JP6419664B2 - 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

配列表の提出
本願と関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子形式で出願されており、その全体を引用により本明細書の一部とする。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＭＳＢ７３２９ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５である。

実施態様の分野
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する単離されたモノクローナル抗体およびその断片ならびに関連する発明を提供する。

背景技術
血液凝固は、血液が出血を止める安定した血栓を形成する過程である。該過程は、血中を循環している多くのプロ酵素（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅｓ）およびプロ補因子（ｐｒｏｃｏｆａｃｔｏｒｓ）（または「凝固因子」）を含む。それらのプロ酵素およびプロ補因子は、いくつかの経路を介して相互作用し、その間にそれらは、連続してもしくは同時に活性化型に変換される。最終的に、該過程は、第Ｖａ因子、イオン化カルシウムおよび血小板の存在下で活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）により、プロトロンビンのトロンビンへの活性化を生じる。活性化されたトロンビンは、順に、血小板凝集を誘導し、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、その後、活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）により架橋されて血栓を形成する。

第Ｘ因子の活性化を生じる過程は、下記の２個の異なる経路により行われ得る：接触活性化経路（以前は内因性経路と呼ばれていた）および組織因子経路（以前は外因性経路と呼ばれていた）。以前、凝固カスケードは、共通の経路に加えられる等しく重要な２個の経路からなると考えられていた。現在では、血液凝固の開始についての主要な経路は、組織因子経路であることが知られている。

第Ｘ因子は、活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と組み合わせて組織因子（ＴＦ）により活性化され得る。ＦＶＩＩａとその重要な補因子であるＴＦの複合体は、血液凝固カスケードの有力なイニシエーターである。

血液凝固の組織因子経路は、組織因子経路インヒビター（「ＴＦＰＩ」）により負に制御される。ＴＦＰＩは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の天然のＦＸａ依存性フィードバックインヒビターである。ＴＦＰＩは、多価Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビターのメンバーである。生理学的には、ＴＦＰＩは、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合してヘテロダイマー複合体を形成し、次いで、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体と相互作用してその活性を阻害し、その結果、血液凝固の組織因子経路を阻害する。原理上は、ＴＦＰＩ活性の妨害は、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を回復させ、その結果、組織因子経路の作用の持続を延長させ、血友病ＡおよびＢにおいて共通して欠損しているＦＸａの産生を増幅し得る。

確かに、いくつかの予備実験による証拠は、ＴＦＰＩに対する抗体によるＴＦＰＩ活性の阻害が、遅延した血液凝固時間を標準化するか、もしくは出血時間を短縮することを示している。例えば、Ｎｏｒｄｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、血友病血漿の延長した希釈プロトロンビン時間（ｄｉｌｕｔｅ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ）が、ＴＦＰＩに対する抗体で血漿を処理した後に標準化されることを示した（Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ．， １９９１， ６６（４）：４６４−４６７）。同様に、Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．は、血友病Ａウサギモデルにおける出血時間が抗ＴＦＰＩ抗体により顕著に短縮することを示した（Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ， １９９５， ６：３８８−３９４）。これらの研究は、抗ＴＦＰＩ抗体によるＴＦＰＩの阻害が血友病ＡもしくはＢの処置において有用であり得ることを示す。ポリクローナル抗ＴＦＰＩ抗体のみがこれらの研究において用いられた。

ハイブリドーマ技術を用いて、組み換えヒトＴＦＰＩ（ｒｈＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体が作製され、同定された。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｉｎ． Ｍｅｄ． Ｊ．， １９９８， １１１（８）：７１８−７２１を参照のこと。希釈プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）についてのモノクローナル抗体の効果が試験された。実験は、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体が第ＩＸ因子を欠損した血漿の希釈トロンボプラスチン血液凝固時間を短縮することを示した。組織因子経路が、生理学的な血液凝固においてだけでなく、血友病の出血においても重要な役割を果たしていることが示される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｎａｎ Ｙｉ Ｋｅ Ｄａ Ｘｕｅ Ｘｕｅ Ｂａｏ， １９９７， ２２（４）：２９７−３００）。

Ｋｊａｌｋｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，０１５，１９４号は、ＦＶＩＩａ、ならびにポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはその断片を含むＴＦＰＩインヒビターを含む、出血症状または凝固処置の処置または予防用組成物を開示している。そのような組成物の使用は、正常な哺乳類血漿における凝固時間を短縮することがまた開示されている。さらに、第ＶＩＩＩ因子またはその変異型が、ＦＶＩＩａおよびＴＦＰＩインヒビターの開示された組成物中に含まれ得ることが示されている。ＦＶＩＩＩまたは第ＩＸ因子とＴＦＰＩモノクローナル抗体の組み合わせについては、示されていない。

血友病の処置に加えて、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含むＴＦＰＩインヒビターは、癌処置のために使用され得ることがまた示されている（Ｈｕｎｇによる米国特許第５，９０２，５８２号を参照のこと）。

したがって、ＴＦＰＩに特異的な抗体は、血液疾患および癌を処置するために必要とされる。

一般に、ヒト疾患についての治療抗体は、マウス、キメラ、ヒト化もしくは完全ヒト抗体を作製するために、遺伝学的改変により作製されている。マウスモノクローナル抗体は、短い血清半減期、ヒトエフェクター機能誘導不能、およびヒト抗マウス抗体の産生のために、治療剤として限定的な使用を有することが示されていた。Ｂｒｅｋｋｅ ａｎｄ Ｓａｎｄｌｉｅ， “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｄａｗｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ，” Ｎａｔｕｒｅ ２， ５３， ５２−６２（Ｊａｎ． ２００３）を参照のこと。キメラ抗体は、ヒト抗キメラ抗体応答を生じることが示されていた。ヒト化抗体はさらに、抗体のマウス構成要素を最小化する。しかしながら、完全ヒト抗体は、マウス構成要素に関連する免疫原性を完全に回避する。したがって、遺伝学的に改変されたモノクローナル抗体の他の形態に関連する免疫原性を回避する完全ヒト抗体を開発する必要性が存在する。特に、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を用いた血友病処置のために必要とされるような慢性的な予防処置は、マウス構成要素またはマウス起源が、所要の頻回投与および治療の長期持続のために必要とされる場合、該治療に対して免疫応答を発症する高いリスクを有する。例えば、血友病Ａについての抗体治療は、患者の生涯にわたって週１回の投与を必要とし得る。これは、免疫系に対する継続したチャレンジであり得る。したがって、血友病Ａおよび関連する先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損の抗体治療のための完全ヒト抗体について、必要性が存在する。

治療抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎにより“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，” Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７（１９７５）に記載されたハイブリドーマ技術を用いて作製され得る。完全ヒト抗体はまた、原核生物および真核生物において組み換え的に産生され得る。宿主細胞における抗体の組み換え的産生は、ハイブリドーマ産生よりも治療抗体のために好ましい。組み換え的産生は、より高い産物の一貫性、より高い産生レベル、および動物由来タンパク質の存在を最小化するか、もしくは除去する制御された製造の利点を有する。これらの理由により、組み換え的に産生される抗ＴＦＰＩ抗体を有することが望ましい。

要約
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体が提供される。さらに、該抗体をコードする単離された核酸分子が提供される。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む医薬組成物ならびに血友病ＡおよびＢのような先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損の処置法がまた提供される。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与することにより出血時間を短縮するための方法がまた提供される。本発明により、ヒトＴＦＰＩに結合するモノクローナル抗体を製造する方法がまた提供される。

