JP6364484B2 - 神経保護剤としてのＥｐｈＡ４阻害剤 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１３年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８４７，４３２号に対する優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が組み込まれる。

認知低下を特徴とするアルツハイマー病（ＡＤ）は、シナプス不全の疾患として出現した。本発明者らは、受容体チロシンキナーゼＥｐｈＡ４がＡＤにおける海馬シナプス機能不全を媒介するために重要であり、かつＥｐｈＡ４シグナル伝達の特異的阻害がＡＤマウスモデルにおいてシナプス障害を逆転させることを発見した。強化されたＥｐｈＡ４シグナル伝達は、ＡＤトランスジェニックマウスの海馬において観察され、ＡＤにおけるシナプス喪失に貢献すると考えられる可溶性アミロイド−βペプチドオリゴマー（Ａβ）は、ラット海馬スライスにおいてＥｐｈＡ４活性化を誘発した。ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用の遮断は、興奮性シナプス伝達においてＡβ誘発性欠陥を阻害した。さらに、海馬のＣＡ１領域内のＥｐｈＡ４レベルの減少またはＥｐｈＡ４機能の妨害は、ＡＤトランスジェニックマウスにおいて海馬長期増強（ＬＴＰ）の抑制を逆転させることが観察された。重要なことに、本発明者らは、小分子リンコフィリン（Ｒｈｙ）を、ニューロン内のＥｐｈＡ４依存性シグナル伝達を効果的に廃止した候補ＥｐｈＡ４阻害剤として特定した。Ｒｈｙのインビボ投与は、ＡＤマウスモデルにおいて正常なＬＴＰを回復させ、病状を軽減させた。さらに、Ｒｈｙの種々の化学誘導体が合成され、Ｒｈｙと比べてＥｐｈＡ４阻害剤と同等または強化された活性を有することが示された。まとめると、本発明者らによる発見は、ＡＤと関連するシナプス機能不全を媒介すること、ならびにＥｐｈＡ４シグナル伝達によって引き起こされるか、または悪化する他の神経変性障害における、ＥｐｈＡ４の今まで知られていなかった役割を明らかにする。これらの発見は、この性質の疾患の治療のための新たな治療手法を示す。

第１の態様では、本発明は、特に過度に活性化したＥｐｈＡ４シグナル伝達の場合に、ＥｐｈＡ４シグナル伝達によって引き起こされるか、または悪化する疾患もしくは状態を治療するための新規の方法を提供する。神経変性障害を含む種々の疾患及び状態、例えば、アルツハイマー病、脊髄損傷、パーキンソン病、頭部損傷（例えば、外傷性脳損傷）、末梢神経再生、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、多くの場合、ルー・ゲーリック病と呼ばれる）、脳卒中、聴覚障害、多発性硬化症、気分障害、種々の種類の癌等のアミロイドβ誘発性神経障害は、過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わることが知られている。ＥｐｈＡ４シグナル伝達を阻害する任意の化合物は、これらの疾患を治療してそれらの症状を軽減する目的で使用することができる。例えば、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの間の特異的結合を妨害及び阻害する化合物は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤として機能することができ、したがってこの特定の治療目的に有用であり得る。多くの場合、この種の阻害剤は、ＥｐｈＡ４またｈＥｐｈＡ４リガンドのいずれかに対する競合的結合を通じて作用し、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの間の結合を崩壊及び減少させる。別の例として、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでＥｐｈＡ４またはそのリガンドの発現を抑制することができる化合物も、ＥｐｈＡ４シグナル伝達を低減することによってそのような神経変性疾患を治療する目的に有用である。場合によっては、リンコフィリン（またはＲｈｙ）、ＫＹＬペプチド（ＫＹＬＰＹＷＰＶＬＳＳＬ、Ｍｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３ Ｄｅｃ；２４（４）：１０００−１０１１）、ＡＰＹペプチド（ＡＰＹＣＶＹＲＲＧＳＷＳＣ）及びＶＴＭペプチド（ＶＴＭＥＡＩＮＬＡＦＰＧ）（いずれもＷＯ２００４／０２８５５１に記載される）、Ｃｐｄ１及びＣｐｄ２（Ｎｏｂｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２４；２８３（４３）：２９４６１−２９４７２に記載される２つの異性体２，５−ジメチルピロリル安息香酸誘導体）等の既知のＥｐｈＡ４阻害剤を、この治療目的で使用することができる。

リンコフィリン（Ｒｈｙ）は、種々の文献に記載されており、例えば、Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３ Ｊｕｌｙ；３６（７）：５７０−５７９、及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ ８５（２０１３）：１２５−１２９を参照されたい。その化学名は、メチル（７β，１６Ｅ，２０α）−１６−（メトキシメチレン）−２−オキソコリノキサン−１７−オエートである。その分子式は、Ｃ_２２Ｈ_２８Ｎ_２Ｏ_４であり、その化学式は、次のとおりである。

Ｒｈｙは、過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患及び状態を治療するためのＥｐｈＡ４シグナル伝達の阻害剤として有用である。イソリンコフィリン（ＩｓｏＲｈｙ）も、ある特定の神経保護活性を呈する化合物として報告されたが、本発明者らは、ＩｓｏＲｈｙがＥｐｈＡ４シグナル伝達を阻害する際に不活性であることを見出した。したがって、ＩｓｏＲｈｙは、本発明における使用を意図しない。

Ｒｈｙの他に、ＥｐｈＡ４シグナル伝達のいくつかの他の阻害剤、例えば、ＫＹＬペプチド、ＡＰＹペプチド、及びＶＴＭペプチド（Ｍｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，上記）、化合物１及び化合物２（Ｎｏｂｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，上記）、ならびに非クラスタ化エフリン−Ａ５−Ｆｃ及びＥｐｈＡ４−Ｆｃ（Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ６，ｅ２４６３６，２０１１）が知られている。ＥｐｈＡ４シグナル伝達の追加の小分子阻害剤は、Ｖａｎ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，４７（１）：４９３−５００、及びＰａｒｍｅｎｔｉｅｒ−Ｂａｔｔｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１１，１１８（６）：１０１６−１０３１）に記載されている。これらの既知の阻害剤のそれぞれは、ＥｐｈＡ４阻害剤としてのそれらの共有する機能的役割に起因して、本発明の特許請求される方法による使用に有効であるが、本発明のいくつかの実施形態では、本発明の特許請求される方法で使用されるＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤は、Ｒｈｙではなく、別の阻害剤である。場合によっては、ＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤は、ＫＹＬ、ＡＰＬ、またはＶＴＭペプチドではなく、別の阻害剤である。場合によっては、ＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤は、Ｃｐｄ１またはＣｐｄ２ではなく、別の阻害剤である。場合によっては、本発明の特許請求される方法で使用されるＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤は、上で指名されたものを含む、既知のＥｐｈＡ４阻害剤のうちのいずれとも異なる、ＥｐｈＡ４阻害剤として新たに特定された化合物である。そのような新たな化合物は、例えば、コリリン及びデンドロビン（本開示の実施例２に記載される）、ならびにＣｐｄ１から修飾された化合物（例えば、本開示の実施例３に記載される化合物６、１４、及び２１）を含むが、本明細書に記載されるものに限定されない。

これらのＥｐｈＡ４阻害剤は、それらが既知であるか、または新たに特定されたかにかかわらず、過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患または状態を治療する目的に有用であり、アルツハイマー病及びアミロイドβ誘発性神経毒性によって引き起こされる他の疾患を含む。しかしながら、本発明を実施する目的で、既知のＥｐｈＡ４阻害剤のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせは、いくつかの実施形態において、実践の範囲から除外され得る。

第２の態様では、本発明は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４シグナル伝達に対して少なくとも同等であり、多くの場合より強力な阻害活性を有するＲｈｙの化学誘導体である新規の化合物を提供する。新規の化合物は、一般に、式Ｉの構造

、またはその薬学的に許容される塩を有すると記載され、式中、各Ｒ^１が、独立して、水素及びアルキルからなる群から選択されるメンバーであり、各Ｒ^２が、独立して、水素及びアシルからなる群から選択されるメンバーであり、各Ｒ^ｑが、独立して、電子対、低級アルキル、アリル、及びアリールメチルからなる群から選択されるメンバーであり、Ｌが、結合、アルキレン、及びアリールアルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、Ｘが、結合、−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（Ｒ^４）−からなる群から選択され、Ｌが結合である場合、Ｘも結合であり、Ｒ^３が、水素、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、アシルアルキル、（Ｒ^４）_２Ｎ−アルキレン、及び

からなる群から選択され、
Ｌが結合である場合、Ｒ^３が、水素、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、及びアシルアルキルからなる群から選択され、Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ^４）−である場合、Ｒ^３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アロイルメチル、アシル、アシルアルキル、及び（Ｒ^４）_２Ｎ−アルキレンからなる群から選択され、かつ各Ｒ^４が、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、及びアシルメチルからなる群から選択される。一般に、そのようなＲｈｙ誘導体は、それ自体がＲｈｙではなく、その塩でもない。これらのＲｈｙ誘導体の例示の化合物は、表１〜３に提供される。過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患及び状態を治療する目的に有用なＲｈｙの化学誘導体は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達に対するそれらの阻害活性及びアルツハイマー病等の状態を治療する際の治療効果を検証するために、典型的に最初に合成され、次に関連する研究分野において既知であるか、または本明細書に記載される１つ以上の機能アッセイ（例えば、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイ、ＥｐｈＡ４依存性成長円錐崩壊アッセイ、またはさらにはＡＰＰ／ＰＳ１及びＡＰＰ変異マウスモデルにおいて）で試験される。

さらに、本発明は、上で指名された疾患及び状態を含むがこれらに限定されない、過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患または状態、特に斑または凝集体形成に関わるもの（例えば、アルツハイマー病等のアミロイドβ関連神経変性障害）を治療する目的に有用な薬学的組成物も提供する。アルツハイマー病に加えて、ＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤を含む（本明細書に開示されるＲｈｙ誘導体を含む）薬学的組成物は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、癌、及び脊髄損傷等の疾患及び障害を治療するために使用されてよく、それらの全ては、ＥｐｈＡ４によって媒介される過剰活性化または過剰細胞内シグナル伝達の成分を有する。アミロイドβ関連神経変性障害は、アミロイド斑の存在が障害の発症及び／または進行に貢献する、神経変性障害である。そのような障害の一例は、アルツハイマー病である。本発明のいくつかの実施形態では、従来の定義の運動ニューロン障害は、「アミロイドβ関連神経変性障害」のクラスから除外される。

本組成物は、典型的に、活性成分としてのＥｐｈＡ４シグナル伝達の阻害剤と、薬学的または生理学的に許容される賦形剤と、を含む。多くの場合、ＥｐｈＡ４阻害剤は、そのような治療を必要とする患者に対して好ましい送達形態、例えば、経口投与または注入のために製剤化される。さらに、コリリン及びデンドロビン等のＥｐｈＡ４阻害剤は、ある特定の薬用植物中に見られるため、ＥｐｈＡ４阻害剤（複数可）を含む活性成分を含有するそのような植物の抽出物は、本明細書に記載されるような治療目的で直接使用され得る。

いくつかの実施形態では、本組成物は、Ｒｈｙの新規の化学誘導体である、例えば、本出願の特許請求の範囲に記載されるもの、または表１〜３に提供されるものである、ＥｐｈＡ４阻害剤を含む。したがって、本明細書に記載されるＥｐｈＡ４阻害剤は、アルツハイマー病、ＡＬＳ、パーキンソン病、外傷性脳損傷、脳卒中、癌、及び脊髄損傷を含むがこれらに限定されない過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患及び状態を治療することを意図した薬剤の製造に使用され得る。

第３の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達の新たな今まで知られていなかった阻害剤を特定することによって神経変性疾患（特に、アルツハイマー病等のアミロイドβ関連神経変性障害）を治療するための治療薬として使用することのできる化合物を特定するための方法を提供する。場合によっては、候補化合物は、ＥｐｈＡ４とそのリガンド（例えば、エフリン）との間の結合を妨害し、したがって低減するその能力について試験される。潜在的に、阻害剤は、小分子、巨大分子（ポリペプチド及びポリヌクレオチド等）、及び同様のものを含む、任意の化学的性質の分子であり得る。典型的に、ＥｐｈＡ４−リガンド結合を中断するその能力について試験される候補化合物は、最初に、ＥｐｈＡ４及びそのリガンドの両方が存在する環境内、ならびにＥｐｈＡ４とそのリガンドとの間の特異的結合に対して許容される条件下に置かれる。次に、候補化合物の存在下でのＥｐｈＡ４とリガンドとの間の結合レベルが決定され、候補化合物が不在であることを除いて同じ条件下でのＥｐｈＡ４とそのリガンドとの間の結合レベル（換言すれば、ＥｐｈＡ４とリガンドとの「対照結合レベル」）と比較される。ＥｐｈＡ４−リガンド結合レベルが、対照結合レベルよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低い場合、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの間の結合は、「阻害された」と見なされ、候補化合物は、少なくとも予備的にＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤であると見なされる。随意に、さらなる試験の追加ステップを実行し、ＥｐｈＡ４シグナル伝達を抑制することによって神経保護を提供する化合物の機能を検証する。例えば、本出願に記載されるＡＤマウスモデルＡＰＰ／ＰＳ１等の動物モデルを使用し、ＥｐｈＡ４−リガンド結合を中断することができる化合物が、アミロイド斑によって阻害される海馬シナプス可塑性を改善すること、ならびにＡＤ病理のある特定の特徴、例えば、皮質及び海馬内のアミロイド斑の低減を改善することに影響するかどうかを検証することができる。

本開示に記載されるように、小分子ＥｐｈＡ４阻害剤をスクリーニングする目的で、多くの場合、最初に小分子ライブラリーを使用して分子ドッキング分析を行う。ＥｐｈＡ４と結合すると予測される小分子が選択される。代替例では、小分子は、最初にスクリーニングされ、細胞ベースまたは無細胞結合アッセイフォーマットで、多くの場合、エフリン等のＥｐｈＡ４の天然リガンドと競合してＥｐｈＡ４に特異的に結合するそれらの能力に対して選択され得る。次に、これらの選択された小分子を、細胞モデル及び動物モデルにおいてＥｐｈＡ４を阻害するそれらの能力について試験する。候補小分子（典型的に、１μＭ〜１０μＭ）を、培養した海馬ニューロンを使用して、ＥｐｈＡ４依存性成長円錐崩壊を阻害するそれらの能力について試験する。小分子が投薬量依存的にＥｐｈＡ４依存性成長円錐崩壊アッセイに対する阻害を示す場合、培養した皮質ニューロン内の（受容体の活性化状態を反映する）ＥｐｈＡ４のエフリン−Ａ依存性自己リン酸化を遮断することに対するこれらの小分子の能力を、ウェスタンブロット分析を使用して調べる。細胞アッセイにおいて、これらの小分子がＥｐｈＡ４阻害剤であることが実証される後、次にさらなる試験を行い、これらの小分子が急性海馬器官型スライスにおいて長期増強（ＬＴＰ、シナプス可塑性の形態）のアミロイドβ誘発性低減を逆転させることができるかどうかを決定する。結果が陽性である場合、これらの小分子を用いて、ＡＤマウスモデル（例えば、ＡＰＰ／ＰＳ１及びＡＰＰ変異マウスモデル）の経口投与を行う。これらのＡＤマウスモデルにおいて、小分子がＬＴＰの阻害を逆転させ、病理学的特徴（アミロイドβ沈着、アストログリオーシス、及び小膠細胞症）を低減させることができるかどうかを評価する。さらに生化学分析を行い、小分子が、Ｅｐｈファミリーの他のメンバーではなく、ＥｐｈＡ４の細胞外ドメインに直接結合することを示す。同じまたは類似のスクリーニングプロセスは、任意の化学的性質のＥｐｈＡ４阻害剤を特定する目的で追従され得る。

別種のＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤は、ＥｐｈＡ４またはそのリガンドの発現を抑制することによって作用し、そのような抑制は、ＲＮＡレベル及び／またはタンパク質レベルにおいてであり得る。多くの分子がこのカテゴリーに該当し得、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、または分解を促進するためにＥｐｈＡ４転写物（もしくはＥｐｈＡ４リガンドの転写物）を特異的に標的とする抗体は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達の有効な阻害剤であり得る。提案されるこの性質の阻害剤は、ＥｐｈＡ４（またはそのリガンド）の任意の低減のために、ＥｐｈＡ４（またはそのリガンド）を発現する細胞に露出することによって試験され得る。この場合も、そのような低減は、提案された阻害剤の不在下であることを除いて同じ条件下でＥｐｈＡ４（またはそのリガンド）の発現レベルと比較した場合、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の低減である。一旦ＥｐｈＡ４（またはそのリガンド）発現の低減が検出されると、提案された阻害剤を上記と同じようにさらに試験し、その神経保護活性を検証することができる。

第４の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達、例えば、アルツハイマー病等のアミロイドβ誘発性神経毒性によって引き起こされるか、または悪化する疾患または障害の治療において使用するためのキットを提供する。該キットは、例えば、ＥｐｈＡ４−リガンド結合を崩壊させることによる、またはＥｐｈＡ４もしくはリガンド発現を（例えば、ＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベルで）抑制することによる、ＥｐｈＡ４シグナル伝達の１つ以上の阻害剤を含む。キットは、多くの場合、複数の容器を含み、該キットがある特定の期間中に患者によって日用するための阻害剤を提供することができるように、それぞれが１日投与量のＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤を含む。場合によっては、阻害剤は、経口投与または静脈内注入、皮下注入、もしくは筋肉内注入等の注入に適した薬学的組成物に製剤化される。随意に、阻害剤の投与時に使用者を指向する指示マニュアルもキットに提供される。
[本発明1001]
式Ｉの化合物
[化1]

、またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
各Ｒ ¹ が、独立して、水素及びアルキルからなる群から選択されるメンバーであり、
各Ｒ ² が、独立して、水素及びアシルからなる群から選択されるメンバーであり、
各Ｒ ^ｑ が、独立して、電子対、低級アルキル、アリル、及びアリールメチルからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｌが、結合、アルキレン、及びアリールアルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
Ｘが、結合、−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（Ｒ ⁴ ）−からなる群から選択され、Ｌが結合である場合、Ｘも結合であり、
Ｒ ³ が、水素、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アロイルメチル、アシル、アシルアルキル、（Ｒ ⁴ ） ₂ Ｎ−アルキレン、及び
[化2]

