JP6359372B2 - ＤＡＲＰｉｎを含む二重特異キメラ蛋白質 - Google Patents

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ＤＡＲＰｉｎ（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む二重特異キメラ蛋白質（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、前記二重特異キメラ蛋白質を含む医薬組成物、前記二重特異キメラ蛋白質を製造する方法、およびＤＡＲＰｉｎを用いる抗体の副作用低減および／または効能増進方法が提供される。

細胞内では多様な蛋白質が互いに相互作用して疾病を誘発させる様々な機序に関与している。これら蛋白質のうちの２つ以上を同時に阻害すると、１つの蛋白質を阻害する場合と比較して、上昇した疾病治療効果が得られるだけでなく、それぞれの阻害薬物に対する耐性の克服の可能性も高まる。このような理由から、様々な蛋白質を阻害可能な多様な二重特異キメラ蛋白質が開発されている。

多くの二重特異キメラ蛋白質が開発されてはいるものの、臨床試験でその効能が立証されなかったり、様々な副作用が観察され、抗体治療剤として商用化されずにいる。このように抗体が商用化されない最も大きな理由の１つは、抗体の安定性および生産性が低いことにある。ＩｇＧ形態を有する初期の二重抗体は、生産過程で抗体の軽鎖および重鎖のランダムな組み合わせが行われるにつれ、所望の１種類の二重抗体を分離、精製することが非常に難しいことから、大量生産の問題がある。また、ＩｇＧ形態でない二重抗体の場合、蛋白質折り畳み（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ）、薬物動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）などの部分で薬物としての安定性が検証されていない。

したがって、二重特異キメラ蛋白質の体内安定性および薬物としての物性を増進させる技術の開発が要求される。

Ｃｈａｐｔｅｒ ５．"Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＤＡＲＰｉｎｓ）：Ｆｒｏｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ"，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ５０３：１０１〜１３４ （２０１２） "Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＡＲＰｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＳＲＰ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ"，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００８）３８２，１２１１−１２２７

本発明は、ＤＡＲＰｉｎの二重特異キメラ蛋白質（二重特異抗体接合体）の製造における用途に関するものである。前記ＤＡＲＰｉｎを用いて製造された二重特異キメラ蛋白質は、副作用（ａｇｏｎｉｓｍ）が低減されたり、および／または効能が増進したものであり得る。

より具体的には、本発明の一例は、ＤＡＲＰｉｎを含む二重特異キメラ蛋白質を提供する。

他の例は、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを含む二重特異キメラ蛋白質を提供する。

他の例は、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと、抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体を含むＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔに対する二重特異キメラ蛋白質を提供する。

他の例は、エピトープが異なるＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを２個以上含む二重特異キメラ蛋白質を提供する。

他の例は、抗体にＤＡＲＰｉｎを結合させる段階を含む二重特異キメラ蛋白質の製造方法を提供する。

他の例は、前記二重特異キメラ蛋白質を含む薬学組成物を提供する。

他の例は、前記二重特異キメラ蛋白質を有効成分として含む癌の予防および／または治療用組成物を提供する。

他の例は、前記二重特異キメラ蛋白質の薬学的有効量を、癌の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法を提供する。

他の例は、前記二重特異キメラ蛋白質の癌の予防および／または治療のための用途を提供する。

他の例は、ＤＡＲＰｉｎを含む抗体の副作用低減および／または効能増進用組成物を提供する。

他の例は、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを含む腫瘍関連蛋白質に対する抗体の副作用低減および／または効能増進用組成物を提供する。

他の例は、抗体にＤＡＲＰｉｎを結合させる段階を含む抗体の副作用を低減および／または効能を増進させる方法を提供する。

他の例は、腫瘍関連蛋白質に対する抗体に抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを結合させる段階を含む腫瘍関連蛋白質に対する抗体の副作用を低減および／または効能を増進させる方法を提供する。

他の例は、ＤＡＲＰｉｎの抗体の副作用低減および／または効能増進のための用途を提供する。

他の例は、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎの腫瘍関連蛋白質に対する抗体の副作用低減および／または効能増進のための用途を提供する。

二重特異キメラ蛋白質は、非常に多様な種類と形態で開発されており、２種以上の抗原に同時に結合することができるため、従来のモノクローナル抗体と比較して治療効果に優れた抗体新薬として期待されている。本発明は、従来のＩｇＧ形態の抗体にＤＡＲＰｉｎを結合させた新しい概念の二重特異キメラ蛋白質を提案する。

ＤＡＲＰｉｎ（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；参照文献：Ｃｈａｐｔｅｒ ５．“Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＤＡＲＰｉｎｓ）：Ｆｒｏｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ５０３：１０１〜１３４ （２０１２）；ａｎｄ“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＡＲＰｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＳＲＰ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００８）３８２，１２１１−１２２７）は、標的蛋白質に対して高い特異性と高い結合親和性を示す遺伝子工学的に作製された抗体擬似蛋白質（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。ＤＡＲＰｉｎは、天然アンキリン（ａｎｋｙｒｉｎ）蛋白質に由来するもので、アンキリン繰り返し単位体（ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ）が２個以上または３個以上、例えば、４または５個繰り返された構造を有する。前記繰り返し単位体が３個、４個、または５個繰り返されたＤＡＲＰｉｎの場合、分子量がそれぞれ約１０ｋＤａ、１４ｋＤａ、または約１８ｋＤａ程度である。

ＤＡＲＰｉｎは、主に、構造的機能を果たすコア部分と、標的と結合する標的結合部分とを含み、前記コア部分は、保存されたアミノ酸配列を有し、前記標的結合部分は、前記コアの外側に位置する部分で、標的に応じて異なるアミノ酸配列を有する。

ＤＡＲＰｉｎは、標的特異性のように抗体と類似する特性を有するため、従来の抗体、例えば、ＩｇＧ形態の抗体またはその抗原結合断片と結合させて、新たな形態の二重特異キメラ蛋白質に作製することができる。

使用可能なＤＡＲＰｉｎの例を下記の表１にまとめており、これらのヌクレオチド配列を図２１Ａ〜図２１Ｇに例示した。

そこで、本発明の一例は、（ａ）ＤＡＲＰｉｎ、および（ｂ）抗体（例えば、ＩｇＧ形態の抗体）、抗体断片（抗原結合断片、例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体）、またはこれらの組み合わせを含む二重特異キメラ蛋白質を提供する。他の例は、（ａ）ＤＡＲＰｉｎを、（ｂ）抗体（例えば、ＩｇＧ形態の抗体）、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体）、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含む二重特異キメラ蛋白質の製造方法を提供する。

前記二重特異キメラ蛋白質において、前記抗体および／または抗原結合断片は、ＤＡＲＰｉｎと同一であるか（この場合、認識部位が異なる）、互いに異なる抗原を標的とするものであってよい。したがって、前記二重特異キメラ蛋白質は、異なる抗原を標的とするか、同一の抗原の互いに異なる認識部位を標的とする二重特異抗体として使用できる。

前記抗体は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）から選択されたものであってよい。

前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプの形態であってよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は、２個の重鎖と、２個の軽鎖とを含み、それぞれの重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合を通して結合され、２個の重鎖−軽鎖構造体を形成し、前記形成された２個の重鎖−軽鎖は、重鎖のＦｃ部位でジスルフィド結合を通して連結されている形態を有する。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両方の重鎖−軽鎖構造体に同一の抗原に対する抗原結合部位を含むことで１つの抗原を標的とする単一標的抗体、または両方の重鎖−軽鎖構造体に互いに異なる抗原に対する抗原結合部位を含むことで２つの抗原を標的とする二重特異キメラ蛋白質であってよい。

前記ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、１つの抗原に対する抗原結合部位を有する１つのｓｃＦｖ−Ｆｃ断片を含むモノマー形態の単一標的抗体、または同一の抗原に対する抗原結合部位を含む２個のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片がＦｃ部位で結合されたダイマー形態の単一標的抗体であるか、異なる抗原に対する抗原結合部位を含む２個のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片がＦｃ部位で結合されたダイマー形態の二重特異キメラ蛋白質であってよい。前記Ｆｃは、哺乳類のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２、具体的には、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプに由来するものであってよい。前記ＩｇＧ形態の抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体が二重特異キメラ蛋白質の場合、これらが標的とする２つの抗原のうちの１つの抗原は、ＤＡＲＰｉｎが標的とする物質と同一のものであってよい。

前記「抗原結合部位」は、抗原と特異的に結合する部分を含むポリペプチドを意味するもので、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）を意味するものである。

また、前記ＤＡＲＰｉｎは、前記ＩｇＧ形態の抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体のＣ末端、Ｎ末端、または結合可能なすべての部位に連結されたものであってよい。例えば、前記ＩｇＧ形態の抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の抗原結合能力の保存を考慮して、前記ＤＡＲＰｉｎは、前記ＩｇＧ形態の抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体のＦｃ部分のＣ末端に連結されたものであってよいが、これに制限されるものではない。

前記二重特異キメラ蛋白質が、ＤＡＲＰｉｎと、ＩｇＧ形態の抗体およびｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の組み合わせを含む場合、ＤＡＲＰｉｎ、ＩｇＧ形態の抗体、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の連結順序には特別な制限がない。場合によっては、連結順序に応じて他の効能を示したり抗体発現率などが異なることがあるが、通常所望の抗体の効能には影響がない。例えば、前記二重特異キメラ蛋白質は、ＩｇＧ形態の抗体、前記ＩｇＧ形態の抗体のＣ末端に連結されたＤＡＲＰｉｎ、および前記ＤＡＲＰｉｎのＣ末端に連結されたｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体を含むものであってよいが、これに制限されるものではない。

前記二重特異キメラ蛋白質において、前記ＤＡＲＰｉｎは、同一のアミノ酸配列を有するＤＡＲＰｉｎが１個以上、例えば、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個繰り返し含まれるか、同一または互いに異なる蛋白質を標的とし、互いに異なるアミノ酸配列を有する２種以上、例えば、２〜１０種、２〜５種、または２〜３種が含まれるとよい。ＤＡＲＰｉｎが２個以上または２種以上含まれる場合、前記２個以上または２種以上のＤＡＲＰｉｎは、互いに連結されて繰り返し体の形態で抗体に結合されてよく、前記ＤＡＲＰｉｎまたはその繰り返し体は、ＩｇＧ形態の抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の各鎖のＣ末端、Ｎ末端、および結合可能な部位のうちの１つ以上に連結されてよい。

前記二重特異キメラ蛋白質は、前記ＤＡＲＰｉｎ、ＩｇＧ形態の抗体、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体と同一または異なる抗原を標的とする抗体の抗原結合断片を１種以上（例えば、１〜５種または１〜３種）を追加的に含むことができる。前記抗原結合断片は、抗体の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）であってよく、二重特異キメラ蛋白質の結合可能なすべての部位、例えば、前記二重特異キメラ蛋白質の重鎖（例えば、Ｆｃ部位）のＣ末端または軽鎖のＣ末端、またはＤＡＲＰｉｎのＣ末端などに結合されてよい。

