JP6412676B2 - ナノ粒子及びナノ粒子製剤 - Google Patents

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本出願は、２０１３年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／７７６９６４号に対して優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書中に援用されるものである。

本発明は、少なくとも１つの界面活性剤及びイソシアネートを含有する化合物の重合によって調製される粒子を対象とする。この粒子を用いて調製される医薬組成物も同じく記載されている。

ナノ粒子及びマクロ粒子（ナノカプセルを含む）は、薬物送達の担体として研究されてきた。しかしながら、生体利用性を向上させるために、治療薬を早期の分解から効果的に保護することができる新規の粒子の開発が、いまだ必要とされている。

ベンダムスチン、４−｛５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチル−２−ベンゾイミダゾリル｝ブタン酸は、以下の化学式を有する：

ベンダムスチン塩酸塩は、１９６３年にドイツ民主共和国（ＧＤＲ：Ｇｅｒｍａｎ Ｄｅｍｏｃｒａｔｉｃ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）において最初に合成され、当地において１９７１年から１９９２年にかけてＣｙｔｏｓｔａｓａｎ（登録商標）の商標名で市販されていた。ベンダムスチン塩酸塩一水和物の合成について記載されている、Ｗ．Ｏｚｅｇｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄ．Ｋｒｅｂｓ，ＩＭＥＴ ３３９３ γ−［１−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｂｉｓ−（ −ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｏ−（２）］−ｂｕｔｙｒｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄｓ．Ｚｂｌ．Ｐｈａｒｍ．１１０,（１９７１） Ｈｅｆｔ １０，１０１３−１０１９を参照のこと。それ以降は、ドイツにおいてこの化合物はＲｉｂｏｍｕｓｔｉｎ（登録商標）の商標名で市販されてきた。ベンダムスチンは、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及び乳癌などの疾患の治療において治療的有用性を有することが示されているアルキル化剤である。ベンダムスチン塩酸塩は、アメリカ合衆国においてＴｒｅａｎｄａ（登録商標）の商標名で市販されている。

ベンダムスチンが有効であることが示されている一方、この化合物は特に水溶液中で不安定であり、その調製及び投与における技術的困難につながることが知られている。結果として、ベンダムスチン塩酸塩は、注入の直前に解凍して用いる凍結乾燥製剤としてのみ市販されていた。さらに、この水中環境の不安定性からこの薬剤は比較的短い半減期を有しており、それがこの現在の製剤の特定の種類の固形腫瘍の治療への適合性を制限している。この現在利用可能な製剤に関連する制限によって、ベンダムスチンの治療的利用の拡大は限定されてきた。ベンダムスチンの新規の製剤が必要とされている。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許出願公開第２０１０／３２３０２０号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１０／０６３４９３号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＢＯＷＥＮ Ｐ："Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ ｔｏ Ｎａｎｏｍｅｔｅｒｓ ａｎｄ ｆｒｏｍ Ｒｏｄｓ ｔｏ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ"．ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＩＳＰＥＲＳＩＯＮ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ．ＴＡＹＬＯＲ ＡＮＤ ＦＲＡＮＣＩＳ ＧＲＯＵＰ．ＮＥＷ ＹＯＲＫ．ＮＹ．ＵＳ．ｖｏｌ．２３．ｎｏ．５．１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００２（２００２−０１−０１）．ｐａｇｅｓ ６３１−６６２．

図１は、本発明のベンダムスチン遊離塩基含有粒子の一実施形態の電子顕微鏡写真を示している。 図２は、本発明のベンダムスチン遊離塩基含有粒子の一実施形態の電子顕微鏡写真を示している。

本発明は、粒子を調製する方法を対象とするものである。本発明の好ましい方法においては、前記粒子はベンダムスチン遊離塩基含有粒子であり、好ましくは、ベンダムスチン遊離塩基含有ナノ粒子である。

本発明の範囲内において、「粒子」はナノ粒子又はマクロ粒子であってもよい。「ナノ粒子」は本技術分野において、約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの間の平均直径を有すると理解される。好ましくは、前記粒子は、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍ、又は約２０ｎｍ〜約６００ｎｍの間に、平均直径を有する。本発明によって形成された「マクロ粒子」は、本技術分野において、０．２μｍ超であって１００μｍまで又は１０００μｍまでの平均直径を有すると理解される。本発明のいずれの材料についての粒子サイズの決定も、本技術分野において周知の任意の方法によって達成されたものであってもよい。粒子サイズの決定についての適切な方法には、動的光散乱法（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）又は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が含まれる。

また、本発明の範囲内において、「ナノ粒子」である粒子は、ナノカプセルであってもよい。「ナノカプセル」は一般的に、連続的なポリマーシェルと治療薬をカプセル化するのに適した内部空間とを有した球形となっている。ナノカプセルは本技術分野において、約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの間の平均直径を有すると理解される。好ましくは、前記ナノカプセルは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍ、又は約２０ｎｍ〜約６００ｎｍの間に、平均直径を有する。

本発明中において用いられる「治療薬」は、治療又は診断の目的のために有用な任意の化合物を指す。本発明の範囲において用いられる治療薬には、例えば、ペプチド、酵素、タンパク質、抗体、抗体断片、アプタマー、ポリヌクレオチド、医療用化合物（医療用化合物の医薬的に許容可能な塩を含む）などの任意の水溶性物質が含まれる。特に好ましい治療薬は、ベンダムスチンである。

