JP6406802B2 - ペプチドおよびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、ペプチドおよび当該ペプチドの利用に関する。

近年、ナノテクノロジーとバイオテクノロジーとが融合した領域にナノバイオテクノロジーと呼ばれる新しい分野が誕生し、急速に発展しつつある。

ナノバイオテクノロジーは、例えば、バイオエレクトロニクス素子、バイオセンサおよびバイオチップなどの開発および製造などを目的としており、ナノバイオテクノロジーに対する期待は極めて大きい。

ナノバイオテクノロジーの分野では、生体由来の様々な材料（例えば、核酸、糖およびタンパク質など）を用いて各種装置（例えば、バイオエレクトロニクス素子、バイオセンサおよびバイオチップなど）を製造している。それ故に、新たな機能を有する生体由来の材料の発見は、ナノバイオテクノロジーの発展に大きく寄与し得る。

例えば、検出対象であるウイルスに対する抗体をシリコンナノワイヤ上に固定化し、上記抗体に対してウイルスが１個でも結合すれば、電気的にウイルスを検出することが可能なバイオセンサの開発が進んでいる。

上述したようなバイオセンサの開発をさらに加速するためには、シリコンやガラスなどの基板上に所望のタンパク質を簡便かつ正確に配置し、固定化させる技術の開発が不可欠である。そして、近年、シリコンに結合し得るタグを介して、シリコンやガラスなどの基板上に所望のタンパク質を簡便かつ正確に配置する技術の開発が進んでいる。

例えば、特許文献１には、上述したタグとして用いることが可能な様々なタンパク質が開示されている。更に具体的には、特許文献１には、酸化ケイ素（例えば、シリカ）に結合することができる特定のタンパク質（ＳＢＰ：silica material binding protein）が開示されている。特許文献１に開示されているタグと目的のタンパク質との融合タンパク質を用いることによって、タグを介して、目的のタンパク質をシリコン基板またはガラス基板上に固定化できる。

ＷＯ２００７／０５５２８８（２００７年５月１８日公開）

しかしながら、ナノバイオテクノロジーの分野の発展に寄与し得る生体由来の材料のスクリーニングは十分とはいえず、新規な材料の発見が待ち望まれている。

例えば、特許文献１に記載のタンパク質は比較的大きなタンパク質（例えば、２７３個のアミノ酸からなるタンパク質）であるので、当該タンパク質と目的のタンパク質とを融合させると、融合タンパク質のサイズが大きくなる。このような大きな融合タンパク質を微生物内で強制発現しても、機能を保持した融合タンパク質を大量に入手することが困難であった。更に具体的には、このような大きな融合タンパク質を微生物内で強制発現すると、融合タンパク質の多くは不溶化してしまい、融合タンパク質を大量に入手することが困難であった。

また、特許文献１に記載のタンパク質は、原核生物を用いた強制発現システムで発現させようとすると、発現量が十分とは言い難かった。

また、特許文献１に記載のタンパク質は比較的大きなタンパク質（例えば、２７３個のアミノ酸からなるタンパク質）であるので、当該タンパク質と目的のタンパク質とを融合させると、目的タンパク質の機能が阻害される虞があった。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであって、その目的は、優れた機能を有するペプチド、および、当該ペプチドの利用法を提供することにある。

ケイ素（Ｓｉ）は、地球上で２番目に多い元素であり、種々の生物の体内に含まれている。真核生物である珪藻では、細胞壁の成分として体内へ取り込まれたケイ素が用いられていることが知られている。具体的には、ケイ素（Ｓｉ）はケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）_４）の状態にて生体内へ取り込まれて重合され酸化ケイ素（例えば、シリカ（ＳｉＯ_２））に変換された後に、細胞壁の成分として利用される。

本発明者らは、原核生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）の体内にケイ酸を取り込む機構を解析する過程において、ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端の１４アミノ酸が、酸化ケイ素に結合する能力のみならず、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力を有していることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の酸化ケイ素結合タグは、上記課題を解決するために、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを、少なくとも一部分として含んでいるペプチドを備えていることを特徴としている。つまり、
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能およびケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力の少なくとも１つを有するペプチド。

本発明の酸化ケイ素結合タグは、上記（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを少なくとも一部分として含んでいる、５０個以下のアミノ酸からなることが好ましい。

本発明の酸化ケイ素結合タグでは、上記（ｂ）に記載のペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列において５個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