からなる群から選択され、
Ｌが結合である場合、Ｒ ³ は、水素、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、及びアシルアルキルからなる群から選択され、
Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ ⁴ ）−である場合、Ｒ ³ は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アロイルメチル、アシル、アシルアルキル、及び（Ｒ ⁴ ） ₂ Ｎ−アルキレンからなる群から選択され、かつ
各Ｒ ⁴ が、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、及びアシルメチルからなる群から選択され、
但し、（1）前記化合物は、リンコフィリンまたはその塩ではなく、かつ（2）前記化合物は、ＥｐｈＡ4阻害剤である、前記化合物、またはその薬学的に許容される塩。
[本発明1002]
Ｒ ¹ が、メチルである、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
Ｒ ² が、水素またはビオチニルである、本発明1001または1002の化合物。
[本発明1004]
Ｒ ^ｑ が、メチルまたは電子対である、本発明1001〜1003のいずれかの化合物。
[本発明1005]
Ｌが、アルキレン基である、本発明1001〜1004のいずれかの化合物。
[本発明1006]
Ｌが、式−（ＣＨ ₂ ） _ｎ のアルキレン基であり、式中、ｎが、3〜12の整数である、本発明1005の化合物。
[本発明1007]
ｎが、5〜10、5〜9、6〜10、または6〜8の整数である、本発明1006の化合物。
[本発明1008]
Ｌが、式−ＣＨ ₂ （1，4−Ｃ ₆ Ｈ ₄ ）ＣＨ ₂ −のアリールアルキレン基である、本発明1001〜1004のいずれかの化合物。
[本発明1009]
Ｌが、結合である、本発明1001〜1004のいずれかの化合物。
[本発明1010]
Ｘが、結合である、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1011]
Ｘが、−Ｏ−である、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1012]
Ｘが、−ＮＨ−である、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1013]
Ｒ ³ が、水素でない、本発明1001〜1012のいずれかの化合物。
[本発明1014]
Ｒ ³ が、ハロである、本発明1001〜1013のいずれかの化合物。
[本発明1015]
Ｒ ³ が、クロロまたはブロモである、本発明1014の化合物。
[本発明1016]
Ｒ ³ が、メチル、ヘテロシクリルアルキル、またはヘテロアリールアルキルである、本発明1001〜1013のいずれかの化合物。
[本発明1017]
Ｒ ³ が、ピリジン−2−イルメチル、ピリジン−3−イルメチル、ピリジン−4−イルメチル、または（3−キノキサリン−2（1Ｈ）−オニル）メチルである、本発明1016の化合物。
[本発明1018]
Ｒ ³ が、アリールである、本発明1001〜1013のいずれかの化合物。
[本発明1019]
Ｒ ³ が、フェニル、4−ベンジルオキシフェニル、4−ヒドロキシフェニル、または3，4−ジメトキシフェニルである、本発明1018の化合物。
[本発明1020]
Ｘが、−Ｏ−であり、Ｒ ³ が、4−ヒドロキシフェニル、4−ベンジルオキシフェニル、または3，4−ジメトキシフェニルである、本発明1019の化合物。
[本発明1021]
Ｒ ³ が、アリールアルキルである、本発明1001〜1013のいずれかの化合物。
[本発明1022]
Ｒ ³ が、ベンジル、2−フェニルベンジル、3−クロロベンジル、3−メトキシベンジル、4−ベンゾイルベンジル、4−ブロモベンジル、4−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル、4−メチルベンジル、4−メトキシベンジル、または2，6−ジクロロベンジルである、本発明1021の化合物。
[本発明1023]
Ｒ ³ が、アシルである、本発明1001〜1013のいずれかの化合物。
[本発明1024]
Ｒ ³ が、ベンゾイル、2−ヨードベンゾイル、2−ヨード−4−ブロモベンゾイル、3，4−ジメトキシベンゾイル、5−メトキシ−2−ニトロベンゾイル、ビオチニル、または3−フェニルアクリロイルである、本発明1023の化合物。
[本発明1025]
Ｒ ³ が、3，4−ジメトキシベンゾイルまたは5−メトキシ−2−ニトロベンゾイルである、本発明1024の化合物。
[本発明1026]
Ｒ ³ が、（4−メトキシベンゾイル）メチル、アリル、シンナミル、6−アミノヘキシル、2−ピロリジン−1−イルエチル、または3−イミダゾール−1−イルプロピル、または（Ｒ ⁴ ）ＮＨ−アルキレンである、本発明1001〜1013のいずれかの化合物。
[本発明1027]
Ｒ ⁴ が、水素またはビオチニルである、本発明1001〜1013及び1026のいずれかの化合物。
[本発明1028]
ＥｐｈＡ4シグナル伝達に対する阻害剤の有効量を、ＥｐｈＡ4シグナル伝達に関わる疾患を患う対象に投与することを含む、前記対象を治療するための方法。
[本発明1029]
前記阻害剤が、Ｒｈｙまたはその機能的誘導体である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記阻害剤が、本発明1001〜1015のいずれかの化合物である、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記阻害剤が、ＫＹＬペプチド、Ｃｐｄ1、コリリン、デンドロビン、化合物6、化合物14、または化合物21である、本発明1028の方法。
[本発明1032]
前記阻害剤が、薬学的に許容される賦形剤と一緒に、薬学的組成物中に存在する、本発明1028の方法。
[本発明1033]
前記阻害剤が、コリリンであり、フルクタス・プソラリエ（Fructus Psoraleae）の抽出物中に存在するか、または前記阻害剤が、デンドロビンであり、デンドロビウム（Dendrobium）種の抽出物中に存在する、本発明1028の方法。
[本発明1034]
前記疾患が、アミロイドβ関連神経変性障害である、本発明1028の方法。
[本発明1035]
前記アミロイドβ関連神経変性障害が、アルツハイマー病である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記疾患が、外傷性脳損傷、脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷、癌、炎症、鬱病、または不安症である、本発明1028の方法。
[本発明1037]
活性化ＥｐｈＡ4シグナル伝達に関わる疾患を治療するために有用な治療薬を特定するための方法であって、
（ｉ）候補化合物をＥｐｈＡ4及びＥｐｈＡ4のリガンドと、ＥｐｈＡ4と前記リガンドとの間の結合を許容する条件下で接触させるステップと、
（ｉｉ）前記候補化合物の存在下でのＥｐｈＡ4と前記リガンドとの結合レベルを決定するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られた前記結合レベルを、前記候補化合物が不在であることを除いて同じ条件下で決定されたＥｐｈＡ4と前記リガンドとの対照結合レベルと比較するステップであって、前記対照結合レベルと比較した場合のステップ（ｉｉ）で得られた前記結合レベルの減少が、前記候補化合物を、ＥｐｈＡ4シグナル伝達に関わる疾患を治療するために有用な治療薬として示す、ステップ
を含む、前記方法。
[本発明1038]
ステップ（ｉｉｉ）において候補化合物が治療薬として示されたら、前記化合物の神経保護活性を確認するために、細胞ベースのアッセイまたは動物モデルにおいて前記候補化合物を試験するステップ（ｉｖ）をさらに含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
ＥｐｈＡ4シグナル伝達に対する阻害剤を含む、ＥｐｈＡ4シグナル伝達に関わる疾患を治療するためのキット。
[本発明1040]
1日投与量の前記阻害剤を含有する複数の容器を含む、本発明1039のキット。
[本発明1041]
前記阻害剤が、Ｒｈｙもしくはその機能的誘導体、ＫＹＬペプチド、Ｃｐｄ1、コリリン、デンドロビン、化合物6、化合物14、または化合物21である、本発明1039のキット。
[本発明1042]
前記阻害剤が、本発明1001〜1015のいずれかの前記化合物である、本発明1039のキット。
[本発明1043]
前記阻害剤が、薬学的に許容される賦形剤と一緒に、薬学的組成物中に存在する、本発明1026のキット。
[本発明1044]
前記薬学的組成物が、経口投与のために製剤化される、本発明1043のキット。
[本発明1045]
前記阻害剤が、コリリンであり、フルクタス・プソラリエの抽出物中に存在するか、または前記阻害剤が、デンドロビンであり、デンドロビウム種の抽出物中に存在する、本発明1039のキット。
[本発明1046]
指示マニュアルをさらに含む、本発明1039のキット。

Ａβは、ＥｐｈＡ４シグナル伝達の活性化を刺激する。（ａ及びｂ）３ヶ月及び６ヶ月時点でのＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬シナプトソーム画分におけるＴｙｒ６０２ ＥｐｈＡ４リン酸化（Ｐ−Ｔｙｒ６０２ ＥｐｈＡ４）及び総ＥｐｈＡ４レベルのウェスタンブロット。ＥｐｈＡ４タンパク質に対して正規化されたＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＰ−Ｔｙｒ６０２ ＥｐｈＡ４の定量化（^＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、スチューデントのニューマン検定、３月齢のＷＴの場合のｎ＝３を除いて、全ての条件でｎ＝４）。（ｃ〜ｆ）Ａβは、ＥｐｈＡ４チロシンリン酸化を増加させた。（ｃ、ｄ）急性ラット海馬スライスを、２０ｎＭ、１００ｎＭ、もしくは５００ｎＭのＡβで２時間、または５００ｎＭで（ｅ、ｆ）に示されるような種々の期間で処置した。ＥｐｈＡ４を、総溶解物から免疫沈降し、次にＰ−Ｔｙｒ ＥｐｈＡ４についてウェスタンブロットに供した。（ｄ、ｆ）ＥｐｈＡ４に対して正規化されたＡβ処置時のＰ−Ｔｙｒ ＥｐｈＡ４の定量化（ｄ）^＊ｐ＜０．０５対０ｎＭ、一元配置分散分析、スチューデントのニューマン検定；０ｎＭの場合ｎ＝６、２０ｎＭ及び１００ｎＭの場合ｎ＝５、５００ｎＭの場合７。（ｆ）^＊＊ｐ＜０．０５対０時間、一元配置分散分析、スチューデントのニューマン検定；ｎ＝３。（ｇ、ｈ）Ａβは、ＥｐｈＡ４クラスタの数を増加させた。培養した海馬ニューロン（２５〜２８ＤＩＶ）を、Ａβで４時間処置した。Ａβは、ＥｐｈＡ４クラスタ化を増加させた（シナプス後部をＰＳＤ−９５抗体で染色した）。代表画像（ｇ）。スケールバー＝１０μｍ。ＥｐｈＡ４またはＰＳＤ−９５クラスタの定量分析（ｈ）（^＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。（ｉ、ｊ）ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用の遮断は、ＥｐｈＡ４のＡβ刺激性活性化を廃止した。急性ラット海馬スライスを、ＫＹＬペプチドで０．５時間、続いてＡβで２時間前処置した。（ｉ）ＥｐｈＡ４を免疫沈降し、Ｐ−Ｔｙｒ ＥｐｈＡ４についてウェスタンブロットに供した。（ｉ）ＥｐｈＡ４活性化の倍率変化が示される（Ｐ−Ｔｙｒ ＥｐｈＡ４／ＥｐｈＡ４、右パネル）。^＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定（ｎ＝３）。 ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用の遮断は、Ａβ媒介性神経伝達障害を防止する。（ａ、ｂ）ＥｐｈＡ４阻害剤ＫＹＬペプチドは、２４〜２６ＤＩＶにおいて海馬ニューロン内の樹状突起棘のＡβ誘発性低減を減衰した。代表画像（ａ）。スケールバー＝１０μｍ。樹状突起棘密度の定量分析（ｂ）^＊＊＊ｐ＜０．００１；二元配置分散分析後のボンフェローニ事後検定（ｎ＝１５〜２０ニューロン）。（ｃ〜ｅ）内因性ＥｐｈＡ４そのリガンド、エフリンとの間の相互作用を遮断する非クラスタ化ＥｐｈＡ４−Ｆｃは、ｍＥＰＳＣの事象間間隔のＡβ誘発性増加をレスキューした。（ｃ）非クラスタ化ＥｐｈＡ４−ＦｃまたはＦｃ対照の存在下でのＡβ刺激性ニューロンからの代表的なｍＥＰＳＣトレース。（ｄ）ｍＥＰＳＣ事象間間隔の累積確率分布。（ｅ）（ｄ）からのデータの平均±標準誤差（ｍＥＰＳＣ事象間間隔：Ｆｃ＝４４５．５±８．８ｍｓ、Ｆｃ＋Ａβ＝６１９．４±１４．３ｍｓ、ＥｐｈＡ４＝５００．４±９．８ｍｓ、ＥｐｈＡ４＋Ａβ＝４７８．５±９．８ｍｓ；３９個以上のニューロンが、少なくとも３つの実験から各条件で記録された）。^＊＊＊ｐ＜０．００１、Ａβ対対照；^＃＃＃ｐ＜０．００１対Ａβ単独、クラスカル・ワリス検定を伴う一元配置分散分析。（ｆ〜ｈ）ＥｐｈＡ４（Ｃｐｄ１）及びＣｄｋ５（Ｒｏｓ）の小分子阻害剤は、事象間間隔のＡβ誘発性増加を防止した。（ｆ）Ｃｐｄ１（５００μＭ）またはＲｏｓ（１０μＭ）を用いる場合、または用いない場合のＡβ刺激性ニューロンからの代表的なｍＥＰＳＣ。（ｇ）ｍＥＰＳＣ事象間間隔の累積確率分布。（ｈ）（ｇ）からのデータの平均±標準誤差（ｍＥＰＳＣ事象間間隔：対照＝４５４．１±１２．５ｍｓ、Ａβ＝８１８．１±２８．２ｍｓ、Ｃｐｄ１＝５５９．５±１６．６ｍｓ、Ｃｐｄ１＋Ａβ＝５４２．６±１５．４ｍｓ、Ｒｏｓ＝４５１．０＋１１．２ｍｓ、Ｒｏｓ＋Ａβ＝４９４．１±１１．７ｍｓ；少なくとも３つの実験から２２個以上のニューロン）。^＊＊＊ｐ＜０．００１、Ａβ対対照；^＃＃＃ｐ＜０．００１対Ａβ単独、クラスカル・ワリス検定を伴う一元配置分散分析。 ＥｐｈＡ４シグナル伝達の遮断は、海馬ＬＴＰのＡβ誘発性障害をレスキューする。（ａ〜ｄ）ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用の遮断は、ＬＴＰのＡβ誘発性低減をレスキューした。急性海馬スライスを、ＥｐｈＡ４阻害剤、すなわち非クラスタ化ＥｐｈＡ４−Ｆｃ［１０μｇ／ｍＬ；（ａ、ｂ）］またはＫＹＬペプチド［１００μＭ；（ｃ、ｄ）］の存在下、Ａβで２時間処置した。シェファー側枝経路のＣＡ１中のＬＴＰは、後次にＨＦＳによって誘発された。（ａ、ｃ）点は、ベースライン値に関して正規化されたｆＥＰＳＰの平均化勾配を表す（平均±標準誤差）。ＬＴＰ誘発（矢印）の５分前（１）及び５０分後（２）のトレース記録が示される。挿入トレースは、ＨＦＳ前（灰色）及び後（黒色）に記録された例示のｆＥＰＳＰである。水平バー：５ｍｓ、垂直バー：０．５ｍＶ。（ｂ、ｄ）ＬＴＰ誘発後の記録の最後の１０分で平均化された平均ｆＥＰＳＰ勾配の定量化（平均±標準誤差）。ＥｐｈＡ４−Ｆｃ共処置の場合：対照＝１６９．２±９．６％、ｎ＝５脳、１０スライス；Ａβ＝１２２．０±６．１％、ｎ＝５脳、９スライス；ＥｐｈＡ４−Ｆｃ＝１５５．７±５．４％、ｎ＝６脳、１０スライス；ＥｐｈＡ４−Ｆｃ＋Ａβ＝１５５．０±６．２％、ｎ＝５脳、１０スライス。ＫＹＬ共処置の場合：対照＝１６９±６．７２％、ｎ＝６脳、１０スライス；Ａβ＝１３２±６．０６％、ｎ＝６脳、１１スライス；ＫＹＬ＝１６４．６±５．７％、ｎ＝６脳、１１スライス；ＫＹＬ＋Ａβ＝１７４．９±９．０％、ｎ＝６脳、１１スライス。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、Ａβ対対照、二元配置分散分析後のボンフェローニ事後検定；^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃ｐ＜０．００１対Ａβ単独、一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。（ｅ〜ｈ）ＥｐｈＡ４シグナル伝達の遮断は、ＡＰＰ／ＰＳ１変異マウスにおけるＬＴＰ障害をレスキューした。（ｅ、ｆ）ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１変異マウスに、浸透圧ポンプを使用してＫＹＬを注入したところ、海馬のシェファー側枝経路のＣＡ１中のＬＴＰは、後次にＨＦＳによって誘発された。（ｇ、ｈ）ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１変異マウスの海馬に、ＥｐｈＡ４−ｓｈＲＮＡ（ｓｈＥｐｈＡ４）またはＧＦＰウイルス（ＧＦＰ）を注入したところ、ＣＡ３−ＣＡ１ ＬＴＰは、注入の３〜４週間後にＨＦＳによって後次に誘発された。（ｅ、ｇ）ベースライン−正規化ｆＥＰＳＰの平均化勾配（平均±標準誤差）。ＬＴＰ誘発（矢印）の５分前（１）及び５０分後（２）のトレース記録が示される。挿入トレースは、ＨＦＳ前（灰色）及び後（黒色）に記録された例示のｆＥＰＳＰである。水平バー：５ｍｓ、垂直バー：０．５ｍＶ。（ｆ、ｈ）ＬＴＰ誘発後の記録の最後の１０分の平均ｆＥＰＳＰ勾配の定量化（平均±標準誤差）（ｆ）ＷＴ、対照＝１９１．８±９．５％、ｎ＝６脳、９スライス；ＷＴ、ＫＹＬ＝１９０．１±６．９％、ｎ＝６脳、１６スライス；Ｔｇ、対照＝１５４．０±８．２％、ｎ＝６脳、１１スライス；Ｔｇ、ＫＹＬ＝１８１．９±８．６％、ｎ＝６脳、９スライス。^＊ｐ＜０．０５、対照条件下のＴｇ対ＷＴ；^＃ｐ＜０．０５、ＴｇマウスにおけるＫＹＬ対対照、一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。（ｈ）ＷＴ、ＧＦＰ＝１９８．０±１７．９４％、ｎ＝６脳、１２スライス；ＷＴ、ｓｈＥｐｈＡ４＝１８６±３１．８５％、ｎ＝６脳、１１スライス；Ｔｇ、ＧＦＰ＝１４６．３±１７．１４％、ｎ＝１１脳、２７スライス；Ｔｇ、ｓｈＥｐｈＡ４＝１６４．７±２３．６２％、ｎ＝７脳、１４スライス；^＊＊＊ｐ＜０．００１、ＧＦＰ条件下のＴｇ対ＷＴ；^＃ｐ＜０．０５、ＴｇマウスにおけるｓｈＥｐｈＡ４対ＧＦＰ、ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置分散分析。 小分子Ｒｈｙは、ＥｐｈＡ４の新規阻害剤である。（ａ）ＥｐｈＡ４と複合したＲｈｙのドッキング構造。ＥｐｈＡ４のリガンド−結合ドメイン（緑色）は、曲面表現で示されるが、Ｒｈｙは、棒として示される（シアンブルー）。Ｒｈｙの酸素、窒素、及びアミン水素原子は、それぞれ赤色、青色、及び白色で着色される。Ｒｈｙとの著しい疎水性相互作用を形成するＥｐｈＡ４上の４つの残基は、Ｄ−Ｅループ中のＩｌｅ^５９（橙色）、Ｉ−Ｊループ中のＰｈｅ^１５４（赤色）、Ｋ中のＬｅｕ^１６６、及びＭβ鎖中のＶａｌ^１９５（黄色）である。さらに、Ｒｈｙのエーテル結合におけるカルボニル及びメトキシル酸素原子は、Ｊβ鎖及びＪ−Ｋループ（紫色）内のＡｓｐ^１５８（約２．１Å）及びＡｒｇ^１６２（約２．１Å）において、ＥｐｈＡ４との２つの強力な水素結合を形成する。（ｂ）Ｒｈｙは、ＥｐｈＡ４に特異的に結合する。Ｒｈｙは、ＥｐｈＢ２の細胞外ドメインではなく、ＥｐｈＡ４の細胞外ドメインに結合する。ストレプトアビジンビーズと結合されたビオチン化Ｒｈｙを用いる組換えＥｐｈＡ４−ＦｃまたはＥｐｈＢ２−Ｆｃタンパク質のインビトロプルダウンアッセイ（実験を３回繰り返した）。（ｃ、ｄ）Ｒｈｙは、Ｅｐｈ−エフリン−Ａ相互作用及びＥｐｈＡ４チロシンリン酸化を阻害した。（ｃ）Ｒｈｙは、ＨＴ２２細胞の表面へのエフリン−Ａ１の結合を低減する。ビオチン化エフリン−Ａ１（Ａ１、０．５μｇ／ｍＬ）での処置前に、ＨＴ−２２細胞をＲｈｙまたはＫＹＬで１０分間プレインキュベートした。ＨＴ−２２細胞表面上のビオチン化エフリン−Ａ１クラスタの定量分析。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。（ｄ）６ＤＩＶにおける皮質ニューロンを、エフリン−Ａ１で３０分間処置する前に、Ｒｈｙで３０分間プレインキュベートした。溶解物を収集し、ＥｐｈＡ４抗体で免疫沈降した。Ｐ−Ｔｒｙについてのウェスタンブロット分析。（ｅ）定量分析データは、平均±標準誤差として提示される（^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定、ｎ＝５）。（ｆ、ｇ）Ｒｈｙは、ＥｐｈＡ４依存性シグナル伝達及び細胞機能を阻害した。（ｆ）Ｒｈｙの存在は、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を廃止した（Ａ１）。^＊＊＊ｐ＜０．００５対Ｆｃ、^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃ｐ＜０．００１対Ａ１、一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。（ｇ）Ｒｈｙは、エフリン−Ａ１刺激性成長円錐崩壊を阻害した（平均±標準誤差、少なくとも３つの実験から１５０個を超えるニューロン）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、異なる条件でのＡ１対Ｆｃ、二元配置分散分析後のボンフェローニ事後検定；^＃ｐ＜０．０５、^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃対照条件でのｐ＜０．００１対Ａ１、一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。Ｒｈｙと同様に、Ｃｐｄ１もまた、１０μＭを超える濃度にもかかわらず、エフリン−Ａ１刺激性成長円錐崩壊を阻害した（データ図示せず）。 Ｒｈｙは、ＡＤマウスにおいて神経伝達及びＬＴＰ阻害のＡβ誘発性欠乏をレスキューする。（ａ〜ｃ）Ｒｈｙ（１０μＭ）による前処置は、神経伝達のＡβ誘発性低減を廃止した。海馬ニューロンを、１０μＭのＲｈｙの存在下でＡβにより処置した。（ａ）代表ｍＥＰＳＣトレース。（ｂ）累積ｍＥＰＳＣ事象間間隔分布。（ｃ）（ｂ）からのデータの平均±標準誤差（ｍＥＰＳＣ事象間間隔：対照＝３１２．９±７．８ｍｓ、Ａβ＝８９７．４±４３．４ｍｓ、Ｒｈｙ＝５１２．２±１３．６ｍｓ、Ｒｈｙ＋Ａβ＝４２０．６±９．６ｍｓ；１７個以上のニューロンが、少なくとも３つの実験から各条件で記録された）。^＊＊＊ｐ＜０．００１ Ａβ対対照；^＃＃＃ｐ＜０．００１対Ａβ単独、一元配置分散分析後のクラスカル・ワリス検定。（ｄ、ｅ）Ｒｈｙは、ＬＴＰのＡβ誘発性阻害を防止した。急性海馬スライスを、Ｒｈｙ（３０μＭ）の存在下でＡβにより処置したところ、シェファー側枝経路のＣＡ１中のＬＴＰは、ＨＦＳによって誘発された。（ｄ）ベースライン−正規化ｆＥＰＳＰの平均化勾配（平均±標準誤差）。ＬＴＰ誘発（矢印）の５分前（１）及び５０分後（２）のトレース記録が示される。（ｅ）ＬＴＰ誘発後の記録の最後の１０分間の平均ｆＥＰＳＰ勾配の定量化（平均±標準誤差）；対照＝１７２．７±７．５％、ｎ＝６脳、１０スライス；Ａβ＝１３１．１±３．９％、ｎ＝６脳、１１スライス；Ｒｈｙ＝１６８．１±６．０％、ｎ＝６脳、１２スライス；Ｒｈｙ＋Ａβ＝１７４．１±９．８％、ｎ＝６脳、１０スライス。^＊＊＊ｐ＜０．００１ Ａβ対対照、二元配置分散分析後のボンフェローニ事後検定；^＃＃＃ｐ＜０．００１対Ａβ単独；一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。（ｆ、ｇ）Ｒｈｙは、ＡＰＰ／ＰＳ１変異マウスにおいてＬＴＰ障害をレスキューした。ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１変異マウスにＲｈｙ（５０ｍｇ・ｋｇ^−１・日^−１）を３週間経口投与したところ、海馬のシェファー側枝経路のＣＡ１中のＬＴＰは、ＨＦＳによって誘発された。（ｆ）ベースライン−正規化ｆＥＰＳＰの平均化勾配（平均±標準誤差）。ＬＴＰ誘発（矢印）の５分前（１）及び５０分後（２）のトレース記録が示される。（ｇ）ＬＴＰ誘発後の記録の最後の１０分間の平均ｆＥＰＳＰ勾配の定量化（平均±標準誤差）；ＷＴ、対照＝１９４．０±７．０％、ｎ＝７脳、１１スライス；ＷＴ、Ｒｈｙ＝１８０．５±７．７％、ｎ＝７脳、１２スライス；Ｔｇ、対照＝１４７．６±３．５％、ｎ＝７脳、８スライス；Ｔｇ、Ｒｈｙ＝１９８．１±８．９％、ｎ＝６脳、１１スライス。^＊＊＊ｐ＜０．００１ ＷＴ対Ｔｇ、^＃＃＃ｐ＜０．００１対照対Ｒｈｙ、二元配置分散分析後のボンフェローニ事後検定。（ｄ、ｇ）挿入トレースは、ＨＦＳ前（灰色）及び後（黒色）に記録された例示の興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）である。水平バー：５ｍｓ、垂直バー：０．５ｍＶ。 Ｒｈｙ投与は、アミロイド斑沈着及び小膠細胞性活性化の低減につながる。（ａ〜ｃ）Ｒｈｙを約１０週間（７．５〜８月齢で）投与した後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド斑沈着のＤＡＢ染色。（ａ）代表画像。スケールバー＝１ｍｍ。（ｂ及びｃ）皮質及び海馬（各脳から４個を超える切片、ｎ＝４脳）内のＡβ染色（アミロイド斑沈着）によって被覆された総面積の数及びパーセンテージの定量化。データは、平均±標準誤差として提示された。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定。（ｄ〜ｈ）Ｒｈｙ投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスのマウス脳切片を、β−アミロイド（赤色、アミロイド斑沈着の場合）及びＩｂａ−１（緑色、小膠細胞性活性化の場合）に対する抗体で共免疫染色した。（ｄ）対応する皮質領域の代表画像。スケールバー＝１００μｍ。（ｅ〜ｇ）定量分析。Ｉｂａ１染色によって被覆された面積（ｅ）、斑に関連するＩｂａ１染色の面積（ｆ）及び強度（ｇ）のパーセンテージ（各脳から２個を超える切片、ｎ＝３脳）。データは、平均±標準誤差として提示された。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。 マウス脳内のＥｐｈＡ４チロシンリン酸化の発生過程における発現。（ａ及びｂ）マウス脳発達の異なる段階におけるＴｙｒ６０２ ＥｐｈＡ４リン酸化（Ｐ−Ｔｙｒ６０２ ＥｐｈＡ４）及び総ＥｐｈＡ４レベルのウェスタンブロット。（ｂ）ＥｐｈＡ４タンパク質に対して正規化されたＰ−Ｔｒｙ６０２の定量化（３月齢脳のものと比較）、ｎ＝３；^＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。 Ｃｄｋ５キナーゼ活性に対するＡβの効果。培養した皮質ニューロン（１６ＤＩＶ）を、示されるような種々の期間にＡβで処置した。Ｃｄｋ５タンパク質を、皮質溶解物から免疫沈降し、ヒストンＨ１タンパク質を基質として使用するキナーゼアッセイに供した。下パネル：キナーゼ活性の倍率変化。^＊＊ｐ＜０．０１対０時間；スチューデントのｔ検定（ｎ＝３）。 ＥｐｈＡ４^−／−海馬ニューロン内のｍＥＰＳＣ頻度の低減に対するＡβ刺激の効果。ＥｐｈＡ４^−／−マウス及び同腹子対照（ＥｐｈＡ４^＋／＋）から培養した海馬ニューロン内のｍＥＰＳＣを、２４〜２７ＤＩＶでＡβの存在下、２４時間記録した。データは、未処置（対照）に対するＡβ処置のｍＥＰＳＣ頻度の比率として提示された。平均±標準誤差；ＷＴ＝０．５７１±０．１１７、ＫＯ＝０．９３１±０．１８８、６脳からのｎ≧５０ニューロン。^＊＊ｐ＜０．０１スチューデントのｔ検定。 Ｒｈｙは、エフリン−Ａ１の細胞結合を阻害する。０．５μｇ／ｍＬビオチン化エフリン−Ａ１（Ａ１）で４５分間、氷上での処置前に、ＨＴ−２２細胞をＲｈｙ（３００μＭ）またはＫＹＬ（１００μＭ）で１０分間プレインキュベートした。スケールバー＝１０μｍ。 Ｒｈｙは、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を廃止する。３ＤＩＶにおいて培養した海馬ニューロンを、示されるような異なる濃度またはＫＹＬ（１００μＭ）でクラスタ化エフリン−Ａ１（Ａ１）及びＲｈｙで共処置し、続いてＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１について染色した。代表画像が示される。スケールバー＝１０μｍ。 Ｒｈｙは、Ｔｇ２５７６変異マウスにおいてＬＴＰ障害をレスキューする。ＷＴ及びＴｇ２５７６変異マウスにＲｈｙ（２０または５０ｍｇ・ｋｇ^−１・日^−１）を３週間経口投与したところ、海馬のシェファー側枝経路のＣＡ１中のＬＴＰは、後次にＨＦＳによって誘発された。（ａ）ベースライン−正規化ｆＥＰＳＰの平均化勾配（平均±標準誤差）。ＬＴＰ誘発の５分前（１）及び５０分後（２）のトレース記録が示される。挿入トレースは、ＨＦＳ前（灰色）及び後（黒色）に記録された例示の興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）である。水平バー：５ｍｓ、垂直バー：０．５ｍＶ。（ｂ）ＬＴＰ誘発後の記録の最後の１０分の平均ｆＥＰＳＰ勾配の定量化（平均±標準誤差）；ＷＴ、対照＝１７０．１±９．７％、ｎ＝３脳、６スライス；ＷＴ、２０Ｒｈｙ＝１６７．３±５．２％、ｎ＝２脳、４スライス；ＷＴ、Ｒｈｙ＝１５６．２±８．５％、ｎ＝３脳、５スライス；Ｔｇ、対照＝１１９．０±３．７％、ｎ＝３脳、６スライス；Ｔｇ、２０Ｒｈｙ＝１６１．９±２．９％、ｎ＝２脳、３スライス；Ｔｇ、５０Ｒｈｙ＝１５９．７±１７．９％、ｎ＝３脳、４スライス。^＊ｐ＜０．０５；一元配置分散分析後のスチューデント−ニューマン−ケウルス検定。 コリリン及びデンドロビンは、ＥｐｈＡ４阻害活性を呈する。小分子阻害効果は、エフリン−Ａ１刺激性成長円錐崩壊を阻害するそれらの能力によって示された。 Ｃｐｄ１（２−ヒドロキシ−４−（２，５−ジメチル−１−ピロリル）安息香酸）化学誘導体：化合物６、１４、及び２１。 ｃｐｄ１の誘導体：化合物６、１４、及び２１は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達に対して阻害作用を呈する。阻害効果は、エフリンＡ１への露出時にＥｐｈＡ４のチロシンリン酸化を抑制する化合物の能力によって示された。 リンコフィリン（Ｒｈｙ）及びコリリン（Ｃｏｒｙ）は、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタを、Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって阻害する。 新規化合物ＲＨＹ−２６及びＲＨＹ−３７は、ＥｐｈＡ４阻害に対してより強力な効果を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、新規化合物ＲＨＹ−２６及びＲＨＹ−３７は、Ｔｈｙよりも５倍及び１２倍強力である。 新規化合物ＲＨＹ−２６は、強力なＥｐｈＡ４阻害効果を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、新規化合物ＲＨＹ−２６は、ＥｐｈＡ４クラスタを約８０％著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−３９、ＲＨＹ−４３、ＲＨＹ−３７、及びＲＨＹ−５６は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレン（ｎ）により結合されたＲｈｙのＮ_１に３，４−ジメトキシ−フェノキシの修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−３８、ＲＨＹ−３６、ＲＨＹ−５７は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレン（ｎ）により結合されたＲｈｙのＮ_１にジメトキシベンゾエートの修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−５４及びＲＨＹ−６０は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレン（ｎ）により結合されたＲｈｙのＮ_１にヒドロキシル−フェノキシ基の修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−４０、ＲＨＹ−４５、ＲＨＹ−５０、及びＲＨＹ−５９は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも高い能力を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレン（ｎ）により結合されたＲｈｙのＮ_１にメトキシ−ニトロベンゾエートまたはメトキシ−フェニルアクリル酸の修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−４２、ＲＨＹ−４４、ＲＨＹ−４９、及びＲＨＹ−５５は、ＥｐｈＡ４阻害に対してより高い能力を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレンにより結合されたＲｈｙのＮ_１にベンジルオキシ−フェノキシ基の修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−２３、２７、ＲＨＹ−３５、ＲＨＹ−３４、ＲＨＹ−３１は、ＥｐｈＡ４阻害に対してより高い能力を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレン（ｎ）により結合されたＲｈｙのＮ_１にブロモ基の修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを低減した。 新規化合物ＲＨＹ−４１、４６、及び４７は、ＥｐｈＡ４阻害に対してより高い能力を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレンにより結合されたＲｈｙのＮ_１にピロリジン−１−イル−エチルアミノまたはイミダゾール−１−イル−プロピルアミノ基の修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−３２は、ＥｐｈＡ４阻害に対してより高い能力を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレンにより結合されたＲｈｙのＮ_１にアミノ−ヘキシルアミノ基の修飾を持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 新規化合物ＲＨＹ−５１は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも高い能力を呈する。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、メチレンにより結合されたＲｈｙのＮ_１にヨード−ベンゾエートまたはヨード−ブロモ−ベンゾエートを持つ新規化合物は、Ｒｈｙと比較した場合、ＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 全ての化合物は、ＥｐｈＡ４クラスタ形成に対して阻害効果を示した。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、新規化合物ＲＨＹ−１０、ＲＨＹ−２８、ＲＨＹ−９、ＲＨＹ−１９、ＲＨＹ−５、ＲＨＹ−１７は、Ｒｈｙと比較してＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 全ての化合物は、ＥｐｈＡ４クラスタ形成に対して阻害効果を示した。Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって、新規化合物ＲＨＹ−１３、ＲＨＹ−６、ＲＨＹ−１、及びＲＨＹ−７は、Ｒｈｙと比較してＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した。 図３０Ａ：Ｒｈｙは、血清の６時間インキュベーション後、マウス血清中で比較的安定したままであった。Ｒｈｙは、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって検出された。データは、ｔ_０における値と比較して、種々の時点で検出されたＲｈｙのパーセンテージとして表される（平均±標準誤差、ｎ＝４マウス）。図３０Ｂ：経口投与後のマウス血漿及び脳中のＲｈｙの薬物動態。データは、投与後の血漿中（ｎｇ／ｍＬ）または脳当たりのＲｈｙの量として表される（平均±標準誤差）。血液及び灌流した全脳を、単回投与後の異なる時点で収集した（１時点当たりｎ＝６匹、１１時点）。図３０Ｃ：マウス脳及び血漿中のＲｈｙの薬物動態パラメータ。 コリリンは、ＡＰＰ／ＰＳ１変異マウスにおいてＬＴＰ障害をレスキューした。ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１変異（Ｔｇ）マウスにコリリン（５０〜１００ｍｇ・ｋｇ−１・日−１）または水（対照）を３週間経口投与し、海馬のＳＣ経路のＣＡ１領域中のＨＦＳによって誘発されたＬＴＰを測定した。グラフは、ベースライン−正規化ｆＥＰＳＰの平均化勾配を示した（平均±標準誤差）。 Ｒｈｙ投与は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬において成体神経新生を増加させる。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＲｈｙ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３ヶ月間を超えて経口投与した。Ｒｈｙ（Ｒ１）投与は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、海馬の歯状回中のＫｉ−６７＋神経前駆細胞の数を増加させた。

