JP6415464B2 - ウイルス阻害性ヌクレオチド配列およびワクチン - Google Patents

Description

本発明は、ヒトゲノムにおける匹敵する遺伝子に対して、ＨＩＶウイルスのゲノムにおいて過剰発現される（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）トリヌクレオチド配列モチーフ、ＡＧＧに関する。

本明細書中で言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の文献は引用してその全体を援用する。

本発明は、合衆国エネルギー省補助金Ｕ．Ｓ．ＤＥ−ＦＧ０２−９０ＥＲ４０５４２による政府の支持でなされた。従って合衆国政府は本発明においてある種の権利を有することができる。

レンチウイルスはウイルスのレトロウイルス科に属する。用語「レンチ」は「遅い」に対するラテン語である。レンチウイルスは、長いインキュベーション期間、および細胞外粒子を形成する必要性なくして直接的に隣接する細胞に感染する能力を有することによって特徴付けられる。長期間の間細胞内に留まるそれらの能力と結合して、それらの遅い代謝回転は、レンチウイルスを、感染した対象における免疫応答を回避するにおいて特に適合したものとする。レンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）のような免疫不全ウイルスを含む。レンチウイルス感染は深刻な病気を引き起こしかねず、もし治療しないまま放置すれば、致命的となり得る。近年、ウイルス負荷を軽減し、ＨＩＶ感染の兆候を緩和するいくつかの抗レトロウイルス薬物および薬物カクテルが開発されている。しかしながら、それらの成功にもかかわらず、これらの薬物は一般には、ウイルス感染を全くは根絶できない。その代わり、ウイルスは感染した対照において、しばしば潜伏状態で執拗に存在する。ＨＩＶのようなレンチウイルス病に対するワクチンを作製する多数の試みもあった。しかしながら、今日、ワクチンは商業的に入手できない。かくして、ＨＩＶのようなレンチウイルスに対する新しい薬物およびワクチンを開発する要望は当該分野に存在する。

同時係属仮特許出願第６０／８０８，４２０号 国際公開特許第２００１／００７６３７号 米国特許第４，２３５，８７１号 米国特許第４，５０１，７２８号 米国特許第４，８３７，０２８号 米国特許第４，７３７，３２３号 国際公開特許第９７／０６２４３号 同時係属仮特許出願第６０／８０８，４２０号

Ｄｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）Ｖｏｌ．３８１、ｐ６６１−６Ｎａｔｕｒｅ、（１９９６）Ｖｏｌ．３８２ ｐ７２２−５ Ｓａｍｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９９６）Ｖｏｌ．３８２ ｐ７２２−５ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９９７）、Ｖｏｌ．７１、ｐ．４８９２−４９０３ Ｒｏｂｉｎｓら、（２００５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８７，ｐ．８３７０−７４ Ｌｅｗｉｓら、（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、ｐ３４３９ Ｂｏｈｎｓａｃｋら、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７、ｐ１ Ｖａｖｒａら、（１９９６）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ ５８、３０ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ＃ＴＭ００１、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｅｎｇら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００、ｐ８１ Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、ｐ４８８ Ｔａｙｌｏｒら、（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、ｐ８７６４ Ｎａｋａｍａｙｅら、（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４、ｐ９６７９ Ｈｉｇｕｃｈｉら、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、ｐ７３５１ Ｓｈｉｍａｄａら、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７、ｐ１５７ Ｈｏら、（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７、ｐ５１ Ｈｏｒｔｏｎら、（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７、ｐ６１ Ｓａｒｋａｒら、（１９９０）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８、ｐ４０４ Ｄａｎｉｅｌら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＳＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｆ ｇｅｎｅ」（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８、ｐ１９３８ Ａｌｍｏｎｄら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ」（１９９５）Ｌａｎｃｅｔ ３４５、ｐ１３４２ Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ」（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、ｐ１４３１ Ｇｕａｎら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｌ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｅｔｅｄ」（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５、ｐ４０５６ Ｍｉｌｌｓら、「Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＨＩＶ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」（２０００）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６，ｐ１４５３ Ｉｌｙｉｎｓｋｉｉら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＩＶ Ｖａｃｃｉｎｅ」（２００１）ＡＩＤＳ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｅｐ ５−８、要旨ｎｏ．１９２ Ａｄｄａｗｅら、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ＨＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ」（１９９６）Ｉｎｔ Ｃｏｎｆ ＡＩＤＳ Ｊｕｌ ７−１２、１１：４、要旨ｎｏ．Ｍｏ．Ａ．１００ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｒｕｚら、「５−ｙｅａｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ（ＨＩＶ−１ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＩＶ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ＨＩＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｈａｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ」（２００３）Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＩＤＳ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＨＩＶ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｐａｒｉｓ、要旨４８６ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」） Ｊ Ｐ Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ、「Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｖｉｒｕｓｓｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅｎ ａｕｓ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」Ｃｈａｐｔｅｒ ４．２ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｏ．Ｋａｙｓｅｒ ａｎｄ Ｒ Ｈ Ｍｕｅｌｌｅｒ）Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、２０００、 Ｏ’Ｎｅｉｌら、「Ｖｉｒｕｓ Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂａｓｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１１：１７３−１７７ Ｐｒｉｏｒら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＩＶ−１」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）３０−５２ Ｍａｊｈｄｉら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｅｌｋ Ｃａｌｖｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｒｒｈｅａ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）３５（１１）：２９３７−２９４２ Ｔｒｅｐａｎｉｅｒら、「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｏｒ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８１）３（４）：２０１−２１１ Ｈａｇｅｎら、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ＶＡＱＴＡ，ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（１９９６）１２：４０６−４１２ Ｃａｒｌｓｓｏｎら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４）４７：２７−３６ Ｐａｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）６０：１７１−１７４ Ｔｓｕｒｕｍｉら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｕｐｒａｍｍｏｎｉｕｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｒｅ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＢＭＭ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｒｅ）ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｒｅｍｏｖａｌ」Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９０）２２（１２）：１０８５−１１００ Ｍａｋｉｎｏら、「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｒｅ，ＢＭＭ」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）１３９（１−２）：８７−９６ Ｊ Ｐ Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ「Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｖｉｒｕｓｓｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅｎ ａｕｓ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」Ｃｈａｐｔｅｒ ４．２、Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ内（ｅｄｓ．Ｏ．ｋａｙｓｅｒとＲ Ｈ Ｍｕｅｌｌｅｒ）Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、２０００ Ｒｏｂｉｎｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、（２００５）Ｖｏｌ．１８７、ｐ．８３７０−７４

本発明は、ヒトゲノムにおける匹敵する遺伝子に対して、ＨＩＶウイルスのゲノムにおいて過剰発現される（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）トリヌクレオチド配列モチーフ、ＡＧＧを提供する。該ＡＧＧモチーフは他のウイルスのゲノムにおいて高いレベルでやはり存在する。該ＡＧＧモチーフは、阻害性ヌクレオチドシグナル配列または「ＩＮＳ」配列であると信じられている。

一つの具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸に向けられる。いくつかの具体例において、ウイルス核酸はＨＩＶウイルスからのものである。他の具体例において、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸はｇａｇ、ｐｏｌ、またはｅｎｖ遺伝子のいずれかにある。

別の具体例において、本発明は、１以上のＡＧＧ配列を含有し、かつ非ＡＧＧ配列に対してＡＧＧ配列の１以上を変化させるウイルス核酸を供することを含む、突然変異した１以上のＡＧＧ配列を有するウイルス核酸を生産する方法に向けられる。該ＡＧＧ配列は、コーディングおよび非コーディング領域を含めた、ウイルスゲノムにおけるいずれかの位置に位置するか、またはそれから由来することができる。別の具体例において、もし該ＡＧＧ配列が蛋白質をコードするウイルス核酸領域にあれば、それに対してＡＧＧ配列が変化された非ＡＧＧ配列は、それが、ウイルス核酸によってコードされる蛋白質の配列、構造、機能、または免疫原性に悪影響しないように選択される。さらなる具体例において、ウイルス核酸はＨＩＶ核酸である。

別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているゲノムを有する突然変異体ウイルスに向けられる。いくつかの具体例において、突然変異体ウイルスは突然変異体ＨＩＶウイルスである。

なお別の具体例において、本発明は、ウイルスではないが、非ＡＧＧ配列に対して１以
上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸配列を含有する組換えウイルスに向けられる。別の具体例において、突然変異体ウイルス核酸は突然変異体ＨＩＶ核酸である。

さらなる具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されている突然変異体ウイルス核酸配列から発現されるウイルス蛋白質に向けられる。別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されている突然変異体ＨＩＶ核酸配列から発現されたＨＩＶ蛋白質に向けられる。

別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸配列を含むウイルスワクチンに向けられる。別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているＨＩＶ核酸配列を含むＨＩＶワクチンに向けられる。

別の具体例において、本発明は、天然に生じるウイルスの核酸配列に見出されるよりも少数のＡＧＧモチーフを有するウイルス核酸配列を含めた、前記したウイルス核酸配列のいずれかを含むウイルスワクチンに向けられる。別の具体例において、本発明は対応する天然に生じるＨＩＶ株の核酸配列に見出されるだろうよりも少数のＡＧＧモチーフを有するＨＩＶ核酸配列を含むＨＩＶワクチンに向けられる。
別の具体例において、本発明は、対応する野生型ウイルスより高い蛋白質発現が可能なウイルスワクチンに向けられ、該ウイルスワクチンは野生型ウイルス核酸配列よりも少数のＡＧＧ配列を持つ核酸配列を含む。別の具体例において、本発明は、対応する野生型ＨＩＶウイルスよりも高い蛋白質発現が可能なＨＩＶワクチンに向けられ、該ＨＩＶワクチンは野生型ＨＩＶウイルス核酸配列よりも少数のＡＧＧ配列を持つ核酸配列を含む。

別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸から生産された蛋白質を含むウイルスワクチンに向けられる。別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているＨＩＶ核酸から生産された蛋白質を含むＨＩＶワクチンに向けられる。

別の具体例において、本発明は、本発明によって提供されるワクチン、および医薬上許容される希釈剤、担体、賦形剤および補助剤よりなる群から選択されるさらなる成分を含む組成物に向けられる。

なお、別の具体例において、本発明は、本発明の有効量のワクチンを対象に投与することを含む、対象をウイルスに対して免疫化する方法に向けられる。一つの具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されている有効量のウイルスを対象に投与することを含む、対象をウイルスから免疫化する方法に向けられる。別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されている、ウイルス蛋白質をコードする有効量の核酸を対象に投与することを含む、対象をＨＩＶに対して免疫化する方法に向けられる。なお、別の具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸から生産された有効量のウイルス蛋白質を対象に投与することを含む、対象をウイルスに対して免疫化する方法に向けられる。いくつかの具体例において、本発明は、対象をＨＩＶに対して免疫化する方法に向けられる。

別の具体例において、本発明は、ウイルスＲＮＡの生産、レンチウイルス蛋白質の生産、またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害し
、または刺激する剤を同定するための方法に向けられる。別の具体例において、該方法は少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する少なくとも１つのウイルス核酸配列を含有する対照細胞、および非ＡＧＧ配列に対して突然変異されている少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する少なくとも１つのウイルス核酸配列を含有するテスト細胞を供し、該テスト細胞および該対照細胞を１以上の剤と接触させ、次いで、対照細胞と比較して、テスト細胞において、ＲＮＡウイルスの生産、レンチウイルス蛋白質の生産またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害し、または刺激する、少なくとも１つの剤を同定することを含む。他の具体例において、該剤は、ＨＩＶ ＲＮＡの生産、ＨＩＶ蛋白質の生産、またはＨＩＶ粒子の生産を阻害し、または刺激し、あるいはＨＩＶ潜伏を阻害し、または刺激する。

別の具体例において、本発明は、ＡＧＧモチーフ結合剤を同定するための方法に向けられる。別の具体例において、該方法は、少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する対照核酸、および非ＡＧＧ配列に対して突然変異されている少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有するテスト核酸を供し、該テスト核酸および該対照核酸を１以上の剤と接触させ、次いで、該対照核酸に結合するが、該テスト核酸に結合しないか、あるいはそれが該テスト核酸に結合するよりも高い親和性でもって該対照核酸に結合する少なくとも１つの剤を同定することを含む。

別の具体例において、本発明は、本発明の方法の１つを用いて同定されたＡＧＧモチーフ結合剤のような、ＡＧＧモチーフ結合剤に向けられる。

なお、別の具体例において、本発明発は、少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する核酸へのＡＧＧ結合剤の結合を阻害し、または刺激する剤、およびこのような剤を同定する方法に向けられる。

また、本発明は、ウイルスのゲノムにおいてＡＧＧモチーフ以外のＩＮＳ配列を同定する方法に向けられる。

本発明のこれらおよび他の具体例は、添付の書面、図面、および特許請求の範囲においてさらに記載される。

図１、部分（ａ）および（ｂ）は、ＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列、およびコードされた蛋白質のアミノ酸配列を示す。部分（ａ）はヌクレオチド位置１から７８０を示し、および部分（ｂ）はヌクレオチド位置７８１から１５４３を示す。該配列は４４のＡＧＧモチーフを含有する。これらのＡＧＧモチーフ内になすことができる可能な突然変異のいくつかを、ヌクレオチド配列上方に示す。例えば、該図面は、ヌクレオチド位置１４４２で出発するＡＧＧモチーフをＡＧＧからＡＡＧに変化させることができることを示す。図１は３８のＡＧＧ突然変異を示す。 ４つの独立したトランスフェクション実験からの一過的にトランスフェクトされた２９３細胞におけるＧａｇ発現の結果を示す。２つの異なるＧａｇ配列は、コドン最適化バージョン（Ａｄａｒｃ）および我々が作り出したモチーフ最適化バージョン（ＲＫ）である。Ｇａｇ遺伝子のＲＨバージョンは、コドン最適化バージョンよりもほぼ２倍高い発現を有する。 マウスにおけるＧａｇ ＤＮＡワクチンの免疫原性を示す。Ｇａｇの２つの異なるバージョンをＤＮＡワクチンに作製し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに注射し、次いで、４週間においてブースター注射した。抗Ｇａｇ抗体レベルを、４週間および６週間の時点においてＥＬＩＳＡによって測定した。我々のバージョン、ＲＫ−Ｇａｇは、４週間においてコドン最適化バージョンよりも５倍大きい免疫応答を誘導し、これは、６週間後に６差のファクターまで増加した。

本発明は、ウイルスゲノムにおける、阻害性ヌクレオチドシグナル配列または「ＩＮＳ」配列に関する。本発明のＩＮＳ配列は、例えば、宿主細胞におけるウイルスＲＮＡのレベルを低下させ、またはウイルスＲＮＡの低い定常状態レベルを維持することによってウイルスに対して阻害効果を有することができる。本発明のＩＮＳ配列は、ウイルス潜伏においても役割を演じることができる。一つの態様において、本発明は、ＩＮＳ配列が突然変異されているウイルス核酸を含有する、または該ウイルス核酸から生産されたワクチンを提供する。別の態様において、本発明は、ＩＮＳ配列の機能に影響させるための方法および組成物、およびＩＮＳ配列を同定する方法を提供する。これらおよび他の具体例を本明細書中に記載する。

定義
単数形「ある」「該」は、内容が明らかにそうでないことを指令しているのでなければ、複数参照を含む。かくして例えば、ある「ウイルス」への言及は、複数のこのようなウイルスを含む。

用語「ＡＧＧ」「ＡＧＧモチーフ」、「ＡＧＧ配列」および「ＡＧＧ配列モチーフ」は、本明細書中においては、総合交換的に用いて、配列ＡＧＧを有する核酸における３つのヌクレオチドの連続ストリングをいう。

