JP6426799B2

JP6426799B2 - 角化細胞に適応したメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法

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Publication number: JP6426799B2
Application number: JP2017142054A
Authority: JP
Inventors: ウンギョンチョ，; ボムホピン，; テリョンイ，; ジヨンハン，; ヒョンジョンチョイ，
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2018-11-21
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: EP2762559B1; JP2014528238A; CN104039953A; EP2762559A1; JP6216318B2; WO2013048139A1; CN104039953B; EP2762559A4; US20140227779A1; JP2017184769A; US10344260B2; HK1196848A1

Description

本明細書には、角化細胞に適応したメラニン形成細胞又はその前駆細胞であるメラノブラストが開示される。また、本明細書には、角化細胞に適応したメラニン形成細胞又はその前駆細胞であるメラノブラストの生産方法が開示される。

表皮内のメラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）の数は、角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の１０分の１と極めて少ない。既存の分離法では、皮膚組織にディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）を処理して得られた表皮層（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｓｈｅｅｔ）に対してトリプシンのような酵素をさらに処理して単一細胞として作った後、特異的成長因子あるいはケモカインなどが入っている培地を供給して、メラニン形成細胞だけが生き残るようにすることで分離している。生体内に少数しか存在しないことと、培地外には特別な分離法がないことから、生体からメラニン形成細胞を直接分離することは効率的ではない。このような理由から市販されるメラニン形成細胞の価格は、相対的に角化細胞に比べて高い。

一方、生体から分離されたメラニン形成細胞は、均質性と増殖力が制限的である。また、メラニン形成細胞を表皮から直接分離して体外でそのまま利用した場合、ＵＶＢなどの刺激に対して反応がなかったり、メラニン合成に関与した遺伝子の発現が却って減少したりする現象が生じることが報告された。前記問題を解決するために、角化細胞とメラニン形成細胞の共同培養にＵＶＢ処理を行ったり、角化細胞の単独培養にＵＶＢを照射した後にその培地をメラニン形成細胞に供給したりするなどの措置が必要であった。

前記のような既存の分離されたメラニン形成細胞の短所を克服して、均質で且つ増殖力に優れると共に、体外でその特性が生体に存在する時とほぼ同様に保持され、共同培養によらずにも機能研究が可能なメラニン形成細胞を分離する方法の開発が必要である。

一方、メラニン形成細胞は、発生過程で神経堤（ｎｅｕｒａｌｃｒｅｓｔ）に由来するメラニン形成幹細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓｔｅｍｃｅｌｌ）と前駆細胞であるメラノブラスト（ｍｅｌａｎｏｂｌａｓｔ）から最終分化すると知られている。メラノブラストは、メラニン形成細胞に比べて増殖と分化能を有し、発生過程の特性上、細胞移動性（ｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を持っている。

神経堤幹細胞−メラノブラスト−メラニン形成細胞への発生と分化、及び前記過程に関与する遺伝子の機能に関する研究は、マウスに対して多く進められてきたが、一部の分化初期マーカーを利用してメラノブラストの分離を試みた結果、収得率は５％未満であった。さらには、マウスとヒトの表皮構造が異なり、各分化段階を区分することができる特異的マーカーがないため、ヒト成体表皮におけるメラノブラストの存在の把握又はこれを皮膚組織から直接分離及び培養する方法に関する報告は非常に希で少ない。既に分離したメラニン形成細胞に培地を変えることでメラノブラスト的性質を誘導する方法は一部報告されたことがあるが、それが必ずしもヒトの皮膚に存在するメラノブラストであるとはいい難い。

韓国公開特許第１０−２０１１−００８７４７３号公報米国特許第５７１２１６３号明細書韓国特許第１０−０９８１０８８号公報

DE LUCA et al., "Human epithelial cells induce human melanocyte growth in vitro but only skin keratinocytes regulate its proper differentiation in the absence of dermis", The Journal of Cell Biology, Vol. 107, pp.1919-1926 (1988.11)

本発明の一実施例の目的は、均質で且つ生着力や生存力に優れ、その結果、良い増力を有するメラニン形成細胞を提供することである。

本発明の他の一実施例の目的は、メラニン形成能を有するメラニン形成細胞を提供することである。

本発明の他の一実施例の目的は、角化細胞とメラニン形成細胞の共同培養にＵＶＢ処理を行ったり、角化細胞の単独培養にＵＶＢを照射した後にその培地をメラニン形成細胞に供給したりするなどの措置を行うことなく、メラニン形成細胞の単独でも研究が可能なメラニン形成細胞を提供することである。

本発明の他の一実施例の目的は、角化細胞との関係を保持する状態で体外で適応したメラニン形成細胞を提供することである。

本発明のまた他の一実施例の目的は、分離されたヒトメラノブラスト及びその生産方法を提供することである。

本発明のまた他の一実施例の目的は、角化細胞に適応したヒトメラノブラスト及びその生産方法を提供することである。

本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞又はその前駆細胞であるメラノブラストの生産方法は、（ａ）角化細胞を角化細胞培地で培養する段階；（ｂ）前記培養物から角化細胞を除去する段階；及び（ｃ）角化細胞が除去された培養物からディッシュ底に付着された細胞を収去し、メラニン形成細胞培地又はメラノブラスト培地で培養する段階を含む。

本発明の一実施例に係る他の生産方法は、メラニン形成細胞の生産方法であって、メラニン形成細胞培地が、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量のミネラル、並びに無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長因子又はタンパク質は含まない基本培地に、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インシュリン、トランスフェリン、及びＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）を含む補充物で補充された培地であってよい。前記補充物は、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ
ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）をさらに含んでいてもよい。

本発明の他の一実施例に係る生産方法は、メラノブラストの生産方法であって、メラノブラスト培地が、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量のミネラル、並びに無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長
因子又はタンパク質は含まない基本培地に、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インシュリン、トランスフェリン、エンドセリン−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）を含む補充物で補充された培地であってよい。

本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞は、下記特徴のうちのいずれか一つ以上を有する角化細胞に適応したメラニン形成細胞である：（ｉ）一次メラニン形成細胞に比べて低い、神経堤幹細胞マーカーであるｐ７５ＮＴＲの発現量；（ｉｉ）一次メラニン形成細胞に比べて高い、メラノブラストから発現するＢＲＮ２の発現量；（ｉｉｉ）一次メラニン形成細胞に比べて高いメラニン含量；（ｉｖ）一次メラニン形成細胞に比べて高いチロシナーゼ活性；（ｖ）ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）欠如培地（ＰＭＡ−ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ）で培養の際、一次メラニン形成細胞に比べてｐ７５ＮＴＲの高い発現増加量；（ｖｉ）ＰＭＡ欠如培地で培養の際、一次メラニン形成細胞に比べてＢＲＮ２の低い発現増加量；（ｖｉｉ）ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量に対する、ＰＭＡ欠如培地で培養の際の角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量の相対的な割合が、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量に対する、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された一次メラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量の割合の６０〜１６０％に該当する発現量；（ｖｉｉｉ）ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量に対する、ＰＭＡ欠如培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量の相対的な割合が、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された一次メラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量に対する、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量の割合の１〜１０倍に該当する発現量；及び（ｉｘ）一次メラニン形成細胞に比べて高い、２時間継代培養後にディッシュ底に付着された細胞の割合。

本発明の一実施例に係るメラノブラストは、角化細胞に適応したメラノブラストであって、ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＳＮＡＩ２、Ｃ−ＫＩＴ、及びＥＤＮＲＢからなる群より選ばれる一つ以上のメラノブラストマーカーの発現量が、一次メラニン形成細胞に比べて高い特徴を有するメラノブラストである。

本発明の一側面によれば、本発明は、均質で且つ生着力や生存力に優れ、その結果、良い増殖力を有するメラニン形成細胞又はメラノブラストを提供することができる。

本発明の一側面によれば本発明は、メラニン形成能を有するメラニン形成細胞を提供することができる。

本発明の一側面によれば、本発明は、角化細胞とメラニン形成細胞の共同培養にＵＶＢ処理を行ったり、角化細胞の単独培養にＵＶＢを照射した後にその培地をメラニン形成細胞に供給したりするなどの措置を行うことなく、メラニン形成細胞の単独でも研究が可能なメラニン形成細胞を提供することができる。

