JP6388700B2

JP6388700B2 - 脂質粒子の製造法および脂質粒子を有する核酸送達キャリア

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Publication number: JP6388700B2
Application number: JP2017203224A
Authority: JP
Inventors: 西川　尚之; 尚之西川; 杉山　享; 享杉山; 貴宏関口; 大野　誠; 誠大野
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2018-09-12
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Also published as: JP2018016642A

Description

本発明は、脂質粒子の製造法および脂質粒子の用途に関し、好適には核酸を細胞内に送達するのに有用な脂質粒子の製造法および脂質粒子の用途に関する。

核酸医薬は、疾患に対する作用機序が明確で、副作用も少なく、次世代の医薬品として記載されている。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いた核酸医薬は、細胞に存在する標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害することができる。その結果、特定の遺伝子または遺伝子群の異常な発現原因となって生じる疾患症状を軽減または治療することができる。このようなＲＮＡ干渉を利用した核酸医薬において、例えば、ｓｉＲＮＡなどの核酸が利用されるが、これらの核酸に機能を発現させるためには、核酸を細胞内に送達することが必要である。

核酸を細胞内に効果的に送達する方法として一般にキャリア（ベクター）が用いられる。核酸がアニオン性であることから、キャリア（ベクター）としてカチオン脂質を用いたカチオン性のリポソーム（非特許文献１）、カチオン性とアニオン性の両方を併せもつ両性リポソーム（特許文献１、２）などの検討がなされている。

最も一般的なリポソームの製造法として、Ｂａｎｇｈａｍ（バンガム）法が知られている。バンガム法とは、容器内でリン脂質をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解させ、次いで有機溶媒を蒸発させて容器内面上に脂質薄膜を作成した後、薄膜に水を加えて薄膜を膨潤させ、さらに容器を振盪することによりリポソームを得る方法である。
その他にも、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などの方法が知られている。

特開２０１１−２１０２６号公報特表２００５−５１７７３９号公報

ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．６，ｐ２７１，１９９９

キャリア（ベクター）の評価のための重要な指標として、内包率がある。内包率とは、キャリア（ベクター）の製造時に内水相に保持させるために添加した親水性物質中の何％が内水相中に保持されているかを示す指標である。
従来のキャリア（ベクター）の製造法では、例えば、核酸を高い内包率で保持することのできるキャリア（ベクター）を得るには十分ではなかった。

本発明は、高い内包率で核酸などを保持することが可能な脂質粒子の製造法、および脂質粒子を有する核酸送達キャリアを提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、（１）リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程と、（２）核酸を含む水相と、工程（１）で調製した油相を混合する工程と、（３）工程（２）で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程と、（４）工程（３）で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程と、を含む製造法が、上記課題を解決した脂質粒子の製造法として提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、課題を解決するための手段は以下の通りである。
［１］下記（１）〜（４）の工程：
（１）リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程；（２）核酸を含む水相と、工程（１）で調製した油相を混合する工程；（３）工程（２）で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程；および（４）工程（３）で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法。
［２］アルコールが炭素数１〜６のアルコールである、［１］に記載の脂質粒子の製造法。
［３］エステルが酢酸エステルである、［１］または［２］に記載の脂質粒子の製造法。
［４］工程（１）において、油相が、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物をさらに含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の脂質粒子の製造法。
［５］少なくｚとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物が一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基、炭素数１０〜２２のアルキルオキシアルキレン基、炭素数１０〜２２のアルカノイルオキシアルキレン基および炭素数１０〜２２のアルキルオキシカルボニルアルキレン基から選択される置換基である）で表される化合物である、［４］に記載の脂質粒子の製造法。
［６］工程（１）において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を４０〜７０℃で加熱する、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の脂質粒子の製造法。
［７］工程（３）において、油相および水相を含む混合液を１０〜３０℃で冷却する、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の脂質粒子の製造法。
［８］［１］〜［７］のいずれか１つに記載の製造法によって得られる脂質粒子を有する核酸送達キャリア。