ヒトＴＦＰＩ（「ｈ−ＴＦＰＩ」）およびマウスＴＦＰＩ（「ｍ−ＴＦＰＩ」）に対するパニングおよびスクリーニングから選択されるＦａｂの代表例の結合活性。エストラジオール−ＢＳＡ（「ＥｓＢ」）に対するコントロールＦａｂおよびＴＦＰＩのパニングから選択される１２個のＦａｂ（１−４および６−１３）を試験した。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ結果の蛍光ユニットを示す。 短縮化ｄＰＴにより示されるとおり、ヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリーニングから取得された４個の代表的な抗ＴＦＰＩ抗体（４Ｂ７：ＴＰ−４Ｂ７、２Ａ８：ＴＰ−２Ａ８、２Ｇ６：ＴＰ−２Ｇ６、２Ｇ７：ＴＰ−２Ｇ７）の用量依存的インビトロ機能活性。実験は、ＴＦＰＩ欠損血漿にスパイクした０．５ ｕｇ／ｍＬのｍＴＦＰＩを含んでいた。 ＲＯＴＥＭアッセイにおいて試験された抗ＴＦＰＩ Ｆａｂ、Ｆａｂ−２Ａ８（ＴＰ−２Ａ８由来）のインビトロ機能活性。 ＩｇＧへの変換後のクローンＴＰ−２Ｇ６（「２Ｇ６」）のヒトＴＦＰＩおよびマウスＴＦＰＩの結合活性。Δ：マウスＴＦＰＩへのＩｇＧ−２Ｇ６結合；□：ヒトＴＦＰＩへのＩｇＧ−２Ｇ６；▲：マウスＴＦＰＩへのコントロールＩｇＧ結合；■：ヒトＩｇＧへのコントロールＩｇＧ結合。 抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）、ＴＰ−３Ｇ１（「３Ｇ１」）、およびＴＰ−３Ｃ２（「３Ｃ２」）は、ＲＯＴＥＭアッセイにおいて試験されたとおり、血友病Ａマウスにおける全血液凝固時間を短縮させた。各点は、一匹の個々の血友病Ａマウスを示す。 抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＴＰ−２Ａ１０（配列番号１８）、ＴＰ−２Ｂ１（配列番号２２）、ＴＰ−２Ａ２（配列番号２）、ＴＰ−２Ｇ２（配列番号６６）、ＴＰ−２Ａ５．１（配列番号６）、ＴＰ−３Ａ３（配列番号９８）、ＴＰ−２Ａ８（配列番号１４）、ＴＰ−２Ｂ８（配列番号３４）、ＴＰ−２Ｇ７（配列番号８２）、ＴＰ−４Ｈ８（配列番号１７０）、ＴＰ−２Ｇ４（配列番号７０）、ＴＰ−３Ｆ２（配列番号１３４）、ＴＰ−２Ａ６（配列番号１０）、ＴＰ−３Ａ２（配列番号９４）、ＴＰ−２Ｃ１（配列番号４２）、ＴＰ−３Ｅ１（配列番号１２６）、ＴＰ−３Ｆ１（配列番号１３０）、ＴＰ−３Ｄ３（配列番号１２２）、ＴＰ−４Ａ７（配列番号１５０）、ＴＰ−４Ｇ８（配列番号１６６）、ＴＰ−２Ｂ３（配列番号２６）、ＴＰ−２Ｆ９（配列番号６２）、ＴＰ−２Ｇ５（配列番号７４）、ＴＰ−２Ｇ６（配列番号７８）、ＴＰ−２Ｈ１０（配列番号９０）、ＴＰ−２Ｂ９（配列番号３８）、ＴＰ−２Ｃ７（配列番号４６）、ＴＰ−３Ｇ３（配列番号１４２）、ＴＰ−３Ｃ２（配列番号１１４）、ＴＰ−３Ｂ４（配列番号１１０）、ＴＰ−２Ｅ５（配列番号５８）、ＴＰ−３Ｃ３（配列番号１１８）、ＴＰ−３Ｇ１（配列番号１３８）、ＴＰ−２Ｄ７（配列番号５０）、ＴＰ−４Ｂ７（配列番号１５８）、ＴＰ−２Ｅ３（配列番号５４）、ＴＰ−２Ｇ９（配列番号８６）、ＴＰ−３Ｃ１（配列番号８６）、ＴＰ−３Ａ４（配列番号１０２）、ＴＰ−２Ｂ４（配列番号３０）、ＴＰ−３Ｈ２（配列番号１４６）、ＴＰ−４Ａ９（配列番号１５４）、ＴＰ−４Ｅ８（配列番号１６２）、およびＴＰ−３Ｂ３（配列番号１０６）の可変軽鎖間のアミノ酸配列アライメント。 抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＴＰ−２Ａ１０（配列番号２０）、ＴＰ−３Ｂ３（配列番号１０８）、ＴＰ−２Ｇ４（配列番号７２）、ＴＰ−２Ａ５．１（配列番号８）、ＴＰ−４Ａ９（配列番号１５６）、ＴＰ−２Ａ８（配列番号１６）、ＴＰ−２Ｂ３（配列番号２８）、ＴＰ−２Ｂ９（配列番号４０）、ＴＰ−２Ｈ１０（配列番号９２）、ＴＰ−３Ｂ４（配列番号１１２）、ＴＰ−２Ｃ７（配列番号４８）、ＴＰ−２Ｅ３（配列番号５６）、ＴＰ−３Ｃ３（配列番号１２０）、ＴＰ−２Ｇ５（配列番号７６）、ＴＰ−４Ｂ７（配列番号１６０）、ＴＰ−２Ｇ６（配列番号８０）、ＴＰ−３Ｃ２（配列番号１１６）、ＴＰ−２Ｄ７（配列番号５２）、ＴＰ−３Ｇ１（配列番号１４０）、ＴＰ−２Ｅ５（配列番号６０）、ＴＰ−２Ｂ８（配列番号３６）、ＴＰ−３Ｆ１（配列番号１３２）、ＴＰ−３Ａ３（配列番号１００）、ＴＰ−４Ｅ８（配列番号１６４）、ＴＰ−４Ａ７（配列番号１５２）、ＴＰ−４Ｈ８（配列番号１７２）、ＴＰ−２Ａ６（配列番号１２）、ＴＰ−２Ｃ１（配列番号４４）、ＴＰ−３Ｇ３（配列番号１４４）、ＴＰ−２Ｂ１（配列番号２４）、ＴＰ−２Ｇ７（配列番号８４）、ＴＰ−３Ｈ２（配列番号１４８）、ＴＰ−２Ａ２（配列番号４）、ＴＰ−３Ｅ１（配列番号１２８）、ＴＰ−２Ｇ２（配列番号６８）、ＴＰ−３Ｄ３（配列番号１２４）、ＴＰ−２Ｇ９（配列番号８８）、ＴＰ−２Ｂ４（配列番号３２）、ＴＰ−３Ａ２（配列番号９６）、ＴＰ−２Ｆ９（配列番号６４）、ＴＰ−３Ａ４（配列番号１０４）、ＴＰ−３Ｃ１（配列番号１３６）、ＴＰ−３Ｆ２（配列番号１３６）、およびＴＰ−４Ｇ８（配列番号１６８）の可変重鎖間のアミノ酸配列アライメント。 （１）抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）、（２）２Ａ８および組み換え第ＶＩＩＩ因子、（３）マウスＩｇＧ、ならびに（４）組み換え第ＶＩＩＩ因子で処理されたマウスについて、尾静脈切断後２４時間にわたる生存率を示す図式。 抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）、第ＶＩＩａ因子、および２Ａ８と第ＶＩＩａ因子の組み合わせで処理されたマウスについて、血液凝固時間および血栓形成時間アッセイを示す図式。 ＦＶＩＩＩインヒビター単独の場合と比較して、ＦＶＩＩＩインヒビターと抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）および抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−４Ｂ７（「４Ｂ７」）で処理された正常なヒト血液についての血液凝固時間を示す図式。

詳細な説明
本明細書で使用される「組織因子経路インヒビター」または「ＴＦＰＩ」なる用語は、天然において細胞で発現するヒトＴＦＰＩのすべての変異型、アイソフォームおよび種ホモログを意味する。本発明の好ましい態様において、本発明の抗体のＴＦＰＩへの結合は、血液凝固時間を減少させる。

本明細書で使用される「抗体」は、全抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）もしくは一本鎖を意味する。該用語は、天然で生じるか、もしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組み換え工程により形成される全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または特定の結合活性を保持する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗体断片を含む。構造にかかわらず、抗体断片は、全長抗体により認識されるものと同一の抗原と結合する。例えば、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体断片は、ＴＦＰＩのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により行われ得る。抗体の「抗原結合部分」なる用語の範囲内に包含される結合断片の例は、下記を含む：（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合した２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは、別々の遺伝子によりコードされるが、組み換え法を用いて、それらを単一タンパク質鎖として結合させる合成リンカーによりそれらを結合させることができ、そこでは、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、対となって一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知である；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」なる用語の範囲内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に既知の慣用的な技術を用いて取得され、該断片は、インタクト抗体と同様の方法で使用のためにスクリーニングされる。

本明細書で使用される「結合を阻害する」および「結合を妨害する」なる用語（例えば、ＴＦＰＩリガンドのＴＦＰＩへの結合の阻害／妨害を参照のこと）は、同義であり、部分的および完全な阻害もしくは妨害の両方を包含する。阻害および妨害はまた、抗ＴＦＰＩ抗体と接触させていないＴＦＰＩと比較して、抗ＴＦＰＩ抗体と接触させた場合におけるＴＦＰＩと生理学的な基質との結合親和性の任意の測定可能な減少、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％までのＴＦＰＩと第Ｘａ因子の相互作用の妨害、またはＴＦＰＩ−第Ｘａ因子複合体と組織因子、第ＶＩＩａ因子もしくは組織因子／第ＶＩＩａ因子の複合体の相互作用の妨害を含むことが意図される。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについての単一結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体を意味する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発によるか、またはインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含み得る。

