JP6418761B2 - Hepatitis tissue, hepatitis virus infection method, hepatitis tissue production method, hepatitis virus propagation method, hepatitis vaccine production method, screening method, and kit - Google Patents
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Description
本発明は肝炎組織体、肝炎ウイルスの感染方法、肝炎組織体の製造方法、肝炎ウイルスの増殖方法、肝炎ワクチンの製造方法、スクリーニング方法、及びキットに関する。 The present invention relates to a hepatitis tissue, a hepatitis virus infection method, a hepatitis tissue production method, a hepatitis virus propagation method, a hepatitis vaccine production method, a screening method, and a kit.
ウイルスが感染するには宿主（動物種や細胞種）特異性があることが知られている。感染後のウイルスの増殖および粒子構築・放出のプロセスにおいては、宿主の様々な因子が用いられるため、宿主因子の影響が非常に強い。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヒトに感染して肝炎、肝硬変、最終的には肝癌を引き起こす病原体として恐れられている。ＨＢＶは通常ヒト、チンパンジー、齧歯類のツパイにのみに感染する。そのため動物実験を行うことが難しい。その他、動物実験系又は動物実験系に代わるシステムとしては、ヒトの初代培養肝細胞、ヒト肝細胞のキメラマウス等が肝炎ウイルスの感染システムとして知られている（非特許文献１〜４）。
しかし、ヒト初代培養肝細胞は短期間のみの培養にしか用いることができず、またヒト肝細胞キメラマウスは非常に高価であることから、これらのシステムの頻用、特に創薬スクリーニングなどの大規模な実験系として用いることは現実的でない。このような経緯から、新たな肝炎ウイルス感染システムの開発が求められていた。
It is known that a host (animal species or cell type) is specific for a virus to infect. Since various factors of the host are used in the process of virus growth and particle construction / release after infection, the influence of host factors is very strong. Hepatitis B virus (HBV) is feared as a pathogen that infects humans and causes hepatitis, cirrhosis, and ultimately liver cancer. HBV usually infects only humans, chimpanzees, and rodents. Therefore, it is difficult to conduct animal experiments. In addition, as an animal experiment system or a system that replaces the animal experiment system, human primary cultured hepatocytes, human hepatocyte chimeric mice, and the like are known as hepatitis virus infection systems (Non-Patent Documents 1 to 4).
However, human primary cultured hepatocytes can only be used for short-term culture, and human hepatocyte chimeric mice are very expensive. Therefore, these systems are frequently used, especially for large-scale screening such as drug discovery screening. It is not realistic to use as a simple experimental system. For this reason, development of a new hepatitis virus infection system has been demanded.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、肝臓の構成単位である肝小葉に近い組織構造を有し、肝炎ウイルスが感染可能であって、肝炎ウイルスの効率的な増殖が可能な肝炎組織体の提供を課題とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, has a tissue structure close to the liver lobule, which is a constituent unit of the liver, can be infected with hepatitis virus, and can efficiently proliferate hepatitis virus. The issue is to provide hepatitis tissue.
本発明者らはこれまでに、内皮細胞ネットワークと肝細胞とを含むin vitro肝組織（ＩＶＬ）を開発してきた。そこで、ＩＶＬで発現する因子の解析を行ったところ、Ｂ型肝炎ウイルスが感染に利用することが報告されているナトリウムイオン−胆汁酸トランスポータータンパク質（ＮＴＣＰ）の発現が従来知られている培養中の肝細胞及び分化誘導された肝細胞系譜の細胞と比較して非常に高いことをつき止めた。
そして本発明者らは、ＩＶＬに肝炎ウイルスを接触させる又は肝炎感染細胞を用いてＩＶＬを製造することにより、肝炎ウイルス感染状態の肝組織を模した肝炎組織体が得られることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
The present inventors have so far developed an in vitro liver tissue (IVL) containing an endothelial cell network and hepatocytes. Thus, when the factor expressed in IVL was analyzed, the expression of sodium ion-bile acid transporter protein (NTCP), which has been reported to be used for infection by hepatitis B virus, was conventionally known. It was found to be very high compared to the hepatocytes and cells of the differentiation-induced hepatocyte lineage.
Then, the present inventors have found that a hepatitis tissue imitating a hepatic tissue infected with hepatitis virus can be obtained by bringing the IVL into contact with the hepatitis virus or producing an IVL using hepatitis-infected cells. Was completed. That is, the present invention is as follows.
（１）肝炎ウイルス感染状態の肝組織を模した肝炎組織体であって、
管状構造を有する内皮細胞と、該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含み、
前記細胞塊を構成する細胞の少なくとも一部は肝炎ウイルスを保持することを特徴とする肝炎組織体。
（２）前記管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊が、肝細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞、肝臓由来の細胞及び肝細胞系譜細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞種を含む前記（１）に記載の肝炎組織体。
（３）前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の肝炎組織体。
（４）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程を有することを特徴とする肝炎ウイルスの感染方法。
（５）前記管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊が、肝細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞、肝臓由来の細胞及び肝細胞系譜細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞種を含む前記（４）に記載の肝炎ウイルスの感染方法。
（６）前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする前記（４）又は（５）に記載の肝炎ウイルスの感染方法。
（７）以下の工程（ａ−１）又は工程（ｂ−１）を有することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の肝炎組織体の製造方法。
（ａ−１）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程
（ｂ−１）管状構造を有する内皮細胞に肝炎ウイルス感染細胞を付着させる工程
（８）以下の工程（ａ−１）〜（ａ−２）又は工程（ｂ−１）〜（ｂ−２）を有することを特徴とする肝炎ウイルスの増殖方法。
（ａ−１）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程
（ａ−２）肝炎ウイルスが接触した肝組織体を培養する工程、
（ｂ−１）管状構造を有する内皮細胞に肝炎ウイルス感染細胞を付着させる工程
（ｂ−２）管状構造を有する内皮細胞に付着した肝炎ウイルス感染細胞を培養する工程
（９）前記管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊又は前記肝炎ウイルス感染細胞が、肝細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞、肝臓由来の細胞及び肝細胞系譜細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞種を含む前記（８）に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
（１０）前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスであることを特徴とする前記（８）又は（９）に記載の肝炎ウイルスの増殖方法。
（１１）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の肝炎組織体より得られた肝炎ウイルス粒子又は肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いることを特徴とする肝炎ワクチンの製造方法。
（１２）前記（８）〜（１０）のいずれか一つに記載の肝炎ウイルスの増殖方法により得られた肝炎ウイルス粒子又は肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いることを特徴とする肝炎ワクチンの製造方法。
（１３）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の肝炎組織体と、評価対象の薬剤候補物質とを共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤のスクリーニング方法。
（１４）前記肝炎組織体が検査対象者由来の肝炎ウイルス感染細胞を含み、前記薬剤が検査対象者の肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤である前記（１３）に記載の薬剤のスクリーニング方法。
（１５）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体と、肝炎ウイルスと、評価対象の薬剤候補物質とを共に培養する工程を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤のスクリーニング方法。
（１６）前記肝炎ウイルスが検査対象者由来であり、前記薬剤が検査対象者の肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤である前記（１５）に記載の薬剤のスクリーニング方法。
（１７）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の肝炎組織体を備えたことを特徴とする肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキット。
(1) A hepatitis tissue modeled after a hepatitis virus-infected liver tissue,
An endothelial cell having a tubular structure, and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure,
A hepatitis tissue, wherein at least some of the cells constituting the cell mass hold hepatitis virus.
(2) At least one cell selected from the group consisting of hepatocytes, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts, liver-derived cells and hepatocyte lineage cells, wherein the cell mass formed on the endothelial cells having the tubular structure is The hepatitis tissue according to (1), which contains a species.
(3) The hepatitis tissue according to (1) or (2), wherein the hepatitis virus is hepatitis B virus or hepatitis C virus.
(4) A method for infecting hepatitis virus, comprising a step of contacting hepatitis virus with a liver tissue comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure. .
(5) The cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure is at least one cell selected from the group consisting of hepatocytes, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts, liver-derived cells and hepatocyte lineage cells. The method for infecting hepatitis virus according to (4) above, comprising a species.
(6) The method for infecting hepatitis virus according to (4) or (5) above, wherein the hepatitis virus is hepatitis B virus or hepatitis C virus.
(7) The method for producing a hepatitis tissue body according to any one of (1) to (3), which comprises the following step (a-1) or step (b-1).
(A-1) a step of bringing a hepatitis virus into contact with a hepatic tissue body comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure (b-1) an endothelium having a tubular structure Step of attaching hepatitis virus-infected cells to cells (8) The following steps (a-1) to (a-2) or steps (b-1) to (b-2): Proliferation method.
(A-1) A step of bringing a hepatitis virus into contact with a hepatic tissue body comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure (a-2) The hepatitis virus has come into contact Culturing liver tissue,
(B-1) a step of attaching hepatitis virus-infected cells to endothelial cells having a tubular structure (b-2) a step of culturing hepatitis virus-infected cells attached to endothelial cells having a tubular structure (9) having the tubular structure The cell mass formed on the endothelial cells or the hepatitis virus-infected cell is at least one cell type selected from the group consisting of hepatocytes, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts, liver-derived cells and hepatocyte lineage cells. The method for proliferating hepatitis virus according to (8) above.
(10) The method for proliferating hepatitis virus according to (8) or (9) above, wherein the hepatitis virus is hepatitis B virus or hepatitis C virus.
(11) A method for producing a hepatitis vaccine, characterized by using hepatitis virus particles or hepatitis virus particle constituent proteins obtained from the hepatitis tissue according to any one of (1) to (3).