前記ＤＡＲＰｉｎと、ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ内の重鎖可変部位と軽鎖可変部位、ｓｃＦｖ−ＦｃとｓｃＦｖ−Ｆｃ（ダイマーを形成する場合）、および前記抗原結合断片、ＤＡＲＰｉｎ、およびＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、リンカーを介するか介することなく連結できる。前記リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、複数のリンカーが使用された場合、互いに同一または異なるものであってよい。前記ペプチドリンカーは、１〜１００個または２〜５０個（例えば、５〜２５個、１〜１０個、または２〜５個）の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってよく、その含まれているアミノ酸の種類は制限がない。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよび／またはＳｅｒ残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａのような中性アミノ酸も含まれてよい。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は当業界で公知である。一方、前記リンカーは、前記二重特異キメラ蛋白質の機能に否定的影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。例えば、前記ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択された１種以上を、計１〜１００個、２〜５０個、または５〜２５個を含んでなるものであってよい。一例において、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎは（Ｇ４Ｓ）の繰り返し数）であって、１〜１０の整数、例えば、２〜５の整数）で表現されるものであってよい。

ＤＡＲＰｉｎは、抗原に対して高い親和性を有しながらも、一般的な抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）より分子量が小さく、安定性に優れることから、物性（例えば、体内ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ（ＰＫ）ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）および体内安定性の側面で有利であり、他の蛋白質との融合が容易で、安定性および物性に優れた二重特異キメラ蛋白質の作製などに有利に使用できる。

一方、上皮細胞成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）は、ＨＥＲファミリーの受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ；ＲＴＫｓ）の一員である。様々な種類のヒト悪性腫瘍から、ＥＧＦＲの過発現、遺伝子増幅、突然変異、または再配列などが頻繁に観察され、癌治療の不良な予後および悪い臨床的結果に関連する。このような理由から、これらのＥＧＦＲは、抗癌療法において重要な標的となる。

したがって、一例において、前記ＤＡＲＰｉｎは、ＥＧＦＲを標的とする、つまり、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ（またはＥＧＦＲ結合ＤＡＲＰｉｎ）であってよい。この場合、（ａ’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および（ｂ’）抗体（例えば、ＩｇＧ形態の抗体）、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体）、またはこれらの組み合わせを含む二重特異キメラ蛋白質が提供される。他の例は、（ａ’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、（ｂ’）抗体（例えば、ＩｇＧ形態の抗体）、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体）、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含む二重特異キメラ蛋白質の製造方法を提供する。前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および抗体および／または抗体断片を含む二重特異キメラ蛋白質は、ＥＧＦＲを含むことで２以上の抗原または２以上の認識部位をターゲットとする二重特異抗体として使用できる。

本発明で使用される抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、ＤＡＲＰｉｎ固有の構造を有しながら、ＥＧＦＲに特異的に結合するすべてのＤＡＲＰｉｎであってよく、例えば、論文（Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｄ．，Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ａｎｄ Ａ．Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，（２００８）ＪＭＢ３８２：１２１１−１２２７）に開示された４種の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎの中から選択された１種以上であってよい。前記４種の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎのアミノ酸配列は次の通りである。

抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ−０１（配列番号１０９）：
ｄｌｇｋｋｌｌｅａａｒａｇｑｄｄｅｖｒｉｌｍａｎｇａｄｖｎａｄｄｔｗｇｗｔｐｌｈｌａａｙｑｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｎｇａｄｖｎａｙｄｙｉｇｗｔｐｌｈｌａａｄｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｎｇａｄｖｎａｓｄｙｉｇｄｔｐｌｈｌａａｈｎｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｈｇａｄｖｎａｑｄｋｆｇｋｔａｆｄｉｓｉｄｎｇｎｅｄｌａｅｉｌｑ
抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ−６７（配列番号１１０）：
ｄｌｇｋｋｌｌｅａａｒａｇｑｄｄｅｖｒｉｌｍａｎｇａｄｖｎａｔｄｎｄｇｎｔｐｌｈｌｓａｗｉｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｈｇａｄｖｎａｄｄｌｌｇｍｔｐｌｈｌａａｄｔｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｙｇａｄｖｎａｒｄｔｒｇｋｔｐｌｈｌａａｒｄｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｈｄａｄｖｎａｑｄｋｆｇｋｔａｆｄｉｓｉｄｎｇｎｅｄｌａｅｉｌｑ
抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ−６８（配列番号１１１）：
ｄｌｇｋｋｌｌｅａａｒａｇｑｄｄｅｖｒｉｌｍａｎｇａｄｖｎａｆｄｙｗｇｍｔｐｌｈｌａａｄｎｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｈｇａｄｖｎａｓｄｎｆｇｆｔｐｌｈｌａａｆｙｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｈｇａｄｖｎａｆｄｍｗｇｎｔｐｌｈｌａａｑｎｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｎｇａｄｖｎａｑｄｋｆｇｋｔａｆｄｉｓｉｄｎｇｎｅｄｌａｅｉｌｑ
抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ−６９（配列番号１１２）：
ｄｌｇｋｋｌｌｅａａｒａｇｑｄｄｅｖｒｉｌｍａｎｇａｄｖｎａｄｄｎａｇｒｔｐｌｈｌａａｎｆｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｎｇａｄｖｎａｋｇｈｈｃｎｔｐｌｈｌａａｗａｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｙｇａｄｖｎａｄｄｄｅｇｙｔｐｌｈｌａａｄｉｇｄｌｅｉｖｅｖｌｌｋｙｇａｄｖｎａｗｄｍｙｇｒｔｐｌｈｌａａｓａｇｈｌｅｉｖｅｖｌｌｋｙｇａｄｖｎａｑｄｋｆｇｋｔａｆｄｉｓｉｄｎｇｎｅｄｌａｅｉｌｑ
前記二重特異キメラ蛋白質において、前記ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと同一または互いに異なる抗原を標的とするものであってよい。同一の抗原を標的とする場合、前記ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体と、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎが認識および／または結合する抗原のエピトープが互いに異なっていてよい。

先に説明したように、ＥＧＦＲは、抗癌治療における主な標的であるため、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ−１）以外の腫瘍関連蛋白質、具体的には、細胞のシグナル伝達に関連する蛋白質、例えば、各種シグナル伝達分子（例えば、各種成長因子）、各種受容体（例えば、受容体チロシンキナーゼ蛋白質など）などの細胞膜蛋白質などを標的とすれば、より上昇した癌治療効果を得ることができる。したがって、前記ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体が抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと異なる抗原、つまり、ＥＧＦＲ以外の抗原を標的（認識）とするものの場合、前記ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の抗原は、それぞれ独立して腫瘍関連蛋白質、例えば、各種成長因子およびＥＧＦＲを除いた受容体チロシンキナーゼ蛋白質からなる群より選択された１種以上であってよい。前記成長因子は、例えば、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などを含むことができる。前記受容体チロシンキナーゼ蛋白質は、各種成長因子の受容体などを含み、具体的には、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３などを含むＥｒｂＢファミリー、インスリン受容体、ＰＤＧＦ受容体（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ＦＧＦ受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）、ＶＥＧＦ受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＤＧＦＲ）、ｃ−Ｍｅｔなどを含むＨＧＦ受容体（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＨＧＦＲ）、Ｔｒｋ受容体（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｅｐｈ受容体（Ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＡＸＬ受容体、ＬＴＫ受容体（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、ＴＩＥ受容体、ＲＯＲ受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＤＤＲ受容体（Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＥＴ受容体、ＫＬＧ受容体、ＲＹＫ受容体（ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＭｕＳＫ受容体（Ｍｕｓｃｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などを含むことができる。一実施形態において、前記ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、それぞれ独立してｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦなどからなる群より選択された１種以上を抗原として認識するものであってよい（図１参照）。

前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプの形態であってよい。前記ＩｇＧ形態の抗体の構造は先に説明した通りである。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両方の重鎖−軽鎖構造体に同一の抗原に対する抗原結合部位を含むことで１つの抗原を標的とする単一標的抗体、または両方の重鎖−軽鎖構造体に互いに異なる抗原に対する抗原結合部位を含むことで２つの抗原を標的とする二重特異キメラ蛋白質であってよい。前記ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、１つの抗原に対する抗原結合部位を有する１つのｓｃＦｖ−Ｆｃ断片を含むモノマー形態の単一標的抗体、または同一の抗原に対する抗原結合部位を含む２個のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片がＦｃ部位で結合されたダイマー形態の単一標的抗体であるか、異なる抗原に対する抗原結合部位を含む２個のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片がＦｃ部位で結合されたダイマー形態の二重特異キメラ蛋白質であってよい。前記ＩｇＧ形態の抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体が二重特異キメラ蛋白質の場合、これらが標的とする２つの抗原のうちの１つは、ＥＧＦＲであってよく、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと同一または異なる部分を認識および／または結合するものであってよい。

前記「抗原結合部位」の定義は先に説明した通りであり、前記腫瘍関連蛋白質、例えば、前記各種成長因子およびＥＧＦＲを除いた受容体チロシンキナーゼ蛋白質からなる群より選択された１種以上の抗原と特異的に結合する部分を含むポリペプチド、例えば、前記抗原に対する抗体の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）であってよい。

前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、前記抗体（例えば、ＩｇＧ形態の抗体）または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体）のＣ末端、Ｎ末端、または結合可能なすべての部位に連結されたものであってよい。例えば、前記抗体または抗体断片の抗原結合能力の保存を考慮して、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、前記抗体または抗体断片のＦｃ部分のＣ末端に連結されたものであってよいが、これに制限されるものではない。

前記二重特異キメラ蛋白質が、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと、ＩｇＧ形態の抗体およびｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の組み合わせを含む場合、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、ＩｇＧ形態の抗体、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の連結順序には特別な制限がない。場合によっては、連結順序に応じて他の効能を示したり抗体発現率などが異なることがあるが、通常、所望の抗体の効能には影響がない。例えば、前記二重特異キメラ蛋白質は、ＩｇＧ形態の抗体、前記ＩｇＧ形態の抗体のＣ末端に連結された抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎのＣ末端に連結されたｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体を含むものであってよいが、これに制限されるものではない。

前記二重特異キメラ蛋白質において、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、同一のアミノ酸配列を有するＤＡＲＰｉｎが１個以上、例えば、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個繰り返し含まれるか、異なる配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎが２種以上、例えば、２〜１０種、２〜５種、または２〜３種が含まれるとよい。異なる配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎの場合、これらが認識および／または結合するＥＧＦＲ上のエピトープは、それぞれ異なっていてよい。また、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎに加えて、ＥＧＦＲ以外の蛋白質を標的とする１種以上、例えば、１〜１０種、１〜５種、または１〜３種のＤＡＲＰｉｎが追加的に含まれるとよい。ＤＡＲＰｉｎが２個以上または２種以上含まれる場合、前記２個以上または２種以上のＤＡＲＰｉｎは、互いに連結されて繰り返し体の形態で抗体に結合されてよく、前記ＤＡＲＰｉｎまたはその繰り返し体は、ＩｇＧ形態の抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の各鎖のＣ末端、Ｎ末端、および結合可能な部位のうちの１つ以上に連結されてよい。例えば、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、前記のような配列番号１０９の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１０の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１１の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および配列番号１１２の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎからなる群より選択された１種以上が１個〜１０個、１〜５個、または１〜３個繰り返された形態で、前記ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体のＣ末端、Ｎ末端、または結合可能なすべての部位（例えば、ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の重鎖、例えば、Ｆｃ部位のＣ末端または軽鎖のＣ末端など）に連結されたものであってよい。例えば、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、配列番号１０９の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１０の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１１の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および配列番号１１２の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎからなる群より選択された１種以上を含むか、前記１種以上のＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎが２個〜１０個繰り返された形態であってよい。