本明細書で使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に存在しない抗体を意味することが意図される（例えば、ＴＦＰＩに結合する単離抗体は、ＴＦＰＩ以外の抗原に結合する抗体が実質的に存在しない）。しかしながら、ヒトＴＦＰＩのエピトープ、アイソフォームもしくは変異型に結合する単離抗体は、例えば他の種に由来する他の関連抗原（例えば、ＴＦＰＩ種ホモログ）との交差反応を有する。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質が実質的に存在しないことであり得る。

本明細書で使用される「特異的結合」は、所定の抗原に結合する抗体を意味する。一般に、抗体は、少なくとも約１０^５Ｍ^−１の親和性で結合し、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の無関係な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合する親和性よりも高い親和性、例えば、少なくとも２倍以上の親和性で所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」なる用語は、本明細書において「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と同義である。

本明細書で使用されるＩｇＧ抗体についての「高親和性」なる用語は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、ある態様において、少なくとも約１０^８Ｍ^−１、ある態様において、少なくとも約１０^９Ｍ^−１、１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１もしくはそれ以上、例えば、１０^１３Ｍ^−１もしくはそれ以上までの結合親和性を意味する。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについて変わり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての「高親和性」結合は、少なくとも約１．０ｘ１０^７Ｍ^−１の結合親和性を意味する。本明細書で使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭもしくはＩｇＧ１）を意味する。

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合する抗原の三次元構造に相補的なＮ末端抗原結合表面を形成する抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３個の超可変領域のうちの１個を意味する。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの相補性決定領域は、各々「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」として示される。ＣＤＲは、抗原−抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は、抗原−抗体結合に特異的な特定の領域を含む。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲ領域を含む６個のＣＤＲを含み得る。

本明細書で使用される「保存的置換」は、１個またはそれ以上のアミノ酸の、類似の生化学的特性を有するアミノ酸での置換を含み、ポリペプチドの生物学的もしくは生化学的機能の欠損を生じないポリペプチドの修飾を意味する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β鎖側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。本発明の抗体は、保存的アミノ酸置換を有し得て、なお活性を保持していることが想定される。

核酸およびポリペプチドについて、「実質的な相同性」なる用語は、２個の核酸もしくは２個のポリペプチド、またはその指定された配列が適当なヌクレオチドまたはアミノ酸挿入もしくは欠失を伴って最適に並べられ、比較された場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％において、通常は少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、または９９．５％において同一であることを示す。あるいは、核酸についての実質的な相同性は、断片が選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合に存在する。本発明は、本明細書に記載された特定の核酸配列およびアミノ酸配列と実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列を含む。

２個の配列間の％同一性は、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した配列により共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、％同一性＝同一の位置の数 ／ 位置の全数 ｘ １００）、それは、２個の配列の最適アライメントについて導入される必要がある。配列の比較および２個の配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズム、例えば、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（商標）のＡｌｉｇｎＸ（商標）モジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いて達成され得る。ＡｌｉｇｎＸ（商標）について、多重アライメントの既定パラメーターは、下記のとおりである：ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）：１０；ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲（ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ｒａｎｇｅ）：８；アライメント遅延（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｄｅｌａｙ）についての％同一性：４０．（さらなる詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｏｎｌｉｎｅ−Ｇｕｉｄｅｓ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ／Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ−ａｎｄ−ｄａｔａ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−ｆｏｒ−ＰＣｓ／ＡｌｉｇｎＸ−Ｍｏｄｕｌｅ−ｆｏｒ−Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ａｄｖａｎｃｅ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌにおいて見出される）。

クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体一致を決定する他の方法（また、グローバル配列アライメントと呼ばれる）は、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， ２（２２）：４６７３−４６８０）を用いて決定され得て、それは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．のアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ）， １９９２， ８（２）：１８９−１９１）に基づくものである。配列アライメントにおいて、クエリーおよび対象配列の両方は、ＤＮＡ配列である。該グローバル配列アライメントの結果は、％同一性である。ペアワイズアライメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）により％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、下記のとおりである：マトリクス＝ＩＵＢ、ｋ−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝１、Ｔｏｐ Ｄｉａｇｏｎａｌｓの数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔｏｐ Ｄｉａｇｏｎａｌｓ）＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１。多重アライメントについて、下記のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメーターが好ましい：ギャップ開始ペナルティ＝１０，ギャップ伸長パラメーター＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アライメント遅延についての％同一性＝４０。

核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製されるか、もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。天然の環境において通常関連している他の細胞構成要素から分離された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｗａｙ）場合に、核酸は「単離される」か、または「実質的に純粋に」なる。核酸を単離するために、下記のような標準的な技術が使用され得る：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野において既知の他の技術。

モノクローナル抗体
ヒトＴＦＰＩに対するヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリーニングから４４個のＴＦＰＩ結合抗体が同定された。各モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域が塩基配列決定され、それらのＣＤＲ領域が同定された。各モノクローナル抗体のこれらの領域に相当する配列識別番号（「配列番号」）を表１に要約する。

表１． 各ＴＦＰＩ結合モノクローナル抗体の重鎖可変領域（「ＶＨ」）および軽鎖可変領域（「ＶＬ」）の配列識別番号（「配列番号」）の要約。各重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域（「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」）についての配列識別番号がまた提供される。Ｎ．Ａ．：核酸配列；Ａ．Ａ．：アミノ酸配列。

１つの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号３８８−４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗体が提供される。これらのＣＤＲ３は、パニングおよびスクリーニングの間に同定された抗体の重鎖から同定される。さらなる態様において、この抗体はさらに、（ａ）配列番号３０２−３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３４５−３８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号３０２−３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および配列番号３４５−３８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の両方を含む。

他の態様において、パニングおよびスクリーニングの間に同定される抗体の軽鎖の１つに由来するＣＤＲ３を共有する抗体が提供される。したがって、本発明は、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号２５９−３０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗体に向けられる。さらなる態様において、抗体はさらに、（ａ）配列番号１７３−２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２１６−２５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号１７３−２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および配列番号２１６−２５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の両方を含む。

他の態様において、抗体は、パニングおよびスクリーニングの間に同定される抗体の重鎖に由来するＣＤＲ３および軽鎖に由来するＣＤＲ３を含む。したがって、本発明は、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する抗体であって、配列番号３８８−４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３および配列番号２５９−３０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗体が提供される。さらなる態様において、抗体はさらに、（ａ）配列番号３０２−３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３４５−３８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７３−２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、および／または（ｄ）配列番号２１６−２５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含む。

他の特定の態様において、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１７３、２１６および２５９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０２、３４５および３８８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１７４、２１７および２６０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０３、３４６および３８９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１７５、２１８および２６１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０４、３４７および３９０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１７６、２１９および２６２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０５、３４８および３９１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１７７、２２０および２６３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０６、３４９および３９２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｆ）配列番号１７８、２２１および２６４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０７、３５０および３９３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｇ）配列番号１７９、２２２および２６５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０８、３５１および３９４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号１８０、２２３および２６６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３０９、３５２および３９５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉ）配列番号１８１、２２４および２６７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１０、３５３および３９６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｊ）配列番号１８２、２２５および２６８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１１、３５４および３９７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｋ）配列番号１８３、２２６および２６９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１２、３５５および３９８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｌ）配列番号１８４、２２７および２７０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１３、３５６および３９９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｍ）配列番号１８５、２２８および２７１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１４、３５７および４００を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｎ）配列番号１８６、２２９および２７２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１５、３５８および４０１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｏ）配列番号１８７、２３０および２７３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１６、３５９および４０２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｐ）配列番号１８８、２３１および２７４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１７、３６０および４０３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｑ）配列番号１８９、２３２および２７５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１８、３６１および４０４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｒ）配列番号１９０、２３３および２７６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３１９、３６２および４０５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｓ）配列番号１９１、２３４および２７７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２０、３６３および４０６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｔ）配列番号１９２、２３５および２７８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２１、３６４および４０７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｕ）配列番号１９３、２３６および２７９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２２、３６５および４０８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｖ）配列番号１９４、２３７および２８０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２３、３６６および４０９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｗ）配列番号１９５、２３８および２８１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２４、３６７および４１０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｘ）配列番号１９６、２３９および２８２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２５、３６８および４１１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｙ）配列番号１９７、２４０および２８３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２６、３６９および４１２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｚ）配列番号１９８、２４１および２８４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２７、３７０および４１３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ａａ）配列番号１９９、２４２および２８５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２８、３７１および４１４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂｂ）配列番号２００、２４３および２８６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３２９、３７２および４１５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃｃ）配列番号２０１、２４４および２８７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３０、３７３および４１６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｄｄ）配列番号２０２、２４５および２８８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３１、３７４および４１７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｅｅ）配列番号２０３、２４６および２８９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３２、３７５および４１８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｆｆ）配列番号２０４、２４７および２９０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３３、３７６および４１９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｇｇ）配列番号２０５、２４８および２９１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３４、３７７および４２０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｈｈ）配列番号２０６、２４９および２９２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３５、３７８および４２１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２０７、２５０および２９３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３６、３７９および４２２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｊｊ）配列番号２０８、２５１および２９４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３７、３８０および４２３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｋｋ）配列番号２０９、２５２および２９５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３８、３８１および４２４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｌｌ）配列番号２１０、２５３および２９６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３９、３８２および４２５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｍｍ）配列番号２１１、２５４および２９７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３４０、３８３および４２６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｎｎ）配列番号２１２、２５５および２９８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３４１、３８４および４２７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｏｏ）配列番号２１３、２５６および２９９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３４２、３８５および４２８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｐｐ）配列番号２１４、２５７および３００を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３４３、３８６および４２９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｑｑ）配列番号２１５、２５８および３０１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３４４、３８７および４３０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｒｒ）配列番号１９４、２３７および２８０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号３３５、３７８および４２１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。