(12) A method for producing a hepatitis vaccine, characterized by using hepatitis virus particles or hepatitis virus particle constituent proteins obtained by the method for propagating hepatitis virus according to any one of (8) to (10).
(13) Growth of hepatitis virus, hepatitis virus comprising a step of culturing the hepatitis tissue according to any one of (1) to (3) above and a drug candidate substance to be evaluated Screening method for drugs that suppress the action of or the expression of hepatitis virus protein.
(14) The hepatitis tissue contains hepatitis virus-infected cells derived from a test subject, and the drug is a drug that suppresses hepatitis virus proliferation, hepatitis virus action or hepatitis virus protein expression of the test subject ( The method for screening a drug according to 13).
(15) including a step of culturing together a hepatic tissue body including an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure, a hepatitis virus, and a drug candidate substance to be evaluated. A screening method for a drug that suppresses the proliferation of hepatitis virus, the action of hepatitis virus, or the expression of hepatitis virus protein.
(16) The drug according to (15), wherein the hepatitis virus is derived from a test subject, and the drug is a drug that suppresses hepatitis virus proliferation, hepatitis virus action, or hepatitis virus protein expression of the test subject. Screening method.
(17) A drug that suppresses the growth of hepatitis virus, the action of hepatitis virus, or the expression of hepatitis virus protein, comprising the hepatitis tissue body according to any one of (1) to (3). Kit for screening.
本発明によれば、肝臓の構成単位である肝小葉に近い組織構造を有し、肝炎ウイルスが感染可能であって、肝炎ウイルスの効率的な増殖が可能な肝炎組織体を提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a hepatitis tissue body having a tissue structure close to liver lobule which is a constituent unit of the liver, capable of infecting hepatitis virus, and capable of efficiently proliferating hepatitis virus.
≪肝炎組織体≫
本発明の肝炎組織体は、肝炎ウイルス感染状態の肝組織を模した肝炎組織体であって、管状構造を有する内皮細胞と、該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含み、前記細胞塊を構成する細胞の少なくとも一部は肝炎ウイルスを保持するものである。
ここで、「内皮細胞上に形成された細胞塊」とは、内皮細胞と細胞塊が直接に接していてもよいし、他の細胞、細胞外マトリックス成分、ハイドロゲル等の任意の物質を介して内皮細胞と細胞塊が接している状態であってもよい。
前記内皮細胞上に形成された細胞塊に含まれる細胞の種類は、肝炎ウイルスが感染可能な細胞であれば、特に制限されないが、細胞塊に含まれる細胞としては、肝細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞、肝臓由来の細胞及び幹細胞由来の肝細胞系譜細胞であることが好ましく、それらが互いに混在した状態で細胞塊に含まれていても良い。前記幹細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、その他の肝細胞系譜に分化し得る細胞等を例示できる。肝細胞系譜細胞は、肝臓の発生の任意段階で肝臓を構成する細胞の特徴として挙げられる表現型の少なくとも一つを有していればよい。
前記内皮細胞上に形成された細胞塊に含まれる細胞はヒト由来の細胞であることがより好ましい。したがって、前記幹細胞としては、ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳ細胞）、ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳ細胞）をより好ましい前記幹細胞として例示できる。幹細胞由来の肝細胞系譜細胞としては、ヒト幹細胞由来の肝細胞系譜細胞であることが好ましい。
≪Hepatitis tissue≫
The hepatitis tissue of the present invention is a hepatitis tissue imitating a hepatic tissue infected with hepatitis virus, and includes an endothelial cell having a tubular structure, and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure. In addition, at least some of the cells constituting the cell mass retain hepatitis virus.
Here, the “cell mass formed on the endothelial cell” means that the endothelial cell and the cell mass may be in direct contact with each other, or through any substance such as other cells, extracellular matrix components, and hydrogel. Thus, the endothelial cell and the cell mass may be in contact with each other.
The type of cells contained in the cell mass formed on the endothelial cells is not particularly limited as long as it is a cell that can be infected with hepatitis virus. Examples of cells contained in the cell mass include hepatocytes and hepatocyte progenitor cells. Preferably, hepatoblasts, liver-derived cells, and stem cell-derived hepatocyte lineage cells may be included in the cell mass in a state where they are mixed together. Examples of the stem cells include ES cells, iPS cells, and other cells that can differentiate into a hepatocyte lineage. The hepatocyte lineage cell only needs to have at least one of the phenotypes mentioned as characteristics of the cells constituting the liver at any stage of liver development.
More preferably, the cells contained in the cell mass formed on the endothelial cells are human-derived cells. Therefore, as the stem cells, human ES cells (hES cells) and human iPS cells (hiPS cells) can be exemplified as the more preferable stem cells. The stem cell-derived hepatocyte lineage cells are preferably human stem cell-derived hepatocyte lineage cells.
管状構造を有する内皮細胞とは、例えば、複数の内皮細胞が集合して管腔構造を形成している状態である。このとき、管腔構造の形成を促進するという点から、内皮細胞同士は互いに網目状につながって内皮細胞のネットワークを形成していることが好ましい。すなわち内皮細胞同士は内皮細胞管状ネットワークを形成していることが好ましい。 Endothelial cells having a tubular structure are, for example, a state in which a plurality of endothelial cells are aggregated to form a luminal structure. At this time, from the viewpoint of promoting the formation of a luminal structure, it is preferable that the endothelial cells are connected to each other in a mesh form to form a network of endothelial cells. That is, the endothelial cells preferably form an endothelial cell tubular network.
内皮細胞の種類としては、特に限定されるものではないが、血管内皮細胞であることが好ましい。血管内皮細胞としては正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いることができる。
前記肝炎ウイルスとしては特に制限されず、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスを挙げることができる。
The type of endothelial cell is not particularly limited, but is preferably a vascular endothelial cell. Normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) can be used as vascular endothelial cells.
The hepatitis virus is not particularly limited, and examples thereof include hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, and hepatitis E virus.
従来、肝炎ウイルスが感染し得る細胞に肝炎ウイルスを感染させて、それを培養させることが試みられてきた。しかし、肝炎ウイルスが細胞へ感染する効率は低く、また肝炎ウイルスが感染した状態にある肝炎ウイルス感染細胞を得ることは出来ても、当該細胞を長期間培養することは難しく、実験系として用いるには不都合があった。
本発明の肝炎組織体は、肝組織体への肝炎ウイルスが非常に感染しやすく、さらには、肝炎ウイルスが良好に保持された状態で長期間培養することが可能である。そのため、肝炎ウイルス感染状態の肝組織を模したin vitroモデルとして、良好且つ安価に用いることができる極めて優れた組織体である。
Conventionally, it has been attempted to infect cells that can be infected with the hepatitis virus and culture it. However, the efficiency with which hepatitis virus infects cells is low, and even though hepatitis virus-infected cells in a state in which hepatitis virus is infected can be obtained, it is difficult to culture the cells for a long period of time. Was inconvenient.
The hepatitis tissue of the present invention is very easily infected with the hepatitis virus in the liver tissue, and can be cultured for a long time in a state where the hepatitis virus is well maintained. Therefore, it is an extremely excellent tissue body that can be used favorably and inexpensively as an in vitro model simulating liver tissue infected with hepatitis virus.
≪肝炎組織体の製造方法・肝炎ウイルスの感染方法≫
＜肝炎組織体の製造方法＞
本発明の肝炎組織体の製造方法は、以下の工程（ａ−１）又は工程（ｂ−１）を有するものである。
（ａ−１）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程
（ｂ−１）管状構造を有する内皮細胞に肝炎ウイルス感染細胞を付着させる工程
≪Method of manufacturing hepatitis tissue, infection method of hepatitis virus≫
<Method for producing hepatitis tissue>
The method for producing a hepatitis tissue of the present invention comprises the following step (a-1) or step (b-1).
(A-1) a step of bringing a hepatitis virus into contact with a hepatic tissue body comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure (b-1) an endothelium having a tubular structure Attaching hepatitis virus-infected cells to cells
工程（ａ−１）は、まず非感染状態の肝組織体を形成させ、該肝組織体に肝炎ウイルスを接触させ、細胞塊を構成する細胞を肝炎ウイルスに感染させ、肝炎組織体を製造する方法である。
まず、この非感染状態の肝組織体の製造方法としては、例えば、培養液中にある培養基板上に内皮細胞を播種した後に肝炎ウイルスの感染対象の細胞を加えて、それらの細胞を含む組織体を形成せることができる。
肝炎ウイルスの感染対象の細胞としては、肝炎ウイルスが感染し得る細胞であれば特に制限されず、肝細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞、肝臓由来の細胞及び幹細胞由来の肝細胞系譜細胞であることが好ましい。前記幹細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、その他の肝細胞系譜に分化し得る細胞等を例示できる。肝細胞系譜細胞は、肝臓の発生の任意段階で肝臓を構成する細胞の特徴として挙げられる表現型の少なくとも一つを有していればよい。
肝炎ウイルスの感染対象の細胞はヒト由来の細胞であることがより好ましい。したがって、前記幹細胞としては、ｈＥＳ細胞、ｈｉＰＳ細胞をより好ましい前記幹細胞として例示できる。幹細胞由来の肝細胞系譜細胞としては、ヒト幹細胞由来の肝細胞系譜細胞であることが好ましい。
In the step (a-1), a non-infected liver tissue is first formed, hepatitis virus is brought into contact with the liver tissue, and cells constituting the cell mass are infected with the hepatitis virus to produce a hepatitis tissue. Is the method.