本発明の例示的な一実施形態は、ポリマーシェルとベンダムスチン遊離塩基を含有する核とを有するナノカプセルを含む。好ましくは、これらのナノカプセルは、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの間の平均直径を有する。あるいは、これらのナノカプセルは、約６０ｎｍ〜約６００ｎｍの間の平均直径を有する。

本発明の粒子は、エマルジョンを形成する工程によって調製される。「エマルジョン」は本技術分野において、通常混ざらない液体の混合物であると理解される。手動又は機械的な混合工程により、これらの通常混ざらない液体は、分散媒（又は「連続相」）中に分散相を形成する。水中油型エマルジョンの場合、当該「油」は一般的に「液滴」の分散相であり、当該水（又は水溶液）は分散媒である。油中水型エマルジョンの場合、水含有の水性相は、分散媒として用いられる当該「油」又はその他の水と混ざらない溶媒の連続相中において、「液滴」の分散相となる。前記エマルジョン中の前記液滴のサイズは、本技術分野において周知の要因、例えば、混合の種類、混合速度、混合時間、油の性質、油と水の比率などに依存して、より大きく又はより小さく設計することが可能である。

本発明の範囲内においてエマルジョンは、ナノエマルジョン又はマイクロエマルジョンのいずれかであってもよい。ナノエマルジョンは、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲を取る分散相の平均液滴直径を有する。その他の好ましいナノエマルジョンは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍ、又は約２０ｎｍ〜約６００ｎｍの間に、平均液滴直径を有する。マイクロエマルジョンは、約１μｍ超であって約１００μｍまででの平均液滴直径を有する。液滴のサイズの決定についての適切な方法には、動的光散乱法（ＤＬＳ）又は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）が含まれる。

本発明のエマルジョンは、有機溶媒を有する連続相と、水溶液の分散相と、少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤とを混合することによって形成される。前記水性相は好ましくは、水及び水溶性の治療薬、例えば、ペプチド又はタンパク質、或いはポリヌクレオチドなどを含む。前記治療薬は低分子の医薬化合物であってもよい。治療薬の医薬的に許容可能な塩が、本発明の範囲において使用されてもよい。

本発明の好ましい実施形態においては、前記エマルジョンは有機溶媒を有する連続相と、例えばベンダムスチン塩酸塩などの医薬的に許容可能なベンダムスチン塩の水溶液を有する分散相と、少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤とを混合することによって形成される。

本発明において使用される「有機溶媒」は、水との混和性に乏しい有機溶媒であって、言い換えれば、水への溶解度が９ｇ／１００ｍＬより低いものである。本発明において使用される好ましい有機溶媒は、Ｃ_５−１０アルカン（ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなど、及びこれらの混合物）、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテルなどであり、特に好ましくはＣ_５−１０アルカンである。ヘキサンが本発明において用いられる典型的な有機溶媒である。

本発明の範囲内において、多価アルコール界面活性剤は前記エマルジョンの安定化を補助するために含まれている。本発明で使用される「多価アルコール界面活性剤」は、複数の−ＯＨ部分を含み、少なくともその幾つかはイソシアネート部分と反応して−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基を形成することが可能である。本技術分野において多価アルコール界面活性剤は周知であり、例えばポリソルベートベースの界面活性剤であるモノラウリン酸ソルビタンのポリオキシエチレン誘導体などのソルビタンエステルが含まれる。そうした多価アルコール界面活性剤の例には、Ｔｗｅｅｎ２０（商標）及びＴｗｅｅｎ８０（商標）が含まれる。ソルビタンエステルのその他の例には、Ｓｐａｎ２０（商標）などのポリエトキシ化ソルビタン及びオレイン酸由来の界面活性剤が含まれる。

治療薬の医薬的に許容可能な塩を有する本発明の実施形態においては、前記エマルジョンは、前記治療薬の医薬的に許容可能な塩の形態を前記治療薬の遊離酸又は遊離塩基の形態に変換するために充分な量の塩基又は充分な量の酸によって処理される。適切な塩基には、アンモニア又はアルキルアミンなどのアミンが含まれる。好ましいアルキルアミンには、ジエチルアミン及びＮ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミンが含まれる。好ましい酸には、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、及びリン酸などが含まれる。

本発明の好ましい実施形態においては、前記エマルジョンは、有機溶媒を有する連続相と、医薬的に許容可能なベンダムスチン塩の水溶液を有する分散相と、少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤とを混合することによって形成される。前記エマルジョンは次いで、前記医薬的に許容可能なベンダムスチン塩をベンダムスチン遊離塩基に変換するために充分な量の塩基によって処理される。前記塩基は、好ましくはアンモニア又はアルキルアミンなどのアミン塩基であり、特に好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミンである。ベンダムスチンの塩の形態を、水溶性がずっと低いベンダムスチン遊離塩基に変換することによって、当該遊離塩基の大部分が、前記分散した「液滴」に保持されたまま前記水溶液から析出し、よってベンダムスチンが前記水溶液と接触することによって分解される程度を最小化すると考えられる。