本発明の脂質粒子の製造法によれば、高い内包率で核酸などを保持することが可能な脂質粒子の製造法、および脂質粒子を有する核酸送達キャリアを提供することができる。

合成例における化合物Ａの^１Ｈ−ＮＭＲの図である。合成例における化合物ＡのＭＳスペクトルの図である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。

（１）脂質粒子の製造法
本発明の脂質粒子の製造は、下記（１）〜（４）の工程：
（１）リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程；
（２）核酸を含む水相と、工程（１）で調製した油相を混合する工程；
（３）工程（２）で得た油相および水相を含む混合液（以下、油相−水相混合液と称することがある）を冷却し、脂質粒子を晶出する工程；および
（４）工程（３）で得られた油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法（以下、本発明の製造法と称することがある）である。

本発明の製造法は、コアセルベーションを利用した粒子の形成方法である。コアセルベーションとは、親水コロイドに他の物質を添加したり、貧溶媒で希釈したり、ｐＨを変化させたりするとき、コロイドに富む液相とコロイドに乏しい液相とのふたつの相に分離する現象のことである。
本発明の製造法において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱し、核酸を含む水相と、得られた油相を混合した後に、時間をかけて冷却することによって一種のコアセルベーション現象が起こり、リン脂質が核酸を内包するように自己組織化することで、高い内包率で核酸を保持したリポソームを得ることができる。

［工程（１）］
本発明の製造法は、工程（１）リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相（油相とは、リン脂質、アルコールおよびエステルを混合して得られる組成物中に含まれる油性成分を意味する）を加熱する工程を含む。

本発明で用いられるリン脂質としては、特に限定されないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然リン脂質、天然由来のリン脂質の不飽和炭素鎖を水素により飽和とした水素添加リン脂質、天然由来のリン脂質に合成により修飾を加えた合成リン脂質などが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いてもよい。

本発明におけるリン脂質の総量は、核酸に対して、モル比で１０：１〜５０００：１であることが好ましく、１００：１〜１０００：１であることがより好ましい。

本発明で使用されるアルコールとしては、特に限定されないが、炭素数１〜６のアルコールを用いることが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、３−メチル−１−ブタノールなどが挙げられる。本発明で使用されるアルコールとしては、極性の観点から、エタノールを用いることがより好ましい。

本発明で使用されるエステルとしては、特に限定されないが、酢酸エステルを用いることが好ましい。具体的には、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチルなどが挙げられる。本発明で使用されるエステルとしては、極性又は親油性の観点から、酢酸エチルを用いることがより好ましい。

本発明におけるエステルとアルコールの比率は、容量比率で９０：１０〜１０：９０であることが好ましく、８０：２０〜３０：７０であることがより好ましく、７０：３０〜４０：６０であることがさらに好ましい。

本発明の製造法では、工程（１）において、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物を（好ましくは脂質として）さらに含むことが好ましい。

本発明において、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物を使用する際の配合量は、脂質全量に対して、１０ｍｏｌ％〜７０ｍｏｌ％であることが好ましく、１５ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％であることがより好ましく、２０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｋ％であることがさらに好ましい。

本発明で用いられる、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、一般式（１）で表される化合物を用いることが好ましい。

式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基、炭素数１０〜２２のアルキルオキシアルキレン基、炭素数１０〜２２のアルカノイルオキシアルキレン基および炭素数１０〜２２のアルキルオキシカルボニルアルキレン基から選択される置換基である。

Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基であることがより好ましく、炭素数１４〜２０のアルキル基であることがさらに好ましい。また、アルキル基中に二重結合を有していてもよい。

本発明の製造法において用いられる、一般式（１）で表される、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物は、特に限定されないが、例えば、下記の方法により合成することができる。

式中、ＰＧは保護基を表し、Ｘは活性エステルを構成する脱離基を表す。Ｒ^１およびＲ^２は、上記と同様である。

すなわち、適切な保護基により保護されたヒスチジンの活性エステル（Ａ）と、アミン誘導体（Ｂ）を塩基存在下で反応させ、化合物（Ｃ）を得た後、適切な脱保護方法によって、一般式（１）で表される化合物を合成することができる。