First, as a method for producing this non-infected liver tissue body, for example, after seeding endothelial cells on a culture substrate in a culture solution, cells to be infected with hepatitis virus are added, and the tissue containing those cells is added. The body can be formed.
The cells to be infected with hepatitis virus are not particularly limited as long as they can be infected with hepatitis virus, and include hepatocytes, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts, liver-derived cells and stem cell-derived hepatocyte lineage cells. Preferably there is. Examples of the stem cells include ES cells, iPS cells, and other cells that can differentiate into a hepatocyte lineage. The hepatocyte lineage cell only needs to have at least one of the phenotypes mentioned as characteristics of the cells constituting the liver at any stage of liver development.
More preferably, the cells to be infected with the hepatitis virus are human-derived cells. Therefore, as the stem cells, hES cells and hiPS cells can be exemplified as more preferable stem cells. The stem cell-derived hepatocyte lineage cells are preferably human stem cell-derived hepatocyte lineage cells.
肝細胞系譜の細胞を、内皮細胞が播種された培地上に播種する場合、肝細胞系譜の細胞は内胚葉細胞又は内胚葉様細胞であることが好ましい。或いは、内胚葉細胞又は内胚葉様細胞への分化誘導には、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａを含む培地を用いることができるので、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａを含む培地中で培養された幹細胞を用いることが好ましい。例えば、ｉＰＳ細胞をＡｃｔｉｖｉｎ Ａを含む培地で数日間培養して内胚葉細胞又は内胚葉様細胞を得ることができる。Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ存在下でのｉＰＳ細胞の培養期間は特に制限されず、１時間〜１２日間が好ましく、１日〜７日間がより好ましく、２日〜５日間がさらに好ましい。 When cells of the hepatocyte lineage are seeded on a medium in which endothelial cells are seeded, the cells of the hepatocyte lineage are preferably endoderm cells or endoderm-like cells. Alternatively, in order to induce differentiation into endoderm cells or endoderm-like cells, a medium containing Activin A can be used. Therefore, it is preferable to use stem cells cultured in a medium containing Activin A. For example, iPS cells can be cultured for several days in a medium containing Activin A to obtain endoderm cells or endoderm-like cells. The iPS cell culture period in the presence of Activin A is not particularly limited, preferably 1 to 12 days, more preferably 1 to 7 days, and even more preferably 2 to 5 days.
このとき、まず、基板上にさらに足場材料の層を形成させ、その上に内皮細胞ネットワークを形成させ、管状構造を有する内皮細胞ネットワークを形成させることが好ましい。足場材料としては、特に制限されず、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−Ｄ−ラミニン、コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＩＶ等のコラーゲン、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）ゲル、及び従来公知の足場材料として使用可能な成分を用いることができる。なかでも、内皮細胞により効率的に管状構造を有する内皮細胞ネットワークを形成させることができるという点から、ＥＨＳゲルを用いることが特に好ましい。内皮細胞がまずネットワークを形成することにより、内皮細胞が管腔構造を形成することが促進され、in vitroであっても、より効率的に管腔構造を形成させることが可能となる。
このように、内皮細胞ネットワークを形成させた後、内皮細胞ネットワークが形成された培地上に、一例として肝細胞を播種すると、幹細胞が内皮細胞ネットワークに向かって移動し、管状構造を有する内皮細胞ネットワーク上に細胞塊を形成し、高度に組織化された肝組織体を形成させることができる。
At this time, it is preferable to first form a scaffold material layer on the substrate and form an endothelial cell network thereon to form an endothelial cell network having a tubular structure. The scaffold material is not particularly limited, and gelatin, laminin, fibronectin, poly-D-laminin, collagen type I, collagen type IV and other collagen, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) gel, and conventionally known scaffold materials Usable components can be used. Among these, it is particularly preferable to use an EHS gel from the viewpoint that an endothelial cell network having a tubular structure can be efficiently formed by endothelial cells. When the endothelial cells first form a network, the endothelial cells are promoted to form a luminal structure, and the luminal structure can be more efficiently formed even in vitro.
Thus, after forming an endothelial cell network, when seeding hepatocytes as an example on a medium in which the endothelial cell network is formed, the stem cells move toward the endothelial cell network, and the endothelial cell network having a tubular structure A cell mass can be formed on the top, and a highly organized liver tissue can be formed.
次いで、非感染状態の当該肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる。肝組織体に肝炎ウイルスを接触させる方法は特に制限されるものではない。例えば、肝組織体を浸している培地中に肝炎ウイルスを添加し、肝組織体に肝炎ウイルスを接触させることができる。或いは、マイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等により肝組織体中に肝炎ウイルスを注入してもよい。肝炎ウイルスと接触した肝組織体の細胞には肝炎ウイルスが取り込まれる。
このようにして、肝組織体に含まれる肝細胞にウイルスを保持させ、本発明に係る肝炎組織体を得ることができる。
Next, the hepatic virus is brought into contact with the non-infected liver tissue. The method of bringing the hepatitis virus into contact with the liver tissue is not particularly limited. For example, hepatitis virus can be added to a medium in which the liver tissue is immersed, and the liver tissue can be contacted with the hepatitis virus. Alternatively, hepatitis virus may be injected into the liver tissue by microinjection or electroporation. The hepatitis virus is taken up by the cells of the liver tissue in contact with the hepatitis virus.
In this way, the hepatocytes contained in the liver tissue can hold the virus, and the hepatitis tissue according to the present invention can be obtained.
工程（ｂ−１）は、管状構造を有する内皮細胞に、予め肝炎ウイルス感染状態にある肝炎ウイルス感染細胞を付着させ、肝炎組織体を製造する方法である。
肝炎ウイルス感染細胞としては、Ｈｅｐ Ｇ２に代表される肝癌細胞株、肝炎ウイルスによる肝癌患者由来の肝炎ウイルス感染細胞、肝炎患者由来の肝炎ウイルス感染細胞の他、細胞に肝炎ウイルスを感染させて得られた肝炎ウイルス感染細胞等が挙げられる。この肝炎ウイルスの感染対象の細胞としては、前述の工程（ａ−１）で説明したものと同様の細胞を用いることができる。工程（ｂ−１）で用いられる内皮細胞、好ましい足場材料についても前述の工程（ａ−１）で説明したものと同様のものを用い、本発明に係る肝炎組織体を得ることができる。
ここで、内皮細胞に肝炎ウイルス感染細胞を「付着させ」るとは、内皮細胞と細胞塊が直接に接して付着していてもよいし、他の細胞、細胞外マトリックス成分、ハイドロゲル等の任意の物質を介して内皮細胞と肝炎ウイルス感染細胞が接し、これらが一体化して肝炎ウイルス感染細胞が内皮細胞に付着している状態であってもよい。
Step (b-1) is a method for producing a hepatitis tissue by attaching hepatitis virus-infected cells in a hepatitis virus-infected state in advance to endothelial cells having a tubular structure.
As hepatitis virus-infected cells, hepatoma cell lines represented by Hep G2, hepatitis virus-infected cells derived from hepatoma patients caused by hepatitis virus, hepatitis virus-infected cells derived from hepatitis patients, and cells obtained by infecting hepatitis viruses And hepatitis virus-infected cells. As the cells to be infected with the hepatitis virus, the same cells as those described in the above step (a-1) can be used. The endothelial cells used in the step (b-1) and the preferred scaffold material can be the same as those described in the above step (a-1), and the hepatitis tissue according to the present invention can be obtained.
Here, “attaching” hepatitis virus-infected cells to endothelial cells may mean that endothelial cells and cell masses are in direct contact with each other, or other cells, extracellular matrix components, hydrogels, etc. The state may be such that the endothelial cells and hepatitis virus-infected cells are in contact with each other through an arbitrary substance, and these are integrated to attach the hepatitis virus-infected cells to the endothelial cells.
このようにして製造された本発明に係る肝炎組織体は、肝組織体へ肝炎ウイルスが非常に感染しやすく、さらには、肝炎ウイルスが良好に保持された状態で長期間培養することが可能である。 The hepatitis tissue according to the present invention thus produced can be easily infected with the hepatitis virus in the liver tissue and can be cultured for a long time in a state where the hepatitis virus is well maintained. is there.
＜肝炎ウイルスの感染方法＞
本発明の肝炎ウイルスの感染方法は、管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程を有する。当該工程は、上述の＜肝炎組織体の製造方法＞における工程（ａ−１）と同一である。
管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体は、肝炎ウイルスが非常に感染しやすい。そのため本発明の肝炎ウイルスの感染方法によれば、非常に効率的に肝炎ウイルスを細胞へ感染させることができる。
<Hepatitis virus infection method>
The method for infecting hepatitis virus of the present invention comprises a step of bringing a hepatitis virus into contact with a liver tissue comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure. This step is the same as the step (a-1) in the above <Method for producing hepatitis tissue>.
A hepatic tissue body including an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure is very easily infected with hepatitis virus. Therefore, according to the hepatitis virus infection method of the present invention, hepatitis virus can be infected into cells very efficiently.