本発明の一側面によれば、本発明は、角化細胞との関係を保持する状態で、体外で適応したメラニン形成細胞又はメラノブラストを提供することができる。

本発明の一側面によれば、本発明は、体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で進められるメラニン形成細胞又はメラノブラスト研究の妥当性を確実にすることができる。

本発明の一側面によれば、本発明は、メラニン形成細胞又はメラノブラストの生存、繁殖、分化、及び再生に関する研究を通じて、母斑（ｎｅｖｉ）、黒子（ｌｅｎｔｉｇｏ）又は染みのような皮膚過色素沈着症、白斑症又は白化のような色素欠如症(ｖｉｔｉｌｉ
ｇｏ，ｌｅｕｋｏｐｌａｋｉａａｎｄａｂｌｉｎｉｓｍ)、黒色腫（ｍｅｌａｎｏ
ｍａ）を含む癌等の発生要因とその治療策を得ることができるようになる。

本発明の一側面によれば、本発明は、シミ、そばかすなどを緩和させ且つメラニン色素の生成を抑制する目的を有する美白化粧品、美白医薬品などの開発を容易にすることができる。

Ａは培養細胞層の分離直後にディッシュ底に残っている細胞を；Ｂは前記ディッシュ底に残っている細胞がメラニン形成細胞培地で成長する様子を；Ｃは前記Ｂの細胞を継代培養した後に高い密度で成長しているメラニン形成細胞の様子を：それぞれ撮像した写真である。本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞、即ち、角化細胞から分離されたメラニン形成細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ａｄａｐｔｅｄｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＫａＭＣ）特異的遺伝子（Ａ）の発現様相を角化細胞と比べて示したグラフである。本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞、即ち、角化細胞から分離されたメラニン形成細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ａｄａｐｔｅｄｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＫａＭＣ）特異的遺伝子（Ｂ）、及び角化細胞特異的遺伝子（Ｃ）の発現様相を角化細胞と比べて示したグラフである。一次メラニン形成細胞（ｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＰＭＣ）とＫａＭＣの遺伝子の発現様相を比べて示したグラフである。ＰＭＣとＫａＭＣのペレット色を比べて撮像した写真（Ａ）とチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）活性度を比べて示すグラフ（Ｂ）である。ＰＭＣとＫａＭＣのＰＭＡの有無による遺伝子の発現変化をそれぞれ示すグラフ（Ａ、Ｂ）である。ＰＭＣとＫａＭＣのＰＭＡの有無によるｐ７５ＮＴＲとＢＲＮ２の発現変化を示すグラフ（Ｃ、Ｄ）と、ペレット色の変化を撮像した写真（Ｅ）である。ＰＭＣとＫａＭＣの初期生着力を比べて撮像した写真（Ａ）と細胞増殖力を比べて示すグラフ（Ｂ）である。Ａは培養細胞層の分離直後にディッシュ底に残っている細胞を、Ｂは前記ディッシュ底に残っている細胞がＰＭＡ−メラノブラスト培地で成長する様子を、Ｃは前記Ｂの細胞を継代培養した後にＰＭＡ＋メラニン形成細胞培地で成長したメラニン形成細胞の様子を撮像した写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ、２５０μｍ）。ＰＭＡの有無による各細胞の各遺伝子発現量を比べて示すグラフである。ＡはＰＭＡ−培地で培養されたＫａＭＢとＰＭＡ＋培地で培養されたＫａＭＣのペレット色を比べて撮像した写真であり、Ｂは前記細胞のチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）活性度を比べて示すグラフであり、Ｃは前記細胞の細胞移動性を比べた写真であり、Ｄは前記細胞における各種のタンパク質の発現程度を比べた結果である。ＡはＰＭＡ−培地又はＰＭＡ＋培地でそれぞれ成長した各細胞の様子を撮像した写真であり、Ｂは時間による各細胞の細胞数を測定して示すグラフであり、ＣはＢｒｄＵ標識を通じて各細胞の増殖力を比べて示すグラフである（Ｓｃａｌｅｂａｒ、２５０μｍ）。ＰＭＡ−又はＰＭＡ＋培地でそれぞれの細胞を長期間培養した場合の各細胞の状態を撮像した写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ、２００μｍ）。

本明細書における「一次メラニン形成細胞（ｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、「ＰＭＣ」）」とは、生体から直接分離されたメラニン形成細胞のことを意味する。

本明細書における「角化細胞に適応したメラノブラスト（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ａｄａｐｔｅｄＭｅｌａｎｏｂｌａｓｔ、「ＫａＭＢ」）」とは、生体外で角化細胞の培養から得られたメラノブラストのことを意味する。

本明細書における「角化細胞に適応したメラニン形成細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ａｄａｐｔｅｄＭｅｌａｎｏｃｙｔｅ、「ＫａＭＣ」）」とは、生体外で角化細胞の培養から得られたメラニン形成細胞であって、一次メラニン形成細胞の基本的な特徴を有しつつも少なくとも一つ以上の別の特徴を示すメラニン形成細胞のことを意味する。

本明細書において言及された「角化細胞培地」とは、ヒトの角化細胞を培養するための培地のことを意味し、これは、当業界において公知となった如何なる培地であってもよいものとする。例えば、前記角化細胞培地は、ウシ脳下垂体抽出物（ＢｏｖｉｎｅＰｉｔｕｔａｒｙＥｘｔｒａｃｔ、ＢＰＥ）、ヒト上皮成長因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ、ｈＥＧＦ）、ウシインシュリン（ｂｏｖｉｎｅＩｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、及びゲンタマイシン及びアンホテリシン−Ｂ（ＧＡ−１０００（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ−Ｂ））を含む培地であってよい。また、前記成分にエピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）及びトランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）がさらに含まれた培地であってもよい。前記培地の商業的入手可能な例として、ロンザ社製の、ＫＧＭ（商標）製品番号ＣＣ−３００１；Ｌｏｎｚａ）、ＫＧＭ（商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商
標）製品番号ＣＣ−３１１１；Ｌｏｎｚａ）、ＫＧＭ（商標）２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）製品番号ＣＣ−３１０７；Ｌｏｎｚａ）、及びＫＧＭ−Ｇｏｌｄ（商標）Ｂｕｌ
ｌｅｔＫｉｔ（商標）製品番号１９２０６０；Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。

本明細書において言及された「メラニン形成細胞培地」とは、メラニン形成細胞の培養のための培地のことを意味し、当業界において公知となった如何なる培地であってもよいものとする。例えば、メラニン形成培地として、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量のミネラル、並びに無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長因子又はタンパク質は含まない培地を用いてもよい。前記メラニン形成細胞培地は、ヒトのメラニン形成細胞をプレートし長期間増殖させるために、メラニン形成細胞の成長に必須な成長因子、ホルモン、及び組織抽出物を含む補充物で補充されたものを用いることが好ましい。例えば、前記補充物は、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ヘパリン、ヒドロコリソン、インシュリン、トランスフェリン、ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）を含んでいてもよい。前記補充物は、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）をさらに含んでいてもよい。

前記補充物の例として、ヒトメラニン形成細胞成長補充物（ＨｕｍａｎＭｅｌａｎｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＨＭＧＳ、ｃａｔ. # Ｓ−００２−５、ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）が挙げられる。ＨＭＧＳで補充されるメラニン形成細胞の基本培地の例として、商業的入手可能な例はカスケードバイオロジクス社製のものでＭ２５４培地が挙げられる。

本明細書において言及された「メラノブラスト培地」は、メラノブラストの培養のための培地のことを意味し、当業界において公知となった如何なる培地であってもよいものとする。例えば、メラノブラスト培地として、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化
合物、微量のミネラル、並びに無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長因子又はタンパク質は含まない培地を用いてもよい。前記メラノブラスト培地は、ヒトのメラノブラストをプレートし長期間増殖させるために、メラノブラストの成長に必須な成長因子、ホルモン、及び組織抽出物を含む補充物で補充されたものを用いることが好ましい。例えば、前記補充物は、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ヘパリン、ヒドロコリソン、インシュリン、トランスフェリン、エンドセリン−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）を含んでいてもよい。