前記二重特異キメラ蛋白質は、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、ＩｇＧ形態の抗体、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体と同一または異なる抗原を標的とする抗体の抗原結合断片を１種以上（例えば、１〜５種または１〜３種）追加的に含むことができる。前記抗原結合断片は、前記各種成長因子および受容体チロシンキナーゼ蛋白質からなる群より選択された１種以上の抗原に対する抗体の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）であってよく、前記二重特異キメラ蛋白質のすべての結合可能な部位（例えば、ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体の重鎖、例えば、Ｆｃ部位のＣ末端または軽鎖のＣ末端、または抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎのＣ末端など）に結合されてよい（図２参照）。例えば、前記抗原結合断片は、以下に説明されるｃ−Ｍｅｔに対する抗原結合部位（抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原結合部位）、ＨＥＲ２に対する抗原結合部位、ＨＥＲ３に対する抗原結合部位、ＥＧＦＲに対する抗原結合部位、ＶＥＧＦに対する抗原結合部位などからなる群より選択された１種以上であってよい。

前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと、ＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ内の重鎖可変部位と軽鎖可変部位、ｓｃＦｖ−ＦｃとｓｃＦｖ−Ｆｃ（ダイマーを形成する場合）、および前記抗原結合断片、ＤＡＲＰｉｎ、およびＩｇＧ形態の抗体および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、リンカーを介するか介することなく連結できる。前記リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、その具体的な内容は先に説明した通りである。

前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、抗原に対して高い親和性を有しながらも、一般的な抗ＥＧＦＲ抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）より分子量が小さく、安定性に優れることから、物性（例えば、体内ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ（ＰＫ）ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）および体内安定性の側面で有利であり、他の蛋白質との融合が容易で、安定性および物性に優れた二重特異キメラ蛋白質の作製に有利に使用できる。

一例において、前記ＩｇＧ形態の抗体、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、ｃ−Ｍｅｔを標的とする抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってよい。この場合、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその断片を含む二重特異キメラ蛋白質は、ＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔを標的とする二重特異抗体であってよい。

ｃ−Ｍｅｔは、ＥＧＦＲと互いに相互作用をして腫瘍に関連する様々な機序に関与する代表的な受容体チロシンキナーゼ蛋白質である。これらの蛋白質は、癌細胞の増殖、癌細胞の侵入、新生血管の生成などを誘導する。また、これらの蛋白質は、互いに相互作用をすることにより互いのシグナル伝達経路に関与し、それぞれの治療剤に対する耐性まで誘発させることがある。さらに、ＥＧＦＲに対する標的治療剤（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｔａｒｃｅｖａ、Ｉｒｅｓａなど）の投与で獲得された耐性には、ｃ−Ｍｅｔの過発現と突然変異が関連しているという研究結果が報告されている。したがって、ＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔを同時に阻害することにより、従来の薬物の副作用、耐性などの問題を解決する可能性が高い上に、単一標的を阻害する場合より上昇した治療効果を収めることができ、従来の薬物に対して効果がなかった癌種にも効果を奏することができると期待される。

また、ｃ−Ｍｅｔだけを単独で標的とする抗体は、制約的な種類の癌において癌増殖抑制効能を示し、ｃ−Ｍｅｔが過発現する場合、大部分でＥＧＦＲの過発現が伴う場合が多いことから、ｃ−Ｍｅｔ標的治療剤に対する耐性克服のためにも、ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲを同時に阻害することが有利である。

したがって、本発明の一例は、（ａ’’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および（ｂ’’）ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはこれらの組み合わせを含む二重特異キメラ蛋白質を提供する。他の例は、（ａ’’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、（ｂ’’）ＩｇＧ形態の抗ＨＥＲ２抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含む二重特異キメラ蛋白質の製造方法を提供する。前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎが２種以上連結されたものの場合、前記製造方法は、２種以上、例えば、２〜１０種、２〜５種、または２〜３種の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを連結（例えば、直列に連結）させる段階を、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、ＩｇＧ形態の抗ＨＥＲ２抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはこれらの組み合わせに連結させる段階の前または後に、追加的に含むことができる。

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔを細胞内に移動させて分解を誘導する機能を有するものであってよく、このような特性によって、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む二重特異キメラ蛋白質は、ｃ−Ｍｅｔの分解だけでなく、ＥＧＦＲの分解も誘導して、ａｇｏｎｉｓｍなしにより上昇した抗癌活性を示すことができる。前記二重特異キメラ蛋白質の適用時、ＥＧＦＲクラスタリング（ＥＧＦＲ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）が観察され、前記二重特異キメラ蛋白質の上昇した効能は、このようなＥＧＦＲクラスタリングによって、関連するＰＴＫなどが共にクラスタリングされて形成されたシグナル伝達複合体（ｓｉｇｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）全体を、ｃ−Ｍｅｔと共に細胞内に移動させて分解することによって得られると見られる。このような前記二重特異キメラ蛋白質の増進した抗癌活性は、ｃ−ＭｅｔのリガンドであるＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の存在時により増進可能であり、ｃ−Ｍｅｔが過発現した細胞（例えば、癌細胞）においてより明確に現れる。また、前記二重特異キメラ蛋白質は、従来の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体などのＥＧＦＲ標的治療剤に対して獲得された耐性の克服が可能で、耐性獲得細胞においても効果を発揮することを特徴とする。このように、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む二重特異キメラ蛋白質は、従来の分解機序と差別化された機序によってより増進した効果を示す。

一具体例において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔに作用して細胞内移動（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導するすべての抗体またはその抗原結合断片であってよい。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔの特定部位、例えば、ＳＥＭＡドメイン内の特定部位をエピトープとして認識するものであってよい。

前記「ｃ−Ｍｅｔ蛋白質」は、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔ蛋白質は、すべての種に由来するものであってよく、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６）、猿ｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、ＮＰ＿００１１６２１００）などのような霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０３２６１７．２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５．１）などのようなげっ歯類由来のものなどであってよい。前記蛋白質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０００２４５に提供されたヌクレオチド配列によって暗号化されたポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０００２３６に提供されたポリペプチド配列によって暗号化された蛋白質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チロシンキナ−ゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、癌発生、癌転移、癌細胞移動、癌細胞侵入、新生血管の生成過程などの様々な機序に関与する。

ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の受容体であるｃ−Ｍｅｔは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の３つの部分に区分され、細胞外部位の場合、二硫化結合によってα−小単位体とβ−小単位体とが連結された形態で、ＨＧＦ結合ドメインであるＳＥＭＡドメイン、ＰＳＩドメイン（ｐｌｅｘｉｎ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ）、およびＩＰＴドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｆｏｌｄ ｓｈａｒｅｄ ｂｙ ｐｌｅｘｉｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｄｏｍａｉｎ）からなる。ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を有するものであってよく、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部位に存在するドメインであって、ＨＧＦが結合する部位に相当する。ＳＥＭＡドメイン中の特定部位、例えば、１０６番目から１２４番目までに相当する配列番号７１のアミノ酸配列を有する領域は、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープ中の２番と３番のプロペラドメインの間のループ（ｌｏｏｐ）部位に相当し、本発明で提案される抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープとして作用することができる。

用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認知される抗原の一部分を意味すると解釈される。一具体例によれば、前記エピトープは、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の連続した５個以上のアミノ酸を含む部位、例えば、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の１０６番目から１２４番目までに相当する配列番号７１内に位置する連続した５個〜１９個のアミノ酸を含むものであってよい。例えば、前記エピトープは、配列番号７１のアミノ酸配列中、配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続した５〜１９個のアミノ酸からなるものであってよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってよい。

前記配列番号７２のアミノ酸配列を有するエピトープは、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメイン内の２番と３番のプロペラ構造のドメインの間のループ部位のうち最も外側に位置した部位に相当し、前記配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープは、一具体例による抗体または抗原結合断片が最も特異的に結合する部位である。

したがって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列中、配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続した５〜１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合するものであってよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片であってよい。

一具体例によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続した８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続した６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または前記１つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
前記重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
前記重鎖可変部位および軽鎖可変部位の組み合わせを含むものであってよい。

前記配列番号４〜配列番号９はそれぞれ、下記の一般式Ｉ〜一般式ＶＩで表されるアミノ酸配列である。

一般式Ｉ
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号４）
一般式ＩＩ
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ_５−Ｔｈｒ（配列番号５）
一般式ＩＩＩ
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ_６−Ｔｙｒ（配列番号６）
一般式ＩＶ
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_７−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘａａ_８−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ_９−Ｘａａ_１０−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号７）
一般式Ｖ
Ｔｒｐ−Ｘａａ_１１−Ｓｅｒ−Ｘａａ_１２−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘａａ_１３（配列番号８）
一般式ＶＩ
Ｘａａ_１４−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_１５−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１６−Ｔｈｒ（配列番号９）
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ_１は、存在しないかＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘａａ_２は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ_３は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_４は、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ_５は、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ_６は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ_７は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_８は、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ_９は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_１０は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ_１１は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ_１２は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_１３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ_１４は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_１５は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_１６は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。

一具体例において、前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってよい。前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってよい。前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってよい。

前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってよい。前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってよい。前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってよい。

一具体例において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変部位；および配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変部位を含むものであってよい。

一具体例によれば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片において、前記重鎖可変部位は、配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変部位は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、または配列番号１０７のアミノ酸配列を含むものであってよい。

所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に、治療目的でヒトに投与時、免疫拒絶反応が起こることがあり、このような免疫拒絶反応を抑制すべく、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝子工学的方法を利用して、抗−アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因とされる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて、抗−アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、相変わらず動物由来のアミノ酸が可変部位に存在していて、潜在的な抗−イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を抱えている。このような副作用を改善すべく開発されたのが、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメラ抗体の可変部位のうち、抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ部位をヒト抗体のフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して作製される。

ヒト化抗体を作製するためのＣＤＲグラフト（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なのは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れる最適化されたヒト抗体を選定することであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化されたヒト抗体の骨格に動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても、動物由来抗体の骨格に位置しながら、抗原の結合に影響を与えるアミノ酸が存在する場合があるので、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在することから、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須といえる。

一実施形態によれば、前記抗体は、マウス由来の抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト由来抗体であってよい。前記抗体は、生体から分離されたものであってよい。

完全な抗体は、２個の全長軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と、軽鎖不変領域とに分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、およびエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。

用語「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために、十分な可変部位の配列を有するアミノ酸配列を含む可変部位ドメインＶ_Ｈ、および３個の不変領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３と、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変部位の配列を有するアミノ酸配列を含む可変部位ドメインＶ_Ｌ、および不変領域ドメインＣ_Ｌを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味で解釈される。