上記の≪肝炎組織体≫、＜肝炎組織体の製造方法＞及び＜肝炎ウイルスの感染方法＞において挙げた本発明の利点は、本発明の肝炎組織体が高度に組織化された状態であるからと考えられる。生体内での肝細胞は細胞や基質、毛細胆管等と隣接して配置されており、それらの細胞からのシグナルの受容やコミュニケーションが肝細胞としての様々な機能の発現に関与し、良好な培養状態が継続可能となっていると考えられる。
また、その結果、本発明の肝炎組織体における肝炎ウイルスへの感染されやすさを高めていると考えられる。これは、後述の［実施例］で示すように、管状構造を有する内皮細胞ネットワーク上に形成されていない細胞では肝炎ウイルスへの感染が著しく劣るのに対し、管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体では、肝炎ウイルスが感染に利用することが知られているＮＴＣＰの発現が高められており、肝炎ウイルスへ非常に感染しやすいことからも示される。
The advantages of the present invention mentioned in the above <Hepatitis tissue>, <Method for producing hepatitis tissue> and <Method for infection with hepatitis virus> are that the hepatitis tissue of the present invention is highly organized. it is conceivable that. In vivo, hepatocytes are placed adjacent to cells, substrates, capillaries, etc., and reception and communication of signals from those cells are involved in the expression of various functions as hepatocytes, and they are well cultured. It is considered that the state can be continued.
As a result, it is considered that the hepatitis tissue of the present invention is more easily infected with the hepatitis virus. As shown in [Examples] described later, this is because the infection with hepatitis virus is significantly inferior in cells not formed on the endothelial cell network having a tubular structure, whereas the endothelial cells having the tubular structure and the tubular structure. Expression of NTCP, which is known to be used for infection by hepatitis virus, is increased in hepatic tissues including cell clusters formed on endothelial cells having a structure, and it is very easy to infect hepatitis virus. It is also shown.
≪肝炎ウイルスの増殖方法≫
本発明の肝炎ウイルスの増殖方法は、以下の工程（ａ−１）〜（ａ−２）又は工程（ｂ−１）〜（ｂ−２）を有する。
（ａ−１）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程
（ａ−２）肝炎ウイルスが接触した肝組織体を培養する工程、
（ｂ−１）管状構造を有する内皮細胞に肝炎ウイルス感染細胞を付着させる工程
（ｂ−２）管状構造を有する内皮細胞に付着した肝炎ウイルス感染細胞を培養する工程。
このように、本発明の肝炎ウイルスの増殖方法は、本発明の肝炎組織体の製造方法が含む工程（ａ−１）に加えて前記工程（ａ−２）を有するもの、又は、本発明の肝炎組織体の製造方法が含む工程（ｂ−１）に加えて前記工程（ｂ−２）を有するものである。
≪Hepatitis virus propagation method≫
The method for growing hepatitis virus of the present invention includes the following steps (a-1) to (a-2) or steps (b-1) to (b-2).
(A-1) A step of bringing a hepatitis virus into contact with a hepatic tissue body comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure (a-2) The hepatitis virus has come into contact Culturing liver tissue,
(B-1) A step of attaching hepatitis virus-infected cells to endothelial cells having a tubular structure (b-2) A step of culturing hepatitis virus-infected cells attached to endothelial cells having a tubular structure.
As described above, the method for propagating hepatitis virus of the present invention includes the step (a-2) in addition to the step (a-1) included in the method for producing a hepatitis tissue of the present invention, or the method of the present invention. In addition to the step (b-1) included in the method for producing a hepatitis tissue body, the step (b-2) is included.
（工程（ａ−１）〜（ａ−２））
本実施形態のウイルス増殖方法では、まず、工程（ａ−１）を行い、肝組織体に肝炎ウイルスを接触させ、細胞塊を構成する細胞を肝炎ウイルスに感染させて、肝炎組織体を得る。その後工程（ａ−２）を行い、当該肝炎組織体を培養し、ウイルスを増殖させる。
別の形態としては、工程（ａ−２）の「肝炎ウイルスが接触した肝組織体」は、肝炎ウイルスへの感染が成立していない状態であり、肝組織体を培養する間に感染が成立して肝炎組織体となってもよい。当該工程（ａ−２）における培養方法については特に制限されず、当業者において一般的な動物細胞の培養方法に従い、培養対象の細胞に応じて適切な方法を選択し、行うことができる。
(Steps (a-1) to (a-2))
In the virus propagation method of this embodiment, first, the step (a-1) is performed, the hepatic virus is brought into contact with the liver tissue, and the cells constituting the cell mass are infected with the hepatitis virus to obtain the hepatitis tissue. Thereafter, the step (a-2) is performed, the hepatitis tissue is cultured, and the virus is propagated.
As another form, the “hepatic tissue contacted with the hepatitis virus” in the step (a-2) is in a state where the infection with the hepatitis virus has not been established, and the infection was established during the culture of the liver tissue. It may be a hepatitis tissue. The culture method in the step (a-2) is not particularly limited, and a person skilled in the art can carry out by selecting an appropriate method according to the cell to be cultured according to a general animal cell culture method.
本実施形態のウイルス増殖方法によれば、肝組織体へのウイルスの感染しやすさが高く、更に肝炎ウイルスが接触した肝組織体の培養も大変良好に行われるので、効率的に肝炎ウイルスを増殖させることができる。 According to the virus propagation method of the present embodiment, it is easy to infect the liver tissue and the culture of the liver tissue contacted with the hepatitis virus is also performed very well. Can be propagated.
（工程（ｂ−１）〜（ｂ−２））
本実施形態のウイルス増殖方法では、まず、工程（ｂ−１）を行い、肝炎組織体を得る。その後工程（ｂ−２）を行い、当該肝炎組織体を培養し、ウイルスを増殖させる。当該工程（ｂ−２）における培養方法についても特に制限されず、当業者において一般的な動物細胞の培養方法に従い、培養対象の細胞に応じて適切な方法を選択し、行うことができる。
(Steps (b-1) to (b-2))
In the virus propagation method of this embodiment, first, the step (b-1) is performed to obtain a hepatitis tissue body. Thereafter, the step (b-2) is performed, the hepatitis tissue is cultured, and the virus is propagated. The culture method in the step (b-2) is not particularly limited, and a person skilled in the art can carry out by selecting an appropriate method according to the cell to be cultured according to a general animal cell culture method.
肝炎ウイルスの増殖は、工程（ｂ−１）で用いる肝炎ウイルス感染細胞にてすでに生じていると考えられるが、本実施形態のウイルス増殖方法によれば、肝炎ウイルス感染細胞を管状構造を有する内皮細胞に付着させて肝炎組織体とすることで、より安定的に肝炎ウイルスの増殖を行わせることができる。 Proliferation of hepatitis virus is considered to have already occurred in the hepatitis virus-infected cells used in step (b-1). According to the virus propagation method of this embodiment, hepatitis virus-infected cells are endothelium having a tubular structure. By attaching to a cell to form a hepatitis tissue, hepatitis virus can be more stably propagated.
≪肝炎ワクチンの製造方法≫
本発明の肝炎ワクチンの製造方法は、本発明の肝炎組織体又は本発明の肝炎ウイルスの増殖方法により得られた、肝炎ウイルス粒子又は肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いる。
≪Method for producing hepatitis vaccine≫
The method for producing a hepatitis vaccine of the present invention uses hepatitis virus particles or hepatitis virus particle constituent proteins obtained by the hepatitis tissue of the present invention or the method for proliferating hepatitis virus of the present invention.
肝炎組織体および肝炎組織体を培養した培養上清には肝炎ウイルス粒子又は肝炎ウイルス粒子構成タンパク質が含まれるので、これらを抗原とした肝炎ウイルスワクチンを製造することができる。肝炎ウイルスワクチンの製造には、例えば、従来公知の方法により肝炎ウイルス粒子等を弱毒化、無毒化または不活化してウイルス粒子を得て、肝炎ワクチンとして製造することも可能である。 Since the hepatitis tissue and the culture supernatant obtained by culturing the hepatitis tissue contain hepatitis virus particles or hepatitis virus particle constituent proteins, hepatitis virus vaccines using these as antigens can be produced. In the production of a hepatitis virus vaccine, for example, hepatitis virus particles can be attenuated, detoxified or inactivated by a conventionally known method to obtain virus particles, which can be produced as a hepatitis vaccine.
本発明の肝炎ワクチンの製造方法によれば、本発明の肝炎組織体又は本発明の肝炎ウイルスの増殖方法によって高効率に得られた肝炎ウイルス粒子又は肝炎ウイルス粒子構成タンパク質を用いるので、効率的に肝炎ワクチンを製造することができる。 According to the method for producing a hepatitis vaccine of the present invention, the hepatitis virus particle or hepatitis virus particle constituent protein obtained with high efficiency by the hepatitis tissue body of the present invention or the method of growing hepatitis virus of the present invention is used. A hepatitis vaccine can be produced.
≪薬剤のスクリーニング方法≫
［第一実施形態］
本実施形態の薬剤のスクリーニング方法は、本発明の肝炎組織体と、評価対象の薬剤候補物質とを共に培養する工程を含む、肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤のスクリーニング方法である。
評価対象の薬剤候補物質としては、特に限定されず、肝炎ウイルス又は肝炎ウイルスタンパク質に対する抑制効果が従来知られている物質でもよく、当該効果が未知の物質でもよい。
第一実施形態の薬剤のスクリーニング方法の手順の一例としては、肝炎組織体を培養している培養液中に薬剤候補物質を加えて培養する系と、薬剤候補物質を加えずに培養する系とを用意して、各肝炎組織体を培養した後に各肝炎組織体中のウイルス量を定量し、得られたウイルス量の値を指標にして薬剤のスクリーニングを行うことができる。ウイルス量の定量方法としては特に限定されず、ウイルス感染により特異的に生産されるタンパク質又は核酸を定量することが挙げられ、より具体的にはＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の方法が挙げられる。
≪Drug screening method≫
[First embodiment]
The drug screening method of the present embodiment suppresses the proliferation of hepatitis virus, the action of hepatitis virus, or the expression of hepatitis virus protein, including the step of culturing the hepatitis tissue of the present invention and the drug candidate substance to be evaluated. This is a screening method for drugs.