本発明の酸化ケイ素結合タグでは、上記（ｂ）に記載のペプチドが、配列番号４〜１１の何れかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。

本発明の目的物質の酸化ケイ素への固定化法は、本発明の酸化ケイ素結合タグおよび目的物質の連結体と、酸化ケイ素と、を結合させる工程を含むことを特徴としている。

本発明のケイ酸を重合させるための組成物は、上記課題を解決するために、本発明の酸化ケイ素結合タグを含むことを特徴としている。

本発明のケイ酸を重合させる方法は、上記課題を解決するために、本発明の組成物とケイ酸との混合溶液を作製する工程を含むことを特徴としている。

本発明は、酸化ケイ素に対する結合能を有するペプチドを用いるので、目的物質を容易に酸化ケイ素へ結合させることができる。

本発明は、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力を有するペプチドを用いるので、酸化ケイ素を容易に作製することができる。

本発明は、常温の中性の水溶液中にて、酸化ケイ素を作製することができる。

本発明は、任意の対象（例えば、タンパク質および微生物など）を、酸化ケイ素にて被覆または包埋することができる。

本発明は、任意の対象（例えば、タンパク質および微生物など）を、酸化ケイ素によって安定化させることができる。

本発明は、原核生物のタンパク質に由来のペプチドを用いるので、原核生物を宿主として用いる強制発現システムを用いて、機能を保持したペプチドを安定かつ大量に作製することができる。

本発明は、比較的小さなペプチドを用いるので、当該ペプチドと他のペプチドとの融合タンパク質を作製したとしても、融合タンパク質のサイズは小さい。このようなサイズの小さい融合タンパク質であれば、微生物を宿主として用いる強制発現システムを用いて、機能を保持した融合タンパク質を安定にかつ大量に作製することができる。

本発明は、比較的小さなペプチドを用いるので、当該ペプチドと他のペプチドとの融合タンパク質を作製したとしても、融合タンパク質における本発明のペプチドの占める割合（例えば、大きさの割合）を小さくすることができる。その結果、融合タンパク質内において、本発明のペプチドが他のペプチドの機能を阻害することを防ぐことができる。

本発明の実施例において、融合タンパク質の精製純度を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 本発明の実施例において、ペプチドが有する、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力を示すグラフである。

本発明は、以下に説示する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本明細書において、「Ａ〜Ｂ」は「Ａ以上Ｂ以下」を意図するものとする。

また、本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」または「ペプチド」と交換可能に使用される。

〔１．ペプチド〕
まず、本発明に用いるペプチドについて説明する。

本発明に用いるペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを、少なくとも一部分として含んでいるペプチドである。つまり、
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能およびケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力の少なくとも１つを有するペプチド。

本発明に用いるペプチドは、ＣｏｔＢ１タンパク質の部分ペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドを、少なくとも一部分として含んでいるペプチドであってもよい。つまり、
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能およびケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力の少なくとも１つを有するペプチド。

「酸化ケイ素に対する結合能」は、過剰量の酸化ケイ素（例えば、ペプチドの１０００倍の質量の酸化ケイ素）とペプチドとを室温にて３０分間接触させて、当該酸化ケイ素に結合するペプチドの量を測定することによって測定することができる。例えば、全ペプチドの好ましくは５％以上、更に好ましくは１０％以上が酸化ケイ素に結合することができれば、当該ペプチドは、酸化ケイ素に対する結合能を有すると判定することができる。なお、全ペプチドの何％が酸化ケイ素に結合したかは、電気泳動上のバンドの濃さを比較すること等によって算出することができる。

ケイ酸が重合されて形成されている「酸化ケイ素」とは、個々のケイ酸が脱水縮合で連結されて、固体の酸化ケイ素になっている状態を意図する。

「ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力」は、遠心分離によって沈殿する、酸化ケイ素の存在を確認することによって測定することができる。遠心分離の条件は、例えば、４，５００×ｇにて３０秒間であり得る。例えば、ペプチド（例えば、１００μｇ）とケイ酸（５００μｇ）とを混合した溶液を１０分間室温にて放置し、その後、当該溶液を４，５００×ｇにて３０秒間遠心分離して、沈殿物中に酸化ケイ素が５０μｇ以上含まれていれば、当該ペプチドは、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力を有していると判定することができる。