用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変部位（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列（相補性決定領域）を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ、３つのＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたり、主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知の意味と同一のものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応を行うことを意味する。

用語「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体の構造に対するそれの断片で、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。一具体例において、前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）_２であってよいが、これに限定されない。前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変部位と、軽鎖の不変領域、および重鎖の１番目の不変領域（Ｃ_Ｈ１）を有する構造で、１つの抗原結合部位を有する。

Ｆａｂ’は、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ−末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有する点からＦａｂと差がある。

Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしつつ生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体片で、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界で広く公知である。

二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変部位と単鎖の可変部位とが共有結合で連結されるか、またはＣ−末端で直接連結されていて、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。前記ペプチドリンカーは、１〜１００個または２〜５０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってよく、その含まれているアミノ酸の種類は制限がない。

前記抗原結合断片は、蛋白質加水分解酵素を用いて得られ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）_２断片が得られる）、遺伝子組換え技術によって作製することができる。

用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内の抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。

動物由来抗体がキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経ると、動物由来のＩｇＧ１ヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジに置換されるが、動物由来のＩｇＧ１ヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジに比べてその長さが短く、２個の重鎖の間の二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）が３個から２個に減少し、ヒンジの硬直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が互いに異なる効果を示す。したがって、ヒンジ領域の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ヒト化抗体の抗原結合の効率性を増加させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配列を変形させるためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者によく知られている。

そこで、本発明の一実施形態において、抗原結合の効率性を増進させるために、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片は、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加または置換されてアミノ酸配列が変形したヒンジ領域を含むものであってよい。例えば、前記抗体は、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、または配列番号１０４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域、または配列番号１０５のアミノ酸配列を有するヒンジ領域（非変形ヒトヒンジ領域）を含むものであってよい。より具体的には、前記ヒンジ領域は、配列番号１００または配列番号１０１のアミノ酸配列を有するものであってよい。

一実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０のハイブリドーマ細胞から生産される、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質の細胞外部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ）に特異的に結合する単クローン抗体であってよい（大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号参照；前記文献は本明細書に参照として組み込まれる）。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号に定義された抗体をすべて含むことができる。

前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の前記定義されたＣＤＲ部位または軽鎖可変部位と重鎖可変部位を除いた軽鎖不変領域と重鎖不変領域は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）の軽鎖不変領域と重鎖不変領域であってよい。

一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号６２のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、配列番号６６のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、および配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖；および
配列番号６８のアミノ酸配列（このうち、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、配列番号７０のアミノ酸配列（このうち、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、および配列番号１０８のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであってよい。

例えば、前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；または
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号７０または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；および
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体からなる群より選択されたものであってよい。

一方、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖であり、配列番号６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて３６番（ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う、配列番号６８内の６２番目のアミノ酸の位置）のヒスチジン（Ｈｉｓ）がチロシン（Ｔｙｒ）に置換された形態のポリペプチドである。前記置換によって、一具体例による抗体の生産量が増加できる。また、前記配列番号１０８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号６８のアミノ酸配列中の１番目から２０番目までのシグナルペプチドを除いた２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいてｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる２７ｅの位置（ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う；配列番号１０８内の３２番目の位置；ＣＤＲ−Ｌ１の内部）のセリン（Ｓｅｒ）がトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換されたもので、前記置換によって、一実施形態による抗体の活性（例えば、ｃ−Ｍｅｔに対する結合親和性、ｃ−Ｍｅｔの分解活性、およびＡｋｔのリン酸化抑制活性など）がより増進できる。

一実施形態において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号１０６の軽鎖相補性決定領域、配列番号１０７の軽鎖可変部位、または配列番号１０８の軽鎖を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってよい。

一例において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＩｇＧ形態の抗体、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプ形態の抗体であってよい。前記ＩｇＧ形態の抗体の構造は先に説明した通りである。

前記ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、抗体の両方の重鎖−軽鎖構造体にｃ−Ｍｅｔに対する抗原結合部位、例えば、前記重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはこれらの組み合わせ、または重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせを含むｃ−Ｍｅｔに対する単一標的抗体であってよい。他の例において、ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、抗体の一方の重鎖−軽鎖構造体にｃ−Ｍｅｔに対する抗原結合部位、例えば、前記重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはこれらの組み合わせ、または重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせを含み、他方の重鎖−軽鎖構造体には、ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原に対する抗原結合部位を含む二重特異（二重標的）抗体であってよい。この場合、前記ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原は、ＥＧＦＲであってよい。

さらに他の例において、ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、両方の重鎖−軽鎖構造体にｃ−Ｍｅｔに対する抗原結合部位を含むＩｇＧ形態のｃ−Ｍｅｔに対する単一標的抗体のＦｃのｃ末端に、リンカーを介するか介することなく、ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原に対する抗原結合部位、例えば、ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原に対する抗体の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）を含む上下非対称型二重特異キメラ蛋白質であってよい。この場合、前記ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原は、ＥＧＦＲであってよい。前記リンカーは先に説明した通りである。

他の例において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体であってよい。前記ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、ｃ−Ｍｅｔに対する抗原結合部位、例えば、前記重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはこれらの組み合わせ、または重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせを含む１個のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片を含むモノマー形態のｃ−Ｍｅｔに対する単一標的抗体、または前記ｃ−Ｍｅｔに対する抗原結合部位を有する２個のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片がＦｃ部位で結合されたホモダイマー形態のｃ−Ｍｅｔに対する単一標的抗体であるか、前記ｃ−Ｍｅｔに対する抗原結合部位を有する１つのｓｃＦｖ−Ｆｃ断片と、ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原に対する抗原結合部位を有するｓｃＦｖ−Ｆｃ断片とがＦｃ部位で結合されたヘテロダイマー形態の二重特異キメラ蛋白質であってよい。この場合、前記ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原は、ＥＧＦＲであってよい。

他の例において、前記二重特異キメラ蛋白質は、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎおよびｃ−Ｍｅｔ以外の腫瘍関連蛋白質、例えば、各種シグナル伝達分子、各種受容体などからなる群より選択されたものに対するＩｇＧ形態またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体を含むものであってよい。前記シグナル伝達分子は、各種成長因子、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦなどからなる群より選択されたものであってよい。前記受容体は、前記シグナル伝達分子と特異的に結合する受容体であって、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３などを含むＥｒｂＢファミリー、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔを除いたＨＧＦＲなどからなる群より選択されたものであってよい。

例えば、前記ＩｇＧ形態またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体は、以下からなる群より選択された抗原結合部位を有するものであってよい。

（１）ＨＥＲ２に対する抗原結合部位：トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ：Ｔ−ＤＭ１）などからなる群より選択された抗ＨＥＲ２抗体の抗原結合部位、例えば、前記抗体の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変部位、軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２）、または配列番号１１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変部位、配列番号１１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（この時、前記重鎖可変部位と軽鎖可変部位は、前記ペプチドリンカーによるかよることなく連結）であってよい。

＜抗ＨＥＲ２抗体の重鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＜抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
（２）ＨＥＲ３に対する抗原結合部位：配列番号１１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変部位、配列番号１１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（この時、前記重鎖可変部位と軽鎖可変部位は、前記ペプチドリンカーによるかよることなく連結）であってよい。

＜抗ＨＥＲ３抗体の重鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＮＲＤＧＳＡＳＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＶＧＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴ
＜抗ＨＥＲ３抗体の軽鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１６）
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＦＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＤＲＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＩＩＳＧＬＱＡＤＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＧＳＳＳＴＨＶＩＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧ
（３）抗ＥＧＧＦＲ／抗ＨＥＲ３二重特異キメラ蛋白質：配列番号１１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変部位、配列番号１１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部位、またはこれらの組み合わせ（この時、前記重鎖可変部位と軽鎖可変部位は、前記ペプチドリンカーによるかよることなく連結）であってよい。

＜抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体の重鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＧＤＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＜抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体の軽鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＩＡＴＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＥＰＥＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと腫瘍関連蛋白質に対する抗体を含む二重特異キメラ蛋白質は、ＥＧＦＲの活性阻害だけでなく、他の腫瘍関連蛋白質の活性を同時に阻害することによって、より上昇した治療効果を得ることができる。より具体的には、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む二重特異キメラ蛋白質は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）活性によって、ｃ−ＭｅｔおよびＥＧＦＲの活性阻害だけでなく、ｃ−ＭｅｔおよびＥＧＦＲを分解させて総量を減少させることによって、より根本的な遮断を可能にする。したがって、前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む二重特異キメラ蛋白質は、従来の抗ＥＧＦＲ抗体に耐性が生じた患者へ適用時にも有効な効果を得ることができる。

発明の他の側面は、前記二重特異キメラ蛋白質を有効成分として含む医薬組成物を提供する。他の例は、前記二重特異キメラ蛋白質を有効成分として含む癌の予防および／または治療用医薬組成物を提供する。さらに他の例は、前記二重特異キメラ蛋白質の薬学的有効量を、癌の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法が提供される。前記癌の予防および／または治療方法は、前記投与する段階の前に、癌の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階を追加的に含むことができる。さらに他の例は、前記二重特異キメラ蛋白質の癌の予防および／または治療のための用途が提供される。前記二重特異キメラ蛋白質は、前記のような（ａ’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および（ｂ’）ＩｇＧ形態の抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体、またはこれらの組み合わせを含む二重特異キメラ蛋白質、または（ａ’’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および（ｂ’’）ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはこれらの組み合わせを含む二重特異キメラ蛋白質であってよい。

前記癌は、ＥＧＦＲおよび／またはｃ−Ｍｅｔの過発現（過生産）および／または異常な活性化に関連する癌であってよい。前記癌は、固形癌または血液癌であってよく、例えば、これに制限されないが、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、すい臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、および頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された１種以上であってよい。特に、前記癌は、従来の抗癌剤、例えば、前記ＥＧＦＲに対する拮抗剤に対して耐性が生じた癌であってよい。前記癌の予防および／または治療効果は、癌細胞の成長抑制だけでなく、癌細胞の移動、侵襲、転移などによる癌の悪化を抑制することも含む。前記治療可能な癌は、原発性癌と転移性癌を含むことができる。

前記二重特異キメラ蛋白質は、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤などと共に提供されてよい。

前記薬学的に許容される担体は、抗体の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。前記医薬組成物は、前記成分のほか、医薬組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。

前記二重特異キメラ蛋白質または医薬組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、蛋白質またはペプチドは消化されることから、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与されてよい。

前記二重特異キメラ蛋白質または医薬組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年令、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、および反応感応性のような要因によって多様に処方できる。例えば、前記二重特異キメラ蛋白質および医薬組成物の１日投与量は、二重特異キメラ蛋白質の量を基準として、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、または０．０２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。用語「薬学的有効量」は、所望の効果、例えば、癌を予防または治療する上で効果を奏する量を意味する。

前記二重特異キメラ蛋白質または医薬組成物は、当該当業者が容易に実施可能な方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することによって単位用量の形態で製造されるか、または多用量容器内に入れて製造されてよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。

また、前記医薬組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されてよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてよい。