The drug candidate substance to be evaluated is not particularly limited, and may be a substance that has conventionally been known to have an inhibitory effect on hepatitis virus or hepatitis virus protein, or a substance whose effect is unknown.
As an example of the procedure of the drug screening method of the first embodiment, a system in which a drug candidate substance is added and cultured in a culture medium in which hepatitis tissue is cultured, and a system in which the drug candidate substance is not added and cultured Are prepared, and after culturing each hepatitis tissue, the amount of virus in each hepatitis tissue is quantified, and drug screening can be performed using the obtained virus amount as an index. The method for quantifying the amount of virus is not particularly limited, and includes quantifying a protein or nucleic acid specifically produced by virus infection, and more specifically, PCR, real-time PCR, northern blotting, western blotting, southern blotting. And methods such as ELISA.
［第二実施形態］
本実施形態の薬剤のスクリーニング方法は、管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体と、肝炎ウイルスと、評価対象の薬剤候補物質とを共に培養する工程を含む、肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤のスクリーニング方法である。
第二実施形態の薬剤のスクリーニング方法の手順の一例としては、肝組織体を培養している培養液中に肝炎ウイルス及び薬剤候補物質を加えて培養する系と、薬剤候補物質を加えずに培養する系とを用意して、各肝炎組織体を培養した後に各肝炎組織体中のウイルス量を定量し、得られたウイルス量の値を指標にして薬剤のスクリーニングを行う方法が挙げられる。肝炎ウイルスと薬剤候補物質とを加える順序及びタイミングは特に限定されず、当該培養液中に先に肝炎ウイルスを加えた後に薬剤候補物質を加える、肝炎ウイルスと薬剤候補物質を同時に加える等の手順で行えばよい。その後、各肝組織体中のウイルス量を定量し、得られたウイルス量の値を指標にして薬剤のスクリーニングを行うことができる。ウイルス量の定量方法としては上記の［第一実施形態］で挙げたものと同様の方法により行うことができる。
[Second Embodiment]
The drug screening method of the present embodiment includes a liver tissue comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure, a hepatitis virus, and a drug candidate substance to be evaluated. A method for screening for a drug that suppresses the growth of hepatitis virus, the action of hepatitis virus, or the expression of hepatitis virus protein, which comprises the step of culturing together.
As an example of the procedure of the drug screening method of the second embodiment, a system in which hepatitis virus and a drug candidate substance are added to the culture medium in which liver tissue is cultured, and culture without adding the drug candidate substance are performed. And a system for culturing each hepatitis tissue, quantifying the amount of virus in each hepatitis tissue, and screening the drug using the obtained value of the amount of virus as an index. The order and timing of adding the hepatitis virus and the drug candidate substance are not particularly limited, and the drug candidate substance is added after the hepatitis virus has been added to the culture medium, and the hepatitis virus and the drug candidate substance are added simultaneously. Just do it. Thereafter, the amount of virus in each hepatic tissue can be quantified, and drug screening can be performed using the obtained amount of virus as an index. As a method for quantifying the amount of virus, it can be carried out by the same method as described in the above [first embodiment].
肝炎組織体又は上記肝組織体と共に培養する評価対象の薬剤候補物質は、一種類でもよく、複数種類の組み合わせであってもよい。複数種類の薬剤候補物質と共に肝炎組織体又は上記肝組織体を培養することで、適切な薬剤の組み合わせをスクリーニングすることができる。
肝炎組織体又は上記肝組織体が検査対象者由来の肝炎ウイルス感染細胞を含んでいる場合、患者（検査対象者）にとって治療効果の高い薬剤をスクリーニングすることができる。なお、この場合患者本来の肝臓の組織に近い状態でスクリーニングすることができる点から、肝炎組織体又は上記肝組織体が患者由来の細胞を含んでいることが好ましい。
本発明の肝炎組織体又は上記肝組織体は、容易に多数のものを用意することも可能であるので、本実施形態の薬剤のスクリーニング方法によれば薬剤候補物質の種類、濃度、組み合わせ等に関するスクリーニングを一度に低コストで行うことができる。
The drug candidate substance to be evaluated cultured together with the hepatitis tissue or the liver tissue may be one kind or a combination of plural kinds. An appropriate combination of drugs can be screened by culturing a hepatitis tissue or the liver tissue together with a plurality of types of drug candidate substances.
When the hepatitis tissue body or the liver tissue body contains hepatitis virus-infected cells derived from the test subject, a drug having a high therapeutic effect for the patient (test subject) can be screened. In this case, it is preferable that the hepatitis tissue body or the liver tissue body contains cells derived from the patient because screening can be performed in a state close to the patient's original liver tissue.
Since it is possible to easily prepare a large number of hepatic tissue bodies or the above liver tissue bodies of the present invention, the drug screening method of the present embodiment relates to the types, concentrations, combinations, etc. of drug candidate substances. Screening can be performed at a low cost at a time.
≪キット≫
本発明のキットは、本発明の肝炎組織体を備えた、肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするためのキットである。
本発明のキットは、より簡便に肝炎ウイルスを抑制する薬剤のスクリーニングを可能とするために、さらに肝炎ウイルスを定量するための試薬類を備えていることが好ましい。また更には、本発明のキットは、肝炎組織体を培養するための器具、キットを使用するための指示書等をさらに備えていてもよい。
このように、肝炎ウイルスの増殖、肝炎ウイルスの作用又は肝炎ウイルスタンパク質の発現を抑制する薬剤をスクリーニングするために必要なものをキット化することにより、肝炎ウイルスを抑制する薬剤のスクリーニングをより簡便にかつ客観的に行うことができる。
≪Kit≫
The kit of the present invention is a kit for screening for a drug that suppresses the proliferation of hepatitis virus, the action of hepatitis virus, or the expression of hepatitis virus protein, comprising the hepatitis tissue of the present invention.
The kit of the present invention preferably further comprises reagents for quantifying the hepatitis virus in order to enable easier screening for drugs that suppress the hepatitis virus. Furthermore, the kit of the present invention may further include an instrument for culturing hepatitis tissue, instructions for using the kit, and the like.
Thus, it is easier to screen for drugs that suppress hepatitis virus by making kits necessary for screening drugs that suppress hepatitis virus growth, hepatitis virus action or hepatitis virus protein expression. And it can be done objectively.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
≪ＩＶＬｈｉＰＳ≫
［肝組織体の作製］
（ＩＶＬｈｉＰＳの作製）
ＥＨＳゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上に、ＨＵＶＥＣｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を４．２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２で播種し、５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した。なお、以下に示す他の培養についても該条件の下で行った。ＨＵＶＥＣｓは１２時間以内にネットワークを形成した。なお、前記ＨＵＶＥＣｓは予めゼラチンコート プレート上でＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ．製）入りの培地中にて培養しておいたものである。
ｈｉＰＳ細胞（２０１Ｂ１株，文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して理研ＢＲＣから提供されたもの、Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872.）をマウス胎仔線維芽細胞上で４μｇのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 社製）含有霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社製）を使用して培養した。７０％コンフルエント状態のｉＰＳ細胞に、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 社製）を加えた後、３日間培養を行った。次いで、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ存在下で３日間培養された当該ｉＰＳ由来の細胞を、１．２×１０５ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２で、培養開始から１日目の前記ＨＵＶＥＣネットワークが形成されている培地中に播種した。その後１日間の培養期間中で、当該ｉＰＳ由来の細胞はＨＵＶＥＣネットワークへと移動した。このようにして、ＨＵＶＥＣネットワーク（管状構造を有する内皮細胞ネットワーク）上に形成されたｈｉＰＳ細胞由来の肝細胞の細胞塊を含む肝組織体（ＩＶＬｈｉＰＳ：human iPS cell-derived in vitro liver system）を得た（図１）。
≪IVL hiPS≫
[Production of liver tissue]
( Production of IVL hiPS )
HUVECs (manufactured by Cambrex Bioscience) were seeded on an EHS gel (manufactured by BD Biosciences) at 4.2 × 10 4 cells / cm 2 and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. In addition, other cultures shown below were performed under these conditions. HUVECs formed a network within 12 hours. The HUVECs were previously cultured in a medium containing EGM-2 (manufactured by Lonza Japan Ltd.) on a gelatin-coated plate.
hiPS cells (201B1 strain, provided by RIKEN BRC through the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology National BioResource Project, Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872.) On mouse fetal fibroblasts 4 μg bFGF (manufactured by R & D Systems) Culture was performed using a medium for primate ES / iPS cells (manufactured by Reprocell). Activin A (manufactured by R & D Systems) was added to 70% confluent iPS cells, and then cultured for 3 days. Subsequently, the iPS-derived cells cultured for 3 days in the presence of Activin A are seeded at 1.2 × 10 5 cells / cm 2 in a medium in which the HUVEC network is formed on the first day from the start of the culture. did. Thereafter, the iPS-derived cells migrated to the HUVEC network during a one-day culture period. Thus, a liver tissue body (IVL hiPS : human iPS cell-derived in vitro liver system) containing a cell cluster of hiPS cell-derived hepatocytes formed on a HUVEC network (endothelial cell network having a tubular structure) is obtained. Obtained (FIG. 1).
