JP6411362B2 - 単一リンカーＦａｂＦｖ抗体及びこれを作製する方法 - Google Patents

Description

本開示は、ある種の多重特異性構築物、構築物を含む医薬製剤、構築物をコードするＤＮＡ、及びこれを含むベクターに関する。本開示はまた、構築物を、例えば、宿主細胞内で発現させる方法、及びこれを医薬組成物として製剤化するための方法にも及ぶ。本開示はまた、処置における構築物及び製剤の使用にも関する。

ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２は、それぞれ、Ｆａｂ−Ｆｖ又はＦａｂ−ｄｓＦｖとして公知の、治療剤として有用なある種の二重特異性分子について開示している。この種の分子は、それらが特異的である抗原に対して良好な結合親和性を示し、フォーマット内で抗原結合性部位の著明な閉塞は生じない。これらの抗体分子のうちの高い百分率の分子は、機能的な単量体として発現するが、ある比率の分子は凝集し、そこから単量体を精製する必要がある。

本発明者らは、該当する分子を再操作して、発現段階における凝集を最小化し、これにより、単量体の収率を実質的に増大させつつ、同等の機能性を備えた分子を提供した。

一実施形態では、３つのポリペプチド：
ａ）式（Ｉ）：
（Ｖｘｘ）_ｎＶｘ−Ｃｘ−Ｘ−Ｖ_１
のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩ）：
（Ｖｙｙ）_ｎＶｙ−Ｃｙ
のポリペプチド鎖
ｃ）式（ＩＩＩ）：
Ｖ_２
のポリペプチド
［式中、
Ｖｘは、可変ドメインを表し、
Ｖｘｘは、可変ドメインを表し、
Ｃｘは、定常領域ドメインを表し、
Ｘは、リンカーを表し、
Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
Ｖｙは、可変ドメインを表し、
Ｖｙｙは、可変ドメインを表し、
Ｃｙは、定常領域ドメインを表し、
Ｖ_２は、可変ドメインを表し、
ｎは、独立に、０又は１を表す］
を含むか又はこれらからなり、
定常領域Ｃｘ及びＣｙが対合し、可変ドメインＶｘ及びＶｙが対合して、結合性ドメインを形成し、任意選択で、特に、ジスルフィド結合が存在する場合に、ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在するように、式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が整列している、多重特異性抗体分子が提供される。

一実施形態ではまた、Ｖｘｘ及びＶｙｙも対合して、結合性ドメインを形成する。

一実施形態では、ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在する。

一実施形態では、３つのポリペプチド：
ａ）式（Ｉａ）：
ＶＨ−ＣＨ_１−Ｘ−Ｖ_１
の重鎖；及び
ｂ）式（ＩＩａ）：
ＶＬ−Ｃ_Ｌ
の軽鎖
ｃ）式（ＩＩＩ）：
Ｖ_２
のポリペプチド
［式中、
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン１を表し、
Ｘは、リンカーを表し、
Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
Ｖ_Ｌは、軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_Ｌは、軽鎖由来の定常領域を表し、
Ｖ_２は、可変ドメインを表す］
を含むか又はこれらからなり、
任意選択で、特に、ジスルフィド結合が存在する場合に、ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在する、二重特異性抗体分子が提供される。

一実施形態では、３つのポリペプチド：
ａ）式（Ｉｂ）：
ＶＨ−ＣＨ_１
の重鎖；及び
ｂ）式（ＩＩｂ）：
ＶＬ−Ｃ_Ｌ−Ｘ−Ｖ_２
の軽鎖
ｃ）式（ＩＩＩ）：
Ｖ_１
のポリペプチド
［式中、
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン１を表し、
Ｘは、リンカーを表し、
Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
Ｖ_Ｌは、軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_Ｌは、軽鎖由来の定常領域を表し、
Ｖ_２は、可変ドメインを表す］
を含むか又はこれらからなり、
任意選択で、特に、ジスルフィド結合が存在する場合に、ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在する、二重特異性抗体分子が提供される。

一実施形態では、ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在する。

本構築物は、発現時に見られる凝集の量を最小化し、得られる単量体の量を最大化する、例えば、単量体は、発現させたタンパク質のうちの８０又は９０％以上など、５０％、６０％、７０％、又は７５％以上でありうるので有利である。

本発明に従う、単一リンカーＦａｂ−Ｆｖ構築物並びに対照構築物であるＦａｂｄｓｓｃＦｖ及びＦａｂｄｓＦｖのための様々な配列を示す図である。 様々な構築物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。 様々な構築物についてのサイズ除外解析を示す図である。 本開示に従う様々な例の構築物についての概略表示である。 ＣＨＯ細胞内の、三重遺伝子プラスミドから発現させた、単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖの一過性発現を示す図である。 三重遺伝子プラスミドから発現させた、様々な単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。 三重遺伝子プラスミドから発現させた、単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖについてのサイズ除外解析を示す図である。

本明細書で採用される「多重特異性抗体」とは、本明細書で記載される抗体分子であって、２つ以上の結合性ドメイン、例えば、２つ又は３つの結合性ドメインを有する抗体分子を指す。一実施形態では、構築物は、三特異性抗体である。本明細書で採用される「三特異性分子」とは、同じ抗原又は異なる抗原に独立に結合しうる、３つの抗原結合性部位を伴う分子を指す。

一実施形態では、構築物は、二重特異性抗体である。本明細書で採用される「二重特異性分子」とは、同じ抗原又は異なる抗原に結合しうる、２つの抗原結合性部位を伴う分子を指す。

一実施形態では、ドメインの全てが、抗原上の同じエピトープに結合すること、又は抗原上の異なるエピトープに結合することを含め、同じ抗原に結合する。

一実施形態では、３つの結合性ドメインが存在し、３つの結合性ドメインの各々が、異なる（別々の）抗原に結合する。

一実施形態では、３つの結合性ドメインが存在し、２つの結合性ドメインが、同じ抗原上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合することを含め、同じ抗原に結合し、第３の結合性ドメインが、異なる（別々の）抗原に結合する。

一実施形態では、本開示は、３つのポリペプチド鎖を含むか又はこれらからなる二重特異性抗体に関する。

本開示に従う多重特異性分子は、
式（Ｉ）及び（ＩＩ）［式中、Ｖｘ−Ｃｘ部分は、Ｖｙ−Ｃｙ部分と併せて、機能的なＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を形成する］のそれぞれか、又は、代替的に、
式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）［式中、ＶＨ−ＣＨ_１部分は、ＶＬ−Ｃ_Ｌと併せて、機能的なＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を形成する］
による重鎖と軽鎖との二量体として提供される。

一実施形態では、本開示の構築物は、２つの抗原結合性部位だけを有する。

本明細書で採用される「抗原結合性部位」とは、可変領域の対、特に、標的抗原と特異的に相互作用する同族対を含む分子の部分を指す。

本明細書で採用される「特異的に」とは、それが特異的である抗原だけを認識する結合性部位、又はそれが特異的な抗原に対する結合親和性が、それが非特異的な抗原に対する親和性と比較して著明に大きな結合性部位、例えば、結合親和性が５、６、７、８、９、１０倍の結合性部位を指すことを意図する。

結合親和性は、標準的なアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴により測定することができる。

一実施形態では、１又は複数の、天然であるか又は操作された、鎖間（すなわち、軽鎖と重鎖との間の）ジスルフィド結合が、機能的なＦａｂ断片内又はＦａｂ’断片内に存在する。

一実施形態では、「天然」のジスルフィド結合は、式（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチド鎖内のＣＨ_１とＣ_Ｌとの間、又は対応する構成要素であるＣｘとＣｙとの間に存在する。下記では、ＣＨ_１に対する言及は、Ｃｘにも同等に当てはまりうる。下記では、Ｃ_Ｌに対する言及は、Ｃｙにも同等に当てはまりうる。

Ｃ_Ｌドメインがカッパ鎖又はラムダ鎖に由来する場合、結合を形成するシステインの天然の位置は、ヒトｃカッパ鎖内及びヒトｃラムダ鎖内の２１４位である（Ｋａｂａｔによる番号付け、４版、１９８７）。

ＣＨ_１内の、ジスルフィド結合を形成するシステインの正確な配置は、実際に採用される特定のドメインに依存する。したがって、例えば、ヒトガンマ１では、ジスルフィド結合の天然の位置は、２３３位（Ｋａｂａｔによる番号付け、４版、１９８７）に配置される。ガンマ２、３、４、ＩｇＭ、及びＩｇＤなど、他のヒトアイソタイプについても、結合を形成するシステインの位置が公知であり、例えば、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＥ、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４については、１２７位であり、ヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂについては、重鎖の１２８位である。

Ｖ_１とＶ_２との可変ドメイン対の間の、任意選択のジスルフィド結合に加えて、分子の定常領域内のジスルフィド結合（単数又は複数）も存在しうる。

一実施形態では、本開示に従う多重特異性抗体は、ＣＨ_１とＣ_Ｌとの間の自然発生のジスルフィド結合内の位置と同等であるか又はこれに対応する位置において、ジスルフィド結合を有する。

一実施形態では、ＣＨ_１を含む定常領域及びＣ_Ｌなどの定常領域は、非自然発生の位置に存在するジスルフィド結合を有する。これは、システイン（単数又は複数）を、要求される位置（単数又は複数）において、アミノ酸鎖へと導入することにより、分子へと操作することができる。この非天然のジスルフィド結合は、ＣＨ_１とＣ_Ｌとの間に存在する天然のジスルフィド結合に加えたジスルフィド結合、又は、これへの代替物としてのジスルフィド結合である。

操作されたシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。これらの方法は、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、又はカセット突然変異誘発（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌら、分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などの部位特異的突然変異誘発キットが市販されている。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３に基づき実施することができる。代替的に、突然変異体は、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドの、アニーリング、ライゲーション、及びＰＣＲ増幅、並びにクローニングを介する全遺伝子合成により作製することもできる。

一実施形態では、ＣＨ_１とＣ_Ｌとの間のジスルフィド結合は、完全に非存在である、例えば、鎖間システインは、セリンなど、別のアミノ酸で置きかえることができる。したがって、分子の機能的なＦａｂ断片内には、鎖間ジスルフィド結合が存在しない。参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００５／００３１７０などの開示は、どのようにして鎖間ジスルフィド結合を伴わないＦａｂ断片をもたらすのかについて記載している。

一実施形態では、ｎは、式（Ｉ）のポリペプチド鎖内では、１である。

一実施形態では、ｎは、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖内では、１である。

一実施形態では、ｎは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチド鎖内では、１である。

一実施形態では、ｎは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチド鎖内では、０である。

Ｖｘｘは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又はこれらの組合せに由来し、例えば、下記で記載される、１〜２０アミノ酸のアミノ酸リンカーを含みうる。一実施形態では、Ｖｘｘは、可変領域、特に、重鎖に由来する可変領域からなる。一実施形態では、Ｖｘｘは、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖｘｘは、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖｘｘは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、Ｖｘｘは、ヒト化されている。