発明の詳細な説明
本出願の実施例は、例証としてのみ提供されており、限定するものではない。当業者であれば、種々の重要でないパラメータが、本質的に同じまたは類似の結果を生じるように変更または修正され得ることを容易に認識するであろう。

Ａ．導入
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も一般的な形態であり、脳内のアミロイド斑及び神経原線維変化の蓄積に関わる。ＡＤの早期発現として見なされる認知障害は、シナプス機能の崩壊に起因すると考えられる。シナプス喪失及び変化の程度は、ＡＤにおける記憶欠損の重症度と相関する^１。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解的切断によって生成される可溶性アミロイド−βペプチドオリゴマー（Ａβ）は、ＡＤ進行中のシナプス障害の主な原因物質であると考えられる^２、３。したがって、Ａβ誘発性シナプス欠損の逆転は、ＡＤ^４における認知障害を治療するための有望な治療手法であると考えられる。

Ａβは、シナプス部位に結合し^５、シナプス喪失及びグルタミン酸作動性シナプス伝達の低減をもたらす^６〜８。Ａβはまた、海馬内のシナプス可塑性を急速に障害し、長期増強（ＬＴＰ）の阻害^２または長期抑制（ＬＴＤ）の促進^９を含み、それらは学習及び記憶と関連する主な細胞機序である。Ａβによって引き起こされるシナプス欠陥は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型及び２−アミノ−３−（３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−イル）プロパノン酸（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体の両方の内在化及び下方調節によって^{１０〜１２}、興奮性シナプスが位置する樹状突起棘の低減と一緒に^８媒介される。したがって、分子標的を特定すること、及びＡＤのシナプス抑制においてＡβの作用を媒介する細胞機序を理解することは、ＡＤの治療介入の開発に重要である。興味深いことに、α７−ニコチンアセチルコリン受容体^１２、代謝調節型グルタミン酸受容体^１３、インスリン受容体^１４、及び受容体チロシンキナーゼ、ＥｐｈＢ２^１５等の種々の細胞表面受容体は、シナプスにおけるＡβの作用を媒介することが報告されている。

受容体チロシンキナーゼのエリスロポエチン産生肝細胞（Ｅｐｈ）ファミリーは、シナプス発達及びシナプス可塑性の調節に重要である^{１６〜１８}。ＥｐｈＢは、ＮＭＤＡ受容体とのその相互作用を通じてシナプス発達を強化するが^{１９、２０}、主に成体海馬内で発現されるＥｐｈＡ４は、神経伝達及び海馬シナプス可塑性の負の調節因子として作用する^２１。ＥｐｈＡ４の、そのリガンド、エフリンによる活性化は、受容体クラスタ化及び自己リン酸化の誘発を通じて前方シグナル伝達を引き起こす^２２。これは、サイクリン依存性キナーゼ５（Ｃｄｋ５）依存性ＲｈｏＡ活性化を通じた樹状突起棘の後退、及び細胞接着の低減につながる^{２３〜２５}。ＥｐｈＡ４は、神経出力が最適範囲内であることを保証する可塑性の形体である恒常性可塑性の間にシナプス及び表面ＡＭＰＡ受容体の除去も引き起こし、したがって、神経ネットワークに安定性を提供する^{２６、２７}。興味深いことに、単に軽度の認知障害を持つＡＤ患者は、無秩序なＥｐｈＢ及びＥｐｈＡ４発現を呈する^２８。ＥｐｈＡ４活性化が、樹状突起棘の喪失及びＡＭＰＡ受容体過多の低減をもたらし^{２１、２７、２９}、ＡＤにおけるシナプス機能不全の基礎となる２つの潜在的機序を表すことを考慮し^８、１０、本発明者らは、ＥｐｈＡ４シグナル伝達とＡβ誘発性シナプス不全との間の考えられる関係を調査した。

発明者らは、ＥｐｈＡ４が、Ａβによって誘発されたシナプス可塑性の障害を媒介することを実証する。シナプス後ＥｐｈＡ４の枯渇またはＥｐｈＡ４とそのリガンドとの間の相互作用の崩壊は、Ａβ治療後、ＡＤマウスモデルにおいてシナプス欠損を逆転させた。重要なことに、分子ドッキング分析は、漢方薬ライブラリーから小分子リンコフィリン（Ｒｈｙ）を候補ＥｐｈＡ４阻害剤として特定した。Ｒｈｙは、ＡＤマウスモデルにおいてＡβ及びＬＴＰ欠陥により誘発された神経伝達障害をレスキューした。したがって、発明者らの発見は、ＡＤの病理におけるＥｐｈＡ４の重要な役割を明らかにしただけでなく、ＡＤまたは例えば、過剰ＥｐｈＡ４活性化及びシグナル伝達によって引き起こされた、または悪化したＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる他の疾患／状態の治療のための治療薬として使用することのできる小分子ＥｐｈＡ４阻害剤も特定した。

Ｂ．ＥｐｈＡ４阻害剤
本出願において初めてＥｐｈＡ４阻害剤として特定された周知の化合物の他に、本発明者らは、ＥｐｈＡ４の新規阻害剤、例えば、Ｒｈｙの新規化学誘導体も提供した。そのような誘導体の例示的一覧は、表１〜３に提示される。

これらの新規誘導体は、出発物質としてＲｈｙを使用して最初に化学的に合成される。例えば、誘導体は、一般に式Ｉの化合物

、またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
各Ｒ^１が、独立して、水素及びアルキルからなる群から選択されるメンバーであり、
各Ｒ^２が、独立して、水素及びアシルからなる群から選択されるメンバーであり、
各Ｒ^ｑが、独立して、電子対、低級アルキル、アリル、及びアリールメチルからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｌが、結合、アルキレン、及びアリールアルキレンからなる群から選択されるリンカーであり、
Ｘが、結合、−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（Ｒ^４）−からなる群から選択され、Ｌが結合である場合、Ｘも結合であり、
Ｒ^３が、水素、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、アシルアルキル、（Ｒ^４）^２Ｎ−アルキレン、及び

からなる群から選択され、
Ｌが結合である場合、Ｒ^３は、水素、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、及びアシルアルキルからなる群から選択され、
Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ^４）−である場合、Ｒ^３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アロイルメチル、アシル、アシルアルキル、及び（Ｒ^４）_２Ｎ−アルキレンからなる群から選択され、
各Ｒ^４は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、及びアシルメチルからなる群から選択される。「誘導体」の定義に従って、誘導体は、典型的にリンコフィリンまたはその塩ではない。

これらの誘導体の化学合成は、一般に、選択した置換基をＮ^１部位におけるＲｈｙの主要構造と、適切なリンカーを介して接合することによって行われる。例示的合成スキームは、本開示の実施例において提供される。適切なリンカー長は、得られたＲｈｙ誘導体のＥｐｈＡ４阻害剤としての機能性に関連することが理解されるため、表１〜３において特定された例示的Ｒｈｙ誘導体において使用される特定リンカーの他に、代替リンカーを、Ｒｈｙに相当するか、または優れたレベルでＥｐｈＡ４シグナル伝達に対する阻害活性を有するＲｈｙ誘導体を合成するプロセスで使用することができる。例えば、３〜１２個、５〜１０個、５〜９個、または６〜８（例えば、６または７）個の炭素の飽和鎖のリンカーは、典型的に、ＲｈｙのＮ^１部位において表１〜３に示される置換基を接合するために使用される場合、機能的Ｒｈｙ誘導体を生成する際に有効である。置換基とＲｈｙの主要構造との間に同等の空間を提供する代替リンカー、例えば、１〜３１Å、好ましくは４〜２４Å、より好ましくは７〜１８Åのリンカー長は、機能的Ｒｈｙ誘導体をＥｐｈＡ４阻害剤として産生するために、本発明における使用に適している。一般に、異なる化学的及び構造的特徴を持つ任意のリンカーは、得られた誘導体が活性ＥｐｈＡ４阻害剤である限り、Ｒｈｙ誘導体の合成において使用され得、これは関連研究分野において既知、及び／または本明細書に記載される機能アッセイにおいて検証され得る。