用語「突然変異体」とは、本明細書中で用いるように、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって改変されている修飾された核酸または蛋白質をいう。例えば、用語突然変異体は、例えば、ＡＧＧモチーフ中の１以上のヌクレオチドをもう１つのヌクレオチドで置換し、あるいは１以上のヌクレオチドを挿入して、ＡＧＧモチーフを破壊し、あるいは他のヌクレオチドをそれらで置換することなく、ＡＧＧモチーフ中の１以上のヌクレオチドを欠失させることによって、ＡＧＧモチーフを破壊するように改変されたアミノ酸をいうのに用いられる。明細書および特許請求の範囲が非ＡＧＧ配列に対してＡＧＧモチーフを突然変異させることに言及する場合、これはＡＧＧモチーフ中の１以上のヌクレオチドをもう１つのヌクレオチドで置換すること、あるいは１以上のヌクレオチドを挿入して、ＡＧＧモチーフを破壊すること、あるいは他のヌクレオチドをそれらで置換することなくＡＧＧから１以上のヌクレオチドを欠失することを含む。

用語「野生型」または「ＷＴ」とは本明細書中で用いるように、ＡＧＧモチーフを破壊するように改変されていない、核酸を含有する核酸、およびウイルス、ベクター、および細胞をいう。用語「野生型」とは、このような核酸によってコードされる蛋白質もいう。かくして、用語「野生型」は、天然に生じる核酸、ウイルス、ベクター、細胞および蛋白質を含む。しかしながら、加えて、用語「野生型」は非天然に生じる核酸、ウイルス、細胞および蛋白質を含む。例えば、そうでないことが述べられているのでなければ、遺伝子的に改変されている核酸、ウイルス、ベクターおよび細胞は、それらの核酸、ウイルスおよび細胞がその中のＡＧＧモチーフを破壊するように改変されていないという条件で、用語「野生型」に含まれるものとする。

本明細書中で用いるように用語「ホモログ」とは、本明細書中で言及される野生型レンチウイルスヌクレオチド配列のような、本明細書中で言及されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上の同一性を保有するヌクレオチド配列をいう。パーセント同一性は、包括的に６０％から９９．９％の範囲内のいずれの数でもあり得る。

また、用語「ホモログ」は、本明細書中で言及されるレンチウイルス蛋白質のような、本明細書中で言及される蛋白質のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％以上の同一性を保有するアミノ酸配列を持つ蛋白質をいうのに用いられる。パーセント同一性は、包括的に、６０％から９９．９％の範囲内のいずれの数でもあり得る。いくつかの具体例において、本明細書中で記載された蛋白質のホモログは、本明細書中で記載された野生型レンチウイルス蛋白質と実質的に同様な構造および／または免疫原性を有する。

本明細書中で用いるように、「ウイルス」は遺伝物質のＲＮＡまたはＤＮＡコアを囲う蛋白質被膜を有するいずれかの感染性粒子も含む。用語「ウイルス」は、本明細書中で用いるように、全てのＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの全ての株、単離体、およびクレードもいう。ウイルスは、限定されるものではないが、全てのアデノウイルス、アルファモウイルス、アレキシウイルス、アロレビウイルス、アルファクリプトウイルス、アルファリポトリクスウイルス、アルファノドアウイルス、アルファパピローマウイルス、アルファレトロウイルス、アルファウイルス、アンドウイルス、アンペロウイルス、アフソウイルス、アクアビルナウイルス、アクアレオウイルス、アレナウイルス、アルテリウイルス、アスコウイルス、アスフィウイルス、アタデノウイルス、オーレウスウイルス、アバストロウイルス、アベナウイルス、アビアドノウイルス、アビビルナウイルス、アビヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、アブラウイルス、バブウイルス、バドナウイルス、バルナウイルス、ブデッルロミクロウイルス、ベゴモウイルス、ベータクリプトウイルス、ベータリポトリクスウイルス、ベータノドウイルス、ベータパピローマウイルス、ベータレトロウイルス、ベータテトラウイルス、ボカウイルス、ボルナウイルス、ブラコウイルス、ブレビデンソウイルス、ブロモウイルス、ビモウイルス、カピロウイルス、カプリポックスウイルス、カルディオウイルス、カルラウイルス、カルモウイルス、カウリモウイルス、カベモウイルス、クラミジアミクロウイルス、クロロウイルス、クロリリドウイルス、クリソウイルス、シルコウイルス、クロステロウイルス、コッコリトウイルス、コルチウイルス、コモウイルス、コロナウイルス、コルチコウイルス、クリパウイルス、ククモウイルス、クルトウイルス、シポウイルス、シストウイルス、サイトメガロウイルス、サイトラブドウイルス、ダイントウイルス、デルタパピローマウイルス、デルタレトロウイルス、デンソウイルス、デペンドウイルス、エボラウイルス、エナモウイルス、エンテロウイルス、エントモビルナウイルス、エントモポックスウイルスＡ、エントモポックスウイルスＢ、エントモポックスウイルスＣ、エフェメロウイルス、イプシロンパピローマウイルス、イプシロンレトロウイルス、エルボウイルス、エランチウイルス、エリスロウイルス、エタパピローマウイルス、ファバウイルス、フィジウイルス、フラビウイルス、フォベアウイルス、フセロウイルス、ガンマリポトリクスウイルス、ガンマパピローマウイルス、ガンマレトロウイルス、ジャルディアウイルス、グラヌロウイルス、グッタウイルス、ジロウイルス、ハンタウイルス、ヘミウイルス、ヘ二パウイルス、ヘパシウイルス、ヘパドナウイルス、ヘパトウイルス、ヒポウイルス、イクノウイルス、イクタルリウイルス、イドノレオウイルス、イラルウイルス、イルトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、イノウイルス、イオタパピローマウイルス、イポモウイルス、イリドウイルス、イサウイルス、イテラウイルス、カッパパピローマウイルス、コブウイルス、ラゴウイルス、ラムダパピローマウイルス、レイシュマニアウイルス、レンチウイルス、レポリポックスウイルス、レビウイルス、ルテオウイルス、リンフォクリプトウイルス、リンフォシスチウイルス、リサウイルス、マクロモウイルス、マクルラウイルス、マキュラウイルス、ママストロウイルス、マンダリウイルス、マラフィウイルス、マルブルグウイルス、マルジウイルス、マルナウイルス、マスタデノウイルス、マストレウイルス、メガロシトウイルス、メタニューモウイルス、メタウイルス、ミクロウイルス、マイトウイルス、モルシポックスウイルス、モルビリウイルス、ムパピローマウイルス、ムロメガロウイルス、マイコレオウイルス、ナイロウイルス
、ナノウイルス、ナルナウイルス、ネクロウイルス、ネポウイルス、ノロウイルス、ノビルハブドウイルス、ヌクレオポリヘドロウイルス、ヌクレオハブドウイルス、ヌパピローマウイルス、オカウイルス、オレアウイルス、オメガテトラウイルス、オミクロンパピローマウイルス、オルビウイルス、オルトブンニアウイルス、オルトヘパドナウイルス、オルトポックスウイルス、オルトレオウイルス、オリザウイルス、パニコウイルス、パラポックスウイルス、パレコウイルス、パルチチウイルス、パルボウイルス、ペフデンソウイルス、ペスチウイルス、ペツウイルス、ファエオウイルス、フレボウイルス、ファイトレオウイルス、ピパピローマウイルス、プラスマウイルス、プレクトロビ、ニューモウイルス、ポレロウイルス、ポリオーマウイルス、ポッテクスウイルス、ポチウイルス、プラシノウイルス、プリムネシオウイルス、シュードウイルス、ラナウイルス、ラフィドウイルス、レスピロウイルス、ラジノウイルス、リノウイルス、ロセオロウイルス、ロタウイルス、ルブウイルス、ルビラウイルス、ルディウイルス、リモウイルス、サポウイルス、セアドルナウイルス、セキウイルス、シアデノウイルス、シンプレックスウイルス、ソイモウイルス、スピロミクロウイルス、スプマウイルス、スイポックスウイルス、テクチウイルス、テショウイルス、テタパピローマウイルス、トゴトウイルス、トンブスウイルス、トポクウイルス、トロウイルス、トスポウイルス、トチウイルス、トリコウイルス、トリチモウイルス、ツングロウイルス、ティモウイルス、バリセロウイルス、ベシキュロウイルス、ベシウイルス、ビチウイルス、ワイカウイルス、ウィスポウイルス、キシパピローマウイルス、ヤタポックスウイルス、ゼータパピローマウイルス、またはそのいずれかの組合せを含む。

用語「レトロウイルス」とは、本明細書中で用いるように、限定されるものではないが、全てのアルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプマウイルス、およびレンチウイルスを含めた全てのレトロウイルスの全ての株、単離体およびクレードをいう。

用語「レンチウイルス」とは、本明細書中で用いるように、限定されるものではないが、ウシ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ビスナ／マエジウイルス、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含めた全てのレンチウイルスのすべての株、単離体、およびクレードをいう。

用語「ＨＩＶ」とは、本明細書中で用いるように、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２双方の全ての株、単離体、およびクレードをいう。かくして、そうでないことが述べられているのでなければ、型を特定することなく（すなわち、１型または２型を特定することなく）用語ＨＩＶを用いる場合、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２双方は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の全ての株、単離体、およびクレードを含めていうと推定されるべきである。

用語「蛋白質」および「ペプチド」とは、本明細書中で用いるように、アミノ酸のポリマー鎖をいう。用語「ペプチド」は、一般には、アミノ酸の比較的短いポリマー鎖をいうのに用いられ、および用語「蛋白質」はアミノ酸のより長いポリマー鎖をいうのに用いられるが、蛋白質と考えることができる分子およびペプチドと考えることができる分子という点でいくらか重複がある。かくして、用語「蛋白質」および「ペプチド」は本明細書中においては相互交換可能に用いることができ、このような用語が用いられる場合、それらは言及されるアミノ酸のポリマー鎖の長さを断じて制限する意図ではない。特に断りのない限り、用語「蛋白質」および「ペプチド」は、言及された特定の蛋白質の全ての断片、誘導体、変種、ホモログ、およびミメティックを含むと解釈されるべきであり、天然に生じるアミノ酸または合成アミノ酸を含むことができる。

用語「ワクチン」および「免疫原性組成物」は、本明細書中においては、ウイルスに対する免疫応答を誘導することができる剤または組成物をいうのに相互交換的に用いられる。別の具体例において、本発明は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＥＩＡＶのようなレンチウイルスに対する免疫応答を誘導することができるワクチンを提供する。用語「ワクチン」および「免疫原性組成物」は、予防または予防的ワクチンおよび治療ワクチンを含む。本発明のワクチン組成物は多数の異なるウイルスと交差−反応性であってもよく、かつそれに対して効果的であり得る。例えば、本発明の免疫原性組成物は多数の異なるタイプのウイルス、レンチウイルスおよび／または多数の異なるタイプの免疫不全ウイルスに対して交差反応性であり得、かつそれに対して効果的であり得る。同様に、本発明の免疫原組成物は、同一ウイルスの異なる株およびクレードの間で交差反応性であり得る。例えば、ＨＩＶの１つの株に対して効果的である本発明による免疫原性組成物は、ＨＩＶの多数の株に対しても効果的であり得る。

本明細書中で用いるように、用語「蛋白質ワクチン」、「蛋白質性ワクチン」および「サブユニットワクチン」は、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質成分を含有するワクチンをいうのに相互交換可能に用いられる。

用語「剤」は、本明細書中で用いるように、限定されるものではないが、ＡＧＧモチーフに結合する剤、ＡＧＧモチーフの機能を阻害する剤、ＡＧＧモチーフの機能を刺激する剤、ＡＧＧモチーフに対するもう１つの剤の結合を阻害し、または刺激する剤、突然変異したＡＧＧモチーフを有する核酸を含有する、または該核酸から作製されたワクチン、本発明のワクチンと同時投与される分子等を含めた、蛋白質、ペプチドまたは医薬のようないずれの分子もいうのに上位概念的に用いられる。

用語「宿主」とは、ウイルス、レンチウイルスによって感染され得る、あるいは本明細書中に記載されたワクチン株、ウイルス、ベクター、プラスミドまたは蛋白質のいずれかを成長させ、増幅させ、または発現させることができる（動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、および昆虫細胞を含めた）いずれの動物または細胞型もいう。

用語「対象」とは、本明細書中に用いるように、ヒトおよび他の哺乳動物種を含めた、本発明のワクチンまたは剤を投与することができるいずれの動物もいう。

「免疫原性」は、免疫応答を刺激する物質の能力を含む。免疫原性は、例えば、物質に対して特異的な抗体の存在を決定することによって測定される。抗体の存在は、当該分野で知られた方法、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出される。

一つの態様において、本発明は、低下した数のＡＧＧ配列を有するウイルスに向けられる。いくつかの具体例において、本発明はレンチウイルスに向けられる。他の具体例において、本発明はレンチウイルスＨＩＶに対して向けられる。
ＨＩＶ生物学
ＨＩＶゲノムは、そのうちいくつかは、蛋白質分解切断に際して異なる機能体を生じる「ポリ蛋白質」として生産されるいくつかの蛋白質をコードする。「ポリ蛋白質」およびそれらの蛋白質分解切断産物を含めた、ＨＩＶゲノムによってコードされる蛋白質の全ては本発明の範囲内にあり、「ＨＩＶ蛋白質」、「ＨＩＶペプチド」、「ＨＩＶポリ蛋白質」、「本発明の蛋白質」、「本発明のポリ蛋白質」または「本発明のペプチド」として本明細書中において言及することができる。本発明のＩＮＳは、これらの蛋白質のいずれかまたは全てをコードするヌクレオチド配列に存在させることができる。本発明のＩＮＳは、ＨＩＶゲノムの非コーディング領域に存在させることもできる。

例えば、ＨＩＶゲノムは、ウイルスのコアを作り上げるｐ１７ＭＡ、ｐ２４ＣＡ、ｐ７
およびｐ６蛋白質へウイルスプロテアーゼによって切断できるｐｒ５５ ＧＡＧ蛋白質をコードする。Ｐｒ１６０ ＧＡＧ−ＰＯＬ前駆体蛋白質は、翻訳フレームシフティングによって作成され、引き続いて、逆転写酵素（ＲＴ）、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、プロテアーゼ（ＰＲ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）に切断されるポリメラーゼポリ蛋白質を生産する。Ｇｐ１６０エンベロープ蛋白質は、細胞プロテアーゼによって、ウイルスをＣＤ−４受容体および共受容体に付着させるＧｐ１２０蛋白質（ＥＮＶ）、およびウイルスエンベロープを宿主細胞膜に融合させるＧｐ４１膜貫通蛋白質に切断される。これらは主な構造蛋白質、およびＨＩＶ粒子の酵素である。２つのさらなる蛋白質、ＴａｔおよびＲｅｖは、組み込まれたプロウイルス（Ｔａｔ）の転写、およびスプライシングされていないｍＲＮＡ（ＧＡＧ−ＰＯＬおよびウイルスゲノムＲＮＡ）の、核から細胞質（Ｒｅｖ）への輸送を調節する。これらの活性は、ウイルス遺伝子の発現、および複製サイクルの間の一時的事象を調節する。４つのアクセサリー蛋白質：Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、ＶｐｒおよびＮｅｆは、細胞蛋白質とで複合体を形成し、イン・ビボにて感染性ウイルスの生産を増強させるが、いくつかの細胞培養においては最小表現型をより多く有するアダプターである。これらのＨＩＶ蛋白質の全ては本発明の範囲内にある。