Ｖｘは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又はこれらの組合せ、特に、重鎖に由来する可変領域に由来しうる。一実施形態では、Ｖｘは、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖｘは、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖｘは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、Ｖｘは、ヒト化されている。

式（Ｉ）のポリペプチド内のＶｘは、ポリペプチド鎖（Ｉａ）内のＶＨに対応する。

ＶＨは、可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_Ｈは、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖ_Ｈは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化されている。

Ｖ_１は、可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_１は、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_１は、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_１は、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖ_１は、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、Ｖ_１は、ヒト化されている。

Ｖｙｙは、重鎖、軽鎖、又はこれらの組合せに由来し、例えば、下記で記載される、１〜２０アミノ酸のアミノ酸リンカーを含みうる。一実施形態では、Ｖｙｙは、可変領域、特に、軽鎖に由来する可変領域からなる。一実施形態では、Ｖｙｙは、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖｙｙは、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖｙｙは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、Ｖｙｙは、ヒト化されている。

Ｖｙは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又はこれらの組合せ、特に、軽鎖に由来する可変領域に由来しうる。一実施形態では、Ｖｙは、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖｙは、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖｙは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、Ｖｙは、ヒト化されている。

式（ＩＩ）のポリペプチド内のＶｙは、式（ＩＩａ）のポリペプチド内のＶＬに対応する。

Ｖ_Ｌは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_Ｌは、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_Ｌは、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖ_Ｌは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、Ｖ_Ｌは、ヒト化されている。

Ｖ_２は、可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_２は、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_２は、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、Ｖ_２は、キメラ可変ドメインである、すなわち、Ｖ_２は、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、Ｖ_１は、ヒト化されている。

一般に、ＶｘｘとＶｙｙは併せて、抗原結合性ドメインを形成する。一実施形態では、ＶｘｘとＶｙｙは併せて、同族対を表す。

一般に、ＶｘとＶｙは併せて、抗原結合性ドメインを形成する。一実施形態では、ＶｘとＶｙは併せて、同族対を表す。

一実施形態では、ＶＨ及びＶＬにより形成される結合性ドメインは、第１の抗原に特異的である。

一実施形態では、ＶＨとＶＬは、同族対を形成する。

一般に、Ｖ_１とＶ_２は併せて、抗原結合性ドメインを形成する。一実施形態では、Ｖ_１とＶ_２は併せて、同族対を表す。

一実施形態では、Ｖ_１とＶ_２は併せて、第１の抗原に特異的な抗原結合性ドメインを形成する（すなわち、分子内の２つの結合性ドメインは、例えば、その中の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合する、同じ抗原に特異的でありうる）。

一実施形態では、Ｖ_１とＶ_２は併せて、ヒト血清アルブミンに対する結合性ドメインである。

一実施形態では、Ｖ_１とＶ_２は併せて、第２の抗原に特異的な抗原結合性ドメインを形成する（すなわち、分子内の２つの結合性ドメインは、異なる抗原に特異的である）。

一実施形態では、Ｖ_１とＶ_２との間のジスルフィド結合は、以下に列挙される残基（以下のリストでは、文脈により別段であることが指し示されない限り、Ｋａｂａｔによる番号付けを採用する）のうちの２つの間に存在する。Ｋａｂａｔによる番号付けに言及するときはいつでも、関連する参考文献は、Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡである。一実施形態では、ジスルフィド結合は、
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ（例えば、Ｚｈｕら（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８を参照されたい）；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、５４５１〜５４５９；又はＲｅｉｔｅｒら（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９巻、２８号、１８３２７〜１８３３１頁；又はＲａｊａｇｏｐａｌら（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０巻、１２号、１４５３〜１４５９頁を参照されたい）；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５（例えば、Ｌｕｏら（１９９５）、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１、１８、８２５〜８３１を参照されたい）；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７（例えば、Ｚｈｕら（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８を参照されたい）；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１（例えば、Ｙｏｕｎｇら（１９９５）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７７、１３５〜１３９を参照されたい）；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０（例えば、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、１３６２〜１３６７を参照されたい）；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６（例えば、Ｚｈｕら（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８を参照されたい）；
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、７５３８〜７５４２頁；又はＪｕｎｇら（１９９４）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１９、３５〜４７を参照されたい）；
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７（例えば、Ｙｏｕｎｇら（１９９５）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７７、１３５〜１３９を参照されたい）；
及び分子内に配置される可変領域対内のこれらに対応する位置
を含む群から選択される位置にある。

上記で列挙したアミノ酸対は、ジスルフィド結合を形成しうるように、システインによる置きかえを助長する位置に存在する。システインは、公知の技法により、これらの所望の位置へと操作することができる。したがって、一実施形態では、本発明に従う、操作されたシステインとは、所与のアミノ酸位置における自然発生の残基を、システイン残基で置きかえた場合のシステインを指す。

操作されたシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。これらの方法は、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、又はカセット突然変異誘発（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌら、分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などの部位特異的突然変異誘発キットが市販されている。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３に基づき実施することができる。代替的に、突然変異体は、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドの、アニーリング、ライゲーション、及びＰＣＲ増幅、並びにクローニングを介する全遺伝子合成により作製することもできる。

したがって、一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（Ｖ_１／Ｖ_２）は、１つはＶ_１内にあり、１つはＶ_２内にある、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合により連結することができ、この場合、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３、並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。

一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（Ｖ_１／Ｖ_２）は、１つはＶ_１内にあり、１つはＶ_２内にある、２つのシステイン残基であって、ＣＤＲの外側にあるシステイン残基の間のジスルフィド結合により連結することができ、この場合、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３、並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。

一実施形態では、Ｖ_１は、重鎖可変ドメインであり、Ｖ_２は、軽鎖可変ドメインであり、Ｖ_１とＶ_２とは、一方はＶ_１のＶＨ４４位にあり、他方はＶ_２のＶＬ１００位にある、２つの操作されたシステイン残基の間のジスルフィド結合により連結されている。

一実施形態では、ＶＨ及びＶ_１はいずれも、重鎖（単数又は複数）又は軽鎖（単数又は複数）由来の可変領域であり、特に、いずれも、２つの別々の重鎖可変領域に由来する。

一実施形態では、ＶＬ及びＶ_２はいずれも、重鎖（単数又は複数）又は軽鎖（単数又は複数）由来の可変領域であり、特に、いずれも、２つの別々の軽鎖可変領域に由来する。

本明細書で採用される「同族対」とは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて作り出される、単一の抗体由来の可変ドメインの対、すなわち、宿主から単離された可変ドメインの自然発生の対合を指す。したがって、同族対とは、ＶＨとＶＬとの対である。一例では、同族対は、抗原に、共作動的に結合する。

本明細書で採用される「可変領域」とは、ＣＤＲ及び適切なフレームワークを含む抗体鎖内の領域を指す。

本開示における使用のための可変領域は一般に、当技術分野で公知の任意の方法により作り出しうる抗体に由来する。

本明細書で採用される「〜に由来する」とは、採用される配列、又は採用される配列と高度に類似する配列を、抗体の軽鎖又は重鎖など、元の遺伝子素材から得た事実を指す。

本明細書で採用される「高度に類似する」とは、その全長にわたり、９６、９７、９８、又は９９％類似するなど、９５％以上類似するアミノ酸配列を指すことを意図する。

抗原ポリペプチドに対して作り出された抗体は、動物の免疫化が必要な場合、周知の日常的なプロトコール（例えば、実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６を参照されたい）を使用して、ポリペプチドを動物、好ましくは、非ヒト動物へと投与することにより得ることができる。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、又はブタなど、多くの温血動物を免疫化することができる。しかし、一般には、マウス、ウサギ、ブタ、及びラットが最も適する。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、モノクローナル抗体とがん治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、７７〜９６頁、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）など、当技術分野で公知の任意の方法により調製することができる。

抗体はまた、単一リンパ球抗体法を使用して、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３（１５）：７８４３〜７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８、及びＷＯ２００４／１０６３７７により記載されている方法を介して、特異的抗体を作製するために選択された単一のリンパ球から作り出された免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、発現させることにより作り出すこともできる。

本発明における使用のための抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して作り出すこともでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１〜５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７〜１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４：９５２〜９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ、１９９７、１８７、９〜１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７：１９１〜２８０）及びＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；同５，２２３，４０９；同５，４０３，４８４；同５，５８０，７１７；同５，４２７，９０８；同５，７５０，７５３；同５，８２１，０４７；同５，５７１，６９８；同５，４２７，９０８；同５，５１６，６３７；同５，７８０，２２５；同５，６５８，７２７；同５，７３３，７４３；同５，９６９，１０８及びＷＯ２００１１／３０３０５により開示されている抗体を含む。

一実施形態では、本開示に従う二重特異性分子は、ヒト化されている。

本明細書で採用される「ヒト化」（ＣＤＲグラフト抗体を含む）とは、非ヒト種由来の１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する分子（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）を指す。ＣＤＲの全体ではなく、ＣＤＲの特異性決定残基を移植しさえすればよいことが察知されるであろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照されたい）。ヒト化抗体は任意選択で、ＣＤＲが由来していた非ヒト種に由来する１又は複数のフレームワーク残基をさらに含みうる。

本明細書で使用される「ヒト化抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖可変領域フレームワーク及び／又は軽鎖可変領域フレームワークへとグラフトされた、ドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の１又は複数のＣＤＲ（所望の場合、１又は複数の改変ＣＤＲを含む）を含有する抗体分子を指す。総説については、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５〜５３９、１９９８を参照されたい。一実施形態では、移植されるＣＤＲの全体ではなく、本明細書の上記で記載したＣＤＲのうちのいずれか１つ由来の特異性決定残基のうちの１又は複数だけを、ヒト抗体フレームワークへと移植する（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照されたい）。一実施形態では、本明細書の上記で記載したＣＤＲのうちの１又は複数由来の特異性決定残基だけを、ヒト抗体フレームワークへと移植する。別の実施形態では、本明細書の上記で記載した各々のＣＤＲ由来の特異性決定残基だけを、ヒト抗体フレームワークへと移植する。

ＣＤＲ又は特異性決定残基をグラフトする場合、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／種類を考慮する、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列であって、マウスフレームワーク領域、霊長動物フレームワーク領域、及びヒトフレームワーク領域を含むフレームワーク配列を使用することができる。本発明に従うヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域のほか、本明細書で提示されるＣＤＲのうちの１又は複数を含む可変ドメインを有すると適切である。