一旦Ｒｈｙの化学誘導体が得られると、次にＥｐｈＡ４シグナル伝達に対するその潜在的阻害活性を、研究分野で既知であるか、または記載される１つ以上のアッセイ（例えば、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイ、ＥｐｈＡ４依存性成長円錐崩壊アッセイ）において、検証のために試験する。ほとんどの場合、候補化合物の不在下でのシグナル伝達のレベルと比較して、ＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達のレベルに対する少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはさらに高いパーセンテージの負の効果が、候補化合物の存在下で検出された場合、この化合物は阻害剤と見なされる。正の対照としてＲｈｙを含む機能アッセイが行われる場合が多い。誘導体の阻害効果は、Ｒｈｙの阻害効果の＋／−１０％以内である場合、誘導体は、ＥｐｈＡ４阻害剤としてＲｈｙに対する同等の活性を有すると見なされる。一方で、誘導体の阻害効果が、Ｒｈｙのそれより少なくとも２０％、例えば、Ｒｈｙのそれより少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上高い場合、誘導体は、ＥｐｈＡ４阻害剤としてＲｈｙに対して強化された活性を有すると見なされる。

「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」という用語は、本明細書で使用される場合、１つのメンバーを持つ態様を含むだけでなく、複数のメンバーを持つ態様も含む。例えば、請求項１に記載される１つの化合物を使用することを含む処置方法の実施形態は、該方法が、請求項１に記載される２つ以上の化合物を使用することを含む態様を含む。

数値を修飾するために本明細書で使用される「約」という用語は、その値の周囲の定義された範囲を示す。「Ｘ」が値である場合、「約Ｘ」は、０．９Ｘ〜１．１Ｘの値、より好ましくは０．９５Ｘ〜１．０５Ｘの値を示す。「約Ｘ」に対するいかなる言及も、具体的に少なくとも値Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、及び１．０５Ｘを示す。したがって、「約Ｘ」は、例えば、「０．９８Ｘ」の請求制限に対する文書記述支援を教示及び提供することが意図される。

量「Ｘ」が全整数値（例えば、「Ｘ個の炭素」）のみを許し、Ｘが最大１５である場合、「約Ｘ」は、（Ｘ−１）〜（Ｘ＋１）を示す。この場合、「約Ｘ」は、本明細書で使用される場合、少なくとも値Ｘ、Ｘ−１、及びＸ＋１を具体的に示す。Ｘが少なくとも１６である場合、値０．９０Ｘ及び１．１０Ｘは、範囲の境界を定義するために最も近い全整数値に四捨五入される。

修飾子「約」が、数値範囲の先頭を記載するために適用される場合、それは範囲の両端に適用する。したがって、「約５０〜２５０ｍｇ」は、「約５０〜約２５０ｍｇ」と等しい。「約」が一組の値の最初の値を記載するために適用される場合、それはその組の全ての値に適用する。したがって、「約１００、１５０、または２００ｍｇ」は、「約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、または約２００ｍｇ」と等しい。しかしながら、修飾子「約」は、その範囲の最後のみ、またはその値の組の後の値のみを記載するために適用され、それはその範囲の値または端のみに適用する。したがって、範囲「約５〜９」は、「約５〜約９」と同じであるが、範囲「５〜約９」は同じではない。

「アシル」は、本明細書で使用される場合、本明細書に定義されるアルカノイル、アルケノイル、アロイル、ヘテロシクロイル、ヘテロアロイル、またはビオチニル基を含む。代表的なアシル基は、アセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、ニコチノイル、シンナモイル、ビオチニル、及び同様のものを含む。

「アシルアルキル」は、本明細書で使用される場合、アシル基置換基を持つアルキル基（好ましくは、メチル基）を含む。代表的なアシルアルキルは、ベンゾイルメチル、３−フェニルアクリロイル）メチル、（４−メトキシベンゾイル）メチル、及び同様のものを含む。

「アルカノイル」は、本明細書で使用される場合、アルキル−Ｃ（Ｏ）−基を含み、アルキル基は、本明細書に定義されるとおりである。代表的なアルカノイル基は、アセチル、エタノイル、及び同様のものを含む。

「アルケノイル」は、本明細書で使用される場合、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−基を含み、アルケニル基は、本明細書に定義されるとおりである。代表的なアルケノイル基は、シンナモイル、アクリロイル、メタクリロイル、３−フェニルアクリロイル、３−（４−メトキシフェニル）アクリロイル、及び同様のものを含む。

「アルケニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む２〜約１５個の炭素原子の直鎖または分岐鎖脂肪族炭化水素基を含み、シス−またはトランス−立体異性体であり得る。好ましいアルケニル基は、２〜約１２個の炭素原子を有し、アルケンに共役したアリール置換基を含み得る（例えば、トランス−２−フェニルエテニル、シス−３−フェニルプロプ−２−エニル、シス−２−フェニルエテニル、トランス−２−（４−メトキシフェニル）エテニル、シンナミル）。「低級アルケニル」は、本明細書で使用される場合、２〜約６個の炭素原子のアルケニルを含む。代表的なアルケニル基は、ビニル、アリル、ｎ−ブテニル、２−ブテニル、３−メチルブテニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、デセニル、及び同様のものを含む。

「アルケニレン」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重または三重結合を含む直鎖または分岐鎖二価炭素鎖を含む。好ましいアルケニレン基は、鎖に４〜約１２個の炭素を含み、より好ましいアルケニレン基は、鎖に５〜約９個、または６個、７個、もしくは８個の炭素を含む。一態様では、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第２の態様では、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい。代表的なアルケニレン基は、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−、−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２−、エチニレン、プロピニレン、ｎ−ヘキシ−２−イニレン、トランス−オクト−４−エニレン、及び同様のものを含む。

「アルコキシ」は、本明細書で使用される場合、アルキル−Ｏ−基を含み、アルキル基は、本明細書に定義されるとおりである。代表的なアルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ヘプトキシ、及び同様のものを含む。

「アルコキシカルボニル」は、本明細書で使用される場合、エステル基、すなわちアルキル−Ｏ−ＣＯ−基を含み、アルキル基は、本明細書に定義されるとおりである。代表的なアルコキシカルボニル基は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、及び同様のものを含む。

「アルキル」は、本明細書で使用される場合、脂肪族炭化水素基を含み、鎖に約１〜約２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖であり得る。好ましいアルキル基は、鎖に１〜約１２個の炭素原子を有する。より好ましいアルキル基は、鎖に１〜１０個または１〜６個の炭素原子を有する。「分岐鎖」は、本明細書で使用される場合、メチル、エチル、またはプロピル等の１つ以上の低級アルキルが、直鎖アルキル鎖に結合される。「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、鎖に１〜約６個の炭素原子、好ましくは５個または６個の炭素原子を含み、直鎖または分岐鎖であり得る。代表的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及び３−ペンチルを含む。

「アルキレン」は、本明細書で使用される場合、二価鎖自体に２〜約１２個の炭素原子の直鎖または分岐二価炭素鎖を含む。好ましいアルキレン基は、二価水素鎖自体に３〜１０個、３〜９個、５〜９個、または６〜８個の炭素原子を有する中間範囲のアルキレン基である（すなわち、−ＣＨ_２−基等の３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の炭素のうちのいずれか）。いくつかの実施形態では、二価鎖中の炭素原子は、ヘテロ原子によって、例えば、ポリアルキレングリコールリンカー内で置換される（例えば、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２−、ｎは１〜４である）。好ましくは、アルキレン基は、直鎖炭化水素である。代表的なアルキレン基は、１，６−ヘキシレン、１，７−ヘプタレン、１，８−オクタレン、及び同様のものを含む。

「アルキニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む２〜約１５個の炭素原子の直鎖または分岐鎖脂肪族炭化水素基を含む。好ましいアルキニル基は、２〜約１２個の炭素原子を有する。より好ましいアルキニル基は、２〜約６個の炭素原子を含む。「低級アルキニル」は、本明細書で使用される場合、２〜約６個の炭素原子のアルキニルを含む。代表的なアルキニル基は、プロピニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル、ヘプチニル、及び同様のものを含む。

「アミノ」は、本明細書で使用される場合、式Ｙ^１Ｙ^２Ｎ−の基を含み、式中、Ｙ^１及びＹ^２は、独立して、水素、アシル、アリール、またはアルキルであるか、またはＹ^１及びＹ^２が、Ｙ_１及びＹ_２がそれを通じて結合する窒素と一緒に接合し、４員〜７員のアザヘテロシクリル基（例えば、ピペリジニル）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｙ_１及びＹ_２が、独立して水素またはアルキルである場合、追加の置換基を窒素に追加することができ、第４級アンモニウムイオンを形成する。代表的なアミノ基は、一次アミノ（Ｈ_２Ｎ−）、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリチルアミノ、ピロリジニル、及び同様のものを含む。好ましくは、「アミノ」は、−ＮＲＲ′基であり、Ｒ及びＲ′は、独立して、Ｈ及びアルキルからなる基から選択されるメンバーである。好ましくは、Ｒ及びＲ′のうちの少なくとも１つはＨである。代替として、「アミノ」は、好ましくはアザヘテロシクリル基（例えば、ピロリジニル）である。

「芳香環」は、本明細書で使用される場合、酸素、硫黄、セレニウム、及び窒素からなる群から選択される０〜４個のヘテロ原子を含み得る、５〜１２員芳香族単環式または融合多環式部分を含む。例示的芳香環は、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ナフタレン、ベンザチアゾリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンズインドール、キノリン、及び同様のものを含む。

「アロイル」は、本明細書で使用される場合、アリール−ＣＯ−基を含み、アリールは、本明細書に定義される。代表的なアロイルは、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、５−メトキシ−２−ニトロベンゾイル、２−ヨードベンゾイル、３，４−ジメトキシベンゾイル、４−ヒドロキシベンゾイル、４−（ベンジルオキシ）ベンゾキシル、２−ヨード−４−ブロモベンゾイル、及び同様のものを含む。

「アリール」は、本明細書で使用される場合、６〜約１４個の炭素原子、好ましくは６〜約１０個の炭素原子の芳香族単環式または多環式環系を含む。好ましい実施形態では、アリール基は、非置換（例えば、フェニル）であるか、またはハロ、アルキル、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、ヒドロキシル、ベンゾイル、ニトロ、及び同様のものを含む群から選択される１〜３個の置換基で置換される。代表的なアリール基は、フェニル、ナフチル、３，４−ジメトキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル、４−ベンジルオキシフェニル、５−メトキシ−２−ニトロフェニル、２−ヨードフェニル、及び２−ヨード−４−ブロモフェニルを含む。

「アリールアルキル」は、本明細書で使用される場合、アリール置換基を持つアルキル基を含む。好ましくは、アリールアルキル基は、ベンジル等のアリールメチル基である。代表的なアリールアルキル基は、ベンジル、２−フェニルベンジル、３−クロロベンジル、３−メトキシベンジル、４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル、４−メチルベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、３−ベンゾイルベンジル、４−ブロモベンジル、４−ベンゾイルベンジル、２，６−ジクロロベンジル、及び同様のものを含む。

「アリールアルキレン」は、本明細書で使用される場合、アリール基を含むアルキレン鎖を含む。代表的なアリーレン基は、−ＣＨ_２（１，４−Ｃ_６Ｈ_４）ＣＨ_２−、及び同様のものを含む。

「ビオチニル」は、本明細書で使用される場合、次の構造の置換基を含む

。好ましくは、ビオチニル置換基は、天然ビオチンと同じ立体化学を有する。

「ジェミナル」置換基は、本明細書で使用される場合、同じ原子に直接結合される２つ以上の置換基を含む。一例は、シクロヘキシルまたはスピロシクロヘキシル環上の３，３−ジメチル置換である。

「ハロ」または「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを含む。

「ヘテロ原子」は、本明細書で使用される場合、炭素または水素以外の原子を含む。代表的なヘテロ原子は、Ｏ、Ｓ、及びＮ、好ましくはＯ及びＮを含む。ヘテロ原子の窒素または硫黄原子は、随意に、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド（スルホキシド）、またはＳ，Ｓ−ジオキシド（スルホン）に酸化される。好ましい態様では、ヘテロ原子は、アルキレン炭素原子に対して少なくとも２つの結合を有する（例えば、−Ｃ_１〜Ｃ_９アルキレン−Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_９アルキレン−）。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、アシル、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基（例えば、−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｎ（Ａｃ）−）でさらに置換される。

「ヘテロアロイル」は、本明細書で使用される場合、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−基を含み、ヘテロアリールは、本明細書に定義されるとおりである。代表的なヘテロアロイル基は、チオフェノイル、ニコチノイル、ピロール−２−イルカルボニル、ピリジノイル、及び同様のものを含む。

「ヘテロシクロイル」は、本明細書で使用される場合、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−基を含み、ヘテロシクリルは、本明細書に定義されるとおりである。代表的なヘテロシクロイル基は、Ｎ−メチルプロリノイル、テトラヒドロフラノイル、及び同様のものを含む。

「ヘテロシクリル」は、本明細書で使用される場合、約３〜約１０個の環原子、好ましくは約５〜約１０個の環原子の非芳香族飽和単環式または多環式環系を含み、環系内の原子のうちの１つ以上は、炭素以外の１つまたは複数の元素、例えば、窒素、酸素、または硫黄である。好ましいヘテロシクリル基は、約５〜約６個の環原子を含む。ヘテロシクリル基は、随意に、少なくとも１つのｓｐ^２−ハイブリダイズ原子（例えば、カルボニル、環内オレフィン、または環外オレフィンを組み込む環）を含む。ヘテロシクリルの前の接頭辞「アザ」、「オキサ」、または「チア」は、少なくとも窒素、酸素、または硫黄原子が、それぞれ環原子として存在することを意味する。ヘテロシクリルの窒素または硫黄原子は、随意に、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド、またはＳ，Ｓ−ジオキシドに酸化される。代表的な単環式ヘテロシクリル環は、ピペリジル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，３−ジオキソラニル、１，４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、及び同様のものを含む。

「ヘテロアリール」は、本明細書で使用される場合、約５〜約１４個の環原子、好ましくは約５〜約１０個の環原子の芳香族単環式または多環式環系を含み、環系の原子のうちの１つは、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素、または硫黄である。好ましいヘテロアリールは、約５〜約６個の環原子を含む。ヘテロアリールの前の接頭辞「アザ」、「オキサ」、または「チア」は、少なくとも窒素、酸素、または硫黄原子が、それぞれ環原子として存在することを意味する。ヘテロアリールの窒素原子は、随意に、対応するＮ−オキシドに酸化される。代表的なヘテロアリールは、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、３−キノキサリン−２（１Ｈ）−オニル、ピラジニル、フラニル、チエニル、ピリミジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、フラザニル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン、イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル、ベンゾフラザニル、インドリル、アザインドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、イミダゾリル、チエノピリジル、キナゾリニル、チエノピリミジル、ピロロピリジル、イミダゾピリジル、イソキノリニル、ベンゾアザインドリル、１，２，４−トリアジニル、ベンゾチアゾリル、及び同様のものを含む。

「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で使用される場合、ヘテロアリール基置換基を持つアルキル基を含む。好ましくは、ヘテロアリールアルキル基は、２−ピリジルメチル等のヘテロアリールメチル基である。代表的なヘテロアリールアルキル基は、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチル、４−ピリジルメチル、及び（３−キノキサリン−２（１Ｈ）−オニル）メチルを含む。

任意の２つの置換基または同じ置換基の任意の２つの例が、代替例の一覧から「独立して選択される」場合、それらは同じ、または異なり得る。例えば、Ｒ^ａ及びＲ^ｂが、独立して、メチル、エチル、ベンジル、及びプロピルからなる群から選択される場合、次に２つのＲ^ａ基及び２つのＲ^ｂ基を持つ分子は、全てメチルである基を有し得る。代替として、第１のＲ^ａは、メチルであり得、第２のＲ^ａは、エチルであり得、第１のＲ^ｂは、プロピルであり得、第２のＲ^ｂは、ベンジル（またはその群から得られる任意の他の置換基）であり得る。代替として、Ｒ^ａ及び第１のＲ^ｂの両方は、エチルであり得るが、第２のＲ^ｂは、ベンジルであり得る（すなわち、置換基のいくつかの対は同じであり得るが、他の対は異なり得る）。

「オキソ」は、本明細書で使用される場合、式＞Ｃ＝Ｏの基を含む（すなわち、カルボニル基−Ｃ（Ｏ）−）。

「スピロシクロアルキル」は、本明細書で使用される場合、炭素原子上のジェミナル置換基が置換されて１，１−置換環を形成するシクロアルキルを含み、スピロシクロアルキニルは、炭素原子上のジェミナル置換基が置換されて１，１−置換環を形成するシクロアルキニルである。

一般に、単位接頭辞「ｕ」は、本明細書で使用される場合、「μ」または「マイクロ」と等しい。例えば、「ｕＬ」は、「μＬ」または「マイクロリットル」と等しい。

Ｃ．ＥｐｈＡ４阻害剤の使用
本出願に記載されるＥｐｈＡ４阻害剤は、過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる神経変性障害を含む種々の疾患及び状態、例えば、アルツハイマー病、脊髄損傷、パーキンソン病、頭部損傷（例えば、外傷性脳損傷）、末梢神経再生、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、聴覚障害、多発性硬化症、気分障害、及び癌等のアミロイドβ誘発性神経障害を治療するために有用である。具体的に、それらは、脳卒中、ＡＬＳ、脊髄損傷、及び癌の治療のために、それを必要とする患者に有効量で投与される場合に有用である。「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、物質が投与される治療効果をもたらす量を指す。これらの効果は、任意の検出可能な程度の疾患／状態の症状及び関連合併症の進行の防止、訂正、または阻害を含む。正確な量は、治療薬の性質、投与の方法、及び治療の目的に依存し、既知の技法を使用して当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照）。

ＥｐｈＡ４受容体は、多くの病期の治療標的として示される。例えば、ＥｐｈＡ４シグナル経路は、虚血から生じるアポトーシス細胞死につながる。エフリンＡ３及びＥｐｈＡ４の発現は、一過性前脳虚血後に海馬内で著しく増加する。しかしながら、ＥｐｈＡ４の阻害は、アポトーシスニューロン細胞死を低減し、したがって、ＥｐｈＡ４シグナル伝達が、虚血後のアポトーシスに関与することを示す（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．５１８（２）：９２−５，２０１２）。さらに、最近の研究は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達カスケードの薬学的阻害が、機能回復に影響し、より具体的には、虚血性脳卒中後の運動機能を改善することを示す（Ｌｅｍｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２２（１１）：２２１４−２０，２０１３）。

ＥｐｈＡ４阻害は、運動ニューロンの進行性変性を特徴とする致死的神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）における神経変性もレスキューする。ＡＬＳにおける変性に最も影響を受け易い運動ニューロンが、より高レベルのＥｐｈＡ４を発現することが示された。さらに、ＥＰＨＡ４発現と疾患の発症及び生存との間の逆相関が、ＡＬＳ患者において観察された。さらに、ＥｐｈＡ４ノックダウンは、家族性ＡＬＳを引き起こす別のタンパク質である変異ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３の発現によって誘発された軸索変性症をレスキューする。これらの発見は、ＥｐｈＡ４が、ＡＬＳにおける運動ニューロン変性及び疾患の進行を調節し、ＡＬＳにおける治療戦略としてのＥｐｈＡ４阻害の使用を強調することを示す（Ｆａｒｕｑｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１１（１０）：７４７，２０１２、Ｖａｎ Ｈｏｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．１８（９）：１４１８−２２，２０１２）。

ＥｐｈＡ４阻害は、脊髄損傷（ＳＣＩ）においても有望な治療能力を示す。ＳＣＩを持つ個体は、麻痺している場合が多く、軸索が成長及び再生する能力の制限に起因して、機能の喪失を回復する可能性はほとんどない。しかしながら、ＥｐｈＡ４は近年、軸索阻害及び星状細胞神経膠症に関与していた。ＥｐｈＡ４遺伝子を欠失するマウスは、より少ない神経膠症を呈し、脊髄半側切断後のそれらの病変脊髄における神経膠瘢痕を著しく低減し、さらに、ＥｐｈＡ４^−／−マウスにおける神経学的転帰は、野生型対照と比較して劇的に改善する（Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４（４５）：１００６４−７３，２００４）。さらに、ＥｐｈＡ４阻害剤の投与は、ＳＣＩの動物モデルにおけるＳＣＩ後の自発運動機能の著しい回復を実証した（Ｓｐａｎｅｖｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．３０（１２）：１０２３−３４，２０１３）。

ＥｐｈＡ４は、癌にも関与している。受容体は、胃癌（Ｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１４：５６５０−５６５６，２００８、Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１３：１９，２０１３）、直腸結腸癌（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．３３：５７３−５７７，２００８）、及び膵臓癌（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ．７（６）：２１６５−２１６９，２０１４）等の種々のヒト癌において上方調節される。ＥｐｈＡ４の高発現は、侵襲、病理学的状態、及び遠隔転移を含む腫瘍進行と相関する（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１３：１９，２０１３）。例えば、脳腫瘍におけるＥｐｈＡ４発現は、正常な脳組織内よりも４倍高いことが示された。さらに、ＥｐｈＡ４は、神経膠芽細胞の増殖及び移行を促進することによって、神経膠芽腫の悪性表現型において重要な役割も果たす（Ｆｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（９）：２７６８−７８，２００８）。したがって、ＥｐｈＡ４阻害剤は、抗癌治療戦略における重要な治療薬である。