（ＩＶＬｈＥＳの作製）
ｉＰＳ細胞に代えてｈＥＳ細胞を用いた以外は、前記（ＩＶＬｈｉＰＳの作製）と同様にして、ＨＵＶＥＣネットワーク（管状構造を有する内皮細胞ネットワーク）上に形成されたｈＥＳ細胞由来の肝細胞の細胞塊を含む肝組織体（ＩＶＬｈＥＳ：human ES cell-derived in vitro liver system）を得た。ｈＥＳ細胞は京都大学の中辻らが樹立し、京都大学経由で供与された KhES-1 株（Suemori, H., Yasuchika, K., Hasegawa, K., Fujioka, T., Tsuneyoshi, N., and Nakatsuji, N. (2006). Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345, 926-932.）を使用した。
(Production of IVL hES )
A cell cluster of hES cell-derived hepatocytes formed on a HUVEC network (endothelial cell network having a tubular structure) in the same manner as in (Preparation of IVL hiPS ) except that hES cells were used instead of iPS cells. (IVL hES : human ES cell-derived in vitro liver system) was obtained. hES cells were established by Nakatsuji et al., Kyoto University, and the KhES-1 strain (Suemori, H., Yasuchika, K., Hasegawa, K., Fujioka, T., Tsuneyoshi, N., and Nakatsuji, N. (2006). Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345, 926-932.).
また比較対象として、ｉＰＳ細胞由来肝細胞及びＨｕｈ−７細胞を用意した。ｉＰＳ細胞由来肝細胞は、ｉＰＳ細胞にＡｃｔｉｖｉｎ Ａを３日間、ＢＭＰ-２とＦＧＦ-４を５日間、ＨＧＦを５日間、ＯＳＭとＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを５日間、順番に培地中に添加して得たものである。Ｈｕｈ−７細胞は、細胞内でのＣ型肝炎ウイルスの増殖が可能なヒト肝癌細胞株である。ｉＰＳ細胞由来肝細胞、及びＨｕｈ−７細胞の両細胞ともにＨＵＶＥＣネットワーク上での培養を経ない状態で培養を行った。 In addition, iPS cell-derived hepatocytes and Huh-7 cells were prepared for comparison. iPS cell-derived hepatocytes were obtained by adding Activin A to iPS cells for 3 days, BMP-2 and FGF-4 for 5 days, HGF for 5 days, and OSM and Dexamethasone for 5 days in this order. It is. Huh-7 cells are a human liver cancer cell line capable of growing hepatitis C virus in cells. Both iPS cell-derived hepatocytes and Huh-7 cells were cultured without being cultured on the HUVEC network.
［ＮＴＣＰ発現量の測定］
得られたＩＶＬｈｉＰＳの培養中のナトリウムイオン−胆汁酸トランスポータータンパク質（ＮＴＣＰ）の発現量を求めた。ＮＴＣＰは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が細胞への感染に利用する可能性が報告されている膜タンパク質である（Yan, H., Zhong, G., Xu, G., He, W., Jing, Z., Gao, Z., Huang, Y., Qi, Y., Peng, B., Wang, H., et al. (2012). Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife 1, e00049.）。ＮＴＣＰの発現量は、リアルタイムＰＣＲ法を用い、培養中の前記ＩＶＬｈｉＰＳ、ｉＰＳ細胞由来肝細胞、Ｈｕｈ−７細胞をそれぞれ同量取り出し、ｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ量を、β-ＡＣＴＩＮに対する相対値として定量した。
ＮＴＣＰ特異的プライマー（配列番号１：５’-ＡＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＣＧ-３’、配列番号２：５’-ＣＣＡＴＴＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＣ-３’）とβ-ＡＣＴＩＮ特異的プライマー（配列番号３：５’-ＧＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ-３’、配列番号４：５’-ＣＡＧＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣ-３’）を使用し、９５℃１５秒、６５℃３０秒を１サイクルとし、４０サイクルまでの反応を測定した。全てのサンプルはｄｕｐｌｉｃａｔｅで測定し、その平均値を測定値として使用した。反応終了後、融解曲線分析により増幅産物が１種類のみであることを確認した。
[Measurement of NTCP expression level]
The expression level of sodium ion-bile acid transporter protein (NTCP) during the culture of the obtained IVL hiPS was determined. NTCP is a membrane protein that has been reported to be used by hepatitis B virus (HBV) to infect cells (Yan, H., Zhong, G., Xu, G., He, W., Jing, Z., Gao, Z., Huang, Y., Qi, Y., Peng, B., Wang, H., et al. (2012). Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife 1, e00049.). The expression level of NTCP was determined by using the real-time PCR method, taking out the same amount of the above IVL hiPS , iPS cell-derived hepatocytes, and Huh-7 cells in culture, and calculating the amount of cDNA obtained by reverse-transcription of mRNA relative to β-ACTIN. As quantified.
NTCP specific primer (SEQ ID NO: 1 5'-ATCGTCCTCAAAATCCAAAACG-3 ', SEQ ID NO: 5'-CCATTGAGGCAGAAGAGAGC-3') and β-ACTIN specific primer (SEQ ID NO: 5'-GGGGCATGGGTCAGAAGGATT-3 ', sequence No. 4: 5′-CAGTGCCACATCACATCAACC-3 ′), 95 ° C. for 15 seconds and 65 ° C. for 30 seconds, and the reaction up to 40 cycles was measured. All samples were measured by duplicate, and the average value was used as the measured value. After completion of the reaction, it was confirmed by melting curve analysis that there was only one amplification product.
図２にＮＴＣＰ発現量の測定結果を示す。グラフの縦軸はＮＴＣＰの発現量（相対値）であり、横軸は培養日数であり、ＩＶＬｈｉＰＳ及びｉＰＳ細胞由来肝細胞については分化誘導開始時点（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ添加時点）からの培養日数である。図２のグラフから、ＩＶＬｈｉＰＳでのＮＴＣＰの発現量は、ｉＰＳ細胞由来肝細胞及びＨｕｈ−７細胞と比較して、高いことが明らかである。この結果から、ＩＶＬｈｉＰＳはＨＢＶへの感染しやすさが高められていることが示された。 FIG. 2 shows the measurement results of NTCP expression level. The vertical axis of the graph is the expression level (relative value) of NTCP, the horizontal axis is the number of culture days, and for IVL hiPS and iPS cell-derived hepatocytes, the number of culture days from the differentiation induction start time (Activin A addition time). . From the graph of FIG. 2, it is clear that the expression level of NTCP in IVL hiPS is higher than that in iPS cell-derived hepatocytes and Huh-7 cells. From this result, it was shown that IVL hiPS has an increased susceptibility to HBV infection.
［Ｂ型肝炎ウイルスの増殖−１］
上記の結果を得て、ＩＶＬｈｉＰＳのＨＢＶへの感染実験を行った。ＩＶＬｈｉＰＳが培養されている培地中へとＨＢＶを添加し本発明に係る肝炎組織体を得た。
また比較対象として、ＥＨＳゲルを用いずに直接ゼラチンコート上に前記ｉＰＳ細胞由来肝細胞を播種した以外は、上記ＩＶＬｈｉＰＳの作製と同様にしてＨＵＶＥＣ上に形成された細胞塊（共培養on gelatin）を得て、ＨＢＶへの感染実験を行った。このとき共培養on gelatinのＨＵＶＥＣはＩＶＬｈｉＰＳとは異なり、管状構造を有する内皮細胞ネットワークを形成していなかった。
ＨＢＶ添加後４日目、８日目、１２日目のＨＢＶの各群でのｐｇＲＮＡの発現量を求めた。ｐｇＲＮＡの発現量は、培養中のＩＶＬｈｉＰＳ、前記共培養on gelatinが含む肝細胞系譜細胞を含むペレットを同量取り出してtotal RNAを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、β-ＡＣＴＩＮに対する相対値としてｐｇＲＮＡ量を定量した。
ｐｇＲＮＡ特異的プライマー（配列番号５：５’-ＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧ-３’、配列番号６：５’-ＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＧＡＧＴＣ-３’）とβ-ＡＣＴＩＮ特異的プライマー（配列番号７：５’-ＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧ-３’、配列番号８：５’-ＧＧＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡ-３’）を使用し、９５℃１５秒、６０℃３０秒を１サイクルとし、４０サイクルまでの反応を測定した。全てのサンプルはｄｕｐｌｉｃａｔｅで測定し、その平均値を測定値として使用した。反応終了後、融解曲線分析により増幅産物が１種類のみであることを確認した。
[Proliferation of hepatitis B virus-1]
Obtaining the above results, an infection experiment of IVL hiPS to HBV was conducted. HBV was added to the medium in which IVL hiPS was cultured to obtain a hepatitis tissue according to the present invention.
For comparison, a cell mass formed on HUVEC (co-culture on gelatin) was prepared in the same manner as the preparation of IVL hiPS except that the iPS cell-derived hepatocytes were directly seeded on a gelatin coat without using an EHS gel. ), And an infection experiment with HBV was conducted. At this time, HUVEC of co-culture on gelatin did not form an endothelial cell network having a tubular structure, unlike IVL hiPS .
The expression level of pgRNA in each group of HBV on the 4th, 8th, and 12th days after the addition of HBV was determined. The expression level of pgRNA was determined as a relative value to β-ACTIN by extracting the same amount of pellets containing IVL hiPS in culture and hepatocyte lineage cells contained in the co-culture on gelatin, extracting total RNA, and performing RT-PCR. The amount of pgRNA was quantified.
pgRNA specific primers (SEQ ID NO: 5'-TCCCCTCGCCTCGCCAGACG-3 ', SEQ ID NO: 6: 5'-GTTCCCACCCTTATGAGTC-3') and β-ACTIN specific primers (SEQ ID NO: 7: 5'-TCTCATAATGAGCTGCGTGTG-3 ', sequence No. 8: 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ′), 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 30 seconds were used as one cycle, and the reaction up to 40 cycles was measured. All samples were measured by duplicate, and the average value was used as the measured value. After completion of the reaction, it was confirmed by melting curve analysis that there was only one amplification product.