他の態様において、本発明は、下記：
（ａ）配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号２０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号２４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｇ）配列番号２６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号２８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号３０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号３２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｉ）配列番号３４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｊ）配列番号３８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｋ）配列番号４２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｌ）配列番号４６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｍ）配列番号５０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｎ）配列番号５４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号５６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｏ）配列番号５８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号６０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｐ）配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号６４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｑ）配列番号６６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号６８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｒ）配列番号７０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号７２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｓ）配列番号７４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号７６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｔ）配列番号７８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｕ）配列番号８２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｖ）配列番号８６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｗ）配列番号９０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号９２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｘ）配列番号９４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号９６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｙ）配列番号９８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１００のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｚ）配列番号１０２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ａａ）配列番号１０６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｂｂ）配列番号１１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１１２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｃｃ）配列番号１１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１１６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｄｄ）配列番号１１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｅｅ）配列番号１２２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｆｆ）配列番号１２６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｇｇ）配列番号１３０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｈｈ）配列番号１３４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号１３８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１４０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｊｊ）配列番号１４２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１４４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｋｋ）配列番号１４６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１４８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｌｌ）配列番号１５０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１５２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｍｍ）配列番号１５４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１５６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｎｎ）配列番号１５８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６０のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｏｏ）配列番号１６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６４のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｐｐ）配列番号１６６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６８のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｑｑ）配列番号１７０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１７２のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；または
（ｒｒ）配列番号８６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３６のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域
を含む抗体に向けられる。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６８、および配列番号１７２で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域を含む、抗体がまた提供される。

ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９４、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４、配列番号１１８、配列番号１２２、配列番号１２６、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１５０、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６６、および配列番号１７０で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域を含む、抗体がまた提供される。

上記の配列識別子を用いた抗体記載に依存することに加えて、ある態様はまた、本明細書に記載された実験において単離されるＦａｂクローンにより記載され得る。ある態様において、組み換え抗体は、下記のクローンの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む：ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８。ある態様において、抗体はさらに、これらの抗体のＣＤＲ２を含み得て、さらにこれらの抗体のＣＤＲ１を含み得る。他の態様において、抗体はさらに、ＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る。

したがって、他の態様において、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域（ここで、該ヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の重鎖ＣＤＲ３である）；および（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域（ここで、該ヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の軽鎖ＣＤＲ３である）を含む抗ＴＦＰＩ抗体であって、ＴＦＰＩに結合する抗体が提供される。抗体はさらに、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の重鎖ＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ２を含み得る。抗体はさらに、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の重鎖ＣＤＲ１および／または軽鎖ＣＤＲ１を含み得る。

上記改変抗体のＣＤＲ１、２および／または３領域は、本明細書に記載されたＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８のＣＤＲ１、２および／または３領域の正確なアミノ酸配列を含み得る。

しかしながら、当業者は、ＴＦＰＩに効率的に結合する抗体の能力を保持する、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の正確なＣＤＲ配列からのいくらかの逸脱物が可能であり得ることを十分に理解している。したがって、他の態様において、改変抗体は、例えばＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の１個またはそれ以上のＣＤＲと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一である１個またはそれ以上のＣＤＲからなり得る。

抗体は、さまざまなクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体（これらに限定されるものではない）のいずれかであり得る。

１つの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに対する単離完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。

他の態様において、ヒト組織因子経路インヒビターのＫｕｎｉｔｚドメイン２に対する単離完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。

核酸
上記のモノクローナル抗体のいずれかをコードする単離核酸分子がまた提供される。

ＴＦＰＩに対する抗体の製造法
モノクローナル抗体は、宿主細胞において本発明の態様によるモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させることにより組み換え的に産生され得る。ヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクターの助けを得て、製造のために適当な宿主細胞に導入され、発現され得る。したがって、ヒトＴＦＰＩに結合するモノクローナル抗体を製造する方法であって、下記工程：
（ａ）本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程；
（ｂ）該宿主細胞を培養して、宿主細胞内においてモノクローナル抗体を発現させる工程；（ｃ）産生されたモノクローナル抗体を単離および精製する工程
を含み、ここで、該核酸分子が本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、方法がまた提供される。

１つの例において、抗体またはその抗体断片を発現させるために、標準的な分子生物学の技術により取得された部分もしくは全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが発現ベクターに挿入され、その結果、遺伝子が転写および翻訳制御配列と操作可能に結合する。本明細書において「操作可能に結合」なる用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するというそれらの意図される機能を発揮するように、抗体がベクターに連結されることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されるか、またはより一般には、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入され得る。抗体遺伝子は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限酵素部位の連結、または制限酵素部位が存在しない場合における平滑末端連結）。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、望まれるアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターにそれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製することができ、その結果、Ｖ_Ｈ断片は、ベクター内のＣ_Ｈ断片と操作可能に結合し、Ｖ_Ｌ断片は、クター内のＣ_Ｌ断片と操作可能に結合する。さらにあるいは、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで結合するように、ベクターにクローン化され得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。

抗体鎖をコードする遺伝子に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を有し得る。「制御配列」なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写もしくは翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望まれるタンパク質発現のレベルなどのような要因に依存し得ることが当業者により理解される。哺乳類宿主細胞発現のための制御配列の例は、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を志向するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス制御配列、例えば、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが使用され得る。

抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞内でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択可能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、Ａｘｅｌ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞において、薬剤、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。選択可能マーカー遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いたｄｈｆｒ−宿主細胞での使用のために）を含む。

軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的な技術により宿主細胞に導入される。「導入」なる用語のさまざまな形態は、外因性ＤＮＡの原核もしくは真核宿主細胞への導入のために通常使用される広範な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン導入などを包含することが意図される。原核もしくは真核宿主細胞内で本発明の抗体を発現させることが理論上は可能であるが、真核細胞、および最も好ましくは哺乳類宿主細胞における抗体の発現が、そのような真核細胞、および特定の哺乳類細胞が原核細胞と比較した場合に、適当に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を構築および分泌する可能性が高いために最も好ましい。

組み換え抗体を発現させるための哺乳類宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載されたｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞を含み、ＤＨＦＲ選択可能マーカー、例えば、Ｒ． Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ． Ａ． Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１−６２１に記載されたものと共に使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現または宿主細胞が増殖している培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法、例えば、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび遠心分離を用いて、培養培地から回収され得る。