さらに、ＥｐｈＡ４は、成体脳内の神経前駆細胞と呼ばれる細胞を増殖させることから機能的ニューロンを産生するプロセスである、成体神経新生において役割を果たす。インビボ研究及びインビトロ研究の両方は、このプロセスが種々の環境因子によって調節され得ることを示唆する。例えば、富化環境、運動、及び学習は、成体神経新生を刺激し得るが、慢性ストレスまたは加齢は、反対に影響する。累積証拠は、鬱病の病因が、海馬内の生体神経新生の欠陥に非常に関連することをさらに示唆する（Ｍａｓｉ ａｎｄ Ｂｒｏｖｅｄａｎｉ，２０１１ ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ ２５，９１３−３１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４，１５３−７９）。慢性ストレスは、恐らく上昇したレベルのグルココルチコイド放出に起因して、成体神経新生の抑制を引き起こす。追加として、抗鬱治療（例えば、イミプラミン及びフルオキセチン）は、成体脳内で神経新生を上方調節することが示され、成体神経新生が、鬱病の病因における中核因子であるという見解をさらに支持する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４，１５３−７９、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｎｅｕｒｏｎ ７９，６６５−７９、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｎｅｕｒｏｎ ６２，４７９−９３）。成体神経新生を刺激し得る薬剤は、鬱病を治療するための新たな治療戦略を提供する。それらの研究では、本発明者らは、Ｒｈｙの経口投与が、マウス海馬内で成体神経新生を増加させ、したがって鬱病または精神障害の治療に使用することができることを発見した。本明細書に記載されるＥｐｈＡ４阻害活性を有するＲｈｙの新規化学誘導体は、したがって、不安症及び鬱病等の神経学的／精神障害を治療するためにも有用である。

多発性硬化症（ＭＳ）は、本明細書に記載されるＥｐｈＡ４阻害剤によって治療され得る別の疾患である。ＭＳは、若年成人において最も一般的な障害を引き起こす神経学的疾患である（Ｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ ２００６ Ｎｅｕｒｏｎ ５２（１）：６１−７６）。原発性脱髄の広範囲にわたる局所病変を持つ中枢神経系の自己免疫疾患であり、変化する軸索、ニューロン及び星状膠細胞の損傷につながる（Ｌａｓｓｍａｎｎ ２０１３ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓ００１４−４８８６（１３）００３６１−０）。ＭＳの特徴である脱髄は、神経伝達を崩壊させ、幅広い症状をもたらす（Ｈｅｒｎaｎｄｅｚ−Ｐｅｄｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１３−４６５）。初期炎症カスケードは、ＣＮＳにおける常駐細胞の活性化から生じ、組織破壊、脱髄、及び進行性神経学的機能不全につながると考えられる（Ｈｅｒｎaｎｄｅｚ−Ｐｅｄｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１３−４６５）。エフリン及びＥｐｈは、シナプス可塑性及び神経幹細胞機能等の重要な役割を果たすだけでなく、それらは、胸腺の発生及びＴ／Ｂ細胞シグナル伝達等の免疫学的機能にも関わる（Ｓｏｂｅｌ ２００５ Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１５（１）：３５−４５、Ｍｕnｏｚ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（１）：１７７−８４５）。ＥｐｈＡ４の遮断は、創傷閉鎖を阻害し、掻創モデルにおける反応性星状細胞の蓄積を低減した（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ−Ｂａｔｔｅｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１１８（６）：１０１６−３１）。異常なエフリン／Ｅｐｈ発現は、多発性硬化症（ＭＳ）における病変の免疫病原性及び神経損傷に関わる（Ｓｏｂｅｌ ２００５ Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１５（１）：３５−４５）。ヒトＭＳ患者における別の研究では、慢性ＭＳ病変におけるものに対して、ＥｐｈＡ４タンパク質の増加が、活性ＭＳ病変内で見出された（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ−Ｂａｔｔｅｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１１８（６）：１０１６−３１）。まとめると、これらの研究は、ＭＳを含む急性ＣＮＳ傷害後の損傷の発生におけるＥｐｈＡ４の活性化のための役割を支持し、ＥｐｈＡ４のその阻害は（例えば、本明細書に記載されるＲｈｙの化学誘導体等のＥｐｈＡ４阻害剤の作用を介して）、ＭＳ及び他の神経変性疾患におけるＣＮＳ機能回復を促進する治療戦略である。

過剰活性化ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患または状態を治療する際に使用するために作製された薬学的組成物は、典型的に、活性成分としての１つのＥｐｈＡ４阻害剤（例えば、本明細書に特定される阻害剤のうちのいずれか１つ）と、薬学的／生理学的に許容される賦形剤または担体と、を含む。そのような組成物は、例えば、経口投与または注入を介して患者への意図された投与経路に対して特異的に製剤化され得る。ＥｐｈＡ４阻害剤は、本出願に記載されるような関連疾患を治療するための薬剤を製造する目的でも有用である。

Ｄ．薬学的組成物及び投与
本発明は、ＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達を阻害する有効量の化合物を含む、薬学的組成物または生理学的組成物も提供し、したがって、予防的用途及び治療的用途の両方で意図された利益を提供する。そのような薬学的または生理学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される賦形剤または担体も含む。本発明の薬学的組成物は、多様な薬物送達系における使用に適している。本発明における使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）において見出される。薬物送達のための方法に関する簡単なレビューは、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい。

本発明の薬学的組成物は、種々の経路によって、例えば、経口、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与され得る。薬学的組成物を投与する好ましい経路は、ＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達によって悪化した状態を患う臓器または組織に、１日当たり７０ｋｇの成人に対して約０．０１〜２５００ｍｇ、好ましくは２．５〜５００ｍｇのＥｐｈＡ４阻害剤の日用量で局所送達される。適切な用量は、単回日用量で、または適切な間隔で提示される分割用量として、例えば、１日当たり２回、３回、４回、またはそれ以上の副用量として投与され得る。

表１〜３に示されるもの等のＥｐｈＡ４阻害剤を含有する薬学的組成物を調製するために、不活性及び薬学的に許容される担体が使用される。薬学的担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固形調製物は、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤、及び坐薬を含む。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、滑剤、懸濁剤、結合剤、または錠剤崩壊剤として作用することもできる１つ以上の物質であり得、それは封入材料でもあり得る。

粉末では、担体は一般に、微細化活性成分との混合物、例えば、表１〜３のＥｐｈＡ４阻害剤である微細化固体である。錠剤では、活性成分（ＥｐｈＡ４シグナル伝達の阻害剤）は、適切な比率で必須結合特性を有する担体と混合され、所望の形状及び大きさに縮小される。

坐薬形態で薬学的組成物を調製するために、脂肪酸グリセリド及びココアバターの混合物等の低融点ワックスが最初に溶解し、活性成分は、例えば、撹拌することによってその中に分散される。次に溶融した均質混合物を、便宜的な大きさの型に注ぎ、冷却して凝固させる。

粉末及び錠剤は、好ましくは、約５重量％〜約７０重量％のＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達の阻害剤の活性成分を含む。適切な担体は、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、糖、ペクチン、デキストリン、スターチ、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター、及び同様のものを含む。

薬学的組成物は、阻害剤が（他の担体の有無に関わらず）担体によって取り囲まれる、カプセルを提供する担体としての封入材料と共に、ＥｐｈＡ４阻害剤の活性化合物の製剤を含み得、したがって担体が化合物と関連するようになる。同様の方法で、カシェ剤を含むこともできる。錠剤、粉末、カシェ剤、及びカプセルは、経口投与に適した固体剤形として使用することができる。

液体薬学的組成物は、例えば、経口または非経口投与に適した溶液、懸濁液、及び経口投与に適した乳剤を含む。活性成分の滅菌水溶液（例えば、表１〜３に見出されるもの等のＥｐｈＡ４阻害剤）、または水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、エタノール、またはプロピレングリコールを含む溶媒中の活性成分の滅菌溶液は、非経口投与に適した液体組成物の例である。これらの組成物は、生理学的条件に近付けるために必要とされる、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、洗剤、及び同様のもの等の薬学的に許容される補助物質を含有し得る。

滅菌溶液は、所望の溶媒系に活性成分（例えば、ＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤）を溶解すること、次に得られた溶液を膜フィルターに通してそれを滅菌するか、または代替として滅菌条件下で予め滅菌した溶媒中に滅菌化合物を溶解することによって調製され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と複合される。調製物のｐＨは、典型的に、３〜１１、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８である。

ＥｐｈＡ４阻害剤を含有する薬学的組成物は、予防的及び／または治療的治療のために投与され得る。治療用途では、組成物は、状態の症状及びある特定種の癌の発症、進行、及び転移等のその合併症を予防、治癒、逆転、または少なくとも部分的に減速もしくは停止させるのに十分な量で、ＥｐｈＡ４媒介性細胞シグナル伝達によって悪化し得る状態を既に患っている患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用途に有効な量は、疾患または状態の重症度、患者の体重及び全身状態に依存するが、一般に７０ｋｇの患者に対して１日当たり約０．１ｍｇ〜約２，５００ｍｇの範囲の阻害剤、より一般的に７０ｋｇの患者に対して１日当たり約２．５ｍｇ〜約５００ｍｇの阻害剤が使用される。

予防的適用では、ＥｐｈＡ４阻害剤を含有する薬学的組成物は、過剰なＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達が望ましくない疾患または状態にかかりやすい、またはそうでなければそれを発症する危険性がある患者に、それらの症状の発症を遅延または防止するのに十分な量で投与される。そのような量は、「予防上有効な用量」であると定義される。この用途では、阻害剤の正確な量は、患者の健康状態及び体重に依存するが、一般に７０ｋｇの患者に対して１日当たり約０．１ｍｇ〜約２，５００ｍｇの阻害剤の範囲、より一般的に７０ｋｇの患者に対して約２．５ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲である。

組成物の単回または多回投与は、治療する医師によって選択される用量レベル及びパターンで実行され得る。いかなる場合でも、薬学的製剤は、治療的または予防的のいずれかで、患者の体内でＥｐｈＡ４によって媒介される細胞シグナル伝達を効果的に阻害するのに十分なＥｐｈＡ４阻害剤の量を提供すべきである。

Ｅ．キット
本発明は、本発明の方法に従い、ＥｐｈＡ４シグナル伝達を阻害し、それ故に癌を治療するためのキットも提供する。該キットは、典型的に、（１）ＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達の阻害剤の有効量を有する薬学的組成物（例えば、表１〜３において特定される化合物）、及び（２）治療され得る患者のタイプ（例えば、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脳卒中、または過剰ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる種々の癌）、スケジュール（例えば、用量及び頻度）、ならびに投与経路等についての説明を含む、薬学的組成物を分注する方法に関する指示を含む情報試料を含む容器を含む。

Ｆ．実施例
実施例１：ＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達を遮断することは、Ａβ誘発性障害を軽減する
結果
Ａβは、ニューロン内のＥｐｈＡ４活性化を刺激する
ＥｐｈＡ４がＡＤ進行時のシナプス機能不全に関わるかどうかを調査するための最初のステップとして、発明者らは、ＡＤマウスモデルの海馬におけるＥｐｈＡ４タンパク質及びその活性の調節を調べた。ＥｐｈＡ４は、マウス海馬シナプトソーム画分において顕著に検出され、その発現は、発達及び加齢時に比較的未変化のままであり（図１ａ、図７）、これは、ＥｐｈＡ４が齧歯類海馬内で高度に発現するという以前の報告と一致する^{２７、２９}。受容体の自己リン酸化を反映する、６０２でのＥｐｈＡ４のチロシンリン酸化（Ｐ−Ｔｙｒ６０２ ＥｐｈＡ４）は、６〜１１ヶ月時点でマウス海馬のシナプトソーム画分において上方調節された（図７）。興味深いことに、Ｐ−Ｔｙｒ６０２ ＥｐｈＡ４レベルは、変異ヒトプレセニリン１及びヒト化ＡＰＰ（ＡＰＰｓｗｅＰＳ１ｄｅ９、以降ＡＰＰ／ＰＳ１と指定される）を、３ヶ月という早さで（野生型［ＷＴ］より約１．５倍早く）発現するＡＤトランスジェニックマウスモデルの海馬シナプトソーム画分において上昇した（図１ａ及びｂ）。シナプス可塑性の欠陥は、約６ヶ月時点でＡＤマウスモデルにおいて最初に観察され^{３０、３１}、これがアミロイド斑の沈着を進行させる。３月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬におけるＥｐｈＡ４活性の増加は、したがって、ＥｐｈＡ４がＡＤのシナプス機能不全に貢献する潜在的標的であるという見解と一致する。次に、ニューロン内のＥｐｈＡ４シグナル伝達が、ＡＤにおいてシナプス機能不全を引き起こす主要物質であると考えられるＡβによって活性化されるかどうかを調べた。チロシンリン酸化及びＥｐｈＡ４のクラスタ化の両方は、受容体の最大活性化に必要である^{１６、２６}。Ａβは、用量依存的に急性ラット海馬スライス中のＥｐｈＡ４のチロシンリン酸化を増加させたことが見出され（図１ｃ〜ｆ）、この増加は、早くも１時間時点で観察され、２時間時点でピークに達した（図１ｅ及びｆ）。Ａβは、培養した海馬ニューロン内のＥｐｈＡ４クラスタ化も強化した（図１ｇ及びｈ）。一方、シナプス後タンパク質ＰＳＤ−９５の斑点の数は、Ａβによる短期処置時にわずかに低減した（図１ｇ及びｈ）^５。Ａβ刺激は、ＥｐｈＡ４の下流標的であるサイクリン依存性キナーゼ５の活性化も強化した（図８）。まとめると、これらの結果は、Ａβが、海馬ニューロン内のＥｐｈＡ４活性化及びＥｐｈＡ４の下流シグナル伝達を急速に誘発することを示唆する。

ＥｐｈＡ４は、エフリン結合ドメイン、高システイン領域、及びフィブロネクチンＩＩＩ型反復ドメインを含む、Ｎ末端外部ドメインを持つＩ型膜貫通タンパク質である^３２。最近では、Ａβが、フィブロネクチン反復ドメインを介して別のＥｐｈファミリーメンバーＥｐｈＢ２と直接相互作用することが示され、これが受容体の分解及びそのシグナル伝達の下方調節につながる^１５。興味深いことに、ペプチド阻害剤（ＫＹＬペプチド）によるＥｐｈＡ４のリガンド結合ドメインの遮断は^３３、ＥｐｈＡ４のＡβ刺激性チロシンリン酸化を廃止した（図１ｉ及びｊ）。これらの発見は、ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用が、海馬ニューロン内のＡβ誘起性ＥｐｈＡ４活性化に重要であることを示唆する。

ＥｐｈＡ４活性化の遮断は、Ａβによって誘発されたシナプス機能不全を防止する。
シナプス伝達及び可塑性におけるＥｐｈＡ４の負の調節的役割を考慮すると^{２４、２７、２９}、ＥｐｈＡ４を活性化するＡβの能力は、ＡＤにおいて観察されたシナプス機能不全に貢献し得る。この仮説を検証するために、発明者らは、Ａβ誘発性樹状突起棘の喪失に対するＫＹＬペプチドの効果を調べた。２４時間のＡβ処置後、成熟海馬ニューロン内で突起棘密度の低減が観察されたが（図２ａ及びｂ、Ａβにおける０．４６±０．２１／μｍ対対照における０．６６±０．１／μｍ）、ＫＹＬペプチドとの共処置は、樹状突起棘のＡβ誘起性低減を廃止した（Ａβ及びＫＹＬペプチドの共処置における０．６１±０．１８／μｍ対ＫＹＬペプチド単独における０．５５±０．１３／μｍ、図２ａ及びｂ）。樹状突起棘の数を低減させることに加えて^３４、ＡＭＰＡＲ媒介性微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）の頻度の減少によって証明されるように、Ａβは、培養した海馬ニューロン内の神経伝達も低減する^８。Ａβによるニューロンの処置は、事象間間隔を著しく増加させ、これは頻度に反比例し、培養した海馬ニューロン内のｍＥＰＳＣの増幅のわずかな低減を伴う^８（図２ｃ〜ｅ、データ図示せず）。ＥｐｈＡ４活性化がＡβ媒介性神経伝達に必要とされるかどうかを検証するために、代替手法を使用し、内因性エフリンリガンドと相互作用し、したがってＥｐｈＡ４の活性化を防止する、ＥｐｈＡ４の非クラスタ化細胞外ドメイン（すなわち、ＥｐｈＡ４−Ｆｃ融合タンパク質）を追加することによってＥｐｈＡ４シグナル伝達を遮断した^２４。非クラスタ化ＥｐｈＡ４−Ｆｃは同様に、Ａβ誘発性シナプス抑制をレスキューし、ｍＥＰＳＣの事象間間隔のＡβ誘発性増加を遮断した（図２ｃ〜ｅ）。Ａβ刺激性シナプス機能不全のＥｐｈＡ４の重要性は、ＥｐｈＡ４^−／−ニューロン内でさらに確認される。Ａβは、ＷＴマウス（ＥｐｈＡ４^＋／＋）から調製されたニューロン内で、ｍＥＰＳＣ頻度を約４０％低減したが、この現象は、Ｆｃ条件のものと同様に、ＥｐｈＡ４^−／−マウスから培養した海馬ニューロン内で廃止された（図２ｃ〜ｅ、図９）。興味深いことに、それぞれ［２，５−ジメチルピロリル安息香酸（Ｃｐｄ１）］^３５または［ロスコビチン（Ｒｏｓ）］^２４によるＥｐｈＡ４またはＣｄｋ５の遮断は、ｍＥＰＳＣの事象間間隔のＡβ誘発性増加の低減によって反映されるように、神経伝達におけるＡβ刺激性低減も減衰した（図２ｆ〜ｈ）。まとめると、これらの観察は、ＥｐｈＡ４／Ｃｄｋ５シグナル伝達の遮断が、神経伝達のＡβ誘発性抑制をレスキューすることを示す。

ＥｐｈＡ４シグナル伝達の遮断は、ＡＤにおける海馬シナプス可塑性の障害を逆転させる。
シナプス可塑性におけるＡβ誘発性障害のＥｐｈＡ４シグナル伝達を遮断する効果を評価するために、発明者らは、ＥｐｈＡ４阻害剤（すなわち、非クラスタ化ＥｐｈＡ４−Ｆｃタンパク質またはＫＹＬペプチド）の存在下、Ａβ処置時に海馬スライス内の海馬シェファー側枝（ＳＣ）経路中のＬＴＰを測定した。高頻度刺激（ＨＦＳ）は、ＳＣ−ＣＡ１ ＬＴＰの程度の著しい増加を誘起したが、ＬＴＰは、Ａβで処置したスライスにおいて阻害された^３、３６（図３ａ〜ｄ）。非クラスタ化ＥｐｈＡ４−Ｆｃ（１０μｇ／ｍＬ）（図３ａ及びｂ）またはＫＹＬペプチド（３０μＭ）（図３ｃ及びｄ）のいずれかで３０分間スライスを前処置することは、ＬＴＰのＡβ誘発性抑制を防止した。ＥｐｈＡ４−ＦｃまたはＫＹＬペプチド単独による処置は、ＨＦＳ誘発性ＬＴＰに著しく影響しなかった（図３ａ〜ｄ）。まとめると、本発見は、ＥｐｈＡ４媒介性シグナル伝達を遮断することが、興奮性シナプス伝達及びシナプス可塑性におけるＡβ誘発性障害を軽減することを実証する。

次に、発明者らは、ＥｐｈＡ４シグナル伝達の遮断が、ＡＤマウスモデルにおいて障害したシナプス可塑性をレスキューすることができるかどうかを調べた。ＨＦＳ誘起性海馬ＳＣ−ＣＡ１ ＬＴＰは、同腹子対照と比較して６〜７月齢ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて障害された^３１（図３ｅ及びｆ）。浸透圧ポンプを使用したＫＹＬペプチドの脳内注入による約３週間の脳内のＥｐｈＡ４シグナル伝達の遮断は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＬＴＰ形成を回復した（図３ｅ及びｆ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｔｇ）は、ビヒクル対照を持つＷＴと比較した場合、興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）の低減した勾配を呈したが、ＬＴＰの減少は、ＫＹＬを注入したＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて回復した（１７μｇ、０．２３μｇ／μＬ）。同様に、３〜４週間のレンチウイルスベースのＥｐｈＡ４ ｓｈＲＮＡによるＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬のＣＡ１領域内のＥｐｈＡ４発現の枯渇は、ＬＴＰの障害を軽減した（図３ｇ及びｈ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ウイルスに感染したＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＬＴＰの低減は、ＧＦＰを発現するＷＴマウスと比較した場合、海馬のＣＡ１領域内のＥｐｈＡ４ノックダウンによって部分的にレスキューされた。この部分的レスキューは、ＥｐｈＡ４−ｓｈＲＮＡ発現ウイルスによるＣＡ１領域内の一部のニューロンのみの感染によって説明され得る（データ図示せず）。まとめると、これらの発見は、正常なシナプス伝達の回復及びＬＴＰ障害のレスキューによって証明されるように、ＥｐｈＡ４シグナル伝達の阻害がＡＤマウスモデルにおけるシナプス機能不全を軽減することを示す。したがって、ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用を遮断することが、ＡＤに対する有望な介入戦略であるかどうかを研究することが大きな関心事である。