図３にＨＢＶのｐｇＲＮＡの発現量の測定結果を示す。共培養on gelatinの肝細胞系譜細胞と比較して、ＩＶＬｈｉＰＳではｐｇＲＮＡの発現量が高められており、ＩＶＬｈｉＰＳにおいて良好にＨＢＶが増殖していることが示された。 FIG. 3 shows the measurement results of the expression level of HBV pgRNA. Compared to hepatocyte lineage cells coculture on gelatin, the expression level of pgRNA at IVL hiPS has increased, it was shown that satisfactory HBV are growing in IVL hiPS.
［Ｂ型肝炎ウイルスの増殖−２］
前記［Ｂ型肝炎ウイルスの増殖−１］と同様にして、ＩＶＬｈｉＰＳが培養されている培地中へとＨＢＶを添加し本発明に係る肝炎組織体を得た。また比較対象として、前述のＨＵＶＥＣ上に形成された細胞塊（共培養on gelatin）と、前記［ＮＴＣＰ発現量の測定］で用いたものと同様にして得たｉＰＳ細胞由来肝細胞とを用意した。
ＨＢＶ添加後６日目、９日目、１２日目の各群の培養液中あたりのＨＢＶのＤＮＡコピー数を求めた。ＰＣＲ条件は前記［Ｂ型肝炎ウイルスの増殖−１］で示したものと同一である。
[Hepatitis B virus growth-2]
In the same manner as in [Proliferation of hepatitis B virus-1], HBV was added to a medium in which IVL hiPS was cultured to obtain a hepatitis tissue according to the present invention. For comparison, cell clusters (co-culture on gelatin) formed on the aforementioned HUVEC and iPS cell-derived hepatocytes obtained in the same manner as used in [Measurement of NTCP expression level] were prepared. .
The number of DNA copies of HBV per culture solution in each group on the 6th, 9th, and 12th days after the addition of HBV was determined. PCR conditions are the same as those shown in [Proliferation of hepatitis B virus-1].
図４にＨＢＶのＤＮＡコピー数の測定結果を示す。共培養on gelatinの肝細胞系譜細胞と比較して、ＩＶＬｈｉＰＳではＨＢＶのＤＮＡコピー数が高められており、ＩＶＬｈｉＰＳにおいて良好にＨＢＶが増殖し、培養液中にウイルス粒子が放出されていることが示された。 FIG. 4 shows the measurement results of the HBV DNA copy number. Compared to hepatocyte lineage cells coculture on gelatin, IVL and DNA copy number is increased the HBV in hiPS, favorably HBV is grown in IVL hiPS, the virus particles are released into the culture medium It has been shown.
以上の結果から、ｉＰＳ細胞を用いて分化誘導した肝細胞系譜とヒト内皮細胞管腔ネットワークと共培養することにより、肝臓の構成単位である肝小葉に近い組織構造（ＩＶＬｈｉＰＳ：human iPS cell-derived in vitro liver system）をin vitroで構築することに成功したことが示された。また、当該ＩＶＬｈｉＰＳでは、ＨＢＶへの感染しやすさが高く、ＨＢＶが良好に増殖可能であった。 From the above results, the tissue structure close to the hepatic lobule which is a constituent unit of the liver (IVL hiPS : human iPS cell-) is obtained by co-culturing with the hepatic cell lineage differentiated using iPS cells and the human endothelial cell lumen network. derived in vitro liver system) was successfully constructed in vitro. In addition, the IVL hiPS was highly susceptible to HBV infection, and HBV was able to grow well.
≪ＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５≫
［肝炎組織体の作製］
（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋））
ＥＨＳゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上に、ＨＵＶＥＣｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）を４．２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２で播種し、５％ＣＯ２、３７℃条件下で培養した。なお、以下に示す他の培養についても該条件の下で行った。ＨＵＶＥＣｓは１２時間以内にネットワークを形成した。なお、前記ＨＵＶＥＣｓは予めゼラチンコート プレート上でＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ．製）入りの培地中にて培養しておいたものである。
次いで、ヒト肝細胞癌由来の細胞株であって、継続的にＨＢＶの複製が行われているＨｅｐ Ｇ２．２．１５を１．２×１０５ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２で、培養開始から１日目の前記ＨＵＶＥＣネットワーク上に播種した。その後１日間培養して、ＨＵＶＥＣネットワーク（管状構造を有する内皮細胞ネットワーク）上に形成されたＨｅｐ Ｇ２．２．１５の細胞塊を含む、本発明に係る肝炎組織体（ＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５）を得た（図５（Ａ））。
≪IVL Hep G2.2.15≫
[Preparation of hepatitis tissue]
(EHS (+), HUVEC (+))
HUVECs (manufactured by Cambrex Bioscience) were seeded on an EHS gel (manufactured by BD Biosciences) at 4.2 × 10 4 cells / cm 2 and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. In addition, other cultures shown below were performed under these conditions. HUVECs formed a network within 12 hours. The HUVECs were previously cultured in a medium containing EGM-2 (manufactured by Lonza Japan Ltd.) on a gelatin-coated plate.
Next, Hep G2.2.15, a cell line derived from human hepatocellular carcinoma, on which HBV is continuously replicated at 1.2 × 10 5 cells / cm 2 on the first day from the start of culture. On the HUVEC network. Thereafter, the hepatitis tissue according to the present invention (IVL Hep G2.2.15 ) containing a cell mass of Hep G2.2.15 formed on a HUVEC network (endothelial cell network having a tubular structure) after culturing for 1 day. ) Was obtained (FIG. 5A).
（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（−））
ＨＵＶＥＣを用いずにＨｅｐ Ｇ２．２．１５を播種した以外は、上記の（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋））系と同様にして、Ｈｅｐ Ｇ２．２．１５の培養を行った（図５（Ｂ）参照）。
(EHS (+), HUVEC (-))
Hep G2.2.15 was cultured in the same manner as the (EHS (+), HUVEC (+)) system described above except that Hep G2.2.15 was seeded without using HUVEC (FIG. 5). (See (B)).
（ＥＨＳ（−）, ＨＵＶＥＣ（＋））
ＥＨＳゲルを用いずに、直接ゼラチンコート上にＨＵＶＥＣを形成させた以外は、上記の（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋））系と同様にして、Ｈｅｐ Ｇ２．２．１５の培養を行った（図５（Ｃ）参照）。
(EHS (-), HUVEC (+))
Hep G2.2.15 was cultured in the same manner as the above (EHS (+), HUVEC (+)) system except that HUVEC was directly formed on the gelatin coat without using an EHS gel. (See FIG. 5C).
（ＥＨＳ（−）, ＨＵＶＥＣ（−））
ＥＨＳゲル及びＨＵＶＥＣを用いずに、直接ゼラチンコート上にＨｅｐ Ｇ２．２．１５を播種した以外は、上記の（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋））系と同様にして、Ｈｅｐ Ｇ２．２．１５の培養を行った（図５（Ｄ）参照）。
(EHS (-), HUVEC (-))
In the same manner as the (EHS (+), HUVEC (+)) system described above, except that Hep G2.2.15 was seeded directly on the gelatin coat without using EHS gel and HUVEC, Hep G2.2. Fifteen cultures were performed (see FIG. 5D).
上記の系のうち、（ＥＨＳ（−）, ＨＵＶＥＣ（＋））の系ＨＵＶＥＣは（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋））の系のＨＵＶＥＣとは異なり、管状構造を有する内皮細胞ネットワークを形成していなかった。 Among the above systems, the (EHS (−), HUVEC (+)) system HUVEC differs from the (EHS (+), HUVEC (+)) system HUVEC to form an endothelial cell network having a tubular structure. It wasn't.
次いで、上記各群でのｐｇＲＮＡの発現量を求めた。ｐｇＲＮＡの発現量は、培養７日目の各群からＨｅｐ Ｇ２．２．１５を含むペレットを同量取り出してtotal RNAを抽出し、半定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、β―ＡＣＴＩＮに対する相対値としてｐｇＲＮＡ量を定量した。
また、上記各群の培養液中あたりのＨＢＶのＤＮＡコピー数を求めた。測定方法は、上記≪ＩＶＬｈｉＰＳ≫で行ったものと同様であり、培養１−３日目と培養３−５日目での培養液に対して測定を行った。
Subsequently, the expression level of pgRNA in each said group was calculated | required. The expression level of pgRNA was determined by extracting the same amount of pellets containing Hep G2.2.15 from each group on the seventh day of culture, extracting total RNA, performing semi-quantitative RT-PCR, and calculating pgRNA as a relative value to β-ACTIN. The amount was quantified.
In addition, the number of HBV DNA copies per culture broth of each group was determined. The measurement method was the same as that performed in the above << IVL hiPS >>, and the culture was measured on the culture day 1-3 and the culture day 3-5.
図５（Ｅ）にＨＢＶのｐｇＲＮＡの発現量を定量した結果を示す。この結果から、ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋）の系で得られたＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５及び、ＥＨＳ（−）, ＨＵＶＥＣ（＋）で培養されたＨｅｐ Ｇ２．２．１５では、ＥＨＳ（＋）,ＨＵＶＥＣ（−）及びＥＨＳ（−）,ＨＵＶＥＣ（−）の系と比較して、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの発現量が高められ、良好にＨＢＶが増殖していることが示された。
図５（Ｆ）に培養液中あたりのＨＢＶのＤＮＡコピー数を定量した結果を示す。この結果から、ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋）の系で得られたＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５では、ＨＢＶのＤＮＡコピー数が他の系と比較して高められており、良好にＨＢＶが増殖し、培養液中にウイルス粒子が放出されていることが示された。
FIG. 5 (E) shows the results of quantifying the expression level of pgRNA of HBV. From this result, EHS (+), HUVEC (+) obtained in IVL Hep G2.2.15 and EHS (-), HUVEC (+) cultured in Hep G2.2.15, EHS Compared with the (+), HUVEC (−), EHS (−), and HUVEC (−) systems, the expression level of HBV pgRNA was increased, indicating that HBV proliferated well.