インタクト抗体を発現させるための部分抗体配列の使用
抗体は、主に、６個の重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間で多様性がある。例えば、本発明によるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変部の各々におけるＣＤＲ領域が同定されている、図６および７を参照のこと。ＣＤＲ配列は、多くの抗体−抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列に移植された特定の天然で生じる抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然で生じる抗体の特性を模倣した組み換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；およびＱｕｅｅｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：１００２９−１００３３を参照のこと）。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースから取得され得る。これらの生殖細胞系列配列は、それらが完全に集合した可変遺伝子を含んでいない（Ｂ細胞成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）により形成される）ために、成熟した抗体遺伝子配列とは異なる。元の抗体と同様の結合特性を有するインタクト組み換え抗体を再構築するために、特定の抗体の全ＤＮＡ配列を取得することは必要ではない（ＷＯ ９９／４５９６２を参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的な重鎖および軽鎖配列は、一般にこの目的のために十分である。部分的配列は、どの生殖細胞系列可変および連結遺伝子断片が組み換え抗体可変遺伝子に関与するかを決定するために使用される。次いで、生殖細胞系列配列は、可変領域の欠損部分を埋めるために使用される。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の特性に関与しない。したがって、発現構築体のために対応する生殖細胞系列リーダー配列を使用する必要がある。欠損配列を付加するために、クローン化ｃＤＮＡ配列が、連結またはＰＣＲ増幅により合成オリゴヌクレオチドと組み合わされ得る。あるいは、全可変領域は、一組の短い重複オリゴヌクレオチドとして合成され、ＰＣＲ増幅により組み合わされ、全体の合成可変領域クローンが作製され得る。この工程は、特定の制限酵素部位の排除もしくは包含、または特定のコドンの最適化のような特定の利点を有する。

重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列は、重複する一組の合成オリゴヌクレオチドを設計するために使用され、天然の配列と同一のアミノ酸をコードする能力を有する合成Ｖ配列が作製される。合成重鎖およびκ鎖配列は、下記の３つの点で天然の配列とは異なり得る：繰り返しヌクレオチド塩基のストリングがオリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を促進するために遮断される；最適な翻訳開始部位がＫｏｚａｋルール（Ｋｏｚａｋ， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１９８６７−１９８７０）にしたがって組み込まれる；およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流で改変される。

重鎖および軽鎖可変領域について、最適なコード鎖配列および対応する非コード鎖配列は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ真ん中で３０−５０ヌクレオチド切片に切断される。したがって、各鎖について、オリゴヌクレオチドは、１５０−４００ヌクレオチドの断片にわたる重複二本鎖セットに構築され得る。次いで、該プールは、鋳型として使用され、１５０−４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物が産生される。一般に、単一の可変領域オリゴヌクレオチドセットは、２つのプールに分割され、それは、別々に増幅され、２個の重複ＰＣＲ産物が産生される。次いで、これらの重複産物は、ＰＣＲ増幅により組み合わされ、完全な可変領域が形成される。発現ベクター構築体に容易にクローン化され得る断片を作製するために、ＰＣＲ増幅において重鎖または軽鎖定常領域の重複断片を含むことがまた望ましくあり得る。

次いで、再構築された重鎖および軽鎖可変領域は、クローン化プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列、および転写終結配列と組み合わされ、発現ベクター構築体が形成される。重鎖および軽鎖発現構築体は、単一ベクターにおいて組み合わされ、宿主細胞に共導入、連続導入、または別々に導入され、次いで、誘導され、両鎖を発現する宿主細胞が形成される。

したがって、他の局面において、ヒト抗ＴＦＰＩ抗体、例えば、ＴＰ２Ａ８、ＴＰ２Ｇ６、ＴＰ２Ｇ７、ＴＰ４Ｂ７などの構造的特徴は、ＴＦＰＩに結合する機能を保持する、構造的に関連するヒト抗ＴＦＰＩ抗体を作製するために使用される。とりわけ、本発明のモノクローナル抗体の特に同定された重鎖および軽鎖領域の１個またはそれ以上のＣＤＲを既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組み換え的に結合させることができ、さらに組み換え的に改変された本発明のヒト抗ＴＦＰＩ抗体を作製し得る。

したがって、他の態様において、抗ＴＦＰＩ抗体を製造する方法であって、下記：（１）ヒト重鎖フレームワーク領域およびヒト重鎖ＣＤＲ（ここで、ヒト重鎖ＣＤＲ３は、配列番号３８８−４３０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む）および／または（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ（ここで、軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号２５９−３０１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む抗体（ここで、該抗体は、ＴＦＰＩに結合する能力を保持する）を製造することを含む、方法が提供される。他の態様において、該方法は、本発明の他のＣＤＲを用いて実施される。

医薬組成物
治療上有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物がまた提供される。「薬学的に許容される担体」は、製剤化を補助するか、もしくは製剤を安定させるために有効成分に加えられ得て、患者に対して顕著な副作用毒性効果を生じない物質である。そのような担体の例は、当業者に既知であり、水、糖、例えば、マルトースもしくはスクロース、アルブミン、塩、例えば、塩化ナトリウムなどを含む。他の担体は、例えば、Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。そのような組成物は、治療上有効量の少なくとも１個の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含み得る。

薬学的に許容される担体は、滅菌水性溶液もしくは分散剤および滅菌注射用溶液もしくは分散剤の即時調製用滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のための該媒体および物質の使用は、当分野において既知である。組成物は、好ましくは、非経腸投与のために製剤化される。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度のために適当な他の秩序構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびその適当な混合物を含む溶媒もしくは分散媒体であり得る。ある場合において、それは、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含み得る。

滅菌注射用溶液は、活性化合物を上記で列挙された１個またはそれ以上の成分の組み合わせを含む適当な溶媒に必要とされる用量で組み込み、その後、フィルター滅菌を行うことにより製造され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、必須の分散剤媒体および上記で列挙された必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより製造される。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合において、製造法のいくつかは、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それらは、上記のその滅菌ろ過溶液からの有効成分と任意のさらに望まれる成分の粉末を産生する。

医薬的使用
モノクローナル抗体は、先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損を処置するための治療目的で使用され得る。例えば、上記の態様におけるモノクローナル抗体は、ＴＦＰＩとＦＸａの相互作用を妨害するか、またはＴＦ／ＦＶＩＩａ活性のＴＦＰＩ依存的阻害を妨害するために使用され得る。さらに、モノクローナル抗体はまた、ＦＸａのＴＦ／ＦＶＩＩａ誘導産生を回復させ、ＦＸａのＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸ依存的増幅の不十分性をバイパスするために使用され得る。

モノクローナル抗体は、止血障害、例えば、血小板減少症、血小板障害および出血障害（例えば、血友病Ａおよび血友病Ｂ）の処置における治療的使用を有する。そのような障害は、治療上有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与することにより処置され得る。モノクローナル抗体はまた、外傷および脳卒中のような適応症における制御不能な出血の処置における治療的使用を有する。したがって、治療上有効量の本発明の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与することを含む、出血時間を短縮させるための方法がまた提供される。

抗体は、止血障害に取り組むべく、単剤療法として、または他の治療と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の１個またはそれ以上の抗体と第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子のような血液凝固因子の共投与は、血友病を処置するために有用であると考えられる。１つの態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第１量のモノクローナル抗体および（ｂ）第２量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含む、先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損を処置する方法であって、該第１量および第２量が共に該欠乏もしくは欠損を処置するのに有効である、方法が提供される。他の態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第１量のモノクローナル抗体および（ｂ）第２量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含む、先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損を処置する方法であって、該第１量および第２量が共に該欠乏もしくは欠損を処置するのに有効であり、さらに第ＶＩＩ因子が共投与されない、方法が提供される。本発明はまた、治療上有効量の本発明ののモノクローナル抗体および第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組み合わせを含むが、第ＶＩＩ因子を含まない、医薬組成物を含む。「第ＶＩＩ因子」は、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子を含む。これらの組み合わせ治療は、血液凝固因子の必要な点滴頻度を減少させ得る。共投与または組み合わせ治療は、各々別々に製剤化されるか、または１つの組成物中に共に製剤化される２個の治療剤の投与を意味し、別々に製剤化された場合には、ほぼ同じ時間点または異なる時間点で投与されるが、同じ治療期間である。

医薬組成物は、出血エピソードの重篤度と共に変わり得るか、または予防的治療の場合においては、患者の血液凝固欠損の重篤度と共に変わり得る用量および頻度で、血友病ＡもしくはＢを患う対象に非経腸で投与され得る。

組成物は、それを必要とする患者に、ボーラス投与として、または持続点滴により投与され得る。例えば、Ｆａｂ断片として存在する本発明の抗体のボーラス投与は、０．００２５から１００ ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５から０．２５ ｍｇ／ｋｇ、０．０１０から０．１０ ｍｇ／ｋｇまたは０．１０−０．５０ ｍｇ／ｋｇの量であり得る。持続点滴について、Ｆａｂ断片として存在する本発明の抗体は、１−２４時間、１−１２時間、２−１２時間、６−１２時間、２−８時間、または１−２時間の間、０．００１から１００ ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５から１．２５ ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から０．７５ ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から１．０ ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０−０．５０ ｍｇ／ｋｇ／分で投与され得る。全長抗体（全長定常領域を有する）として存在する本発明の抗体の投与について、投与量は、約１−１０ ｍｇ／ｋｇ体重、２−８ ｍｇ／ｋｇ、または５−６ ｍｇ／ｋｇであり得る。そのような全長抗体は、一般に、３０分から３時間延長した点滴により投与され得る。投与の頻度は、状態の重篤度に依存し得る。頻度は、週に３回から２もしくは３週毎に１回の範囲内であり得る。