ウイルススクリーニングによって特定された小分子ＥｐｈＡ４阻害剤
ＥｐｈＡ４−リガンド錯体の詳細な構造分析は^{３２、３７、３８}、ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用を調節する小分子の仮想スクリーニングに対して有望な基礎を提供する。具体的に、ＥｐｈＡ４の外部ドメイン内のリガンド結合ポケットの固有性は、受容体を小分子スクリーニングにとって理想的な標的にする^{３７、３９}。したがって、発明者らは、分子ドッキングを通じて、ＥｐｈＡ４阻害剤の社内漢方薬データベースの仮想スクリーニングを行った。分子ドッキングは、ＥｐｈＡ４の細胞外ドメインと、高スループットスクリーニングによって以前に特定された市販のＥｐｈＡ４阻害剤、Ｃｐｄ１^３５と一緒に２２５化合物を含む社内漢方薬データベースとの間で行った。小分子Ｒｈｙは、最低ドッキングエネルギーでＥｐｈＡ４に結合する上位３化合物のうちの１つとして特定された。Ｒｈｙは、中枢神経系疾患を標的とする処方で一般的に使用される漢方薬カギカズラ（Ｍｉｑ）ジャック（ＵＲ）の主要なアルカロイド成分である^４０。それにもかかわらず、ＡＤ等の神経変性疾患におけるＲｈｙの臨床適用は、調査されていない。さらに、この小分子は、神経保護活性を呈することが報告されているが、その基礎にある機序は、主に未知である^４０。ドッキング分析において、Ｒｈｙは、以前に特定されたＥｐｈＡ４阻害剤Ｃｐｄ１（−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりも著しく低いドッキングエネルギー（−９．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を付与する。これは、Ｃｐｄ１のものよりも高いＥｐｈＡ４との結合能力を呈した（約６７倍高いＥｐｈＡ４との結合親和性、図４ａ）^３９。Ｒｈｙのこの強力な結合親和性は、ヒトＥｐｈＡ４のリガンド結合ドメインとのその大きな相互作用界面に起因し得る（図４ａ）。明らかに、Ｒｈｙは、ＥｐｈＡ４のリガンド結合チャネル上の複数の疎水性残基との広範な接触を形成する（図４ａ）。プルダウン分析は、ビオチン化Ｒｈｙ（Ｂｉｏ−Ｒｈｙ）が、ＥｐｈＢ２のものではなく、ＥｐｈＡ４の細胞外ドメインに特異的に結合したことを明らかにした（図４ｂ）。Ｒｈｙが、細胞状況においてＥｐｈＡ４に結合するためにエフリン−Ａと競合するかどうかを実証するために、Ｒｈｙによる前処置が、ＥｐｈＡ４を発現する細胞系であるＨＴ−２２細胞上の外因性エフリン−Ａ１の結合を低減したかどうかを調べた^４１。ＫＹＬペプチドによる前処置と同様に、Ｒｈｙ前処置は、ＨＴ−２２細胞に対するエフリン−Ａ１の結合を低減し（図４ｃ、図１０）、Ｒｈｙが細胞表面上の受容体結合のためにエフリン−Ａ１と競合することを示唆している。ＥｐｈＡ４阻害剤としてのＲｈｙの有効性は、ＥｐｈＡ４依存性シグナル伝達及び機能に拮抗するその能力によってさらに確認された。エフリン−Ａ１刺激は、培養した海馬ニューロン内のＥｐｈＡ４チロシンリン酸化、ＥｐｈＡ４クラスタの数、及びＥｐｈＡ４依存性成長円錐崩壊を増加させたが、Ｒｈｙによる前処置は、ＥｐｈＡ４の特異的リン酸化（図４ｄ及びｅ）及びクラスタ化（図４ｆ、図１１）、ならびに成長円錐崩壊（図４ｇ）を用量依存的に低減した。

Ｒｈｙの経口投与は、ＡＤマウスモデルにおける海馬シナプス可塑性の阻害を逆転させる
ＥｐｈＡ４シグナル伝達の遮断がＡＤ進行中に神経伝達及びシナプス可塑性を強化することを考慮して、Ａβ誘発性シナプス欠陥に対するＲｈｙの効果をさらに調べた。重要なことに、培養した海馬ニューロンのＲｈｙによる前処置は、ｍＥＰＳＣ及びＬＴＰのＡβ誘発性障害をレスキューした。Ａβは、ｍＥＰＳＣの頻度を低減した（すなわち、事象間間隔を増加させた）が、Ｒｈｙは、ｍＥＰＳＣ頻度のＡβ誘発性低減をレスキューした（図５ａ〜ｃ）。さらに、培養した海馬ニューロンのＲｈｙによる前処置は、ＡβがＬＴＰを抑制するのを防止したが、Ｒｈｙ単独での処置は、海馬ＬＴＰに影響しなかった（図５ｄ及びｅ）。重要なことに、３〜４週間の約５月齢ＡＰＰ／ＰＳ１マウスへのＲｈｙの経口投与（５０ｍｇ・ｋｇ^−１・日^−１）は、シナプス可塑性の障害を軽減した（図５ｆ及びｇ）。ＷＴマウスと比較して、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｔｇ）は、ＨＦＳに反応してＬＴＰの減少を呈した。Ｒｈｙ投与は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＬＴＰの低減を完全にレスキューした。Ｒｈｙは、高レベルのヒトＡＰＰのスウェーデン変異形態を発現する、別のＡＤマウスモデル、Ｔｇ２５７６マウスにおいて、用量依存的にＬＴＰ阻害に対する類似のレスキュー効果を呈した（図１２）。

ＡＤマウスモデルにおいてシナプス変化をレスキューすることに加えて、Ｒｈｙは、ＡＤ病理のある特定の特徴も改善した。発明者らは、アミロイド斑の数及び総面積が、水による処置と比較して、Ｒｈｙの１０週間投与後にＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質及び海馬内で著しく減少したことを見出した（図６ａ〜ｅ）。アミロイド斑を取り囲む小膠細胞の活性化は、アミロイド斑の沈着と相関する^４２。広範な斑関連小膠細胞症は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質内で発生したが、Ｉｂａ１染色によって明らかになるように、Ｒｈｙを投与したＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて斑関連反応性小膠細胞症の著しい低減が観察された（図６ｆ〜ｈ）。したがって、仮想スクリーニングによってＥｐｈＡ４の小分子阻害剤として特定されたＲｈｙは、ＡＤマウスモデルのシナプス可塑性の欠陥を効果的にレスキューし、ＡＤの進行を減速させた。

考察
新たに出現した証拠は、ＡＤにおいて神経ネットワーク障害及び認知低下に関わるシナプス喪失及び機能不全が、早期ＡＤ発症の主因を表し得ることを明らかにした。したがって、シナプス機能不全の軽減は、ＡＤにおける認知低下の治療のための有望な治療手法である。本発見は、ＥｐｈＡ４が、ＡＤにおけるシナプス機能不全を媒介する際に重要な役割を果たし、ＡＤの新たな治療標的であることを実証する。ペプチド及び小分子を含む、複数の手法を使用するＥｐｈＡ４−リガンド相互作用の遮断は、疾患の進行時に障害されたシナプス可塑性をレスキューすることができる。ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用を標的とする小分子阻害剤の開発は、ＡＤの有効な疾患修飾性治療であることが判明し得る。

ＥｐｈＡ４は、Ａβの細胞標的である
Ｅｐｈは、シナプス機能及び可塑性の調節に関係しているが、ＥｐｈファミリーのメンバーがシナプスにおけるＡβの細胞標的である可能性は、最近になって調査されたに過ぎない^{１５、２６}。ＥｐｈＢ２は、ＡＤにおいて下方調節され、Ａβ依存性シナプス機能不全を媒介するが^１５、本研究は、ＥｐｈＡ４が、ＡＤにおいて過剰活性化され、シナプス機能不全をもたらすことを明らかにした。最近のゲノムワイド関連分析（ＧＷＡＳ）は、単一ヌクレオチドポリ多型が、ＥＰＨＡ４の近位に位置することを特定し^４３、ＥＰＨＡ１遺伝子は、後期発症ＡＤと関連する^４４。ＥＰＨＡ４の変異または多型を特定することを目的とするさらなる研究は、ＥＰＨＡ４がＡＤと関連するかどうかを解明するように保証される。さらに、Ｅｐｈファミリーの異なるメンバーがどのように関わるか、及びこれらのシグナル伝達経路が、ＡＤ進行の間にクロストークするかどうかを調べることが重要である。

Ａβは、どのようにＥｐｈＡ４活性化を誘発するか？ＡβがフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインにおいてＥｐｈＢ２に結合すること^１５、及びＥｐｈＡ４がこの同じドメインも含むことを考慮すると、Ａβは、受容体に直接結合することによってＥｐｈＡ４活性化を刺激し得る。代替として、Ａβは、ＥｐｈＡ４シグナル伝達を誘起するようにエフリンＡ３−ＥｐｈＡ４相互作用を調節し得る。この可能性は、海馬内のシナプス後樹状ＥｐｈＡ４の活性化が、星状細胞内に存在するエフリン−Ａ３とのその相互作用に著しく依存し、ＥｐｈＡ４チロシンリン酸化が、エフリン−Ａ３−ノックアウトマウスの海馬内で減少し^４５、エフリン−Ａ３を発現するマウスにおいて増加する^４６という事実によって支持される。最後に、Ａβは、神経活動の調節によってＥｐｈＡ４活性化を強化し得る^４７。神経活動の慢性増加に反応するＥｐｈＡ４の活性化に関する発明者らの以前の発見は、この可能性と一致する^２７。

ＡＤにおけるＥｐｈＡ４の病態生理学的役割
ＥｐｈＡ４は、成体海馬内のシナプス構造及び機能の重要な調節因子である^{２４、２７、２９}。ＥｐｈＡ４とそのリガンドエフリン−Ａ３との間の相互作用は、双方向（すなわち、順方向及び逆方向）シグナルを産生し、それらの両方は、海馬機能の調節に重要である。星状細胞エフリンＡによるシナプス後ＥｐｈＡ４の活性化は、成体齧歯類海馬内のＥｐｈＡ４順方向シグナル伝達の活性化を可能にし、突起棘の喪失ならびに表面ＡＭＰＡ受容体の除去をもたらす^{２７、２９}。ＥｐｈＡ４は、恐らくアクチン細胞骨格の再組織化を通じて、Ｃｄｋ５−ＲｈｏＡ依存的に^２４、ＰＬＣγ１−コフィリン依存的に^４８、または接着受容体の調節によって^２３、樹状突起棘の後退を引き起こす。ＥｐｈＡ４は、培養した海馬ニューロン内のＡＭＰＡ受容体の分解をプロテアソーム依存的に誘起し、最終的にシナプスからのそれらの除去を誘起する^２７。樹状突起棘低減及びＡＭＰＡ受容体除去の両方は、ＡＤ進行中のシナプス喪失及び機能不全に貢献する重要な因子である^{１０、３４}。ＥｐｈＡ４の別の興味深い特徴は、受容体が、エフリン−Ａ３を通じて星状細胞中の逆シグナル伝達を誘起すること、及びグリア細胞中のグルタミン酸輸送体を低下させることによってグルタミン酸の取込みを調節することができるということである^４６。ＥｐｈＡ４−またはエフリン−Ａ３−ノックアウトマウスは、グリアグルタミン酸輸送体（例えば、ＧＬＡＳＴ及びＧＬＴ１）の発現の増加を呈するが、星状細胞内のエフリン−Ａ３過剰発現は、これらのタンパク質のレベルを低減する。したがって、ＥｐｈＡ４−エフリンＡ３逆シグナル伝達は、シナプス間隙におけるグルタミン酸蓄積を強化する。ＡＤマウスは、異常なグルタミン酸取込みを呈するが^４９、ＥｐｈＡ４逆シグナル伝達が、グルタミン酸取込みの異常調節によってＡＤにおけるシナプス機能不全に関わるかどうかを調べることは興味深いであろう。さらに、ＥｐｈＡ４は近年、脊髄損傷における炎症関連遺伝子の発現の調節に関与していた^５０。ＥｐｈＡ４が炎症等のＡＤ病理に貢献する他の経路を調節するかどうかは、依然として未知である。

ＡＤにおける治療介入のための標的としてのＥｐｈＡ４
シナプス機能不全を逆転させることは、ＡＤにおける認知低下に対する潜在的な治療戦略である。本研究におけるＡＤの細胞標的としてのＥｐｈＡ４の特定及びＥｐｈＡ４−リガンド相互作用の詳細な構造特徴は^{３２、３７、３８}、ＡＤの治療のためのＥｐｈＡ４阻害剤を開発することに対して大きな期待をもたらす。実際に、ＥｐｈＡ４及びエフリンを標的とするための種々の戦略（例えば、抗体のＦｃ領域に融合されたＥｐｈＡ４の組換え細胞外ドメイン、ならびにＥｐｈＡ４に結合する特定のペプチド及び小分子）^５１が開発された。本研究で特定された小分子、Ｒｈｙ、及びリガンド結合ドメインにおいてＥｐｈＡ４に結合し、エフリン結合を阻害するペプチドＫＹＬ^５２は、ＡＤトランスジェニックマウスモデルにおいて、Ａβ誘発性シナプス機能不全及びシナプス可塑性の欠陥を効果的に軽減する。追加の研究は、リガンド結合ドメインにおいてＡβがＥｐｈＡ４に結合する可能性、及びこれらのＥｐｈＡ４阻害剤がＥｐｈＡ４−Ａβ相互作用を直接遮断する可能性を除外する必要があるが、ＥｐｈＡ４とエフリンとの間の内因性相互作用が、Ａβ誘起性シナプス欠陥及び機能不全を媒介すると推測することは興味深い。したがって、ＥｐｈＡ４−リガンド相互作用を標的とする介入の開発は、ＡＤのための有望な治療戦略であり得る。ＡＤに加えて、ＥｐｈＡ４阻害剤は、筋萎縮性側索硬化症^５３及び脊髄損傷^５４を含むがこれらに限定されない、ＥｐｈＡ４が関わる種々の疾患の治療のための治療薬として使用することができる。

ＡＤにおけるＲｈｙの有益な効果の基礎となる機序は、依然として解明されていない。興味深いことに、Ｒｈｙは、ＡＤのシナプス機能不全も軽減し得る、ＮＭＤＡ拮抗薬^５５及びカルシウムチャネル遮断薬^５６であることが以前に示唆されている。しかしながら、後次研究は、Ｒｈｙが、ＮＭＤＡ受容体に結合することも、グルタミン誘発性Ｃａ^２＋流入を阻害することもないことを明らかにし^５７、本発明者らは、海馬ニューロン内のＮＭＤＡ電流を阻害できないことも見出した（データ図示せず）。したがって、ＡＤにおけるシナプス機能不全の逆転に対するＲｈｙの有益な効果が、ＮＭＤＡ受容体に対するＲｈｙの阻害作用に起因する可能性は低い。ここで、発明者らは、構造ベースのコンピューター内スクリーニング手法を使用し、ＥｐｈＡ４のリガンド結合ドメインを標的とする小分子をスクリーニングする試みを通じて、ＲｈｙをＥｐｈＡ４阻害剤として特定する。ＥｐｈＡ４に対するＲｈｙの阻害活動は、リガンド結合、受容体のリガンド誘発性活性化、及びその下流シグナル伝達を防止するその能力によって確認される（図４）。ＡＤトランスジェニックマウスのシナプス可塑性欠陥を軽減することにおけるＲｈｙの有益な効果を考慮すると（図５）、Ｒｈｙは、ＡＤのための治療薬として使用することができると考えられる。Ｒｈｙ及びＥｐｈＡ４、ならびに他のＥｐｈメンバーとの結合界面の構造詳細に関する今後の特性化は、化学誘導を通じてＲｈｙの構造の最適化を許し得、最終的により高い親和性、特異性、及び能力を持つ新たなＥｐｈＡ４阻害剤の特定につながり得る。

結論として、本発見は、ＥｐｈＡ４が、ＡＤ病理におけるシナプス可塑性の障害を媒介するために重要であるという証拠を提供する。ＥｐｈＡ４の下流の分子及び細胞機序を理解することは、ＡＤ治療に有用である新たな化合物の特定につながり得る。ＥｐｈＡ４を標的とすることは、ＡＤの防止及び治療に有益であり得る。重要なことに、ＥｐｈＡ４の小分子阻害剤、ＲｈｙがＡＤモデルにおけるシナプス障害を軽減する能力は、この介入戦略に対するサポートを提供する。

材料及び方法
化学物質、抗体、及びウイルス
使用される抗体は、抗ＥｐｈＡ４及び抗体Ｃｄｋ５抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＰＳＤ−９５（ＢｉｏＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）、抗β−アミロイド（Ａβ８−１７に対する６Ｆ／３Ｄ、Ｄａｋｏ）、抗Ｉｂａ−１（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０）及び抗Ｔａｕ−１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）、ホスホ−Ｔｙｒ ６０２（ｐ−Ｙ６０２ ＥｐｈＡ４）（ＥＣＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにヒトＦｃに対するＦｃ及びヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含む。ヒストンＨ１組換えタンパク質及びロスコビチンはＭｉｌｌｉｐｏｒｅから、［２，５−ジメチルピロリル安息香酸（Ｃｐｄ１）］はＭａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、及びＲｈｙはＢａｏｊｉ Ｈｅｒｂｅｓｔ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈから購入した。エフリン−Ａ１、ＥｐｈＡ４−Ｆｃ、ＥｐｈＢ２−Ｆｃ、ビオチン化エフリン−Ａ１−Ｆｃ、及びビオチン化ＥｐｈＡ４−Ｆｃ組換えタンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから、ＫＹＬペプチドはＢｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから、及びＡβモノマーはｒＰｅｐｔｉｄｅから購入した。ＥｐｈＡ４ ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスは、前述のように構築された^{２４、５８}。ウイルスは、アイオワ大学の遺伝子導入ベクターコアによって包装された。

ビオチン化Ｒｈｙの合成、ならびにβ−アミロイドオリゴマー及びエフリンの調製
Ｂｉｏ−Ｒｈｙの合成は、ＲｈｙのＮ_１とｔｅｒｔ−ブチル（６−ブロモヘキシル）カルバメートとの間の求核置換反応を用いた。産生物のｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基が分離され、１−ヘキサンアミン置換Ｒｈｙを産出した。次にＢｉｏ−Ｒｈｙは、カップリング試薬の存在下で置換Ｒｈｙをビオチンと反応させることによって得られた。

オリゴマーＡβ（Ａβ）を、前述のように調製した^{５９、６０}。簡単に言うと、０．５ｍｇのモノマーＡβ１−４２を、２２．２μＬのドライＤＭＳＯに溶解し、次に氷冷フェノールレッドフリーＦ−１２媒質に希釈して、最終Ａβ濃度１００μＭを生じた。Ａβ溶液を４℃で２４時間インキュベートし、次に１４，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を液体窒素中で冷凍し、−２０℃で最大１ヶ月間保管した。特定されない限り、培養したニューロンまたは海馬スライスは、典型的に５００ｎＭでＡβにより処置した。

エフリン−Ａ１−Ｆｃを、ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（１：４．５）でプレクラスタ化し^２４、使用前に６０分間室温でインキュベートした。前述のようにエフリン−Ａ１ ０．１μｇ／ｍＬを用いて、海馬ニューロン内で成長円錐崩壊アッセイを行った^６１。

分子ドッキングによる社内漢方薬データベースの仮想スクリーニング
ＡｕｔｏＤｏｃｋ ４．０を用いて、ＥｐｈＡ４（ＰＤＢコード２ＷＯ２）及び２２５化学化合物を含む当社内漢方薬データベースとの間のドッキングを行った^{６３、６４}。ラマルク説の遺伝的アルゴリズムを、次のパラメータと共に使用した：集団内の個体数２００、エネルギー評価の最大数５，０００，０００、世代の最大数、２７，０００、遺伝的アルゴリズムの実行回数２０。

細胞培養物及び急性海馬スライス
一次皮質及び海馬ニューロンを、前述のように胎生期１８〜１９日ラット胚から調製した^２４。簡単に言うと、皮質ニューロン（１プレート当たり６×１０^６）を、ポリ−Ｄ−リシン（１２．５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた１００ｍｍ培養皿上に置いた。ラット海馬ニューロンを、ポリ−Ｄ−リシン（５０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた１８ｍｍカバースリップ上に、免疫細胞化学的分析の場合は０．５×１０^５／１８ｍｍカバースリップ、成長円錐崩壊アッセイの場合は０．１×１０^５／１８ｍｍカバースリップ、またはｍＥＰＳＣ記録の場合は１．５×１０^５もしくは１．５×１０^５／１８ｍｍカバースリップの密度で播種した。２％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にニューロンを供給した。急性脳スライスを、Ｐ１５−Ｐ１７ Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製した。簡単に言うと、ラットを速やかに断頭し、それらの脳を氷冷人工脳髄液（ＡＣＳＦ）に浸漬した。海馬を切除し、ビブラトーム（Ｌｉｅｃａ）を使用して３００μｍ厚のスライスを調製した。次にスライスを、９５％Ｏ_２＋５％ＣＯ_２で平衡化された循環ＡＣＳＦを含むインキュベート室に移し、実験前に回復のために少なくとも２時間室温で保持した^６５。