本発明によると、本発明の前記エマルジョンは、少なくとも２つのイソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）部分を有する化合物によって処理される。複数のイソシアネート部分、例えば２０超のイソシアネート部分を含む化合物が本発明の範囲内であるが、本発明の使用に好ましい化合物は、２つから１０の間のイソシアネート部分を有する。本発明の例示的な実施形態は、２つ又は４つのイソシアネート部分を有する化合物を含み、ジイソシアネート化合物（すなわち、２つのイソシアネート部分を有する化合物）が特に好ましい。少なくとも２つのイソシアネート部分を含む化合物は、周知のものでありかつ／又は商業的に利用可能である。本発明の最も好ましい実施形態においては、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、アルキルジイソシアネートであり、例えば１，６−ヘキシルジイソシアネートである。

前記エマルジョンを前記イソシアネート含有化合物によって処理することによって、前記イソシアネート基と前期少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤との重合を起こす。前記重合は、前記少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤の前記−ＯＨ部分の少なくとも幾つかと、前記イソシアネート含有化合物の前記イソシアネート基の少なくとも幾つかとの反応を介して発生し、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−の結合を形成する。本発明の範囲において、多価アルコール界面活性剤は、前記イソシアネート含有との重合に利用できる前記エマルジョン中におけるモノマーにすぎない。したがって、結果得られる本発明のポリマーは、前記イソシアネート含有化合物と、少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤とのみから形成されるものである。これらの結果得られるポリマーは、本発明の粒子を形成し、この粒子は治療薬を含んでいても含んでいなくてもよい。好ましくは、これらの結果得られるポリマーは、本発明のナノカプセルのポリマーシェルを形成するものである。

前記イソシアネート含有化合物と、前記少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤との前記重合は、水−多価アルコール界面において発生し、本発明の粒子を形成する。前記重合は、架橋、すなわち１つのポリマー鎖が別の鎖に結合することを含んでよいい。重合の程度は、本技術分野の当業者に理解されるように、カロザースの式を用いて計算することが可能である。例えば、Ｃｏｗｉｅ Ｊ．Ｍ．Ｇ．"Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ & Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｉｅ １９９１），ｐ．２９；Ｒｕｄｉｎ Ａｌｆｒｅｄ"Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８２，ｐ．１７１；Ａｌｌｃｏｃｋ Ｈａｒｒｙ Ｒ．，Ｌａｍｐｅ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｗ． ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｊａｍｅｓ Ｅ．"Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"（３ｒｄ ｅｄ．，Ｐｅａｒｓｏｎ ２００３）ｐ．３２４；Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ，Ｗａｌｌａｃｅ（１９３６）"Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ"．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ ３２：３９−４９を参照のこと。

多価アルコール界面活性剤と充分に重合させて本発明の粒子を形成するために必要なイソシアネート含有化合物の量は、使用される多価アルコール界面活性剤の量と、当該使用される多価アルコール界面活性剤の化学的組成とに依存して異なるであろう。しかしながら、本技術分野の当業者は日常的な実験を使用して、多価アルコール界面活性剤と充分に重合させて本発明の粒子を形成するために必要なイソシアネート含有化合物の量を容易に決定することが出来るであろう。

前記イソシアネート含有化合物を前記多価アルコール界面活性剤と充分に重合させて本発明の粒子を形成するために必要な時間の量は、当該イソシアネート含有化合物及び当該多価アルコール界面活性剤の各化学的組成に依存して異なるであろう。しかしながら、本技術分野の当業者は日常的な実験を使用して、本発明の粒子を形成するために必要な時間の量を容易に決定することが出来るであろう。

本発明の幾つかの実施形態において、前記エマルジョンは、少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物が少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤と水性相−多価アルコール界面において重合し、本発明の粒子を形成するのに充分な時間、少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物によって処理される。

本発明の好ましい実施形態において、前記エマルジョンは、前記イソシアネート含有化合物が少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤と水−多価アルコール界面において重合し、本発明のベンダムスチン遊離塩基含有粒子を形成するのに充分な時間、少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物によって処理される。特に好ましい実施形態においては、この処理は本発明のベンダムスチン遊離塩基含有ナノカプセルを生成する。

本発明の幾つかの実施形態において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、少なくとも１つのｐＨ感受性部分をさらに有する。前記ｐＨ感受性部分は、本発明の粒子がより高い又は低いｐＨのどちらかに曝されたとき、切断、加水分解、又はそれ以外の点で本発明の粒子の化学的又は物理的性質を変化させるであろうと考えられる。ｐＨ感受性部分の一例は、テトラヒドロピラン部分であり、これは酸性のｐＨにおいて加水分解する。その他のｐＨ感受性部分には、エステル、ヒドラゾン、カルボキシジメチル無水マレイン酸、オルトエステル、イミン、β−チオプロピオネート、ビニルエステル、及びホスホルアミデートが含まれる。例えば、Ｇａｏ，Ｗ． ｅｔ ａｌ．，ｐＨ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ． ７，ｎｏ． ６，１９１３−１９２０（２０１０）を参照のこと。ｐＨ感受性部分を本発明の化合物に組み込む一方法を、以下の図式において記載している：