ここで、ヒスチジンの活性エステル（Ａ）において使用できる保護基としては、例えば、Ｗ．グリーン（W.Greene）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載の保護基などが挙げられる。具体的には、Ｂｏｃ基（tert-ブトキシカルボニル基）、Ｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）などが好ましい例として挙げられる。

使用できる活性エステルの例として、フェニルエステル、トリフルオロフェニルエステル、ペンタフェニルエステル、ヒドロキシスクシンイミドエステルなどを挙げることができ、原料入手性または安定性の観点から、ヒドロキシスクシンイミドエステルが好ましい。

使用できる塩基としては、無機塩基、有機塩基を挙げることができる。無機塩基の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどを挙げることができ、有機塩基の例としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミンなどを挙げることができる。使用する塩基は、反応に用いるヒスチジンの活性エステル（Ａ）の保護基によって、適切な塩基を用いることが好ましい。

使用できる溶媒としては、特に限定されないが、一般的な有機溶媒を用いることができる。具体的には、エーテル系溶剤、エステル系溶剤、アミド系溶剤、ハロゲン系溶剤を用いることができ、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶剤、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン系溶剤が好ましい例として挙げられる。

使用できる脱保護反応としては、例えば、Ｗ．グリーン（W.Greene）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）第4版、第255〜265頁、2007年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載の方法などが挙げられる。

本発明の製造法で用いられる、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物として、式（２）で表される化合物（２−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル−３−（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）プロパンアミド）［本明細書中において化合物Ａとも称する］を使用することが好ましい。

本発明の製造法において、式（２）で表される化合物を使用することで、高い内包率で核酸を保持することができ、且つ、標的細胞における核酸の放出性に優れた脂質粒子を得ることができる。

本発明の工程（１）において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する際の温度は、４０〜７０℃であることが好ましく、４５〜６５℃であることがより好ましく、５０〜６０℃であることがさらに好ましい。
また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。

［他の成分］
本発明の油相には、リン脂質、アルコールおよびエステル以外に、本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて、他の成分を含むことができる。

（ステロール）
本発明の製造法は、油相にステロールを含んでもよい。本発明において、油相にステロールを含むことで、膜流動性を低下させ、脂質粒子の安定化効果を得ることができる。
ステロールとしては、特に限定されないが、コレステロール、フィトステロール（シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロールなど）、エルゴステロール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−２’−ヒドロキシエチルエーテル。コレステリル−４’−ヒドロキシブチルエーテルなどを上げることができる。これらの中でも、コレステロールが好ましい。
本発明において、ステロールの配合量は、全脂質量に対して１０ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％であることが好ましく、２０ｍｏｌ％〜５５ｍｏｌ％であることがより好ましく、２５ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。

（ポリエチレングリコール鎖を有する脂質）
本発明の製造法は、油相にポリエチレングリコール鎖（以下、「ＰＥＧ鎖」と称する。）を有する脂質を含んでもよい。本発明において、油相にＰＥＧ鎖を有する脂質を含むことで、脂質粒子の分散安定化効果を得ることができる。
ＰＥＧ鎖を有する脂質としては、特に限定されないが、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールＰＥＧ誘導体、ジアルキルグリセロールＰＥＧ誘導体、コレステロールＰＥＧ誘導体、セラミドＰＥＧ誘導体などが挙げられる。これらの中でも、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミンが好ましい。
ＰＥＧ鎖の重量平均分子量は、５００〜５０００が好ましく、７５０〜２０００がより好ましい。
ＰＥＧ鎖は分岐していてもよく、ヒドロキシメチル基のような置換基を有していてもよい。

本発明おいて、ＰＥＧ鎖を有する脂質の配合量は、全脂質量に対して０．５ｍｏｌ％〜１２ｍｏｌ％であることが好ましく、２ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％であることがより好ましく、４ｍｏｌ％〜８ｍｏｌ％であることがさらに好ましい。