ＡＤマウスモデル、ｓｈＲＮＡノックダウン、ペプチド注入、及び薬物投与
ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した（Ｂ６Ｃ３−Ｔｇ［ＡＰＰｓｗｅ，ＰＳＥＮ１ｄＥ９］８５Ｄｂｏ／Ｊ）^６６。これらのマウスは、スウェーデン二重変異及びエクソン−９−欠失ＰＳＥＮ１変異を担持するヒト／マウスＡＰＰ構築体（ＡＰＰｓｗｅ＋ＰＳＥＮ１／ｄＥ９）を組み込むことによって生成された。ヒトＡβＰＰの二重変異（Ｌｙｓ^６７０→Ａｓｎ^６７０、Ｍｅｔ^６７１→Ｌｅｕ^６７１）を発現するＡＰＰトランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６）も使用した^３１。実験には両性を使用し、この研究で使用された全てのマウスは、香港科技大学の動物ケア施設によって産生された。遺伝子型は、尾部生検のポリメラーゼ連鎖反応分析によって確認した。同性の４〜５匹のマウスを、１２時間の明／暗周期で適宜食餌及び水と共にケージに収容した。

ＡＤマウスにおいてＫＹＬペプチドによりＥｐｈＡ４シグナル伝達を遮断する効果を調査するために、４〜５月齢のＡＤトランスジェニックマウスにＡｌｚｅｔミニ浸透圧ポンプ（モデル１００４）を埋め込み、その内容物を０．１１μＬ／ｈで２８日間圧送した。ポンプには、０．２３μｇ／μＬのＫＹＬペプチド（１７μｇ）または人工脳髄液（ＣＳＦ）中のビヒクル溶媒のいずれかを装填した。ミニ浸透圧ポンプを、右半球内で脳室内的に調整した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのＣＡ１領域内のＥｐｈＡ４は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ偽型レンチウイルス粒子をｐＦＵＧＷ−ｓｈＥｐｈＡ４と共に、前述のように対応する領域に両側的に注入することによってノックダウンされた^５８。ＡＤマウスに、Ｒｈｙを２０ｍｇまたは５０ｍｇ・ｋｇ^−１・日^−１（０．０１ｇ／ｍＬ水）で１日の強制飼養により、ＬＴＰ測定前に３〜４週間経口投与した。

シナプトソーム調製、免疫沈降、及びウェスタンブロット分析
海馬シナプトソームを、前述のように調製した^６７。Ｐ１５−Ｐ１７ラットからの急性海馬スライスを、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．２％バナジウム酸ナトリウム）中に種々のプロテアーゼ阻害剤と共に溶解した。Ｃｄｋ５キナーゼアッセイの場合、培養した皮質ニューロン［１６日インビトロ（ＤＩＶ）］を、溶解緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス［ｐＨ７．６］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＮａＦ、及び０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）中に種々のプロテアーゼ阻害剤と共に溶解した。ウェスタンブロット分析を、前述のように行った^２４。

免疫沈降アッセイの場合、溶解物を、対応する抗体で２時間４℃で免疫沈降し、続いてタンパク質Ｇセファロースで１時間４℃でインキュベートした^２４。試料をＲＩＰＡ緩衝液または緩衝液Ａで洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁した。ＥｐｈＡ４チロシンリン酸化は、４Ｇ１０抗体を使用し、ウェスタンブロット分析によって検出された。

免疫細胞化学的、免疫組織化学的、共焦点顕微鏡、及び定量的分析
Ａβ処置したニューロン内のＥｐｈＡ４及びＰＳＤ−９５の細胞内局在を調べるために、ニューロンをメタノールで２０分間、−２０℃で固定した^２４。免疫染色を、前述のように行った^６８。簡単に言うと、ニューロンを、ＧＤＢ緩衝液中の抗ＰＳＤ−９５抗体（１：５００）及び抗ＥｐｈＡ４抗体（１：１０００）で終夜４℃でインキュベートし、リン酸緩衝液で洗浄して、対応する二次抗体で１時間、室温でインキュベートした。画像取得の場合、細胞を、ＰｒｏＬｏｎｇ褪色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に載置し、ｚ−スタック取得モードを使用する６３倍油浸対物レンズを持つ、Ｚｅｉｓｓレーザー走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７ ＤＵＯ）を使用して画像を取得した。

免疫組織化学分析の場合、マウスに麻酔をかけ、生理食塩水に続いて４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）によって経心的に灌流して脳を除去した^６６。終夜の後固定及び一連の低温保護の後、クライオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ ５６０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、２０μｍの厚さで脳を冠状に切開した。これらの切片を、β−アミロイド（１：２００）及びＩｂａ１（１：５００）抗体で終夜４℃で染色し、続いて適切な蛍光共役二次抗体でインキュベートし、Ｈｙｄｒｏｍｏｕｎｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に載置した。Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＡ顕微鏡で画像を撮影した。３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色の場合、切片を再水和し、抗原検索に供した。次に切片を、Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ抗体希釈剤（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）に希釈したβ−アミロイド抗体で終夜４℃でインキュベートし、続いて二次抗体インキュベーションを（Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ ＥｎＶｉｓｉｏｎ／ＨＲＰ、ウサギ／マウス）室温で１時間行った。次にβ−アミロイド染色を、ＤＡＢ法により室温で１０分間現像した（Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ ＤＡＢ＋Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）。次にこれらの切片をヘマトキシリンで対染色し、上昇濃度のエタノールで脱水し、キシレンで清浄してＤＰＸに載置した。Ｚｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒ．Ｖ１２顕微鏡を使用して画像を撮影した。

同一の取得設定を使用して同じ実験からの画像を入手し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｅｔａ Ｉｍａｇｅ Ｓｅｒｉｅｓ ７．５、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）により画像を分析した^{２４、５８}。ＥｐｈＡ４及びＰＳＤ−９５クラスタを定量化するために、各ニューロンから２つの樹状セグメントを定量化のために分析した。樹状細胞の外郭を手でトレースした。各実験における全画像の背景に対する基礎閾値を測定した。次にこれらの閾値の平均を、同じ実験における全画像に適用した。樹状細胞中のクラスタ密度を測定するために、隣接した樹状細胞のシグナルよりも２倍高い強度を持つクラスタを含むように画像を最初に閾値化し、クラスタの総数及び樹状細胞の長さを自動的に測定した。ＤＡＢ、Ｉｂａ１、またはＡβ染色の定量化の場合、対照における背景シグナルの強度よりも２．５倍高い強度を持つクラスタを含むように画像を閾値化した。皮質及び海馬領域をトレースし、皮質または海馬内の斑の面積の数及びパーセンテージ（対象とする面積上のＡβ染色により被覆された面積）として、アミロイド沈着を定量化した。斑関連Ｉｂａ１染色を定量化するために、アミロイド沈着を取り囲むＩｂａ１染色の面積及び強度を測定した。

ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊプログラムを使用してタンパク質帯強度の比重定量化を行った。スチューデントのｔ検定または分散分析を使用して統計分析を行い、必要に応じて図の凡例に示されるような異なる試験を行った。全実験は、指示される場合を除いて少なくとも３回行った。

Ｃｄｋ５キナーゼアッセイ
Ｃｄｋ５／ｐ３５キナーゼアッセイは、１〜２μＣｉ［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ及び８μｇヒストン−Ｈ１タンパク質を含有するキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ［ｐＨ７．４］、１５ｍＭ ＭｇＣｌ^２、及び１００μＭ ＡＴＰ）中で３０分間３０℃で行った^２４。次に１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してリン酸化ヒストン−Ｈ１タンパク質を分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。

Ｒｈｙ−ＥｐｈＡ４−結合アッセイ
プルダウン分析の場合、Ｂｉｏ−Ｒｈｙをストレプトアビジン磁気ビーズに１時間結合し、次にこれらのビーズを、０．５％ ＢＳＡの存在下で１時間、組換えＥｐｈＡ４−ＦｃまたはＥｐｈＢ２−Ｆｃでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズをＤＰＢＳで４回洗浄し、錯体中のＥｐｈの存在をウェスタンブロット分析によって決定した。

ＲｈｙがＨＴ−２２細胞の細胞表面に対するエフリン−Ａ１の結合を阻害するかどうかを調べるために、細胞ベースの結合アッセイを、前述のようにいくつかの修正とともに行った^６９。ＨＴ−２２細胞を、ポリ−Ｄ−リシンカバースリップ上に播種した。細胞を異なる濃度のＲｈｙまたはＫＹＬで１０分間４℃プレインキュベートし、続いて０．５μｇ／ｍＬビオチン化エフリン−Ａ１で４５分間４℃でインキュベートした。次に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次にビオチン化エフリン−Ａ１の標識を表面化するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８共役ストレプトアビジン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で免疫染色した。

ＥｐｈＡ４クラスタ化及び成長円錐崩壊アッセイ
３ＤＩＶにおけるニューロンを、異なる濃度のＲｈｙまたはＫＹＬで対照として１５分間、前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに１５分間前処置し、４％パラホルムアルデヒドで固定した^６１。ＥｐｈＡ４クラスタ化の場合、ニューロンを抗ＥｐｈＡ４及び抗Ｔａｕ−１抗体で染色した。成長円錐崩壊アッセイの場合、フィラメントアクチンについてはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５共役ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、軸索については抗Ｔａｕ−１抗体によってニューロンを染色した。崩壊した成長円錐を二重盲検的に採点した。実験を少なくとも３回繰り返し、各実験に対して５０個を超えるニューロンを分析した。データは、平均±標準誤差として提示される。

樹状突起棘の分析
培養したラット海馬ニューロンを、１４〜１６ＤＩＶにおいてＧＦＰプラスミドでトランスフェクトし、３０μＭのＫＹＬペプチドによる処置後、２４〜２８ＤＩＶにおいて２４時間Ａβに露出した。ニューロンを４％パラホルムアルデヒドで固定し、前述のように６３倍対物レンズを使用する共焦点顕微鏡を使用して調べた^２４。

電気生理学
小型ＥＰＳＣ記録の場合、約２５〜２８ＤＩＶにおいて、試験試薬と一緒に５００ｎＭのＡβを用いるか、または用いずに海馬ニューロンを２４時間共処置した。１１０ ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、２ＣａＣｌ_２、０．８ＭｇＣｌ_２、１０ＨＥＰＥＳ、及び１０Ｄ−グルコース（ｐＨ７．４）を（ｍＭで）含有する外部溶液、ならびに１３５ＣｓＣｌ_２、１０ ＨＥＰＥＳ、２ＭｇＣｌ_２、４ＮａＡＴＰ、０．４ＮａＧＴＰ、及び０．５ＥＧＴＡ（ｐＨ７．２）を（ｍＭで）含有する内部溶液を用いて、全細胞パッチクランプ記録を室温で作成した^{２４、２７}。０．５μＭ ＴＴＸと共にＧＡＢＡ作動性ＩＰＳＣを遮断して作用電位誘発性ＥＰＳＣを防止するために、ピクロトキシン（２００μｍ）を外部溶液に含めた。小型ＥＰＳＣ記録の場合、細胞を−７０ｍＶで保持した。これらの実験に対するピペット抵抗は、典型的に３〜５ＭΩであったが、直列抵抗は、１５〜２０ＭΩであった。各細胞からのミニを、各条件で１分間記録した。ｍＥＰＳＣの測定は、ＡＭＰＡ受容体ＥＰＳＣを測定するためのミニ分析プログラム（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ Ｉｎｃ．）に記載されるものに従った。直列及び入力抵抗が１０％未満変化した記録時期のみを分析した。データは、少なくとも３つの実験の平均±ＳＥＭとして提示される。

ＬＴＰ記録の場合、屠殺後速やかにマウス脳を切断し、氷冷９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２（ａＣＳＦ）に浸漬した^５８。振動組織スライサー（ＨＭ６５０Ｖ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して脳スライス（３００μｍ厚）を調製し、酸素化緩衝液に２時間３２℃で浸漬した。海馬領域を切除し、６４個の記録電極が埋め込まれたＭＥＤ−Ｐ２１０Ａプローブ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ）の中心に置いた。次にこれらのスライスを、５００ｎＭのＡβで酸素化ａＣＳＦ中２時間、ＬＴＰ誘発前に灌流させた^７０。ＥｐｈＡ４阻害剤による処置の場合、スライスをペプチドまたは化学物質で１時間、Ａβの適用前に前処置した。ＭＥＤ６４多チャネル記録システムを使用してｆＥＰＳＰを記録し、１０ｋＨｚのサンプリング速度で区域ＣＡ１の樹状層からデータを収集した。各スライスの場合、ベースライン刺激強度は、入力−出力曲線に従って決定された最大ｆＥＰＳＰ反応の約５０％を引き出したレベルで設定された。ＬＴＰは、３連続のＨＦＳ（１００Ｈｚ、１秒、３０秒間隔で送達される）によって誘発された。ＬＴＰの程度を、ＬＴＰ誘発後６０分間隔の間に取られたｆＥＰＳＰ勾配の変化率（１０％〜９０％）として定量化した。

実施例２：コリリン及びデンドロビンは、ＥｐｈＡ４シグナル伝達を阻害する
小分子ＥｐｈＡ４阻害剤をスクリーニングするために、発明者らは、小分子ライブラリーを使用して分子ドッキング分析を行った。Ｒｈｙに加えて、２つの小分子（１つのＴＣＭデータベースからスクリーニングされた）もＥｐｈＡ４阻害活性を呈する。培養した海馬ニューロンを使用してＥｐｈＡ４依存性成長円錐崩壊を阻害するＥｐｈＡ４を阻害することにおけるそれらの能力を遂行した。ラット海馬ニューロンが、図１３に示される濃度で小分子（コリリン、デンドロビン）により処置され、かつエフリン−Ａ１で処置された場合、化合物は、エフリン−Ａ１刺激性成長円錐崩壊を阻害した。

実施例３：Ｃｐｄ１から誘導された化合物は、ＥｐｈＡ４シグナル伝達を阻害する
Ｎｏｂｅｒｉｎｉら（上記）に記載されるように、Ｃｐｄ１は、化学名２−ヒドロキシ−４−（２，５−ジメチル−１−ピロリル）安息香酸を有し、次の化学式を有する。

本発明者らは、Ｃｐｄ１からいくつかの化学誘導体を生成し、化合物６、１４、及び２１がＥｐｈＡ４シグナル伝達阻害剤の活性を有することを見出した。これらのＣｐｄ１誘導性化合物は、それらの化学名及び化学式によって図１４に示される。それらのＥｐｈＡ４阻害剤効果は、図１５に示される。簡単に言うと、ラット皮質ニューロンを、異なる濃度でＣｐｄ１から誘導された化合物により処置し、かつエフリン−Ａ１で処置した。図１５は、ＥｐｈＡ４チロシンリン酸化についてのウェスタンブロット分析の結果を示す。

実施例４：新規Ｒｈｙ誘導体の合成
ＲＨＹ−２６：

テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、５ｍＬ）中のＲｈｙ（１００ｍｇ）の溶液に、水素化ナトリウム（ＮａＨ、５０ｍｇ）、続いて１，８−ジクロロオクタン（０．２４ｍＬ）を添加した。混合物を５０℃に加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ジクロロメタン（ＤＣＭ、３×１５ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＲＨＹ−２６（５ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−３７：

ステップ１：
ＴＨＦ（２ｍＬ）中のＲＨＹ（１００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（５０ｍｇ）、続いて１，８−ジクロロオクタン（０．２０ｍＬ）を添加した。混合物を５０℃に加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：２０）によって精製し、ＺＪ−４−１７２−１（７０ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＺＪ−４−１７２−１（７０ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（２０ｍｇ）、続いて３，４−ジメトキシフェノール（５６ｍｇ）を添加した。混合物を５０℃に加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（５ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×５ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（１０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３３）によって精製し、ＲＨＹ−３７（２０ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−３６：

ステップ１：
ＴＨＦ（２ｍＬ）中のＲＨＹ（１００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（５０ｍｇ）、続いて１，８−ジブロモオクタン（０．２０ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：２０）によって精製し、ＺＪ−４−１７２−１（７０ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＺＪ−４−１７２−１（４０ｍｇ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（３８ｍｇ）、続いて３，４−ジメトキシ安息香酸（３８ｍｇ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（５ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×５ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣ_３水性液（１０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３３）によって精製し、ＲＨＹ−３６（１０ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−４２：

ステップ１：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＲＨＹ（３００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（１５０ｍｇ）、続いて１，６−ジブロモヘキサン（０．５ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（２０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（３０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＺＪ−４−１７８（２００ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＺＪ−４−１７８（９０ｍｇ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（６８ｍｇ）、続いて４−（ベンジルオキシ）フェノール（１００ｍｇ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＲＨＹ−４２（５０ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−４５：

ステップ１：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＲＨＹ（３００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（１５０ｍｇ）、続いて１，７−ジブロモヘプタン（０．５３ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（２０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（３０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＺＪ−４−１８３（２２０ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＺＪ−４−１８３（６０ｍｇ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（５０ｍｇ）、続いて５−メトキシ−２−ニトロ安息香酸（６４ｍｇ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＲＨＹ−４５（２０ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−４８：

ステップ１：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＲＨＹ（３００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（１５０ｍｇ）、続いて１，７−ジブロモヘプタン（０．５３ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（２０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（３０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＺＪ−４−１８３（２２０ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＺＪ−４−１８３（６０ｍｇ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（４５ｍｇ）、続いて４−（ベンジルオキシ）フェノール（５０ｍｇ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＺＪ−４−１８５−１（３０ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ３：
ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中のＺＪ−４−１８５−１（２０ｍｇ）の溶液に、１０％ Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を添加し、混合物を２０時間、Ｈ_２中で撹拌した後、混合物をセライト（ＭｅＯＨ溶離液）のパッド上で濾過し、溶媒を真空で蒸発させた。粗産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＲＨＹ−４８（１０ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−５０：

ステップ１：
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＲＨＹ（３００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（１５０ｍｇ）、続いて１，８−ジブロモオクタン（０．５８ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（２０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（３０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＺＪ−４−１８９（２００ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＺＪ−４−１８９（６０ｍｇ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（６０ｍｇ）、続いて５−メトキシ−２−ニトロ安息香酸（５０ｍｇ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＲＨＹ−５０（２０ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−２３：

ＴＨＦ（５ｍＬ）中のＲＨＹ（１００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（５０ｍｇ）、続いて１，５−ジブロモペンタン（０．１８ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＲＨＹ−２３（１００ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−４６：

ステップ１：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＲＨＹ（３００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（１５０ｍｇ）、続いて１，７−ジブロモヘプタン（０．５３ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（２０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（３０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＺＪ−４−１８３（２２０ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＺＪ−４−１８３（７０ｍｇ）の溶液に、２−（ピロリジン−１−イル）エタンアミン（９０μＬ）を添加し、混合物を８０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、飽和Ｈ_２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ／ＮＨ_３．Ｈ_２Ｏ＝６：１００：１）によって精製し、ＲＨＹ−４６（１０ｍｇ）を黄色油として得た。

ＲＨＹ−４７：

ステップ１：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＲＨＹ（３００ｍｇ）の溶液に、ＮａＨ（１５０ｍｇ）、続いて１，７−ジブロモヘプタン（０．５３ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を水（２０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（３０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：３０）によって精製し、ＺＪ−４−１８３（２２０ｍｇ）を黄色油として得た。

ステップ２：
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＺＪ−４−１８３（７０ｍｇ）の溶液に、３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロパン−１−アミン（９０μＬ）を添加し、混合物を８０℃まで加熱し、２０時間撹拌した後、反応液を飽和ＮａＨＣＯ_３水性液（１０ｍＬ）で急冷し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、飽和Ｈ_２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄した。複合有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて濾過し、溶媒を真空で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ／ＮＨ_３．Ｈ_２Ｏ＝６：１００：１）によって精製し、ＲＨＹ−４７（１５ｍｇ）を黄色油として得た。

実施例５：機能的及び分析的アッセイ
エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイ
ＥｐｈＡ４シグナル伝達を阻害することにおけるＲｈｙ誘導体の能力を、ＥｐｈＡ４クラスタ化アッセイにおいて調べた。ラット海馬ニューロンを、ポリ−Ｄ−リシン（５０μｇ／ｍＬ）でコーティングした４８ウェルプレート上に、１ウェル当たり６０００細胞で播種した。２％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でニューロンをインキュベートした。３ＤＩＶにおけるニューロンを、ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体で２０分間、続いて前クラスタ化エフリン−Ａ１（０．２５μｇ／ｍＬ）リガンドでさらに４０分間前処置し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。次にニューロンを、抗ＥｐｈＡ４及び抗Ｔａｕ−１抗体で免疫染色した。ＥｐｈＡ４クラスタの細胞撮像及び定量化を、ＩＮ細胞アナライザー６０００ハイコンテントアッセイシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。ＥｐｈＡ４クラスタを、Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって定量化した。一元配置分散分析後のニューマン−ケウルス多重比較検定（Ｐｒｉｓｍ ５ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を用いて統計分析を行った。