前記補充物の例として、ＰＭＡ-ＦｒｅｅＨｕｍａｎＭｅｌａｎｏｃｙｔｅＧｒ
ｏｗｔｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−２（ＰＭＡ−ＦｒｅｅＨＭＧＳ-２、ｃａｔ．# Ｓ
−０１６-５、ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）が挙げられる。ＨＭＧＳ−２で補
充されるメラノブラストの基本培地の例として、商業的入手可能な例は、カスケードバイオロジクス社製のものでＭ２５４培地が挙げられる。

本明細書において言及された「ＰＭＡ含有培地」とは、メラニン形成細胞への分化を助けるＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）を含む培地のことを意味する。

本明細書において言及された「カルシウム培地」とは、前記角化細胞培地にカルシウムがさらに添加された培地のことを意味する。例えば、ＣａＣｌ_２が１．０〜１．６ｍＭ、又は１．２〜１．４ｍＭの濃度で前記角化細胞培地に添加されたカルシウム培地であってよい。

本明細書において言及された「ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）欠如培地（ＰＭＡ−ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ）」とは、ヒトのメラノブラストの培養のための培地であって、ＰＭＡが欠如しエンドセリン−１を含む培地のことを意味する。例えば、商業的に入手可能なＰＭＡ−ｆｒｅｅＨＭＧＳ−２（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｓ−０１６−５）が添加されたＭ２５４培地のことを意味する。

本明細書において言及された「ｐ７５ＮＴＲ」とは、神経堤幹細胞マーカーである低親和性神経成長因子受容体（Ｌｏｗａｆｆｉｎｉｔｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）であって受託番号ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＭ＿００２５０７、ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００２５０７．３、ＧＩ：２９５８４２４０１の遺伝子のことを意味する。

本明細書において言及された「ＢＲＮ２」とは、メラノブラストから発現する遺伝子であってＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＰＯＵｃｌａｓｓ３ｈｏｍｅｏｂｏｘ２（ＰＯＵ３Ｆ２）のｍＲＮＡのことを意味する。受託番号ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮｏ．ＮＭ＿００５６０４、ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿００５６０４．２、ＧＩ：５１７０２５２０にて寄託されている。

本明細書において言及された「ＥＤＮＲＢ」とは、ヒトのエンドセリンレセプタータイプＢ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＢ、ＮＭ＿００１１２２６５９．２）遺伝子のことを意味し、Ｃｈｒ．１３：７８４６９６１６−７８４９２９６６に位置する。

本明細書において言及された「Ｃ−ＫＩＴ」とは、ヒトのｖ−ｋｉｔＨａｒｄｙ−Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ４ｆｅｌｉｎｅｓａｒｃｏｍａｖｉｒａｌｏｎｃｏｇｅｎｅ
ｈｏｍｏｌｏｇ（ＮＭ＿００１０９３７７２．１）遺伝子のことを意味し、Ｃｈｒ．４
：５５５２４０９５−５５６０６８８１に位置する。

本明細書において言及された「ＳＮＡＩ２」とは、ヒトのｓｎａｉｌｈｏｍｏｌｏｇ２（ＮＭ＿００３０６８．４）遺伝子のことを意味し、Ｃｈｒ．８：４９８３０２３６−４９８３３９８８に位置する。

本明細書において言及された「ＭＩＴＦ」とは、ヒトの小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ、ＮＭ＿１９８１５８．２）遺伝子のことを意味し、Ｃｈｒ．３：６９７８８５８６−７００１７４８８に位置する。

本明細書において言及された「ＤＣＴ」とは、ヒトのドパクロムトートメラーゼ（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）遺伝子のことを意味し、Ｃｈｒ．１３：９５０９１８３５−９５１３１９３６に位置する。

本明細書において言及された「ＴＹＲＰ１」とは、ヒトのチロシナーゼ関連タンパク質１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１、ＮＭ＿０００５５０.２）遺伝子のことを意味し、Ｃｈｒ．９：１２６９３３８６−１２７１０２６６に位置
する。

ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）は、メラニン形成細胞の分化を誘導する物質を意味する。

メラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）は、保護性メラニン色素（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｍｅｌａｎｉｎｐｉｇｍｅｎｔ）を作る細胞であって、形態上、樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）を有しており、表皮基底層（ｂａｓａｌｌａｙｅｒ）に基底細胞と１：４〜１：１０の範囲の割合で存在する。メラニン形成細胞は、一つ当たり基底層あるいは有棘層を構成する３６個の角化細胞（ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｕｎｉｔ）と樹状突起を介して接触している。メラニンは、紫外線から角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の核を保護する機能を有しており、メラニンの量が少ない人は皮膚癌にかかる可能性が高いと知られている。人種間のメラニン形成細胞数には差がないが、メラニン小体の数、大きさ、メラニン化の程度、メラニン小体の分布、及び角化細胞内における分解によって蓄積されるメラニンの量が異なり、それによって皮膚色が決まる。メラニン合成に重要な酵素であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）とメラニン形成細胞の数は、年齢が増加するにつれて減少すると知られている。メラニン形成細胞は、発生過程で神経堤（ｎｅｕｒａｌｃｒｅｓｔ）から由来し、メラニン形成細胞幹細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓｔｅｍｃｅｌｌ）と前駆細胞であるメラノブラスト（ｍｅｌａｎｏｂｌａｓｔ）からメラニンを合成分泌するメラニン形成細胞に分化する。

前記段階（a）の角化細胞はヒトの角化細胞であってよい。

前記ヒト角化細胞は、ヒトから由来したものであれば如何なる角化細胞を用いてもよいものとする。ヒトから直接分離又は分離された後に培養された角化細胞だけではなく、他
の細胞から誘導された角化細胞も使用可能である。商業的に入手可能なヒト角化細胞としては、ロンザ社製のＮＨＥＫ−Ｎｅｏ、Ｐｏｏｌｅｄ（ＮｅｏｎａｔａｌＮｏｒｍａｌ
ＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ：製品番号００１９２９０６、組織取得番号：Ｐ８６７、白人ら）、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ（製品番号００１９２９０７、組織取得番号：２０６４７、白人）、ＮＨＥＫ−Ａｄｕｌｔ（製品番号００１９２６２７、組織取得番号：２１１５５、白人）、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ（製品番号００１９２９０７、組織取得番号：１８０８０、黒人）が挙げられる。角化細胞が基底膜（ｂａｓｅｍｅｍｂｒａｎｅ）に付着して増殖する性質を維持するために、ディッシュは０．１〜０．２％ゼラチンあるいは１〜１０μｇ／ｍｌコラーゲンタイプＩでコーティングして用いることが好ましい。前記細胞は、３５〜３７℃、５〜１０％ＣＯ_２イン
キュベーターで培養されていてよく、約７０〜８０％の密度になったときに継代培養をしてもよい。

前記段階（ｂ）は、（イ）培養された角化細胞を前記角化細胞培地にカルシウムが添加されたカルシウム培地で培養する段階；（ロ）前記カルシウム培地を除去し細胞を洗浄した後に角化細胞培地に置き換えて培養する段階；（ハ）培地を除去した後に細胞を洗浄しインキュベートさせる段階；及び（ニ）前記インキュベートされた細胞に緩衝液又は角化細胞培地を添加して角化細胞をシート形態に分離させる段階を含んでいてもよい。

前記段階（ａ）から段階（ｂ）に移行する時点は、段階（ａ）において角化細胞を角化細胞培地で培養した結果、細胞が培養ディッシュにおいて８０〜１００％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にて培養された時点であってよい。好ましくは、９０〜１００％コンフルエントにて培養された時点であってよい。前記時点でカルシウム培地に置き換えることで角化細胞の分化を促進させて、シート（ｓｈｅｅｔ）を形成するように誘導することができる。