一方、前記二重特異キメラ蛋白質または医薬組成物は、抗体または抗原結合断片を含むため、免疫リポソームとして剤形化されてよい。抗体を含むリポソームは、当業界で広く知られている方法により製造されてよい。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびポリエチレングリコール−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であって、逆相蒸発法によって製造できる。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド−交替反応によってリポソームに接合できる。ドキソルビシンのような化学療法剤が追加的にリポソーム内に含まれるとよい。

前記医薬組成物の投与対象または前記予防および／または治療方法の投与対象患者は、哺乳類、例えば、ヒト、猿などの霊長類、またはラット、マウスなどのげっ歯類などであってよいが、これに制限されるものではなく、従来の抗癌剤、例えば、ＥＧＦＲに対する拮抗剤（例えば、抗体）および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対して耐性が生じた癌患者であってよい。

先に説明したように、ＤＡＲＰｉｎは、物性（例えば、ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ（ＰＫ）ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）および体内安定性に優れ、従来の抗体、例えば、ＩｇＧ形態の抗体と融合して二重特異キメラ蛋白質に作製される場合、ＤＡＲＰｉｎが標的とする抗原を含む２種以上の抗原を同時に標的にすることができるだけでなく、ＩｇＧ形態の抗体の物性および／または安定性を増進させることができる。このように、従来のＩｇＧ形態の抗体にＤＡＲＰｉｎを融合させることにより、従来の二重特異キメラ蛋白質の最も大きい問題とされていた安定性の問題を改善し、より増進した抗体効能を得ることができる。

したがって、本発明の一例は、（ａ）ＤＡＲＰｉｎを、（ｂ）ＩｇＧ形態の抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含む抗体の効能増進方法を提供する。他の例は、（ａ’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、（ｂ’）ＩｇＧ形態の抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含む抗体の効能増進方法を提供する。さらに他の例は、（ａ’’）抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、（ｂ’’）ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能増進方法を提供する。

前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能増進は、２種以上の抗原を標的とすることによって得られる相乗効果、抗体の薬物としての物性、例えば、薬物動力学的な物性（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ（ＰＫ）ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）の増進、体内または体外安定性の増進、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する耐性の克服、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の副作用（ａｇｏｎｉｓｍ）の低減、またはこれらのすべてを意味するものであってよい。

前記抗体の効能増進方法において、ＤＡＲＰｉｎ、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、ＩｇＧ形態の抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体、これらの連結形態などの具体的な内容は先に説明した通りである。

他の例は、前記記載した二重特異キメラ蛋白質を暗号化する核酸分子を提供する。前記核酸分子は、適切なベクターに含まれている形態で提供されてよい。したがって、他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターにおいて、前記蛋白質複合体をコーディングする核酸分子は、プロモーターに作動的に連結されてよい。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることにより、他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節することができる。前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクター、または発現のためのベクターとして構築されてよい。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物において外来の蛋白質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界で公知の多様な方法により構築できる。

他の例は、前記核酸または前記組換えベクターを含む（形質転換された）組換え細胞を提供する。前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界で広く知られている運搬方法を利用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ_２方法または電気穿孔方法などを用いることができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法、および遺伝子ボンバードメントなどを用いることができるが、これに限定しない。

前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を利用して、当業界で広く知られている方法により容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含まれている培地で形質転換体を培養することにより、形質転換体を容易に選別することができる。

前記二重特異キメラ蛋白質は、前記核酸分子を前記細胞で発現（例えば、前記細胞を前記核酸分子の発現を許容する条件下で培養）させる段階、および、選択的に、前記発現した二重特異キメラ蛋白質を一般的な方法で分離および／または精製する段階によって生産されてよい。したがって、一例は、前記核酸分子を前記細胞で発現させる段階を含む前記二重特異キメラ蛋白質の製造方法を提供する。

本発明で提供される二重特異キメラ蛋白質、例えば、抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎと、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む二重特異キメラ蛋白質は、従来の抗ｃＭｅｔ抗体と比較して、次のような増進した効果を期待することができる。

１．ＩｇＧ−ＤＡＲＰｉｎ形態の二重特異キメラ蛋白質プラットホームの構築
２．ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ配列の汎用化
３．新たなＭＯＡ（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ）によるＥＧＦＲ活性の阻害
４．従来の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または抗ＥＧＦＲ治療剤より増加した癌細胞抑制効果
５．従来の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、または抗ＥＧＦＲ治療剤に対して耐性を有する癌細胞の抑制効果
６．ＥＧＦＲ／ＭＥＴの併用投与またはＥＧＦＲ／ＨＥＲ２の併用投与と比較して、優れた効能を発揮するＩｇＧ−ＤＡＲＰｉｎ形態の二重特異キメラ蛋白質の確保

一実施形態にかかる抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを用いた多様な二重特異キメラ蛋白質の製造過程を模式的に示したものである。 一実施形態にかかる抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを用いた多様な二重特異キメラ蛋白質の製造過程を模式的に示したものである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質の製造過程を模式的に示したものである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質の物性を示す結果である。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質のＥＧＦ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎの程度を示すグラフである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質のＡ４３１細胞においてＥＧＦＲのリン酸化阻害の程度を示すグラフである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質のＳＮＵ５細胞株に対する増殖阻害の程度を示すグラフである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質のＭＫＮ４５細胞株に対する増殖阻害の程度を示すグラフである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質のＨ１９９３細胞株に対する増殖阻害の程度を示すグラフである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質のＡ４３１細胞株に対する増殖阻害の程度を示すグラフである。 抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質によるｃ−ＭｅｔおよびＥＧＦＲのＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示す蛍光イメージである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質処理によるｃ−Ｍｅｔ（上段）およびＥＧＦＲ（下段）の発現量の変化を示すグラフである。 一実施形態にかかる抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質の製造過程を模式的に示したものである。 一実施形態にかかる抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質の物性を示す結果である。 一実施形態にかかる抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質のＭＫＮ４５細胞株に対する増殖阻害の程度を示すグラフである。 抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質によるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示す蛍光イメージである。 一実施形態にかかる抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の製造過程を模式的に示したものである。 一実施形態にかかる抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の物性を示す結果である。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ（Ｅ０１＋Ｅ６９）ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の製造過程を模式的に示したものである。 一実施形態にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ（Ｅ０１＋Ｅ６９）ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の物性を示す結果である。 多様なＤＡＲＰｉｎの塩基配列を示す。 多様なＤＡＲＰｉｎの塩基配列を示す。 多様なＤＡＲＰｉｎの塩基配列を示す。 多様なＤＡＲＰｉｎの塩基配列を示す。 多様なＤＡＲＰｉｎの塩基配列を示す。 多様なＤＡＲＰｉｎの塩基配列を示す。 多様なＤＡＲＰｉｎの塩基配列を示す。

以下、本発明を実施例および試験例を通してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例および試験例は、本発明を例示するためのもので、本発明を制限すると解釈されてはならない。

参考例１：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の作製
１．１．ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体‘ＡｂＦ４６’の生産
１．１．１．マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、５匹のマウスに、１匹あたり１００μｇのヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、同量の完全フロイントアジュバントを混合して、４−６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射した。２週後に、前記と同様の方法で、前記抗原として使用されたヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質を、前記注射した量の半分である５０μｇを、同量の不完全フロイントアジュバントと混合して、マウスの腹腔内に注射した。１週後、最後のブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）が行われ、３日後に、前記マウスの尾から採血して血清を得た後、１／１０００にＰＢＳで希釈して、ＥＬＩＳＡでｃ−Ｍｅｔを認知する抗体の力価が増加することを確認した。前記結果で抗体の量が十分に得られるマウスを選別し、下記の細胞融合過程を行った。

１．１．２．細胞融合およびハイブリドーマの製造
細胞融合実験３日前に、５０μｇのＰＢＳに、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質の混合物をＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射し、免疫化されたマウスを麻酔した後、体の左側に位置した脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで粉砕して細胞を分離し、培養培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合して、脾臓細胞懸濁液を調製した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を回収した。前記得られた脾臓細胞１ｘ１０^８個と、骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）１×１０^８個を混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離された沈殿物を徐々に分散させ、培養培地（ＤＭＥＭ）に入っている４５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１ｍｌ）を処理し、３７℃で１分間維持させた後、培養培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを添加した。以降、培養培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌを１分間添加し、３７℃の水で５分間放置した後、５０ｍｌに合わせて再び遠心分離した。細胞沈殿物を分離培地（ＨＡＴ培地）で１〜２×１０^５／ｍｌ程度に再懸濁させ、９６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに０．１ｍｌずつ分注した後、３７℃の二酸化炭素培養器で培養して、ハイブリドーマ細胞群を作製した。

１．１．３．ｃ−Ｍｅｔ蛋白質に対する単クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選別
前記参考例１．１．２で製造されたハイブリドーマ細胞群のうち、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質にだけ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質とヒトのＦｃ蛋白質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法によってスクリ−ニングした。

マイクロタイタープレートに、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質を、１ウェルあたりそれぞれ５０μｌ（２μｇ／ｍｌ）ずつ加えてプレート表面に付着させ、反応しない抗原は洗浄して除去した。ｃ−ＭｅｔでないＦｃに結合される抗体を選別して除外させるために、ヒトのＦｃ蛋白質を、前記と同様の方法でプレート表面に付着させた。

前記参考例１．１．２で得られたハイブリドーマ細胞の培養液を、前記用意されたそれぞれのウェルに５０μｌずつ加えて１時間反応させた後、リン酸緩衝溶液−トゥイーン２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄し、反応しない培養液を除去した。これに、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ）を加えて、１時間、室温で反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。次に、ペルオキシダーゼの基質溶液（ＯＰＤ）を加えて反応させ、その反応の程度は、ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒで４５０ｎｍにおける吸光度を測定して確認した。

前記のような反応程度の確認によって、ヒトのＦｃには結合せず、ヒトのｃ−Ｍｅｔ蛋白質にだけ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を繰り返し選別した。繰り返し選別によって得られたハイブリドーマ細胞株を制限稀釈して、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株１個のクローンを最終的に得た。最終選別されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、２００９年１０月６日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である、大韓民国、ソウル、鍾路区、蓮建洞所在の韓国細胞株研究財団に寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０が付与された（韓国公開特許第２０１１−００４７６９８号参照）。

１．１．４．モノクローナル抗体の生産および精製
前記参考例１．１．３で得られたハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、培養液からモノクローナル抗体を生産精製した。

まず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含まれている培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍｌで培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳで２回以上洗浄し、ＦＢＳが除去された状態で、前記細胞沈殿物を培養培地（ＤＭＥＭ）培地５０ｍｌに再懸濁させた後、３日間、３７℃の二酸化炭素培養器で培養した。

以降、遠心分離して、抗体を生産する細胞を除去し、抗体の分泌した培養液を分離して、４℃に保管するか、直ちに集めて、抗体の分離精製に使用した。親和性カラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇａｇａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）を装着したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、前記用意された培養液５０ｍｌ〜３００ｍｌから抗体を純粋精製した後、蛋白質凝集用フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてＰＢＳで上層液を置換し、精製された抗体を保管し、後の実施例に使用した。