本発明の幾つかの実施形態において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物はまた、少なくとも１つの水溶性部分を有していてもよい。本発明の範囲において、「水溶性部分」には親水性基が含まれる。親水性基は本技術分野の当業者に周知であり、水酸基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、リン酸基、エーテル基、エステル基、ホスホジエステル基、グリコシル基、及びペプチド基が含まれる。例示的な水溶性部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）部分、官能基化ＰＥＧ部分、及びこれらの混合物を有する化合物が含まれる。本発明のこうした実施形態において、結果得られる粒子は水溶性部分を含むであろう。

本発明の幾つかの実施形態において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物はまた、少なくとも１つのマレイミド部分を有していてもよい。マレイミド部分は、優れたマイケル受容体となる活性化アルケンである。マレイミド部分は、様々な求核分子（マイケル供与体）と反応することが可能であり、求核分子と当該マレイミド部分を結合する。適切な求核分子は、本明細書に記載されているようなｐＨ感受性部分を有していてもよい。

マレイミド部分に対するマイケル付加反応のための適切な求核分子はまた、本明細書に記載されているような少なくとも１つの水溶性部分を有していてもよい。少なくとも１つの水溶性部分を有し、本発明の前記マレイミド部分と反応するのに適切な求核分子の例には、チオール−ＰＥＧ（ＳＨ−ＰＥＧ含有化合物）及びアミノ−ＰＥＧ（ＮＨ_２含有化合物）が含まれる。

本発明の特定のナノカプセルの実施形態においては、当該ナノカプセルの前記ポリマーシェルは、少なくとも１つのｐＨ感受性部分を選択的に有していてもよい。前記ｐＨ感受性部分は、より高い又は低いｐＨのどちらかに曝されたとき、切断又は加水分解するであろうと考えられる。この切断又は加水分解により、前記ナノカプセルのポリマーシェルの「開放」が生じ、当該ナノカプセル中に封入さた任意の治療薬が周辺環境へと放出されることを可能にする。ｐＨ感受性部分の一例は、テトラヒドロピラン部分であり、これは酸性のｐＨにおいて加水分解する。その他のｐＨ感受性部分には、エステル、ヒドラゾン、カルボキシジメチル無水マレイン酸、オルトエステル、イミン、β−チオプロピオネート、ビニルエステル、及びホスホルアミデートが含まれる。例えば、Ｇａｏ，Ｗ． ｅｔ ａｌ．，ｐＨ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ． ７，ｎｏ． ６，１９１３−１９２０（２０１０）を参照のこと。

本発明の特定の実施形態においては、前記ポリマーシェルは、少なくとも１つのマレイミド部分を選択的に有していてもよい。本発明の一実施形態においては、前記少なくとも１つのマレイミド部分を有する粒子は、少なくとも１つの水溶性化合物を有する求核分子と反応し、当該マレイミド部分をリンカーとして利用することで、当該水溶性化合物を当該粒子に結合させてもよい。少なくとも１つの水溶性部分を有し、本発明の前記マレイミド部分と反応するのに適切な求核分子の例には、チオール−ＰＥＧ（ＳＨ−ＰＥＧ含有化合物）及びアミノ−ＰＥＧ（ＮＨ_２含有化合物）が含まれる。したがって、本発明の幾つかの実施形態には、前記ポリマーシェルが少なくとも１つのＰＥＧ部分を有する粒子が含まれる。

本発明の幾つかの実施形態において、前記粒子のポリマーシェルは少なくとも１つの標的リガンドを選択的に有する。本明細書で使用される場合、「標的リガンド」には、生体内において組織及び／又は受容体に向かう標的活性を有するか又は促進可能である、任意の化合物、部分、又は残基が含まれる。標的リガンドが関連する可能性のある標的には、例えば、心筋組織（心筋の細胞及び心筋細胞を含む）、膜組織（内皮及び上皮を含む）、薄膜、結合組織（間質を含む）、又は腫瘍などの組織；血塊；並びに例えば、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体断片、免疫グロブリンなどの細胞表面受容体、及びステロイドホルモンの細胞質受容体が含まれる。適切な標的リガンドの例には、例えば、抗体、抗体断片、受容体分子、受容体結合分子、糖タンパク質及びレクチンを含むタンパク質；オリゴペプチド及びポリペプチドを含むペプチド；ペプチド模倣体；単糖類及び多糖類を含む糖類；ビタミン；ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、共同因子、置換低分子を含む生理活性物質、並びにヌクレオシド、ヌクレオシド及びペプチド核酸などのこれらの模倣物を含む遺伝子材料が含まれる。

本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって形成された前記粒子は、単離されてもよい。前記粒子は、本技術分野の当業者に周知のいかなる方法によっても単離されてもよい。好ましくは、前記粒子の単離には、前記有機溶媒を蒸発させる工程と、当該粒子を水溶液中に分散させ、当該粒子の水性分散体を形成する工程とが、選択的に含まれる。前記粒子の水性分散体を噴霧乾燥することで、前記粒子を単離してもよい。或いは、前記粒子の水性分散体を、本技術分野の当業者に周知の方法を用いることで凍結乾燥してもよい。