前記（ｂ）の段階（イ）では、角化細胞を、前記角化細胞培地にカルシウムが添加されたカルシウム培地で２〜６日間培養してもよい。前記培養は、２〜３日間行われていてもよい。前記培養期間にわたって培養を行うことで角化細胞の効果的な分化、即ち、培養上皮細胞層を形成するように助けることができる。カルシウム培地での培養もまた、同様の３５〜３７℃、５〜１０％ＣＯ_２インキュベーターで行ってもよい。

前記段階（ロ）では、前記カルシウム培地で培養された角化細胞を、緩衝液又は角化細胞培地で洗浄してカルシウムを除去した後に再び角化細胞培地を添加して培養してもよい。前記緩衝液は特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）及び／又はＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ７．４）が挙げられる。緩衝液にて洗浄する代わりに、角化細胞培地で複数回洗浄してもよい。洗浄された細胞は、再び角化細胞培地で３〜７日間さらに培養してもよい。
前記段階（ハ）では、新たに置き換えた培地の色の変化が止まってそれ以上変わらない時に培地を除去すればよい。前記除去は、前記３〜７日間の追加培養期間内で行えばよい。培地を除去してから緩衝液で洗浄した後にインキュベートさせてもよい。前記洗浄に用いられる緩衝液には、例えば、ＰＢＳが挙げられる。インキュベーションは、洗浄された細胞を入れて蓋をした後に、インキュベーターに５〜１０分間入れることであってよい。前記時間にわたってインキュベートすることで角化細胞を培養上皮細胞層の形態として容易に分離することができるようになる。

前記段階（ニ）では、前記インキュベートされた細胞に再び緩衝液又は角化細胞培地を入れる過程で培養上皮細胞層が自発的にシート形態に分離されていてもよい。前記緩衝液は、例えばＰＢＳであってよい。

前記段階（ｃ）では、段階（ｂ）で角化細胞が除去された後にディッシュ底に付着している細胞を収去してメラノブラスト培地又はメラノブラスト培地で培養してもよい。

前記段階（ｃ）では、前記培養上皮細胞層を除去してからディッシュをＰＢＳで複数回洗浄した後にアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；製品番号、ＳＣＲ００５）を３〜１０分間処理してもよい。分離された細胞を遠心分離して沈殿させた後に、一般の培養ディッシュあるいはゼラチン、例えば０．１％ゼラチンでコーティングされたディッシュに移してもよい。この時からメラニン形成細胞培地を使用して培養してもよい。メラニン形成細胞培地は、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量のミネラル、並びに無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長因子又はタンパク質は含まない基本培地に、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ＤＭＳＯ、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インシュリン、トランスフェリン、及びＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）を含む補充物で補充された培地であってよい。例えば、ＨＭＧＳ（ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ＣａｓｃａｓｅＢｉｏｌｏｇｙ；製品番号：Ｓ−００２−５）が添加されたＭ２５４（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｍ−２５４−５００）培地を利用してもよい。細胞の密度が約７０〜９０％になったときに継代培養をしてもよい。

前記段階（ｃ）では、前記培養上皮細胞層を除去してからディッシュをＰＢＳで複数回洗浄した後にアキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；製品番号、ＳＣＲ００５）を３〜１０分間処理してもよい。分離された細胞を遠心分離して沈殿させた後に、一般の培養ディッシュあるいはゼラチン、例えば０．１％ゼラチンでコーティングされたディッシュに移してもよい。この時からメラノブラスト培地を使用して培養してもよい。メラノブラスト培地は、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量のミネラル、並びに無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長因子又はタンパク質は含まない基本培地に、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インシュリン、トランスフェリン、エンドセリン−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）を含む補充物で補充された培地であってよい。例えば、ＨＭＧＳ−２（ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−２、ＰＭＡ−ｆｒｅｅ；ＣａｓｃａｓｅＢｉｏｌｏｇｙ；製品番号：Ｓ−０１６−５）が添加されたＭ２５４（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｍ−２５４−５００）培地を利用してもよい。細胞の密度が約７０〜９０％になったときに継代培養をしてもよい。

又は、前記段階（ｃ）では、培養上皮細胞層を除去してから、ディッシュをＰＢＳで洗浄し直ぐＨＭＧＳ−２が添加されたＭ２５４培地を供給して追加培養をした後に、細胞の密度が７０〜９０％になったときに新たなディッシュに移して培養をしていてもよい。
本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞は、（ｉ）一次メラニン形成細胞に比べて低い、神経堤幹細胞マーカーであるｐ７５ＮＴＲの発現量；（ｉｉ）一次メラニン形成細胞に比べて高い、メラノブラストから発現するＢＲＮ２の発現量；（ｉｉｉ）一次メラニン形成細胞に比べて高いメラニン含量；（ｉｖ）一次メラニン形成細胞に比べて高いチロシナーゼ活性；（ｖ）ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）欠如培地で培養の際、一次メラニン形成細胞に比べてｐ７５ＮＴＲの高い発現増加量；（ｖｉ）ＰＭＡ欠如培地で培養の際、一次メラニン形成細胞に比べてＢＲＮ２の低い発現増加量；（ｖｉｉ）ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量に対する、ＰＭＡ欠如培地で培養の際の角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量の相対的な割合が、ＰＭＡ含有メラニン形成細
胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量に対する、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された一次メラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量の割合の６０〜１６０％に該当する発現量；（ｖｉｉｉ）ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量に対する、ＰＭＡ欠如培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量の相対的な割合が、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された一次メラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量に対する、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量の割合の１〜１０倍に該当する発現量；及び（ｉｘ）一次メラニン形成細胞に比べて高い、２時間継代培養後のディッシュ底に付着された細胞の割合のうちの一つ以上の特徴を有するメラニン形成細胞であってよい。

前記（ｉ）のｐ７５ＮＴＲの発現量は、一次メラニン形成細胞に比べて１／１０倍以下に低いものであってよい。また、前記（ｉ）のｐ７５ＮＴＲの発現量は、一次メラニン形成細胞に比べて１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／６０又は１／７０倍に低い発現量であってよい。また、前記（ｉ）のｐ７５ＮＴＲの発現量は、一次メラニン形成細胞に比べて１／１０〜１／１０００倍に低い発現量であってよい。また、前記（ｉ）のｐ７５ＮＴＲの発現量は、一次メラニン形成細胞に比べて１／２０〜１／５００倍、１／３０〜１／２８０倍、１／４０〜１／１９０倍又は１／５０〜１／１４０倍に低いものであってよい。このような発現量の差異によって、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力に優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｉｉ）のＢＲＮ２の発現量は、一次メラニン形成細胞に比べて５倍以上に高いものであってよい。また、前記（ｉｉ）のＢＲＮ２の発現量は、一次メラニン形成細胞に比べて１０倍又は１５倍以上高いものであってよい。また、前記（ｉｉ）のＢＲＮ２の発現量は、一次メラニン形成細胞に比べて５倍〜５０倍、１０倍〜４０倍、１５倍〜３０倍又は１６倍〜２０倍以上であってよい。このような発現量の差異により、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力に優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｉｉｉ）のメラニン含量は、一次メラニン形成細胞に比べて２倍以上に高いものであってよい。また、前記（ｉｉｉ）のメラニン含量は、一次メラニン形成細胞に比べて３倍又は４倍以上高いものであってよい。また、前記（ｉｉｉ）のメラニン含量は、一次メラニン形成細胞に比べて２倍〜１０倍、３倍〜５倍又は３倍〜４倍であってよい。このような含量の差異により、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力に優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｉｖ）のチロシナーゼの活性は、３７℃で１２０分間インキュベーションの際に一次メラニン形成細胞に比べて２倍以上、４倍以上又は８倍以上高いものであってよい。また、２倍〜３２倍、４倍〜１６倍又は６倍〜１０倍であってよい。このような活性の差異により、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力に優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｖ）の発現量は、一次メラニン形成細胞の発現量の２倍以上であってよい。また前記（ｖ）の発現量は、一次メラニン形成細胞の発現量の２倍〜１８倍、３倍〜１０倍又は４倍〜８倍であってよい。このような発現量の差異により、本発明の一実施例に係る角
化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力に優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｖｉ）の発現量は、一次メラニン形成細胞の発現量の９／１０〜１／１０倍であってよい。また、前記（ｖｉ）の発現量は、一次メラニン形成細胞の発現量の７／１０〜３／１０倍であってよい。このような発現量の差異により、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力に優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｖｉｉ）の発現量は、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量に対する、ＰＭＡ欠如培地で培養の際の角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量の相対的な割合が、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量に対する、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された一次メラニン形成細胞のｐ７５ＮＴＲの発現量の割合の６０〜１６０％、８０〜１４０％又は９０〜１３０％に該当する発現量であってよい。このような発現量の差異により、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力が優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｖｉｉｉ）の発現量は、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量に対する、ＰＭＡ欠如培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量の相対的な割合が、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された一次メラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量に対する、ＰＭＡ含有メラニン形成細胞培地で培養された角化細胞に適応したメラニン形成細胞のＢＲＮ２の発現量の割合の１〜１０倍、２〜８倍、３〜７倍又は４〜６倍に該当する発現量であってよい。このような発現量の差異により、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞が持つ特徴である、一次メラニン形成細胞に比べて均質で増殖力に優れ、且つ角化細胞なしでもメラニン形成能を保有する能力を極大化させることができる。