本発明で使用しうるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら、前出）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは、重鎖に使用することができ、ＲＥＩは、軽鎖に使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ、及びＰＯＭは、重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。代替的に、ヒト生殖細胞系列の配列を使用することができる（これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で入手可能である）。

本発明のヒト化抗体では、アクセプター重鎖及びアクセプター軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要がなく、所望の場合は、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含む場合もある。

フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と正確に同じ配列を有する必要がない。例えば、希少な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又は種類に高頻度で生じる残基へと変更することができる。代替的に、アクセプターフレームワーク領域内の選択された残基は、ドナー抗体内の同じ位置において見出される残基に対応するように変更することができる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４を参照されたい）。このような変更は、ドナー抗体の親和性を復帰させるのに必要な最小限に保つべきである。アクセプターフレームワーク領域内の、変更する必要がありうる残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に提示されている。

一実施形態では、本開示の二重特異性抗体は、完全ヒト抗体であり、特に、可変ドメインのうちの１又は複数は、完全ヒト可変ドメインである。

完全ヒト分子とは、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト起源であるか、又は必ずしも同じ抗体由来でない、ヒト起源の配列と実質的に同一な分子である。完全ヒト抗体の例は、例えば、上記で記載したファージディスプレイ法により作製される抗体、並びにマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子と、任意選択で、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子とを、それらのヒト対応物、例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４、及びＥＰ０４６３１５１において一般的な用語で記載されているヒト対応物で置きかえたマウスにより作製される抗体を含みうる。

Ｃｘとは、軽鎖又は重鎖、特に、重鎖由来の定常ドメインである。

式（Ｉ）のポリペプチド内のＣｘは、式（Ｉａ）のポリペプチド内のＣＨ_１に対応する。一実施形態では、Ｃｘは、ＣＨ_１と同等である。

一実施形態では、ＣＨ_１ドメインとは、重鎖又はその誘導体由来の自然発生ドメイン１である。一実施形態では、ＣＨ断片は、ＣＨ_１ドメインからなる。

Ｃｙとは、軽鎖又は重鎖、特に、軽鎖由来の定常ドメインである。

式（ＩＩ）のポリペプチド内のＣｙは、式（ＩＩａ）のポリペプチド内のＣＬに対応する。一実施形態では、Ｃｙは、ＣＬと同等である。

一実施形態では、軽鎖内のＣ_Ｌ断片は、定常カッパ配列若しくは定常ラムダ配列又はこれらの誘導体である。

本明細書で採用される、「自然発生ドメインの誘導体」とは、自然発生配列内の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸を、例えば、所望されない特性を消失させることなどにより、ドメインの特性を最適化するように置きかえるか又は欠失させているが、ドメインを特徴づける特色（単数又は複数）は保持されたドメインを指すことを意図する。

一実施形態では、Ｘとは、リンカー、例えば、部分であるＣＨ_１とＶ_１とを接続するのに適するペプチドである。

一実施形態では、Ｘとは、リンカー、例えば、部分であるＣ_ＬとＶ_２とを接続するのに適するペプチドである。

一実施形態では、ペプチドリンカーは、５０アミノ酸以下、例えば、２０アミノ酸以下の長さである。

一実施形態では、リンカーは、配列１３〜７７に示される配列から選択される。

一実施形態では、リンカーは、配列番号１０３又は配列番号１０４に示される配列から選択される。

剛性リンカーの例は、ペプチド配列であるＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号６２）、ＰＰＰＰ（配列番号６３）、及びＰＰＰを含む。

一実施形態では、ペプチドリンカーは、アルブミン結合性ペプチドである。

アルブミン結合性ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０において提示されており、以下を含む：

アルブミン結合性ペプチドを、リンカーとして使用することにより、二重特異性抗体分子の半減期を延長しうるので有利である。

疑念を避けるために述べると、Ｖ_２もやはり抗体分子内に存在し、ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在する場合を含む、Ｖ_１との対合のためにその中に保持される。

一実施形態では、本開示の二重特異性抗体分子は、２つの異なる対象の抗原に選択的に結合することが可能である。

一実施形態では、Ｖｘｘ／Ｖｙｙ、Ｖｘ／Ｖｙ、ＶＨ／ＶＬ、及びＶ_１／Ｖ_２が結合する対象の抗原は、細胞会合タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質、及び可溶性タンパク質から独立に選択される。

対象の抗原はまた、疾患時又は感染時に上方調節されるタンパク質など、任意の医学的に関連するタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドでもありうる。細胞表面タンパク質の特定の例は、接着分子、例えば、β１インテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン、又はＬ−セレクチンなどのインテグリン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ抗原及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに、適切な場合、これらの受容体を含む。

可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７、ＩＬ−２３などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来成長因子、並びに、適切な場合、これらの受容体を含む。他の抗原は、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、ＨｅｐＢ、及びＨｅｐＣなどのウイルス、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒及び毒素を含む。

一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質を使用して、対象の抗原の活性を機能的に変化させることができる。例えば、抗体融合タンパク質は、前記抗原の活性を、直接的に又は間接的に、中和する場合もあり、アンタゴナイズする場合もあり、アゴナイズする場合もある。

一実施形態では、ＶＨ及びＶＬが結合する対象の抗原は、ＯＸ４０である。一実施形態では、多重特異性抗体のＶｘ−Ｃｘ部分又はＶＨＣＨ１部分は、配列番号３で与えられる配列を有する。一実施形態では、多重特異性抗体のＶｙ−Ｃｙ部分又はＶＬ−ＣＬ部分は、配列番号７で与えられる配列を有する。

一実施形態では、ＶＨ／ＶＬ又はＶ_１／Ｖ_２が結合する対象の抗原は、補体経路の活性化及び／又はエフェクター細胞の動員など、エフェクター機能を動員する能力をもたらす。

エフェクター機能が、動員分子をその表面上に保有する細胞と関連する場合、エフェクター機能の動員は直接的でありうる。間接的な動員は、本開示に従う分子内の結合性ドメイン（Ｖ_１／Ｖ_２など）の、動員ポリペプチドへの結合により、例えば、因子の放出が引き起こされ、これにより、エフェクター機能が直接的に又は間接的に動員されうるときに生じる場合もあり、シグナル伝達経路の活性化を介する場合もある。例は、ＴＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１７、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニン、並びにＣ２、Ｃ４、Ｃ３コンベルターゼ、及びＣ５〜Ｃ９など、古典的補体活性化カスケード及び代替的補体活性化カスケードの他のメンバーを含む。

本明細書で使用される「動員ポリペプチド」は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγＲ、Ｃ１ｑ及びＣ３などであるがこれらに限定されない補体経路タンパク質、ＣＤ６８、ＣＤ１１５、ＣＤ１６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２などであるがこれらに限定されないＣＤマーカータンパク質（分化抗原群（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）マーカー）を含む。ＣＤマーカータンパク質である、さらなる動員ポリペプチドは、ＣＤ１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、Ｄ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０６、ＣＤ１１４、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６９、ＣＤ１８４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＣＤ２５７、ＣＤ２７８、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、及びＣＤ３０４、又は細胞介在性エフェクター機能を直接的に若しくは間接的に動員する能力を保持するこれらのうちのいずれかの断片を含む。動員ポリペプチドはまた、エフェクター機能を保有する、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、及びＩｇＡなどの免疫グロブリン分子も含む。

一実施形態では、本開示に従う分子内の結合性ドメイン（Ｖ_１／Ｖ_２など）は、Ｃ１ｑが特に好ましい、補体経路タンパク質に対する特異性を有する。

さらに、本発明の分子を、核種キレート剤タンパク質に結合する単一ドメイン抗体により、放射性核種をキレートするのに使用することができる。このような融合タンパク質は、治療のためのイメージング法又は放射性核種によるターゲティング法において有用である。

一実施形態では、本開示に従う分子内の１つの結合性ドメイン（Ｖ_１／Ｖ_２など）は、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６、及びＣＤ３５が特に好ましい、ＣＤマーカータンパク質に対する特異性を有する。

一実施形態では、例えば、血清キャリアタンパク質である循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１に結合することにより、前記対象の抗原に対する特異性を伴う抗体断片の半減期を延長するために、本開示に従う分子内の結合性ドメイン（Ｖ_１／Ｖ_２など）は、前記血清キャリアタンパク質である循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する。

本明細書で使用される「血清キャリアタンパク質」は、チロキシン結合性タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン、及びアルブミン、又はこれらのうちのいずれかの断片を含む。

本明細書で使用される「循環免疫グロブリン分子」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＤ、又はこれらのうちのいずれかの断片を含む。

ＣＤ３５／ＣＲ１とは、半減期を３６日間（通常２８〜４７日間の範囲；Ｌａｎａｒｏら、１９７１、Ｃａｎｃｅｒ、２８（３）：６５８〜６６１）とする、赤血球上に存在するタンパク質である。

一実施形態では、Ｖ_１／Ｖ_２が特異性を有するタンパク質は、ヒト血清キャリアなどの血清キャリアタンパク質である。極めて好ましい実施形態では、血清キャリアタンパク質は、ヒト血清アルブミンである。

アルブミンに結合する可変領域及びＣＤＲは、図１に示される構築物に開示されている。

したがって、一実施形態では、３つのポリペプチド：
ａ）式（Ｉａ）：
ＶＨ−ＣＨ_１−Ｘ−Ｖ_１
の重鎖；及び
ｂ）式（ＩＩａ）：
ＶＬ−Ｃ_Ｌ
の軽鎖
ｃ）式（ＩＩＩ）：
Ｖ_２
のポリペプチド
［式中、
Ｖ_Ｈは、重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン１を表し、
Ｘは、リンカーを表し、
Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
Ｖ_Ｌは、軽鎖可変ドメインを表し、
Ｃ_Ｌは、軽鎖由来の定常領域を表し、
Ｖ_２は、可変領域を表す］
を含むか又はこれらからなり、
Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌが、結合性ドメインを形成するように整列した可変領域の同族対であり、Ｖ_１及びＶ_２が、任意選択でその間にジスルフィド結合がある結合性ドメインを形成するように整列した可変領域の同族対であり、例えば、Ｖ_１及びＶ_２が、ｉｎ ｖｉｖｏでアルブミン、特に、ヒト血清アルブミンに結合することが可能である、二重特異性抗体分子が提供される。

一実施形態では、Ｖ１又はＶ２は、配列番号４、配列番号８、配列番号８３、及び配列番号８６からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、Ｖ１は、配列番号４で与えられる配列を有し、Ｖ２は、配列番号８で与えられる配列を有する。一実施形態では、Ｖ１は、配列番号８６で与えられる配列を有し、Ｖ２は、配列番号８３で与えられる配列を有する。