上述したＣｏｔＢ１タンパク質は、原核生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９）に由来するタンパク質であって、当該タンパク質の全長のアミノ酸配列を配列番号１にて示し、当該タンパク質の全長をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２にて示す。また、配列番号３に記載のアミノ酸配列とは、ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端の１４個のアミノ酸に相当するアミノ酸配列である。

後述する実施例にて示しているように、ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端の１４個のアミノ酸は、酸化ケイ素（例えば、二酸化ケイ素（シリカ）、石英、クリストバライト、シリカゲルなど）に対する結合能を有しているのみならず、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力をも有している。それ故に、当該１４個のアミノ酸に対応するペプチドを少なくともその一部分として含むペプチドは、酸化ケイ素に結合するタグとして用いることができるのみならず、ケイ酸を重合させるための組成物に用いることができる。

上記（ｂ）に記載のペプチドにおいて、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。

また、上記（ｂ）に記載のペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と、好ましくは５７％以上、より好ましくは６４％以上、より好ましくは７１％以上、より好ましくは７９％以上、より好ましくは８６％以上、最も好ましくは９３％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能およびケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力の少なくとも１つを有するペプチドであってもよい。

なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）を行い、一致するアミノ酸配列の割合（％）として相同性を算出することができる。

このような変異ペプチドは、公知の方法によって人為的に導入された変異を有するペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するペプチドを単離精製したものであってもよい。

ペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のペプチドにおいて、当該ペプチドの構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

好ましい変異としては、アミノ酸の置換、欠失、または添加を挙げることができる。上述した変異の中では、アミノ酸の置換が更に好ましいと言える。

アミノ酸の置換としては特に限定されないが、例えば、任意のアミノ酸が、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることができる。

更に具体的に、アミノ酸の置換として、グルタミン、セリン、グリシン、アルギニンまたはアラニンが、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることもできる。

更に具体的に、アミノ酸の置換として、ｉ）グルタミン、セリン、グリシンおよびアルギニンがアラニンへ置換される置換、および、ｉｉ）アラニンがグリシンへ置換される置換を挙げることができる。

更に具体的には、上記（ｂ）に記載のペプチドが、配列番号４〜１１の何れかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

勿論、本発明は、上述した具体的な変異に限定されない。

本発明に用いるペプチドは、上述した（ａ）または（ｂ）に記載のペプチドのみからなるペプチドであってもよいし、上述した（ａ）または（ｂ）に記載のペプチド以外の部分を含むペプチドであってもよい。

上述した（ａ）または（ｂ）に記載のペプチド以外の部分のペプチドのアミノ酸配列および長さは特に限定されず、適宜、所望のアミノ酸配列および長さであり得る。例えば、上述した（ａ）または（ｂ）に記載のペプチド以外の部分のペプチドは、ＣｏｔＢ１タンパク質に由来するペプチドであってもよいし、ＣｏｔＢ１タンパク質に由来しないペプチドであってもよい。

例えば、上述した（ａ）または（ｂ）に記載のペプチド以外の部分のペプチドのアミノ酸配列は、ＣｏｔＢ１タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列に対して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下の相同性を有するものであってもよい。

本発明に用いるペプチドを構成するアミノ酸の総数は特に限定されず、例えば、１００個以下であってもよく、９０個以下であってもよく、８０個以下であってもよく、７０個以下であってもよく、６０個以下であってもよく、５０個以下であってもよく、４０個以下であってもよく、３０個以下であってもよく、２０個以下であってもよく、１４個以下であってもよい。

所望の効果をより高めるという観点からは、本発明に用いるペプチドを構成するアミノ酸の総数は少ないほど好ましいといえる。例えば、５０個以下であることが好ましく、４０個以下であることがより好ましく、３０個以下であることがより好ましく、２０個以下であることがより好ましく、１４個以下であることが最も好ましい。

本発明に用いるペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、化学合成されても、組換え発現されてもよい。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）など）を利用することができる。

組換え発現を行う場合、原核生物（例えば、大腸菌など）を用いた強制発現システムを用いることが一般的であるといえる。この場合、真核生物由来のペプチドを、原核生物を用いた強制発現システムによって発現させようとしても、効率よく発現しない場合が多い。また、発現させるタンパク質のサイズが大きくなると、発現されたタンパク質が不溶性となり、活性を保持した形態にて回収できなくなる場合が多い。

本発明に用いるペプチドは、原核生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓに由来するタンパク質であるとともに、サイズも小さい。それ故に、当該ペプチドであれば、原核生物を用いた強制発現システムを用いて、活性を保持した形態にて安定かつ大量に作製することができる。