１．２．ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６の作製
一般に、マウス抗体は、治療目的でヒトに注入された時、免疫拒絶反応（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す可能性が高いことから、これを解決するために、前記参考例１．１．で作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から、抗原の結合に関連する可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を除いた不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を、ヒトＩｇＧ１抗体の配列に置換するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６を作製した。

重鎖に相当するヌクレオチド配列は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ’（配列番号３８）で、軽鎖に相当するヌクレオチド配列は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ’（配列番号３９）で構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３９）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、キメラ抗体の発現のため重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、臨時発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。使用された細胞株は２９３Ｆ ｃｅｌｌであり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。臨時発現１日前の細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、ｃｅｌｌ数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、臨時発現を進行させた。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を進行させ、１５ｍｌのｔｕｂｅに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。

以降、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳの添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳの添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄液をそれぞれ１００ｍｌ取って、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出させた。得られた溶出物をＰＢＳバッファーに交換し、最終的にキメラ抗体ＡｂＦ４６（以下、ｃｈＡｂＦ４６と名づける）を精製した。

１．３．キメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６からヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の作製
１．３．１．重鎖のヒト化（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｈｅａｖｙおよびＨ３−ｈｅａｖｙ２種のデザインのために、まず、Ｉｇ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通して、前記参考例１．２で精製されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖腺（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子を分析した。その結果、ＶＨ３−７１がアミノ酸レベルで８３％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＨ３−７１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この時、３０番（Ｓ→Ｔ）、４８番（Ｖ→Ｌ）、７３番（Ｄ→Ｎ）、７８番（Ｔ→Ｌ）のアミノ酸は、元々、マウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列にｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎした。以降、Ｈ１は、追加的に８３番（Ｒ→Ｋ）と８４番（Ａ→Ｔ）のアミノ酸に突然変異を与え、最終的にＨ１−ｈｅａｖｙ（配列番号４０）とＨ３−ｈｅａｖｙ（配列番号４１）を構築した。

Ｈ４−ｈｅａｖｙのデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調べた結果、ＡｂＦ４６抗体のマウスの骨格配列と配列が非常に類似すると同時に、従来の最も安定的と知られているＶＨ３サブタイプを用いて、Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を導入した。これにより、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）を構築した。

１．３．２．軽鎖のヒト化（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｌｉｇｈｔ（配列番号４３）およびＨ２−ｌｉｇｈｔ（配列番号４４）の２種のデザインのために、Ｉｇ Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルで７５％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１の骨格に導入されるようにデザインした。この時、Ｈ１−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆変異させ、Ｈ２−ｌｉｇｈｔは、４９番のアミノ酸（Ｙ→Ｉ）１個だけをｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎして構築した。

Ｈ３−ｌｉｇｈｔ（配列番号４５）のデザインのために、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した結果のうち、前記ＶＫ４−１のほか、ＶＫ２−４０を選定した。マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬとＶＫ２−４０は、アミノ酸レベルで６１％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１の骨格に導入されるようにデザインした。この時、Ｈ３−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆変異させて構築した。

Ｈ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）のデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調べた結果、従来の最も安定的と知られているＶｋ１ ｓｕｂｔｙｐｅを用いて、Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を導入した。この時、Ｈ４−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を追加的にｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎして構築した。

以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−ｈｅａｖｙ；配列番号４７、Ｈ３−ｈｅａｖｙ；配列番号４８、Ｈ４−ｈｅａｖｙ；配列番号４９）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔに前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−ｌｉｇｈｔ；配列番号５０、Ｈ２−ｌｉｇｈｔ；配列番号５１、Ｈ３−ｌｉｇｈｔ；配列番号５２、Ｈ４−ｌｉｇｈｔ；配列番号５３）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、臨時発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて進行した。使用された細胞株は２９３Ｆ ｃｅｌｌであり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。臨時発現１日前の細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、ｃｅｌｌ数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、臨時発現を進行させた。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を進行させ、１５ｍｌのｔｕｂｅに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのｔｕｂｅにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍのｉｎｃｕｂａｔｏｒで５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄液各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒに交換し、最終的にヒト化抗体ＡｂＦ４６（以下、ｈｕＡｂＦ４６と名づける）を精製した。一方、後の実施例で使用したヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の重鎖、軽鎖の組み合わせは、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）およびＨ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）である。

１．４．ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変部位および軽鎖可変部位を用いてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを作製するための遺伝子をデザインした。それぞれ重鎖可変部位および軽鎖可変部位を‘ＶＨ−リンカー−ＶＬ’の形態となるようにし、前記リンカーは‘ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ’（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するようにデザインした。このようにデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコーディングするポリヌクレオチド（配列番号５５）をバイオニアに依頼して合成し、これを発現させるためのベクターを配列番号５６に示した。

以降、前記ベクターから発現した結果物を分析し、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合力を示すことを確認した。

１．５．親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのライブラリー遺伝子の作製
１．５．１．標的ＣＤＲの選定およびプライマーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のために６つの相補性決定部位（ＣＤＲ）を、前記作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から‘Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ’によって定義した。それぞれのＣＤＲは下記の表２の通りである。

抗体ＣＤＲのランダム配列導入のために、次のようにプライマーを作製した。従来のランダム配列導入方式は、突然変異を与えようとする部位に同一の割合の塩基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が導入されるようにＮコドンを用いたが、本実施例では、ｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲにランダム塩基を導入するために、各ＣＤＲのアミノ酸をコーディングする３個の野生型ヌクレオチド中の１番目および２番目のヌクレオチドの８５％はそのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ導入する方式を採った。また、３番目のヌクレオチドは、同一に（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３％Ｔ）が導入されるようにプライマーをデザインした。

１．５．２．ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリーの作製およびｃ−Ｍｅｔに対する結合力の確認
ＣＤＲのランダム配列の導入による抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記参考例１．５．１のような方法で作製されたプライマーを用いて行った。鋳型としてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを用いて、図１に示す方法のように、２個のＰＣＲ切片を作製し、これを重複拡張重合酵素連鎖反応（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）方法により、所望のＣＤＲだけがそれぞれ突然変異したｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を確保して作製された６つのＣＤＲをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。

このように作製されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのｃ−Ｍｅｔに対する結合力を確認し、それぞれのライブラリーは、野生型に比べてｃ−Ｍｅｔに対する結合力が大部分低下する傾向を示したが、一部でｃ−Ｍｅｔに対する結合力が維持される突然変異を確認した。

１．６．作製されたライブラリーから親和度の改善された抗体の選別
前記構築されたライブラリーからｃ−Ｍｅｔに対するライブラリーの結合力を向上させた後、それぞれの個別クローンからｓｃＦｖの遺伝子配列を分析した。確保された遺伝子配列はそれぞれ下記の表３の通りであり、これをＩｇＧ形態に変換した。下記のクローンのうち、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３、Ｌ３−５から生産された４種の抗体を選別して後続の実験を行った。

１．７．選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ’（配列番号３８）で構成され、重鎖の場合、親和性の成熟後に、抗体のアミノ酸が変更されなかったので、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖をそのまま使用した。ただし、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１のヒンジでないＵ６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５７）に置換した。軽鎖は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ’で構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成し、親和性の成熟後に、選別された前記４種の抗体の軽鎖可変部位を含んでコードするポリヌクレオチド（配列番号５８〜配列番号６１）をバイオニアに依頼して合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｌ３−１由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５８、Ｌ３−２由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５９、Ｌ３−３由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６０、Ｌ３−５由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６１）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、親和性の成熟した抗体の発現のためのベクターを構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、臨時発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて進行した。使用された細胞株は２９３Ｆ ｃｅｌｌであり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。臨時発現１日前の細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、臨時発現を進行させた。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を進行させ、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意し、ＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄液各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒに交換し、最終的に親和力の成熟した４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｌ３−１由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２（Ｌ３−２由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３（Ｌ３−３由来）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５（Ｌ３−５由来）と名づける）を精製した。

１．８．不変領域および／またはヒンジ領域の置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の製造
前記参考例１．７で選別された４種の抗体のうち、ｃ−Ｍｅｔとの結合親和性が最も高く、Ａｋｔのリン酸化およびｃ−Ｍｅｔの分解の程度が最も低いと測定されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１を対象に、ヒンジ領域または不変領域およびヒンジ領域の置換された抗体を作製した。

ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトのカッパ（ｋａｐｐａ）不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）；ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）；ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなる重鎖、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）とそれぞれ名づけた。また、一方、前記３種の抗体は、生産量増大のために、ヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖の３６番のヒスチジン（Ｈｉｓ）をすべてチロシン（Ｔｙｒ）に置換した。

前記３種の抗体を作製するために、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６３）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６５）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなるポリペプチド（配列番号６６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６７）、３６番のヒスチジンがチロシンに置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトのカッパ不変領域からなるポリペプチド（配列番号６８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６９）をバイオニアに依頼して合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔに前記重鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を挿入して、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｃａｔ ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、臨時発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて進行した。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。臨時発現１日前の細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、臨時発現を進行させた。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を進行させ、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭ ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上澄液各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒに交換し、最終的に３種の抗体（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ））を精製した。このうち、本発明にかかる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を代表してｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）を選択して下記の実施例に使用し、便宜上、前記抗体をＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２と名づけた。

実施例１：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の作製１
前記参考例１で作製されたＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のｃ−末端に４種の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ（配列番号１０９、１１０、１１１、および１１２）をそれぞれ融合させ、４種の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ融合体（抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質）を作製した（図３参照）。Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２抗体の重鎖と抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、１０個のアミノ酸で構成された‘ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ’（Ｇ４Ｓ）２リンカーを用いて‘Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２重鎖−（Ｇ４Ｓ）２−抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ’の形態で作製した。

前記４種の抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質に対してＢｉａｃｏｒｅによる親和度確認試験（下記の実施例２を参照）を行い、このうち、最も高い親和度でＥＧＦＲ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）に結合する１種を選抜し、これをＭＥ−１９（Ｅ０１ＤＡＲＰｉｎ（配列番号１０９）を含む）と名づけた。

実施例２：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の物性およびＥＧＦＲの親和度
前記実施例１で製造されたＭＥ−１９二重抗体の物性を調べるために、前記抗体を精製し、ＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｈｏ）が装着されたＨＰＬＣ装備（ＷＡＴＥＲＳ２６９５）に、２０ｕｇの抗体を０／５ｍｌ／ｍｉｎの速度で注入し、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。

前記結果を図４に示した。図４において、「１」は可溶性ダイマー（ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｍｅｒ）に対するピーク定量値、「２」はモノマーに対するピーク定量値を示す。図４から明らかなように、前記選抜されたＭＥ−１９は、可溶性ダイマーの形成が非常に少ないことが（＜１）観察され、非常に安定した分子であることが分かる。

前記作製されたＭＥ−１９二重抗体（抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質）の２種の抗原（ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ）に対する各親和度を、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥ）を用いて確認した。ヒトＦａｂ結合剤（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５チップ（＃ＢＲ−１００５−３０、ＧＥ）の表面に製造会社の説明書に従って固定化させた。約９０〜１２０ＲＵのＭＥ−１９二重抗体を捕獲し、多様な濃度のＥＧＦＲ−Ｆｃ（＃３４４−ＥＲ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を前記捕獲された抗体に注入した。これに、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）溶液を注入して前記表面を再生させた（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）。親和度を測定するために、前記実験から得られたデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフィッティングした。