また、本発明の粒子及び医薬的に許容可能な希釈剤又は賦形剤を有する医薬組成物も本発明の範囲内である。「医薬的に許容可能な担体又は希釈剤」には、ありとあらゆる溶媒、増量剤、安定化剤、分散媒、被覆材、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに生理的に互換性を持つ同種のものが含まれる。医薬的に許容可能な担体及び希釈剤の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せから、１つ又は複数が含まれる。多くの場合、例えば、等張剤、トレハロース及びスクロースなどの糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、又は前記組成物中の塩化ナトリウムから１つまたは複数含まれることが望ましいであろう。医薬的に許容可能な湿潤剤などの物質、或いは少ない量の湿潤剤又は乳化剤、保存剤、或いは緩衝材などの補助物質が、同様に本発明の範囲に含まれる。

本発明の医薬組成物には、本発明のナノカプセル、好ましくはベンダムスチン含有ナノカプセル、及び医薬的に許容可能な希釈剤又は賦形剤が含まれる。医薬的に許容可能な希釈剤の一例は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。

本発明の粒子を、単独か又は医薬組成物の一部として用いるかのいずれかによって、患者の癌を治療してもよい。これらの方法は、本発明の粒子を単独か又は医薬組成物の一部として、治療を要する患者に投与する工程を有する。本発明の方法を用いて治療されうる好適な癌には、例えば、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、低悪性度非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫）、中悪性度非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、乳癌、又は肺癌などの、固形又は非固形腫瘍が含まれる。例えば、肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、精巣癌、黒色腫、神経膠芽腫、大腸癌、頭部及び頸部癌、卵巣癌、及び前立腺癌などの、その他の固形又は非固形腫瘍もまた、本発明の化合物及び組成物によって治療可能であると考えられる。さらに、例えば乳癌などの固形又は非固形腫瘍もまた、本発明の化合物によって治療可能であると考えられる。

本発明の一実施形態において、本発明の化合物及び組成物を用いることによって、１つ又は複数の、例えばアルキル化剤などの化学療法薬に耐性を示す患者が治療される。患者が耐性を示す可能性のあるアルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン、アルキルスルホネート、トリアゼン、ピペラジン、及びニトロソウレアが含まれる。患者が耐性を示すようになる可能性のある、前記様々な種類の化学療法薬のより具体的な例を、以下に記載する。これらの薬剤の１つ又は複数に対して耐性を示す患者は、本発明の化合物及び組成物を用いた治療によって、恩恵を受けるであろう。

ナイトロジェンマスタード
Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）の商標名で市販されるメクロレタミンは、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫の治療、並びに乳癌及び肺癌の後期治療のために注射によって投与されるほか、菌状息肉症（皮膚Ｔ細胞リンパ腫）の皮膚病変のための外用処置として投与される。

Ｉｆｅｘ（登録商標）の商標名で市販されているイフォスファミドは、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の両方、並びに再発精巣癌、頭部及び頸部癌、及び子宮頸癌の治療のために用いられる。

メルファランは、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）の商標名で市販されている化学療法薬であり、Ｌ−ＰＡＭ又はフェニルアラニンマスタードとも呼ばれる。これは、多発性骨髄腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、及び乳癌を治療するために用いられる。

Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）の商標名で市販されているクロラムブシルは、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫を含む悪性リンパ腫、巨大濾胞性リンパ腫、及びホジキン病を治療するために最も広く用いられる。これは、非ホジキンリンパ腫、乳癌、卵巣癌、精巣癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、血小板血症、及び絨毛癌を治療するために成功裏に用いられてきた。

シクロホスファミドは、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標）として市販されており、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫；乳癌、精巣癌、子宮内膜癌、卵巣癌、及び肺癌を治療するために用いられる。

ニトロソウレア
ストレプトゾシンは、Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）の商標名で市販されており、島細胞膵臓癌を治療するために用いられる。

カルムスチンはＢｉＣＮＵ又はＢＣＮＵとしても知られており、ある種の脳腫瘍、神経膠芽腫、脳幹神経膠腫、髄芽腫、星状細胞腫、上衣腫、及び転移性脳腫瘍のために用いられる。これはまた、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、肺癌、及び大腸癌の治療においても用いられる。

ロムスチンはＣＣＮＵ又はＣｅｅＮＵとしても知られており、原発性及び転移性の脳腫瘍、ホジキン病、及び非ホジキンリンパ腫の治療のために用いられるほか、黒色腫、肺癌、及び大腸癌のためにも用いられる。

アルキルスルホネート
ブスルファンは、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）及びＭｙｌｅｒａｎ（登録商標）の商標名で市販されており、慢性骨髄性白血病の治療のために用いられる。トリアジン
ダカルバジンは、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）の商標名で市販されており、転移性悪性黒色腫、ホジキン病、軟部肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、膵島細胞癌、及び甲状腺髄様癌の治療のために用いられる。

テモロゾミドは、Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）の商標名で市販されており、特定の種類の脳腫瘍、未分化星状細胞腫、及び多形神経膠芽腫の治療のために用いられる。

エチレンイミン
チオテパは、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）の商標名で知られており、乳癌、卵巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫の治療のために用いられるアルキル化剤である。

本明細書で使用される場合、「アルキル」の用語は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、３−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、ヘキシル基、オクチル基などの、１〜８の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基を指す。アルコキシル基、アルコキシカルボニル基、及びアルキルアミノカルボニル基などのアルキル含有基のアルキル部分も、上述において定義されたアルキルと同じ意味を持つ。低級アルキル基は好ましく、１〜４の炭素原子を含む上述において定義されたとおりのアルキル基である。「Ｃ_１−Ｃ_４アルキル」などの名称は、１〜４の炭素原子を含むアルキルラジカルを指す。