〔２．酸化ケイ素結合タグ〕
本発明の酸化ケイ素結合タグは、上述したペプチドを備えているものである。

上述したように、本発明に用いるペプチドは、酸化ケイ素に対する結合能を有している。それ故に、本発明の酸化ケイ素結合タグは、ペプチドが有する能力によって、酸化ケイ素に結合することができる。

本発明に用いるペプチドの詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。

本発明の酸化ケイ素結合タグは、上述したペプチドのみからなるものであってもよいし、上述したペプチド以外の構成を備えているものであってもよい。

上述したペプチド以外の構成としては特に限定されず、例えば、ペプチド、核酸、糖、低分子化合物、および、高分子化合物などを挙げることができる。そして、本発明の酸化ケイ素結合タグは、これらペプチド、核酸、糖、低分子化合物、および、高分子化合物などが、上述したペプチドに対して連結されたものであってもよい。

上述したペプチド以外の構成がペプチドである場合には、当該ペプチドは、様々な機能を有する機能性ペプチドであることが好ましい。

機能性ペプチドとしては特に限定されないが、例えば、プロテアーゼの切断配列を含むペプチドであってもよいし、マーカーペプチド（例えば、蛍光タンパク質）であってもよいし、タグ（例えば、エピトープ標識ペプチド（例えば、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ）、ＧＳＴタンパク質）であってもよい。

機能性ペプチドがプロテアーゼの切断配列を含むペプチドであれば、本発明の酸化ケイ素結合タグと目的物質との連結体を酸化ケイ素に結合させた後で、当該連結体をプロテアーゼによって処理することによって、目的物質を精製することができる。

なお、本明細書において「連結体」とは、物質Ａ（例えば、酸化ケイ素結合タグ）と物質Ｂ（例えば、目的物質）とが所望の化学結合によって結合しているものを意図しており、上記化学結合の具体的な種類は限定されない。

機能性ペプチドがマーカーペプチドであれば、本発明の酸化ケイ素結合タグの存在を容易に検知することができる。更に具体的には、酸化ケイ素に結合している本発明の酸化ケイ素結合タグを容易に検知することができる。

機能性ペプチドがタグであれば、本発明の酸化ケイ素結合タグを製造したときなどに、当該酸化ケイ素結合タグを容易に精製することができる。

ペプチド、核酸、糖、低分子化合物、および、高分子化合物などと、本発明に用いるペプチドとを連結させる方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることが可能である。

例えば、両者を周知の架橋剤によって連結させてもよい。また、両者がペプチドである場合には、両者を１つの融合タンパク質として作製してもよい。なお、本明細書において「融合タンパク質」とは、複数のペプチドがペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を介して結合されて、１つのタンパク質となっているものを意図する。

〔３．目的物質の酸化ケイ素への固定化法〕
本発明の目的物質の酸化ケイ素への固定化法は、本発明の酸化ケイ素結合タグおよび目的物質の連結体と、酸化ケイ素と、を結合させる工程を含む方法である。

本発明の酸化ケイ素結合タグの詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。

上記連結体は、本発明の酸化ケイ素結合タグと目的物質とが連結されたものである。上述したように、本発明の酸化ケイ素結合タグは本発明に用いるペプチドを備えているものである。そして、本発明に用いるペプチドは、酸化ケイ素に対する結合能を有している。それ故に、上記連結体は、ペプチドが有する能力によって、酸化ケイ素に結合することができる。つまり、本発明の目的物質の酸化ケイ素への固定化法では、本発明の酸化ケイ素結合タグを介して、目的物質が酸化ケイ素に結合することになる。

上記目的物質としては特に限定されず、ペプチド、核酸、糖、低分子化合物、および、高分子化合物などを挙げることができる。

上記目的物質と、本発明の酸化ケイ素結合タグとを連結させる方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、上記目的物質と、本発明の酸化ケイ素結合タグとを、周知の架橋剤によって連結させてもよい。あるいは、目的物質がペプチドである場合には、上記目的物質と本発明の酸化ケイ素結合タグとを、１つの融合タンパク質として作製してもよい。

本発明の酸化ケイ素結合タグおよび目的物質の連結体と、酸化ケイ素と、を結合させる工程は、所望の溶媒に連結体を可溶化させた上で、当該溶媒と酸化ケイ素とを接触させることによって行うことができる。