［工程（２）］
本発明の製造法は、工程（２）：核酸を含む水相と、工程（１）で調製した油相を混合する工程を含む。

［核酸］
本発明に用いられる核酸としては、公知の任意の形態の核酸が含まれる。核酸の具体例としては、一般的なＲＮＡ、ＤＮＡ、およびそれらの誘導体を挙げることができ、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。本発明に用いることのできる核酸としては、具体的には、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマーなどを挙げることができる。本発明に用いられる核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡを使用することが好ましい。

本発明で用いられる核酸は、天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性など、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖またはリン酸バックボーンなどの少なくとも一部が修飾されているような非天然型であってもよい。
糖部が修飾されている非天然型核酸としては、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルＲＮＡ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ核酸、架橋型核酸（ＬＮＡ／ＢＮＡ）などが挙げられる。また、糖部をペプチドに置き換えたペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノに置き換えたモルフォリノ核酸なども、非天然型核酸の一例として挙げることができる。
リン酸バックボーンが修飾されている非天然型核酸としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体などが挙げられる。

本発明の製造法における水相（水相とは、水性成分を意味する）は、例えば、核酸を水などの水性成分に溶解させることで得られる。

本発明の工程（２）では、水相と、工程（１）で得られる油相とを混合する。水相と油相とを混合する比率（質量比）は、３．０：１．０〜１．０：１．０が好ましく、１．６：１．０〜１．１：１．０がより好ましい。

水相と油相とを混合する際の温度は、４０〜７０℃であることが好ましく、４５〜６５℃であることがより好ましく、５０〜６０℃であることがさらに好ましい。
また、混合する時間は、液全体が均一になっていることが確認できればよく、特に限定されない。また、加熱時間は、液全体の温度が均一に所望の温度になっていることが確認できればよく、特に限定されない。

［工程（３）］
本発明の製造法は、工程（３）：工程（２）で得た油相−水相混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程を含む。

本発明の工程（３）において、油相−水相混合液の冷却条件は１０〜３０℃が好ましく、１５〜２５℃がより好ましい。
また、冷却時間は、特に限定されないが、冷却速度は−３℃／分以下であることが好ましい。

［工程（４）］
本発明の製造法は、工程（４）：工程（３）で得た油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程を含む

本発明の工程（４）において、油相−水相混合液からアルコールおよびエステルを除去する方法としては、特に限定されず、一般的な手法により除去することができる。

［その他の工程］
本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、必要に応じてサイジングを施すことができる。サイジングには、槽内超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかにより脂質粒子を含む液（懸濁液）を超音波処理することにより、粒子径を小さくすることができる。
また、本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、必要に応じて濃縮することができる。濃縮には種々の既知の方法を採用することができ、例えば、限外ろ過膜を用いた濃縮方法を挙げることができる。

（２）脂質粒子について
本発明において、脂質粒子とは、脂質から構成される粒子を意味し、特に限定されない。本発明の脂質粒子には、脂質二分子膜より構成される閉鎖小胞体であるラメラ構造を持つリポソームが含まれる。リポソームとしては、多重リポソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、巨大一枚膜リポソームなどの構造が知られているが、特に限定されるものではない。本発明の脂質粒子には、前述のリポソームのような脂質二分子膜構造（ラメラ構造）を持たない、粒子内部も構成成分が詰まった構造を持つ粒子も含まれる。

脂質形成の形態は、電子顕微鏡観察またはエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により、リポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）、内水層を持つ構造、またはリポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）および内水層を持たず、粒子内部に電子密度が高いコアを持っていることから、脂質をはじめとする構成成分が詰まった構造を有していることなどが確認できる。エックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定によっても、脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）の有無を確認できる。

本発明の脂質粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましくは１０〜１０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは７５〜３５０ｎｍである。脂質粒子の粒子径は、一般的な方法（例えば、動的光散乱法、レーザー回折法など）により測定することができる。

（３）脂質粒子の利用
本発明の製造法によって得られる脂質粒子の一例としては、脂質粒子をｉｎｖｉｔｒｏで細胞に導入することによって、細胞に核酸など（例えば、遺伝子など）を導入することができる。また、本発明の製造法によって得られる脂質粒子に、医薬用途を有する核酸を含む場合、脂質粒子は核酸医薬として生体に投与することができる。