一例では、Ｖ１又はＶ２、特に、Ｖ１は、配列番号８７で与えられるＣＤＲＨ−１の配列、配列番号８８で与えられるＣＤＲＨ２の配列、及び配列番号８９で与えられるＣＤＲＨ−３の配列を含むＶＨドメインである。一例では、Ｖ１又はＶ２、特に、Ｖ１は、配列番号９３で与えられるＣＤＲＨ−１の配列、配列番号９４で与えられるＣＤＲＨ２の配列、及び配列番号９５で与えられるＣＤＲＨ−３の配列を含むＶＨドメインである。

一実施形態では、Ｖ１又はＶ２、特に、Ｖ２は、配列番号９０で与えられるＣＤＲＬ−１の配列、配列番号９１で与えられるＣＤＲＬ２の配列、及び配列番号９２で与えられるＣＤＲＬ−３の配列を含むＶＬドメインである。一実施形態では、Ｖ１又はＶ２、特に、Ｖ２は、配列番号９６で与えられるＣＤＲＬ−１の配列、配列番号９７で与えられるＣＤＲＬ２の配列、及び配列番号９８で与えられるＣＤＲＬ−３の配列を含むＶＬドメインである。

一例では、Ｖ１又はＶ２、特に、Ｖ１は、配列番号４、配列番号８６、配列番号９９、又は配列番号１００で与えられる配列を含むＶＨドメインである。

一例では、Ｖ１又はＶ２、特に、Ｖ２は、配列番号８、配列番号８３、配列番号１０１、又は配列番号１０２で与えられる配列を含むＶＬドメインである。

一例では、Ｖ１は、配列番号９９で与えられる配列を含むＶＨドメインであり、Ｖ２は、配列番号１０１で与えられる配列を含むＶＬドメインである。

一例では、Ｖ１は、配列番号１００で与えられる配列を含むＶＨドメインであり、Ｖ２は、配列番号１０２で与えられる配列を含むＶＬドメインである。

一例では、ポリペプチドＩａは、配列番号６で与えられる配列を有する。

一例では、ポリペプチドＩＩａは、配列番号７で与えられる配列を有する。

一例では、ポリペプチドＩｂは、配列番号３で与えられる配列を有する。

一例では、ポリペプチドＩＩｂは、配列番号５で与えられる配列を有する。

一例では、ポリペプチドＩａは、配列番号６で与えられる配列を有し、ポリペプチドＩＩａは、配列番号７で与えられる配列を有し、Ｖ_２は、配列番号８で与えられる配列を有する。

一例では、ポリペプチドＩｂは、配列番号３で与えられる配列を有し、ポリペプチドＩＩｂは、配列番号５で与えられる配列を有し、Ｖ_１は、配列番号４で与えられる配列を有する。

本発明はまた、本明細書で開示される配列又は抗体と８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似する配列も提供する。

本明細書で使用される「同一性」は、整列させた配列内の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が、配列の間で同一であることを指し示す。本明細書で使用される「類似性」は、整列させた配列内の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が、配列の間で類似する種類であることを指し示す。例えば、ロイシンで、イソロイシン又はバリンを置換することができる。互いに置換しうることが多い他のアミノ酸は、
・フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
・リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
・アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
・アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
・システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
を含むがこれらに限定されない。同一性及び類似性の程度は、たやすく計算することができる（計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；バイオコンピューティング：インフォマティクス及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；科学データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、１部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；ＮＣＢＩから市販されているＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、３：２６６〜２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：１３１〜１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７：６４９〜６５６）。

代替的な態様では、本発明は、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖへと連結されたＦａｂ断片又はＦａｂ’断片であって、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ（ｄｓｓｃＦｖ）を、直接的に、又は本明細書で記載されるリンカーなどのリンカーを介して、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片の重鎖又は軽鎖のＣ末端へと連結したＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を提供する。Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ融合タンパク質は、二重特異性であることが好ましい。一例では、ｄｓｓｃＦｖは、ヒト血清アルブミンなどの血清キャリアタンパク質に結合する。一例では、ｄｓｓｃＦｖを、配列番号７８で与えられるリンカーにより、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片の重鎖のＣ末端へと連結する。一例では、ｄｓｓｃＦｖを、配列番号１０３で与えられるリンカーにより、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片の軽鎖のＣ末端へと連結する。一例では、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖの重鎖は、配列番号９で与えられる配列を有し、軽鎖は、配列番号１０で与えられる配列を有する。一例では、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖの重鎖は、配列番号１１で与えられる配列を有し、軽鎖は、配列番号１２で与えられる配列を有する。

一実施形態では、本開示の二重特異性抗体分子を、標的抗原（単数又は複数）に対する親和性を改善するように加工する。このような変異体は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含む、多数の親和性成熟プロトコールにより得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（前出）は、これらの親和性成熟法について論じている。

本明細書のこの文脈で採用される「親和性の改善」とは、出発分子を上回る改善を指す。

所望の場合、本発明における使用のための抗体は、１又は複数のエフェクター分子へとコンジュゲートさせることができる。エフェクター分子は、本発明の抗体へと接合させうる単一の部分を形成するように連結された、単一のエフェクター分子、又は２つ以上のこのような分子を含みうることが察知されるであろう。エフェクター分子へと連結された抗体断片を得ることが所望である場合、これは、抗体断片を、直接的に又はカップリング剤を介して、エフェクター分子へと連結する、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順により調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体へとコンジュゲートさせるための技法は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８；及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３、６７〜１２３を参照されたい）。特定の化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６、及びＷＯ０３０３１５８１において記載されている化学的手順を含む。代替的に、エフェクター分子が、タンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３、及びＥＰ０３９２７４５において記載されている組換えＤＮＡ手順を使用して達成することができる。

本明細書で使用される「エフェクター分子」という用語は、例えば、生物学的に活性のタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は自然発生のポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に、放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子、並びに蛍光化合物又はＮＭＲ分光法若しくはＥＳＲ分光法により検出されうる化合物などのレポーター基を含む。

他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２、及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート放射性核種；又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トキソイド、及びスラミンなどであるがこれらに限定されない薬物を含みうる。

他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド、及び酵素を含む。対象の酵素は、タンパク質分解酵素である、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、又は抗血栓剤である組織プラスミノーゲン活性化因子、又は抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカインである、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の成長因子及び免疫グロブリンなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含むがこれらに限定されない。

他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用な、検出可能な物質を含みうる。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子群、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン断層法における使用のための）、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。一般に、診断法としての使用のための、抗体へとコンジュゲートさせうる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子群は、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンを含み、適切な蛍光材料は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、及びフィコエリトリンを含み、適切な発光材料は、ルミノールを含み、適切な生物発光材料は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びイクオリンを含み、適切な放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃを含む。

別の例では、エフェクター分子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の半減期を延長することが可能であり、且つ／又は抗体の免疫原性を低減することが可能であり、且つ／又は上皮障壁を越える、免疫系への抗体の送達を増強することが可能である。この種の適切なエフェクター分子の例は、ＷＯ０５／１１７９８４において記載されているエフェクター分子など、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質、又はアルブミン結合性化合物を含む。

エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般に、合成ポリマー又は自然発生のポリマー、例えば、任意選択で、置換された直鎖状又は分枝鎖状のポリアルキレンポリマー、ポリアルケニレンポリマー、又はポリオキシアルキレンポリマーの場合もあり、分枝鎖状又は非分枝鎖状の多糖、例えば、ホモ多糖又はヘテロ多糖の場合もある。

任意選択の具体的な置換基は、１又は複数のヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基を含む上述の合成ポリマー上に存在しうる。

合成ポリマーの具体例は、任意選択で、置換された直鎖状又は分枝鎖状のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はこれらの誘導体、とりわけ、任意選択で、メトキシポリ（エチレングリコール）又はこれらの誘導体など、置換されたポリ（エチレングリコール）を含む。具体的な自然発生のポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はこれらの誘導体を含む。本明細書で使用される「誘導体」は、例えば、マレイミドなどのチオール選択性反応性基などの反応性誘導体を含むことを意図する。反応性基は、直接的に又はリンカーセグメントを介して、ポリマーへと連結することができる。このような基の残余部分は、いくつかの場合には、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、生成物の一部を形成することが察知されるであろう。ポリマーのサイズは、所望に応じて変化させることができるが、一般に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａなど、５０００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲内にあるであろう。ポリマーのサイズは、特に、生成物の意図される使用、例えば、腫瘍など、ある種の組織へと局在化する能力、又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択することができる（総説には、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５を参照されたい）。したがって、例えば、例えば、腫瘍の処置における使用のために、生成物が、循環を離れ、組織を透過することを意図する場合、例えば、分子量を約５０００Ｄａとする、低分子量のポリマーを使用することが有利でありうる。生成物が循環内に滞留する適用には、例えば、分子量を２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲をとする、高分子量のポリマーを使用することが有利でありうる。

適切なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）又は、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体などのポリアルキレンポリマーを含み、とりわけ、分子量を約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲とするポリアルキレンポリマーを含む。

一例では、本発明における使用のための抗体を、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分へと接合させる。特定の一例では、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片内に配置される、任意の結合可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸の官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を介して接合させることができる。このようなアミノ酸は、抗体断片内に天然で生じる場合もあり、組換えＤＮＡ法（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）を使用して断片へと操作する場合もある。一例では、本発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であり、この場合、修飾は、エフェクター分子の接合を可能とする、その重鎖のＣ末端への、１又は複数のアミノ酸の付加である。さらなるアミノ酸は、エフェクター分子を接合させうる１又は複数のシステイン残基を含有する、修飾ヒンジ領域を形成すると適切である。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を接合させることができる。

ＰＥＧ分子は、抗体断片内に配置される少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して、共有結合的に連結されると適切である。修飾抗体断片へと接合させた各ポリマー分子は、断片内に配置されるシステイン残基の硫黄原子へと共有結合的に連結することができる。共有結合的連結は一般に、ジスルフィド結合、又は、特に、硫黄−炭素間結合となろう。チオール基を、接合点として使用する場合、適切な形で活性化させたエフェクター分子、例えば、マレイミドなどのチオール選択性誘導体、及びシステイン誘導体を使用することができる。活性化させたポリマーを、上記で記載した、ポリマー修飾抗体断片の調製における出発材料として使用することができる。活性化させたポリマーは、α−ハロカルボン酸など、チオール反応性基を含有する任意のポリマー、又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドでありうる。このような出発材料は、購入することもでき（例えば、旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．であるＮｅｋｔａｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）、従来の化学的手順を使用して、市販の出発材料から調製することもできる。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（旧ＳｈｅａｒｗａｔｅｒであるＮｅｋｔａｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手できる）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（旧ＳｈｅａｒｗａｔｅｒであるＮｅｋｔａｒから入手できる）を含む。