前記（ｉｘ）の２時間継代培養後のディッシュ底に付着された細胞の割合は、８０％以上であってよい。前記（ｉｘ）の２時間継代培養後のディッシュ底に付着された細胞の割合は、９０％以上であってよい。前記（ｉｘ）の２時間継代培養後のディッシュ底に付着された細胞の割合は、９５％以上であってよい。本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞は、角化細胞から由来したものであってよい。特に、ヒトの角化細胞から由来したものであってよい。

本発明の他の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞は、前述した方法のうちのいずれかによって生産されたものであってよい。

本発明の好適な一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞をブダペスト条約による国際寄託機関である生物資源センター（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ、ＫＣＴＣ）に２０１１年９月１４日付けにて寄託し、寄託番号としてＫＣＴＣ１２０１５ＢＰを付与された。

本発明の一実施例に係る角化細胞の培養から分離されたメラノブラストは、角化細胞に適応したメラノブラストであって、ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＳＮＡＩ２、Ｃ−Ｋ
ＩＴ、及びＥＤＮＲＢからなる群より選ばれる一つ以上のメラノブラストマーカーの発現量が、一次メラニン形成細胞又は角化細胞に適応したメラニン形成細胞に比べて高い特徴を有するものであってよい。

他の実施例において、前記メラノブラストは、ＭＩＴＦ及びＤＣＴのうちの一つ以上のメラノブラストマーカーの発現量が一次メラニン形成細胞又は角化細胞に適応したメラニン形成細胞に比べて２倍以上、３倍以上、４倍以上又は５倍以上高い特徴を有するものであってよい。前記のような高い発現量が、本明細書に開示されたメラノブラストを一次メラニン形成細胞又は角化細胞に適応したメラニン形成細胞（ＫａＭＣ）と区別する特徴であってよい。

また、一実施例において、前記メラノブラストは、角化細胞に適応したメラニン形成細胞に比べて高いＢＲＮ２タンパク質発現量及び低いＴＹＲタンパク質発現量のうちのいずれか一つ以上の特徴を有する細胞であってよい。

また他の実施例において、前記メラノブラストは、メラノブラスト培地で９日間培養の際、初期の細胞数に比べて２０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、又は３５倍以上増加した細胞数を示すものであってよい。前記のような高い細胞増殖量は、本明細書に開示されたメラノブラストを一次メラニン形成細胞又は角化細胞に適応したメラニン形成細胞（ＫａＭＣ）と区別する特徴であってよい。

また他の実施例において、前記メラノブラストは、メラノブラスト培地での６回以上、７回以上、８回以上又は９回以上の継代培養の際も増殖し続ける細胞であってよい。前記のように長期間の細胞増殖性維持特性は、本明細書に開示されたメラノブラストを一次メラニン形成細胞又は角化細胞に適応したメラニン形成細胞（ＫａＭＣ）と区別する特徴であってよい。

本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラノブラストは、角化細胞から由来したものであってよい。特に、ヒトの角化細胞から由来したものであってよい。

本発明の他の一実施例に係る角化細胞に適応したメラノブラストは、前述した方法のうちのいずれか一つによって生産されたものであってよい。

本発明の好適な一実施例に係る角化細胞に適応したメラノブラストをブダペスト条約による国際寄託機関である生物資源センター（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ、ＫＣＴＣ）に２０１２年７月２４日付にて寄託し、寄託番号としてＫＣＴＣ１２２５０ＢＰを付与された。

以下、一実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これの実施例は、発明を例示するためのものに過ぎず、発明の範囲を制限しようとするものではないことは当業者に自明である。

［実施例］
１．角化細胞に適応したメラノサイトの生産
（ａ）角化細胞を培養する段階
ヒト角化細胞（ＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）は、ロンザ社製のＮＨＥＫ−Ｎｅｏ、Ｐｏｏｌｅｄ（ＮｅｏｎａｔａｌＮｏｒ
ｍａｌＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ：製品番号００１９２９０６）を使用した。ヒト角化細胞の培養のための角化細胞培地は、ＫＧＭ−Ｇｏｌｄ（商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）製品番号１９２０６０；Ｌｏ
ｎｚａ）を使用した。角化細胞が基底膜に付着して増殖する性質を保持するために、ディッシュは１０μｇ／ｍｌコラーゲンタイプＩでコーティングしたものを使用した。前記細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、約７０％の密度になったときに
継代培養をした。角化細胞を培養上皮細胞層に分化を誘導するときは、ＫＧＭ−２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（製品番号ＣＣ−３１０７；Ｌｏｎｚａ）と０．１％ゼラチンコーティングを使用した。

（ｂ）角化細胞の除去段階
角化細胞を培養上皮細胞層のシート形態としてディッシュから分離あるいは除去するために、前記角化細胞培地に最終的に高濃度のカルシウムを添加した、即ち、１．２ｍＭ
ＣａＣｌ_２を添加したカルシウム培地を使用した。高濃度のカルシウム培地での培養もまた、同様の３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで行った。角化細胞が培養ディッシュ
の底が見えないように培養された時点（約９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）で角化細胞培地
を前記高濃度のカルシウム培地に置き換えて３日間培養を行った。前記培養された角化細胞をＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）で３回洗浄して高濃度のカルシウムを除去し、角化細胞培地に置き換えて４日間さらに培養を行った。この期間内に新たに置き換えた培地の色の変化が止まってそれ以上変わらない時に培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、蓋をしてインキュベーターに５分間入れておいた。再びＰＢＳを入れる過程で培養上皮細胞層が自発的に分離された。培養上皮細胞層が除去された直後にディッシュ底には依然として細胞が残っていた。

その残っている細胞を顕微鏡で撮像した写真が図１のＡである。図１のＡに示したように、前記細胞は、角化細胞とは異なり、細長い模様を示している。

（ｃ）角化細胞が除去された培養物からディッシュ底に付着された細胞を収去し、培養する段階
前記培養上皮細胞層を除去した後にディッシュをＰＢＳで２回洗浄し、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；製品番号、ＳＣＲ００５）を５分間処理した。分離された細胞を遠心分離して沈殿させた後に０．１％ゼラチンでコーティングされたディッシュに移した。このときからＨＭＧＳ（Ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ＣａｓｃａｓｅＢｉｏｌｏｇｙ；製品番号：Ｓ−００２−５）が添加されたＭ２５４（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｍ−２５４−５００）培地を利用した。その結果としての培養された細胞を顕微鏡で撮像した写真が図１のＢである。図１のＢに示されるように、二極（ｂｉｐｏｌａｒ）の模様を示している。

前記細胞の密度が約８０％になった時に継代培養をした。継代培養で培養された細胞を再び顕微鏡で撮像した結果が図１のＣである。図１のＣに示されるように、角化細胞から分離されたメラニン形成細胞は、継代培養が可能で且つ良好な増殖力を示した。