本明細書で使用される場合、「医薬的に許容可能な塩」は、開示されている化合物の誘導体であって、親化合物が変更されてその酸又は塩基の塩となった誘導体を指す。医薬的に許容可能な塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩又は有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩；及びその他同種のものが含まれるが、これらに限定されない。したがって、「酸付加塩」の用語は、酸を加えることによって調製された親化合物についての、対応する塩の誘導体を指す。。前記医薬的に許容可能な塩には、例えば無機酸又は有機酸から形成された、親化合物の通常の塩又は第４級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そうした通常の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来の塩；並びに、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタン硫酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の酸性又は塩基性化合物は、双性イオンとして存在してもよい。遊離酸、遊離塩基、及び双性イオンを含む化合物の全ての形態が、本発明の範囲内にあると考えられる。幾つかの実施形態において、前記医薬組成物を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａｌｆｏｎｏｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８５）に記載されているような医薬的に許容可能な手順にしたがって調製してもよい。

本明細書で使用される場合、「固形腫瘍」は、組織の腫瘤に局在する悪性腫瘍を指す。固形腫瘍の例には、リンパ腫、肉腫、細胞腫が含まれ、乳癌、脳癌、骨癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「非固形腫瘍」は、最も一般的には、血液学的癌、つまり血液の悪性癌を指す。非固形腫瘍の例には、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、低悪性度非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫）、多発性骨髄腫などが含まれる。

本発明の粒子を調製するための一般的手順
前記ナノカプセルを、水相（Ｗ）中にベンダムスチン塩酸塩を溶解させ、それを多価アルコール界面活性剤システムを含む油相（Ｏ）によって乳化する、Ｗ／Ｏナノエマルジョンの処理を用いて形成した。得られたＷ／Ｏエマルジョンを、次いで塩基（ＮＨ_３又はアルキルアミン）によって処理し、前記ベンダムスチン塩酸塩を遊離塩基として析出させ、水環境中における化合物の加水分解への安定性を上昇させた。この析出処理は得られる水液滴の粒子サイズを不安定化させないことが明らかにされた。このシステムを次いで、前記多価アルコール界面活性剤（Ｓｐａｎ及びＴｗｅｅｎ）と反応するジイソシアネート化合物によって処理し、当該多価アルコール界面活性剤をジイソシアネート基の架橋剤として反応させた。その結果、主に水−油界面において、前記イソシアネート部分が界面活性剤の頭部基と接触したときに縮合重合が起きた。ベンダムスチン遊離塩基のカプセル化は、わずか２５μＬの１，６−ヘキシルジイソシアネートによって完了することが明らかになった。

次いで前記溶媒（ヘキサン）を加熱、回転蒸発、又は噴霧乾燥によって除去し、本発明のポリマーシェル粒子をナノカプセルとして得た。適切な界面活性剤システム（ＨＳＡ、ＰＶＡなど）を用いて、前記ナノカプセルを水中に分散させることによって水性システムへと変換した。前記ナノカプセルのシェルは、カルバメート及び尿素の混合物を有し、純粋な有機溶媒への溶解を防いだ。前記凍結乾燥したナノ粒子を解凍し、クライオ透過型電子顕微鏡（ｃ−ＴＥＭ：ｃｒｙｏ−Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて分析した。前記ナノ粒子の大多数は、２０〜４０ｎｍの固体球であり、容易に水中に分散していた。粒子の少数は１２５ｎｍの範囲にあった。前記粒子は全て滑らかな表面を有していた。

ベンダムスチンナノカプセル：１０ｍＬのＳｐａｎ２０及び１０ｍＬのＴｗｅｅｎ８０を１１３ｍＬのヘキサン中で混合することによって油相を調製した。次いで前記油相を２５ｍｇ／ｍＬのベンダムスチン塩酸塩を有する２０ｍＬの水相に加えた。この混合物を、ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘハンドヘルドホモジナイザーを用いて処理し、粒子サイズ５９．７ｎｍのナノエマルジョンを得た。前記ナノエマルジョンを次いで、５００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミンと共にマグネチックスターラーバーを用いて撹拌することによって、前記ベンダムスチン塩酸塩をベンダムスチン遊離塩基に変換し、当該遊離塩基は水区画中にナノカプセルとして析出した。５００μＬの１，６−ヘキシルジイソシアネートを、〜５分後に加え、その混合物を６０分間撹拌することによって、前記ポリマーを形成させた。ナノカプセルの前記ヘキサン懸濁液を、３００ｍＬの水（ＳＷＦＩ）と混合し、超音波プローブホモジナイザーを用いて乳化した。得られた水性懸濁液から、前記ヘキサン及び前記水の一部を回転蒸発器を用いて除去し、１５０ｍＬの容量を得た。次いでこの１５０ｍＬに、１２ｇのＰＶＰ Ｃ−１７と３０ｇのマンニトールとを増量剤として混合し、総容量を２００ｍＬに調整した。この懸濁液を次いで１０ｍＬずつのアリコートに分割して３０ｍＬの生理食塩水バイアルに入れ凍結乾燥した。

