連続抽出後、収率は７０％に達する。

このグラフは、濃縮バイオマス（ＤＭ ２４％）では、初期バイオマス（ＤＭ １１％）よりも、収率が１０％高いことも示す。したがって、反応収率は水の存在によって制限される。

未粉砕対照ではルテインおよびカロチンが全くないことは、対象の分子の回収に関して、細胞溶解が重要なことを示す。

＃ステップ６：オレオレジンの調製−総カロチノイドの濃縮
次いで、真空下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−２１５タイプの、Ｂｕｃｈｉ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄロータリー・エバポレーターに接続された、２リットルの褐色丸底フラスコに、ステップ５で調製される様々な画分Ｆを移す。

次いで、２００ｍｂａｒの真空および５０℃で、溶媒の蒸発を２時間実施する。

得られた様々な結果を、バイオマス中およびオレオレジン中のルテイン含量（乾燥重量と比較した質量％）を示す図４にまとめる。

オレオレジン最終乾燥物質含量は６５％〜８０％であり、ルテインの量は、乾燥オレオレジン１００ｇに対して約２〜３ｇの範囲である。

ＤＭ ２４％を含有する濃縮した粉砕クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）材料からのオレオレジンの抽出により、ルテインの７倍濃縮が可能である。

実施例２：超臨界流体による、ルテインに富むオレオレジンの抽出
ステップ１：細胞可溶化物の調製
バイオマスは、実施例１の条件に従って溶解したクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の懸濁水の形である。乾燥物質含量の測定および色素の定量分析を下表１に示す。

ステップ２：オレオレジンの取得
ルテイン３６８ｍｇを含む、総カロチノイド１２６０ｍｇを含有するバイオマス１０５０ｇと、酢酸エチル５００ｇの割合で、溶解したバイオマスと酢酸エチルとを、３リットルフラスコ内で、メカニカルスターラーで２時間撹拌しながら混合する。このようにして得た混合物を、遠心分離によりデカントする：上澄を回収し、ペレットを第２回抽出にかける。

この第２回抽出は、再度酢酸エチル５００ｇを使用して前述と同一条件で実施する。得られた混合物を遠心分離でデカントする：上澄を回収し、第２回抽出と同一条件でペレットを第３回抽出にかける。

５抽出操作が実施されるまで続け、酢酸エチル２５００ｇが使用された。

このようして回収した上澄を併せて１つの溶液とし、次いで真空下、ロータリー・エバポレーターで蒸発させ、その結果として、一方では溶媒が回収され、他方ではオレオレジンが回収される。

このようにして得たオレオレジンの質量は１１．９５ｇであり、ルテイン３１０ｍｇを含む、総カロチノイド５５０ｍｇを含有する。

ステップ３：超臨界流体による抽出
前ステップ中に得たオレオレジンを、２つの焼結金属フィルタで閉じられる円筒バスケットに入れ、それ自体を高圧容器に入れ、液体ＣＯ_２が流量３ｋｇ／時間で給送されるポンプに接続し、したがって２８ＭＰａで圧縮された流体を次には４５℃に加熱し、オレオレジンが充填されたバスケットが入っている高圧容器に導入する。

溶質が充填された後、高圧容器を出る流体の圧力は、オレオレジンと接触すると、４５℃に維持された２つの低気圧セパレータ内で５ＭＰａに低下される：溶質は分離されてセパレータ内に回収され、ＣＯ_２は大気中に排出される。

２時間の抽出後、高圧容器を減圧し、開口してバスケットを回収する。バスケットに入っていた残留物はルテイン２１８ｍｇを含有する、質量１．７５ｇを有する乾燥粉末状である、すなわち、残留物の総重量と比べて１２％というルテインの質量含量を有する。

Claims (10)

1. 微細藻類により産生される、ルテインに富む組成物を調製する方法において、
   １）前記微細藻類のバイオマスから細胞可溶化物を調製すること、
   ２）ルテインおよび脂質を含有するオレオレジンを最初のバイオマスから得るために、溶解した前記微細藻類のバイオマスを極性溶媒で処理すること、
   ３）ステップ２）で得られるオレオレジンを、超臨界圧で流体の形の無極性溶媒を用いて抽出することにより、超臨界圧の無極性溶媒により同伴される画分として、主としてトリグリセリド類から成る無極性脂質に富む画分を得ること、および超臨界圧の無極性溶媒により同伴されなかったオレオレジンの画分として、ルテインに富む不溶性画分を得ること、ならびに、
   ４）このようなルテイン富化画分を回収すること、
   を含み、
   ステップ２）の極性溶媒が、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルおよびシクロヘキサノンからなる群から、単独でまたは組み合わせて、選択され、
   ステップ３）において、超臨界圧で流体の形の無極性溶媒は、２５〜４０ＭＰａの圧力および４０〜７０℃の温度になることを特徴とする方法。
2. ステップ２）の極性溶媒が酢酸エチルである、請求項１に記載の方法。
3. 臨界圧で流体の形の前記無極性溶媒が二酸化炭素であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. ステップ１）で、前記細胞可溶化物が、重量基準で１０％〜１５％の範囲の乾燥物質含量を有するクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類のバイオマスを粉砕することにより得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類は、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. ステップ２）が実施される前に、ステップ１）で得られる前記細胞可溶化物が、重量基準で１５％超の乾燥物質含量まで濃縮される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ステップ２）が、極性溶媒で、前記細胞可溶化物を抽出する少なくとも１つのステップ、および得られた有機相から前記極性溶媒を除去することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ステップ１）で得られる前記細胞可溶化物が、重量基準で２０％〜３０％の範囲の乾燥物質含量まで濃縮される、請求項６または７に記載の方法。
9. 医薬組成物、栄養補助食品または食品を調製するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られるルテイン富化組成物の使用。
10. 栄養補助食品、食品および医薬組成物から選択される、ルテインを含む組成物を調製する方法であって、
    ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施することにより、微細藻類のバイオマスから、ルテイン富化画分を調製すること、および
    ｂ）ステップａ）で得られるルテイン富化画分から、前記組成物を得ること、
    を含む、方法。

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