２．角化細胞から生産された角化細胞に適応したメラニン形成細胞（ＫａＭＣ）の特性の究明
ＫａＭＣと比較するための一次メラニン形成細胞（ｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＰＭＣ）は、ロンザ社製のＮＨＥＭ−Ｎｅｏ（ＮｅｏｎａｔａｌｎｏｒｍａｌＨｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、製品番号ｃｃ−２５０４）を利用した。

（１）ｑＰＣＲ分析
前記分離されたＫａＭＣ、角化細胞（ＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌ
Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）は、ロンザ社製のＮＨＥＫ−Ｎｅｏ、Ｐｏｏｌｅｄ（ＮｅｏｎａｔａｌＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ：製品番号００１９２９０６）（ＫＣ）、一次メラニン形成細胞（
ｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＰＭＣ）のそれぞれをＰＢＳで洗浄し、キット（ｍｉＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、製品番号２１７００４）を利用して全ＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１８０８０−０５１）を通じてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子に特異的に結合するプライマー（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）とＳＹＢＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲ
ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；製品番号、４３０４４３７）を利用してメラニン形成細胞系細胞のマーカーであるＳＯＸ１０、ＰＡＸ３、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＰＭＥＬ、ＮＥＳＴＩＮのｍＲＮＡ発現の変化を測定した。

その結果を図２に示した。図２に示されるように、ＫａＭＣは角化細胞（ＫＣ）に比べてメラニン形成細胞特異的遺伝子を過量発現していることが分かる。

一方で、メラニン形成細胞系細胞のマーカーであるＳＯＸ１０のｍＲＮＡ発現の変化を測定した。その結果を図３のＢに示した。図３のＢに示されるように、ＫａＭＣは角化細胞（ＫＣ）に比べてメラニン形成細胞特異的遺伝子であるＳＯＸ１０を９百万倍程度に過量発現していることが分かる。

一方、角化細胞のマーカーであるＩＴＧＡ６、ＴＰ６３、ｋｅｒａｔｉｎ１４（ＫＲＴ１４）のｍＲＮＡ発現の変化を測定した。その結果、ＫａＭＣでは角化細胞（ＫＣ）に比べて顕著に減少した（図３のＣ）。

また、一次メラニン形成細胞である最初メラニン形成細胞（ｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＰＭＣ）に比べて、全般的なメラニン形成細胞特異的遺伝子の発現量には差異がないが（図４のＡ）、神経堤幹細胞マーカーであるｐ７５ＮＴＲがＰＭＣには多量発現しており（図４のＢ）、メラノブラスト（ｍｅｌａｎｏｂａｓｔ）から発現するものと知られたＢＲＮ２はＫａＭＣで相対的に多く発現していることが分かった（図４のＣ）。

（２）チロシナーゼ活性分析（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ）
培地を除去してから細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、溶菌バッファー（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）（Ｓｉｇｍａ）を入れて細胞を取得した。４℃で１時間にわたってロッキングしながら細胞内タンパク質を抽出した後、遠心分離（１３００ｒｐｍ、１５分）にて細胞ペレット（ｃｅｌｌｐｅｌｌｅｔ）と抽出物とを分離した。

図５のＡは、メラニン形成細胞培地で育ったＰＭＣとＫａＭＣとをディッシュから分離した後に撮像したペレット写真である。図５のＡに示されるように、一次メラニン形成細胞（ＰＭＣ）に比べて、本発明の一実施例に係る角化細胞に適応したメラニン形成細胞（ＫａＭＣ）のほうがより多くのメラニンを含んでいることが分かる。二つの細胞とも白人から由来したものであることから、前記メラニン含量の差異は注目するに値するものである。

一方、前記分離された抽出物を新しいＥ−ｔｕｂｅに移した後、ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ）（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号：２３２２７）を利用してタンパク質定量をした。４０μｇのタンパク質と溶菌バッファーとを合わせて総１００μｌになるように９６−ウェルプレートに入れた後、１００μｌのＬ−Ｄｏｐａ（Ｓｉｇｍａ、製
品番号Ｄ−９６２８、２ｍｇ／ｍｌｉｎ０.１Ｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅ
ｒ、ｆｉｌｔｒａｔｅｄ）を入れ、３７℃で多様な時間（１５、３０、６０、１２０分）の間反応を行わせた。各反応時間後にマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ
ｒｅａｄｅｒ）を利用して、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。

その結果を図５のＢに示している。図５のＢに示されるように、インキュベーション時間が増加するほどＫａＭＣのチロシナーゼ活性がますます増大し、１２０分間インキュベーションを行った時には、ＫａＭＣがＰＭＣに比べて約８倍もの高いチロシナーゼ活性を示した。

（３）ＰＭＡに対する反応性の調査：
メラニン形成細胞の分化を誘導する物質であるＰＭＡの効果を調べるために、継代培養の際にＰＭＡ−ｆｒｅｅＨＭＧＳ−２（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｓ−０１６−５）が添加されたＭ−２５４を利用した（ＰＭＡ−）。前記結果をＨＭＧＳ（Ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ＣａｓｃａｓｅＢｉｏｌｏｇｙ；製品番号：Ｓ−００２−５）が添加されたＭ２５４（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｍ−２５４−５００）培地で培養された細胞の結果と比較した（ＰＭＡ＋）。その結果を図６及び図７に示した。

分化されたメラニン形成細胞を脱分化させると知られたエンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）を含むＰＭＡ−培地を入れたとき、ＰＭＣとＫａＭＣ内のメラニン形成細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡ発現の程度にはそれほど差異が見られないが（図６のＡとＢ）、ＰＭＡ−培地で培養した場合、ＫａＭＣではｐ７５ＮＴＲの発現量が、ＰＭＣではＢＲＮ２の発現量がＰＭＡ＋培地で培養した場合に比べて大きく増加した（図７のＣとＤ）。特に、ＰＭＡ＋培地で培養されたＫａＭＣのｐ７５ＮＴＲ発現量に対する、ＰＭＡ−培地で培養されたＫａＭＣのｐ７５ＮＴＲ発現量の割合は、ＰＭＡ＋培地で培養されたＫａＭＣに対する、ＰＭＣのｐ７５ＮＴＲ発現量の割合（図４のＢ）とほぼ同じレベルに増加したのである（図７のＣ）。また、ＰＭＡ＋培地で培養されたＰＭＣのＢＲＮ２の発現量に対する、ＰＭＡ−培地で培養されたＰＭＣのＢＲＮ２の発現量の割合は、ＰＭＡ＋培地で培養されたＰＭＣに対する、ＫａＭＣのＢＲＮ２の発現量の割合（図４のＣ）とほぼ同じレベルに増加したのである（図７のＤ）。

さらに、ＰＭＡ−培地で培養した結果、ＫａＭＣペレットの色もまた薄くなる現象が観察された（図７のＥ）。これは、ＫａＭＣはＰＭＣに比べてより多くの色素を形成しており、このような色素形成はメラニン形成細胞分化誘導物質であるＰＭＡの有無によって調節が可能であることを意味する。

要するに、ｐ７５ＮＴＲとＢＲＮ２の発現を調節することでメラニン形成細胞の分化及び脱分化を誘導することができ、且つ色素の形成を調節することができることが期待される。

（４）初期の生着力と生存力、及び細胞増殖力の比較：
継代培養初期の生着力や生存力を調べるために、同一の条件下で継代培養後、２時間が経過した時点で細胞の状態を観察した。具体的にＫａＭＣとＰＭＣを０．１％ゼラチンでコーティングされたディッシュへ移し、ＨＭＧＳ（Ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ＣａｓｃａｓｅＢｉｏｌｏｇｙ；製品番号：Ｓ−００２−５）が添加されたＭ２５４（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｍ−２５４−５００）培地で、２時間３７℃で培養した。その結果は図８のＡに示されるとおりである。図８のＡを見てみると、ＫａＭＣは２時間以内に９５％以上の細胞がディッシュ底に確実に付着してデンドライト（ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ）を延ばした形態を示し
ている反面、同じ時間の間、ＰＭＣは付着できずに浮いている細胞の数が多いことが分かった。図８のＡにおいて矢印で表示したものが浮いている細胞である。