FIG. 5 (F) shows the result of quantifying the number of HBV DNA copies per culture medium. From this result, in the IVL Hep G2.2.15 obtained in the EHS (+) and HUVEC (+) systems, the DNA copy number of HBV was increased compared to other systems, and HBV was excellent. It was shown that the virus had proliferated and virus particles were released in the culture medium.
以上の結果から、Ｈｅｐ Ｇ２．２．１５とヒト内皮細胞管腔ネットワークと共培養することにより、肝臓の構成単位である肝小葉に近い組織構造（ＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５）をin vitroで構築することに成功したことが示された。また、当該ＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５では、ＨＢＶが良好に増殖可能であった。 From the above results, the tissue structure (IVL Hep G2.2.15 ) close to the hepatic lobule, which is a constituent unit of the liver, was obtained in vitro by co-culturing with Hep G2.2.15 and the human endothelial cell lumen network. It was shown to be successful in building. Moreover, in the said IVL Hep G2.2.15 , HBV was able to proliferate favorably.
≪ＩＶＬＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅ≫
［肝炎組織体の作製］
分化型の肝細胞癌由来の細胞株であるＨｕＨ−７にｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄをトランスフェクションさせ、継続的にＨＢＶ遺伝子が発現している細胞株であるＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅを得た。
（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋））
上述の≪ＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５≫の（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋））において、Ｈｅｐ Ｇ２．２．１５に代えて前記ＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅを用い、ＨＵＶＥＣネットワーク（管状構造を有する内皮細胞ネットワーク）上に形成されたＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅの細胞塊を含む、本発明に係る肝炎組織体（ＩＶＬＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅ）を得た（図６（Ａ））。
また、Ｈｅｐ Ｇ２．２．１５に代えて前記ＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅを用い、上述の≪ＩＶＬＨｅｐ Ｇ２．２．１５≫と同様にして（ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（−））（図６（Ｂ）参照）、（ＥＨＳ（−）, ＨＵＶＥＣ（−））（図６（Ｃ）参照）、（ＥＨＳ（−）, ＨＵＶＥＣ（−））（図６（Ｄ）参照）の系でＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅの培養を行った。
≪IVL HuH-HB- Ae≫
[Preparation of hepatitis tissue]
Genotype A-containing plasmid was transfected into HuH-7, which is a cell line derived from differentiated hepatocellular carcinoma, to obtain HuH-HB-Ae, which is a cell line in which the HBV gene is continuously expressed.
(EHS (+), HUVEC (+))
In (EHS (+), HUVEC (+)) of the above-mentioned << IVL Hep G2.2.15 >>, the above-mentioned HuH-HB-Ae is used instead of Hep G2.2.15, and a HUVEC network (having a tubular structure) A hepatitis tissue (IVL HuH-HB-Ae ) according to the present invention containing a cell mass of HuH-HB-Ae formed on the (endothelial cell network) was obtained (FIG. 6 (A)).
Further, use of the HuH-HB-Ae instead Hep G2.2.15, in the same manner as above «IVL Hep G2.2.15 »(EHS (+ ), HUVEC (-)) ( FIG. 6 ( B)), (EHS (−), HUVEC (−)) (see FIG. 6 (C)), (EHS (−), HUVEC (−)) (see FIG. 6 (D)) in the system of HuH-HB. -Ae was cultured.
次いで、上記各群でのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の発現量を求めた。ＨＢｓＡｇの発現量は、各群の培養液に対してＨＢｓＡｇに対する抗体を用いてエンザイムイムノアッセイによって求めた。
図６（Ｅ）に培養液中あたりのＨｂｓＡｇを定量した結果を示す。この結果から、ＥＨＳ（＋）, ＨＵＶＥＣ（＋）の系で得られたＩＶＬＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅでは、ＨＢｓＡｇの値が他の系と比較して有意に高められており、良好にＨＢＶが増殖し、培養液中にウイルス粒子が放出されていることが示された。
Next, the expression level of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in each group was determined. The expression level of HBsAg was determined by enzyme immunoassay using an antibody against HBsAg to the culture solution of each group.
FIG. 6 (E) shows the results of quantifying HbsAg per culture medium. From this result, in the IVL HuH-HB-Ae obtained in the EHS (+) and HUVEC (+) systems, the value of HBsAg was significantly increased as compared with other systems, and HBV proliferated well. It was shown that virus particles were released in the culture solution.
以上の結果から、ＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅとヒト内皮細胞管腔ネットワークと共培養することにより、肝臓の構成単位である肝小葉に近い組織構造（ＩＶＬＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅ）をin vitroで構築することに成功したことが示された。また、当該ＩＶＬＨｕＨ−ＨＢ−Ａｅでは、ＨＢＶが良好に増殖可能であった。 From the above results, by co-culturing with HuH-HB-Ae and human endothelial cell lumen network, a tissue structure (IVL HuH-HB-Ae ) close to the liver lobule, which is a constituent unit of the liver, is constructed in vitro. Was shown to be successful. In addition, in the IVL HuH-HB-Ae , HBV was able to grow well.
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。 The configurations and combinations thereof in the embodiments described above are examples, and the addition, omission, replacement, and other modifications of the configurations can be made without departing from the spirit of the present invention. Further, the present invention is not limited by each embodiment, and is limited only by the scope of the claims.
本発明の肝炎組織体、肝炎ウイルスの感染方法、肝炎組織体の製造方法、肝炎ウイルスの増殖方法、肝炎ワクチンの製造方法、スクリーニング方法、及びキットは、肝炎ウイルスを対象とする医療関連分野に広く適用可能である。 The hepatitis tissue, the hepatitis virus infection method, the hepatitis tissue production method, the hepatitis virus propagation method, the hepatitis vaccine production method, the screening method, and the kit of the present invention are widely used in medical-related fields targeting hepatitis virus. Applicable.
Claims (14)
管状構造を有する内皮細胞と、該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含み、
前記細胞塊が、肝細胞、肝癌細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞及び肝細胞系譜細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞種を含み、
前記細胞塊を構成する細胞の少なくとも一部は肝炎ウイルスを保持することを特徴とする肝炎組織体。 A hepatitis tissue modeled after a hepatitis virus-infected liver tissue,
An endothelial cell having a tubular structure, and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure,
The cell mass includes at least one cell type selected from the group consisting of hepatocytes, hepatoma cells, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts and hepatocyte lineage cells,
A hepatitis tissue, wherein at least some of the cells constituting the cell mass hold hepatitis virus.
前記細胞塊が、肝細胞、肝癌細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞及び肝細胞系譜細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞種を含むことを特徴とする肝炎ウイルスの感染方法。 In liver tissue comprising a cell mass formed on the endothelial cells with endothelial cells and tube-like structure having a tubular structure, it has a step of contacting the hepatitis virus,
A method for infecting hepatitis virus, wherein the cell mass contains at least one cell type selected from the group consisting of hepatocytes, hepatoma cells, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts, and hepatocyte lineage cells .
（ａ−１）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程
（ｂ−１）管状構造を有する内皮細胞に肝炎ウイルス感染細胞を付着させる工程
（前記細胞塊又は前記肝炎ウイルス感染細胞は、肝細胞、肝癌細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞及び肝細胞系譜細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞種を含む。） The method for producing a hepatitis tissue body according to claim 1 or 2, comprising the following step (a-1) or step (b-1).
(A-1) a step of bringing a hepatitis virus into contact with a hepatic tissue body comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure (b-1) an endothelium having a tubular structure Attaching hepatitis virus-infected cells to cells
(The cell mass or the hepatitis virus-infected cell contains at least one cell type selected from the group consisting of hepatocytes, hepatoma cells, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts, and hepatocyte lineage cells.)
（ａ−１）管状構造を有する内皮細胞と該管状構造を有する内皮細胞上に形成された細胞塊とを含む肝組織体に、肝炎ウイルスを接触させる工程
（ａ−２）肝炎ウイルスが接触した肝組織体を培養する工程、
（ｂ−１）管状構造を有する内皮細胞に肝炎ウイルス感染細胞を付着させる工程
（ｂ−２）管状構造を有する内皮細胞に付着した肝炎ウイルス感染細胞を培養する工程
（前記細胞塊又は前記肝炎ウイルス感染細胞は、肝細胞、肝癌細胞、肝細胞前駆細胞、肝芽細胞及び肝細胞系譜細胞からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞種を含む。） A method for growing hepatitis virus, comprising the following steps (a-1) to (a-2) or steps (b-1) to (b-2).
(A-1) A step of bringing a hepatitis virus into contact with a hepatic tissue body comprising an endothelial cell having a tubular structure and a cell mass formed on the endothelial cell having the tubular structure (a-2) The hepatitis virus has come into contact Culturing liver tissue,
(B-1) A step of attaching hepatitis virus-infected cells to endothelial cells having a tubular structure (b-2) A step of culturing hepatitis virus-infected cells attached to endothelial cells having a tubular structure
(The cell mass or the hepatitis virus-infected cell contains at least one cell type selected from the group consisting of hepatocytes, hepatoma cells, hepatocyte progenitor cells, hepatoblasts, and hepatocyte lineage cells.)
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