一実施形態では、分子内のＦａｂ又はＦａｂ’を、ＰＥＧ化する、すなわち、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７［また、「ポリ（エチレングリコール）化学：生物技術的・生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；「ポリ（エチレングリコール）化学及び生物学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ；並びに「生物医科学のためのバイオコンジュゲーションによるタンパク質カップリング法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００２、５４：５３１〜５４５も参照されたい］で開示されている方法に従い、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））をそれへと共有結合的に接合させる。一例では、ＰＥＧを、ヒンジ領域内のシステインへと接合させる。一例では、ＰＥＧで修飾されたＦａｂ断片は、マレイミド基を、修飾ヒンジ領域内の単一のチオール基へと共有結合的に連結している。リシン残基は、マレイミド基へと共有結合的に連結することができ、リシン残基上のアミン基の各々へは、分子量を約２０，０００Ｄａとする、メトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを接合させることができる。したがって、Ｆａｂ断片へと接合させるＰＥＧの全分子量は、約４０，０００Ｄａでありうる。

特定のＰＥＧ分子は、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（旧ＳｈｅａｒｗａｔｅｒであるＮｅｋｔａｒから入手できる）としてもまた公知の、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）の２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミド（ＭＷ：２０，０００）で修飾されたリシンを含む。

ＰＥＧリンカーの代替的な供給元は、ＧＬ２−４００ＭＡ２（式中、下記の構造内のｍは、５であり、ｎは、約４５０である）、及びＧＬ２−４００ＭＡ（式中、ｍは、２であり、ｎは、約４５０である）

を供給しているＮＯＦを含む。すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。以下の種類：

のさらなる代替的なＰＥＧエフェクター分子も、Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ、及びＪｅｎｋｅｍから市販されている。

一実施形態では、ＰＥＧ化し（例えば、本明細書で記載されるＰＥＧで）、鎖内のアミノ酸２２６、例えば、重鎖のアミノ酸２２６（連鎖的な番号付けによる）において、又はこの近傍において、アミノ酸残基であるシステインを介して接合させた抗体が提供される。

一実施形態では、ＤＮＡ配列など、本開示の分子をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。

一実施形態では、本開示の分子の、２つ以上など、１又は複数のポリペプチド構成要素、例えば、
式（Ｉ）：
（Ｖｘｘ）_ｎＶｘ−Ｃｘ−Ｘ−Ｖ_１
のポリペプチド鎖
式（ＩＩ）：
（Ｖｙｙ）_ｎＶｙ−Ｃ_ｙ
のポリペプチド鎖
式（ＩＩＩ）：
Ｖ_２
のポリペプチド
［式中、
Ｖｘは、可変ドメインを表し、
Ｖｘｘは、可変ドメインを表し、
Ｃｘは、定常領域ドメインを表し、
Ｘは、リンカーを表し、
Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
Ｖｙは、可変ドメインを表し、
Ｖｙｙは、可変ドメインを表し、
Ｃｙは、定常領域ドメインを表し、
Ｖ_２は、可変ドメインを表し、
ｎは、独立に、０又は１を表す］
をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。

一実施形態では、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドは、ベクター内に含まれる。

当業者には、ベクターを構築しうる一般的な方法である、トランスフェクション法及び培養法が周知である。この点では、「分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより刊行されている、Ｍａｎｉａｔｉｓによるマニュアルが参照される。

また、本発明の抗体をコードする１又は複数のＤＮＡ配列を含む、１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるために、任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌系、例えば、大腸菌系、及び他の微生物系を使用することもでき、また、真核生物の宿主細胞発現系、例えば、哺乳動物の宿主細胞発現系を使用することもできる。適切な哺乳動物の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリドーマ細胞を含む。

本発明はまた、本発明に従う抗体分子を作製するためのプロセスであって、本発明のベクターを含有する宿主細胞を、タンパク質の、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからの発現をもたらすのに適する条件下で培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含むプロセスも提供する。

重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物を作製するために、細胞系に、第１のベクターが軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターが重鎖ポリペプチドをコードする、２つのベクターをトランスフェクトすることができる。代替的に、単一のベクターであって、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含むベクターを使用することもできる。一例では、細胞系に、各々が本発明の抗体分子のポリペプチド鎖をコードする、３つのベクターをトランスフェクトすることができる。一例では、細胞系に、各ベクターが、
ａ）式（Ｉ）：
（Ｖｘｘ）_ｎＶｘ−Ｃｘ−Ｘ−Ｖ_１；
のポリペプチド鎖
ｂ）式（ＩＩ）：
（Ｖｙｙ）_ｎＶｙ−Ｃ_ｙ
のポリペプチド鎖、及び
ｃ）式（ＩＩＩ）：
Ｖ_２
のポリペプチド
［式中、
Ｖｘは、可変ドメインを表し、
Ｖｘｘは、可変ドメインを表し、
Ｃｘは、定常領域ドメインを表し、
Ｘは、リンカーを表し、
Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
Ｖｙは、可変ドメインを表し、
Ｖｙｙは、可変ドメインを表し、
Ｃｙは、定常領域ドメインを表し、
Ｖ_２は、可変ドメインを表し、
ｎは、独立に、０又は１を表す］
から選択される異なるポリペプチドをコードする、３つのベクターをトランスフェクトする。

多重特異性抗体生成物の発現を最適化するために、宿主細胞へとトランスフェクトされた各ベクターの比を変化させうることが察知されるであろう。一実施形態では、ベクターの比は、１：１：１である。当業者は、トランスフェクション後におけるタンパク質発現レベルについての日常的な試験により、最適な比を見出すことが可能なことが察知されるであろう。

また、ポリペプチド構成要素のうちの２つ以上、特に、３つ以上が、単一のベクター内のポリヌクレオチドによりコードされる場合、本発明のポリペプチド構成要素をコードする各ポリヌクレオチドのために異なるプロモーターを活用することにより、各ポリペプチド構成要素の相対発現を変化させうることも察知されるであろう。

一実施形態では、ベクターは、単一のプロモーターの制御下で、本発明の多重特異性抗体分子の３つのポリペプチド鎖全てをコードする、単一のポリヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ベクターは、本発明の多重特異性抗体分子の３つのポリペプチド鎖全てをコードする、単一のポリヌクレオチド配列を含み、この場合、各ポリペプチド鎖をコードする各ポリヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの制御下にある。

本開示に従う抗体及び断片は、宿主細胞から良好なレベルで発現させる。したがって、抗体及び／又は断片の特性は、最適化され、市販のための加工を助長すると考えられる。

本発明の抗体は、病理学的状態の処置及び／又は予防において有用である。

本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの１又は複数と組み合わせて含む医薬組成物又は診断組成物も提供する。したがって、処置における使用のための本発明の抗体の使用、及び医薬を製造するための本発明の抗体の使用が提供される。

組成物は通例、通常薬学的に許容可能な担体を含む滅菌の医薬組成物の一部として供給されるであろう。本発明の医薬組成物は加えて、薬学的に許容可能なアジュバントも含みうる。

本発明はまた、医薬組成物又は診断組成物を調製するためのプロセスであって、本発明の抗体分子を、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの１又は複数と併せて添加及び混合するステップを含むプロセスも提供する。

抗体分子は、医薬組成物又は診断組成物中で唯一の有効成分の場合もあり、他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体、若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む、他の有効成分を伴う場合もある。他の適切な有効成分は、寛容を誘導することが可能な抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ４抗体を含む。

さらなる実施形態では、本開示に従う抗体、断片、又は組成物を、さらなる薬学的に活性の薬剤、例えば、コルチコステロイド（プロピオン酸フルチカゾンなど）及び／若しくはベータ−２−アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール、又はフォルモテロールなど）、又は細胞成長及び細胞増殖の阻害剤（ラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサートなど）、又は、代替的に、ＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて採用する。一実施形態では、阻害剤は、低分子である。別の実施形態では、阻害剤は、標的に特異的な抗体である。

医薬組成物は、治療有効量の、本発明の抗体を含むと適切である。本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、標的とされる疾患若しくは状態を処置、改善、若しくは防止するのに必要とされる治療剤の量、又は検出可能な治療的効果若しくは予防的効果を呈示するのに必要とされる治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量はまず、細胞培養アッセイにおいて推定することもでき、動物モデルにおいて、通例、齧歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、又は霊長動物において推定することもできる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するのに使用することもできる。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量及び投与経路を決定することができる。

ヒト対象のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全般的健康、対象の年齢、体重、及び性別、食餌、投与時期及び投与頻度、薬物の組合せ（単数又は複数）、治療に対する反応過敏性及び寛容／応答に依存するであろう。この量は、日常的な実験により決定することができ、主治医の判断の範囲内にある。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。代替的に、用量は、１日当たり１０〜１００、２００、３００、又は４００ｍｇなど、１日当たり１〜５００ｍｇでもありうる。医薬の組成物は、あらかじめ決定された量の、本発明の活性薬剤を含有する単位剤形中に存在すると好都合でありうる。

組成物は、患者へと個別に投与することもでき、他の薬剤、薬物、又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次的に、又は別個に）投与することもできる。

本発明の抗体分子を投与するときの用量は、処置される状態の性格、存在する炎症の程度、及び抗体分子が、予防的に使用されるのか、又は既存の状態を処置するために使用されるのかに依存する。

投与の頻度は、抗体の半減期分子及びその効果の持続期間に依存するであろう。抗体分子の半減期が短い（例えば、２〜１０時間）場合、１日当たり１回又は複数回の投与を必要とする可能性がある。代替的に、抗体分子の半減期が長い（例えば、２〜１５日間）場合、毎日１回、毎週１回、なお又は１若しくは２カ月ごとに１回投与するだけでよい可能性もある。

薬学的に許容可能な担体はそれ自体、組成物を施される個体に対して有害な抗体の産生を誘導するべきでなく、毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性のウイルス粒子など、大型でゆっくりと代謝される高分子でありうる。

例えば、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ホスファート、及びスルファートなどの鉱酸塩、又はアセタート、プロピオナート、マロナート、及びベンゾアートなど、有機酸の塩などの、薬学的に許容可能な塩を使用することができる。

加えて、治療用組成物中の薬学的に許容可能な担体は、水、生理食塩液、グリセロール、及びエタノールなどの液体も含有しうる。加えて、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質など、補助物質も、このような組成物中に存在させることができる。このような担体は、医薬組成物を、患者が服用するための、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液として製剤化することを可能とする。

投与に適する形態は、例えば、注射又は注入による例えば、ボーラス注射若しくは持続注入による非経口投与に適する形態を含む。生成物が、注射又は注入用の生成物である場合、それは、油性媒体中又は水性媒体中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンの形態を取ることが可能であり、懸濁剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有しうる。代替的に、抗体分子は、適切な滅菌の液体を伴う使用の前に再構成するための乾燥形態でもありうる。