一方、生着力や生存力、及び細胞増殖力を調べるために、ＢｒｄＵを利用したＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ、製品番号：１１６４７２２９００１）を利用した。０.４％トリパンブ
ルー（ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）染色と細胞計数器（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｅｒ）を利用して細胞数を数えた。ＰＭＣとＫａＭＣともに同じ細胞数（３×１０^４）をプレート（ｐｌａｔｉｎｇ）した。それにもかかわらず、初日（１ｄａｙｐｏｓｔｐｌａｔｉｎｇ）のＢｒｄＵで標識されるＰＭＣの数がＫａＭＣに比べて顕著に低くなっていることが分かった（図８のＢ）。倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）はそれほど差異がないと見られ、ＫａＭＣの図１Ｃで示すような良好な細胞増殖力は、継代培養時に優れた生着力や生存力、及び増殖する／増殖することのできる細胞数が多いことを示す。

３．角化細胞に適応したメラノブラスト（ＫａＭＢ）の生産
（ａ）角化細胞を培養する段階
ヒト角化細胞を前記１．（ａ）の項目と同様にして培養した。

（ｂ）角化細胞の除去段階
前記１．（ｂ）項目と同様にして角化細胞をシート形態に分離させた。その結果、ディッシュ底には依然として細胞が残っていた。

その残っている細胞を顕微鏡で撮像した写真が図９のＡである。図９のＡに示されるように、前記細胞は、角化細胞とは異なり、細長い模様を示している。

（ｃ）角化細胞が除去された培養物からディッシュ底に付着された細胞を収去し、培養する段階
前記培養上皮細胞層を除去してからディッシュをＰＢＳで２回洗浄し、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；製品番号、ＳＣＲ００５）を５分間処理した。分離された細胞を遠心分離して沈殿させた後に新しいディッシュに移した。この時からＨＭＧＳ−２（Ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−２、ＰＭＡ−ｆｒｅｅ；ＣａｓｃａｓｅＢｉｏｌｏｇｙ；製品番号：Ｓ−０１６−５）が添加されたＭ２５４（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｍ−２５４−５００）培地を利用した。その結果としての培養された細胞を顕微鏡で撮像した写真が図９のＢである。前記細胞の密度が約８０％になった時に継代培養をした。図９のＢに示される細胞を、メラニン形成細胞の代表的分化誘導物質であるＰＭＡが添加されたメラニン形成細胞培地（Ｍ２５４／ＨＭＧＳ）で育てると、二極（ｂｉｐｏｌａｒ）の分化された模様を示す（図９のＣ）。

４．角化細胞の培養から生産された角化細胞に適応したメラノブラスト（ＫａＭＢ）の特性の究明
ＫａＭＢと比較するための一次メラニン形成細胞（ｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＰＭＣ）は、ロンザ社製のＮＨＥＭ−Ｎｅｏ（ＮｅｏｎａｔａｌｎｏｒｍａｌＨｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、製品番号ｃｃ−２５０４）を利用した。また、ＫａＭＢと比較するための角化細胞に適応したメラニン形成細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ａｄａｐｔｅｄＭｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＫａＭＣ）を用意した。ＫａＭＣは、前記段階（ｃ）で分離された細胞をＨＭＧＳ（Ｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；ＣａｓｃａｓｅＢｉｏｌｏｇｙ；製品番号：Ｓ−００２−５）が添加されたＭ２５４（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、製品番号：Ｍ−２５４−５００）培地で培養したことを除いては、ＫａＭＢと同法にて得た。また、ＰＭＡを入れた培地と入れていない培地とでそれぞれ培養した。

（１）ｑＰＣＲ分析
前記分離されたＫａＭＢ、ＫａＭＣ、一次メラニン形成細胞（ｐｒｉｍａｒｙｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＰＭＣ）のそれぞれをＰＢＳで洗浄し、キット（ｍｉＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、製品番号２１７００４）を利用して全ＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１８０８０-０５１）にてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型と
して遺伝子に特異的に結合するプライマー（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＳＹＢＲ（ＴａｑＭａｎ(R) ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、Ａｐｐｌｉ
ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；製品番号、４３０４４３７）を利用してメラノブラスト／メラニン形成細胞系のマーカーであるＮＯＴＣＨ１、ＳＯＸ１０、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ｃ−ＫＩＴ、ＳＮＡＩ２、ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＰＭＥＬのｍＲＮＡ発現の変化を測定した。

その結果を図１０に示した。図１０に示されるように、ＫａＭＢ細胞のＲＴ−ｑＰＣＲの分析結果、ＰＭＡ−あるいはＰＭＡ＋培地で培養したＰＭＣに比べて、またＰＭＡ＋培地で培養したＫａＭＣに比べて、ＥＤＮＲＢ、ｃ−ＫＩＴ、ＳＮＡＩ２、ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１などのメラノブラストマーカーを相対的に多く発現していることが分かる。

図１１のＡはメラニン形成細胞分化誘導物質であるＰＭＡのない培地で成長したＫａＭＢとＰＭＡを入れた培地で成長したＫａＭＢ由来のＫａＭＣをディッシュから分離した後に撮像したペレット写真である。これより、ＫａＭＢはＰＭＡのある条件で色素を形成することができるメラニン形成細胞に分化できることが分かる。

一方、前記分離された抽出物を新しいＥ−ｔｕｂｅに移した後、ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ）（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号：２３２２７）を利用してタンパク質定量をした。４０μｇのタンパク質と溶菌バッファーとを合わせて総１００μｌになるように９６−ウェルプレートに入れた後、１００μｌのＬ−Ｄｏｐａ（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｄ−９６２８、２ｍｇ／ｍｌｉｎ０．１Ｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｆｉｌｔｒａｔｅｄ）を入れて、３７℃で多様な時間（１５、３０、６０、１２０分）間反応を行わせた。各反応時間後にマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ
ｒｅａｄｅｒ）を利用して、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。

その結果を図１１のＢに示している。図１１のＢに示されるように、インキュベーション時間が増加するほど、ＫａＭＢに比べてＫａＭＣのチロシナーゼ活性が増加することが分かる。

（３）細胞移動性の調査
各タイプの細胞（５×１０^４）を、Ｉ型コラゲン（最終１０μｇ／ｍｌ）でコーティングをした８．０ｍｍのポアサイズを有する細胞培養インサート（ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒ
ｅｉｎｓｅｒｔ）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、製品番号：３５３０９７）に植えて２４−ウェルに入れた後、４時間にわたって培養した。培地を除去し、メタノールを入れて５〜１０分間固定させた。ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ）で５分間核を染色し水で数回洗浄した後、細胞質染色のためにエオシン（Ｅｏｓｉｎ）を入れて１〜５分間浸しておいた。水で数回洗浄した後、インサートの内側を耳掻きを利用してきれいに拭いた。ナイフを利用してインサートからフィルターだけを分離した後、スライドガラスの上にマウントした。その結果を図１１のＣに示した。トランスウェルを使用して移動性を確認した結果、分化状態のＫａＭＣに比べて、ＫａＭＢが４時間以内と遥かに優れた移動性を示した。生体内メラノブラストが発生過程の特性上、移動性（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を持つという点に基づくとき、ＫａＭＢはメラノブラスト的性質を有することが確認された。