細胞表面におけるＣＤ−４蛋白質および共受容体に結合するそのｇｐ１２０ ＥＮＶ蛋白質を用い、ＨＩＶウイルスはＴ細胞および単球に付着する。Ｔ細胞はサイトカイン受容体ＣＸＣＲ４を発現し、単球はＣＣＲ５共受容体を発現し、および末梢血液リンパ球はその双方を発現する。ＥＮＶ蛋白質における遺伝的改変は単球向性ウイルス（Ｒ５ウイルス）、Ｔ細胞向性ウイルス（Ｘ４ウイルス）およびデュアル向性ウイルスを生産する。共受容体はＥＮＶの付着およびＧｐ４１融合において必須である。正常なＨＩＶ共受容体を欠如する人々は、例えば、彼らはＣＣＲ５／デルタ３２多形らを有するために、ＨＩＶ感染に対してほとんど完全に耐性である（例えば、Ｄｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）Ｖｏｌ．３８１、ｐ６６１−６およびＳａｍｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９９６）Ｖｏｌ．３８２ ｐ７２２−５参照）。ＣＣＲ５共受容体をブロックする薬物は、現在、臨床試験中である。

ＨＩＶウイルスと細胞との融合の後に、ウイルス粒子は、逆転写酵素（ＲＴ）を用いてウイルスＲＮＡをＤＮＡコピーにコピーし、粒子は核まで移動し、そこで、ウイルスＤＮＡをインテグラーゼ（ＩＮ）を用いて細胞ゲノムに組み込む。長い末端反復（ＬＴＲ）ＤＮＡ配列は、組込まれたＤＮＡからウイルスｍＲＮＡを生じさせるのに必須である多数の転写因子結合部位を含有する。ＴＡＴＡエレメントに加えて、細胞転写因子によって認識されるＬＴＲにおいては２つのＮＦカッパｂ部位および３つのＳｐ−１部位がある。加えて、ＬＥＦ、ＥＴＳおよびＵＳＦ転写因子についての部位も存在する。これらの細胞転写因子は、転写を開始するのを助けるが、これは非常に低いレベルで起こる。ＴＡＴが生産された後、それは細胞蛋白質（サイクリンＴＩ）に結合し、次いで、ＴＡＴ−ｃｙｃＴ１複合体はウイルスｍＲＮＡ中の（ＴＡＲと呼ばれる）ＲＮＡループ構造に結合する。ＴＡＴ−ｃｙｃＴ１複合体は、次に、ＣＤＫ９プロテインキナーゼに結合し、これは、ＲＮＡポリメラーゼ−ＩＩのサブユニットの１つのカルボキシ末端をリン酸化する。これは、（１００倍だけ増加する）ウイルスＲＮＡ転写の有効な開始で必要である。３０を超える異なるウイルスＲＮＡ分子がこれらの事象によって生産される。それらは３つのカテゴリー：（１）ＧＡＧ、ＰＯＬおよび無傷ウイルスゲノムを作成するのに用いられるスプライシングされていないＲＮＡ、（２）ＥＮＶ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、およびＶｐｒ蛋白質を作成するのに使用されるサイズが約５．０Ｋｂの部分的にスプライシングされたＲＮＡ、および（３）ＲＥＶ、ＴＡＴおよびＮｅｆに翻訳される小さなスプライシングされたＲＮＡ（１．７〜２．０Ｋｂ）に入る。核からのこれらのＲＮＡの輸送は、十分にスプライシングされたｍＲＮＡについては最も効果的である。かくして、感染後早くに、ＴＡＴ、ＲＥＶおよびＮＥＦのみが効果的に作成される。次いで、ＴＡＲへのＴＡＴ結合は、転写の速度を１００倍だけ増加させる。ＲＥＶ蛋白質が作成され、それがＥＮＶ遺伝子中のＲｅｖ応答
性エレメント（ＲＲＥ）に結合した後にのみ、より大きくスプライシングされていない、または十分にスプライシングされていないｍＲＮＡは細胞質により効果的に輸送される。このようにして、ＴＡＴおよびＲＥＶの合成はウイルスのライフサイクルのタイミングを調節する。

ＴＡＴに加えて、細胞中でウイルスＲＮＡの定常レベルを低下させるＨＩＶゲノム中のシグナルの第二の組がある。これらを阻害性ヌクレオチドシグナル配列（ＩＮＳ配列）という。推定ＩＮＳ含有領域は、ＨＩＶゲノムのｇａｇ／ｐｏｌ領域において従前に同定されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９９７）、Ｖｏｌ．７１、ｐ．４８９２−４９０３参照）。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらによる従前の研究において、推定ＩＮＳ配列を含有する領域は、領域のコーディング能力を変化させることなく、ＡＵＵＵＡペンタヌクレオチドを排除し、ＡＵ含有量を減少させるように突然変異された。これらの突然変異の結果、ＨＩＶ ＲＮＡのレベルが７０〜１３０倍増大した。突然変異したＩＮＳ配列にて、かつ機能的ＲＥＶの存在下で、感染した細胞におけるＨＩＶ ＲＮＡの増加は、これらの２つの区別される機能なくして１６０倍より高かった。

ＨＩＶウイルスは、低い定常状態レベルのウイルスＲＮＡを有することによって、ＨＩＶウイルスは利点を獲得すると考えられる。細胞を急速に複製しそれを殺傷するウイルスは、より遅いサイクルを使用するものよりも少ない細胞当たりのウイルスを急速に生産することが提唱されている。事実、迅速な効果的ウイルス生産および細胞殺傷は、例えば、ポリオウイルスで観察されたように、ウイルスの完全な免疫クリアランス、および引き続いての感染に対する免疫性にしばしばつながる。対照的に、細胞内に長時間留まるウイルスはそれらに対する免疫応答を回避でき、あるいはその有効性を少なくとも低下させ得る。

ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の推定ＩＮＳ含有領域における突然変異は相加的であるが、ＩＮＳの配列は従前には定義されたことがない（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら）。ＩＮＳ含有領域は、感染細胞においてウイルスＲＮＡの定常状態レベルを降下させるように作用する。少なくとも３つの可能なメカニズムが存在し、これは、（１）転写の低下された速度、（２）ＨＩＶ ＲＮＡのＲＮＡ分解の増大した速度、（３）核からのＨＩＶ ＲＮＡの低下した輸送速度（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら）を含む。

ＥｎｖおよびＧａｇに対する不十分な免疫応答は、ＨＩＶ−１に対するワクチンを作り出す努力において基本的な問題である。ＤＮＡワクチンでは、免疫応答は発現レベルに相関し、従って、これらのＯＲＦの発現の増加は、生ワクチンの構築に対する有意な経路ブロックを緩和することができよう。ＨＩＶからの大きなｍＲＮＡはプロセッシングの問題を有し、恐らくは、それらのＲＮＡにおいてコードされた蛋白質結合部位の組のため、核から効果的に輸出されない。核封じ込めを引き起こすシグナルの同定および除去は、これらのＯＲＦの発現レベルを増大させ、免疫応答を改善する。

ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のゲノムは９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、その全ては代替スプライシングを通じて単一プロモータから発現される。全長ｍＲＮＡと共に、６つのＯＲＦｓ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、およびＶｐｒについてのスプライス形態は、それらのＲＮＡにおいてコードされたＲＥＶ応答エレメント（ＲＲＥ）を含有する。ＲＥＶ蛋白質の不存在下においては、これらの６つのＯＲＦの発現は不十分である。残りの３つのＯＲＦｓ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆはＲＥＶ蛋白質とは独立して効果的に発現される。

ＲＲＥを含有するｍＲＮＡは、未だ決定されていないシグナル、あるいは正常な発現を
妨げるシグナルの組を含有するようである。これらのＯＲＦの不十分な発現の主な原因は核封じ込めである。ＨＩＶ−１のゲノムは、ヒトゲノムにおける既知のコーディング遺伝子の組と比較して、異常なヌクレオチド分布を有する。ＨＩＶ−１の臨床的単離体にわたって平均されたアデニンの割合は、平均ヒトコーディング遺伝子を上回る。本実験およびワクチン試験で広く用いられるコドン最適化株は、ヒト細胞に導入されたＧａｇの発現レベルを５００および１０００倍の間で増加させることができる。しかしながら、コドン最適化による発現の実質的な増加は、せいぜい、核単離の問題に間接的に取込むことができる。

ＨＩＶウイルス粒子の組立は、ＧＡＧ−ＰＯＬポリ蛋白質がウイルスＲＮＡをパッケージングする細胞膜において起こる。ウイルス粒子が、今や、ＨＩＶ ＥＮＶおよびｇｐ４１蛋白質を含有する宿主細胞の原形質膜から出芽する。ウイルス粒子の放出の後、ウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）はＧＡＧ−ＰＯＬポリ蛋白質を切断して、成熟および感染性粒子を生起させる。Ｖｉｆはウイルスの組立に関与していると考えられる。また、ＮＥＦおよびＶｐｕは細胞ＣＤ−４蛋白質の分解、および感染した細胞の膜からのウイルスの放出に関与する。Ｖｐｒ蛋白質は組立時にビリオンに取込まれ、感染において初期に役割をするように見え、粒子を核に輸送し、他方、Ｖｉｆは細胞において抗ウイルス細胞酵素活性に拮抗する。放出された感染性ウイルスはさらなる細胞に付着し、それに感染し、進行的感染およびＣＤ−４リンパ球の殺傷の結果、正常に機能しない免疫系をもたらす。

本発明のＩＮＳ配列
遺伝子暗号は縮重しているゆえに、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドレベルにおいて相互から異なる可能性があるが、同一蛋白質またはペプチドをコードすることができる。しかしながら、天然においては、しばしば、特定のコドン用法およびＡＴ／ＧＣ含有量についての選択的圧力がある。また、ヌクレオチド配列によってコードされる蛋白質においてアミノ酸の頻度および順序に対して選択的圧力がある。これらの選択圧の各々について正規化され、次いで、ゲノムにおいて予測される配列モチーフ（例えば、長さが２〜８ヌクレオチドの配列モチーフ）の平均頻度を計算し、これをこれらのモチーフの現実の頻度と比較する方法が開発されている。この方法は、その内容を本明細書に引用して援用する、同時係属仮特許出願第６０／８０８，４２０号に、およびＲｏｂｉｎｓら（２００５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８７，ｐ．８３７０−７４に記載されている。これらの内容は本明細書に引用して援用する。この方法を用いて、ゲノムにおいて過剰および／または過少発現された（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）オリゴヌクレオチド配列モチーフのリフトを生じさせることができる。このような過剰および／または過少発現された配列は機能的情報を含有することができる。

本発明においては、Ｒｏｂｉｎｓらの方法を用いて、ＨＩＶ−１およびヒトゲノムにおけるこのような過剰および過少発現された配列モチーフを探索した。配列モチーフＡＧＧは、ＨＩＶゲノムにおいては過剰発現され、相当するヒト遺伝子においては過少発現されることが見出された。例えば、図１はＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子において同定された４８のＡＧＧモチーフを示す。ｇａｇ遺伝子において同定されたＡＧＧモチーフの２／３を超えるものが、アミノ酸をコードするリーディングフレームにはなく、これは、これらの配列がアミノ酸／蛋白質レベルにおける選択のため、保存されていないことを示す。第三のコドンの位置の変化は異なるＨＩＶ単離体で共通しているが、ＡＧＧモチーフもまたコドンの第三の位置においてさえ特に保存されていることも見出された。さらに、ＡＧＧモチーフは、分析された４００を超えるＨＩＶ−１株において、また、ＨＩＶ−２において、およびＦＩＶ、ＳＩＶ、およびＥＩＡＶを含めた他のレンチウイルスにおいて保存されていることが見出された。

ＡＧＧは配列モチーフのような本発明のＩＮＳ配列は、多くの異なるタイプのウイルス
のゲノムにおいて存在することが可能である。一つの具体例において、本発明は、限定されるものではないが、アデノウイルス、アルファモウイルス、アレキシウイルス、アロレビウイルス、アルファクリプトウイルス、アルファリポトリクスウイルス、アルファノドアウイルス、アルファパピローマウイルス、アルファレトロウイルス、アルファウイルス、アンドウイルス、アンペロウイルス、アフソウイルス、アクアビルナウイルス、アクアレオウイルス、アレナウイルス、アルテリウイルス、アスコウイルス、アスフィウイルス、アタデノウイルス、オーレウスウイルス、アバストロウイルス、アベナウイルス、アビアドノウイルス、アビビルナウイルス、アビヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、アブラウイルス、バブウイルス、バドナウイルス、バルナウイルス、ブデッルロミクロウイルス、ベゴモウイルス、ベータクリプトウイルス、ベータリポトリクスウイルス、ベータノドウイルス、ベータパピローマウイルス、ベータレトロウイルス、ベータテトラウイルス、ボカウイルス、ボルナウイルス、ブラコウイルス、ブレビデンソウイルス、ブロモウイルス、ビモウイルス、カピロウイルス、カプリポックスウイルス、カルディオウイルス、カルラウイルス、カルモウイルス、カウリモウイルス、カベモウイルス、クラミジアミクロウイルス、クロロウイルス、クロリリドウイルス、クリソウイルス、シルコウイルス、クロステロウイルス、コッコリトウイルス、コルチウイルス、コモウイルス、コロナウイルス、コルチコウイルス、クリパウイルス、ククモウイルス、クルトウイルス、シポウイルス、シストウイルス、サイトメガロウイルス、サイトラブドウイルス、ダイントウイルス、デルタパピローマウイルス、デルタレトロウイルス、デンソウイルス、デペンドウイルス、エボラウイルス、エナモウイルス、エンテロウイルス、エントモビルナウイルス、エントモポックスウイルスＡ、エントモポックスウルスＢ、エントモポックスウイルスＣ、エフェメロウイルス、イプシロンパピローマウイルス、イプシロンレトロウイルス、エルボウイルス、エランチウイルス、エリスロウイルス、エタパピローマウイルス、ファバウイルス、フィジウイルス、フラビウイルス、フォベアウイルス、フセロウイルス、ガンマリポトリクスウイルス、ガンマパピローマウイルス、ガンマレトロウイルス、ジャルディアウイルス、グラヌロウイルス、グッタウイルス、ジロウイルス、ハンタウイルス、ヘミウイルス、ヘニパウイルス、ヘパシウイルス、ヘパドナウイルス、ヘパトウイルス、ヒポウイルス、イクノウイルス、イクタルリウイルス、イドノレオウイルス、イラルウイルス、イルトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、イノウイルス、イオタパピローマウイルス、イポモウイルス、イリドウイルス、イサウイルス、イテラウイルス、カッパパピローマウイルス、コブウイルス、ラゴウイルス、ラムダパピローマウイルス、レイシュマニアウイルス、レンチウイルス、レポリポックスウイルス、レビウイルス、ルテオウイルス、リンフォクリプトウイルス、リンフォシスチウイルス、リサウイルス、マクロモウイルス、マクルラウイルス、マキュラウイルス、ママストロウイルス、マンダリウイルス、マラフィウイルス、マルブルグウイルス、マルジウイルス、マルナウイルス、マスタデノウイルス、マストレウイルス、メガロシトウイルス、メタニューモウイルス、メタウイルス、ミクロウイルス、マイトウイルス、モルシポックスウイルス、モルビリウイルス、ムパピローマウイルス、ムロメガロウイルス、マイコレオウイルス、ナイロウイルス、ナノウイルス、ナルナウイルス、ネクロウイルス、ネポウイルス、ノロウイルス、ノビルハブドウイルス、ヌクレオポリヘドロウイルス、ヌクレオハブドウイルス、ヌパピローマウイルス、オカウイルス、オレアウイルス、オメガテトラウイルス、オミクロンパピローマウイルス、オルビウイルス、オルトブンニアウイルス、オルトヘパドナウイルス、オルトポックスウイルス、オルトレオウイルス、オリザウイルス、パニコウイルス、パラポックスウイルス、パレコウイルス、パルチチウイルス、パルボウイルス、ペフデンソウイルス、ペスチウイルス、ペツウイルス、ファエオウイルス、フレボウイルス、ファイトレオウイルス、ピパピローマウイルス、プラスマウイルス、プレクトロビ、ニューモウイルス、ポレロウイルス、ポリオーマウイルス、ポッテクスウイルス、ポチウイルス、プラシノウイルス、プリムネシオウイルス、シュードウイルス、ラナウイルス、ラフィドウイルス、レスピロウイルス、ラジノウイルス、リノウイルス、ロセオロウイルス、ロタウイルス、ルビウイルス、ルブラウイルス
、ルディウイルス、リモウイルス、サポウイルス、セアドルナウイルス、セキウイルス、シアデノウイルス、シンプレックスウイルス、ソイモウイルス、スピロミクロウイルス、スプマウイルス、スイポックスウイルス、テクチウイルス、テショウイルス、テタパピローマウイルス、トゴトウイルス、トンブスウイルス、トポクウイルス、トロウイルス、トスポウイルス、トチウイルス、トリコウイルス、トリチモウイルス、ツングロウイルス、ティモウイルス、バリセロウイルス、ベシキュロウイルス、ベシウイルス、ビチウイルス、ワイカウイルス、ウィスポウイルス、キシパピローマウイルス、ヤタポックスウイルス、ゼータパピローマウイルス科のウイルスを含めたいずれのウイルス科のゲノムにおけるＩＮＳ配列にも向けられる。