本発明の製造法によって得られる脂質粒子を核酸医薬として使用する場合には、本発明の脂質粒子は単独でまたは薬学的に許容される投与媒体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）と混合して、生体に投与することができる。
薬学的に許容される担体との混合物中における脂質粒子の濃度は、特に限定されず、一般的には０．０５質量％から９０質量％とすることができる。また、本発明の脂質粒子を含む核酸医薬は、薬学的に許容される他の添加物質、例えば、ｐＨ調整緩衝剤、浸透圧調整剤などを添加してもよい。

本発明の脂質粒子を含む核酸医薬をｉｎｖｉｖｏで投与する際の投与経路は、特に限定されず、任意の方法で投与することができる。投与方法としては、経口投与、非経口投与（関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉投与など）が挙げられる。本発明の脂質粒子を含む核酸医薬は、疾患部位に直接注射することにより投与することもできる。

本発明の脂質粒子の剤形は、特に限定されないが、経口投与を行う場合には、本発明の脂質粒子は、適当な賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、懸濁剤、シロップ剤などの形態で使用することができる。また、非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および等張滅菌注射剤、懸濁化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、安定化剤または保存料などの添加剤を適宜含めることができる。

（４）核酸送達キャリア
本発明の製造法によって得られる脂質粒子は、高い内包率で核酸を保持することが可能であるため、核酸送達キャリアとして非常に有用である。本発明の核酸送達キャリアは、例えば、得られた脂質粒子を核酸などと混合して、細胞にｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションをすることにより、細胞に核酸などを導入することができる。また、本発明の核酸送達キャリアは、核酸医薬における核酸送達キャリアとしても有用である。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
また、本発明において、コレステロールは、ディッシュマン社製コレステロールＨＰを、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）は、日油社製ＣＯＡＴＳＯＭＥＭＣ６０６０を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール修飾ホスホエタノールアミン、ＰＥＧ鎖分子量：２０００）は、日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＤＳＰＥ−０２０ＣＮを、レシチンは、日油社製ＣＯＡＴＳＯＭＥＮＣ−５０を、使用した。

［合成例：式（２）で表される化合物（以下、化合物Ａ）の合成］
第一工程
テトラヒドロフラン230mLに、ジヘキサデシルアミン23gおよびトリエチルアミン5.52gを加え、攪拌しながらBoc-His(1-Boc)-OSU 24.6gを添加し、室温で１時間攪拌し、50℃で５時間攪拌した。その後、テトラヒドロフランを減圧留去し、反応物にクロロホルム450mLおよび水200mLを加えた。有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１０％クエン酸水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル=5/1〜3/1）で精製し、油状物の保護体24gを得た。

第二工程
トリフルオロ酢酸35ｍLに、第一工程で得られた保護体21.7gを少しずつ加え、室温で24時間攪拌した。その後、飽和炭酸水素ナトリウム40gを含む水溶液600mLに徐々に添加し、１時間攪拌した。得られた反応液にクロロホルム500mLを加え、有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=10/1）で精製し、無色固体の化合物Ａを11.6g得た。化合物の同定は、NMRおよびMSにより行った。

［実施例１］
（コアセルベーション法）
油相の調製
Ｌ−α―ジパルミトイルホスファチジルコリン、レシチン、コレステロール、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を、６１／１５／２０／４のモル比となるように、それぞれ８０ｍｇ、２０ｍｇ、１４ｍｇ、２０ｍｇ量り取り、エタノールを０．３ｍＬ、酢酸エチルを０．７ｍＬ加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相に、後述のｓｉＲＮＡ５ｍｇを滅菌水０．２６３ｍＬで溶解した核酸水溶液０．２５ｍＬ、さらに滅菌水を１．０ｍＬ添加し、５５℃で１０分間加熱した。その後攪拌しながら室温で放冷した。つづいて１００ｍＭヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール／酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製ＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒ）を用い、０．４μｍフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。