上記溶媒の具体的な構成としては特に限定されないが、例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いることができる。ＮａＣｌの濃度は、１５０ｍＭに限定されず、２００ｍＭ以上１．０Ｍ以下であってもよいし、５００ｍＭ以上１．０Ｍ以下であってもよい。ＮａＣｌの濃度が高いほど、不要な物質が酸化ケイ素へ吸着することを防止することができる。

また、上記溶媒へは、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、ＮＰ−４０（登録商標）など）を加えてもよい。溶媒中の界面活性剤の濃度は特に限定されないが、例えば、０．０１重量％〜１．００重量％であり得、０．１重量％〜１．００重量％であり得、０．５重量％〜１．００重量％であり得る。界面活性剤の濃度が高いほど、不要な物質が酸化ケイ素へ吸着することを防止することができる。

〔４．ケイ酸を重合させるための組成物〕
本発明のケイ酸を重合させるための組成物は、本発明の酸化ケイ素結合タグを含むものである。

上述したように、本発明の酸化ケイ素結合タグは、ケイ酸を重合させる能力を有している。それ故に、本発明の組成物は、ペプチドが有する能力によって、ケイ酸を重合させることができる。本発明の組成物は、従来法とは異なり、常温にて中性の水溶液中でケイ酸を重合させることができる点においても、優れたものであるといえる。

本発明の酸化ケイ素結合タグの詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。

本明細書中で使用される場合、用語「組成物」はその含有成分を単一組成物中に含有する態様と、単一キット中に別個に備えている態様であってもよい。すなわち、本発明の組成物は、重合されるべきケイ酸をさらに含んでいてもよいが、本発明の酸化ケイ素結合タグを含有している組成物と、重合されるべきケイ酸とを別々に備えているキットの形態であってもよい。

用いられるケイ酸の種類は特に限定されず、例えば、オルトケイ酸、メタケイ酸、テトラエチルオルソケイ酸、テトラメチルオルソケイ酸を用いることが可能である。これらの中では、テトラメチルオルソケイ酸が好ましいといえる。

本発明の組成物中におけるペプチドの濃度は特に限定されないが、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよいし、１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬであってもよいし、１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬであってもよい。

〔５．ケイ酸を重合させる方法〕
本発明のケイ酸を重合させる方法は、本発明の組成物とケイ酸との混合溶液を作製する工程を含む方法である。

本発明の組成物の詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。

本発明の組成物とケイ酸とを混合する際に用いられる溶液は特に限定されず、適宜、所望の溶液を用いることができる。例えば、トリス緩衝液（組成：０．１Ｍ ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ８．０））、または、Ｓバッファー（０．１Ｍ ＫＨ_２Ｐ０_４（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＮａＯＨ）などを用いることができる。

上記混合溶液におけるペプチドの濃度は特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／ｍＬ〜２．０μｍｏｌ／ｍＬであることが好ましく、０．１μｍｏｌ／ｍＬ〜０．６μｍｏｌ／ｍＬであることが更に好ましい。上記濃度であれば、効率よくケイ酸を重合させて酸化ケイ素とすることができる。

上記混合溶液の温度は特に限定されないが、高すぎない方が好ましいといえる。例えば、２５℃〜３０℃であり得るが、これに限定されない。当該温度範囲であれば、ペプチドの機能が損なわれることを防ぐことができる。

上記混合溶液のｐＨは特に限定されないが、弱アルカリ性であるｐＨ７．０〜９．０であることが好ましく、ｐＨ７．５〜８．５であることが更に好ましく、ｐＨ８．０であることが更に好ましいといえる。上記濃度であれば、効率よくケイ酸を重合させて酸化ケイ素とすることができる。

＜１．ＣｏｔＢ１ペプチドを利用したタンパク質の精製＞
ＣｏｔＢ１タンパク質の全長に相当するペプチド（配列番号１）のＣ末端側、または、ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端の１４アミノ酸残基に相当するペプチド（配列番号３）のＣ末端側に、プロテアーゼ（ＳＵＭＯ ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって特異的に認識および切断されるｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ＳＵＭＯ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ｓｍｔ３ｐ；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＮＰ＿０１０７９８）が付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを合成した。なお、ＣｏｔＢ１遺伝子の配列を配列番号２に示す。