別の具体例において、本発明は、レトロウイルス科のウイルスのゲノムにおけるＩＮＦ配列に向けられる。このようなウイルスの例は、限定されるものではないが、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプマウイルス、およびレンチウイルス属のウイルスを含む。

さらなる具体例において、本発明は、レンチウイルスのゲノムにおけるＩＮＳ配列に向けられる。このようなレンチウイルスの例は、限定されるものではないが、ウシ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ビスナ／マエジウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。

ＡＧＧモチーフの過剰発現、およびレンチウイルス科を横切ってのその保存は、それが機能的に重要であることを示唆する。ＡＧＧ配列モチーフはＩＮＳ配列であってよく、それを保有するウイルスに対して阻害効果を有することができる。例えば、本発明のＡＧＧモチーフは、限定されるものではないが、ウイルスＲＮＡの低い定常状態レベル、ウイルスの遅い代謝回転、および恐らくは潜伏の維持を含めた、ＩＮＳ配列に一般的に帰される阻害効果のいずれかおよび全てに関与し得る。

ＡＧＧモチーフの発見は、ワクチン生産、組換えウイルス蛋白質の生産、新しい薬物の同定のための、およびとりわけウイルス潜伏を研究するための新しい機会を提供する。

一つの具体例において、本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異された、例えば、ＨＩＶ核酸のようなレンチウイルスまたはウイルス核酸に向けられる。別の具体例において、本発明は、このような突然変異を作成する方法に向けられる。このような突然変異は、コーディングおよび非コーディング領域を含めた、レンチウイルスまたはウイルスのゲノム中のどこかで作成されてよい。例えば、一つの具体例において、突然変異はレンチウイルスゲノムのｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖ遺伝子中にあってよい。このような突然変異はレンチウイルスまたはウイルスに由来するいずれの核酸中でなされていてもよい。本発明は、非ＡＧＧ配列に対して１以上のＡＧＧ配列を変化させるように突然変異されたレンチウイルスまたはウイルスに由来するいずれかの、および全ての核酸、および核酸がウイルス、ワクチン株、プラスミド、発現ベクター内に存在するか否かに関わらず、遊離核酸分子、またはその他としてこのような突然変異を作成するいずれかの、および全ての方法を含む。

本発明のＡＧＧモチーフは、ＡＧＧモチーフ中の１以上のヌクレオチドをもう１つのヌクレオチドで置換することによって、いずれかの非ＡＧＧ配列に突然変異されてもよい。例えば、ＡＧＧモチーフ中の第一のヌクレオチドはＡからＧ、Ｔ、Ｃ、Ｕ、あるいはいずれかの他の天然に生じるまたは合成ヌクレオチドに突然変異されていてもよい。ＡＧＧモ
チーフ中の第二のヌクレオチドは、ＧからＡ、Ｔ、Ｃ、Ｕ、またはいずれかの他の天然に生じるまたは合成ヌクレオチドに突然変異していてもよい。ＡＧＧモチーフにおける第三のヌクレオチドは、ＧからＡ、Ｔ、Ｃ、Ｕ、またはいずれかの他の天然に生じるまたは合成ヌクレオチドに突然変異されていてもよい。ＡＧＧモチーフのいずれの１つの位置が変化されていてもよく、あるいはＡＧＧモチーフの多数の位置が変化されていてもよい。例えば、ＡＧＧモチーフ中のいずれかのヌクレオチド位置１、２または３が変化されていてよい（ここで、位置１は元来Ａであった位置であり、位置２は元来Ｇであった位置、および位置３は元来第二のＧであった蛋白質である）。さらに、ＡＧＧモチーフのいずれの２つの位置は前記したように変化されてよく、あるいはＡＧＧモチーフの全ての３つの位置は前記したように変化されてもよい。非ＡＧＧ配列へのＡＧＧモチーフの突然変異は、ＡＧＧモチーフを分裂するための１以上のヌクレオチドの挿入、または他のヌクレオチドの代わりにそれらで置換することのないＡＧＧからの１以上のヌクレオチドの欠失のような他のタイプの突然変異も含む。

変化させるべきＡＧＧモチーフはいずれのレンチウイルス、ウイルス、レンチウイルス誘導またはウイルス誘導核酸におけるいずれかの場所に、例えば、コーディングまたは非コーディング領域に位置させてもよい。ＡＧＧモチーフがコーディング領域に位置する具体例において、ＡＧＧモチーフは、核酸によってコードされたアミノ酸を変化させない配列に変化させることができる。例えば、ＡＧＧモチーフは単一コドンを構成し、かくして、アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ）をコードする場合、モチーフはその各々もまたアルギニンをコードする、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＵ、またはＣＧＴいずれかに変化させることができる。ＡＧＧモチーフはコーディング領域における２つのコドンにわたることができる。かかる場合、ＡＧＧモチーフは、ＡＧＧモチーフによってスパンされる２つのコドンのいずれかによってコードされたアミノ酸を変化させる必要がない配列に変化されるのはやはり可能である。当業者であれば、遺伝子コード、またはＲＮＡまたはＤＮＡコドンの表を参照することによって、コードされたアミノ酸を変化させることなくＡＧＧモチーフ内のヌクレオチド位置の１以上をどのようにして変化させるかを容易に決定することができる。

いくつかの具体例において、ＡＧＧモチーフは、コードされたアミノ酸に影響する非ＡＧＧトリヌクレオチドに変化させてもよい。このような突然変異の結果、コードされる１以上の異なるアミノ酸がもたらされ得るか、あるいは欠失され、またはアミノ酸配列に付加される１以上のアミノ酸がもたらされ得る。もしＡＧＧモチーフが、コードされるアミノ酸に影響する非ＡＧＧトリヌクレオチドに変化するならば、コードされた蛋白質の構造、機能または免疫原性に悪影響しない１以上のアミノ酸の変化をなすことが可能である。例えば、突然変異体核酸によってコードされる突然変異体蛋白質は、野生型蛋白質と実質的に同一の構造および／または機能および／または免疫原性を有することができる。いくつかのアミノ酸変化は増大された免疫原性に導くことができる可能性があり、当業者であれば、いつこのような修飾が適切であるかを認識するであろう。

ＡＧＧモチーフの非ＡＧＧモチーフへの突然変異は、限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、陽性構成物質選択方法、特有の制限部位排除（ＵＳＥ）、デオキシウリジン取込、ホスホロチオエート取込み、およびＰＣＲベースの突然変異誘発方法を含めた、当該分野で知られたいずれの適当な突然変異誘発方法によってなされてもよい。このような方法の詳細は、例えば、Ｌｅｗｉｓら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、ｐ３４３９、Ｂｏｈｎｓａｃｋら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７、ｐ１、Ｖａｖｒａら（１９９６）Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ ５８、３０、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ＃ＴＭ００１、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｎｇら．（１
９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００、ｐ８１、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、ｐ４８８、Ｋｕｎｋｅら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、ｐ３６７、Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、ｐ８７６４、Ｎａｋａｍａｙｅら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４、ｐ９６７９、Ｈｉｇｕｃｈｉら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、ｐ７３５１、Ｓｈｉｍａｄａら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７、ｐ１５７、Ｈｏら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７、ｐ５１、Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７、ｐ６１、およびＳａｒｋａｒら（１９９０）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８、ｐ４０４に見出すことができる。Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ Ｉｎｃ．からのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット、およびＰｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．からのＡｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩイン・ビトロ突然変異誘発系のような、部位特異的突然変異誘発を行うための多数のキットは商業的に入手可能である。このような商業的に入手可能なキットを用いて、ＡＣＧモチーフを非ＡＧＧ配列に突然変異させるのに用いることもできる。

ワクチン
本発明の方法および組成物は、ワクチンの生産で特に有用であろう。長期間の間、細胞内にとどまるそれらの能力とカップリングさせた、感染サイクルの間に生じるウイルス粒子の低い量は、ＨＩＶのようなレンチウイルスの免疫系への曝露を制限する。この特性はウイルスにとって有利であるが、効果的なワクチンを生じさせる能力に悪影響を及ぼす。例えば、宿主細胞において感染し、複製するように設計されたウイルスワクチンは低レベルの子孫を生じさせることができ、長期間の、宿主細胞において「隠された」ままであってよい。結果として、このようなワクチンは、免疫応答および免疫学的記憶を効果的にトリガーできなくてもよい。同様に、１以上のレンチまたはウイルス抗原をコードするＤＮＡワクチンは宿主において低レベルの抗原を発現するようであり、今度は、免疫応答および免疫学的記憶を生じさせるにおけるＤＮＡワクチンの有効性を制限する。

本発明のＡＧＧモチーフの発見は、より少数のＡＧＧモチーフを有し、従って、ウイルスＲＮＡの増大した定常状態レベル、ウイルスにコードされた蛋白質の増大した発現、増大した感染サイクル、および免疫系への増大した曝露を有する突然変異体ウイルスの生成の可能性を高める。このような突然変異体ウイルスはウイルスワクチンとして有用であろう。このような突然変異体ウイルスを含む、またはそれに由来するワクチンを以下により詳細に記載する。また、本発明のＡＧＧモチーフの発見は、そうでなければ当てはまる場合よりは、より高い率にておよび／またはより大きな量で、ウイルスによりコードされた蛋白質を生産する突然変異体ウイルス核酸配列を生じる可能性を高める。このような突然変異体核酸は、後により詳細に記載するように、ＤＮＡワクチンとして有用であり得る。さらに、このような突然変異体核酸は、蛋白質ワクチンで用いるウイルス蛋白質の生産のためにやはり有用であり得る。このような蛋白質を含む、またはそれより誘導されるワクチンもまた、後により詳細に記載する。

本発明は、予防／予防的ワクチンおよび治療ワクチンを共に含む。予防ワクチンは、ワクチンがそれに対して生産されるように設計された病気に感染していない対象に投与されるものである。理想的な予防的ワクチンは、ウイルスが、ワクチン接種された対象において感染を確立するのを妨げる、すなわち、それは完全な保護的免疫性を供する。しかしながら、たとえそれが完全な保護的免疫性を供しなくても、予防ワクチンは、依然として、いくらかの保護を対象に与えることができる。例えば、予防ワクチンは病気の兆候、重症度、および／または持続期間を減少させることができる。ＨＩＶの場合には、予防ワクチンは、たとえ完全な保護的免疫性を供するのに十分でなくても、末期のＡＩＤＳへの進行を妨げ、または遅延させることができる。治療ワクチンは、そのウイルスに既に感染した対象においてそのウイルス感染のインパクトを低下させるために投与される。治療ワクチ
ンは、病気の兆候、重症度、および／または持続期間を減少させることができる。ＨＩＶの場合には、治療ワクチンの投与は、末期ＡＩＤＳへの進行を妨げ、または遅延させることができる。

本発明は、突然変異したＡＧＧモチーフを有する核酸を含む、または突然変異したＡＧＧモチーフを有する核酸から生産されたいずれかのおよび全てのタイプのワクチンを含む。いくつかの異なるタイプのワクチンは本明細書中に記載される。しかしながら、当業者であれば、使用することができる他のタイプのワクチン、およびワクチンを生産するための他の方法があることを認識するであろう。本発明は、示された特定のタイプのワクチンに限定されない。その代わり、それは、突然変異したＡＧＧモチーフを有する核酸を含む、または突然変異したＡＧＧモチーフを有する核酸から生産されたいずれかのおよび全てのワクチンを含む。

本発明は、「ウイルスワクチン」を含む。用語「ウイルスワクチン」は、本明細書中で用いるように、減弱化ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチンおよびウイルスベクターワクチンを含む。本発明は、その各々を後に記載する、ＤＮＡワクチンおよび蛋白質性または「サブユニット」ワクチンも含む。種々のタイプのワクチンの中にはかなりの重複があることに注意すべきである。例えば、ウイルスワクチンは、ＤＮＡワクチンを作成するのに用いられるのと同一、または同様な核酸を含むことができる。同様に、ＤＮＡワクチンおよびウイルスワクチンは、蛋白質性ワクチンを作成するために用いられるのと同一、または同様な蛋白質を発現させることができる。かくして、後にいずれかの１つのタイプのワクチンについて掲げられる記載は、そのワクチンタイプのみについて有用であると解釈されるべきではない。その代わり、いずれか１つのタイプのワクチンに関する記載の全てを用い、相互交換的に、本発明によって含まれるいずれかのおよび全てのタイプのワクチンに適用することができる。

一つの態様において、本発明は、配列番号：１を含む本発明のレンチウイルスを含めたウイルスに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物を提供する。一つの具体例において、免疫原性組成物は、レンチウイルスまたはウイルス感染の兆候を緩和でき、および／またはレンチウイルスまたはウイルス感染の持続期間を低下させることができる。別の具体例において、免疫原性組成物は、ウイルス感染に対する保護的免疫性を誘導することができる。本発明の免疫原性組成物は、本明細書中に開示されるレンチウイルスに対して効果的であり得、レンチウイルスの多数の異なるクレードおよび株に対して、および他のウイルスに対して交差反応性であり、およびそれに対して効果的でもあり得る。ウイルスワクチン
Ａ）減弱化ウイルスワクチン
一つの具体例において、本発明は、突然変異した１以上のＡＧＧ配列を有する減弱化ウイルスワクチンを提供する。減弱化されたウイルスは、それらがもはや病気を引き起こさないが、依然として、免疫応答を刺激できるように、それらを弱めるように改変されたウイルスである。ウイルスを減弱化することができる多くの方法がある。例えば、ウイルスは、免疫系によって認識される抗原をコードする配列を無傷のままとして、病気を引き起こすのに必要なウイルス配列の除去または破壊によって減弱化することができる。減弱化されたウイルスは、宿主細胞中で複製できてもできなくてもよい。複製できる減弱化ウイルスが有用である。なぜならば、ウイルスは対象への投与の後にイン・ビボで増幅され、かくして、免疫応答を刺激するのに入手できる免疫原の量を増加させるからである。