架橋実験。３つのベンダムスチンのナノエマルジョンを０．５％ＰＶＡ（２ｍＬ）中に２５ｍｇ／ｍＬになるよう調製した。次いでナノエマルジョンを５μＬ、１５μＬ、又は２５μＬのヘキシルジイソシアネートによって処理した。これらの混合物を、添加直前、添加直後、添加１２時間後において、ＨＰＬＣを用いて分析した。ヘキシルジイソシアネートの添加前に取られたサンプルは、ＨＰＬＣにより期待通りのベンダムスチン濃度を示した。添加１２時間後に取られたサンプルによって、１５〜２５μＬのモノマー（ヘキシルジイソシアネート）が、本発明のナノカプセル中にベンダムスチンをカプセル化するのに必要となることが示された。

電子顕微鏡グリッドの準備
５ｍｇのサンプルに２．０ｍＬのｄｄＨ２Ｏを加え、１分間ボルテックスすることによってサンプルを可溶化した。このサンプルを４００メッシュ銅グリッド上のカーボン被覆穴開きカーボン膜により支持されたガラス状の氷中に保存した。このサンプルは、原液のサンプル溶液３μＬ滴を清潔なグリッドに滴下し、フィルター紙によって拭い取り、即座に液体のエタン中にガラス化処理することによって調製された。撮像のために電子顕微鏡に移動させるまで、グリッドを液体窒素中に保管した。

電子顕微鏡撮像
ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２電子顕微鏡を使用し、ＦＥＩ Ｅａｇｌｅ ４Ｋｘ４Ｋ ＣＣＤカメラを装備して１２０ＫｅＶの動作下において、電子顕微鏡観察を実施した。グリッドの温度を−１７０℃未満に保つクライオステージを用いて、前記グリッドを前記電子顕微鏡中に移動させた。前記グリッドの画像を複数の縮尺において撮影し、標本の全体的な分布を見積もった。低倍率において撮像に適切と思われる目的領域を特定した後、高倍率の画像を、１１０，０００ｘ（０．１０ｎｍ／ｐｉｘｅｌ）、６７，０００ｘ（０．１６ｎｍ／ｐｉｘｅｌ）、５２，０００ｘ（０．２１ｎｍ／ｐｉｘｅｌ）、及び２１，０００ｘ（０．５０ｎｍ／ｐｉｘｅｌ）の公称倍率において撮影した。前記画像は、−２．５〜−１．５μＭ（１１０，０００ｘ）、−３μＭ（６７，０００ｘ）、−４μＭ（５２，０００ｘ）、及び−５μＭ（２１，０００ｘ）の公称不足焦点において撮影した。

本発明の特定のナノカプセルのクライオ透過型電子顕微鏡観察によって、当該ナノカプセルの外層が、外見及び厚さ（約６〜８ｎｍ）において脂質二重層と一致していることが示された。前記ナノカプセルの直径は、約２０ｎｍから約６００ｎｍの範囲を取った。中身のあるナノカプセルは、より小さいナノ粒子のように見えるものを含んでいた。

図１は本発明のベンダムスチン遊離塩基含有ナノカプセルのサンプルの画像を示しており、このサンプルはガラス状氷中に保存して５２，０００ｘの倍率で撮影されている。挿入画像は、画像のより小さな領域をより大きい縮尺において示している。

図２は、本発明のベンダムスチン遊離塩基含有ナノカプセルのサンプルの画像を示しており、このサンプルはガラス状氷中に保存して１１０，０００ｘの倍率で撮影されている。

Claims (26)