［実施例２］
（コアセルベーション法）
２００ｍＭヒスチジン溶液の調製
Ｌ−ヒスチジン１５．５ｇを量り取り、５００ｍＬの滅菌水で溶解した。ｐＨ７となるように２００ｍＭＨＣｌを添加し、２００ｍＭヒスチジン溶液を得た。
油相の調製
Ｌ−α―ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを、２６／２６／４４／４のモル比となるように、それぞれ３７ｍｇ、３０ｍｇ、３３ｍｇ、２０ｍｇ量り取り、エタノールを０．３ｍＬ、酢酸エチルを０．７ｍＬ加えて溶解させ、油相を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述の工程で得た油相に、後述のｓｉＲＮＡ５ｍｇを滅菌水０．２６３ｍＬで溶解した核酸水溶液０．２５ｍＬ、２００ｍＭヒスチジン溶液０．６２５ｍＬ、さらに滅菌水を０．３７５ｍＬ添加し、５５℃で１０分間加熱した。つづいて１００ｍＭヒスチジン溶液を用いて室温で透析し、エタノール／酢酸エチル混合溶液を除去した。得られた溶液をエクストルーダー（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製ＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒ）用い、０．４μｍフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。

［実施例３］
（コアセルベーション法）
油相の調製において、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを、２６／２２／４４／８のモル比となるように、それぞれ３１ｍｇ、３１ｍｇ、３３ｍｇ、４４ｍｇ量り取った以外は、実施例２と同様に調製し、核酸を保持する脂質粒子を得た。

比較例１
（バンガム法）
油相の調製
Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを、２６／２６／４４／４のモル比となるように、それぞれ３７ｍｇ、３０ｍｇ、３３ｍｇ、２０ｍｇ量り取り、エタノール０．３ｍＬ、酢酸エチル０．７ｍＬを加えて溶解させ、油相を得た。
脂質膜の形成
上述の工程で得た油相をナスフラスコに入れ、エバポレーターでエタノールと酢酸エチルを留去することで脂質膜を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述のナスフラスコに、後述のｓｉＲＮＡ５ｍｇを滅菌水０．２６３ｍＬで溶解した核酸水溶液０．２５ｍＬ、２００ｍＭヒスチジン溶液０．６２５ｍＬ、さらに滅菌水０．３７５ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーを用いて５５℃で攪拌しながら水和した。得られた液をエクストルーダー（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製ＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒ）を用い、０．４μｍフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。

［比較例２］
（コアセルベーション法）
油相の調製において、エタノール０．３ｍＬおよび酢酸エチル０．７ｍＬの混合液を、エタノール１ｍＬに替えて溶解した以外は、実施例２と同様に調製し、核酸を保持する脂質粒子を得た。

［比較例３］
（バンガム法）
油相の調製
Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン、化合物Ａ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを、６１／１５／２０／４のモル比となるように、それぞれ８０ｍｇ、２０ｍｇ、１４ｍｇ、２０ｍｇ量り取り、クロロホルム１．０ｍＬを加えて溶解させ、油相を得た。
脂質膜の形成
上述の工程で得た油相をナスフラスコに入れ、エバポレーターでエタノールと酢酸エチルを留去することで脂質膜を得た。
核酸保持脂質粒子の調製
上述のナスフラスコに、後述のｓｉＲＮＡ５ｍｇを滅菌水０．２６３ｍＬで溶解した核酸水溶液０．２５ｍＬ、さらに滅菌水１．０ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーを用いて５５℃で攪拌しながら水和した。得られた液をエクストルーダー（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製ＭｉｎｉＥｘｔｒｕｄｅｒ）を用い、０．４μｍフィルターを通過させることで整粒し、核酸を保持する脂質粒子を得た。

ｓｉＲＮＡは以下の配列のものを使用した。
５’−ＧＵＵＣＡＧＡＣＣＡＣＵＵＣＡＧＣＵＵ−３’（ｓｅｎｓｅ鎖）（配列番号１）
３’−ＣＡＡＧＵＣＵＧＧＵＧＡＡＧＵＣＧＡＡ−５’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖）（配列番号２）