本発明によると、適当な減弱化ウイルス株を入手し、または生じさせることができ、あるいは減弱化ウイルス株におけるＡＧＧ配列の１以上を非ＡＧＧ配列に突然変異させることができる。いくつかの減弱化された生ウイルスワクチンは、レンチウイルスまたはウイルス感染に対して保護するのに有用であることが示された。例えば、生減弱化サル免疫不
全ウイルス（ＳＩＶ）は、ＳＩＶでの挑戦に対して霊長類を保護するのに用いられてきた。例えば、Ｄａｎｉｅｌら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＳＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｆ ｇｅｎｅ」（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８、ｐ１９３８、Ａｌｍｏｎｄら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ」（１９９５）Ｌａｎｃｅｔ ３４５、ｐ１３４２参照。これらの文献に開示された減弱化の方法および減弱化されたウイルス株は、本発明と組合せて用いてもよい。減弱化の他の方法は、Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ」（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、ｐ１４３１）およびＧｕａｎら（「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｌ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｅｔｅｄ」（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５、ｐ４０５６）によって記載されている。ＳＩＶはＨＩＶに対する共通して用いられるモデルであり、ＳＩＶで有用な減弱化方法はＨＩＶに対しても有用であり得ることに注意すべきである。公開された国際公開特許第２００１／００７６３７号は、テトラサイクリンアナログの存在下においてのみ複製するように修飾された生減弱化ＨＩＶワクチンを記載する。種々の他の生減弱化ＨＩＶ株が開発されており、例えば、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびＮｅｆ応答性エレメントまたはＮＲＥ遺伝子を欠如するＨＩＶ−１である「デルタ４」、およびデルタ４ワクチン株に基づくが、ＮＦｋＢ結合エレメントをコードする遺伝子においてさらに欠失を有する「デルタｋＵＲＮ」がある。また、どのようにして生減弱化ＨＩＶワクチンを生じさせることができるかを記載するいくつかの論文がある。例えば、Ｍｉｌｌｓら「Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＨＩＶ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」（２０００）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １６，ｐ１４５３参照。減弱化のためのいずれかのこのような方法は、本発明に従って用いることができる。もし用いる減弱化方法がウイルスゲノム内の、またはウイルス核酸内の欠失を含むならば、これらの突然変異を、偶然の復帰を低下させるのに十分な大きさとすることができる。例えば、もしこのような方法を用いるならば、２０塩基以上を欠失させることができる。

Ｂ）殺傷されたウイルスのワクチン
別の具体例において、本発明は、突然変異された１以上のＡＧＧ配列を有する「殺傷された」または「不活化された」ウイルスワクチンを提供する。このようなワクチンは、一般には、非機能的であり、かくして、ウイルス遺伝子を発現せず、またはワクチン接種された対象において複製しない。しかしながら、本発明の方法を用いて、ウイルスの不活化に先立って、イン・ビトロまたはエクス・ビボでウイルスの拡大および成長を容易とすることができる。例えば、ウイルス中の１以上のＡＧＧモチーフを非ＡＧＧ配列に突然変異することによって、ウイルス拡大の速度は、より多量のウイルスを生産でき、次いで、ワクチンとして使用するために不活化できるように増加させることができる。

当該分野で知られる不活化のいずれの適当な方法を用いても、化学的、熱的または物理的不活化、または電離放射線の照射による不活化のような、本発明の突然変異体ウイルスを不活化することができる。例えば、Ｉｌｙｉｎｓｋｉｉらは、気体を利用して、ウイルスの構造を、その三次構造および可能な免疫原性を含むことなく、それを非感染性とするように破壊し／損傷させるＨＩＶに対する物理的不活化方法を開発した（Ｉｌｙｉｎｓｋｉｉら「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＩＶ Ｖａ
ｃｃｉｎｅ」（２００１）ＡＩＤＳ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｅｐ ５−８、要旨ｎｏ．１９２参照）。他の者は、その免疫原性を保有しつつ、０．２％ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いて化学的にＨＩＶウイルスを不活化する方法を開発している（Ａｄｄａｗｅら「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ＨＩＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ」（１９９６）Ｉｎｔ Ｃｏｎｆ ＡＩＤＳ Ｊｕｌ ７−１２、１１：４、要旨ｎｏ．Ｍｏ．Ａ．１００参照）。全不活化ＨＩＶワクチンもまたヒト試験でテストされてきた。例えば、化学的処理および照射の組合せによって不活化された（「ＨＩＶ−１免疫原」、「Ｓａｌｋワクチン」、または「ＡＧ１６６１」としても知られる）治療ワクチンＲｅｍｕｎｅ（登録商標）は、ＨＩＶ感染患者において免疫療法として研究されてきた（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｒｕｚら「５−ｙｅａｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ（ＨＩＶ−１ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ＨＩＶ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ＨＩＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｈａｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ」（２００３）Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＩＤＳ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＨＩＶ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｐａｒｉｓ、要旨４８６参照）。本発明の方法は、前記した不活化方法のいずれか、または当該分野で知られる他のウイルス不活化方法と組合せて用いることができる。

Ｃ）ウイルスベクターワクチン
１以上のＡＧＧ配列を非ＡＧＧ配列に変化させるように突然変異された本発明のレンチウイルスまたはウイルス核酸配列もまた、対象への投与に適したウイルスベクターに組込むこともできる。レンチウイルスまたはウイルス核酸は、限定されるものではないが、ＧＡＧ、ｐ１７ＭＡ、ｐ２４ＣＡ、ｐ７およびｐ６、ＧＡＧ−ＰＯＬ、ＲＴ、ＲＮＡａｓｅ
Ｈ、ＰＲ、ＩＮ、Ｇｐ１６０、Ｇｐ１２０ＥＮＶ、Ｇｐ４１、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、ＶｐｒおよびＮｅｆ、およびその断片、変種、ホモログおよび誘導体を含めたいずれのレンチウイルスまたはウイルス蛋白質もコードすることができる。適当なウイルスベクターの例は、限定されるものではないが、（修飾されたワクシニアウイルスＡｎｋａｒａまたは「ＭＶＡ」、天然痘ワクチンで用いるワクシニアのかなり減弱化された株のような）ワクシニアウイルス、レトロウイルス、（カナリア痘、牛痘、および鶏痘を含めた）ポックスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスを含む。これらのウイルスベクターは、それらの天然ウイルスカウンターパートと比較して改変することができ、例えば、それらは減弱化されており、および／または非複製的であってよい。

当業者であれば、適当なウイルスベクターを容易に選択し、本発明の突然変異体核酸をこのようなベクターに挿入することができる。突然変異体核酸は、ワクチン接種した対象におけるレンチウイルスまたはウイルス蛋白質の発現を指令するために適当なプロモータの制御下とすべきである。ウイルスベクターに既に存在するプロモータを用いてもよい。別法として、外因性プロモータを用いてもよい。適当なプロモータの例は、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、ＨＩＶ長い末端反復（ＨＩＶ−ＬＴＲ）、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲ（ＨＴＬＶ−ＬＴＲ）および単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモータを含む。

本発明の核酸配列をウイルス発現ベクターに挿入するのに用いることができる技術は、当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）参照。

本発明の方法は、当該分野で知られたいずれのタイプのウイルスベクターワクチンと組合せて用いてもよく、またはそれに対する改良と組み合わせて用いてもよい。現在開発中のＨＩＶウイルスベクターワクチンの例は、ＨＩＶクレードＢ ＧＡＧ−ＰＯＬ Ｎｅｆを含有するＭｅｒｃｋの非複製アデノウイルスベクター、クレードＢ Ｅｎｖ、ＧＡＧ、Ｐｒｏ、ＲＴ、およびＮｅｆを含有するＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒのカナリア痘ベクター、およびクレードＢ ＥｎｖおよびＧＡＧを含有するＴｈｅｒｉｏｎのＭＶＡベクターを含む。現在開発中のこれらのおよび他のＨＩＶワクチンの詳細は、ｗｗｗ．ｈｖｔｎ．ｏｒｇ．のＨＩＶワクチン試験ネットワークによって提供される。本発明の方法は、レンチウイルスまたはウイルス核酸成分内の阻害性ＡＧＧモチーフを非ＡＧＧ配列に突然変異することによって、これらのようなウイルスベクターワクチンの効率を改善するのに用いることができ、今度は、ワクチン接種された対象におけるレンチウイルスまたはウイルス蛋白質の改良された発現に導く。

ＤＮＡワクチン
本発明は、対象への投与に適したＤＮＡワクチンも含む。１以上のＡＧＧ配列を、いずれかのレンチウイルスまたはウイルス蛋白質、あるいはその部分、断片、誘導体またはホモログをコードする非ＡＧＧ配列へ変化させるレンチウイルスまたはウイルス核酸をＤＮＡプラスミドまたは発現ベクターに挿入して、本発明に従ってＤＮＡワクチンを作成することができる。例えば、一つの具体例において、ＤＮＡワクチンは、１以上のＡＧＧ配列を、ＧＡＧ、ｐ１７ＭＡ、ｐ２４ＣＡ、ｐ７およびｐ６、ＧＡＧ−ＰＯＬ、ＲＴ、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＰＲ、ＩＮ、Ｇｐ１６０、Ｇｐ１２０ＥＮＶ、Ｇｐ４１、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、ＶｐｒおよびＮｅｆ、およびその断片、変種、ホモログおよび誘導体よりなる群から選択される蛋白質をコードする非ＡＧＧ配列に変化させるために１以上のレンチウイルスまたはウイルス核酸を含有するプラスミドを含む。

当業者であれば、適当なＤＮＡプラスミドまたは発現ベクターを容易に選択し、本発明の突然変異体核酸をこのようなプラスミドまたは発現ベクターに挿入することができる。レンチウイルスまたはウイルス蛋白質をコードする核酸は、ワクチン接種された対象において、１以上のＡＧＧ配列を非ＡＧＧ配列に変化させるための核酸の発現を指令する適当なプロモータの制御下とすべきである。発現ベクターに既に存在するプロモータを用いることができる。別法として、外因性プロモータを用いてもよい。適当なプロモータの例は、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、ＨＩＶ長い末端反復（ＨＩＶ−ＬＴＲ）、ＨＴＬＶ−１
ＬＴＲ（ＨＴＬＶ−ＬＴＲ）および単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモータを含む。

本発明の核酸配列をＤＮＡプラスミドおよび発現ベクターに挿入するのに用いることができる技術は当業者によく知られている。例えば、用いることができる標準的な組換えＤＮＡ技術はＳａｍｂｒｏｏｋに記載されている。

本発明の方法は、当該分野で知られたいずれかのタイプのレンチウイルスまたはウイルスＤＮＡワクチンと組合せて、またはそれに対する改良として用いることができる。現在開発中のＤＮＡワクチンの例は、クレードＢ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、およびクレードＡ、Ｂ、およびＣ、Ｅｎｖを含有するＮＩＨ ＤＮＡプラスミド、クレードＢ ＧａｇおよびＥｎｖを含有するＣｈｉｒｏｎのＤＮＡプラスミド、およびクレードＢ Ｇａｇを含有するＤＮＡプラスミドであるＧＥＮＥＶＡＸを含む。現在開発中のこれらおよび他のＨＩＶワクチンの詳細は、ｗｗｗ．ｈｖｔｎ．ｏｒｇのＨＩＶワクチン試験ネットワーク（ＨＶＴＮ）によって提供される。本発明の方法は、レンチウイルスまたはウイルス核酸成分内の阻害性ＡＧＧモチーフを非ＡＧＧ配列に突然変異させることによって、これらのよ
うなワクチンの効率を改良することができ、今度は、ワクチン接種された対象におけるレンチウイルスまたはウイルス蛋白質の改良された発現に導く。

蛋白質ワクチン
本発明は、蛋白質性ワクチンも含む。いずれのレンチウイルスまたはウイルス蛋白質、またはその断片、誘導体、変種またはホモログを用いて、本発明に従って、蛋白質性ワクチンを作成することもできる。例えば、一つの具体例において、本発明の方法によって修飾されるべき選択されたレンチウイルスまたはウイルス核酸は、ＧＡＧ、ｐ１７ＭＡ、ｐ２４ＣＡ、ｐ７およびｐ６、ＧＡＧ−ＰＯＬ、ＲＴ、ＲＮＡａｓｅ Ｈ、ＰＲ、ＩＮ、Ｇｐ１６０、Ｇｐ１２０ＥＮＶ、Ｇｐ４１、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、ＶｐｒおよびＮｅｆ、およびその断片、変種、ホモログおよび誘導体をコードする核酸よりなる群から選択される。このようなワクチンを生産するために本発明の方法を用いる利点は、１以上のＡＧＧモチーフを非ＡＧＧ配列に突然変異させることによって、生産された蛋白質の量、および／または蛋白質生産速度を実質的に増加させることができることにある。

一つの具体例において、本発明の方法によって修飾されたレンチウイルスまたはウイルス核酸を適当な発現ベクターに組込んで、適当な発現系における蛋白質の発現を可能とする。適当な発現系の例は、限定されるものではないが、培養された哺乳動物、昆虫、細菌、または酵母細胞を含む。レンチウイルスまたはウイルス蛋白質またはペプチドを、次いで、細胞中で発現させ、精製することができる。次いで、精製された蛋白質を、対象への投与に適した組成物に組込むことができる。組換え蛋白質の発現および精製のための方法および技術は当該分野でよく知られており、またこのような適当な方法のいずれも用いることができる。

いずれのプラスミドまたは発現ベクターを用いることもできるが、但し、それは所望の発現系におけるレンチウイルスまたはウイルス蛋白質の発現を指令するためにプロモータを含有するものとする。例えば、もし蛋白質を細菌細胞において生産すべきであれば、細菌において発現を指令できるプロモータを用いるべきであり、もし蛋白質を哺乳動物細胞において生産すべき場合、哺乳動物細胞において発現を指令できるプロモータを用いるべきであり、もし蛋白質を昆虫細胞において生産すべき場合、昆虫細胞において発現を指令できるプロモータを用いるべきであり、もし蛋白質を酵母において発現すべき場合、酵母において発現を指令できるプロモータを用いるべきである。別の具体例において、蛋白質は、哺乳動物プロモータからの哺乳動物発現系において発現させる。適当なプロモータは、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、ＨＩＶ長い末端反復（ＨＩＶ−ＬＴＲ）、ＨＴＬＶ−１
ＬＴＲ（ＨＴＬＶ−ＬＴＲ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモータ、およびＳＶ４０ウイルス初期プロモータを含む。適当な発現ベクターは、限定されるものではないが、とりわけ、コスミド、プラスミド、ならびに複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、減弱化ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、レンチウイルスおよびヘルペスウイルスのようなウイルスベクターを含む。適当なプロモータ、および外因性核酸の付加のためのクローニング部位を既に含有する商業的に入手可能な発現ベクターを用いることもできる。

細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞発現系のようないずれの適当な発現系も用いることができる。別の具体例において、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質は、本発明の突然変異体レンチウイルスまたはウイルス核酸で安定にして、または一過的にトランスフェクトされたかのいずれかの哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物細胞において発現される。用いることができる適当な哺乳動物細胞の例は、限定されるものではないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞を含む。本発明の突然変異体核酸を含有するように設計された、
哺乳動物から直接的に得られる一次または二次細胞を発現系として用いることもできる。

当業者であれば、本発明に従って用いる適当な発現系、プロモータおよび発現ベクターを容易に選択することができる。細胞系および発現ベクターの作動可能な組合せの例はＳａｍｂｒｏｏｋに記載されている。本発明の核酸配列を発現ベクターに挿入するのに用いることができる技術は当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。

本発明の方法を、当該分野で知られたいずれのタイプの蛋白質性ワクチンと組合せて、またはその改良として用いることもできる。現在開発中の蛋白質性ワクチンの例はＣｈｉｒｏｎの蛋白質サブユニットクレードＢ Ｅｎｖ、およびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのクレードＢ Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合蛋白質およびクレードＢ Ｅｎｖサブユニットを含む。本発明の方法は、種々の蛋白質サブユニットをコードする核酸内の阻害性ＡＧＧモチーフを非ＡＧＧ配列に突然変異させることによって、これらのようなワクチンの生産の効率を改良するのに用いることができよう。