（４）タンパク質発現分析
ＫａＭＢ、ＫａＭＣのそれぞれを１００−ｍｍディッシュで培養し、密度が８０〜９０％になったとき、ＰＢＳで２回洗浄し、溶菌バッファー（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ、Ｓｉｇｍａ）１００〜１５０μｌを入れて、セルスクレーパ（ＳＰＬＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を取得した。低温冷蔵庫（４〜８℃）で１０分間インキュベートし、１０分間遠心分離した後に、各種のタンパク質を含む上層部を新しいチューブに移してからＢＣＡタンパク質定量キット（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；製品番号、２３２２７）にてタンパク質定量をした。１５μｇタンパク質を電気泳動した後にニトロセルローズ膜に移送した後、ＳＯＸ１０（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ２８６４）、ＰＡＸ３（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ２４５７）、ＢＲＮ２（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈＧｒｏｕｐ、１４５９６−１−ＡＰ）、ＭＡＲＴ１（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＳ−７１６）、ＴＹＲＰ２（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃ−９、ｓｃ−７４４３９）、ＴＹＲＰ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈ−９０、ｓｃ−２５５４３）、ＴＹＲ（ＳａｎｔａＣｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈ−１０９、ｓｃ−１５３４１）、ＧＡＤＰＨ（ＳａｎｔａＣｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＦＬ−３３５、ｓｃ−２５７７８）のそれぞれの抗体でウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）を行った結果、ＫａＭＢから特異的にＢＲＮ２の発現が観察され（図１１のＤ、星印（＊））、ＫａＭＣからはメラニン生成の核心タンパク質であるチロシナーゼ（ＴＹＲ）の発現が増加していることが分かった（図１１のＤ、矢印（←））。ＢＲＮ２はヒトメラノブラストマーカーであり、角化細胞の培養から分離したＫａＭＢは、メラノブラストであることが確認された。

（５）ＰＭＡに対する反応性の調査
前記のようなメラノブラスト的性質を有するようになったことが単に培地の入れ替えによる脱分化の結果であるか否かを確認するために、一次メラニン形成細胞とＫａＭＢを、メラニン形成細胞の分化を誘導する物質であるＰＭＡが含まれたメラニン形成細胞培地とＰＭＡが含まれていないメラノブラスト培地のそれぞれで培養させた。その結果、一次メラニン形成細胞は、ＰＭＡのある培地では適当に育ったが、ＰＭＡのないメラノブラスト培地ではほとんど育っていないことが分かった（図１２のＡ、3^rd、4^th panels）。これ
に対し、角化細胞から分離されたＫａＭＢは、ＰＭＡのあるメラニン形成細胞培地よりはＰＭＡが含まれていないメラノブラスト培地で遥かに優れた増殖力を示した（図１２のＡ、1^st、2^nd panels）。このような結果から、ＫａＭＢは、単にメラノブラスト培地で育
てて得られる脱分化された細胞とは異なる性格の細胞であることが分かる。

（６）細胞成長曲線
各細胞のタイプ毎に２４−ウェルプレートの１ウェル当たり３．４×１０^４（総５ウェル）を植えて０、３、６、９、１２日目に細胞数の測定を行った。その結果、ＫａＭＢ細
胞が最も優れた増殖力を示した（図１２のＢ）。

（７）細胞分裂能の調査
各細胞を９６−ウェルプレートの１ウェル当たり１×１０^４個を植えて３日間培養後、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵキット（Ｒｏｃｈｅ、製品番号：１１６４７２２９０
０１）を利用して細胞をラベリングした後、吸光度を１０、２０、３０分おきに測定した。ＢｒｄＵは分裂する細胞のＤＮＡにくっ付く性質がある。その結果、ＰＭＡが含まれていないメラノブラスト培地におけるＫａＭＢが最も多く分裂及び増殖をしていることが分かった（図１２のＣ）。ＫａＭＢは、ＰＭＡのない培地条件で長期間（passage 9）培養
する間に大きな変化がなかったが（図１３、3^rd panel）、一次メラニン形成細胞はこの
培地でほとんど増殖ができず、且つ長期間（passage 6）培養する間に細胞内部に多くの
液胞（ｖａｃｕｏｌｅｓ）を形成した（図１３、1^st panel）。ＫａＭＣとＰＭＣのそれ
ぞれを、ＰＭＡを含むメラニン形成細胞培地で培養した時すらも、ＫａＭＣがＰＭＣよりも優れた増殖力を示した（図１２のＢ、Ｃ）。

前記のような実験結果から、角化細胞培養から分離されたＫａＭＢは、ＰＭＡ−メラノブラスト培地で最上の増殖力を示し且つメラノブラストの遺伝子マーカーとタンパク質を特異的に発現しており、分化誘導物質であるＰＭＡによってメラニン形成細胞から分化できることから、メラノブラストであることが分かる。また角化細胞の培養から分離されたＫａＭＢ由来のＫａＭＣは、一次メラニン形成細胞よりも優れた増殖力を保有していることが分かる。これは、皮膚組織から直接分離された一次メラニン形成細胞よりも角化細胞の環境下で体外環境に適応してから分離されるメラニン形成細胞のほうがより良好な増殖力を保有するようになることを意味する。

本発明の一側面によれば、本発明は、メラニン形成細胞又はメラノブラストの生存、繁殖、分化、及び再生に関する研究を通じて、母斑（ｎｅｖｉ）、黒子（ｌｅｎｔｉｇｏ）又は染みのような皮膚過色素沈着症、白斑症又は白化のような色素欠如症（ｖｉｔｉｌｉｇｏ，ｌｅｕｋｏｐｌａｋｉａａｎｄａｌｂｉｎｉｓｍ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）を含む癌等の発生要因とその治療策を得ることができるようになる。

Claims

生体外で角化細胞の培養から得られるメラニン形成細胞又はその前駆細胞であるメラノブラストを生産する方法であって、
（ａ）角化細胞を角化細胞培地で培養する段階；
（ｂ）前記角化細胞培地にカルシウムが添加されたカルシウム培地で角化細胞を培養した後、培養物から角化細胞を除去する段階；及び
（ｃ）角化細胞が除去された培養物からディッシュ底に付着された細胞を収去し、メラニン形成細胞培地又はメラノブラスト培地で培養する段階；
を含み、
前記段階（ｂ）は、
（イ）培養された角化細胞を、前記角化細胞培地にカルシウムを添加したカルシウム培地で培養する段階；
（ロ）前記カルシウム培地を除去した後に細胞を洗浄し、前記角化細胞培地に置き換えて再び角化細胞を培養する段階；
（ハ）前記角化細胞培地を除去した後に細胞を洗浄し、インキュベートさせる段階；及び
（ニ）インキュベートされた細胞から角化細胞をシート形態に分離させる段階：
を含み、
前記角化細胞の培養から得られるメラニン形成細胞は、
２時間継代培養後総培養細胞に対するディッシュ底に付着された細胞の割合が８０％以上であり、
チロシナーゼ活性を有し、
前記角化細胞培地は、ウシ脳下垂体抽出物（ＢｏｖｉｎｅＰｉｔｕｔａｒｙＥｘｔｒａｃｔ，ＢＰＥ）、ヒト上皮成長因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｈＥＧＦ）、ウシインシュリン（ｂｉｖｉｎｅｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）及びアンホテリシン−Ｂ（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ−Ｂ）を含む培地であり、
前記段階（ｃ）におけるメラニン形成細胞培地は、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量のミネラル、及び無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長因子又はタンパク質は含まない基本培地に、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インシュリン、トランスフェリン、及びＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）を含む補充物で充填された培地であり、
前記段階（ｃ）におけるメラノブラスト培地は、必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、有機化合物、微量のミネラル、並びに無機塩を含むが、抗生剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、ホルモン、成長因子又はタンパク質は含まない基本培地に、ウシ胎児血清、塩基性線維芽細胞成長因子、ウシ脳下垂体抽出物、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インシュリン、トランスフェリン、エンドセリン−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）を含む補充物で補充された培地である、
メラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。
前記段階（ａ）における角化細胞はヒトの角化細胞である、請求項１に記載のメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。
前記段階（ニ）は、前記インキュベートされた細胞に緩衝液又は角化細胞培地を添加して角化細胞をシート形態に分離させることを含む、請求項１または２に記載のメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。
前記段階（イ）では、角化細胞を前記角化細胞培地にカルシウムが添加されたカルシウム培地で２〜６日間培養する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。
前記メラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法は、
段階（ａ）において角化細胞を角化細胞培地で培養した結果、細胞が培養ディッシュにおいて８０〜１００％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にて培養された時点で角化細胞培地からカルシウム培地に置き換えることを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。
前記段階（ロ）では、角化細胞培地で３〜７日間培養する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。
前記段階（ハ）では、培地の色の変化が止まってそれ以上変わらない時点で培地を除去する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。
前記段階（ハ）における前記インキュベーションは、５〜１０分間行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載のメラニン形成細胞又はその前駆細胞の生産方法。