さらに、組成物は、皮下注射により患者に投与され得る。例えば、１０から１００ ｍｇの抗ＴＦＰＩ抗体の用量が、週１回、２週間に１回、または月１回、皮下注射により患者に投与され得る。

本明細書で使用される「治療上有効量」は、それを必要とする患者にインビボでの血液凝固時間を有効に増大させるか、またはインビボで測定可能な利益を生じるのに必要である抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体または該抗体と第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子の組み合わせの量を意味する。正確な量は、治療組成物の構成要素および物理的特性、意図される患者集団、個々の患者の考慮事項などを含むがこれらに限定されない多くの要因に依存し、当業者により容易に決定され得る。

実施例
一般的な材料および方法
実施例１． ヒトＴＦＰＩに対するヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリーニング
ＴＦＰＩに対するヒト抗体ライブラリーのパニング
ヒトＴＦＰＩ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）に対するファージディスプレイコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーＨｕＣａｌ Ｇｏｌｄ（Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２００８， ３７６：１１８２−１２００）をパニングすることにより、抗ＴＦＰＩ抗体を選択した。要約すると、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、４℃で一晩、２００ μｌのＴＦＰＩ（５ μｇ／ｍｌ）で被覆し、次いで、プレートを、５％ ミルクを含むＰＢＳバッファーでブロックした。０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを洗浄した後、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーのアリコートをＴＦＰＩで被覆されたウェルに加え、２時間インキュベートした。非結合ファージをＰＢＳＴで洗い流し、抗原結合ファージをジチオスレイトールで溶出し、Ｅ． ｃｏｌｉ株ＴＧ１に感染させ、増幅させた。次回のパニングのために、ヘルパーファージによりファージをレスキューした。全３回のパニングを行い、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、最後の２回からのクローンをヒトＴＦＰＩに対してスクリーニングした。

ＥＬＩＳＡでの抗原結合による抗体クローンのスクリーニング
ヒトＴＦＰＩに結合する抗体クローンを選択するために、２回目および３回目のパニングからのファージクローンのＦａｂ遺伝子を細菌発現ベクターにサブクローン化し、Ｅ． ｃｏｌｉ株ＴＧ１において発現させた。細菌溶解物をヒトＴＦＰＩ被覆化Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに加えた。洗浄後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦａｂを検出抗体として使用し、過酸化水素を含むＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることにより、プレートを発現させた。バックグラウンドよりも少なくとも５倍以上高いシグナルを陽性として考えた。抗ヒトＴＦＰＩ抗体のマウスＴＦＰＩに対する交差反応を、同様のマウスＴＦＰＩ結合ＥＬＩＳＡにより決定した。プレートをマウスＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＢＳＡおよびリゾチームで被覆した。最後の２個の抗原（ＢＳＡおよびリゾチーム）をネガティブコントロールとして使用した。代表的な一組のデータを図１に示す。

抗ＴＦＰＩヒト抗体の配列
ＴＦＰＩに対するＨｕＣａｌ Ｇｏｌｄヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリーニング後、ＤＮＡ塩基配列決定を陽性抗体クローンについて行い、４４個の特定の抗体配列を生じた（表２）。これらの抗体配列の内、２９個がλ軽鎖であり、１５個がκ軽鎖であった。重鎖可変領域の我々の解析は、２８個のＶＨ３、１４個のＶＨ６、１個のＶＨ１および１個のＶＨ５を示す。

表２． ４４個の抗ＴＦＰＩ抗体の可変領域のペプチド配列

マウスＴＦＰＩに対する交差反応
上記４４個のヒトＴＦＰＩ結合クローンをまた、ＥＬＩＳＡによりマウスＴＦＰＩへの結合について試験した。１９個の抗体について、マウスＴＦＰＩに対する交差反応が見出された。マウス血友病モデルを用いた試験を容易にするために、我々はさらに、これらの１９個の抗体およびヒトＴＦＰＩに特異的な５個の抗体を特徴づけた。代表的な一組のデータを図１に示す。これらの抗体のいずれもがＥＬＩＳＡにおいてＢＳＡまたはリゾチームに結合しなかった。

実施例２． 抗ＴＦＰＩ抗体の発現および精製
抗ＴＦＰＩ抗体（Ｆａｂ断片として）を細菌株ＴＧ１において発現させ、精製した。要約すると、抗体発現プラスミドを含む細菌株ＴＧ１の単一コロニーを取り出し、３４ μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールおよび１％ グルコースの存在下、８ ｍｌの２ｘＹＴ培地で一晩増殖させた。７ ｍｌ容量の培養物を、３４ μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールおよび０．１％ グルコースを含む２５０ ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ培地に移した。インキュベーションの３時間後、Ｆａｂ発現を誘導するために、０．５ ｍＭ ＩＰＴＧを加えた。培養を、２５℃で一晩、継続した。培養物を遠心分離し、細菌細胞を沈殿させた。次いで、沈殿物をＢｕｇ Ｂｕｓｔｅｒ溶解バッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁した。遠心分離後、細菌溶解物の上清をろ過した。製造者の指示にしたがって、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を介して、Ｆａｂ断片を親和性精製した。

実施例３． 抗ＴＦＰＩ抗体のＥＣ_５０および結合親和性の決定
精製化Ｆａｂ抗体を用いて、抗ＴＦＰＩ抗体のヒトもしくはマウスＴＦＰＩに対するＥＣ_５０を決定した。上記と同様に、ＥＣ_５０をＥＬＩＳＡにより評価した。ＳｏｆｔＭａｘを用いて、結果を解析した。抗ＴＦＰＩ抗体の結合親和性をＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて決定した。要約すると、抗原（すなわち、ヒトもしくはマウスＴＦＰＩ）を、製造者の指示にしたがって、アミンカップリングキット（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を用いてＣＭ５−チップに固定した。固定化ＴＦＰＩの量を、約３００ ＲＵを提供する抗原量に調整した。抗体Ｆａｂを移動相において解析し、精製化抗体の少なくとも５個の異なる濃度（０．１、０．４、１．６、６．４および２５ ｎＭ）をＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて使用した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、動力学および結合親和性を計算した。

表３で示されるとおり、２４個の抗ＴＦＰＩ Ｆａｂは、ヒトＴＦＰＩ（０．０９から７９２ ｎＭ）およびマウスＴＦＰＩ（０．０６から１０３５ ｎＭ）に対するさまざまなＥＣ_５０を示し、したがって、Ｂｉａｃｏｒｅにより決定された親和性は、ヒトＴＦＰＩに対してさまざまであった（１．２５から１１４０ ｎＭ）。マウスＴＦＰＩに対するＦａｂのＢｉａｃｏｒｅ試験において、親和性のバリエーションはより小さかった（３．０８から５１．８ ｎＭ）。

表３． ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅにより決定されたヒトもしくはマウスＴＦＰＩに対する２４個の抗体の結合活性（ｈＴＦＰＩ：ヒトＴＦＰＩ；ｍＴＦＰＩ：マウスＴＦＰＩ；Ｎｅｇ：シグナルは、バックグラウンドの２倍未満であった；ＮＤ：実施なし）

実施例４． 抗ＴＦＰＩ ＦａｂのＩｇＧへの変換
同定されたすべての抗ＴＦＰＩ抗体は完全ヒトＦａｂであり、それは、治療剤としてヒトＩｇＧに適当に変換され得る。しかしながら、この実施例にいて、選択されたＦａｂを、マウスモデルにおける試験のためにより適当なマウスＩｇＧ定常領域を含むキメラ抗体に変換した。選択された抗体の可変領域を、マウス定常領域を含む哺乳類発現ベクターに移植した。次いで、完全集合ＩｇＧ分子をＨＫＢ１１細胞に導入して、発現させた（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００６， ３４：１６５−１７８）。培養物上清を回収して、濃縮した。製造者の指示にしたがって、Ｈｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して、抗ＴＦＰＩ ＩｇＧ分子を親和性精製した。