本発明の免疫原性組成物はサブユニットワクチンを含むことができる。サブユニットワクチンは、１以上のウイルス蛋白質またはサブユニット、またはそれらの蛋白質またはサブユニットの部分をコードする核酸を含有するＤＮＡワクチンのような核酸ワクチンを含む。このようなワクチンを用いる場合、核酸は対象に投与され、核酸によってコードされる免疫原性蛋白質またはペプチドは、蛋白質またはペプチドに対する免疫応答が対象において生じるように対象において発現される。サブユニットワクチンは、ウイルス蛋白質またはサブユニットそれ自体、またはそれらの蛋白質またはサブユニットの部分を含有する蛋白質性ワクチンでもあり得る。本発明のサブユニットワクチンは、対象において免疫原性である、本明細書中に記載されたレンチウイルスまたはウイルス蛋白質またはペプチドのいずれか、またはそのいずれかの部分、断片、誘導体または突然変異体をコードし、または含有することができる。当業者であれば、本明細書中に記載されたレンチウイルスまたはウイルス蛋白質およびペプチドの免疫を容易にテストすることができ、かつサブユニットワクチンに用いるための適当な蛋白質またはペプチドを選択することができる。

ワクチン組成物
本発明のワクチン組成物は、前記したもののような、（減弱化ウイルス、不活化ウイルス、およびウイルスベクターを含めた）少なくとも１つのウイルス、核酸、または蛋白質を含む。組成物は、限定されるものではないが、医薬上許容される担体、緩衝液、安定化剤、（水のような）希釈剤、保存剤、可溶化剤、または免疫変調剤を含めた１以上のさらなる成分を含むこともできる。適当な免疫変調剤は、限定されるものではないが、アジュバント、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、および本発明のワクチンの少なくとも１つの成分の免疫系による認識を容易とする剤を含む。当業者であれば、本発明のワクチン組成物に含める適当な添加剤を容易に選択することができる。

本発明の疎水性化合物のための担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水性相を含む共溶媒系であり得る。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってよい。ＶＰＤは３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００の、無水エタノール中で一定容量までとした溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、水溶液中に５％デキストロースで１：１希釈されたＶＰＤよりなる。この共溶媒系は疎水性化合物を十分溶解させ、それ自体は全身投与に際して低毒性を生じる。当然、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性特徴を破壊することなくかなり変化させることができる。さらに、共溶媒成分の同一性を変化させることができ、例えば、他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ、ポリエチレングリコールの画分サイズ
は変化させることができ、他の生体適合性ポリマーはポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンを置き換えることができ、他の糖または多糖をデキストロースの代わりに置換することができる。別法として、疎水性免疫原性化合物のための他の送達系を使用することもできる。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体のよく知られた例である。ジメチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒を使用することもできるが、通常、より大きな毒性という犠牲を払うものである。加えて、化合物は、治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような徐放系を用いて送達してもよい。種々のタイプの徐放性材料が確立されており、当業者によってよく知られている。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に応じて、数週間から１００日を超えるまで化合物を放出することができる。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、蛋白質または他の有効成分安定化のためのさらなる戦略を使用することができる。

免疫原性組成物は、適当な固体またはゲル相担体または賦形剤を含んでもよい。このような担体または賦形剤の例は、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーを含む。本発明の有効成分の多くは、免疫学的に適合するカウンターイオンを持つ塩として供してもよい。このような免疫学的に許容される塩基付加塩は、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持し、かつ水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基性アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミンなどのような無機または有機塩基との反応によって得られる塩である。

本発明の免疫原性化合物は、蛋白質またはペプチド抗原と共に蛋白質または本発明の他の有効成分の複合体の形態であってもよい。蛋白質および／またはペプチド抗原は、刺激シグナルをＢおよびＴリンパ球の双方に送達するであろう。Ｂリンパ球は、それらの表面免疫グロブリン受容体を介して抗原に応答する。Ｔリンパ球は、ＭＨＣ蛋白質による抗原の提示に続いてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じて抗原に応答する。ＭＨＣ、および宿主細胞上のクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子によってコードされたものを含めた構造的に関連する蛋白質は、ペプチド抗原をＴリンパ球に提示するように働くであろう。抗原成分は、単独で、あるいは直接的にＴ細胞にシグナルを与えることができる共刺激分子と共に、精製されたＭＨＣペプチド複合体として供することもできる。別法として、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンおよび他の分子に結合することができる抗体、ならびにＴ細胞上のＴＣＲおよび他の分子と結合することができる抗体は、本発明の免疫原性組成物と組み合わせることができる。

本発明の免疫原性組成物は、本発明の蛋白質が、他の許容される担体に加えて、水性溶液中で、ミセル、不溶性単層、液晶、またはラメラ層として凝集された形態で存在する脂質のような両親媒性剤と組み合わせられたリポソームの形態とすることができる。リポソーム処方のための適当な脂質は、限定されるものではないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、ホスホ脂質、サポニン、胆汁酸などを含む。このようなリポソーム処方の調製は、その全てを本明細書に引用して援用する、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、および第４，７３７，３２３号に開示されたように、当業者のレベル内のものである。

ワクチン処方で有用な他の添加剤は知られており、当業者に明らかであろう。

有効量
本発明のワクチン組成物の「免疫学的に有効な量」を対照に投与すべきである。本明細書中で用いるように、用語「免疫学的に有効な量」とは、対象において所望の免疫応答を
誘導でき、または該誘導を増強させることができる量をいう。所望の応答は、とりわけ、抗体または細胞媒介免疫応答、または双方の誘導、ウイルス負荷の低下、感染の兆候の改善、兆候の開始の遅延、感染の持続期間の低下などを含むことができる。免疫学的に有効な量は、保護免疫性を誘導するのに十分な量でもあろう。

当業者であれば、過度な実験なくして「免疫学的に有効な量」が何かを容易に決定することができる。例えば、低用量で開始し、次いで、免疫学的効果をモニタリングしつつ用量を増加させ、有効量を慣用的な手段によって決定することができる。対象のサイズ、年齢、および一般的状態、対象における他のワクチン、または薬物の存在、対象にワクチン接種すべき特定のウイルスのビルレンスなどを含めた、多数の因子を、投与するのに最適な量を決定する場合に考慮することができる。実際の用量は、種々の動物実験からの結果を考慮した後に選択することができる。

送達の経路／投与法
本発明のワクチン組成物は、単一用量、複数用量にて、あるいは「プライム・ブースト」法を用いて投与することができる。プライム・ブースト法を用いる場合、本発明のワクチンは「プライミング」剤または「ブースティング」剤または双方として用いてもよい。組成物は、限定されるものではないが、非経口、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、経口、または眼内経路を含めたいずれかの適当な経路によってあるいは経路の組合せによって投与することができる。組成物は、本発明の組成物がその上にコーティングされた、金粒子のような粒子を火炎処理する「ガン」デバイスを用いて、対象の皮膚に投与してもよい。当業者であれば、選択された送達経路に従ってワクチン組成物を処方できるであろう。

ウイルス精製
不活化ウイルスの精製方法は当該分野で知られており、例えば、勾配遠心、超遠心、連続流超遠心、ならびにイオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および液体アフィニティクロマトグラフィのようなクロマトグラフィの１以上を含んでもよい。さらなる精製方法は限外濾過および透析濾過を含む。Ｊ Ｐ Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ「Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｖｉｒｕｓｓｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅｎ ａｕｓ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」Ｃｈａｐｔｅｒ ４．２ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ
Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｏ．Ｋａｙｓｅｒ ａｎｄ Ｒ Ｈ Ｍｕｅｌｌｅｒ）Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、２０００参照。また、Ｏ’Ｎｅｉｌら、「Ｖｉｒｕｓ Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂａｓｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１１：１７３−１７７、Ｐｒｉｏｒら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ
Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＩＶ−１」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）３０−５２、およびＭａｊｈｄｉら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｅｌｋ Ｃａｌｖｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｒｒｈｅａ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）３５（１１）：２９３７−２９４２参照。

本発明で用いるのに適した精製方法の他の例はポリエチレングリコールまたは硫酸アンモニウム沈殿（Ｔｒｅｐａｎｉｅｒら、「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｏｒ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８１）３（４）：２０１−２１１、Ｈａｇｅｎら、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ＶＡＱＴＡ，ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（１９９６）１２：４０６−４１２、およびＣａｒｌｓｓｏｎら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ ｂｙ
Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ
ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４）４７：２７−３６参照）ならびに限外濾過およびミクロ濾過（Ｐａｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）６０：１７１−１７４、Ｔｓｕｒｕｍｉら「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ
ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｕｐｒａｍｍｏｎｉｕｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｒｅ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＢＭＭ ｈｏｌｌｏｗ
ｆｉｂｒｅ）ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｒｅｍｏｖａｌ」Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９０）２２（１２）：１０８５−１１００、およびＭａｋｉｎｏら、「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｒｅ，ＢＭＭ」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）１３９（１−２）：８７−９６参照）を含む。

ウイルスは、イオン交換クロマトグラフィのようなクロマトグラフィを用いて精製することができる。色精製は、大容量のウイルス含有懸濁液の生成を可能とする。注目するウイルス産物は単純な吸着／脱着メカニズムによって色媒体と相互作用することができ、および大容量の試料を単一の負荷で処理することができる。吸着剤に対して親和性を有しない汚染物はカラムを通過する。次いで、ウイルス物質を濃縮された形態で溶出することができる。

用いることができるアニオン交換樹脂はＤＥＡＥ，ＥＭＤ ＴＭＡＥを含む。カチオン交換樹脂は、スルホン酸修飾表面を含むことができる。ウイルスは、第一工程のための強力なアニオン交換樹脂（例えば、ＥＭＤ ＴＭＡＥ）および第二工程のためのＥＭＤ−ＳＯ．ｓｕｂ．３（カチオン交換樹脂）を含むイオン交換クロマトグラフィを用いて精製することができる。金属結合アフィニティクロマトグラフィ工程を、所望により、他の精製のために含めることができる（例えば、国際公開特許第９７／０６２４３号参照）。

Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ．ＴＭ．ＥＭＤのような樹脂を用いることもできる。この合成メタクリレート系樹脂は、共有結合された長い線状ポリマー鎖（いわゆる「テンタクル」）を有する。この「テンタクル化学」は、大量の立体的に接近可能なリガンドが、いずれの立体障害もなくして生体分子に結合することを可能とする。

カラムベースの液体アフィニティクロマトグラフィは、本発明で用いることができるもう１つの精製方法である。精製方法で用いる樹脂の１つの例はＭａｔｒｅｘ．ＴＭ．Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ．ＴＭ．Ｓｕｌｆａｔｅ（ＭＣＳ）である。ＭＣＳはセルロースの６−位置上の低濃度のスルフェートエステル官能性を持つ、３，０００ダルトン排除制限（そのポア構造はマクロ分子を排除する）の剛性球状（ほぼ４５〜１０５．ｍｕ．ｍ直径）セルロースマトリックスよりなる。機能性リガンド（スルフェートエステル）が比較的高度に分散されるにつれ、それは、ほとんどの可溶性蛋白質がビード表面に吸着されるのを可能とするのに不十分なカチオン電荷密度を呈する。従って、典型的なウイルスプール（細胞培養上清、例えば、パイロジェンおよびほとんどの汚染蛋白質、ならびに核酸およびエン
ドトキシン）に見出される蛋白質のバルクをカラムから洗浄し、結合したウイルスの一定程度の精製が達成される。

ＭＣＳの剛性高強度ビーズは圧縮に対して抵抗する傾向がある。ＭＣＳ樹脂の圧力／流れ特性は高い線流速を可能とし、大きなカラムにおいてさえ高速処理を可能とし、それを容易に拡張または縮小可能なユニット操作とする。加えて、ＭＣＳでのクロマトグラフィ精製工程は安全性および産物滅菌性の高い保証を供し、過剰な産物取り扱いおよび安全性の関心を回避する。エンドトキシンはそれに結合しないので、ＭＣＳ精製工程が迅速かつ汚染物がない脱パイロジェン化を可能とする。緩やかな結合および溶出条件は、高い能力および生成物収率を供する。従って、ＭＣＳ樹脂は、濃縮、精製および脱パイロジェン化のための単純、迅速、効果的なかつコスト削減手段を代表する。さらに、ＭＣＳ樹脂は、繰り返し再利用することができる。

不活化されたウイルスは、勾配遠心、または密度勾配遠心によってさらに精製することができる。商業的規模の操作のためには、連続流スクロース勾配遠心はひとつのオプションであろう。この方法は、抗ウイルスワクチンを精製するのに広く用いられており、当業者に知られている（Ｊ Ｐ Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ「Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｖｉｒｕｓｓｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅｎ ａｕｓ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」Ｃｈａｐｔｅｒ ４．２、Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ内（ｅｄｓ．Ｏ．ｋａｙｓｅｒとＲ Ｈ Ｍｕｅｌｌｅｒ）Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、２０００参照）。

本発明のウイルスを精製するのに用いることができるさらなる精製方法は、核酸分解剤、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ活性を有するヌクレアーゼ、またはＢｅｎｚｏｎａｓｅ．ＴＭ．として商業的に入手可能なＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓからのようなエンドヌクレアーゼのような核酸分解酵素、アニオン官能基を持つ膜吸着剤（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ．ＴＭ．）、またはアニオン官能基でのさらなるクロマトグラフィ工程（例えば、ＤＥＡＥまたはＴＭＡＥ）の使用を含む。限外濾過／透析濾過および最終の滅菌濾過工程を精製方法に加えることもできよう。

本発明の精製されたウイルス調製物は、細胞または細胞培養から由来する汚染蛋白質を実質的に含まず、約１０００、５００、２５０、１５０、１００、または５０ｐｇの細胞核酸／．ｍｕ．ｇ未満のウイルス抗原、および約１０００、５００、２５０、１５０、１００、または５０ｐｇ未満の細胞核酸／用量を含むことができる。精製されたウイルス調製物はまた、約２０ｐｇ未満または約１０ｐｇ未満を含むことができる。ウイルス試料中の宿主細胞核酸レベルを測定する方法は当該分野で知られている。ＷＨＯまたはＦＤＡのような規制当局によって認可されたまたは推奨された標準化された方法を用いることができる。

本発明の他の具体例
別の具体例において、本発明は、ウイルスＲＮＡの生産、ウイルス蛋白質の生産、またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害し、または刺激する剤を同定するための方法に向けられる。別の具体例において、該方法は、少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する少なくとも１つのウイルス核酸配列を含有する対照細胞、および非ＡＧＧ配列に突然変異されている少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する少なくとも１つのウイルス核酸配列を含有するテスト細胞を供し、テスト細胞および対照細胞を１以上の剤と接触させ、次いで、対照細胞と比較してテスト細胞において、ウイルスＲＮＡの生産、ウイルス蛋白質の生産またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害しまたは刺激する少なくとも１つの剤を同定することを含む。

別の具体例において、本発明は、レンチウイルスＲＮＡの生産、レンチウイルス蛋白質の生産、またはレンチウイルス粒子の生産を阻害するまたは刺激する、あるいはレンチウイルス潜伏を阻害するまたは刺激する剤を同定する方法に向けられる。別の具体例において、該方法は、少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する少なくとも１つのレンチウイルスまたはウイルス核酸配列を含有する対照細胞、および非ＡＧＧ配列に突然変異されている少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する少なくとも１つのレンチウイルスまたはウイルス核酸配列を含有するテスト細胞を供し、テスト細胞および対照細胞を１以上の剤と接触させ、次いで、対照細胞と比較してテスト細胞において、レンチウイルスまたはウイルスＲＮＡの生産、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質の生産、またはレンチウイルスまたはウイルス粒子の生産を阻害するまたは刺激する、あるいはレンチウイルスまたはウイルス潜伏を阻害するまたは刺激する少なくとも１つの剤を同定することを含む。