これらの遺伝子の下流に、クローニング用の２つのＢｓａＩ認識配列を付加した上で、更に、５’末端にはＮｄｅＩ認識配列を、３’末端にはＢａｍＨＩ認識配列を付加した。

合成したＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、当該消化物と、同様に制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ−２４ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて１６℃にて２時間の間、ライゲーションさせた。その後、ライゲーション産物を用いて、クローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドを保持しているクローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を選抜した。

市販のキットを用いて、選抜されたクローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９から、所望のプラスミドを精製した。所望のプラスミドのうち、「全長ＣｏｔＢ１タンパク質−ＳＵＭＯ」融合タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドを、ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１−ＳＵＭＯとし、「ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端側の１４ペプチド−ＳＵＭＯ」融合タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドをｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯとした。

蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅した。遺伝子の増幅には、鋳型としてｐｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、プライマーとしてｍＣｈｅ−Ｆｏｒ（５‘−ＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’：配列番号１２）およびｍＣｈｅ−Ｒｅｖ（５‘−ＡＡＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’：配列番号１３）をそれぞれ用いた。

得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓａＩで消化した。同様に、ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１−ＳＵＭＯおよびｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯを制限酵素ＢｓａＩで消化した。ＰＣＲ産物の消化物とプラスミドの消化物とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて１６℃にて２時間の間、ライゲーションさせた。その後、ライゲーション産物を用いて、クローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドを保持しているクローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を選抜した。

市販のキットを用いて、選抜されたクローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９から、所望のプラスミドを精製した。所望のプラスミドのうち、「全長ＣｏｔＢ１タンパク質−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ」融合タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドを、ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙとし、「ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端側の１４ペプチド−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ」融合タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドをｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙとした。

ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ、および、ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙの各々を用いて、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ （Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換して、形質転換体を取得した。

上記形質転換体の各々を、１％グルコースを含む２×ＹＴ培地にて、３７℃にて培養した。ＯＤ_６００が０．５になった時点にて、０．２ｍＭの濃度になるように培地に対してＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加し、３７℃にて更に４時間の培養を行った。当該４時間の培養によって、所望の融合タンパク質を大量発現した菌体を得た。

融合タンパク質を大量発現した菌体の各々を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。当該懸濁液を遠心分離処理（２０，０００×ｇ、３０分、４℃）し、その上清を菌体抽出画分として回収した。

菌体抽出画分の各々に１０ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ｆｉｎｅ ｐｏｗｄｅｒ ｃａ. ０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で３０分間混合した。その後、遠心分離（５，０００×ｇ、２分、２５℃）により酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を除いて、沈殿した酸化ケイ素粒子（酸化ケイ素結合画分）を回収した。

沈殿した酸化ケイ素粒子を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄した後、当該酸化ケイ素粒子をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より販売されているＳＵＭＯ ｐｒｏｔｅａｓｅに付属の「ＳＵＭＯ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ＋ Ｓａｌｔ」に懸濁し、当該懸濁液にＳＵＭＯ ｐｒｏｔｅａｓｅを加えて、室温で３時間反応させた。反応後の懸濁液を遠心分離処理（２０，０００×ｇ、３０分、４℃）して、上清（精製画分）と沈殿物（プロテアーゼ処理後の酸化ケイ素結合画分）とに分けた。

上述した「菌体抽出画分」、「酸化ケイ素結合画分」、「プロテアーゼ処理後の酸化ケイ素結合画分」および「精製画分」をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、融合タンパク質の精製純度を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。なお、「酸化ケイ素結合画分」および「プロテアーゼ処理後の酸化ケイ素結合画分」については、沈殿物にＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えて９５℃にて５分間加熱することによって得られる上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。

図１において、レーン１、２、３および４の各々は、「菌体抽出画分」、「酸化ケイ素結合画分」、「プロテアーゼ処理後の酸化ケイ素結合画分」および「精製画分」の結果を示している。また、図１において、左側には「全長ＣｏｔＢ１タンパク質−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ」融合タンパク質の試験結果を示し、右側には「ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端側の１４ペプチド−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ」融合タンパク質の試験結果を示している。

レーン１およびレーン２の結果から、融合タンパク質が酸化ケイ素粒子に結合することが明らかになった。

また、レーン２、３および４の結果から、酸化ケイ素粒子に結合した融合タンパク質が、ＳＵＭＯ ｐｒｏｔｅａｓｅによって切断されて酸化ケイ素粒子から遊離することが明らかになった。