実施例５． 抗ＴＦＰＩ中和抗体の選択
抗ＴＦＰＩ中和抗体を、３個の実験条件下でのＴＦＰＩ活性の阻害に基づいて選択した。ＴＦＰＩの活性を、ＡＣＴＩＣＨＲＯＭＥ（登録商標）ＴＦＰＩ活性アッセイ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．， Ｓｔａｍｆｏｒｄ， ＣＴ）（すなわち、第Ｘ因子を活性化して第Ｘａ因子にするＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の触媒活性を阻害するＴＦＰＩの能力を測定するための三段階発色アッセイ）を用いて測定した。抗ＴＦＰＩ抗体の中和活性は、回復したＦＸａ産生量に比例する。最初の設定において、精製化抗ＴＦＰＩ抗体を、示された濃度でヒトもしくはマウス組み換えＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、サンプルをＴＦ／ＦＶＩＩａおよびＦＸと混合し、次いで、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の残余活性を、高度に特異的なｆＸａ発色基質であるＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ（登録商標）ＦＸａを用いて測定した。この基質は、該アッセイにおいて産生されるＦＸａによってのみ切断され、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）発色団を放出し、それを４０５ ｎｍで測定した。サンプル中に存在するＴＦＰＩ活性を、既知のＴＦＰＩ活性レベルを用いて構築された標準曲線から補間した。アッセイをエンドポイント様式で行った。他の２個の設定において、抗ＴＦＰＩ抗体を正常なヒト血漿もしくは血友病Ａ血漿にスパイクし、回復したＦＸａ産生を測定した。

実施例６． 抗ＴＦＰＩ抗体は、希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）アッセイにおいて血液凝固時間を短縮する
本質的にＷｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．， １９９１， ６４（２）：２１３−２２２に記載されたとおり、ｄＰＴアッセイを行った。要約すると、ヒト正常血漿（ＦＡＣＴ， Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、ヒトＴＦＰＩ欠損血漿（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）または血友病Ａ血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を、血漿と０．１当量のコントロールバッファーまたは抗ＴＦＰＩ抗体を混合することにより調整した。２５℃で３０分間のインキュベーション後、血漿サンプル（１００ μｌ）を、トロンボプラスチンの起源として２００ μｌの適当に希釈された（１：５００希釈）Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（Ｂｉｏｍｅｔｉｅｕｘ）と組み合わせて、ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ ＳＴＡ４（Ｓｔａｇｏ）を用いて血液凝固時間を決定した。ＰＢＳまたは０．１ Ｍ 塩化ナトリウム、０．１％ ウシ血清アルブミンおよび２０ μＭ 塩化カルシウムを含む０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓに基づくバッファー（ｐＨ ７．５）で、トロンボプラスチンを希釈した。

実施例７． 抗ＴＦＰＩ抗体単独または抗ＴＦＰＩ抗体と組み換え第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子の組み合わせは、ＲＯＴＥＭアッセイにおいて血液凝固時間を短縮する
ＲＯＴＥＭシステム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ）は、４チャンネル装置、コンピューター、血漿標準物、アクチベーターならびに使い捨てカップおよびピン（ｃｕｐｓ ａｎｄ ｐｉｎｓ）を含んでいた。ＲＯＴＥＭ止血システムのトロンボエラストグラフィパラメーターは、下記を含んでいた：血液凝固を開始するための反応時間を反映する血液凝固時間（ＣＴ）（データ収集の開始後、２ ｍｍの振幅を得るために必要とされる時間）；血液凝固増幅を反映する血栓形成時間（ＣＦＴ）およびα角、ならびに血栓の硬度を反映する最大振幅および最大弾性係数。ＲＯＴＥＭアッセイにおいて、３００ μｌの新鮮なクエン酸全血もしくは血漿を評価した。製造者の指示にしたがって、すべての構成要素を再構成し、混合しつつ、各システムのために必要とされる期間の間、データを収集した。要約すると、２０ μｌのＣａＣｌ_２（２００ ｍｍｏｌ）を加えながら、３００ μｌの血液もしくは血漿を、自動ピペットを用いてＲＯＴＥＭカップ内で回収／分配する（ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ／ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）ことにより、サンプルを混合し、その直後にサンプルを混合し、データ収集を開始した。コンピューター制御（ソフトウェア２．９６版）ＲＯＴＥＭシステムを用いて、データを２時間収集した。

血液凝固時間の短縮における抗ＴＦＰＩ抗体の効果を検出するためのＲＯＴＥＭアッセイの例示的な結果を図３および５に示す。図３は、ＴＰ−２Ａ８−Ｆａｂを単独で、または組み換えＦＶＩＩＩと組み合わせた場合に、ヒト血友病Ａ血漿またはマウス血友病Ａ全血における血液凝固時間を短縮させることを示す（ＲＯＴＥＭシステムをＮＡＴＥＭで開始させた）。図５は、ＩｇＧ様式での抗ＴＦＰＩ抗体（ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−３Ｇ１およびＴＰ−３Ｃ２）がネガティブコントロールマウスＩｇＧ抗体と比較して血液凝固時間を短縮したことを示す。これらの結果および当分野における理解に基づいて、当業者は、これらの抗ＴＦＰＩ抗体と組み換えＦＩＸの組み合わせがまた、これらの抗体単独の場合と比較して血液凝固時間を短縮させることを予測し得る。

実施例８． 抗ＴＦＰＩ抗体のインビトロ機能活性
ＴＦＰＩの機能妨害についてＴＦＰＩ抗体を調べるために、発色アッセイＡＣＴＩＣＨＲＯＭＥおよび希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）を用いて、パニングおよびスクリーニングから得られた抗体の機能活性を試験した。両アッセイにおいて、モノクローナルラット抗ＴＦＰＩ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）をポジティブコントロールとして用い、ヒトポリクローナルＦａｂをネガティブコントロールとして用いた。発色アッセイにおいて、８個の抗体は、ラットモノクローナル抗体と比較して５０％以上ＴＦＰＩ活性を阻害した（表４）。ｄＰＴアッセイにおいて、これらの８個の抗ＴＦＰＩ Ｆａｂのすべては、高い阻害活性（８０秒未満まで血液凝固時間を短縮する）を示し、８個中４個のＦａｂは、７０秒未満のｄＰＴを示した。ｄＰＴの短縮における４個の代表的なクローンの用量依存性を図２に示す。しかしながら、低いＴＦＰＩ阻害活性を示すか、またはＴＦＰＩ阻害活性を示さない他のヒト抗ＴＦＰＩ Ｆａｂはまた、ｄＰＴにおける血液凝固時間を短縮した。例えば、ＴＰ−３Ｂ４およびＴＰ−２Ｃ７は、２５％未満の阻害活性を示すのみであったが、７０秒未満までｄＰＴを短縮し得た。阻害性活性およびｄＰＴの単純な線形回帰解析は、有意な相関を示す（ｐ＝０．００９５）が、大きな分散を有する（決定係数（Ｒ ｓｑｕａｒｅ）＝０．２５８）。

表４． ヒトＴＦＰＩアッセイおよびｄＰＴアッセイでの阻害活性により決定された抗ＴＦＰＩ抗体のインビトロ機能活性

抗ＴＦＰＩ Ｆａｂの中の一つであるＦａｂ−２Ａ８をまたＲＯＴＥＭアッセイにおいて試験し、ここで、低いレベルの第ＶＩＩＩ因子を有するヒト血友病Ａ血漿またはマウス血友病Ａ全血を使用した。図３に示されたとおり、ポリクローナルウサギ抗ＴＦＰＩ抗体と比較すると、Ｆａｂ−２Ａ８は、ヒト血友病Ａ血漿において同様の活性を示し、２２００秒から約１７００秒まで血液凝固時間（ＣＴ）を減少させた。マウス血友病Ａ全血を使用すると、コントロール抗体であるウサギ抗ＴＦＰＩは、２７００秒から１０００秒までＣＴを短縮し、Ｆａｂ−２Ａ８は、２６５０秒から１７００秒までＣＴを短縮した。これらの結果は、Ｆａｂ−２Ａ８がヒト血漿およびマウス血液において血液凝固時間を有意に短縮させ得ることを示す（ｐ＝０．０３）。