脂質粒子の粒径測定
脂質粒子の粒径は、脂質粒子分散液を、大塚電子（株）製のゼータ電位・粒径測定システムＥＬＳ−Ｚ２を用いて、原液のまま測定した。

ｓｉＲＮＡの内包率の評価
（総核酸濃度定量）
核酸を保持する脂質粒子０．０２ｍＬに、３Ｍ酢酸アンモニウム水溶液０．０１ｍＬとグリコーゲン０．００３ｍＬを添加し、つづいてエタノール０．５ｍＬを添加することで、脂質を溶解し、核酸のみを沈殿させた。−２０℃で２時間静置後、１４０００×ｇ、４℃の条件で１５分間遠心し、上清を除去した。１５分以上風乾させた後、水を加えて再溶解させ、ナノドロップＮＦ１０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて濃度測定することで、総核酸濃度を定量した。

（外水相における核酸濃度の定量）
Ｑｕａｎｔ−ｉＴＲｉｂｏＧｒｅｅｎＲＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、マニュアル＆プロトコルに記載のｌｏｗ−ｒａｎｇｅａｓｓａｙに従って定量した。まず、上述のキットに含まれる２０×ＴＥバッファーを水で希釈し、１×ＴＥバッファーとした。外水相の核酸のみを定量するため、核酸を保持する脂質粒子０．００５ｍＬに１×ＴＥバッファーを０．０９５ｍＬ添加し、２０倍希釈液を調整した。つづいて、２０倍希釈液０．１ｍＬに１×ＴＥバッファーを１．９９ｍＬ添加することで、核酸を保持する脂質粒子を破壊せず、ＴＥバッファーで４０００倍に希釈したサンプルを得た。
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬原液０．００９ｍＬに、１×ＴＥバッファー１．７９１ｍＬを添加し、２００倍希釈液を調整し、つづいて２００倍希釈液０．２２ｍＬに１×ＴＥバッファー１．９８ｍＬを添加することで、２０００倍に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬を得た。
４０００倍に希釈したサンプル０．１ｍＬを、９６ウェルプレートに入れ、つづいて２０００倍に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬０．１ｍＬをサンプルに加え、プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔＥＦ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて蛍光（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍ）を測定することで、外水相における核酸濃度を定量した。

（内包率の算出）
上述の工程で得られた総核酸濃度および外水相での濃度の定量結果を用いて、下記式に従って、実施例１〜３、比較例１〜３の核酸を保持する脂質粒子の内包率を算出した。
内包率（％）＝（総核酸濃度−外水相における核酸濃度）÷総核酸濃度×１００

結果を表１に表す。

表１に示すように、コアセルベーション法により調整した脂質粒子は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物を使用しなくても、従来の調整法であるバンガム法に比べて、予想外に内包率が向上することが判明した。また、実施例２および３のように、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物を用いて、コアセルベーション法により得られた核酸を保持する脂質粒子は、非常に高い内包率を有することが分かった。

Claims

下記（１）〜（４）の工程：
（１）リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を加熱する工程；
（２）核酸を含む水相と、工程（１）で調製した油相を混合する工程；
（３）工程（２）で得た油相および水相を含む混合液を冷却し、脂質粒子を晶出する工程；および
（４）工程（３）で得た油相および水相を含む混合液からアルコールおよびエステルを除去する工程、
を含む、核酸を内包した脂質粒子の製造法であって、
アルコールがエタノールであり、エステルが酢酸エチルであり、
工程（１）において、油相が、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物をさらに含み、
少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのイミダゾイル基を有する化合物が一般式（１）：

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、炭素数１０〜２２のアルキル基、炭素数１０〜２２のアルキルオキシアルキレン基、炭素数１０〜２２のアルカノイルオキシアルキレン基および炭素数１０〜２２のアルキルオキシカルボニルアルキレン基から選択される置換基である）で表される化合物である、
脂質粒子の製造法。
工程（１）において、リン脂質、アルコールおよびエステルを含む油相を４０〜７０℃で加熱する、請求項１に記載の脂質粒子の製造法。
工程（３）において、油相および水相を含む混合液を１０〜３０℃で冷却する、請求項１または２に記載の脂質粒子の製造法。
工程（２）において、水相と油相が質量比で１．６：１．０〜１．１：１．０となるように混合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。