製剤化したら、本発明の組成物を、対象へと直接投与することができる。処置される対象は、動物でありうる。しかし、１又は複数の実施形態では、組成物を、ヒト対象への投与に適合させる。

一実施形態では、本開示に従う製剤中で、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値と同様ではない。というのも、製剤のｐＨが７であれば、８〜９以上のｐＩが適切でありうる。理論により束縛されることを望まないが、これは最終的に、安定性が改善された、例えば、抗体又は断片が溶液中に滞留する最終製剤を提供しうると考えられる。

本発明の医薬組成物は、経口経路、静脈内経路、筋内経路、動脈内経路、脊髄内経路、髄腔内経路、脳室内経路、経皮経路（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ、ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、腸内経路、局所経路、舌下経路、膣内経路、又は直腸内経路を含むがこれらに限定されない、任意の数の経路により投与することができる。また、皮下噴射器を使用して、本発明の医薬組成物を投与することもできる。治療用組成物は、液体溶液又は懸濁液としての注射剤として調製しうることが典型的である。また、注射の前に液体媒体中で溶解又は懸濁させるのに適する固体形態も調製することができる。本発明の抗体分子は、皮下投与するか、吸入により投与するか、又は局所投与することが好ましい。

組成物の直接的な送達は一般に、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、若しくは筋内注射により達成されるか、又は組織の間質腔へと送達されるであろう。組成物はまた、対象の具体的組織へと投与することもできる。投与処置は、単回投与スケジュールの場合もあり、複数回投与スケジュールの場合もある。

組成物中の有効成分は、抗体分子であることが察知されるであろう。したがって、組成物中の有効成分は、消化管内の分解を受けやすいであろう。したがって、組成物を、消化管を使用する経路により投与する場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、抗体を、それが消化管から吸収されたら放出する薬剤を含有する必要があるであろう。

薬学的に許容可能な担体についての完全な議論は、レミントン薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＪ．、１９９１）において参照可能である。

一実施形態では、製剤を、吸入を含む局所投与のための製剤として提供する。

適切な吸入用調製物は、吸入用粉末、高圧ガスを含有する計量型エアゾール、又は高圧ガスを含有しない吸入用溶液（噴霧用溶液又は噴霧用懸濁液など）を含む。活性物質を含有する、本開示に従う吸入用粉末は、上述の活性物質だけからなる場合もあり、上述の活性物質の、生理学的に許容可能な賦形剤との混合物からなる場合もある。

これらの吸入用粉末は、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖、及び多糖（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらの互いとの混合物を含みうる。単糖又は二糖が、もっぱらではないが特にそれらの水和物の形態で適切には使用され、ラクトース又はグルコースが使用される。

肺内に沈着させるための粒子は、１〜９ミクロン、例えば、０．１〜５μｍ、特に、１〜５μｍなど、１０ミクロン未満の粒子サイズを要求する。有効成分（抗体又は断片など）の粒子サイズは、極めて重要である。

当技術分野では、吸入用エアゾールを調製するのに使用しうる高圧ガスが公知である。適切な高圧ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン、並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、又はシクロブタンの塩素化誘導体及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素などの炭化水素の中から選択する。上述の高圧ガスは、それら自体で使用することもでき、その混合物中で使用することもできる。

特に適切な高圧ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、及びＴＧ２２７の中から選択される、ハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）、及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、及びこれらの混合物は、特に、適切である。

高圧ガス含有吸入用エアゾールはまた、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、滑沢剤、及びｐＨを調整するための手段など、他の成分も含有しうる。当技術分野では、これらの成分の全てが公知である。

本発明に従う高圧ガス含有吸入用エアゾールは、重量で最大５％の活性物質を含有しうる。本発明に従うエアゾールは、例えば、重量で０．００２〜５％、重量で０．０１〜３％、重量で０．０１５〜２％、重量で０．１〜２％、重量で０．５〜２％、又は重量で０．５〜１％の活性物質を含有する。

代替的に、肺への局所投与はまた、例えば、噴霧器、例えば、圧縮器へと接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．製のＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮器へと接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などのデバイスを採用する、液体溶液製剤又は懸濁液製剤の投与を介する場合もある。

一実施形態では、製剤を、噴霧化による送達のための単位用量を含有する個別のアンプルとして提供する。

一実施形態では、抗体を、再構成のための凍結乾燥形態で、又は代替的に、懸濁液製剤として供給する。

本発明の抗体は、例えば、溶液又は懸濁液の形態で溶媒中に分散させて送達することができる。本発明の抗体は、適切な生理学的溶液、例えば、生理食塩液、薬理学的に許容可能な溶媒、又は緩衝液中に懸濁させることができる。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、水１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルバート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有しうる。前述の通り、懸濁液は、例えば、凍結乾燥抗体から作製することができる。

治療用懸濁液又は治療用溶液製剤はまた、１又は複数の賦形剤も含有しうる。当技術分野では、賦形剤が周知であり、緩衝剤（例えば、シトラート緩衝剤、ホスファート緩衝剤、アセタート緩衝剤、及びビカルボナート緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁液は、リポソーム内又は生体分解性マイクロスフェア内に封入することができる。製剤は一般に、滅菌製造プロセスを採用して、実質的滅菌形態で提供されるであろう。

これは、当業者が精通している方法を介する、抗体の、滅菌緩衝溶媒溶液中の無菌懸濁液である製剤に使用される緩衝溶媒溶液の濾過、及び製剤の滅菌容器への分配による、作製及び滅菌処理を含みうる。

本開示に従う噴霧用製剤は、例えば、ホイル包装内にパッケージングされた、単回投与単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。各バイアルは、ある容量、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液緩衝剤中に単位用量を含有する。

本開示の抗体は、噴霧化を介する送達に適すると考えられる。また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与しうることも想定されている。これを達成するために、抗体鎖をＤＮＡ配列から発現させ、ｉｎ ｓｉｔｕでアセンブルするように、抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列であって、適切なＤＮＡ構成要素の制御下にあるＤＮＡ配列を、患者へと導入する。

病理学的状態又は障害は、例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌、及び寄生虫）、感染と関連した内毒性ショック、関節リウマチなどの関節炎、重度の喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣疾患、腹膜炎、乾癬、血管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン−バレー症候群など、中枢神経系及び末梢神経系の免疫介在性炎症性障害、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫性障害、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植拒絶、心筋梗塞などの虚血性疾患を含む心疾患のほか、アテローム性動脈硬化、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎、及び低塩酸症からなる群から選択することができる。

本発明はまた、疼痛、特に、炎症と関連した疼痛の処置又は予防における使用のための、本発明に従う抗体分子も提供する。

したがって、処置及びこれを採用する処置法における使用のための、本発明に従う抗体が提供される。

一実施形態では、抗体（特に、本発明に従う抗体又は断片）を精製するためのプロセスが提供される。

一実施形態では、抗体（特に、本発明に従う抗体又は断片）を精製するためのプロセスであって、不純物をカラム上に保持し、抗体を非結合画分中に維持するように、アニオン交換クロマトグラフィーを、非結合モードで実施するステップを含むプロセスが提供される。ステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施することができる。

プロセスは、例えば、約４〜５のｐＨで実施される、カチオン交換クロマトグラフィーを採用する、初期捕捉ステップもさらに含みうる。

プロセスは、生成物及びプロセス関連不純物が、生成物流から適切な形で分解されることを確実にするために、さらなるクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）もさらに含みうる。

精製プロセスはまた、濃縮ステップ及び透析ステップなど、１又は複数の限外濾過ステップも含みうる。

前出で使用した「精製形態」とは、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％（ｗ／ｗ）以上の純度など、少なくとも９０％の純度を指すことを意図する。

「内毒素を実質的に含有しない」とは一般に、生成物１ｍｇ当たり０．５又は０．１ＥＵなど、抗体生成物１ｍｇ当たり１ＥＵ以下の内毒素含量を指すことを意図する。

「宿主細胞タンパク質又は宿主細胞ＤＮＡを実質的に含有しない」とは一般に、１ｍｇ当たり１００μｇ以下、特に、必要に応じて、１ｍｇ当たり２０μｇなど、抗体生成物１ｍｇ当たり４００μｇ以下の宿主細胞タンパク質含量及び／又は宿主細胞ＤＮＡ含量を指すことを意図する。

本発明の抗体分子はまた、診断において、例えば、ＯＸ４０を伴う疾患状態についてのｉｎ ｖｉｖｏ診断及びｉｎ ｖｉｖｏイメージングにおいて使用することもできる。

本明細書の文脈における「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味することを意図する。

技術的に適切である限りにおいて、本発明の実施形態は、組み合わせることができる。

本明細書では、実施形態について、ある種の特色／要素を含むものとして記載している。本開示はまた、前記特色／要素からなるか又はこれらから本質的になる別個の実施形態にも及ぶ。

本発明について、付属の図を参照する以下の例において、例示だけを目的としてさらに記載する。

（例１）
単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖ
哺乳動物細胞内で発現させるための、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖプラスミドの構築
可撓性リンカーであるＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０３）を使用して、６４５ｖＬを、Ａ２６の軽鎖Ｋｍ３アロタイプのヒトカッパ定常領域のＣ末端へと融合させることにより、又は可撓性リンカーであるＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７８）を使用して、６４５ｖＨを、Ａ２６の重鎖γ１アイソタイプのヒトガンマ１ＣＨ１定常領域のＣ末端へと融合させることにより、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（図１を参照されたい）を発現させるための、Ａ２６Ｆａｂ融合タンパク質を構築した。加えて、６４５ｖＬ及び６４５ｖＨの両方のフレームワーク領域内の選択された残基において、ＤＮＡ配列への点突然変異も導入した。突然変異（重鎖におけるＧ４４Ｃ及び軽鎖におけるＧ１００Ｃ）を導入して、６４５Ｆｖの重鎖と軽鎖との間の鎖間ジスルフィド結合を創出した。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖ（図１を参照されたい）を発現させるためのＡ２６Ｆａｂ融合タンパク質を、以下の通りに構築した。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、可撓性リンカーであるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９）を介して、６４５ｖＬのＮ末端を、６４５ｖＨのＣ末端と連結することにより構築した。点突然変異を、フレームワーク残基である６４５ｖＬ内のＧ１００Ｃ及び６４５ｖＨ内のＧ４４ＣにおいてＤＮＡ配列へと導入して、ジスルフィド連結されたｓｃＦｖ（ｄｓｓｃＦｖ）を作製した。次いで、可撓性リンカーであるＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０４）を使用して、６４５ｄｓｓｃＦｖを、Ａ２６の軽鎖Ｋｍ３アロタイプのヒトカッパ定常領域のＣ末端へと融合させるか、又は可撓性リンカーであるＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号８０）を使用して、Ａ２６の重鎖γ１アイソタイプのヒトガンマ１ＣＨ１定常領域のＣ末端へと融合させた。Ａ２６Ｆａｂ軽鎖−６４５ｄｓｖＬ、Ａ２６Ｆａｂ重鎖−６４５ｄｓｖＨ、Ａ２６Ｆａｂ軽鎖、Ａ２６Ｆａｂ重鎖、６４５ｄｓｖＬフリードメイン、６４５ｄｓｖＨフリードメイン、Ａ２６Ｆａｂ軽鎖−６４５ｄｓｓｃＦｖ、及びＡ２６Ｆａｂ重鎖−６４５ｄｓｓｃＦｖを化学的に作製し、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で、哺乳動物発現ベクターへと個別にクローニングした。