前記得られた結果を表４に示した。

表４から確認されるように、前記実施例１で作製された二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて測定時、ＥＧＦＲに対してＫＤ＝０．３５ｎＭの非常に高い親和度を保有することが明らかになった。

実施例３：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質のＥＧＦ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ試験
前記実施例１で作製された二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９のＥＧＦの競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）の可否を確認するために、ＥＬＩＳＡ法を利用した競合アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を実施した。９６−ｗｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に０．２５ｕｇ／ｗｅｌｌのＥＧＦＲ（＃３４４−ＥＲ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をコーティングした後、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＥＧＦ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と順次に希釈したＭＥ−１９を混合して分注し、常温で２時間反応させた。前記反応物を０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、これに、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されている抗−ストレプトアビジン抗体（＃２１１４０、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ｗｅｌｌに分注し、常温で１時間反応させた。前記と同様に洗浄した後、発色反応を誘導するために、ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各ｗｅｌｌに分注した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。比較のために、二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９の代わりに、Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて、同様の方法で試験を行った。

前記測定結果を図５に示した。図５のように、前記二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９がＥＧＦに対して競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）することを確認した。従来の抗体であるＥｒｂｉｔｕｘと比較した時、ＭＥ−１９は、ＥＧＦがＥＧＦＲに結合されることを比較的に弱く妨害する。

実施例４：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質のＥＧＦＲのリン酸化阻害効果試験
前記実施例１で作製された二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９のＥＧＦＲのリン酸化阻害効果を確認するために、ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａであるＡ４３１細胞株においてｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦＲ測定実験を実施した。９６−ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルの量でＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ）を分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。前記培養した細胞から培地を除去した後、無血清培地（＃３０−２００２、ＡＴＣＣ）を分注して１８時間培養した。前記培養した細胞に二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９を５ｕｇ／ｍｌの濃度で分注して３０分間培養後、２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加して３０分間さらに培養した。培養が終わった細胞は溶解した後、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、前記二重特異キメラ蛋白質によるＥＧＦＲのリン酸化の程度を測定した。比較のために、二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９の代わりに、Ｅｒｂｉｔｕｘ（＃ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ）（陽性対照群）を用いて、同様の方法で試験を行った。

前記得られた結果を図６に示した。図６において、ｍｅｄｉａで記載された結果は、何ら抗体も処理しない場合の結果である。図６のように、ｃ−Ｍｅｔの発現が低いＡ４３１細胞において、ＭＥ−１９の場合、特異にも、ｎａｔｕｒａｌ ＥＧＦを処理する場合（ｍｅｄｉａ）よりも多くＥＧＦＲのリン酸化を増加させることが明らかになった。このような結果は、ＭＥ−１９がＡ４３１細胞にＥＧＦＲを過リン酸化（ｈｙｐｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）させてＥＧＦＲシグナル伝達経路を撹乱させることを示唆する。

実施例５：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の細胞増殖阻害効果試験
前記実施例１で作製された二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９の癌細胞増殖阻害効果の試験を行うために、ＳＮＵ５細胞株（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ Ｎｏ．００００５）、ＭＫＮ４５細胞株（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ Ｎｏ．８０１０３）、Ｈ１９９３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５９０９）、およびＡ４３１細胞株（ＡＴＣＣ）に対する細胞増殖阻害効果の試験を行った。

すべての細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０培地（＃１１８７５−０９３、Ｇｉｂｃｏ）に１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加し、５％ＣＯ_２および３７℃の条件で培養した。細胞増殖分析（Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）のために、各細胞株を１×１０^４ｃｅｌｌ／ウェルの濃度で９６ウェルプレートで継代培養しながら、実施例１で作製された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質ＭＥ−１９を５ｕｇ（ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）／ｍｌの量で処理し、７２時間培養した。陰性対照群として抗体を添加しない培地を使用し、陽性対照群として市販中のＥＧＦＲ阻害剤であるＥｒｌｏｔｉｎｉｂ（Ｅｒで表示；＃Ｓ１０２３、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ；２ｕＭ（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ））、Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｅｂｔで表示；＃ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ；５ｕｇ／ｍｌ）、参考例１で作製されたＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２抗体５ｕｇ／ｍｌ、および参考例１で作製されたＬ３−１Ｙ抗体とＥｒｂｉｔｕｘとの併用処理した群をそれぞれ使用した。

培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８ ａｓｓａｙ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、製造会社の指示に従って細胞増殖の程度を分析した。簡略に説明すれば、７２時間培養後、ＣＣＫ８ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ｕｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）ずつ、各ｗｅｌｌに添加して２．５時間を追加培養した後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を読み出した。

前記得られた結果を、図７（ＳＮＵ５）、図８（ＭＫＮ４５）、図９（Ｈ１９９３）、および図１０（Ａ４３１）にそれぞれ示した。図７および図１０において、コントロールは抗体を処理しない培地であり、図８および図９のＹ軸のＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘはＣＣＫ８で測定した細胞増殖数値を意味する。図７〜図９のように、ＭＥ−１９は、ｃ−Ｍｅｔが過発現するＳＮＵ５およびＭＫＮ４５のような胃癌細胞とｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲがすべて過発現するＨ１９９３細胞において、いずれもＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２およびＥｒｂｉｔｕｘの単独投与および併用投与時より優れた抗癌効能を示すことが確認された。また、図１０のように、ＭＥ−１９は、ｃ−Ｍｅｔの発現が低いＡ４３１細胞において、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２の単独投与時より優れた抗癌効能を示す。

実施例６：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質によるｃ−ＭｅｔとＥＧＦＲのＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ
ＭＫＮ４５胃癌細胞株（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ Ｎｏ．８０１０３）を４Ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの量で用意し、これに、参考例１で用意したＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（＃ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ）、および実施例１で作製されたＭＥ−１９を、それぞれ単独処理または併用処理の方法で、各ウェルあたり１ｕｇ／ｍｌの濃度となるように（併用処理の場合、それぞれ１ｕｇ／ｍｌとなるように）添加し、２時間、３７℃でインキュベーティングした。これに、４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを１５分間処理して細胞をプレートに固定させ、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ブロッキングバッファー（０．５％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００ ａｎｄ ５％（ｖ／ｖ）ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ）を常温で１時間処理した後、ｃ−ＭｅｔおよびＥＧＦＲに対する一次抗体（ｃ−Ｍｅｔ一次抗体；＃ＦＡＢ３５８２Ａ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＥＧＦＲ一次抗体；＃５６１６、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１：１００に希釈し、１００μｌの量で、１５時間、４℃で処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体（＃Ａ２１４３３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２０００に希釈し、１００ｕｌの量で、１時間、常温で処理し、再びＰＢＳで３回洗浄して、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（＃Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ）としてｐｌａｔｅを用意した。前記用意された細胞を、Ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ７１０）で細胞を観察した。

前記得られた結果を図１１に示した。図１１に示されているように、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２を単独処理した場合、ｃ−Ｍｅｔだけが細胞内に移動し、ＥＧＦＲは、相変わらず細胞膜に位置するのに対し、ＭＥ−１９を処理する場合には、ｃ−ＭｅｔとＥＧＦＲがいずれも細胞内に移動することを確認することができる。

前記結果をまとめると、ＤＡＲＰｉｎが適用されたＭＥ−１９は、従来のＥＧＦＲ阻害抗体とは異なるメカニズムによってＥＧＦＲの機能を阻害すると見られる。

実施例７：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質による標的受容体の発現量の減少
抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質による標的受容体であるｃ−ＭｅｔとＥＧＦＲの発現量の減少を確認するために、ヒトの胃癌細胞株であるＭＫＮ４５（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ Ｎｏ．８０１０３）とＳＮＵ６３８（ＡＴＣＣ）を、２ｘ１０^３ｃｅｌｌ／ウェルの量で９６ウェルプレートに継代培養しながら、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２、Ｅｒｂｉｔｕｘ、およびＭＥ１９をそれぞれ５ｕｇ／ｍｌの量で処理して２４時間培養した。陰性対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）として抗体を添加しない培地を使用した。培養後、細胞をＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｌｙｓｉｓ−Ｍ（＃０４７１９９５６００１、Ｒｏｃｈｅ）で溶解した後、細胞溶解物を収集した。ｃ−Ｍｅｔの発現量測定のために、Ｔｏｔａｌ ｃＭｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＤＹＣ３５８Ｅ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＥＧＦＲの発現量測定のために、Ｔｏｔａｌ ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（＃７２９７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を製造会社の指示に従って使用した。

前記得られた結果を図１２に示した。図１２に示されているように、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２とＭＥ１９は、陰性対照群に比べてｃ−Ｍｅｔの発現量を顕著に減少させた。Ｅｒｂｉｔｕｘは、ＥＧＦＲの発現量に影響を与えないのに対し、ＭＥ１９は、ｃ−Ｍｅｔの発現量（上段参照）だけでなく、ＥＧＦＲの発現量（下段参照）も顕著に減少させることが分かる。

実施例８：抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の作製
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）のｃ−末端に抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ（配列番号１０９）を融合させ、抗ＨＥＲ２抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ融合体（抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質）を作製した（図１４参照）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体の重鎖と抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、１０個のアミノ酸で構成された‘ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ’（Ｇ４Ｓ）２リンカーを用いて連結し、‘Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ重鎖−（Ｇ４Ｓ）２−抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ’の形態で作製した。

前記作製された抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質をＨ２Ｅ−０１と名づけた。

実施例９：抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の物性およびＥＧＦＲの親和度
前記実施例８で製造された抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体Ｈ２Ｅ−０１の物性を調べるために、前記抗体を精製し、ＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｈｏ）が装着されたＨＰＬＣ装備（ＷＡＴＥＲＳ２６９５）に、２０μｇの抗体を０／５ｍｌ／ｍｉｎの速度で注入し、ＨＰＬＣを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。

前記結果を図１４に示した。図１４において、「１」は可溶性ダイマー（ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｍｅｒ）に対するピーク定量値、「２」はモノマーに対するピーク定量値を示す。図１４から明らかなように、前記抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異抗体Ｈ２Ｅ−０１は、実施例１で作製されたＭＥ−１９の場合と同様に、可溶性ダイマーの形成が非常に少ないことが（＜１）観察され、非常に安定した分子であることが分かる。

前記作製された抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体の２種の抗原（ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ）に対する各親和度を、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥ）を用いて確認した。ヒトＦａｂ結合剤（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＣＭ５チップ（＃ＢＲ−１００５−３０、ＧＥ）の表面に製造会社の説明書に従って固定化させた。約９０〜１２０ＲＵの二重抗体を捕獲し、多様な濃度のＥＧＦＲ−Ｆｃ（＃３４４−ＥＲ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を前記捕獲された抗体に注入した。これに、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）溶液を注入して前記表面を再生させた（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）。親和度を測定するために、前記実験から得られたデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフィッティングした。

前記得られた結果を表５に示した。

表５から確認されるように、前記実施例８で作製された二重特異キメラ蛋白質は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて測定時、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に対して、ＫＤ＝０．０３または＜０．０１ｎＭの非常に高い親和性を保有することが明らかになった。