以上の説明から明らかなように、酸化ケイ素粒子をＳＵＭＯ ｐｒｏｔｅａｓｅによって処理した後の上清を回収することによって、目的とするタンパク質（本実施例ではｍＣｈｅｒｒｙだが、本発明は当該タンパク質に限定されない）を高純度で回収できることが明らかになった。

「全長ＣｏｔＢ１タンパク質−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ」融合タンパク質を用いた場合、回収されたタンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）の純度は約９０％であり、「ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端側の１４ペプチド−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ」融合タンパク質を用いた場合、回収されたタンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）の純度は約９０％であり、何れの融合タンパク質を用いた場合も、回収されたタンパク質の純度は高かった。

＜２．ＣｏｔＢ１ペプチドの改変体を利用したタンパク質の精製＞
ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端の１４アミノ酸残基に相当するペプチドに変異を導入し、当該変異がペプチドの酸化ケイ素への結合能に対して如何なる影響を与えるか確認した。具体的には、ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端の１４アミノ酸残基に相当するペプチド内の様々なアミノ酸をアラニンまたはグリシンに置換し、当該置換後のペプチドについて、酸化ケイ素への結合能を確認した。以下に、試験方法および試験結果について、以下に説明する。

ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ内のＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端の１４アミノ酸残基に相当するＤＮＡに対して、周知のインバースＰＣＲ法によって変異を導入した。これによって、８種類の変異型の「ＣｏｔＢ１タンパク質のＣ末端側の１４ペプチド−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ」融合タンパク質を発現する発現用プラスミドを作製した。

当該変異型の融合タンパク質の変異箇所のアミノ酸配列を表１に示す。また、変異体＃１〜変異体Ｈ８の各々を含む融合タンパク質を発現するための発現用プラスミドを、各々「ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃１」〜「ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃８」と呼ぶ。

インバースＰＣＲ法による「ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃１」〜「ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃７」の作製には、鋳型としてｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙを用い、プライマーとして各々「＃１＿Ｆｏｒと＃１＿Ｒｅｖとの組み合わせ」〜「＃７＿Ｆｏｒと＃７＿Ｒｅｖとの組み合わせ」を用いた。

インバースＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）によってリン酸化した後、当該増幅ＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）によって環状化した。環状化された増幅ＤＮＡ断片を用いて、クローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドを保持しているクローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を選抜した。

一方、インバースＰＣＲ法による「ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃８」の作製には、鋳型としてｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃５を用い、プライマーとして「＃８＿Ｆｏｒと＃８＿Ｒｅｖとの組み合わせ」を用いた。

そして、インバースＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）によってリン酸化した後、当該増幅ＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）によって環状化した。環状化された増幅ＤＮＡ断片を用いて、クローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドを保持しているクローニング用大腸菌宿主ＪＭ１０９を選抜した。

「ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃１」〜「ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＃８」の各々を用いて、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ （Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換して、形質転換体を取得した。

上記形質転換体の各々を、１％グルコースを含む２×ＹＴ培地にて、３７℃にて培養した。ＯＤ_６００が０．５になった時点にて、０．２ｍＭの濃度になるように培地に対してＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加し、３７℃にて更に４時間の培養を行った。当該４時間の培養によって、所望の融合タンパク質を大量発現した菌体を得た。

融合タンパク質を大量発現した菌体の各々を、反応バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。当該懸濁液を遠心分離処理（２０，０００×ｇ、３０分、４℃）し、その上清を菌体抽出画分として回収した。

菌体抽出画分の各々に１０ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ｆｉｎｅ ｐｏｗｄｅｒ ｃａ. ０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で３０分間混合した。その後、遠心分離（５，０００×ｇ、２分、２５℃）により酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を、酸化ケイ素粒子に対する未結合画分として回収した。

菌体抽出画分の蛍光値から未結合画分の蛍光値を差し引いた値を、酸化ケイ素粒子に結合した融合タンパク質の蛍光値とした。

菌体抽出画分中の融合タンパク質のうちの、酸化ケイ素粒子に結合した融合タンパク質の割合（酸化ケイ素に結合した融合タンパク質の蛍光値／菌体抽出画分の蛍光値）を指標として、各変異融合タンパク質の結合力を比較した。

ポジティブコントロールとして、ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いて同様の試験を行い、ネガティブコントロールとして、ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙから「ＣｏｔＢ１ｐ」に対応する領域を欠失させたｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いて同様の試験を行った。