いくつかの具体例において、該剤はＨＩＶ ＲＮＡの生産、ＨＩＶ蛋白質の生産、またはＨＩＶ粒子の生産を阻害し、または刺激し、あるいはＨＩＶ潜伏を阻害し、または刺激する。例えば、剤の全「ライブラリ」は、高スループットスクリーング方法を用いてこのようにしてスクリーニングすることができる。当業者であれば、高スループットスクリーニング方法を容易に設計して、レンチウイルスまたはウイルスＲＮＡの生産、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質の生産、またはレンチウイルスまたはウイルス粒子の生産を阻害するまたは刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害するまたは刺激する剤を同定することができる。マルチウェルプレートにおいて細胞を成長させる方法はよく知られており、剤のライブラリからの異なる剤をマルチウェルプレートの異なるウェルに投与するための方法が知られている。いくつかの方法を用いて、レンチウイルスまたはウイルスＲＮＡの生産、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質の生産、またはレンチウイルスまたはウイルス粒子の生産に対する、あるいはレンチウイルスまたはウイルス潜伏に対するライブラリ剤の効果を決定することができる。例えば、高スループットスクリーニングで用いられる細胞が、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質、および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のような蛍光蛋白質の間の融合のような、１以上の融合蛋白質をコードするように作成することができよう。このようにして、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質の生産は、レンチウイルスまたはウイルス蛋白質の生産を刺激し、または阻害する剤が検出されるのを可能とするであろう蛍光検出方法によってモニターすることができよう。

別の具体例において、本発明は、ＡＧＧモチーフ結合剤を同定するための方法に向けられる。一つの具体例において、該方法は、少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する対照核酸、および非ＡＧＧ配列に突然変異されている少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有するテスト核酸を供し、テスト核酸および対照核酸を１以上の剤と接触させ、次いで、対照核酸に結合するが、テスト核酸に結合せず、あるいはそれがテスト核酸に結合するよりも高い親和性でもって対照核酸に結合する少なくとも１つの剤を同定することを含む。別の具体例において、複数の反復ＡＧＧモチーフを含有するテスト核酸、およびヌクレオチドのランダム分類および順序を含む対照核酸を供し、テスト核酸および対照核酸を１以上の剤と接触させ、次いで、テスト核酸に結合するが、テスト対照酸に結合しないか、あるいはそれが対照核酸に結合するよりも高い親和性でもってテスト核酸に結合する少なくとも１つの剤を同定することを含む。これらの構築体に結合する剤を検出することができる多数の方法がある。例えば、一つの具体例において、前記したテストおよび対照核酸は、カラムまたは１以上の他の適当な固体基質上で供され、（細胞溶解物またはテスト剤のライブラリのような）テスト試料をこれらの基質上に通過させることができる。テストおよび／または対照物質に結合する剤を溶出させ、分析することができよう。別の具体例において、酵母１−ハイブリッド方法を用いて、ＡＧＧモチーフに結合する剤を同定することができよう。さらなる具体例において、電気詠動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実行して、ＡＧＧモチーフに結合する剤を同定することができよう。ヌクレオチド結合剤
を同定するのに適した他の方法は当該分野で知られており、このような方法のいずれを用いても、ＡＧＧモチーフに結合する剤を同定することもできよう。本発明は、本発明の方法を用いて同定されたもののようなＡＧＧモチーフ結合剤も含む。

なお別の具体例において、本発明は、少なくとも１つのＡＧＧモチーフを含有する核酸へのＡＧＧ結合剤の結合を阻害し、または刺激する剤、および前記したような剤を同定する方法に向けられる。

本発明のこれらおよび他の具体例を、以下の非限定的実施例においてさらに記載する。

実施例１−ＨＩＶ−１ゲノムにおけるＡＧＧモチーフの同定
遺伝暗号は縮重しているので、ヌクレオチド配列はヌクレオチドレベルにおいて相互に異なることができるが、同一蛋白質またはペプチドをコードすることができる。しかしながら、自然においては、しばしば、特定のコドン用法およびＡＴ／ＧＣ含有量についての選択圧がある。また、ヌクレオチド配列によってコードされた蛋白質におけるアミノ酸の頻度および順序に対して選択圧がある。これらの選択圧の各々を正規化し、次いで、ゲノムにおいて予測される配列モチーフ（例えば、長さが２から８のヌクレオチドの配列モチーフ）の平均頻度を計算し、これを、そのゲノムにおけるこれらのモチーフの現実の頻度と比較する方法を用いて、ヒトゲノムと比較して、ＨＩＶ−１ゲノムにおいて過剰発現され、および過少発現される配列モチーフを探した。この方法は、その内容を本明細書に引用して援用する、同時係属仮特許出願第６０／８０８，４２０号、およびＲｏｂｉｎｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、（２００５）Ｖｏｌ．１８７、ｐ．８３７０−７４）に記載されている。

前記したＨＩＶ剤の生物学に基づき、ＨＩＶゲノムは１以上のＩＮＳモチーフを含有する可能性がある。我々は、これらのモチーフは、匹敵するＡリッチな含有量を有する宿主（すなわち、ヒト）遺伝子において存在しないであろうと予測した（ＨＩＶゲノムは高いＡ含有量を有する）。ＨＩＶに匹敵するＡ含有量を有する４，０００ヒトゲノムを同定し、前記した方法を用いて実験した。配列モチーフ、ＡＧＧが同定され、これは予測される頻度と比較してこれらのヒト遺伝子においては過少発現された。同一ＡＧＧモチーフが、ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子双方において過剰発現されることが見出された。（図１に示されたように）ｇａｇ遺伝子に存在する４８のＡＧＧオリゴヌクレオチド配列のうち、２／３を超えて、アミノ酸をコードするリーディングフレームにはなく、これらの配列はアミノ酸／蛋白質レベルにおける選択のため保存されていなかったことを示す。３番目のコドン位置の変化は異なるＨＩＶ単離体において共通し、ＡＧＧモチーフもまたコドンの第３の位置においてさえ特に保存されていることが判明した。さらに、ＡＧＧモチーフは、分析した４００を超える異なるＨＩＶ−１において過少発現されることも見出された（全てはＡＧＧモチーフの４０から４８コピーの間で含有することが判明した）。これらの結果は、ＡＧＧモチーフは、ＨＩＶゲノムに保有され、および／または豊富化されつつ、ヒトゲノムにおいて（すなわち、ＨＩＶ宿主において）それに対して選択されていることを示唆する。統合すると、これらの結果は、ＡＧＧモチーフがＩＮＳ配列であり得ることを示唆する。

実施例２−他のレンチウイルスにおけるＡＧＧモチーフの同定
ＡＧＧモチーフの存在は、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のいくつかの株、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含めた広く種々のレンチウイルスにおいて調査された。これらのウイルスのすべては、ＡＧＧモチーフの予測された、または予測されたよりも高い頻度を有することが判明した。しかしながら、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）およびヒトレトロトランスポゾン
ＬＩＮＥ−１はＡＧＧモチーフの予測された、または予測されたよりも高い頻度を有しなかった。

実施例３−他のＩＮＳ配列の同定のための方法
ＨＩＶゲノムはＡＧＧモチーフに加えてさらなるＩＮＳ配列を含有する可能性がある。また、ＡＧＧモチーフはより大きなＩＮＳ配列または複数配列の一部を形成する可能性がある。ＡＧＧモチーフの同定のための前記した方法を適用して、ＨＩＶゲノムにおいて、または事実、他のレンチウイルス、または他のレトロウイルスのようないずれの他のウイルスのゲノムにおいてもさらなるＩＮＳ配列を発見することができる。

実施例４−ＡＧＧモチーフの機能
ＡＧＧモチーフの役割は、アミノ酸についてのコーディングを変化させることなく１以上のモチーフを突然変異させることによってテストされるであろう。例えば、各々が、ＨＩＶ ＬＴＲによって調節される、野生型または突然変異体ＨＩＶ−１ ｇａｇ配列を含有するプラスミドは同一の細胞型に（一過的にまたは安定して）トランスフェクトされ、生産されるｇａｇ ｍＲＮＡの定常状態レベルは、例えば、リアルタイムＰＣＲを用いて測定されるであろう。この実験は、ｇａｇ遺伝子におけるＡＧＧ配列が転写の速度、このｍＲＮＡの細胞質への輸送、またはｍＲＮＡの半減期に影響するか否かをテストするであろう。この同一実験は、ｇａｇおよびｐｏｌ領域双方において突然変異した１以上のＡＧＧ配列を有する構築体にて反復されるであろう。

蛋白質レベルにおいてＡＧＧモチーフの効果を調べるために、ＧＡＧ−ＰＯＬおよび緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）についてのコーディング配列を含有する構築体が用いられるであろう。次いで、蛍光顕微鏡のような標準的な蛍光検出方法を用い、ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＧＦＰを生産する細胞を検出することができる。フローサイトメトリおよび蛍光活性化細胞ソーティングを用いることもできる。細胞は、野生型ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＧＦＰ、または突然変異体ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＧＦＰのいずれかをコードする核酸（すなわち、非ＡＧＧモチーフに突然変異された１以上のＡＧＧを有する構築体）でトランスフェクトされるであろう。突然変異体配列でトランスフェクトされた細胞において検出されるかなり高いレベルのＧＦＰがあろうと予測される。

もしこの実験が予測された結果を示せば、これは（１）ＡＧＧモチーフがＩＮＳ配列であり、および（２）ＡＧＧ ＩＮＳ配列が細胞においてＨＩＶ ｍＲＮＡの定常状態レベルを降下させるように作用することができることを証明するであろう。

これらの構築体のＴＡＴおよびＲＥＶ依存性もまたテストされるであろう。ＡＧＧ突然変異体構築体でトランスフェクトされた細胞は、ＴＡＴおよびＲＥＶの不存在においてさえ、高いレベルのＧＡＧ−ＰＯＬ ＲＮＡ（恐らくは、野生型構築体よりも７０から１３０倍高い）を作成するであろうと予測される。ＴＡＴおよび／またはＲＥＶ発現構築体での細胞の共トランスフェクション、あるいはＧＡＧ−ＰＯＬ構築体におけるＴＡＴおよびＲＥＶコーディング配列を含めることは、ＧＡＧ−ＰＯＬ ＲＮＡのレベルをさらにさえ増加させると予測される。

実施例５−ワクチン
今日、ＨＩＶ挑戦に対して免疫性を付与することができる商業的に入手可能なワクチンはない。なぜこのようなワクチンを作成するのが可能でなかったかには多くの理由がある。ワクチンの生産を困難にしたであろう１つの因子は、ＨＩＶが細胞内に長時間留まる能力であろう。細胞内ウイルスは抗体媒介（しかし、ＣＤ−８ Ｔ細胞媒介はそうではない）免疫性から保護される。ＨＩＶウイルスは、細胞内部での生産のその遅い速度、細胞内部で潜伏したままであるその能力、および細胞融合によって細胞から細胞に拡大するその
能力のため長時間細胞内に隠れていることができる。

ＨＩＶウイルスのこれらの特性は、多数のレベルでの効果的なワクチンを作成する能力に悪影響し得る。１つのレベルにおいて、不活化または減弱化ＨＩＶワクチンのようなＨＩＶウイルスに基づくワクチンは、野生型ＨＩＶウイルスがそうであるように、宿主細胞に進入し、長時間宿主細胞に留まることができる。かくして、ウイルスの短いライフサイクル、およびウイルスがその間に細胞内で曝露される時間の限定された量のため、免疫系は、ＨＩＶでの引き続いての挑戦に対する保護免疫を生じさせるのに十分強い免疫応答を作り出すことができない。もう１つのレベルにおいて、用いる核酸構築体における、ＡＧＧモチーフのようなＩＮＳ配列の存在のため、ＤＮＡは非常に低いレベルのＨＩＶ−コーディング抗原を発現することができる。一般に、生産される抗原がより多ければ、免疫応答はより大きいであろう。かくして、もし低レベルのＨＩＶ抗原が生産されたならば、それらの抗原に対して生じた免疫応答もまた低いであろう。

ワクチンで用いる、またはワクチンを生産するのに用いるウイルス核酸内の１以上のＡＧＧモチーフを突然変異させることによってこれらの問題を克服し、かくして、より効果的なワクチンを作成するのが可能であろう。例えば、病気を引き起こすその能力を低下させるように改変されたことに加え、１以上のＡＧＧモチーフを破壊するように突然変異された減弱化ＨＩＶワクチンを生産することができよう。

前記アプローチをテストするために、突然変異したＡＧＧモチーフを有する減弱化されたＨＩＶウイルスが作成されるであろう。宿主細胞を感染させ、コードされたＨＩＶ蛋白質を発現させ、および新しいウイルス粒子を生産するこれらの突然変異したウイルスの能力は、細胞培養系を用いてイン・ビトロで実験されるであろう。また、宿主においてイン・ビボにて免疫応答を生じさせるこれらの突然変異したウイルスの能力は、ＨＩＶ感染の適当な動物モデルを用いてテストされるであろう。

加えて、同一アプローチがＳＩＶウイルスおよびＦＩＶウイルスを用いてテストされるであろう。突然変異したＡＧＧモチーフを有する減弱化ＦＩＶおよびＳＩＶウイルスが作成されるであろう。宿主細胞を感染するこれらの突然変異したウイルスの能力は、細胞培養系を用いてイン・ビトロで検討されるであろう。また、免疫応答を生じさせるこれらの突然変異したウイルスの能力は、ＳＩＶおよび／またはＦＩＶ感染に対して感受性である宿主においてイン・ビボでテストされるであろう。これらのＳＩＶおよびＦＩＶ実験は、ＨＩＶワクチン／ＨＩＶ感染のための有用なモデルを供するであろう。加えて、サル種におけるＳＩＶに対するワクチンの作成およびテスト、およびネコ種におけるＦＩＶに対するワクチンの作成およびテストはそれ自体有用である。サル種においてＳＩＶ挑戦に対して保護を供することができる免疫学的組成物、および／またはネコ種においてＦＩＶ挑戦に対して保護を供することができる免疫学的組成物は本発明の範囲内にある。

実施例６−ＨＩＶ潜伏のためのモデル、および潜伏におけるＡＧＧモチーフの役割
前記したのと同様な実験において、野生型および突然変異体ｇａｇ−ｐｏｌ構築体は、安定して細胞にトランスフェクトされるであろう。野生型ＡＧＧの取込みコピーを有する細胞系は、ＡＧＧ配列の活性のため、低いレベルのＧＡＧおよびＰＯＬ ＲＮＡおよび蛋白質を生産するであろうと予測される。またクローンのいくつかは、潜伏に関与すると信じられている確率論的表現型スイッチングの現象のため、いずれのＧＡＧ−ＰＯＬ ｍＲＮＡまたは蛋白質を生産しないであろうと予測される。これらのクローンは潜伏の細胞培養モデルを供するであろう。

ＧＡＧ−ＰＯＬを発現しないものから低レベルのＧＡＧ−ＰＯＬを発現するクローンを区別するために、ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＧＦＰ発現構築体を用いてもよい。かくして、ＧＡＧ
−ＰＯＬ−ＧＦＰを発現する細胞は蛍光検出方法によって検出することができ、（蛍光活性化細胞ソーティングまたはＦＡＣＳのような）細胞ソーティングを用いて、２つのもの、すなわち、ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＧＦＰを発現するもの、および発現しないものを分離することができる。また、これらのクローンをテストして、それらが、事実、ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＧＦＰ蛋白質をコードする核酸の取込みコピーを含有することを確認するのも可能であろう。