実施例１０：抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質の細胞増殖阻害効果試験
前記実施例８で作製された二重特異キメラ蛋白質Ｈ２Ｅ−０１の癌細胞増殖阻害効果の試験を行うために、ＭＫＮ４５細胞株（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ Ｎｏ．８０１０３）に対する細胞増殖阻害効果の試験を行った。

ＭＫＮ４５細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０培地（＃１１８７５−０９３、Ｇｉｂｃｏ）に１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加し、５％ＣＯ_２および３７℃の条件で培養した。細胞増殖アッセイのために、各細胞株を、１×１０^４ｃｅｌｌ／ウェルの濃度で９６ウェルプレートで継代培養しながら、実施例８で作製された抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質を５μｇ／ｍｌの量で処理し、７２時間培養した。陰性対照群として抗体を添加しない培地を使用し、陽性対照群として市販中のＥＧＦＲ阻害剤のＥｒｂｉｔｕｘ（＃ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ；５ｕｇ／ｍｌ）、ＨＥＲ２阻害剤のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｏｃｈｅ；５ｕｇ／ｍｌ）、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体とＥｒｂｉｔｕｘ抗体との併用処理した群をそれぞれ使用した。

培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８ ａｓｓａｙ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、製造会社の指示に従って細胞増殖の程度を分析した。簡略に説明すれば、７２時間培養後、ＣＣＫ８ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ｕｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）ずつ、各ｗｅｌｌに添加して２．５時間を追加培養した後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を読み出した。

前記得られた結果を図１５に示した。図１５のように、抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体は、ＭＫＮ４５のような胃癌細胞においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＥｒｂｉｔｕｘの単独投与および併用投与時より優れた抗癌効能を示すことが確認された。

実施例１１：抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質によるＨＥＲ２およびＥＧＦＲのＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ
ＭＫＮ４５胃癌細胞株（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ Ｎｏ．８０１０３）を４Ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの量で用意し、これに、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（＃ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ）、および実施例８で作製された抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体Ｈ２Ｅ−０１を、それぞれ単独処理または併用処理の方法で、各ウェルあたり１μｇ／ｍｌの濃度となるように（併用処理の場合、それぞれ１μｇ／ｍｌとなるように）添加し、２時間、３７℃でインキュベーティングした。これに、４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを１５分間処理して細胞をプレートに固定させ、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ブロッキングバッファー（０．５％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００および５％（ｖ／ｖ）ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ）を常温で１時間処理した後、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲに対する一次抗体（ＨＥＲ２一次抗体：＃２８０００３Ｚ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＥＧＦＲ一次抗体：＃５６１６、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１：１００に希釈し、１００μｌの量で、１５時間、４℃で処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体（＃Ａ２１４３３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２０００に希釈し、１００ｕｌの量で、１時間、常温で処理し、再びＰＢＳで３回洗浄し、ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（＃Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ）としてｐｌａｔｅを用意した。前記用意された細胞を、Ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ７１０）で細胞を観察した。

前記得られた結果を図１６に示した。図１６に示されているように、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎとＥｒｂｉｔｕｘの併用処理した場合、ＥＧＦＲとＨＥＲ２が相変わらず細胞膜に位置しているのに対し、二重抗体を処理する場合には、ＥＧＦＲとＨＥＲ２が細胞内に移動することを確認することができる。

前記結果をまとめると、ＤＡＲＰｉｎが適用された抗ＨＥＲ２／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体は、従来のＥＧＦＲまたはＨＥＲ２阻害抗体とは異なるメカニズムによってＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の機能を阻害すると見られる。

実施例１２：抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ融合体
抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体ＲＧ−７５９７のｃ−末端に抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ（配列番号１０９）を融合させ、抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ融合体（抗ＨＥＲ３／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質）を作製した（図１７参照）。ＲＧ−７５９７抗体の重鎖とＤＡＲｐｉｎは、１０個のアミノ酸で構成された‘ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ’（Ｇ４Ｓ）２リンカーを用いて、‘ＲＧ−７５９７重鎖−（Ｇ４Ｓ）２−抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ’の形態で作製した。前記抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体ＲＧ−７５９７は、次のような重鎖可変部位（配列番号１１７）および軽鎖可変部位（配列番号１１８を有するもので、ＩｇＧ１Ｆｃを用いて作製した。

＜抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体の重鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＧＤＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＜抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体の軽鎖可変部位のアミノ酸配列＞（配列番号１１８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＩＡＴＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＥＰＥＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
前記製造された抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ融合体をＥＨ３Ｅ−０１と名づけた。

このように製造された抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体ＥＨ３Ｅ−０１の物性を調べるために、前記抗体を精製し、ＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｈｏ）が装着されたＨＰＬＣ装置（ＷＡＴＥＲＳ２６９５）に、２０μｇの抗体を０／５ｍｌ／ｍｉｎの速度で注入し、ＨＰＬＣを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。

前記結果を図１８に示した。図１８において、「１」は可溶性ダイマー（ｓｏｌｕｂｌｅｄｉｍｅｒ）に対するピーク定量値、「２」はモノマーに対するピーク定量値を示す。図１８から明らかなように、前記製造された抗体ＥＨ３Ｅ−０１は、実施例１で作製されたＭＥ−１９の場合と同様に、可溶性ダイマーの形成が非常に少ないことが（＜１％）観察され、非常に安定した分子であることが分かる。

実施例１３：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重特異キメラ蛋白質の作製２
前記参考例１で作製された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のｃ−末端に２個の抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ−０１：配列番号１０９；ＤＡＲＰｉｎ−６９：配列番号１１２）を融合させ、ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎがＩｇＧタイプの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の各ダイマーのｃ−末端に２個ずつ結合された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ融合体（抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質）を作製した（図１９参照）。Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２抗体の重鎖とＤＡＲｐｉｎ−０１は、１０個のアミノ酸で構成された‘ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ’（Ｇ４Ｓ）２リンカーを用いて連結し、ＤＡＲＰｉｎ−０１とＤＡＲＰｉｎ−６９も、１０個のアミノ酸で構成された‘ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ’（Ｇ４Ｓ）２リンカーを用いて連結した。したがって、最終形態は、‘Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２重鎖−（Ｇ４Ｓ）２−抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ−０１−（Ｇ４Ｓ）２−抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ−６９’の形態である。

このように製造された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異キメラ蛋白質をＭＥ−２８と名づけた。

このように製造された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体の物性を調べるために、前記抗体を精製し、ＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｈｏ）が装着されたＨＰＬＣ装置（ＷＡＴＥＲＳ２６９５）に、２０μｇの抗体を０／５ｍｌ／ｍｉｎの速度で注入し、ＨＰＬＣを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。

前記結果を図２０に示した。図２０において、「１」は可溶性ダイマー（ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｍｅｒ）に対するピーク定量値、「２」はモノマーに対するピーク定量値を示し、‘３’と‘４’はそれぞれ、分解された二重抗体断片を示すと推定される。図２０から明らかなように、前記選抜された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、実施例１で作製されたＭＥ−１９の場合とは異なり、可溶性ダイマーまたは多重体の形成が増加することが（＞５）観察され、反面、親和性は増加することが観察された。

前記作製された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ二重抗体のＥＧＦＲに対する親和度を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ）を用いて確認した。ヒトＦａｂ結合剤（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＣＭ５チップ（＃ＢＲ−１００５−３０、ＧＥ）の表面に製造会社の説明書に従って固定化させた。約９０〜１２０ＲＵの二重抗体を捕獲し、多様な濃度のＥＧＦＲ−Ｆｃ（＃３４４−ＥＲ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を前記捕獲された抗体に注入した。これに、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）溶液を注入して前記表面を再生させた（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）。親和度を測定するために、前記実験から得られたデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフィッティングした。

前記得られた結果を表６に示した。

表６から確認されるように、前記作製された二重特異キメラ蛋白質は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて測定時、ＥＧＦＲに対してＫＤ＜０．０１ｎＭが非常に高い親和度を保有することが明らかになった。

Claims (16)

1. 抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および
   前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎに連結されたＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片、またはこれらの組み合わせを含み、
   前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片は配列番号７１のアミノ酸配列中の配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続した５〜１９個のアミノ酸からなるエピトープに結合する、二重特異キメラ蛋白質。
2. 前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、配列番号１０９のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１１のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および配列番号１１２のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎからなる群より選択された１種以上が１個または２個〜１０個繰り返された形態である、請求項１に記載の二重特異キメラ蛋白質。
3. 前記ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片は、
   配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続した８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続した６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または前記１つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
   配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
   前記重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
   前記重鎖可変部位および軽鎖可変部位の組み合わせを含むものである、請求項１または２に記載の二重特異キメラ蛋白質。
4. 前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列、および配列番号２４のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列、および配列番号２６のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列、および配列番号８５のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、および配列番号１０６のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１のアミノ酸配列、配列番号３４のアミノ酸配列、配列番号３５のアミノ酸配列、および配列番号３６のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり、
   前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号１６のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、および配列番号８９のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものである、請求項３に記載の二重特異キメラ蛋白質。
5. 前記ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片は、
   配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変部位、
   配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、または配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部位、または
   前記重鎖可変部位と軽鎖可変部位の組み合わせを含むものである、請求項３に記載の二重特異キメラ蛋白質。
6. 前記ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
   配列番号６２のアミノ酸配列、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４のアミノ酸配列、配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、配列番号６６のアミノ酸配列、および配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖；および
   配列番号６８のアミノ酸配列、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、配列番号７０のアミノ酸配列、配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、および配列番号１０８のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものである、請求項１または２に記載の二重特異キメラ蛋白質。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異キメラ蛋白質を含む、医薬組成物。
8. 癌の予防または治療のためのものである、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含み、
   前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片は配列番号７１のアミノ酸配列中の配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続した５〜１９個のアミノ酸からなるエピトープに結合する、二重特異キメラ蛋白質の製造方法。
10. 前記ＤＡＲＰｉｎは、配列番号１０９のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１１のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および配列番号１１２のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎからなる群より選択された１種以上が１個または２個〜１０個繰り返された形態である、請求項９に記載の二重特異キメラ蛋白質の製造方法。
11. 前記ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片は、
    配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続した８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続した６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または前記１つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
    配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
    前記重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
    前記重鎖可変部位および軽鎖可変部位の組み合わせを含むものである、請求項１０に記載の二重特異キメラ蛋白質の製造方法。
12. 抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎを、ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片、またはこれらの組み合わせに連結させる段階を含み、
    前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片は配列番号７１のアミノ酸配列中の配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続した５〜１９個のアミノ酸からなるエピトープに結合する、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能増進方法。
13. 前記抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎは、配列番号１０９のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１０のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、配列番号１１１のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ、および配列番号１１２のアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎからなる群より選択された１種以上が１個または２個〜１０個繰り返された形態である、請求項１２に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能増進方法。
14. 前記ＩｇＧ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体断片は、
    配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続した８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続した６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、または前記１つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
    配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
    前記重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
    前記重鎖可変部位および軽鎖可変部位の組み合わせを含むものである、請求項１２または１３に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能増進方法。
15. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異キメラ蛋白質をコードする、核酸分子。
16. 請求項１５に記載の核酸分子を含む、細胞。