ポジティブコントロールの酸化ケイ素に対する結合力を１００としたときの、各変異融合タンパク質の相対的な酸化ケイ素に対する結合力を表３に示す。表３から明らかなように、３〜５個のアミノ酸に変異を施したとしても、変異融合タンパク質の酸化ケイ素に対する結合力は十分に維持された。なお、ポジティブコントロールの酸化ケイ素に対する結合力を１００としたときの、変異融合タンパク質の酸化ケイ素に対する結合力は、約５０％〜８５％であった。

＜３．ケイ素の重合試験＞
本実施例では、周知の化学合成法によって合成した配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド（１４アミノ酸）が、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素（具体的には、シリカ）とする能力を有するか否かを検討した。なお、本実施例におけるネガティブコントロールとしては、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を用いた。

配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド、および、ＢＳＡの各々を超純水に溶解して、１〜２０ｍｇ/ｍｌの濃度のペプチド溶液を調製した。

各ペプチド溶液５μＬ、１ｍＭ ＨＣｌ溶液で１５分間水和させた１Ｍ ＴＭＯＳ（テトラメチルオルソケイ酸）溶液５μＬ、およびＳバッファー（０．１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４［ｐＨ８．０］、０．１Ｍ ＮａＯＨ）４０μＬを混合した後、室温で１０分間静置した。

混合溶液を１０，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離した後、上清を除去し、沈殿物を０．１ｍＬの超純水で２回洗浄した。上清を完全に除いた後、アスピレーターにて沈殿物を３０分間乾燥させた。当該乾燥物をシリカ粒子（シリカ重合体）として以後の試験に用いた。

上述したシリカ粒子に対して５０μＬの１Ｎ ＮａＯＨを添加し、９５℃にて３０分間加熱した。

この溶液を超純水にて適度に希釈した後、当該溶液のケイ酸の濃度を測定した。ケイ酸の濃度は、周知のケイ酸−モリブデン法に基づいて、市販のキットであるＳｉｌｉｃａｔｅ ｔｅｓｔ（メルク社製、Ｃａｔ.♯１．１４７９４．０００１）を用いて行った。

具体的には、超純水７８０μＬに測定試料２０μＬを加え、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（キット中の試薬）を１５μＬ添加して攪拌した後、３分間室温で静置した。

その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（キット中の試薬）を１５μＬ添加して攪拌した後、更に、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ（キット中の試薬）を８０μＬ加えた。

攪拌して１０分間室温で静置した後、８１０ｎｍにおける吸光度を測定した。ケイ酸の濃度の検量線は、１，０００μｇ／ｍＬのケイ素標準液（メルク社製、Ｃａｔ.♯１．７０２３６．０５００）を０〜５０μｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度になるように超純水にて希釈し、それぞれの溶液の吸光度とケイ酸の濃度との関係に基づいて作製した。当該検量線を用いて、シリカ粒子の原料であるケイ酸の量を算出し、当該ケイ酸の量から、上述したシリカ粒子中に含まれるシリカの量（換言すれば、算出された量のケイ酸から形成され得る、シリカの量）を算出した。

図２に、各ペプチド濃度にて形成されたシリカの量を示した。なお、図２において、黒塗りの四角形は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドの試験結果を示し、白抜きの四角形は、ＢＳＡの試験結果を示す。

図２に示すように、ＢＳＡには、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力が検出されなかったのに対し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドには、ケイ酸を重合させて酸化ケイ素とする能力が検出された。

本発明は、プロテインチップ、ナノバイオデバイス、ハイブリッド素材、電子素材、光学材料、センサー、半導体基板などの分野に利用することができる。

Claims (5)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）の何れか一方に記載のペプチドのみからなることを特徴とする酸化ケイ素結合タグ。
   （ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
   （ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、アミノ末端から数えて１２番目のアミノ酸以外の１〜５個のアミノ酸が、アラニン又はグリシンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するペプチド。
2. 上記（ｂ）に記載のペプチドが、配列番号４〜１１の何れかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の酸化ケイ素結合タグ。
3. 請求項１または２に記載の酸化ケイ素結合タグおよび目的物質の連結体と、酸化ケイ素と、を結合させる工程を含むことを特徴とする、目的物質の酸化ケイ素への固定化法。
4. 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含むことを特徴とする、ケイ酸を重合させるための組成物。
5. 請求項４に記載の組成物とケイ酸との混合溶液を作製する工程を含むことを特徴とする、ケイ酸を重合させる方法。