単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖの、ＨＥＫ２９３における発現
製造元の指示書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に、関連するプラスミドをトランスフェクトした。以下のプラスミドを混合して、異なる構築物を発現させた：Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのためのプラスミドは、Ａ２６Ｆａｂ Ｈｅａｖｙ−（Ｓ、３×Ｇ４Ｓ／Ｔ）−６４５ｄｓｖＨ及びＡ２６Ｆａｂ Ｌｉｇｈｔ−（Ｓ、３×Ｇ４Ｓ）−６４５ｄｓｖＬであり；単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ＬＣ−ｖＬ間連結された）のためのプラスミドは、Ａ２６Ｆａｂ Ｈｅａｖｙ、６４５ｄｓｖＨ及びＡ２６Ｆａｂ Ｌｉｇｈｔ−（Ｓ、３×Ｇ４Ｓ）−６４５ｄｓｖＬであり；単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ＨＣ−ｖＨ間連結された）のためのプラスミドは、Ａ２６Ｆａｂ Ｈｅａｖｙ−（Ｓ、３×Ｇ４Ｓ／Ｔ）−６４５ｄｓｖＨ、Ａ２６Ｆａｂ Ｌｉｇｈｔ及び６４５ｄｓｖＬであり；Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖ（ＨＣ−ｓｃＦｖ）のためのプラスミドは、Ａ２６Ｆａｂ Ｈｅａｖｙ−（Ｓ、２×Ｇ４Ｓ／Ｔ）−６４５ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨ−４×Ｇ４Ｓ−ｖＬ）、及びＡ２６Ｆａｂ Ｌｉｇｈｔであり；Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖ（ＬＣ−ｓｃＦｖ）のためのプラスミドは、Ａ２６Ｆａｂ Ｈｅａｖｙ及びＡ２６Ｆａｂ Ｌｉｇｈｔ−（Ｓ、２×Ｇ４Ｓ）−６４５ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨ−４×Ｇ４Ｓ−ｖＬ）であった。加えてまた、トランスフェクションに使用されるプラスミドの比も変化させ、２つのプラスミドを組み合わせる場合の比を１：１とするのに対し、３つのプラスミドを組み合わせる場合には、いくつかの異なる比を調べた。合計５０μｇのプラスミドＤＮＡを、１２５μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋４．２５ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共に、ＲＴで２０分間インキュベートした。次いで、混合物を、懸濁液中に１ｍｌ当たりの細胞１×１０^６個のＨＥＫ２９３細胞５０ｍｌへと添加し、３７℃で振とうしながらインキュベートした。７日目に、１５００ｇで遠心分離することにより、上清を採取して、細胞を除去し、上清に、０．２２μｍのフィルターを流過させた。発現レベルは、プロテインＧ ＨＰＬＣにより決定した。

全ての構築物の発現レベルは同等であり（表４を参照されたい）、３〜１５μｇ／ｍｌの範囲にわたった。Ｆａｂ−ｄｓＦｖは、１３〜１４μｇ／ｍｌで発現し、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖは、７〜１５μｇ／ｍｌで発現し、単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖは、３〜１３μｇ／ｍｌで発現した。文献では、ｖＬとｖＨとを一体にする、ｖＬとｖＨとの間のリンカー、又は二量体化モチーフを欠くＦｖ領域の発現は、連結されたＦｖより、発現レベルが実質的に低いことが報告されている。これは、各種の構築物の最大の発現の間で著明な差違が観察されないこのデータでは、観察されていない。

ＨＥＫ２９３に発現させた、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖについてのＢＩＡｃｏｒｅ解析
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ構築物、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ構築物、及び単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖ構築物の相互作用についての結合親和性及び反応速度パラメータを、ＣＭ５センサーチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤であるＰ２０）ランニングバッファーを使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００上で実行される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。ヒトＦ（ａｂ’）_２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；１０９−００６−０９７）又は自家製の抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体を使用して、単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖ試料を、センサーチップ表面へと捕捉した。捕捉抗体の共有結合による固定化は、標準的なアミンカップリング化学反応により達成した。

各アッセイサイクルはまず、１分間にわたる注入を使用して、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ構築物、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ構築物、又は単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖ構築物を捕捉してから、３分間にわたる抗原の注入からなること会合相を施し、この後、５分間解離をモニタリングすることからなった。各サイクルの後、４０ｍＭ ＨＣｌの２×１分間にわたる注入に続いて、３０秒間にわたる５ｍＭのＮａＯＨにより捕捉表面を再生させた。使用される流量は、捕捉が１０μｌ／分であり、会合相及び解離相が３０μｌ／分であり、再生が１０μｌ／分であった。

反応速度アッセイのために、５０〜６．２５ｎＭのヒト血清アルブミン、又は２５ｎＭの単一濃度のＯＸ４０の滴定を実施した。ブランクのフローセルは、基準の控除に使用した。測定器のノイズ及びドリフトを控除するために、バッファーブランクの注入を組み入れた。

反応速度パラメータは、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用する、結果として得られるセンサーグラムの、標準的な１：１結合モデルへの同時的なグローバルフィッティングにより決定した。

全ての試料のオン速度、オフ速度、及び親和性は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びヒトＯＸ４０のいずれの抗原についても同様である（表５を参照されたい）。したがって、異なる構築物内の異なるリンカーの存在及び位置は、その抗原へのいずれの可変領域の親和性に対しても著明な影響を及ぼさない。

ＨＥＫ２９３に発現させた、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖの、プロテインＧによる精製
分子量カットオフを１０ｋＤａとする遠心分離濃縮器を使用して、約５０ｍｌのＨＥＫ２９３上清を、約２ｍｌへと、約２５倍に濃縮した。濃縮された上清を、２０ｍＭのホスファート、４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で平衡化された、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと適用した。カラムを、２０ｍＭのホスファート、４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄し、結合した材料を、０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で溶出させた。溶出ピークを回収し、２Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）により、ｐＨを約ｐＨ７へと調整した。分子量カットオフを１０ｋＤａとする遠心分離濃縮器を使用して、ｐＨを調整された溶出物を濃縮し、バッファーを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）へと交換した。

プロテインＧにより精製された、ＨＥＫ２９３に発現させた、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
要求される場合、試料を水で希釈し、次いで、試料を還元するために、２６μｌまで、４倍濃度のビス−トリスＬＤＳ試料バッファー１０μＬ及び１０倍濃度の還元剤４μＬを添加した。試料をボルテックス混合し、１００℃で３分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。調製された試料を、４〜２０％のアクリルアミントリス／グリシンＳＤＳゲルへとロードし、１２５Ｖの定常電圧で１１０分間泳動させた。ゲルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅタンパク質染色で染色した（図２を参照されたい）。

還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、泳動位置及び染色強度のいずれに関してもバンド形成パターンを有し、これらは、適正に発現させた全ての構築物に関して一定である。レーン２のＦａｂ−ｄｓＦｖについては、約３６及び約３７ｋＤａにおいて、ほぼ同等の染色を伴う２つのバンドが見られるはずである。レーン３のＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ（ＬＣ−ｓｃＦｖ）については、約５１及び約２３ｋＤａにおいて、上方のバンドのほぼ２倍の染色を伴う２つのバンドが見られるはずである。レーン４のＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ（ＨＣ−ｓｃＦｖ）については、約５０及び約２６ｋＤａにおいて、上方のバンドのほぼ２倍の染色を伴う２つのバンドが見られるはずである。レーン６〜９の単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖ（ＬＣ−ｖＬ）については、約３６、約２３、及び約１３ｋＤａにおいて、上方から下方のバンドへと、ほぼ３：２：１の比の染色を伴う３つのバンドが見られるはずである。レーン１０〜１２の単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖ（ＨＣ−ｖＨ）については、約３７、約２６、及び約１２ｋＤａにおいて、上方から下方のバンドへと、ほぼ３：２：１の比の染色を伴う３つのバンドが見られるはずである。

プロテインＧにより精製された、ＨＥＫ２９３に発現させた、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ、及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖについてのＧ３０００ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
５０μｇの試料を、７．８×３００ｍｍのＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー株式会社）へと注入し、１ｍｌ／分の２００ｍＭのホスファート（ｐＨ７．０）によるイソクラティック勾配で展開した。シグナルの検出は、２８０ｎｍにおける吸光度を介して行った（図３を参照されたい）。プロテインＧによる精製の後、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖが約４５％の単量体であり、Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓｓｃＦｖが５５〜６０％の範囲でやや多くの単量体を有するのに対し、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖは全て８０％を超える単量体であり、一部は１００％の単量体である。

（例２）
哺乳動物細胞内で発現させるための、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及びＡ２６Ｆａｂ−６４８ｄｓＦｖ三重遺伝子プラスミドの構築
まず、例１／図１で記載した単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖフォーマットの単一の遺伝子構成要素から、中間体の二重遺伝子ベクターを作り出すことにより、三重遺伝子プラスミドを構築した。重鎖の発現をコードする遺伝子断片であって、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター、重鎖、及びＳＶ４０のポリＡ領域を含む遺伝子断片を、哺乳動物発現ベクター内の軽鎖遺伝子の下流にサブクローニングした。それぞれ、重鎖は、Ａ２６ Ｆａｂ重鎖、又はリンカー（Ｓ、３×Ｇ_４Ｓ）を介して６４５ｄｓｖＨ若しくは６４８ｄｓｖＨへと連結されたＡ２６ Ｆａｂ ｈｅａｖｙであり、軽鎖は、リンカー（Ｓ、３×Ｇ_４Ｓ）を介して６４５ｄｓｖＬ若しくは６４８ｄｓｖＬへと連結されたＡ２６ Ｆａｂ ｌｉｇｈｔ、又はＡ２６ Ｆａｂ軽鎖である。これにより、各フォーマットのための中間体の二重遺伝子プラスミドが作り出された。三重遺伝子プラスミドを構築するため、続いて、フリー同族ｖ領域（６４５ｄｓｖＬ、６４８ｄｓｖＬ、６４５ｄｓｖＨ、又は６４８ｄｓｖＨ）の発現をコードする断片を、中間体のベクター内の重鎖遺伝子の下流における固有の制限部位においてサブクローニングした。最後に、後段で安定的な細胞系を作り出すために、哺乳動物選択マーカーを、発現プラスミドへとサブクローニングした。これにより、哺乳動物選択マーカーを伴うか又はこれを伴わない、単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖの発現に関連する遺伝子を、均等な遺伝子比で含有するプラスミドのセットがもたらされた。これらのプラスミドは、単一の遺伝子プラスミドから発現させた、単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖの単量体％と比較するための、一過性の哺乳動物発現系についての初期評価（図３）で使用される。