1. ベンダムスチン遊離塩基を含む粒子を調製する方法であって、
   有機溶媒を有する連続相と、医薬的に許容可能なベンダムスチン塩の水溶液を有する分散相と、少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤とを混合することによってエマルジョンを形成する工程と、
   前記エマルジョンを充分な量の塩基によって処理する工程であって、前記医薬的に許容可能なベンダムスチン塩をベンダムスチン遊離塩基に変換する、前記処理する工程と、
   少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物によって前記エマルジョンを処理する工程と、
   イソシアネート含有化合物が前記少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤と水−多価アルコール界面において重合し、ベンダムスチン含有粒子を形成するのに充分な時間を与える工程と、
   選択的に、前記粒子を単離する工程と
   を有する方法。
2. 粒子を調製する方法であって、
   有機溶媒を有する連続相と、水溶液の分散相と、少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤とを有するエマルジョンを形成する工程と、
   少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物によって前記エマルジョンを処理する工程と、
   前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物が前記少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤と水性相−多価アルコール界面において重合し、前記粒子を形成するのに充分な時間を与える工程と、
   選択的に、前記粒子を単離する工程と
   を有する方法。
3. 請求項２記載の方法において、前記水性相は、水及び水溶性の治療薬を有するものである、方法。
4. 請求項３記載の方法において、前記治療薬は、ペプチド又はタンパク質であり、または前記治療薬は、ポリヌクレオチドである、方法。
5. 請求項３記載の方法において、前記治療薬は、医薬的に許容可能な塩の形態であり、選択的に前記方法は、さらに、前記治療薬の医薬的に許容可能な塩の形態を前記治療薬の遊離酸又は遊離塩基の形態に変換するために充分な量の塩基又は充分な量の酸によって前記エマルジョンを処理する工程を有する、方法。
6. 請求項１又は請求項５記載の方法において、前記塩基はアンモニア又はアルキルアミンである、方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法において、前記エマルジョンはナノエマルジョンであり、及び／または前記粒子はナノ粒子であり、及び／または前記粒子はナノカプセルであり、及び／または前記粒子は、動的光散乱法（ＤＬＳ）または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で測定した場合に、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約６００ｎｍの平均直径を有する、方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法において、前記有機溶媒は、Ｃ_５−１０アルカン、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、又はこれらの混合物であり、選択的に前記Ｃ_５−１０アルカンは、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、またはこれらの混合物であり、選択的に前記有機溶媒はヘキサンである、方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法において、前記多価アルコール界面活性剤は、ポリエトキシ化ソルビタン及びオレイン酸由来の界面活性剤、モノラウリン酸ソルビタンのポリオキシエチレン誘導体、ソルビタンエステルである界面活性剤、又はこれらの混合物である、方法。
10. 請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、少なくとも１つのｐＨ感受性部分をさらに有し、選択的に前記ｐＨ感受性部分はテトラヒドロピラン部分である、方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、少なくとも１つのマレイミド部分をさらに有するものである、方法。
12. 請求項１１記載の方法において、前記少なくとも１つのマレイミド部分は、前記少なくとも１つのｐＨ感受性部分と結合するリンカーとして機能し、選択的に前記ｐＨ感受性部分はテトラヒドロピラン部分である、方法。
13. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、少なくとも１つの水溶性部分をさらに有し、選択的に前記少なくとも１つの水溶性部分は、ＰＥＧ部分、官能基化ＰＥＧ部分、またはこれらの混合物である、方法。
14. 請求項１１記載の方法において、前記少なくとも１つのマレイミド部分は、前記少なくとも１つの水溶性部分と結合するリンカーとして機能し、選択的に前記少なくとも１つの水溶性部分は、ＰＥＧ部分、官能基化ＰＥＧ部分、またはこれらの混合物である、方法。
15. 請求項１１記載の方法であって、さらに、少なくとも１つの水溶性化合物によって前記粒子を処理する工程を有し、選択的に前記少なくとも１つの水溶性化合物は、ＳＨ−ＰＥＧ含有化合物またはＮＨ２−ＰＥＧ含有化合物である、方法。
16. 請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、４〜１０のイソシアネート部分を有するものである、方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか１つに記載の方法において、前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、ジイソシアネートであり、選択的に前記少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物は、アルキルジイソシアネートであり、好ましくは１，６−ヘキシルジイソシアネートである、方法。
18. 請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法において、前記粒子を単離する工程は、
    ａ．選択的に、前記有機溶媒を蒸発させる工程と、
    ｂ．前記粒子の水性分散物を形成するために、前記粒子を水溶液中に分散させる工程と
    を有し、選択的に前記方法は、さらに、前記水性分散物を凍結乾燥させる工程を有する、方法。
19. 粒子であって、
    治療薬を有する核と、
    前記核を取り囲み、かつ少なくとも２つのイソシアネート部分を有する化合物と少なくとも１つの多価アルコール界面活性剤とから重合したポリマーを有するシェルと
    を有し、選択的に前記粒子は、動的光散乱法（ＤＬＳ）または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で測定した場合に、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約６００ｎｍの平均直径を有する、粒子。
20. 請求項１９記載の粒子及び医薬的に許容可能な希釈剤又は賦形剤を有する医薬組成物であって、前記医薬的に許容可能な希釈剤は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、医薬組成物。
21. ポリマーシェルとベンダムスチン遊離塩基を含有する核とを有するナノカプセルであって、選択的に前記ナノカプセルの平均直径は、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍであり、選択的に前記ナノカプセルの平均直径は、動的光散乱法（ＤＬＳ）または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で測定した場合に、約６０ｎｍ〜約６００ｎｍである、ナノカプセル。
22. 請求項２１記載のナノカプセルにおいて、前記ナノカプセルのポリマーシェルは、少なくとも１つのｐＨ感受性部分を選択的に有し、選択的に前記ｐＨ感受性部分はテトラヒドロピラン部分である、ナノカプセル。
23. 請求項２１または２２記載のナノカプセルにおいて、前記ポリマーシェルは、少なくとも１つの標的リガンドを選択的に有し、選択的に前記ポリマーシェルは少なくとも１つのＰＥＧ部分を選択的に有する、ナノカプセル。
24. 請求項２１〜２３のいずれか１つに記載のナノカプセル及び医薬的に許容可能な希釈剤又は賦形剤を有する医薬組成物。
25. 患者の癌を治療するための請求項２４記載の医薬組成物であって、選択的に前記癌は、慢性リンパ性白血病、ホジキン病、低悪性度非ホジキンリンパ腫、中悪性度非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、乳癌、または肺癌であり、選択的に前記癌は、肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、精巣癌、黒色腫、神経膠芽腫、大腸癌、頭部及び頸部癌、卵巣癌、または前立腺癌である、医薬組成物。
26. 請求項２５記載の医薬組成物において、前記患者は、１つ又は複数の化学療法薬に耐性を示すものであり、選択的に前記１つ又は複数の化学療法薬はアルキル化剤である、医薬組成物。

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