Ｒｈｙの分析的検出
Ｒｈｙの識別及び量を、ターボＶソース及びエレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）プローブ（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を備えるＡＢ ＳＣＩＥＸ ４５００ ＱＴＲＡＰシステムに連結されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを使用して分析した。アセトニトリル（ＡＣＮ）中のＲｈｙを、水及びＡＣＮ中の０．１％ギ酸からなる移動相を持つＣ１８カラム（ＢＥＨ Ｃ１８、５０×２．１ｍｍ、１．７μｍ、４０℃）上で分離した。５マイクロリットルの試料を注入し、次のプログラムによって０．６ｍＬ／分の流量で溶離した（０〜４．０分、１０〜３５％ ＡＣＮ、４．０〜４．１分、１００％ ＡＣＮ；７．０〜７．１分、１００〜１０％ ＡＣＮ、７．１〜１０分、１０％ ＡＣＮ）。Ｒｈｙの検出は、正イオン化モードで実行した。ＥＳＩ条件は次のとおりであった：脱クラスタ化電位１２０Ｖ、入口電位１０Ｖ、衝突セル出口電位１２Ｖ、衝突エネルギー３８Ｖ、カーテンガス５０（任意単位）、衝突ガス１０（任意単位）、イオンスプレイ電圧４５００ｋＶ、ソース温度５００℃、イオン源ガス１：４５（任意単位）、イオン源ガス２：６０（任意単位）。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用し、３対の親／娘イオンによってｍ／ｚ ３８５．１→３５３．１、３８５．１→２６９．１、３８５．１→１６０．１Ｒｈｙを決定し、測定した。この条件下、Ｒｈｙの保持時間は２．５６分である。

Ｒｈｙのインビトロ安定性アッセイ
アセトニトリル（ＡＣＮ）中３μＭのＲｈｙを、Ｃ５７ＢＩ／６マウスから調製された血清に添加し、混合物を種々の時間間隔でインキュベートした。インキュベーションは、ＡＣＮの添加によって終了させた。混合物をスピンダウンし、上清の半分を空気乾燥させた。残渣をＡＣＮに再溶解し、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。

Ｒｈｙの血液及び脳透過性アッセイ
雄Ｃ５７ＢＩ／６マウス（１６週齢）を、香港技科大学（ＨＫＵＳＴ）動物ケア施設から入手し、研究の１週間前に研究室に順応させた。Ｒｈｙ（５ｍｇ／ｍＬ）を水に溶解し、１０ｍＬ／ｋｇの体積で５０ｍｇ／ｋｇを経口付与した。この研究における手順は、ＨＫＵＳＴ動物倫理委員会によって承認され、実施基準及び実験目的の動物使用に従って行った。

終末部血液（Ｋ２ＥＤＴＡ管）及び脳組織を、Ｒｈｙ投与後に異なる時間間隔で採取した（０、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、２４０、４８０分）（ｎ＝６）。血漿は、血液を３，８００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することによって入手した。３０分の心灌流後に０．９％生理食塩水を用いてマウス脳を採取した。８０μＬの０．９％生理食塩水を添加した全マウス脳を、１０秒間（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ Ｍｉｎｉｌｙｓ）４０００ｒｐｍでセラミックビーズにより均質化に供した。Ｒｈｙ投与したマウスの血漿（８０μＬ）及び脳ホモジネート、または所望の濃度の２０μＬのＲｈｙ（２．５〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲の９データ点）を、次に約１ｍＬのメタノールで抽出し、３分間渦流した。試料を１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を新たな管に移し、残りの試料を別の抽出に供した。２つの抽出物から得られた上清をプールし、蒸発乾燥させた。乾燥した試料を、０．３ｍＬのメタノールに溶解し、３０秒間渦流させた後、５分間超音波処理し、１７，９００×ｇで５分間遠心分離した。上清（８０μＬ）を、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のためにバイアルに移した。マウス血漿及び脳中のＲｈｙのＣ_ｍａｘ、Ｔ_ｍａｘ、及びｔ_１／２を、ソフトウェアＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３を使用して計算した。マウス血漿及び脳からのＲｈｙの回収率は、それぞれ８２％及び６８％であった。血漿及び脳中のＲｈｙの標準曲線のＲ２値は、それぞれ０．９９８７及び０．９９６３であった。

実施例６：リンコフィリン及びコリリンは、培養した海馬ニューロン中のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタを阻害した
リンコフィリン（Ｒｈｙ）及びコリリン（Ｃｏｒｙ）がＥｐｈＡ４阻害剤であることが実証された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ及びＣｏｒｙの効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＣｏｒｙで２０分間、続いて前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。ＥｐｈＡ４クラスタを、Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって定量化した。図１６に示されるように、Ｒｈｙ及びＣｏｒｙは、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を低減した。

実施例７：Ｒｈｙ、ＲＨＹ−２６、及びＲＨＹ−３７の新規誘導体は、より強力なＥｐｈＡ４阻害を呈する
ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ及びその誘導性の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体で２０分間、続いて前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。ＥｐｈＡ４クラスタを、Ｔａｕ正面積に対する軸索上のＥｐｈＡ４クラスタの総面積の比率を計算することによって定量化した。図１７に示されるように、Ｒｈｙ及びその誘導体は、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を用量依存的に著しく低減した。新規誘導体、ＲＨＹ−２６及びＲＨＹ−３７のＥｐｈＡ４クラスタに対する阻害効果は、Ｒｈｙと比較して、それぞれ５倍及び１２倍優れていた。

実施例８：新規化合物ＲＨＹ−２６は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
化合物群は、メチレンによって接続されたクロロ基で置換されたＮ１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−２２（５−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−２６（８−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（３０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図１８に示されるように、クロロ置換を持つ誘導体は、Ｒｈｙと比較した場合、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約４０〜８０％低減し、メチレンによってＲｈｙのＮ１部位に結合されたクロロ基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を増加させることを示した。ＲＨＹ−６１（３−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−６２（９−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−６３（６−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−６４（７−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−６５（１０メチレンリンカー）、ＲＨＹ−６６（１１−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−６７（１２−メチレンリンカー）のＥｐｈＡ４阻害剤としての能力も、同じアッセイシステムにおいて試験され、検証される。

実施例９：新規化合物ＲＨＹ−３７、ＲＨＹ−３９、ＲＨＹ−４３、ＲＨＹ−５６は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
化合物群は、メチレンによって接続された３，４−ジメトキシ−フェノキシ基で置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−３９（６−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−４３（７−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−３７（８−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（３０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図１９に示されるように、ＲＨＹ−３９、ＲＨＹ−４３、ならびにＲＨＹ−３７及びＲＨＹ−５６は、Ｒｈｙと比較した場合、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約７０〜８０％著しく低減し、ＲｈｙのＮ_１部位における６〜９メチレン結合３，４−ジメトキシ−フェノキシ基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を増加させることを示した。

実施例１０：新規化合物ＲＨＹ−３８、ＲＨＹ−３６、ＲＨＹ−５７は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する。
化合物群は、メチレンによって接続されたジメトキシベンゾエートで置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−３３（６−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−３８（７−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−３６（８−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−５７（９−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（５０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２０に示されるように、この修飾を持つ全ての化合物は、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約２０〜８０％低減した。ＲＨＹ−３８、ＲＨＹ−３６、及びＲＨＹ−５７は、Ｒｈｙよりも強力な活性を呈し、ＲＨＹ−３３は、Ｒｈｙと同等の能力を示し、６〜９メチレン結合ジメトキシベンゾエートの付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を維持または増加させることを示す。

実施例１１：新規化合物ＲＨＹ−５４及びＲＨＹ−６０は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する。
化合物群は、メチレンによって接続されたジメトキシベンゾエートで置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−４８（７−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−５４（８−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−６０（９−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。Ｒｈｙまたは誘導体（３０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２１に示されるように、この修飾群を持つ化合物は、ＲＨＹ−５４及びＲＨＹ−６０を用いた場合、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化に対してＲｈｙよりも著しく強力な阻害効果を示し、Ｒｈｙ−４８は、Ｒｈｙと同等の能力を示し、ＲｈｙのＮ_１におけるメチレン結合ヒドロキシル−フェノキシ基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を維持または増加させることを示す。

実施例１２：新規化合物ＲＨＹ−４０、ＲＨＹ−４５、ＲＨＹ−５０、ＲＨＹ−５９は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
化合物群は、メチレンによって接続されたメトキシ−ニトロベンゾエートまたはメトキシ−フェニルアクリル酸で置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−４０（６−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−４５（７−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−５０（８−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−５８、及びＲＨＹ−５９（９−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（３０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２２に示されるように、全ての化合物は、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約３０〜６０％低減した。ＲＨＹと比較した場合、ＲＨＹ−４０、ＲＨＹ−４５、ＲＨＹ−５０、及びＲＨＹ−５９は、より強力であり、ＲｈｙのＮ_１部位におけるメチレン結合メトキシ−ニトロベンゾエートまたはメトキシ−フェニルアクリル酸の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を増加させることを示す。

実施例１３：新規化合物ＲＨＹ−４２、ＲＨＹ−４４、ＲＨＹ−４９、及びＲＨＹ−５５は、ＥｐｈＡ４阻害活性を呈する
化合物群は、メチレンによって接続されたベンジルオキシ−フェノキシ基で置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−４２（６−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−４４（７−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−４９（８−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−５５（９−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（３０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２３に示されるように、この修飾を持つ化合物は、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約４０〜６０％低減し、メチレン結合ベンジルオキシ−フェノキシ基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を増加させることを示した。

実施例１４：ブロモ置換基を持つ新規ＲＨＹ誘導体は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
化合物群は、メチレンによって接続されたブロモ基で置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−２３（５−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−２７（６−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−３５（７−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−３４（８−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−３１（９−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（３０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２４に示されるように、ＲｈｙのＮ_１部位にブロモ基を持つ修飾は、Ｒｈｙと比較した場合、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約５０〜７０％低減し、Ｎ_１部位における５〜９メチレン結合ブロモ基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を増加させることを示した。

実施例１５：アミノ基を含有する置換基を持つ新規ＲＨＹ誘導体は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
化合物群は、メチレンによって接続されたピロリジン−１−イル−エチルアミノまたはイミダゾール−１−イル−プロピルアミノ基で置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−４１（６−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−４６（７−メチレンリンカー）、ＲＨＹ−５３（８−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−４７（７−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（５０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２５に示されるように、ＲｈｙのＮ_１部位にピロリジン−１−イル−エチルアミノまたはイミダゾール−１−イル−プロピルアミノ基を持つ修飾は、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約４０〜５０％低減し、５〜９メチレンと結合した部分のこれらの基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を増加させることを示した。ＲＨＹ−５３（８−メチレンリンカー）のＥｐｈＡ４阻害剤としての能力も、同じアッセイシステムにおいて試験され、検証される。

実施例１６：アミノ−ヘキシルアミノ基を持つ新規ＲＨＹ誘導体は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
化合物群は、メチレンによって接続されたアミノ−ヘキシルアミノ基で置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−２４（５−メチレンリンカー）、及びＲＨＹ−３２（９−メチレンリンカー）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（５０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２６に示されるように、ＲｈｙのＮ_１部位にアミノ−ヘキシルアミノ基を持つ修飾は、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約２０％低減し、５〜９または６〜９メチレン結合アミノ−ヘキシルアミノ基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を維持または増加させることを示した。

実施例１７：新規化合物ＲＨＹ−５１及びＲＨＹ−５２は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
化合物群は、メチレンによって接続されたヨード−ベンゾエートまたはヨード−ブロモ−ベンゾエートで置換されたＮ_１部位を持つＲｈｙから修飾された。ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害することに対するＲｈｙ、ＲＨＹ−５１（８−メチレンリンカーを持つヨード−ベンゾエート）、及びＲＨＹ−５２（８−メチレンリンカーを持つヨード−ブロモ−ベンゾエート）の効果を、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（３０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２７に示されるように、ＲｈｙのＮ_１部位におけるこれらの修飾は、培養した海馬ニューロン内のエフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタ化を約２０〜７０％低減し、メチレンと結合した部分のこれらの基の付加が、ＥｐｈＡ４阻害に対する能力を維持または増加させることを示した。

実施例１８：ＲｈｙのＮ_１の修飾は、ＥｐｈＡ４阻害に対してＲｈｙよりも強力な効果を呈する
Ｎ_１部位において、４−ベンゾイル−ベンジル（ＲＨＹ−２１）、３−クロロ−ベンジル（ＲＨＹ−１９）、メチル（ＲＨＹ−１８）、４−メチル−ベンジル（ＲＨＹ−１１）、４−メトキシ−ベンジル（ＲＨＹ−１２）、ビフェニル−２−イルメチル（ＲＨＹ−１０）、２，６−ジクロロ−ベンジル（ＲＨＹ−８）、４−ブロモ−ベンジル（ＲＨＹ−５）、ベンゾイル（ＲＨＹ−３０）、（４−メトキシ−フェニル）−エタノン（ＲＨＹ−２８）、アリル（ＲＨＹ−１７）、フェニル−アリル（ＲＨＹ−９）、ピリジン−２−イルメチル（ＲＨＹ−１５）、ピリジン−３−イルメチル（ＲＨＹ−１４）、またはピリジン−４−イルメチル（ＲＨＹ−１６）で置換されたＲｈｙから修飾された化合物群を、ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害するそれらの能力について、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（５０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２８に示されるように、全ての化合物は、ＥｐｈＡ４クラスタ形成に対する阻害効果を示し、ＲＨＹ−１０、ＲＨＹ−２８、ＲＨＹ−９、ＲＨＹ−１９、ＲＨＹ−５、ＲＨＹ−１７が最も著しい。

実施例１９：新規化合物ＲＨＹ−１３、ＲＨＹ−６、ＲＨＹ−１、ＲＨＹ−７は、Ｒｈｙと比較してＥｐｈＡ４クラスタを著しく低減した
Ｎ_１部位において、メチル−（ＲＨＹ−１３）、ベンジル−（ＲＨＹ−６）、メトキシ−ベンジル（ＲＨＹ−１）、ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル（ＲＨＹ−７）、またはビオチニル化−（ＲＨＹ−２５、ＲＨＹ−２、ＲＨＹ−３）、二量体−（ＲＨＹ−２９）、Ｃ２３でのジメチル化（ＲＨＹ−４）で置換されたＲｈｙから修飾された化合物群を、ＥｐｈＡ４媒介性細胞機能を阻害するそれらの能力について、エフリン−Ａ１誘発性ＥｐｈＡ４クラスタアッセイを使用して調べた。ＲｈｙまたはＲｈｙ誘導体（５０μＭ）で２０分間、次に前クラスタ化エフリン−Ａ１でさらに４０分間、ニューロンを前処置した。ＥｐｈＡ４及びＴａｕ−１抗体に対してニューロンを染色した。図２９に示されるように、全ての化合物は、ＥｐｈＡ４クラスタ形成に対する阻害効果を示し、ＲＨＹ−１３、ＲＨＹ−６、ＲＨＹ−１、及びＲＨＹ−７が最も顕著である。

実施例２０：Ｒｈｙは、経口投与後に脳及び血漿内で検出可能である
Ｒｈｙの薬学的活性は、全身投与後の脳または血漿においてＲｈｙのアクセス性または安定性の試験を促した。Ｒｈｙの安定性を調査するために、異なる時間間隔でマウス血清により化合物をインキュベートした後、残留するＲｈｙの量を最初に測定した。Ｒｈｙの濃度を、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって決定した。Ｒｈｙは、多重反応モニタリングモードにより、約２．５６分の保持時間で３対の前駆産物イオンピークを用いて検出された。血清中のＲｈｙ濃度は、最初の６０分間比較的未変化のままであり、３６０分のインキュベーション期間にわたって約２０％低減したことが見出された（図３０Ａ）。

次に、Ｒｈｙが、経口投与後に脳及び血漿内で検出可能であり得るかどうかを調べた。Ｒｈｙは、マウスの血漿及び緩衝生理食塩水灌流脳から、単一経口投与後、種々の時間間隔で、５０ｍｇ／ｋｇで（１０ｍＬ／ｋｇ）抽出された。Ｒｈｙは、投与後１０分に血漿及び脳の両方で容易に検出された（図３０Ｂ）。血漿中のＲｈｙの濃度は、約０．５時間でピークに達し（Ｔ_ｍａｘ＝３０．８４±２．５２分、Ｃ_ｍａｘ＝５８３．２０±３２．８６ｎｇ／ｍＬ）、約１．５時間で５０％低減した（ｔ_１／２＝８１．１２±１２．０６分）。脳内で、Ｒｈｙのレベルは、約１時間でピークに達し（Ｔ_ｍａｘ＝５５．０２±９．１８分、Ｃ_ｍａｘ＝４４２．７３±２７．３８ｎｇ／脳）、約２時間でｔ_１／２に達した（１０７．２２±２７．３０分）（図３０Ｃ）。３時間の投与後、Ｒｈｙのレベルは、血漿及び脳内でＣ_ｍａｘの１０％に低下した。まとめると、経口投与後、Ｒｈｙは、速やかに消化系から全身循環に入り、血中で検出されることが実証された。さらに、化合物は、血液−脳障壁を通過し、マウス脳組織内で検出され得る。

実施例２１：コリリンは、ＡＤマウスモデルにおいて正常なＬＴＰ誘発を回復する
ＷＴ及びＡＰＰ／ＰＳ１変異（Ｔｇ）マウスに、コリリン（水中の１０ｍｇ／ｍＬ）を、１日の強制飼養により、ＬＴＰ測定前に３〜４週間経口投与した。３連続のＨＦＳ（１００Ｈｚで１秒間、３０秒間隔で送達される）によって誘発されたＬＴＰを、海馬のＳＣ経路のＣＡ１領域内で測定した。ＬＴＰの程度を、ＬＴＰ誘発後６０分間隔の間に取られたｆＥＰＳＰ勾配の変化率（１０％〜９０％）として定量化した。図３１に示されるように、障害したＬＴＰを、ＷＴマウス（黒色トレース）と比較して、Ｔｇマウス（緑色トレース）において観察した。５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇでのコリリンの処置は、ＴｇマウスにおいてＬＴＰ障害をレスキューし、対照マウスに相当するレベルに回復した。

実施例２２：Ｒｈｙ投与は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬において成体神経新生を増加させる。
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＲｈｙ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、３ヶ月間を超えて経口投与した。マウス脳を分割し、ＫＩ６７抗体で染色し、分化前駆細胞及び新生ニューロンを除く、細胞周期中の全ての細胞を標識化した。図３２に示されるように、Ｒｈｙ（Ｒ１）投与は、対照処置マウスと比較して、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬の歯状回中のＫｉ−６７＋神経前駆細胞の数を増加させた。

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参考文献

Claims (14)

1. 式Ｉの化合物
   

   

   、またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
   各Ｒ^１が、独立して、水素及びアルキルからなる群から選択されるメンバーであり、
   各Ｒ^２が、独立して、水素及びアシルからなる群から選択されるメンバーであり、
   各Ｒ^ｑが、独立して、電子対、低級アルキル、アリル、及びアリールメチルからなる群から選択されるメンバーであり、
   Ｌが、アルキレンであり、
   Ｘが、結合、−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（Ｒ^４）−からなる群から選択され、
   Ｒ^３が、水素、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アロイルメチル、アシル、アシルアルキル、（Ｒ^４）_２Ｎ−アルキレン、及び
   

   

   からなる群から選択され、かつ
   各Ｒ^４が、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、及びアシルメチルからなる群から選択され、
   但し、前記化合物は、ＥｐｈＡ４阻害剤である、前記化合物、またはその薬学的に許容される塩。
2. Ｌが、式−（ＣＨ_２）_ｎのアルキレン基であり、式中、ｎが、３〜１２の整数である、請求項１に記載の化合物。
3. Ｘが、結合、−Ｏ−、または−ＮＨ−である、請求項１または２に記載の化合物。
4. （ｉ）Ｒ^３が、水素でないか、
   （ｉｉ）Ｒ^３が、ハロであるか、
   （ｉｉｉ）Ｒ^３が、メチルまたはヘテロアリールアルキルであるか、
   （ｉｖ）Ｒ^３が、アリールであるか、
   （ｖ）Ｒ^３が、アリールアルキルであるか、
   （ｖｉ）Ｒ^３が、アシルであるか、あるいは
   （ｖｉｉ）Ｒ^３が、（４−メトキシベンゾイル）メチル、アリル、シンナミル、６−アミノヘキシル、または３−イミダゾール−１−イルプロピル、または（Ｒ^４）ＮＨ−アルキレンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
5. Ｘが、−Ｏ−であり、Ｒ^３が、４−ヒドロキシフェニル、４−ベンジルオキシフェニル、または３，４−ジメトキシフェニルである、請求項１に記載の化合物。
6. Ｒ^４が、水素またはビオチニルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
7. 以下からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物：
   

   

   

   

   

   

   。
8. ＥｐｈＡ４シグナル伝達に対する阻害剤の有効量を含む、ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患を患う対象を治療するための治療薬であって、該阻害剤が請求項１〜７のいずれか一項記載の化合物である、治療薬。
9. 前記阻害剤が、薬学的に許容される賦形剤と一緒に、薬学的組成物中に存在する、請求項８に記載の治療薬。
10. 前記疾患が、
    （ｉ）アミロイドβ関連神経変性障害であるか、あるいは
    （ｉｉ）外傷性脳損傷、脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷、癌、炎症、鬱病、または不安症である、請求項８に記載の治療薬。
11. ＥｐｈＡ４シグナル伝達に対する阻害剤を含み、前記阻害剤が、請求項１〜７のいずれか一項記載の化合物である、ＥｐｈＡ４シグナル伝達に関わる疾患を治療するためのキット。
12. １日投与量の前記阻害剤を含有する複数の容器を含む、請求項１１に記載のキット。
13. 前記阻害剤が、薬学的に許容される賦形剤と一緒に、薬学的組成物中に存在する、請求項１１に記載のキット。
14. 指示マニュアルをさらに含む、請求項１１に記載のキット。

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