実施例９． キメラＩｇＧへの変換後の抗ＴＦＰＩ抗体の機能
第Ｘａ因子産生および希釈プロトロンビン時間のインビトロアッセイは、２４個の抗ＴＦＰＩ Ｆａｂ、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｇ１およびＴＰ−４Ｂ７のうちの少なくとも６個がＴＦＰＩ機能を妨害し得ることを示す。血友病Ａマウスを用いたインビボ試験を容易にするために、我々は、マウスＩｇＧ１アイソタイプを用いてこれらの６個の抗ＴＦＰＩヒトＦａｂキメラＩｇＧに変換した。ＩｇＧ発現ベクターをＨＫＢ１１細胞に導入し、発現した抗体を培養上清において回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムで精製した。代表的なクローンである２Ｇ６−ＦａｂをＩｇＧに変換すると、２Ｇ６−ＩｇＧは、ヒトＴＦＰＩに結合するＥＣ_５０の２倍の増加（０．４８ ｎＭから０．２２ ｎＭ）およびマウスＴＦＰＩに結合するＥＣ_５０のの１０倍の増加（５．１８ ｎＭから０．５１ ｎＭ）を示した。ヒトおよびマウスＴＦＰＩに結合するＩｇＧ−２Ｇ６の結果を図４に示す。

実施例１０． 血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウス尾静脈切断モデルにおける生存率についての効果
薬理学的評価のために、マウス尾静脈切断モデルを確立した。このモデルは、正常な個体と重篤な血友病の間で観察される広範囲にわたる出血表現型をシュミレートする。これらの試験のために、血友病Ａ雄マウス（８週齢、２０から２６ ｇ）を用いた。尾静脈投与により、損傷前に、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体（４０ μｇ／マウス）を単独で、または血液凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ（０．１ ＩＵ／マウス）と共にマウスに投与した。投与の２４時間後に、先端から２．７ ｍｍの位置で（直径で）、左尾静脈を切断した。切断後２４時間にわたって、生存を観察した。組み換えＦＶＩＩＩと共に提供されると、生存率は、用量依存的であることが示された（データは示していない）。図８で示されるデータは、別々の試験からのものであった（各々、ｎ＝１５およびｎ＝１０）。結果は、ＴＰ−２Ａ８−ＩｇＧが、コントロールマウスＩｇＧと比較して血友病Ａマウスの生存率を有意に延長させ、組み換えＦＶＩＩＩと組み合わされた場合には、薬剤単独の場合と比較して改善された生存率を示すことを示した。

実施例１１． 抗ＴＦＰＩ抗体と組み換え第ＶＩＩａ因子の組み合わせはさらに、血液凝固時間および血栓形成時間を短縮した
抗ＴＦＰＩ抗体および組み換えＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）の組み合わせ効果を、ＥＸＴＥＭ（１：１０００希釈）およびマウス血友病Ａ全血を用いて、ＲＯＴＥＭシステムにより評価した。示された量の抗ＴＦＰＩ抗体、ＴＰ−２Ａ８−ＩｇＧ（「２Ａ８」）、および組み換えＦＶＩＩａ（「ＦＶＩＩａ」）を３００ μｌのクエン酸マウス血友病Ａ全血に加えて、ＥＸＴＥＭシステムにより血液凝固を開始させた。図９は、ＴＰ−２Ａ８−ＩｇＧまたは組み換えＦＶＩＩａのマウス血友病Ａ全血への添加が、それぞれ血液凝固時間および血栓形成時間を短縮させることを示す。ＴＰ−２Ａ８−ＩｇＧおよび組み換えＦＶＩＩａ（「２Ａ８ ＋ ＦＶＩＩａ」）の組み合わせはさらに、血液凝固時間および血栓形成時間を短縮させ、これは、抗ＴＦＰＩ抗体と組み換えＦＶＩＩａの組み合わせがインヒビターを有するか、もしくは有さない血友病患者の処置において有用であることを示す。

実施例１２． 抗ＴＦＰＩ抗体は、ＦＶＩＩＩインヒビター誘導ヒト血友病血液における血液凝固時間を短縮した
非血友病患者から採取された全血において血友病を誘導する中和ＦＶＩＩＩ抗体を用いたＲＯＴＥＭアッセイで、選択された抗ＴＦＰＩ抗体である２Ａ８および４Ｂ７をまた試験した。図１０は、正常なヒト血液が約１０００秒の血液凝固時間を有することを示す。ＦＶＩＩＩ中和抗体（ＰＡＨ， １００ μｇ／ｍＬ）の存在下において、血液凝固時間は、約５２００秒まで延長された。延長された血液凝固時間は、抗ＴＦＰＩ抗体である２Ａ８または４Ｂ７の添加により有意に短縮され、これは、抗ＴＦＰＩ抗体がインヒビターを有する血友病患者の処置において有用であることを示す。

実施例１３． 阻害性抗ＴＦＰＩ抗体は、ヒトＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２に結合する
ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡを用いて、阻害性抗体がＴＦＰＩのどのドメインに結合するかを決定した。組み換え全長ヒトＴＦＰＩもしくはＴＦＰＩドメインをこれらの試験のために使用した。実施例３と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。ウエスタンブロットにおいて、ヒトＴＦＰＩもしくはドメインを、４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ ＰＡＧＥランニングバッファーＭＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に流し、次いで、セルロース膜に移した。阻害性抗体と共に１０分間インキュベーションした後、ＳＮＡＰｉｄシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を用いて膜を３回洗浄した。１から１０，０００希釈でのＨＲＰ結合ロバ抗マウス抗体（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を膜と共に１０分間インキュベートした。同様の洗浄工程後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ ）を用いて、膜を発現させた。コントロール抗Ｋｕｎｉｔｚドメイン１抗体は、全長ＴＦＰＩ、切断型ＴＦＰＩおよびドメインに結合するが、阻害性抗ＴＦＰＩ抗体は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２を含むＴＦＰＩにのみ結合する。これは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２への結合が抗体の阻害性作用のために必要であることを示す。

表５． ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより決定された抗体が結合するドメイン

本発明は、特定の態様および実施例に関して記載されているが、さまざまな修飾および変化が可能であり、本発明の真の精神および範囲から離れることなく同等物が置換され得るものと理解されるべきである。したがって、明細書および実施例は、限定的な意味ではなく例示的なものとして捉えられるべきである。さらに、本明細書に記載されたすべての記事、書籍、特許出願および特許は、引用により本明細書の一部とする。

Claims (18)

1. ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉｔｚドメイン２を含む結合部位に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体を含む、治療組成物であって、抗体重鎖が配列番号１６と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列から構成され、抗体軽鎖が配列番号１４と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列から構成され、前記重鎖が配列番号３０５に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号３４８に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号３９１に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有し、前記軽鎖が配列番号１７６に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号２１９に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号２６２に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有し、かつ該ヒトモノクローナルＩｇＧがＴＦＰＩ活性の５０％以上の阻害を示す、組成物。
2. 第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 第ＶＩＩ因子が存在しない、請求項２に記載の組成物。
4. 抗体が表面プラズモン共鳴分析法により、１．２５から１１４０ｎＭのヒトＴＦＰＩへの結合親和性を有する、請求項１に記載の組成物。
5. 抗体が皮下注射用の薬学的に許容される担体中に製剤化される、請求項１に記載の組成物。
6. 抗体が一本鎖の断片である、請求項１に記載の組成物。
7. 抗体重鎖が配列番号１６に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１に記載の組成物。
8. 抗体軽鎖が配列番号１４に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１に記載の組成物。
9. 抗体が表面プラズモン共鳴分析法により、１．２５ｎＭのヒトＴＦＰＩへの結合親和性を有する、請求項１に記載の組成物。
10. 抗体が注射用の薬学的に許容される担体中に１０から１００ｍｇの用量で製剤化される、請求項１に記載の組成物。
11. ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉｔｚドメイン２を含む結合部位に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体を含む、治療組成物であって、抗体重鎖が配列番号１６０と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列から構成され、抗体軽鎖が配列番号１５８と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列から構成され、前記重鎖が配列番号３４１に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号３８４に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号４２７に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有し、前記軽鎖が配列番号２１２に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号２５５に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号２９８に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有し、かつ該ヒトモノクローナルＩｇＧがＴＦＰＩ活性の５０％以上の阻害を示す、組成物。
12. 第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 第ＶＩＩ因子が存在しない、請求項１２に記載の組成物。
14. 抗体が表面プラズモン共鳴分析法により、１５．８ｎＭのヒトＴＦＰＩへの結合親和性を有する、請求項１１に記載の組成物。
15. 抗体が注射用の薬学的に許容される担体中に１０から１００ｍｇの用量で製剤化される、請求項１１に記載の組成物。
16. 抗体が一本鎖の断片である、請求項１１に記載の組成物。
17. 抗体重鎖が配列番号１６０に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１１に記載の組成物。
18. 抗体重鎖が配列番号１６０に示されるアミノ酸配列から構成され、かつ抗体軽鎖が配列番号１５８に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１１に記載の組成物。

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