ＨＩＶ潜伏の確率的表現型スイッチングモデルに従い、我々は、非発現クローンの一定パーセンテージは、いくつかの時点において、ＧＡＧ−ＰＯＬ−ＧＦＰの発現のスイッチを入れるであろうと予測する。ＧＡＧ−ＰＯＬ遺伝子がスイッチを入れられる周波数／速度、およびスイッチに影響する環境的変数を測定することができる。このようなモデルは、ＨＩＶ潜伏を逆行させ、かくして、ウイルスを処理に対してより応答性とする（プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、および他の剤のような）剤を同定するのに有用であろう。

このモデルを用いてＡＧＧモチーフの潜伏に対する効果を調べることもできる。ＲＥＶおよびＴＡＴの不存在下において、ＡＧＧ配列はＨＩＶ ＲＮＡの定常状態レベルを低下させるように働くことができると予測される。また、ＡＧＧモチーフは、潜伏において起こるように、ＨＩＶ ＲＮＡの生産を完全に排除することができるであろうという可能性がある。事実、ＡＧＧモチーフはＨＩＶ潜伏における重要な因子を担う可能性がある。

実施例７−ＡＧＧ結合蛋白質および剤
ＩＭＳ配列は、転写に対して不活性であるクロマチンを生産するように作用する細胞蛋白質を結合させることによって作用することができると提案されてきた（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら参照）。この研究において、ＨＩＶと同程度に高いＡＧＧ頻度を有する、スクリーニングされた４，０００遺伝子のうち９つの細胞遺伝子が同定された。従って、ヒト細胞に存在する細胞ＡＧＧ結合蛋白質がある可能性がある。このような蛋白質が存在するか、およびもしそうであれば該蛋白質を単離するかを決定するために、Ｔ細胞抽出物は、コンペティターヒトＤＮＡの洗浄をしつつＡＧＧオリゴヌクレオチドカラムを通過するであろう。もしこのような蛋白質が同定されれば、蛋白質のアミノ酸配列が決定され、蛋白質をコードする遺伝子が同定されるであろう。

もし同定されれば、このようなＡＧＧ結合蛋白質または（例えば、ＡＧＧに結合することによって）蛋白質の効果を模倣する剤はウイルス潜伏を誘導するのに有用であり得る。これはいくつかの状況で望ましいであろう、もし潜伏が剤での処理によって誘導できるならば、感染した宿主におけるＨＩＶ感染のいずれの結果も最小化し、または完全に排除するのが可能であろう。このような蛋白質または剤もまた、宿主に対して最小の副作用を有するにすぎないと予測される。というのは、宿主遺伝子のほとんど大部分はＨＩＶのそれよりも１００倍低いＡＧＧ頻度を有するからである。

さらに、もしこのようなＡＧＧ結合蛋白質が同定されたならば、ＡＧＧへの蛋白質の結合の親和性をブロックし、または低下させる、あるいはそうでなければＡＧＧ結合の活性を破壊する剤についてスクリーニングするのが可能であろう。このような剤は、ＨＩＶウイルスの代謝回転において潜伏を逆行させるのに有用であり得る。このような効果は、ある状況においては、例えば、他の薬物および／またはワクチンの能力を増大させて、ＨＩＶ感染を根絶するのが望ましいであろう。

ＡＧＧ結合蛋白質、ＡＧＧ結合蛋白質の効果を模倣する剤、およびＡＧＧ結合蛋白質の活性をブロックし、該活性の親和性を低下させ、またはそうでなければ破壊する剤の効果を、本明細書中に記載されたモデルを用いてテストすることができ、また、ＳＩＶおよび
／またはＦＩＶのようなＨＩＶに対する動物モデルでテストすることもできる。

実施例８−ＨＩＶ−１ゲノムおよびヒトゲノムの系統的比較における多数のヌクレオチドモチーフの同定
本発明実施例においては、核封じ込めにおいて原因となる役割を演じることが疑われる多数のヌクレオチドモチーフが、ＨＩＶ−１ゲノムおよびヒトゲノムの系統的比較において同定される。短いモチーフＡＧＧが同定され、これは、ヒトゲノムおよびＨＩＶ−１ゲノムにおけるコーディング遺伝子の間に最大微分表現を有する。この同定は、本発明の方法の使用を介してなされた。該方法はＨＩＶ−１ゲノムおよびヒトコーディング遺伝子の間の表現の実質的差を呈する数ダースのモチーフを同定する。本実施例で呈された結果は単一のモチーフに焦点をあてて、制御された実験における発現レベルに対するその寄与を単離する。Ｇａｇのコドン最適化バージョンを修飾し、同様な変化を行って、ＡＧＧの出現の数を低下させる。２つのプラスミドが作り出され、１つはＧａｇの元のコドン最適化（ＣＯ）配列を備えたものであり、他方は有意に低下されたＡＧＧを持つモチーフ最大化（ＭＯ）配列を備えたものである。構築体はヒト上皮細胞系（２９３細胞）においてトランスフェクトされ、Ｇａｇの発現はＭＯ配列について７０％高いことが示される。Ｇａｇの２つの配列を注射マウスワクチンに作製して、２つの構築体の間の微分抗体応答についてテストする。ワクチンのＭＯバージョンを持つマウスは４週間後に４．５倍大きな抗Ｇａｇ抗体応答を有する。４週間におけるＤＮＡブースト、および６週間における第二の読み出しを伴い、ギャップはＭＯおよびＣＯワクチンの間に継続的に拡大している。

本発明の方法（前記したＲｏｂｉｎｓ−Ｋｒａｓｎｉｔｚ方法）は、アミノ酸の順序およびコドン用法から独立したヒトゲノムのコーディング領域において短いヌクレオチドモチーフを見出す。コドン用法は、与えられた遺伝子で用いられる各コドンの全フラクションを意味するように定義される。Ｒｏｂｉｎｓ−Ｋｒａｓｎｉｔｚ方法の結果は、ヒトゲノムのコーディング領域において過少発現され、および過剰発現される長さが２から７の塩基の正確なヌクレオチドモチーフの組である。ＨＩＶゲノムと比較されるのはこれらのモチーフである。Ｒｏｂｉｎｓ−Ｋｒａｓｎｉｔｚ方法における最初の工程は、ヒトゲノムと比較するためのバックグラウンド配列の創製である。このバックグラウンドは、各遺伝子におけるアミノ酸の順序およびコドン用法の拘束に従うヒトゲノムからのコーディング配列の完全にランダム化されたバージョンである。各遺伝子内の各アミノ酸についてのコドンをランダムに並べ替えるモンテカルロプログラムを設計することができる。表１は説明的例である。

最大エントロピー分布（ＭＥＤ）を得るための手法は、ランダム化された反復の組を含む。各アミノ酸についてコードするヌクレオチドのトリプレットを、それ自体の間でランダムに並べ替える。これは、８つのアミノ酸を持つモック短蛋白質の説明的例である。シャフリング手法はＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４をランダムに並べ替え、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を別々に並べ替える。各反復は新しい配列を生じさせる。この例では、ロイシンについての１２の異なる組合せおよび３６のユニークな配列を与えるヒスチジンについての
３つの組合せがある。それらは、ＭＥＤが多数の反復の制限において獲得されるようなシャフリング手法において重み付けされる。

前記したシャフリング手法はランダム化された配列の組を与える。確率分布をこれらの配列から抽出される。配列の合計組において見出された各モチーフの出現の数が合理的に大きい限り、確率分布は、全てのモチーフの組におけるその分率によって与えられたモチーフの確率を評価することによって形成することができる。

シャフリング手法の後、２つの分布が定義され、現実の配列から見出された現実の分布、およびバックグラウンドの代わりとして用いられる最大エントロピー分布（ＭＥＤ）である。情報理論標準は、過少発現された、および過剰発現されたモチーフを選択するための方法として用いられる。情報のほとんどのビットを現実の分布およびＭＥＤの間の差に寄与させるモチーフは選択された最初のモチーフである。情報を用い、理論は同一のユニット、ビットの数に全ての結果を入れる９つの特徴を有する。これは、異なる長さのモチーフ、および過剰または過少発現されるモチーフの比較を可能とする。２つの分布の間の情報のほとんどのビットに寄与するモチーフを計算するのに使用される式は、カルバック・ライブラー距離または相対的エントロピーである。各モチーフについての相対的エントロピー寄与を計算し、最大値を選択する。

一旦、配列中のほとんどの過少または過剰発現されたモチーフが同定されたならば、次のほとんど過少または過剰発現されたモチーフが選択される。しかしながら、一旦、それができなければ、二番目に大きい相対的エントロピーを有するモチーフを単純に取る。これは、モチーフが重複するからであり、与えられたモチーフのこのような過少または過剰発現はすべての他のモチーフの分布に影響する。ＣｐＧの例はこの点を説明する。ヒトゲノムにおいて、ジヌクレオチドモチーフＣＧは最大相対的エントロピーを有する。しかしながら、サブセットとしてのＣＧを含有する全ての８つのトリマーは、トップの５０の最大相対的エントロピーモチーフ内に入る。これは、ＣＧに対する選択の単純な人工物である。ＭＥＤからのＣＧの寄与は、次のモチーフを見出すための相対的エントロピーを再度計算する前に除かれている必要がある。もしモチーフがｗと呼ばれるならば、ｗを含有する全てのモチーフは、再度拡大縮小されたＭＥＤが現実の分布としてｗに対して同一の分布を有するように、同一量だけ再度拡大縮小される。これはｗの相対的エントロピーをゼロとし、同時に、全ての他のモチーフからｗの寄与を除去する。再拡大縮小のこの選択は、分布の間の全相対的エントロピーを単調に減少させる。

該手法は、ある時点で１つのモチーフの寄与がＭＥＤの再拡大縮小を通じて相対的エントロピーから除去されるように反復される。次いで、次のモチーフが選択される。該手法の反復が継続され、さらなるモチーフが見出されるにつれ、シャッフルされたゲノムを比較することによって決定されるように、最大の残りを持つモチーフまで、相対的エントロピーは統計学的に有意ではない。

ヒトゲノムにおける１００のほとんどの過少および過剰発現されたモチーフの組で開始し、本明細書中に提示される方法は、全「Ａ」含有量が考慮された後に、ＨＩＶゲノムおよびヒトゲノムの間の最大密度差を有するモチーフを同定する。モチーフは、平均ＨＩＶ「Ａ」含有量の１％内の「Ａ」含有量を持つヒト遺伝子の組に制限される。次いで、ＨＩＶゲノムにおける密度の比率を、ヒトコーディング領域における密度で除する。もしヒト密度がＨＩＶのそれよりも大きければ、該量をその逆数によって置き換える。最大の密度の比率を持つモチーフは、ＨＩＶ ｍＲＮＡの核単離のための原因となるシグナルについての予測である。

ヒトゲノムのコーディング領域において極端に過少発現されたＡＧＧトリプレットは、
ヌクレオチドの偏りを考慮するＨＩＶにおける高い頻度でもって見出される。本発明の目的は、モチーフＡＧＧの頻度を低下させることによるＨＩＶのＯＲＦの再暗号化が、蛋白質発現を増加させるであろうということである。

この研究のために、実験テストはＧａｇ遺伝子に焦点を当てた。Ａｄａｒｃ−ＧａｇというＧａｇのコドン最適化配列を、アミノ酸配列が修飾され、非常に稀なコドンは導入されないように、全てのＡＧＧを系統的に除去することによって再暗号化される。その結果はＲＫ−Ｇａｇである。

第一の工程は、ＲＫ−Ｇａｇがコドン最適化バージョンＡｄａｒｃ−Ｇａｇと比較して増大した発現を有するかを決定することである。ＲＫ−Ｇａｇにおける修飾はコドン最適化の一部を外すので、蛋白質発現レベルは、モチーフＡＧＧがｍＲＮＡプロセッシングまたは輸送を有意に阻害するのでなければ、減少することが予測されるはずである。発現レベルを比較するために、ヒト２９３細胞をＧａｇの２つの異なるバージョンの１つでイン・ビトロにてトランスフェクトした。蛋白質レベルを測定し、ＲＫ−Ｇａｇはコドン最適化Ａｄａｒｃ−Ｇａｇよりも７０％高かった（図２）。

免疫応答に対する発現におけるほとんど２倍の利得の効果をテストするために、ＤＮＡワクチンを配列の各々から作り出した。これらのＤＮＡワクチンはＢａｌｂ／Ｃマウスの後脚筋肉に注射され、次いで、４週間後にブースターショットが与えられる。抗Ｇａｇ抗体力価は、４週間および６週間の時点において抗Ｐ２４ ＥＬＩＳＡによって測定された（詳細については方法参照）。結果は図３に見出される。イン・ビトロでの発現の７０％増加は、マウスモデルにおいて液性免疫応答の５倍を超える差に翻訳された。

単一トリプレットの出現を低下させるＧａｇ遺伝子の再暗号化は、マウスモデルにおいてＨＩＶ ＤＮＡワクチンへの免疫応答を実質的に改良した。この短いモチーフはマウスよりもヒトコーディング配列において稀であり、従って、結果はヒトにおいてなおより劇的であると予測されるであろう。工程の組は、同様なＥＮＶ ＯＲＦの再暗号化、および免疫応答を誘導するその能力のテストを含めた、臨床的に活力のあるワクチンを指令において移動させることが求められるであろう。別の工程は、霊長類において抗体応答を中和させるのを探すことであろう。この仕事の意図は、ＨＩＶ ＯＲＦの再暗号化が現在のコドン最適化スキームよりも発現および免疫応答を大いに改良することができるという証拠を提供することである。さらに、本発明の方法の適用は、再コードをする手法へ取込まれるべきモチーフの組を作り出す効果的な手段である。本発明の方法によって決定された他のモチーフの系統的包含は、本実施例において示された大きな利得に対して改良する能力を有する。

Claims (4)

1. （ａ）複数のＡＧＧ配列を含み、ＨＩＶ ｐｒ５５ ｇａｇ蛋白質をコードする第１核酸配列を提供する工程と、
   （ｂ）変化された核酸配列を得るために、前記第１核酸配列のＡＧＧ配列を非ＡＧＧ配列に置き換えるように変化させる工程と、
   （ｉ）工程（ｂ）の変化は、ＨＩＶ ｐｒ５５ ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列を改変しないか、又はレアコドンを導入しないものであり、
   （ｉｉ）工程（ｂ）で変化された核酸配列は、７未満のＡＧＧ配列を有し、
   （ｉｉｉ）工程（ｂ）で変化された核酸配列は、前記第１核酸配列と比較して、宿主細胞又は無細胞翻訳系で更に発現されている、
   （ｉｖ）前記変化は、前記第１核酸配列の少なくとも２つのコドンをスパンしている少なくとも１つのＡＧＧ配列の変異を含む、
   を含む、宿主細胞又は無細胞翻訳系での増加されたＨＩＶ ｐｒ５５ ｇａｇ蛋白質の産生方法。
2. 前記変化は、前記第１核酸配列に複数の核酸置換を導入することを含む、請求項１記載の方法。
3. （ａ）ＨＩＶ ｐｒ５５ ｇａｇ蛋白質をコードし、少なくとも４４個のＡＧＧ配列を含む第１核酸配列を提供する工程と、
   （ｂ）最適化された配列を得るために、前記第１核酸配列中の３８以上のＡＧＧ配列を非ＡＧＧ配列に変更してＡＧＧ配列の総数を減少させるように変化させる工程と、
   を含み、
   前記変化は、ＨＩＶ ｐｒ５５ ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列を改変しないか、又はレアコドンを導入しないものであり、前記最適化された配列は、前記第１核酸配列と比較して、宿主細胞又は無細胞翻訳系で更に発現されており、前記変化は、前記第１核酸配列の少なくとも２つのコドンをスパンしている少なくとも１つのＡＧＧ配列の変異を含む、宿主細胞又は無細胞翻訳系での増加されたＨＩＶ ｐｒ５５ ｇａｇ蛋白質の産生方法。
4. 前記変化は、前記第１核酸配列に複数の核酸置換を導入することを含む、請求項３記載の方法。

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