単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及びＡ２６Ｆａｂ−６４８ｄｓＦｖの、ＣＨＯ細胞内の三重遺伝子プラスミドからの一過性発現
ＣＨＯ細胞を、１×Ｌ−ｇｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＣＤ ＣＨＯ培地中、＞９９％の生存率で、指数増殖期まで成長させた。細胞は、Ｅａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で洗浄することにより調製し、社内の推奨に従い、プラスミドＤＮＡを、ＣＨＯ細胞へと電気穿孔した。トランスフェクトされた細胞を、１×Ｌ−ｇｌｕｔａＭＡＸ及び１×ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＣＤ ＣＨＯ培地へと移し、オービタルシェーカー内、３７℃、８％のＣＯ_２、及び１４０ｒｐｍでの振とうで２４時間インキュベートした。インキュベーション後、又は培養物が１ｍｌ^−１当たりの細胞少なくとも２×１０^６個の生存可能な細胞密度に達したら、温度を３２℃へと低下させた。続いて、トランスフェクションの７２時間後、３ｍＭの酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、培養物を、８％のＣＯ_２及び１４０ｒｐｍでの振とうを伴う３２℃で、さらに１１日間再インキュベートした。上清を遠心分離により採取し、０．４５μＭ及び０．２２μＭの滅菌フィルターを介して逐次的に濾過した。発現力価は、プロテインＧ ＨＰＬＣにより、Ｆａｂ断片基準物質に照らして定量化した。

三重遺伝子プラスミドからの発現レベルは、哺乳動物選択マーカーの存在に依存した（図５を参照されたい）。発現力価は、哺乳動物選択マーカーを伴わないプラスミドから発現させた、単一リンカーＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖタンパク質の中では大きかったが、哺乳動物選択マーカーを伴うプラスミドから発現させた場合には、予測される通り、追加の遺伝子の発現により要求される代謝負荷に起因して、同等ではあるがこれよりは低いレベルが得られた。加えて、６４５ｄｓｖＬ又は６４８ｄｓｖＬ鎖へと連結されたＡ２６ Ｆａｂ Ｌｉｇｈｔを含有するタンパク質についても大きな発現力価が観察された。

ＣＨＯ細胞内の三重遺伝子プラスミドから発現させた、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及びＡ２６Ｆａｂ−６４８ｄｓＦｖの、プロテインＧによる精製
分子量カットオフを１０ｋＤａとする遠心分離濃縮器を使用して、２００ｍｌの上清を約２０倍濃縮した。濃縮された上清を、２０ｍＭのホスファート、４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で平衡化された、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと適用した。カラムを、２０ｍＭのホスファート、４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄し、結合した材料を、０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で溶出させた。溶出ピークを回収し、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）により、ｐＨを約ｐＨ７へと調整した。分子量カットオフを１０ｋＤａとする遠心分離濃縮器を使用して、ｐＨを調整された溶出物を濃縮し、バッファーを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）へと交換した。タンパク質濃度は、Ａ_２８０において分光光度的に推定した。

プロテインＧにより精製された、ＣＨＯ細胞内の三重遺伝子プラスミドから発現させた、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及びＡ２６Ｆａｂ−６４８ｄｓＦｖについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
要求される場合、タンパク質試料をＰＢＳ中で希釈した。試料を還元するために、後段の試料８．２５μｌへと、４倍濃度のビス−トリスＬＤＳ試料バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３．７５μｌ、１００ｍＭのＮ−エチルマレイミド１．５μｌ、及び１０倍濃度の還元剤１．５μｌを添加した。試料をボルテックス混合し、１００℃で３分間インキュベートし、冷却し、１３２００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。調製された試料を、４〜２０％のアクリルアミドトリス／グリシンＳＤＳゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へとロードし、トリス−グリシンバッファー中、１２５Ｖの定常電圧で約１５０分間泳動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のタンパク質基準物質であるＳｅｅｂｌｕｅ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、基準マーカーとして使用した。ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水で脱色した（図６を参照されたい）。

還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、泳動位置及び染色強度のいずれに関してもバンド形成パターンを有し、これらは、適正に発現させた全ての構築物に関して一定である。全ての単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖについて、約３６〜３７（ｉ）、約２４〜２６（ｉｉ）、及び約１２〜１３ｋＤａ（ｉｉｉ）において３つのバンドが見られるはずであり、染色が、上方から下方のバンドへと、ほぼ３：２：１の比であるはずである。

プロテインＧにより精製された、ＣＨＯ細胞内の三重遺伝子プラスミドから発現させた、単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及びＡ２６Ｆａｂ−６４８ｄｓＦｖについてのＧ３０００ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
５０ｕｌの試料を、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、カラム（株式会社東ソー）へと注入し、１ｍｌ／分の２００ｍＭのホスファート（ｐＨ７．０）によるイソクラティック勾配で展開した。シグナルの検出は、２８０ｎｍにおける吸光度を介して行った（図７を参照されたい）。三重遺伝子プラスミドから発現させた全ての単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖは、哺乳動物選択マーカーの存在又は発現レベルにかかわらず、９０％を超える単量体を達成し、大半が、１００％の単量体である。このデータは、単一の遺伝子プラスミドから発現させた、単量体の単一リンカーＡ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖのデータと良好に符合する（図３）。これはまた、三重遺伝子プラスミドの構成内に存在するフォーマットをコードする、関連する遺伝子の均等な遺伝子比が、高度に単量体性の単一リンカーＦａｂ−ｄｓＦｖの発現に最適であることも指し示す。

Claims (17)

1. ３つのポリペプチド：
   ａ）式（Ｉ）：
   （Ｖｘｘ）_ｎＶｘ−Ｃｘ−Ｘ−Ｖ_１
   のポリペプチド鎖；及び
   ｂ）式（ＩＩ）：
   （Ｖｙｙ）_ｎＶｙ−Ｃｙ
   のポリペプチド鎖
   ｃ）式（ＩＩＩ）：
   Ｖ_２
   のポリペプチド
   ［式中、
   Ｖｘは、可変ドメインを表し、
   Ｖｘｘは、可変ドメインを表し、
   Ｃｘは、定常領域を表し、
   Ｘは、リンカーを表し、
   Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
   Ｖｙは、可変ドメインを表し、
   Ｖｙｙは、可変ドメインを表し、
   Ｃｙは、定常領域を表し、
   Ｖ_２は、可変ドメインを表し、
   ｎは、独立に、０又は１を表す］
   からなり、
   定常領域Ｃｘ及びＣｙが対合し、可変ドメインＶｘ及びＶｙが対合して、結合性ドメインを形成し、並びにジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在するように、式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が整列している、多重特異性抗体分子。
2. ３つのポリペプチド；
   ａ）式（Ｉａ）：
   ＶＨ−ＣＨ_１−Ｘ−Ｖ_１
   の重鎖；及び
   ｂ）式（ＩＩａ）：
   ＶＬ−Ｃ_Ｌ
   の軽鎖
   ｃ）式（ＩＩＩ）：
   Ｖ_２
   のポリペプチド
   ［式中、
   ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し、
   ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン１を表し、
   Ｘは、リンカーを表し、
   Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
   ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し、
   Ｃ_Ｌは、軽鎖由来の定常領域を表し、
   Ｖ_２は、可変ドメインを表す］
   からなり、
   ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在する、二重特異性抗体分子。
3. ３つのポリペプチド；
   ａ）式（Ｉｂ）：
   ＶＨ−ＣＨ_１
   の重鎖；及び
   ｂ）式（ＩＩｂ）：
   ＶＬ−Ｃ_Ｌ−Ｘ−Ｖ_２
   の軽鎖
   ｃ）式（ＩＩＩ）：
   Ｖ_１
   のポリペプチド
   ［式中、
   ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し、
   ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン１を表し、
   Ｘは、リンカーを表し、
   Ｖ_１は、可変ドメインを表し、
   ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し、
   Ｃ_Ｌは、軽鎖由来の定常領域を表し、
   Ｖ_２は、可変領域を表す］
   からなり、ジスルフィド結合が、Ｖ_１とＶ_２との間に存在する、二重特異性抗体分子。
4. Ｖ１が、重鎖可変ドメインを表し、Ｖ２が、軽鎖可変ドメインを表す、請求項１から３までのいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子。
5. 可変ドメイン対Ｖ_１／Ｖ_２が、１つはＶ_１内にあり、１つはＶ_２内にある、２つの操作されたシステイン残基の間のジスルフィド結合により連結されており、操作されたシステイン残基の対の位置が、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３、並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子。
6. 可変ドメイン対Ｖ_１／Ｖ_２が、血清キャリアタンパク質に対する特異性を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子。
7. Ｖ_１が、配列番号８７で与えられるＣＤＲＨ−１の配列、配列番号８８で与えられるＣＤＲＨ２の配列、及び配列番号８９で与えられるＣＤＲＨ−３の配列を含み、Ｖ_２が、配列番号９０で与えられるＣＤＲＬ−１の配列、配列番号９１で与えられるＣＤＲＬ２の配列、及び配列番号９２で与えられるＣＤＲＬ−３の配列を含む、請求項６に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子。
8. Ｖ_１が、配列番号９３で与えられるＣＤＲＨ−１の配列、配列番号９４で与えられるＣＤＲＨ２の配列、及び配列番号９５で与えられるＣＤＲＨ−３の配列を含み、Ｖ_２が、配列番号９６で与えられるＣＤＲＬ−１の配列、配列番号９７で与えられるＣＤＲＬ２の配列、及び配列番号９８で与えられるＣＤＲＬ−３の配列を含む、請求項６に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子。
9. Ｘが、配列番号７８で与えられる配列を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子。
10. Ｘが、配列番号１０３で与えられる配列を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子。
11. 請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子をコードするポリヌクレオチド。
12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
13. それぞれ請求項１２又は１１に記載のベクター又はポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
14. 各ベクターが請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子の異なるポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む３つのベクターを含む宿主細胞。
15. 多重特異性又は二重特異性抗体分子を、請求項１３又は請求項１４に記載の宿主細胞から発現させるステップを含むプロセス。
16. 請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多重特異性又は二重特異性抗体分子と、少なくとも１つの賦形剤とを含む医薬組成物。
17. 処置における使用のための、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多重特異性若しくは二重特異性抗体分子、又は請求項１６に記載の医薬組成物。